WO2013147081A1 - 生体物質検出方法 - Google Patents

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WO2013147081A1
WO2013147081A1 PCT/JP2013/059374 JP2013059374W WO2013147081A1 WO 2013147081 A1 WO2013147081 A1 WO 2013147081A1 JP 2013059374 W JP2013059374 W JP 2013059374W WO 2013147081 A1 WO2013147081 A1 WO 2013147081A1
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biological material
fluorescent
encapsulant
dye
detection method
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健作 高梨
秀樹 郷田
敬三 高野
星野　秀樹
中野　寧
幸祐 権田
憲明 大内
みか 渡邉
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コニカミノルタ株式会社
国立大学法人東北大学
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    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Definitions

  • the present invention relates to a biological substance detection method, and more particularly to tissue staining that is stained using a fluorescent label.
  • Pathological diagnosis is performed as one of medical diagnoses.
  • the pathologist diagnoses the disease from a piece of tissue collected from the human body and tells the clinician whether treatment or surgery is necessary.
  • the medical doctor determines the drug treatment policy, and the surgical doctor determines whether or not to perform the operation.
  • tissue specimens obtained by organ excision and needle biopsy are sliced to a thickness of several microns to create tissue specimens, and they are widely observed with an optical microscope to obtain various findings. It has been broken.
  • a specimen is prepared by dehydrating and collecting a paraffin block to fix the collected tissue, then slicing it to a thickness of several ⁇ m, and removing the paraffin.
  • immunostaining In pathological diagnosis, immunological observation, called immunostaining, is performed to diagnose functional abnormalities such as abnormal expression of genes and proteins by applying molecular target staining for confirming the expression of molecular information in specimens.
  • a dye staining method using an enzyme DAB staining or the like
  • DAB staining measures the amount of antigen by staining and observing the antigen to be observed using the peroxidase-modified antibody that can develop color using diaminobenzidine (DAB) as a substrate.
  • DAB staining measures the amount of antigen by staining and observing the antigen to be observed using the peroxidase-modified antibody that can develop color using diaminobenzidine (DAB) as a substrate.
  • DAB staining measures the amount of antigen by staining and observing the antigen to be observed using the peroxidase-modified antibody that can develop color using diaminobenzidine (DAB) as a substrate.
  • Cell nucleus, lime, cartilage tissue, bacteria and mucus are stained blue-blue to light blue by hematoxylin staining, and cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes and keratinocytes are stained red to dark red by eosin staining.
  • the pathologist makes a diagnosis based on morphological information such as changes in the size and shape of the cell nucleus and changes in the pattern of the tissue in the microscopic image of the stained tissue specimen, and staining information. ing. Examples of other morphological observation staining include Papanicolaou staining (Pap staining) used for cytology. By performing both morphological staining and immunostaining on one section, it is possible to simultaneously perform morphological observation and immunological observation of the specimen.
  • Non-Patent Document 3 DAB staining is often used for immunological observation.
  • staining with an enzyme label such as DAB staining has a problem that it is difficult to estimate the actual amount of antibody or the like from the staining concentration because the staining concentration greatly depends on environmental conditions such as temperature and time. Therefore, in immunological observation in pathological diagnosis, a fluorescent labeling method using a fluorescent label is performed instead of staining with an enzyme label. This method is characterized in that it has better quantitativeness than DAB staining (Non-Patent Document 1).
  • Observation using a fluorescent label is performed by a confocal laser microscope or an epi-fluorescence microscope.
  • a typical incident light fluorescent microscope has light with an irradiation light intensity 100 times that of 1000 W / m 2 which is a normal sunlight exposure test condition as found in the standard JIS C 8914 of the solar cell.
  • Non-Patent Documents 2 to 3, Patent Documents). 4 fluorescent dyes and inorganic nanoparticles and their aggregates.
  • the integrated body is more preferable from the viewpoint of light resistance, but integration alone is not sufficient for the light resistance performance required in the fluorescence microscope observation.
  • the integration body is more preferable from a viewpoint of a signal.
  • aqueous encapsulants and oil-based encapsulants are known as encapsulants for encapsulating stained pathological sections.
  • the water-based encapsulant has a large difference in refractive index from the sample, so that it is difficult to make the sample transparent or permanent.
  • oil-based encapsulants have characteristics that they have a small difference in refractive index from the specimen and can make the specimen transparent, have good morphological dyeing and coloring, and are used as standard for permanent specimens. For this reason, the oil-based encapsulant is preferably used for specimen preparation.
  • a mounting medium for immunostaining specimens permanent specimens can be prepared, and in the case of double staining with morphological staining, it is better to use an oil-based mounting medium with good morphological staining color and color development. It is considered more preferable.
  • a confocal laser microscope or a fluorescence microscope is used to observe the fluorescent label.
  • a high-intensity excitation light hits a stained section during fluorescence observation.
  • the fluorescent label using a fluorescent dye or the like gradually deteriorates, and has a great influence on fluorescence observation and determination of immunostaining results.
  • the fluorescent label is free from deterioration, and the light resistance needs to be improved.
  • a method of mixing an anti-fading agent with the encapsulant can be considered.
  • an aqueous encapsulant for example, when 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) is used as a fluorescent dye, for example, 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO) or prolong gold Improvement of the light resistance of DAPI is performed by using a fading inhibitor such as (registered trademark, manufactured by Molecular Probes).
  • a fading inhibitor such as (registered trademark, manufactured by Molecular Probes).
  • oil-based encapsulants for fluorescent dye staining has the above-mentioned problems, and so far, oil-based encapsulants have not been used for fluorescent dye staining. For this reason, there has been no motivation to mix an oil-based encapsulant with an anti-fading agent and use it in fluorescent dyeing, and no such attempt has been made.
  • An object of the present invention is to provide a staining method in which fluorescence stainability does not deteriorate even when an oil-based encapsulant is used in a fluorescent immunostained specimen. Furthermore, in the fluorescent immunostaining specimen obtained by the staining method, there is provided a method for preventing deterioration of the fluorescent label due to irradiation of excitation light and improving light resistance. It is also to provide a kit for use in the use of these methods.
  • the present inventors have carried out a fixing treatment after binding the fluorescent label in the staining using the fluorescent label, so that the fluorescent staining property is not affected even if the oil-based encapsulating agent is used. I found that it did not decrease. Furthermore, it has been found that the light resistance performance of the fluorescent label can be greatly improved by incorporating an anti-fading agent into the oil-based encapsulant used at that time, and the present invention has been completed.
  • the present invention in order to achieve at least one of the above problems, the present invention includes the following matters.
  • a biological substance detection method for specifically detecting a biological substance from a pathological section comprising an immunostaining process using a fluorescent label, a section fixing process, and an organic solvent that is not freely miscible with water
  • a biological substance detection method comprising: an encapsulation process step of encapsulating a section using an agent.
  • a kit for use in the biological material detection method according to item [1] An encapsulant containing an organic solvent that is not freely miscible with water;
  • a pathological section used in the biological material detection method according to item [1], wherein immunostaining treatment using a fluorescent label for specifically detecting biological material, fixation treatment, and free mixing with water A pathological section that has been encapsulated with an encapsulant containing an organic solvent that does not.
  • a specimen in which the light resistance of the fluorescent label is further improved can be produced. If the biological substance detection kit of item [3] is used, a specimen that can be prepared by the method of item [1] can be obtained.
  • the section of the item [5] is a specimen obtained by the method of the item [1] that does not deteriorate the fluorescent staining property, and is a permanent sample. It is a pathological section that is an immunostained specimen using a fluorescent label with good taste and color development.
  • a biological material detection method is a method for specifically detecting a biological material from a pathological section. Basically, (1) immunostaining a pathological section using a fluorescent label. And (2) irradiating the stained pathological section with excitation light to cause fluorescence emission, and detecting a biological substance from the pathological section.
  • the step (1) includes a section fixing treatment step and an encapsulation step.
  • the process of (1) may have processes, such as a deparaffinization process and an activation process, like the general biological substance detection method. Further, either before or after the step (1), a step of observing and staining a pathological section using a staining agent for morphological observation may be included. By doing so, it is possible to simultaneously perform immunostaining using a fluorescent label and morphological observation staining using a staining agent for morphological observation.
  • a fluorescent dye in particular, in the step of immunostaining the pathological section of (1), (A) a fluorescent dye, (B) a fluorescent nanoparticle, (C) a fluorescent dye-containing nanoparticle, (D) a fluorescent nanoparticle as a fluorescent label.
  • Particle-containing particles can be used. Higher brightness of the fluorescent label is preferable from the viewpoint of the ratio of the signal value to the fluorescence of eosin or cell autofluorescence, which is noise. Therefore, as the fluorescent label of the present invention, (B) fluorescent nanoparticles, (C) fluorescent dye-containing nanoparticles, and (D) fluorescent nanoparticle-containing particles have higher brightness than (A) fluorescent dyes. Is more preferably used.
  • (C) fluorescent dye-containing nanoparticles and (D) fluorescent nanoparticle-containing particles that are aggregates are particularly preferably used.
  • the details of the fluorescent label for immunostaining, the immunostaining process, the staining agent for morphological observation, and the morphological observation dyeing process are as follows.
  • the fluorescent label for immunostaining in the present invention may be any existing one as long as it can be used for immunostaining. Any of (A) fluorescent dye, (B) fluorescent nanoparticle, (C) fluorescent dye inclusion nanoparticle, and (D) fluorescent nanoparticle inclusion particle may be sufficient.
  • any existing fluorescent dye may be used in the present invention. It can be obtained or produced by a known method.
  • the encapsulated fluorescent dye is selected from, for example, rhodamine dye molecules, squarylium dye molecules, cyanine dye molecules, aromatic ring dye molecules, oxazine dye molecules, carbopyronine dye molecules, and pyromesene dye molecules. can do.
  • Alexa Fluor registered trademark, manufactured by Invitrogen
  • BODIPY registered trademark, manufactured by Invitrogen
  • Cy registered trademark, manufactured by GE Healthcare
  • Dy registered trademark, manufactured by GE Healthcare
  • HiLyte registered trademark, manufactured by Anaspec
  • dye molecule DyLight (registered trademark, manufactured by Thermo Scientific)
  • ATTO registered trademark, manufactured by ATTO-TEC
  • MFP registered trademark, manufactured by Mobitec
  • the generic names of such dye molecules are named based on the main structure (skeleton) in the compound or the registered trademark, and the range of fluorescent dyes belonging to each is appropriate for those skilled in the art without undue trial and error. Can be grasped.
  • rhodamine dye molecules include 5-carboxy-rhodamine, 6-carboxy-rhodamine, 5,6-dicarboxy-rhodamine, rhodamine 6G, tetramethylrhodamine, X-rhodamine, Texas Red, Spectrum® Red, LD700® PERCHLORATE , Etc.
  • squarylium dye molecule examples include SRfluor 680-Carboxylate, 1,3-Bis [4- (dimethylamino) -2-hydroxyphenyl] -2,4-dihydroxycyclobutenedidium dihydroxide, bis, 1,3-Bis, dimethylyl)) phenyl] -2,4-dihydroxycyclobutenedidium dihydroxide, bis, 2- (4- (Dithylamino) -2-hydroxy-4-hydroxy, 4- (dithyrimino) -2-hydryloxy-2-hydroxy-3-2-hydroxy-3 oxocyclobut-1-eno ate, 2- (4- (Dibutylamino) -2-hydroxyphenyl) -4- (4- (dibutylimino) -2-hydroxycyclohexa-2,5-diylenedene) -3-oxycyclobut-1-enolate, 2- (8-Hydroxy) -1,1,7,7-tetramethyl
  • cyanine dye molecules include 1-Butyl-2- [5- (1-butyl-1,3-dihydro-3,3-dimethyl-2H-indol-2-ylidene) -penta-1,3. -Dienyl] -3,3-dimethyl-3eiti-indolium hexafluorophosphate, 1-Butyl-2- [5- (1-butyl-3,3-dimethyl-1,3-dihydro-indol-2-ylidene) -3- chloro-penta-1,3-dienyl] -3,3-dimethyl-3H-indolium hexafluorophosphate, 3-Ethyl-2- [5- (3-ethyl-3H-benzothiazol-2-ylide e) -penta-1,3-dienyl] -benzothiazol-3-ium iodide, and the like.
  • aromatic ring dye molecule examples include N, NN-Bis- (2,6-diisopropylphenyl) -1,6,7,12- (4-tert-butylphenoxy) -perylene-3,4,9,10.
  • oxazine dye molecule examples include Cresyl violet, Oxazine 170, EVOblue 30, Nile Blue and the like.
  • carbopyronine dye molecule examples include CARBOPPYRONIN 149.
  • pyromesene dye molecule examples include PYRROMETHENE650.
  • Alexa Fluor dye molecule examples include Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635 , Alexa Fluor 635 , Alexa Fluor 750 and the like (manufactured by Invitrogen).
  • BODIPY dye molecules include BODIPY FL, BODIPY TMR, BODIPY 493/503, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, 3061 , BODIPY 650/665 (manufactured by Invitrogen) and the like.
  • Cy-based dye molecule examples include Cy3.5, Cy5, and Cy5.5 (manufactured by GE Healthcare).
  • DY dye molecule include DY-590, DY-610, DY-615, DY-630, DY-631, DY-632, DY-633, DY-634 (manufactured by DYOMICS). Can be mentioned.
  • HiLyte dye molecule examples include HiLyte 594, HiLyte Fluor TR (manufactured by Anaspec).
  • DyLight type dye molecule examples include DyLight 594, DyLight 633 (manufactured by Thermo Scientific).
  • ATTO dye molecules include ATTO590, ATTO610, ATTO620, ATTO633, ATTO655, and the like (manufactured by ATTO-TEC).
  • MFP dye molecules include MFP590, MFP631 (manufactured by Mobitec) and the like.
  • examples of other dyes include C-Phycocyanin, Phycocyanin, APC (Allophycocyanin), APC-XL, and NorthernLights637 (manufactured by R & D Systems).
  • these derivatives can be mentioned.
  • the fluorescent nanoparticles used in the present invention have a particle size of 1 to 500 nm, preferably 10 to 200 nm.
  • the fluorescent nanoparticles are composed of a semiconductor or a phosphor.
  • the semiconductor for example, a group II-VI semiconductor such as ZnSe, ZnTe, CdSe, CdTe, PbS, PbSe, PbTe or the like, or a group II-VI semiconductor such as AlAs, AlSb, GaP, GaAs, GaSb, InP, InAs, InSb, or the like is used. From the viewpoint of toxicity, GaP and InP can be preferably used.
  • the phosphor for example, Y 2 O 3 , YVO 4 , ZnO, ZnS, or the like can be used for the base material, and Eu, Nd, or the like can be used for the emission center.
  • the excitation wavelength is suitable for observation.
  • fluorescent dye-containing nanoparticles From the viewpoint of the ratio of signal value to fluorescence of eosin or cell autofluorescence, which is noise, it is preferable that the luminance of the fluorescent label is high. Therefore, as the fluorescent label in the present invention, fluorescent dye-containing nanoparticles having higher brightness than fluorescent dyes are more preferably used.
  • Fluorescent pigment-encapsulated nanoparticles are nano-sized particles having a structure in which a plurality of fluorescent pigments are encapsulated in organic or inorganic particles (matrix).
  • the fluorescent dye-containing nanoparticles used in the present invention can be prepared by a known method after selecting an appropriate fluorescent dye and an organic or inorganic material that forms the particles.
  • organic or inorganic substances that form particles include polystyrene, polyamide, polylactic acid, polyacrylonitrile, polyglycidyl methacrylate, polymelamine, polyurea, polybenzoguanamine, polyfuran, polyxylene, phenolic resin, polysaccharides, silica, and the like.
  • the thing which can include fluorescent dye is mentioned. By encapsulating the fluorescent dye in such particles, deterioration due to irradiation of excitation light is less likely to occur (higher light resistance) than the fluorescent dye alone.
  • Fluorescent dyes encapsulated may be the fluorescent dyes listed in the item (A) Fluorescent dye. Moreover, those derivatives (what can function as a fluorescent pigment, for example, a well-known derivative) can be mentioned.
  • the fluorescent dyes as described above may be included in the fluorescent dye-containing nanoparticles in a single kind or in a mixture of a plurality of kinds.
  • fluorescent dyes such as aromatic ring dye molecules and rhodamine dye molecules are preferred because of their relatively high light resistance, and among them, perylene belonging to aromatic ring dye molecules, particularly perylene diimide is preferred.
  • perylene belonging to aromatic ring dye molecules, particularly perylene diimide is preferred.
  • fluorescent dye-containing nanoparticles satisfying the predetermined luminance retention rate according to the present invention can be produced by selecting an appropriate matrix.
  • the method for producing the fluorescent dye-encapsulated nanoparticles is not particularly limited. Any method may be used for introducing the dye into the particle, such as a method of synthesizing the particle by bonding a dye molecule to the monomer as the particle raw material, or a method of introducing the dye by adsorbing the dye to the particle.
  • the average particle diameter of the fluorescent dye-containing nanoparticles is not particularly limited, but is usually 10 to 500 nm, preferably 50 to 200 nm. Further, the coefficient of variation indicating the variation in particle diameter is not particularly limited, but is usually 20% or less, and preferably 5 to 15%.
  • the particle size of the fluorescent dye-encapsulated nanoparticles is obtained by taking an electron micrograph using a scanning electron microscope (SEM), measuring the cross-sectional area of the fluorescent dye-encapsulated nanoparticles, and calculating the measured value as the area of the corresponding circle. Can be measured as the diameter (area circle equivalent diameter).
  • the average (average particle size) and coefficient of variation of the particle size of a population of fluorescent dye-containing nanoparticles are measured as described above for a sufficient number (for example, 1000) of fluorescent dye-containing nanoparticles. After that, the average particle diameter is calculated as its arithmetic average, and the coefficient of variation is calculated by the formula: 100 ⁇ standard deviation of particle diameter / average particle diameter.
  • the fluorescent nanoparticle-containing particles used in the present invention are particles in which the fluorescent nanoparticles described in the above (B) are included in particles made of an organic substance or an inorganic substance.
  • the fluorescent nanoparticles may be included in the fluorescent dye-encapsulated nanoparticles either alone or as a mixture of a plurality of types.
  • the method for producing the fluorescent dye-containing nanoparticles is not particularly limited. Any method may be used for introducing fluorescent nanoparticles into the particles, such as a method of synthesizing particles by bonding fluorescent nanoparticles to the monomer that is the raw material of the particles, or a method of adsorbing and introducing fluorescent nanoparticles to the particles. .
  • the excitation wavelength suitable for observation is adjusted by adjusting the particle size, matrix composition, and impurity content of the fluorescent nanoparticles to be included.
  • the size of the fluorescent nanoparticle-containing particles is 10 to 500 nm, preferably 50 to 200 nm.
  • morphological observation staining can be performed.
  • hematoxylin and eosin staining using the two dyes of hematoxylin and eosin as described above is used as standard.
  • Dyeing is not limited to this. Examples of other morphological observation staining include Papanicolaou staining (Pap staining) used for cytology.
  • the nucleus, lime, cartilage tissue, bacteria, and mucus are stained blue-blue to light blue by hematoxylin staining, and cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes, and keratinocytes are red to dark red by eosin staining. Stained.
  • cell nuclei, limestone, cartilage tissue, bacteria, and mucus are stained blue-blue to light blue with a dye having the same absorption wavelength as that of hematoxylin and hematoxylin, similar to eosin analogs and eosin
  • the cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes, and keratinocytes may be stained red to dark red with a dye having the absorption wavelength and emission wavelength.
  • a fluorescent staining method is used in which a biological substance to be detected is stained with a fluorescent label for immunostaining as described above.
  • a label (conjugate) in which a fluorescent label and a primary antibody are directly bound is prepared, and the antigen is stained (primary antibody method).
  • a label that directly binds the antibody to the secondary antibody and stains the antigen bound to the primary antibody (secondary antibody method)
  • a label that directly binds the fluorescent label and biotin For example, a method (biotin-avidin method or sandwich method) of staining a combination of a primary antibody and a secondary antibody modified with avidin or streptavidin can be used.
  • Any primary antibody may be used for immunostaining and will vary depending on the subject to be immunostained. For example, when performing immunostaining using HER2 as an antigen, an anti-HER2 antibody is used.
  • any secondary antibody may be used, and varies depending on the primary antibody. Examples include anti-mouse, rabbit, cow, goat, sheep, dog and chicken antibodies.
  • Any existing method may be used for binding the fluorescent label with the antibody or biotin.
  • amidation by reaction of amine and carboxylic acid for example, amidation by reaction of amine and carboxylic acid, sulfidation by reaction of maleimide and thiol, imination by reaction of aldehyde and amine, amination by reaction of epoxy and amine can be used.
  • the above immunostaining is not limited to tissue staining, and can also be applied to cell staining.
  • the biological substance to be detected is not particularly limited as long as a substance that specifically binds to the biological substance exists.
  • a combination of an antigen and an antibody is used as described above.
  • a combination of a nucleic acid molecule (oligonucleotide, polynucleotide) and a nucleic acid molecule having a sequence capable of complementary binding thereto can be used. It is.
  • the immobilization process performed in the staining method of the present invention is a process of immobilizing the fluorescent label introduced by the immunostaining process on a biological material or an antibody bound to the biological material.
  • the fixation treatment can be performed by immersing the stained tissue section obtained by the histochemical staining step in the fixation treatment solution.
  • it can be performed by immersing the stained tissue section obtained by the histochemical staining step in a dilute paraformaldehyde aqueous solution for about several minutes to several hours.
  • Examples of the fixing treatment solution used in the present invention include cross-linking agents such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol, and cell membrane permeants.
  • cross-linking agents such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol, and cell membrane permeants.
  • formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde are preferably used because they can be firmly fixed.
  • the enclosing process includes a dehydration / penetration process using an organic solvent for a tissue section and an enclosing process using an oil-based encapsulant.
  • the dehydration / penetration step is performed by washing the stained tissue section with an aqueous washing solution such as PBS, followed by dehydration with EtOH (ethanol) and xylene replacement.
  • Dehydration with EtOH involves substituting EtOH by sequentially immersing the tissue sections in EtOH with a reduced water content such as 50%, 30%, 10%, or 0%. It is done in. By immersing the EtOH-substituted section in xylene, the xylene replacement is performed and the section is transparent.
  • Encapsulation is performed by placing an oil-based encapsulant on the xylene-substituted section and placing a cover glass or the like.
  • the encapsulant is composed of a solvent (encapsulated solvent) and a resin.
  • an oil-based encapsulant (sometimes commonly referred to as a water-insoluble encapsulant) is used.
  • An oil-based encapsulant refers to an encapsulant containing a solvent that is not freely miscible with water.
  • the encapsulant of the present invention can contain an anti-fading agent. This is called an antifade-containing encapsulant.
  • the mounting medium may be a commercially available oil-based mounting medium or prepared in-house.
  • oil-based encapsulants include DPX (manufactured by Sigma-Aldrich. Main component: polystyrene polymer approximately 21.8%, xylene approximately 69.7%), Enteran New (registered trademark, manufactured by Merck Ltd., main component: acrylic) Resin, xylene about 60%), Paramount N (registered trademark, manufactured by Pharma Co., Ltd., main components: acrylic resin, aliphatic hydrocarbon).
  • Commercially available oil-based encapsulants include those that can be used as they are, and those that are used after the product (stock solution) is diluted with a predetermined solvent.
  • an oil-based encapsulant can be prepared by dissolving a natural resin such as Canadian balsam or a synthetic resin such as polystyrene or polymethyl methacrylate in an encapsulating solvent.
  • a solvent containing an organic solvent that is not freely miscible with water is used as the encapsulating solvent.
  • the solvent contained in the above-mentioned commercially available oil-based encapsulant, the predetermined solvent for diluting the commercially available oil-based encapsulant, the solvent used to prepare the oil-based encapsulant in-house correspond to the above-mentioned encapsulated solvent To do.
  • an aromatic hydrocarbon an unsaturated hydrocarbon, a compound containing a carbonyl (ketone), an ester, an ether, or an alcohol can be selected and used.
  • benzene, toluene, xylene and the like can be used as the aromatic hydrocarbon.
  • unsaturated hydrocarbon limonene, pinene and the like can be used.
  • ketone cyclohexanone, methyl ethyl ketone, or the like can be used.
  • ester type butyl acetate or the like can be used.
  • ether anisole, 1, 4-di (2-hydroxyethoxy) benzene, ethylene glycol monophenyl ether, or the like can be used.
  • alcohol butanol, pentanol, hexanol and the like can be used.
  • xylene, toluene, and limonene are preferable from the viewpoint of easy availability, a refractive index of about 1.5 close to the section, and a drying speed of about several tens of minutes suitable for work.
  • any one organic solvent that is not freely miscible with water may be used alone, or a plurality of organic solvents may be mixed and used.
  • the encapsulating solvent may be composed of only an organic solvent that is not freely miscible with water, and, if necessary, with an organic solvent that is not freely miscible with water, as long as the effect of the present invention is not impaired. And / or an organic solvent that is freely miscible with water.
  • the ratio (volume%) of the solvent that is not miscible with water in the encapsulating solvent is usually 50 to 100%, preferably 70 to 100%, more preferably 90 to 100%.
  • Encapsulants containing a solvent that is not miscible with water, specified in this range, have a small difference in refractive index from the sample and can make the sample transparent, have good morphological dyeing and color development, make it easier to create a permanent sample, Since it can be dehydrated, it is preferable from the viewpoint that it is easy to prevent mixing of water at the time of specimen preparation and that drying at the time of specimen preparation can be made uniform.
  • the resin used in the present invention is not particularly limited as long as the above conditions are satisfied. For example, natural resins such as Canadian balsam, synthetic resins such as polystyrene and polymethyl methacrylate, etc. Is mentioned.
  • Anti-fading agent As anti-fading agents, there are no problems with solubility in encapsulated solvents including phenol, amine, phosphorus, sulfur, and unsaturated hydrocarbon anti-fading agents, including solvents that are not freely miscible with water. Can be selected and used.
  • Phenol-based fading inhibitors include rutin, catechin, hesperidin, methyl hesperidin, myricitrin, quercetin, morin, fisetin, naringenin, naringin, hesperidin, taxifolin, apigenin, geosmin, luteolin, cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin, peargonidin , Tannins, tocopherols, tocotrienols, phenols derived from natural products, p-phenylazophenol, 4-nitroaniline, 2,6-di-tert-butyl-4-hydroxymethylphenol, N, N'-disalicylical -1,2-propanediamine, triethylene glycol-bis [3- (3-tert-butyl-5-methyl-4-hydroxyphenyl) propionate], 1,6-hexanediol-bis [3- 3,5-di-t-butyl-4-hydroxy
  • amine-based color fading inhibitors examples include tertiary amines such as 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO), phenothiazine, and bis (2,2,6,6-tetramethyl-4 sebacate). -Piperidyl), secondary amines such as 2,2,6,6-tetramethylpiperidine, and alkaloids such as caffeine can be used.
  • DABCO 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane
  • phenothiazine phenothiazine
  • bis (2,2,6,6-tetramethyl-4 sebacate bis (2,2,6,6-tetramethyl-4 sebacate).
  • secondary amines such as 2,2,6,6-tetramethylpiperidine
  • alkaloids such as caffeine
  • Examples of phosphorus-based fading inhibitors include 2-mercaptobenzimidazole, triphenyl phosphite, tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP HCl), diisodecylpentaerythritol diphosphite, 9,10-dihydro-9 -Oxa-10-phosphaphenanthrene 10-oxide or the like can be used.
  • sulfur-based fading inhibitors As sulfur-based fading inhibitors, sulfides such as didodecyl 3,3-thiodipropionate and 2,2′-thiodiethanol, dibenzyl disulfide, DL- ⁇ lipoic acid (thioctic acid), 3,6-dithia Disulfides such as -1,8-octanediol and thiols such as dithiothreitol and octanediol can be used.
  • sulfides such as didodecyl 3,3-thiodipropionate and 2,2′-thiodiethanol, dibenzyl disulfide, DL- ⁇ lipoic acid (thioctic acid), 3,6-dithia Disulfides such as -1,8-octanediol and thiols such as dithiothreitol and octanediol can be used.
  • Unsaturated hydrocarbons include lutein, lycopene, astaxanthin, canthaxanthin, capsanthin, myxoxanthophylls, zeaxanthin, carotenes, carotenes, carotenoids, xanthophylls, ascorbic acid, tocotrienols, unsaturated fatty acids, etc. Can be used.
  • the anti-fading agent preferably contains at least one selected from the group consisting of phenol and amine. These anti-fading agents can more effectively prevent photobleaching by preventing oxidation by active oxygen that causes photobleaching of fluorescent labels.
  • anti-fading agent Any one type of anti-fading agent may be used alone, or a plurality of types may be used in combination.
  • These anti-fading agents preferably have no absorption at an absorption wavelength of 450 to 600 nm, and preferably have no emission at an emission wavelength of 500 to 700 nm, so as not to adversely affect observation under a fluorescence microscope. Absorption leads to a decrease in the brightness of the fluorescent label. In addition, if there is light emission, noise increases during observation with a fluorescence microscope.
  • the absence of absorption of the anti-fading agent means that when the xylene solution of 1 mg / mL concentration of the anti-fading agent is prepared and placed in a 10 mm cell and the absorbance is measured, both the absorbance at 450 nm and 600 nm is 0. It means 5 or less.
  • the section slide prepared using the encapsulant containing the anti-fading agent is transparent. “Transparent” means that the absorbance at 450 nm and 600 nm is 0.1 or less when the absorbance of the prepared section slide is measured at 450 to 600 nm.
  • the stained pathological section may be irradiated with excitation light having an appropriate wavelength and output.
  • Fluorescence observation may be performed from a lens barrel of a fluorescence microscope, or may be performed by separately displaying an image photographed by a camera installed on the fluorescence microscope on a display means (a monitor or the like). Although it depends on the fluorescent substance, there are cases where it is possible to observe the fluorescence through taking an image with a camera even if the fluorescence cannot be sufficiently observed by visual observation from the tube of the fluorescence microscope. You may use the filter which selectively permeate
  • both immunostaining and morphological observation staining may be applied to the same pathological section, but when observing an image by morphological observation staining, a fluorescent label for immunostaining is used. It is not necessary to irradiate the excitation light for exciting the light, and the observation may be performed under the same observation conditions as the optical microscope.
  • the fluorescence observation can be performed after irradiating the excitation light for an arbitrary time, but under normal irradiation conditions (irradiation energy, etc.), preferably within 90 minutes from the start of the excitation light, more preferably from the start of the excitation light. Do this within 30 minutes.
  • the brightness of the fluorescent label does not change before and after observation with a fluorescence microscope.
  • the luminance after light irradiation for 30 minutes is maintained at 70% before irradiation under the observation condition of 40 times the full aperture of a general fluorescent microscope. In this range of reduced luminance, it can be operated as a certain reliable biological substance detection method in the observation of fluorescent immunostaining.
  • the biological material detection kit of the present invention is used for the biological material detection method of the present invention including the above steps.
  • the biological material detection kit of the present invention has an encapsulant containing a solvent that is not freely miscible with water, or an encapsulant containing a solvent that is not freely miscible with water and an anti-fading agent.
  • Such a biological substance detection method can have instructions for use described as instructions, a fluorescent label for immunostaining, and a fluorescent labeling reagent.
  • the fluorescent label for immunostaining contained in the kit can be selected from the fluorescent labels described in the above section [Fluorescent label for immunostaining].
  • the fluorescent labeling reagent the substances described in the above [Immunostaining step], for example, a primary antibody, a secondary antibody and the like can be selected.
  • the encapsulant is an encapsulant described in the above [Encapsulant] section, and the solvent and resin constituting the encapsulant are the solvents and resins described in the above ⁇ Encapsulated solvent> and ⁇ Resin> section, respectively. You can choose from.
  • the anti-fading agent can be selected from the anti-fading agents described in the above section [An anti-fading agent].
  • the instructions for use included in the kit are instructions for use according to any of the biological material detection methods of the present invention for carrying out the method of the present invention.
  • the specific mode of the instruction manual may be any as long as it can appropriately transmit the above information. For example, it may be printed on a piece of paper, packaging of a kit, a label of a component of the kit, or may be recorded in a computer-readable medium such as a diskette or CD.
  • fluorescent label 1 Texas Red dye
  • Sulforhodamine 101 acid chloride Texas Red dye, manufactured by Dojindo
  • Streptavidin binding to the fluorescent dye was performed as follows.
  • the Texas® Red dye was adjusted to 3 nM using PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and SM (PEG) 12 (Thermo) was added to this solution to a final concentration of 10 mM.
  • PBS phosphate buffered saline
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • SM 12 SM
  • Thermo was added to this solution to a final concentration of 10 mM.
  • succinimidyl-[(N-maleidopropionamid) -dodecaethyleneglycol] ester) was mixed and allowed to react for 1 hour. The mixture was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again. By performing washing by the same procedure three times, fluorescent dye-encapsulated nanoparticles
  • streptavidin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
  • the above Texas® Red dye and streptavidin were mixed in PBS containing 2 mM of EDTA and allowed to react for 1 hour. 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction. After concentrating the obtained solution with a centrifugal filter, unreacted streptavidin and the like were removed using a gel filtration column for purification to obtain a streptavidin-bound Texas® Red dye.
  • Fluorescent label 2 Perylene dye
  • Perylene diimide used as a fluorescent dye was prepared by the following method. N, N′-Bis (2,6-diisopropylphenyl) -1,6,7,12-tetraphenylperylene-3,4: 9,10-tetracarboxdiimide was treated with concentrated sulfuric acid to produce a perylene diimide sulfonic acid derivative. This was converted to an acid chloride to obtain a perylene diimide sulfonic acid chloride derivative. A streptavidin-binding dye was obtained in the same manner as the fluorescent dye 1 except that this was used.
  • the resulting particles (0.1 mg) were dispersed in 1.5 mL of EtOH, and 2 ⁇ L of aminepropyltrimethoxysilane LS-3150 (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was added and reacted for 8 hours for surface amination treatment.
  • the obtained dye-encapsulated nanoparticles were adjusted to 3 nM using PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and SM (PEG) was added to this solution to a final concentration of 10 mM. ) 12 (manufactured by Thermo Scientific, succinimidyl-[(N-maleidopropionamid) -dodecaethyleneglycol] ester) was mixed and allowed to react for 1 hour. The mixture was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again. By performing washing by the same procedure three times, fluorescent dye-encapsulated nanoparticles having a maleimide group at the end were obtained.
  • PBS phosphate buffered saline
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • streptavidin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
  • the above fluorescent nanoparticles and streptavidin were mixed in PBS containing 2 mM of EDTA and reacted for 1 hour. 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction. After the obtained solution was concentrated with a centrifugal filter, unreacted streptavidin and the like were removed using a gel filtration column for purification to obtain streptavidin-bound TexasTRed dye-encapsulated melamine nanoparticles.
  • fluorescent label 4 perylene dye-encapsulated melamine nanoparticles
  • the perylene diimide sulfonic acid derivative described in the dye 2 was used as a fluorescent dye. Except that, streptavidin-linked perylene dye-encapsulated melamine nanoparticles were obtained in the same manner as in the fluorescent dye 3 method.
  • fluorescent label 5 Fluorescent label 5: FITC dye-encapsulated melamine nanoparticles
  • fluorescein isothiocyanate manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd., FITC
  • streptavidin-binding FITC dye-encapsulated melamine nanoparticles were obtained in the same manner as the fluorescent dye 3 described above.
  • Fluorescent label 6 Texas Red dye-encapsulated silica nanoparticles
  • 3.4 mg of Texas Red dye used in fluorescent label 1 and 3 ⁇ L of 3-aminopropyltrimethoxysilane (3-aminopropyltrimethoxysilane, manufactured by Shin-Etsu Silicone, KBM903) were mixed in DMF to obtain an organoalkoxysilane compound.
  • 0.6 mL of the obtained organoalkoxysilane compound was mixed with 48 mL of ethanol, 0.6 mL of TEOS (tetraethoxysilane), 2 mL of water, 2 mL of 28% aqueous ammonia for 3 hours.
  • TEOS tetraethoxysilane
  • the mixed solution prepared in the above step was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added to disperse the sediment and centrifuged again. In the same procedure, washing with ethanol and pure water was performed twice. Texas Red dye-encapsulated silica nanoparticles were obtained.
  • the obtained dye-encapsulated nanoparticles were adjusted to 3 nM using PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and SM (PEG) was added to this solution to a final concentration of 10 mM. ) 12 (manufactured by Thermo Scientific, succinimidyl-[(N-maleidopropionamid) -dodecaethyleneglycol] ester) was mixed and allowed to react for 1 hour. The mixture was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again. By performing washing by the same procedure three times, fluorescent dye-encapsulated nanoparticles having a maleimide group at the end were obtained.
  • PBS phosphate buffered saline
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • streptavidin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
  • Fluorescent label 7 perylene dye-encapsulated silica nanoparticles
  • Perylene diimide used in the fluorescent label 2 was used as the fluorescent dye. Except that, streptavidin-linked perylene dye-encapsulated silica nanoparticles were obtained in the same manner as in the fluorescent dye 6 method.
  • fluorescent label 8 FITC dye-encapsulated silica-encapsulated nanoparticles
  • the FITC used in fluorescent dye 3 was used as the fluorescent dye. Except that, streptavidin-linked perylene dye-encapsulated silica nanoparticles were obtained in the same manner as in the fluorescent dye 6 method.
  • Texas Red dye-containing polystyrene particles were prepared by a soap-free emulsion polymerization method.
  • a fluorescent dye Sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red dye manufactured by Dojin Co., Ltd.) and 4-aminostyrene (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) were mixed for 1 hour at room temperature to prepare a dye-bound styrene.
  • Purification was performed by dispersing the collected particles in pure water and collecting them again by centrifugation. The obtained particles were added to excess ammonia water to convert the epoxy group at the end of the particle into an amino group, thereby obtaining dye-encapsulated polystyrene nanoparticles having an amino group at the end.
  • the obtained dye-encapsulated nanoparticles were adjusted to 3 nM using PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and SM (PEG) was added to this solution to a final concentration of 10 mM. ) 12 (manufactured by Thermo Scientific, succinimidyl-[(N-maleidopropionamid) -dodecaethyleneglycol] ester) was mixed and allowed to react for 1 hour. The mixture was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again. By performing washing by the same procedure three times, fluorescent dye-encapsulated nanoparticles having a maleimide group at the end were obtained.
  • PBS phosphate buffered saline
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • streptavidin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
  • Fluorescent label 10 perylene dye-encapsulated polystyrene nanoparticles
  • Perylene diimide used in the fluorescent label 2 was used as the fluorescent dye. Except that, streptavidin-bonded perylene dye-encapsulated silica nanoparticles were obtained in the same manner as the fluorescent dye 9.
  • fluorescent label 11 FITC dye-encapsulated polystyrene nanoparticles
  • the FITC used in fluorescent dye 3 was used as the fluorescent dye. Except that, streptavidin-bonded perylene dye-encapsulated silica nanoparticles were obtained in the same manner as the fluorescent dye 9.
  • fluorescent label 12 As fluorescent nanoparticles, carboxylic acid-terminated CdSe / ZnS (Invitrogen Corp .: Qdot 605) was used. This was activated with EDTA (manufactured by Thermoscience) and then combined with streptavidin in the same manner as fluorescent labeling 1 to obtain streptavidin-binding fluorescent nanoparticles.
  • encapsulating agents 1-1 to 1-10, 2-1 to 2-5, and 3-1 shown below were prepared.
  • [Fixing agent-containing encapsulant] Encapsulant 1-1: Rutin-containing encapsulant
  • Enterant New Merck Co., Ltd., main component: acrylic resin, about 60% xylene
  • Paramount N Puracia Corp., main component: acrylic resin, aliphatic hydrocarbon
  • Enteran New and Paramount N were used without being diluted as they were purchased.
  • As an anti-fading agent 1% by weight of rutin (hereinafter abbreviated as “wt%”) was added to the encapsulant and stirred to obtain an anti-fading encapsulant.
  • Encapsulant 1-2 2,6-di-tert-butyl-4-hydroxymethylphenol-containing encapsulant
  • Enterant New (Merck) or Paramount N (Pharmacia) was used as the encapsulant.
  • As a discoloration inhibitor 1 wt% of 2,6-di-tert-butyl-4-hydroxymethylphenol was added to the encapsulant and stirred to obtain a discoloration inhibitor-containing encapsulant.
  • Encapsulant 1-3 Encapsulant containing bis (2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl) sebacate
  • Enterant New (Merck) or Paramount N (Pharmacia) was used as the encapsulant.
  • 1 wt% of bis (2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl) sebacate was added as an anti-fading agent and stirred to obtain an anti-fading agent-containing encapsulant.
  • Encapsulant 1-4 Encapsulant containing phenothiazine
  • Enterant New (Merck) or Paramount N (Pharmacia) was used as the encapsulant.
  • 1 wt% of phenothiazine was added as an anti-fading agent to the encapsulant and stirred to obtain an anti-fading encapsulant.
  • Encapsulant 1-5 2-mercaptobenzimidazole Enterant New (Merck) or Paramount N (Pharmacia) was used as the encapsulant.
  • a discoloration inhibitor 1 wt% of 2-mercaptobenzimidazole was added to the encapsulant and stirred to obtain a discoloration inhibitor-containing encapsulant.
  • Encapsulant 1-6 Encapsulant containing triphenyl phosphite
  • Enterant New (Merck) or Paramount N (Pharmacia) was used as the encapsulant.
  • 1 wt% of triphenyl phosphite was added to the encapsulant as an anti-fading agent and stirred to obtain an anti-fading agent-containing encapsulant.
  • Encapsulant 1-7 Encapsulant containing dibenzyl disulfide
  • Enterant New (Merck) or Paramount N (Pharmacia) was used as the encapsulant.
  • 1 wt% of dibenzyl disulfide was added to the encapsulant as an anti-fading agent and stirred to obtain an anti-fading agent-containing encapsulant.
  • Encapsulant 1-8 Encapsulant containing 3,3′-thiodipropionate didodecyl
  • Enterant New Merck
  • Paramount N Paramount N
  • Encapsulant 1-9 Encapsulant containing DL- ⁇ -lipoic acid
  • Enterant New (Merck) or Paramount N (Pharmacia) was used as the encapsulant.
  • an anti-fading agent 1 wt% of DL- ⁇ -lipoic acid was added to the encapsulant and stirred to obtain an anti-fading agent-containing encapsulant.
  • Encapsulant 1-10 Encapsulant containing retinoic acid
  • Enterant New (Merck) or Paramount N (Pharmacia) was used as the encapsulant.
  • 1 wt% of retinoic acid was added as an anti-fading agent to the encapsulant and stirred to obtain an anti-fading-containing encapsulant.
  • Encapsulant 2-1 Encapsulant not containing anti-fading agent
  • Enterant New manufactured by Merck
  • Paramount N Puracia
  • Encapsulant 2-2 cyanidin-containing encapsulant 1 wt% of cyanidin was added to the encapsulant as an anti-fading agent and stirred to obtain an anti-fading agent-containing encapsulant.
  • Encapsulant 2-3 p-phenylazophenol-containing encapsulant
  • 1 wt% of p-phenylazophenol was added to the encapsulant and stirred to obtain an anti-fading agent-containing encapsulant.
  • Encapsulant 2-4 4-nitroaniline-containing encapsulant
  • Enterant New (Merck) or Paramount N (Pharmacia) was used as the encapsulant.
  • As the anti-fading agent 1 wt% of 4-nitroaniline was added to the encapsulant and stirred to obtain an anti-fading agent-containing encapsulant.
  • Encapsulant 2-5 Encapsulant containing lycopene
  • Enterant New (Merck) or Paramount N (Pharmacia) was used as the encapsulant.
  • an anti-fading agent 1 wt% of lycopene was added to the encapsulant and stirred to obtain an anti-fading agent-containing encapsulant.
  • Encapsulant 3-1 DABCO-containing aqueous encapsulant
  • Fluoromount manufactured by Cosmo Bio Inc .; aqueous encapsulant
  • 1 wt% of 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO) was added as an anti-fading agent to the encapsulant and stirred to obtain an anti-fading encapsulant.
  • DABCO 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane
  • ⁇ Tissue staining process> Immunostaining of human breast tissue was performed using fluorescent labels 1-13.
  • a tissue array slide (CB-A712) manufactured by Cosmo Bio was used. The tissue array slide was deparaffinized, washed with water, and autoclaved in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) for 15 minutes to activate the antigen. The tissue array slide after the antigen activation treatment was washed with a PBS buffer, and then subjected to a blocking treatment in a wet box for 1 hour using a PBS buffer containing 1% BSA.
  • biotinylated trastuzumab diluted to 0.05 nM with PBS buffer containing 1% BSA was reacted with the tissue section for 2 hours, and then washed. Furthermore, immunohistochemically stained sections were obtained by reacting with fluorescent labels 1 to 13 for 0.5 hours and then washing. The obtained immunohistochemically stained section was immersed in a 4% neutral paraformaldehyde aqueous buffer solution for 10 minutes for fixation.
  • HE staining was performed on the immunohistochemically stained section fixed above, and the section after staining was dehydrated by immersing in ethanol, and the dehydrated section was further immersed in xylene and air-dried to perform penetration. Double stained sections were obtained. In addition, even if HE dyeing is performed as morphological dyeing, there is no influence on the light resistance evaluation described later.
  • the excitation wavelength (nm) and the fluorescence wavelength (nm) were set by an optical filter, and Texas Red, perylene imide, and the nanoparticles included therein were set to an excitation wavelength of 575 to 600 nm and a fluorescence wavelength of 612 to 682 nm.
  • Fluorescein and its encapsulated nanoparticles were set to an excitation wavelength of 450 to 490 nm and a fluorescence wavelength of 500 to 550 nm.
  • CdSe and its encapsulated nanoparticles had an excitation wavelength of 345 to 395 nm and a fluorescence wavelength of 600 to 700 nm.
  • the excitation 575 ⁇ irradiation light intensity is 900 W / cm 2 of 600nm near the central portion of the visual field in the excitation 450 to the irradiation light intensity of 900 W / cm 2 near the central portion of the visual field in 490 nm
  • the irradiation light intensity near the center of the field of view was 500 W / cm 2
  • the irradiation light intensity near the center of the field of view was 500 W / cm 2
  • the irradiation light intensity near the center of the field of view was 500 W / cm 2 .
  • the irradiation light intensity is calculated by measuring the light energy value when the objective 40 ⁇ lens is mounted with a power meter 8230 manufactured by Advantest and dividing by the 40 ⁇ lens irradiation field area (about ⁇ 450 ⁇ m).
  • the exposure time at the time of image acquisition was arbitrarily set so that the luminance of the image was not saturated, and the image was acquired. For example, measurement was performed in 1000 milliseconds. The acquired image was not corrected and the luminance value was linear in the full range.
  • the brightness of each pixel is calculated from the acquired image using Image-J (US National Institutes of Health), which is image analysis software, and the average brightness (immunostaining part) of the site (immunostaining part) stained with the fluorescent label (Luminance) was calculated.
  • the average luminance corresponds to the signal value (S).
  • S signal value
  • the brightness is “0” as black (darkest) and “255” as white (brightest).
  • the luminance value is calculated and then divided by the maximum gradation value and multiplied by 255 so that the value can be compared with the value at 256 gradations.
  • the light resistance of the fluorescent label is evaluated by continuing to irradiate excitation light in a state where the visual field is not moved for 30 minutes. From both microscopic images immediately after irradiation (at the start of irradiation, 0 minutes) and after irradiation (30 minutes), an immunostained portion The luminance was obtained, and the luminance retention rate (%) expressed by (Expression: luminance after irradiation for 30 minutes / luminance immediately after irradiation ⁇ 100) was calculated.

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Abstract

　蛍光免疫染色標本において、油系封入剤を使用しても、蛍光染色性が低下しない染色方法を提供する。さらには、当該染色方法によって得られる蛍光免疫染色標本において、励起光の照射による蛍光標識体の劣化を防止し、耐光性能を向上させる方法を提供する。　本発明の生体物質検出方法は、病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法であって、蛍光標識体を用いた免疫染色工程と、切片の固定処理工程と、水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤を用いて切片を封入する封入処理工程とを有する生体物質検出方法である。さらには、前記封入剤が退色防止剤を含む生体物質検出方法である。

Description

生体物質検出方法
　本発明は生体物質検出方法に関し、特に蛍光標識体を用いて染色される組織染色に関する。
　医学的診断の１つとして、病理診断が行なわれている。病理医は人体から採取した組織片から病気を診断し、治療や手術の要不要を臨床医に伝える。患者の状態と病理診断によって、内科系医師は薬物治療方針を、外科系医師は手術を行うか否かを決定する。
　病理診断では、臓器摘出や針生検によって得た組織検体を厚さ数ミクロン程度に薄切して組織標本を作成し、様々な所見を得るために光学顕微鏡を用いて拡大観察することが広く行われている。多くの場合、標本は、採取した組織を固定するため脱水し、パラフィンブロック化した後、数μｍの厚さに薄切りし、パラフィンを取り除いて作製される。
　病理診断では、免疫染色と呼ばれる、標本の分子情報の発現を確認するための分子標的染色を施し、遺伝子やタンパクの発現異常といった機能異常を診断する免疫観察が行なわれている。免疫染色には、例えば、酵素を用いた色素染色法（ＤＡＢ染色等）が用いられる。ＤＡＢ染色は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質として発色させることのできるペルオキシダーゼで修飾された抗体を用いて、観察対象となる抗原を当該発色により染色して観察することで抗原量を測るものである。あるいは蛍光標識法が用いられることもある。蛍光標識法は、蛍光色素が修飾された抗体を用いて対象となる抗原を染色して観察することで抗原量を測るものである。
　また、標本は光を殆ど吸収および散乱せず無色透明に近いため、観察に先立って、形態観察のために、色素による染色を施されることがある。染色手法としては種々のものが提案されている。特に組織標本に関しては、標本の形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリンおよびエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が標準的に用いられている（非特許文献１、特許文献１～２）。ヘマトキシリン染色により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色され、エオジン染色により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色される。病理医は、染色された組織標本の顕微鏡画像の中で、細胞の核の大きさや形の変化、組織としてのパターンの変化などの形態学的な情報、染色情報、をもとに診断を行っている。なお、この他の形態観察染色としては、例えば細胞診に用いられるパパニコロウ染色（Ｐａｐ染色）等がある。一つの切片に対して形態染色と免疫染色の両方を行なうことにより、標本の形態観察と免疫観察を同時に行うこともできる。
　現在、免疫観察には多くの場合、ＤＡＢ染色が多く用いられている（特許文献３）。しかしながら、ＤＡＢ染色のような酵素標識による染色は、染色濃度が温度・時間などの環境条件により大きく左右されるため、染色濃度から実際の抗体等の量を見積もることが難しいという課題がある。そのため、病理診断における免疫観察では、酵素標識による染色の代わりに、蛍光標識体を用いる蛍光標識法も行なわれている。この方法はＤＡＢ染色と比べて定量性に優れるという特徴がある（非特許文献１）。
　蛍光標識体を用いた観察は共焦点レーザー顕微鏡や落射型蛍光顕微鏡により行なわれる。このような顕微鏡では高強度の励起光があたることになる。例えば、太陽電池の規格ＪＩＳ Ｃ ８９１４で見られるような通常の太陽光曝露試験条件である１０００Ｗ／ｍ2に対し、典型的な落射型蛍光顕微鏡では１００倍の照射光強度の光となる。
　励起光によって蛍光標識がダメージを受けて発光しなくなると、シグナルの低下を引き起こす。このため、蛍光標識体を用いた観察においては耐光性能が重要となる。
　蛍光標識体としては、蛍光色素や無機ナノ粒子（半導体ナノ粒子、量子ドット等と称されることもある）、それらの集積体の利用が知られている（非特許文献２～３、特許文献４）。蛍光色素や無機ナノ粒子と、それらの集積体では、集積体の方が耐光性能が向上することが報告されている（特許文献５）。従って、耐光性の観点から集積体の方がより好ましいが、蛍光顕微鏡観察において要求される耐光性能には、集積化だけでは十分ではない。なお、色素１個と集積体１個では１個あたりの輝度が集積体の方が高くなるので、シグナルの観点から、集積体の方がより好ましい。
　標本作製において、染色後の病理切片を封入するための封入剤としては、水系封入剤および油系封入剤が知られている。水系封入剤は標本との屈折率差が大きいために標本を透明としにくい、永久標本としにくい、という課題がある。一方、油系封入剤は標本との屈折率差が小さく標本を透明とできる、形態染色の色味や発色が良い、永久標本用として標準的に用いられている、という特徴がある。このため、油系封入剤の方が標本作製に好適に用いられる。
　したがって、免疫染色の標本の封入剤としても、永久標本を作製でき、また、形態染色との二重染色をする場合には、形態染色の色味や発色が良い油系封入剤を用いる方がより好ましいと考えられる。
　しかしながら、蛍光染色をおこなった標本を油系封入剤で封入すると、蛍光色素が封入剤中に溶出し、染色性が失われるという問題がある。そのため、蛍光標識体を用いずに染色する場合は油性封入剤を使用できるのに対し、蛍光標識体を用いて染色する場合は、上記問題点を有する水性封入剤を使用せざるを得ないという実情があった。
　加えて、蛍光標識体の観察には共焦点レーザー顕微鏡や蛍光顕微鏡が用いられる。これらの顕微鏡では、蛍光観察の際に高強度の励起光が染色した切片へとあたることになる。この励起光により、蛍光色素等を用いた蛍光標識体は徐々に劣化し、蛍光観察時や免疫染色結果の判定において大きな影響を及ぼす。蛍光標識体は劣化が無いことが理想的であり、耐光性能を向上させる必要がある。
　蛍光標識体の耐光性能を向上させるには、封入剤に退色防止剤を混合する方法が考えられる。水系封入剤においては、例えば、蛍光色素として４'，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を用いる場合、例えば、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）やプロロングゴールド（登録商標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ社製）等の退色防止剤を用いる事でＤＡＰＩの耐光性能の改善を図ることが行なわれている。しかしながら、蛍光標識の劣化の緩和はされるが、完全に抑制することはできないため、短時間に観察を行なう必要がある。
　しかし、油系封入剤を蛍光色素染色に用いることには、上述の問題点があるため、これまで、油系封入剤は蛍光色素染色に用いられてこなかった。そのため、油系封入剤に退色防止剤を混合し、蛍光染色において使用するという動機づけが生じることがなく、そのような試みはなされてこなかった。
特表２００１－５２５５８０号公報 特開２００９－１１５５９９号公報 特開２０１０－１３４１９５号公報 特開２０１０－２０９３１４号公報 特開２００８－１４７３９４号公報
「診断に役立つ免疫組織化学」、文光堂、2007年 「機能性色素の合成と応用技術」、シーエムシー出版、2007年 「量子ドットの生命科学領域への応用」、シーエムシー出版、2007年
　本発明の課題は、蛍光免疫染色標本において、油系封入剤を使用しても、蛍光染色性が低下しない染色方法を提供することである。さらには、当該染色方法によって得られる蛍光免疫染色標本において、励起光の照射による蛍光標識体の劣化を防止し、耐光性能を向上させる方法を提供することである。また、これらの方法の使用に用いられるキットを提供することである。
　本発明者らは、鋭意検討の結果、蛍光標識体を用いた染色において、蛍光標識体を結合させた後に固定処理を行うことで、油系封入剤による封入を行っても、蛍光染色性が低下しないことを見出した。さらに、その際に用いる油系封入剤に、退色防止剤を含有させることで、蛍光標識の耐光性能を大幅に向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の一側面では、上記の課題のうち少なくとも一つを実現するために、本発明は以下の事項を含む。
　[１] 病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法であって、蛍光標識体を用いた免疫染色工程と、切片の固定処理工程と、水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤を用いて切片を封入する封入処理工程とを有する生体物質検出方法。
　[２] 前記封入剤が退色防止剤を含む、項[１]に記載の生体物質検出方法。
　[３] 項［１］に記載の生体物質検出方法に用いるキットであって、
水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤と、
前記生体物質検出方法を記載した使用説明書と
を有する生体物質検出用キット。
　[４] 項［２］に記載の生体物質検出方法に用いるキットであって、
水と自由混和しない有機溶媒および退色防止剤を含む封入剤と、
前記生体物質検出方法を記載した使用説明書と
を有する生体物質検出用キット。
　[５] 項［１］に記載の生体物質検出方法に用いる病理切片であって、生体物質を特異的に検出するための蛍光標識体を用いた免疫染色処理、固定処理、および水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤を用いた封入処理がなされた病理切片。
　項［１］の生体物質検出方法によれば、蛍光標識体を用いた免疫染色において蛍光染色性が低下しない標本を作製することができ、かつ、永久標本を作製することができる。また、形態染色との二重染色をする場合には、形態染色の色味や発色が良い標本を作製することができる。
　項［２］の生体物質検出方法によれば、上記効果に加え、さらに、蛍光標識の耐光性能を向上させた標本を作製することができる。
　項［３］の生体物質検出用キットを用いれば、項［１］の方法で作製できる標本を得ることができる。
　項［４］の生体物質検出用キットを用いれば、項［２］の方法で作製できる標本を得ることができる。
　項［５］の切片は、項［１］の方法によって得られる、蛍光染色性が低下しない標本、かつ、永久標本であり、形態染色との二重染色をした場合には、形態染色の色味や発色が良い、蛍光標識体を用いた免疫染色標本である病理切片である。
　以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　本発明の典型的な実施形態にかかる生体物質検出方法は、病理切片から生体物質を特異的に検出する方法であり、基本的には、（１）蛍光標識体を用いて病理切片を免疫染色する工程と、（２）染色後の病理切片に励起光を照射して蛍光発光させ、その病理切片から生体物質を検出する工程と、を有している。本発明では、（１）の工程において、切片の固定処理工程および封入工程を含む。
　（１）の工程は、一般的な生体物質検出方法と同様に、脱パラフィン工程、賦活化処理工程などの工程を有していてもよい。
　さらに、（１）の工程の前後どちらかに、形態観察用の染色剤を用いて病理切片を形態観察染色する工程を含んでもいてもよい。こうすることで、蛍光標識体を用いた免疫染色と形態観察用の染色剤を用いた形態観察染色の同時染色を行なうことも可能とできる。
　本発明では特に、（１）の病理切片を免疫染色する工程において、蛍光標識体として、（Ａ）蛍光色素、（Ｂ）蛍光ナノ粒子、（Ｃ）蛍光色素内包ナノ粒子、（Ｄ）蛍光ナノ粒子内包粒子、を用いることができる。蛍光標識体の輝度が高い方が、ノイズであるエオジンの蛍光や細胞自家蛍光に対する信号値の比の観点から好ましい。従って、本発明の蛍光標識体としては、（Ａ）蛍光色素と比して輝度が高い、（Ｂ）蛍光ナノ粒子、（Ｃ）蛍光色素内包ナノ粒子、および、（Ｄ）蛍光ナノ粒子内包粒子がより好適に用いられる。また、耐光性能がより高いという観点から、集積体である（Ｃ）蛍光色素内包ナノ粒子および（Ｄ）蛍光ナノ粒子内包粒子が特に好適に用いられる。
　免疫染色用の蛍光標識体、免疫染色工程、形態観察用の染色剤、形態観察染工程の詳細は次のとおりである。
　〔免疫染色用の蛍光標識体〕
　本発明における免疫染色用の蛍光標識体は、免疫染色に用いる事ができるものであれば既存の如何なるものでも構わない。（Ａ）蛍光色素、（Ｂ）蛍光ナノ粒子、（Ｃ）蛍光色素内包ナノ粒子、（Ｄ）蛍光ナノ粒子内包粒子、のいずれであっても良い。
　〔（Ａ）蛍光色素〕
　本発明で用いる蛍光色素は既存の如何なるものを用いても構わない。公知の方法により入手または作製することができる。
　内包される蛍光色素は、例えば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子、等の中から選択することができる。あるいはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子等の中から選択することができる。このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。
　ローダミン系色素分子の具体例としては、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン　６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、テキサスレッド、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ、ＬＤ７００ ＰＥＲＣＨＬＯＲＡＴＥ、などが挙げられる。
　スクアリリウム系色素分子の具体例としては、ＳＲｆｌｕｏｒ ６８０－Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、１，３－Ｂｉｓ［４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ　ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，　ｂｉｓ、１，３－Ｂｉｓ［４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ　ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，　ｂｉｓ、２－（４－（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－（ｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ－２，５－ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、２－（４－（Ｄｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－（ｄｉｂｕｔｙｌｉｍｉｎｉｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ－２，５－ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、２－（８－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１，１，７，７－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－１，２，３，５，６，７－ｈｅｘａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｏ［３，２，１－ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－９－ｙｌ）－４－（８－ｈｙｄｒｏｘｙ－１，１，７，７－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２，３，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｉｄｏ［３，２，１－ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ－９（５Ｈ）－ｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、などが挙げられる。
　シアニン系色素分子の具体例としては、１－Ｂｕｔｙｌ－２－［５－（１－ｂｕｔｙｌ－１，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２Ｈ－ｉｎｄｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）－ｐｅｎｔａ－１，３－ｄｉｅｎｙｌ］－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－３ｅｉｔｉ－ｉｎｄｏｌｉｕｍ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１－Ｂｕｔｙｌ－２－［５－（１－ｂｕｔｙｌ－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｉｎｄｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｃｈｌｏｒｏ－ｐｅｎｔａ－１，３－ｄｉｅｎｙｌ］－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－３Ｈ－ｉｎｄｏｌｉｕｍ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３－Ｅｔｈｙｌ－２－［５－（３－ｅｔｈｙｌ－３Ｈ－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）－ｐｅｎｔａ－１，３－ｄｉｅｎｙｌ］－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－３－ｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ、などが挙げられる。
　芳香環系色素分子の具体例としては、Ｎ, Ｎ－Ｂｉｓ－（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，６，７，１２－（４－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）－ｐｅｒｙｌｅｎ－３，４，９，１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｎａｃｉｄ ｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ,Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，６，７，１２－ｔｅｔｒａｐｈｅｎｏｘｙｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４：９，１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ，Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４，９，１０－ｂｉｓ（ｄｉｃａｒｂｉｍｉｄｅ）、１６，Ｎ,Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３,４,９,１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｄｉｉｍｉｄｅ、４，４'－[（８，１６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－８,１６－ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－２,１０－ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｂｕｔｙｒｉc  ａｃｉｄ、２，１０－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－８,１６－ｄｉｏｎｅ、２，１０－Ｂｉｓ（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ）ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－８,１６－ｄｉｏｎｅ, ３，３'－[（８，１６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－８,１６－ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎ－２,１０－ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ、１７－ＢＩＳ（Ｏｃｔｙｌｏｘｙ）Ａｎｔｈｒａ［９，１，２－ｃｄｅ－］Ｂｅｎｚｏ［ＲＳＴ］Ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ－５－１０－Ｄｉｏｎｅ、Ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄ, ５，１０－ｄｉｈｙｄｒｏ－５,１０－ｄｉｏｘｏａｎｔｈｒａ[９，１，２－ｃｄｅ]ｂｅｎｚｏ[ｒｓｔ]ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ－１６,１７－ｄｉｙｌｅｓｔｅｒ、Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚａｎｔｈｒｏｎｅ、Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ, ４，４'，４''，４'''－[[２，９－ｂｉｓ[２，６－ｂｉｓ(１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ]－１,２,３,８,９,１０－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１,３,８,１０－ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９－ｄｅｆ：６，５，１０－ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－５，６，１２，１３－ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ-，Ｂｅｎｚｅｎｅｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ、 ４，４'，４''，４'''－［［２，９－ｂｉｓ［２，６－ｂｉｓ（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１,２,３,８,９,１０－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１,３,８,１０－ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９－ｄｅｆ：６，５，１０－ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－５，６，１２，１３－ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ[Ｎ,Ｎ,Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－］、などが挙げられる。
　オキサジン系色素分子の具体例としては、Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ、Ｏｘａｚｉｎｅ１７０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、Ｎｉｌｅ Ｂｌｕｅなどが挙げられる。
　カルボピロニン系色素分子の具体例としては、ＣＡＲＢＯＰＹＲＯＮＩＮ　１４９などが挙げられる。
　ピロメセン系色素分子の具体例としては、ＰＹＲＲＯＭＥＴＨＥＮＥ６５０などが挙げられる。
　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ系色素分子の具体例としては、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６１０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３３、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６６０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６８０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７５０など（以上インビトロジェン社製）が挙げられる。
　ＢＯＤＩＰＹ系色素分子の具体例としては、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ　４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ　５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ　５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ　５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ　５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ　５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ　６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ　６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）などが挙げられる。
　Ｃｙ系色素分子の具体例としては、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（以上ＧＥヘルスケア社製）などが挙げられる。
　ＤＹ系色素分子の具体例としては、ＤＹ－５９０、ＤＹ－６１０、ＤＹ－６１５、ＤＹ－６３０、ＤＹ－６３１、ＤＹ－６３２、ＤＹ－６３３、ＤＹ－６３４（以上ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、などが挙げられる。
　ＨｉＬｙｔｅ系色素分子の具体例としては、ＨｉＬｙｔｅ５９４、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ ＴＲ（以上アナスペック社製）などが挙げられる。
　ＤｙＬｉｇｈｔ系色素分子の具体例としては、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ６３３（以上サーモサイエンティフィック社製）などが挙げられる。
　ＡＴＴＯ系色素分子の具体例としては、ＡＴＴＯ５９０、ＡＴＴＯ６１０、ＡＴＴＯ６２０、ＡＴＴＯ６３３、ＡＴＴＯ６５５など（以上ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）が挙げられる。
　ＭＦＰ系色素分子の具体例としては、ＭＦＰ５９０、ＭＦＰ６３１（以上Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）などが挙げられる。
　その他色素としては、Ｃ－Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＡＰＣ－ＸＬ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ６３７（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、等が挙げられる。
　また、これらの誘導体（蛍光色素として機能しうるもの、例えば、公知の誘導体）を挙げることができる。
　〔（Ｂ）蛍光ナノ粒子〕
　本発明で用いられる蛍光ナノ粒子とは、粒子サイズが１～５００ｎｍのものであり、好ましくは１０～２００ｎｍである。
　蛍光ナノ粒子は半導体または蛍光体から構成される。
　半導体は例えばＩＩ－ＶＩ族半導体であるＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＰｂＴｅ等やＩＩ－ＶＩ族半導体であるＡｌＡｓ、ＡｌＳｂ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ等を用いることができ、毒性の観点から、ＧａＰやＩｎＰを好適に用いることができる。
　蛍光体は、例えば母体にＹ2Ｏ3やＹＶＯ4、ＺｎＯ、ＺｎＳ等を用い、発光中心にＥｕやＮｄ等を用いることができる。
　蛍光ナノ粒子の粒子サイズ、母体組成、不純物量を調整することで観察に適した励起波長とする。
　〔（Ｃ）蛍光色素内包ナノ粒子〕
　ノイズであるエオジンの蛍光や細胞自家蛍光に対する信号値の比の観点から、蛍光標識体の輝度は高い方が好ましい。従って、本発明における蛍光標識体としては、蛍光色素と比して輝度が高い、蛍光色素内包ナノ粒子がより好適に用いられる。
　蛍光色素内包ナノ粒子とは、有機物または無機物でできた粒子（母体）中に複数の蛍光色素が内包された構造を有するナノサイズの粒子である。本発明で用いる蛍光色素内包ナノ粒子は、適切な蛍光色素および粒子を形成する有機物または無機物を原料として選択した上で、公知の方法により作製することができる。
　粒子を形成する有機物または無機物としては、例えば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、ポリグリシジルメタクリレート、ポリメラミン、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリフラン、ポリキシレン、フェノール樹脂、多糖、シリカ等、安定的に蛍光色素を内包できるものが挙げられる。蛍光色素をこのような粒子中に内包させることにより、蛍光色素単独よりも励起光の照射による劣化の起こりにくい（耐光性が強い）。
　内包される蛍光色素は、前記（Ａ）蛍光色素の項目で挙げた蛍光色素を用いることができる。また、それらの誘導体（蛍光色素として機能しうるもの、例えば、公知の誘導体）を挙げることができる。
　以上のような蛍光色素は、蛍光色素内包ナノ粒子中に、いずれか一種を単独で内包させるようにしても、複数種を混合して内包させるようにしてもよい。
　たとえば、芳香環系色素分子、ローダミン系色素分子などの蛍光色素は比較的耐光性が高いため好ましく、なかでも芳香環系色素分子に属するペリレン（ｐｅｒｙｌｅｎｅ）、特にペリレンジイミド（ｐｅｒｙｌｅｎｅ　ｄｉｉｍｉｄｅ）が好ましい。一方、比較的耐光性の低い蛍光色素であっても、適切な母体を選択することにより、本発明による所定の輝度保持率の条件を満たす蛍光色素内包ナノ粒子を作製できる可能性がある。
　蛍光色素内包ナノ粒子の製造方法は特に限定されるものではない。粒子原料であるモノマーに色素分子を結合させて粒子を合成する方法、粒子に色素を吸着させて導入する方法等、粒子への色素の導入にはいかなる方法を用いても構わない。
　蛍光色素内包ナノ粒子の平均粒径は特に限定されないが、通常１０～５００ｎｍであり、好ましくは５０～２００ｎｍである。また、粒径のばらつきを示す変動係数も特に限定されないが、通常は２０％以下であり、好ましくは５～１５％である。なお、蛍光色素内包ナノ粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し、蛍光色素内包ナノ粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定することができる。蛍光色素内包ナノ粒子の集団の粒子サイズの平均（平均粒径）および変動係数は、十分な数（たとえば１０００個）の蛍光色素内包ナノ粒子について上記のようにして粒子サイズ（粒径）を測定した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径、により算出される。
　〔（Ｄ）蛍光ナノ粒子内包粒子〕
　本発明で用いられる蛍光ナノ粒子内包粒子とは、有機物または無機物でできた粒子に対し、上記（Ｂ）で説明した蛍光ナノ粒子が内包されてなるものである。蛍光ナノ粒子は、蛍光色素内包ナノ粒子中に、いずれか一種を単独で内包させるようにしても、複数種を混合して内包させるようにしてもよい。
　蛍光色素内包ナノ粒子の製造方法は特に限定されるものではない。粒子原料であるモノマーに蛍光ナノ粒子を結合させて粒子を合成する方法、粒子に蛍光ナノ粒子を吸着させて導入する方法等、粒子への蛍光ナノ粒子の導入はいかなる方法を用いても構わない。内包される蛍光ナノ粒子の粒子サイズ、母体組成、不純物量を調整することで観察に適した励起波長とする。
　蛍光ナノ粒子内包粒子のサイズは１０～５００ｎｍのものであり、好ましくは５０～２００ｎｍである。
　〔形態観察染色工程〕
　本発明においては、形態観察染色を行うことができる。形態観察染色工程では、特に組織標本の形態を観察する場合、前述したようなヘマトキシリンおよびエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が標準的に用いられるが、本発明における形態観察染色はこれに限定されるものではない。他の形態観察染色としては、例えば細胞診に用いられるパパニコロウ染色（Ｐａｐ染色）等がある。
　ＨＥ染色では、ヘマトキシリン染色により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色され、エオジン染色により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色される。他の形態観察染色において、ヘマトキシリン類縁体やヘマトキシリンと同様の吸収波長を持つ色素により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色され、エオジン類縁体やエオジンと類似の吸収波長、発光波長を持つ色素により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色されてもよい。
　〔免疫染色工程〕
　本発明における免疫染色の方法としては、前述したような免疫染色用の蛍光標識体で検出の対象とする生体物質を染色する、蛍光染色法が用いられる。
　例えば、特定の抗原に対して免疫染色を行う際には、蛍光標識体と１次抗体を直接結合した標識（コンジュゲート）を作製し、抗原を染色する方法（１次抗体法）、蛍光標識体と２次抗体を直接結合した標識を作製し、抗原に１次抗体を結合したものを染色する方法（２次抗体法）、蛍光標識体とビオチンを直接結合した標識を作製し、抗原に１次抗体とアビジンあるいはストレプトアビジン修飾した２次抗体を結合したものを染色する方法（ビオチン－アビジン法またはサンドイッチ法）等を用いることができる。
　免疫染色に用いる１次抗体はいかなるものでも構わず、免疫染色を行ないたい対象によって変わる。例えばＨＥＲ２を抗原とする免疫染色を行なう場合には、抗ＨＥＲ２抗体を用いる。また、２次抗体は如何なるものを用いても構わず、１次抗体によって変わる。例えば抗マウス・ラビット・牛・ヤギ・羊・犬・チキン抗体が挙げられる。
　蛍光標識体と抗体やビオチンの結合は既存の如何なる方法を用いても構わない。例えば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化等を用いることができる。
　なお、上記の免疫染色は、組織染色に限定されるものではなく、細胞染色に適用することも可能である。また、検出の対象とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではない。典型的には、上記のように抗原および抗体の組み合わせが用いられるが、例えば、核酸分子（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）およびそれに相補的に結合しうる配列を有する核酸分子の組み合わせを用いることも可能である。
　〔固定処理工程〕
　本発明の染色方法において行われる固定処理工程は、上記免疫染色工程により導入された蛍光標識体を、生体物質もしくは生体物質に結合した抗体等に固定化する工程である。固定化処理液で処理する事で、タンパク質の架橋や変性を行ない、蛍光標識体と生体物質もしくは生体物質に結合した抗体等とを、化学的、物理的により強固に結合し、安定した状態とできる。本発明において固定処理は、固定処理溶液に組織化学染色工程により得られた染色組織切片を浸漬することにより行うことができる。例えば、希パラホルムアルデヒド水溶液中に、組織化学染色工程により得られた染色組織切片を数分から数時間程度浸漬することにより行うことができる。
　本発明で用いられる固定処理溶液として、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤、細胞膜透過物質等が挙げられる。この中では、強固に固定ができることから、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドが好ましく用いられる。
　〔封入工程〕
　封入工程は、組織切片の有機溶媒による脱水・透徹工程と、油系封入剤による封入工程とからなる。脱水・透徹工程は、染色した組織切片をＰＢＳ等の水系洗浄液で洗浄後、ＥｔＯＨ（ethanol）による脱水およびキシレン置換により行なわれる。ＥｔＯＨによる脱水は、ＥｔＯＨの水含有率を、例えば、５０％、３０％、１０％、０％というように水含有率を下げたＥｔＯＨに、組織切片を順次漬けていき、ＥｔＯＨに置換することで行なわれる。ＥｔＯＨ置換した切片をキシレンに漬ける事で、キシレン置換が行なわれ、切片が透徹される。キシレン置換した切片に油系封入剤を載せ、カバーガラス等を載せる事で封入が行なわれる。
　〔封入剤〕
　封入剤は、溶媒（封入溶媒）と樹脂とから構成される。本発明の封入剤には、油系封入剤（一般的に非水溶性封入剤と呼ばれることもある。）を用いる。油系封入剤とは、水と自由混和しない溶媒を含む封入剤をいう。
　ここで、水と自由混和しないとは、水に対して体積で１５%以下の溶解度であるこという。
　また、本発明の封入剤は、退色防止剤を含むことができる。これを退色防止剤含有封入剤という。
　封入剤は市販の油系封入剤でも自家で調製してもよい。市販の油系封入剤としては例えばＤＰＸ（シグマアルドリッチ社製。主成分：ポリスチレンポリマー約２１．８％、キシレン約６９．７％）、エンテランニュー（登録商標、メルク社製。主成分：アクリル樹脂、キシレン約６０％）、パラマウントＮ（登録商標、ファルマ社製。主成分：アクリル樹脂、脂肪族炭化水素）を挙げることができる。市販の油系封入剤には、製品をそのままの状態で使用できるものと、製品（原液）を所定の溶媒で希釈した後に使用するものがある。また、カナダバルサムなどのような天然樹脂や、ポリスチレンやポリメタクリル酸メチルなどのような合成樹脂を封入溶媒に溶かすことにより、自家で油系封入剤を調製することができる。
　〈封入溶媒〉
　本発明では、封入溶媒として、水と自由混和しない有機溶媒を含む溶媒を用いる。上記市販の油系封入剤に含まれている溶媒、市販の油系封入剤を希釈するための所定の溶媒、自家で油系封入剤を調製するために用いた溶媒などが上記封入溶媒に相当する。
　水と自由混和しない有機溶媒としては、芳香族炭化水素、不飽和炭化水素、カルボニルを含む化合物（ケトン）、エステル、エーテル、アルコールの中から、そのようなものを選択して用いる事ができる。
　このうち、芳香族炭化水素としては、ベンゼン、トルエン、キシレン等を用いる事ができる。不飽和炭化水素としては、リモネン、ピネン等を用いる事ができる。ケトンとしては、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン等を用いる事ができる。エステル系としては、酢酸ブチル等を用いる事ができる。エーテルとしては、アニソール、１, ４－ジ（２－ヒドロキシエトキシ）ベンゼン、エチレングリコールモノフェニルエーテル等を用いる事ができる。アルコールとしては、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール等を用いる事ができる。特に、キシレン、トルエンおよびリモネンが、入手の容易さ、切片と近い１．５程度の屈折率、作業に適した数十分程度の乾燥速度、の点から好ましい。
　水と自由混和しない有機溶媒は、いずれか一種を単独で用いても、複数種を混合して用いてもよい。
　また、封入溶媒は、水と自由混和しない有機溶媒のみからなるものであってもよいし、必要に応じて、本発明の作用効果を阻害しない範囲で、水と自由混和しない有機溶媒とともに、水および／または水と自由混和する有機溶媒を含むものであってもよい。水と自由混和しない封入剤における、封入溶媒中の、水と自由混和しない溶媒の割合（体積％）は、通常５０～１００％であり、好ましくは７０～１００％であり、より好ましくは９０～１００％である。この範囲で規定された、水と自由混和しない溶媒を含む封入剤は、標本との屈折率差が小さく標本を透明とできる、形態染色の色味や発色が良い、永久標本を作成やすい、より脱水した条件とできるため、標本作製時の水の混入を防止しやすい、標本作製時の乾燥が均一にできる、という観点から好ましい。
　〈樹脂〉
　封入剤に含まれる樹脂は、封入剤の溶媒分が蒸発した後、固形分として残るので、観察に影響を与えないようなものが適切である。従って、ガラスに近い屈折率で透明性が高いものが適切である。また、着色や蛍光は蛍光顕微鏡観察に悪影響を与えるので無い方が良い。本発明に用いる樹脂としては、上記条件を満たすものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、カナダバルサムなどのような天然樹脂や、ポリスチレンやポリメタクリル酸メチルなどのような合成樹脂が挙げられる。
　〔退色防止剤〕
　退色防止剤としては、フェノール系、アミン系、リン系、硫黄系および不飽和炭化水素系の退色防止剤の中から、水と自由混和しない溶媒を含む封入溶媒への溶解性に問題がないものを選択して用いることができる。
　フェノール系の退色防止剤としては、ルチン、カテキン、ヘスペリジン、メチルヘスペリジン、ミリシトリン、クエルセチン、モリン、フィセチン、ナリンゲニン、ナリンギン、ヘスペリジン、タキシフォリン、アピゲニン、ゲオスミン、ルテオリン、シアニジン、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、タンニン、トコフェロール、トコトリエノール、のような天然物由来のフェノール類、ｐ－フェニルアゾフェノール、４－ニトロアニリン、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－ヒドロキシメチルフェノール、Ｎ,Ｎ'－ジサリチルアル－１，２－プロパンジアミン、トリエチレングリコール-ビス[３－(３－ｔ－ブチル－５－メチル－４－ヒドロキシフェニル)プロピオネート]、１，６－ヘキサンジオール-ビス[３－（３，５－ジ－ｔ－ブチル－４－ヒドロキシフェニル)プロピオネート]、２，４－ビス－(ｎ－オクチルチオ)－６－(４－ヒドロキシ－３,５－ジ－ｔ－ブチルアニリノ)－１,３,５－トリアジン、ペンタエリスリチル・テトラキス[３－（３，５－ジ－ｔ－ブチル－４－ヒドロキシフェニル)プロピオネート]、２, ２－チオ-ジエチレンビス[３－（３，５－ジ－ｔ－ブチル－４－ヒドロキシフェニル)プロピオネート]、オクタデシル－３－(３，５－ジ－ｔ－ブチル－４－ヒドロキシフェニル)プロピオネート、Ｎ,Ｎ'－ヘキサメチレンビス(３，５－ジ－ｔ－ブチル－４－ヒドロキシ-ヒドロシンナマミド)、３，５－ジ－ｔ－ブチル－４－ヒドロキシベンジルフォスフォネート-ジエチルエステル、１，３，５－トリメチル－２,４,６－トリス(３，５－ジ－ｔ－ブチル－４－ヒドロキシベンジル)ベンゼン、トリス－（３，５－ジ－ｔ－ブチル－４－ヒドロキシベンジル)-イソシアヌレイト、オクチル化ジフェニルアミン、２, ４,－ビス[(オクチルチオ)メチル]－Ｏ－クレゾール、イソオクチル－３－（３，５－ジ－ｔ－ブチル－４－ヒドロキシフェニル)プロピオネート、１，３，５－トリス（４－ｔ－ブチル－３－ヒドロキシ－２，６－ジメチルベンジル）イソシアヌル酸のようなヒンダードフェノール類等を用いることができる。
　アミン系の退色防止剤としては、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）等の３級アミンや、フェノチアジン、セバシン酸ビス（２，２，６，６－テトラメチル－４－ピペリジル）、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン等の２級アミン、カフェインのようなアルカロイド、を用いることができる。
　リン系の退色防止剤としては、２－メルカプトベンゾイミダゾール、亜リン酸トリフェニル、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ ＨＣｌ）、ジイソデシルペンタエリスリトールジホスファイト、９，１０-ジヒドロ-9-オキサ-10-ホスファフェナントレン１０-オキシド等を用いることができる。
　硫黄系の退色防止剤としては、３，３－チオジプロピオン酸ジドデシル、２，２'－チオジエタノール等のスルフィドや、ジベンジルジスルフィド、ＤＬ－αリポ酸（チオクト酸）、３，６－ジチア－１,８－オクタンジオール等のジスルフィド、ジチオスレイトールやオクタンジオール等のチオールを用いることができる。
　不飽和炭化水素系では、ルテイン、リコピン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、ミキソキサントフィル、ゼアキサンチン、カロテン、レチノイン酸等のカロテン類やカロテノイド類、キサントフィル類、アスコルビン酸、トコトリエノール、不飽和脂肪酸類等を用いる事ができる。
　前記退色防止剤は、フェノールおよびアミンからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。これらの退色防止剤は、蛍光標識の光退色の原因となる活性酸素による酸化を防止することにより、光退色をより効果的に防止することができる。
　退色防止剤は、いずれか一種を単独で用いても、複数種を混合して用いてもよい。
　これら退色防止剤は、蛍光顕微鏡観察に悪影響が無いよう、吸収波長４５０～６００ｎｍで吸収が無いことが好ましく、発光波長５００～７００ｎｍで発光が無いことが好ましい。吸収があると蛍光標識の輝度低下につながる。また、発光があると蛍光顕微鏡観察時にノイズが増加する。なお、退色防止剤吸収の吸収が無いとは、退色防止剤の１ｍｇ／ｍＬ濃度のキシレン溶液を調整し、１０ｍｍセルに入れて吸光度測定を行なった際に、４５０ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度がともに０．５以下であることをいう。
　本発明において、蛍光色素の輝度の低下を避ける観点から、上記退色防止剤を含む封入剤を用いて作製した切片スライドは透明であることが好ましい。「透明」とは、作製した切片スライドについて、４５０～６００ｎｍの吸光度測定をしたときに、４５０ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度がともに０．１以下であることをいう。
　〔蛍光観察工程〕
　上記工程により免疫染色および形態観察染色が施された病理切片に、用いられている蛍光標識体に応じた適切な波長を有する励起光を照射することにより、その蛍光標識体が発する蛍光を観察する。このような工程により、その病理切片内に存在する所定の生体分子を検出することができ、例えば、抗体医薬（例えば、ＨＥＲ２を標的とするハーセプチン等）の適用の適否を判定するための情報として利用することができる。
　励起光の照射には、一般的な蛍光観察と同様の照射手段を用いればよく、例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザー光源から、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルターを用いて、適切な波長および出力の励起光を染色された病理切片に照射すればよい。
　蛍光の観察は、蛍光顕微鏡の鏡筒から行ってもよいし、蛍光顕微鏡に設置されたカメラが撮影した画像を別途表示手段（モニタ等）に表示して行ってもよい。蛍光物質によるが、蛍光顕微鏡の鏡筒からの目視によっては十分に蛍光を観察することができない場合であっても、カメラによる画像の撮影を通じて蛍光を観察することが可能な場合もある。必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルターを用いてもよい。
　なお、本発明においては同一の病理切片に対して免疫染色および形態観察染色の両方が施されている場合があるが、形態観察染色による像を観察する際には、免疫染色用の蛍光標識体を励起させるための励起光を照射する必要はなく、光学顕微鏡と同様の観察条件下で観察すればよい。
　そのため、蛍光観察は任意の時間、励起光を照射した後に行うことができるが、通常の照射条件下（照射エネルギー等）において、好ましくは励起光開始から９０分以内、より好ましくは励起光開始から３０分以内に行うようにする。
　蛍光顕微鏡による観察の前後では、蛍光標識の輝度は変化しないことが望ましい。本発明においては、一般的な蛍光顕微鏡の絞り全開４０倍の観察条件で、３０分間光照射後の輝度が、照射前の７０％を維持する。この輝度低下の範囲では蛍光免疫染色の観察において、一定の信頼性のある生体物質検出方法とみなして運用することが可能である。
　〔キット〕
　本発明の生体物質検出用キットは、上記工程を含む本発明の生体物質検出方法に使用されるものである。本発明の生体物質検出用キットは、上記水と自由混和しない溶媒を含む封入剤、または、上記水と自由混和しない溶媒ならびに退色防止剤を含む封入剤を有するものであり、さらに、本発明に係る生体物質検出方法が指示として記載された使用説明書、免疫染色用の蛍光標識体および蛍光標識化試薬を有することができる。
　キットに含まれる免疫染色用の蛍光標識体としては、上記〔免疫染色用の蛍光標識体〕の項に記載された蛍光標識体から選択することができる。蛍光標識化試薬としては、上記〔免疫染色工程〕の項に記載した物質、例えば1次抗体、２次抗体等を選択することができる。封入剤は、上記〔封入剤〕の項に記載されている封入剤であり、その封入剤を構成する溶媒および樹脂は、上記〈封入溶媒〉および〈樹脂〉の項にそれぞれ記載した溶媒および樹脂から選択することができる。退色防止剤としては、上記〔退色防止剤〕の項に記載した退色防止剤から選択することができる。
　〈使用説明書〉
　キットに含まれる使用説明書は、本発明の方法を実施するために、本発明に係る生体物質検出方法のいずれかが、指示として記載された使用説明書である。使用説明書の具体的態様は上記情報を適切に伝達できるものであればよい。例えば、紙片、キットの包装、キットの構成物のラベル等に印刷されているものでよく、ディスケット、ＣＤ等コンピューターで読み取り可能な媒体中に記録されているものでもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　＜蛍光標識の作製＞
　蛍光標識は、すべてストレプトアビジン結合体として作製した。
　（蛍光標識１：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素）
　蛍光色素としてＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１ ａｃｉｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（同仁化学社製、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素）を用いた。蛍光色素へのストレプトアビジン結合は、以下のようにおこなった。
　Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素に、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－［（Ｎ－ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）－ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付いた蛍光色素内包ナノ粒子を得た。（単位Ｍはモル濃度ｍｏｌ／Ｌを表す。）
　一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をＮ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）にてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、色素内包ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
　上記のＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素を得た。
　（蛍光標識２：ペリレン色素）
　蛍光色素として用いたペリレンジイミドは次の方法で準備した。Ｎ,Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１,６,７,１２－ｔｅｔｒａｐｈｅｎｏｘｙｐｅｒｙｌｅｎｅ－３,４：９，１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅを濃硫酸で処理し、ペリレンジイミドスルホン酸誘導体を作製した。これを酸クロリドに変換してペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体とした。これを用いた以外は蛍光色素１の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合色素を得た。
　（蛍光標識３：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包メラミンナノ粒子）
　ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）２．５ｍｇを水２２．５ｍLに加えた後、ホットスターラ―上で７０℃２０分間加熱し、メラミン樹脂ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）１．５ｇを加え、さらに５分間加熱撹拌した。ギ酸１００μＬを加え、６０℃２０分間で加熱攪拌した後、室温放冷した。冷却後、反応混合物を遠心用チューブに入れて遠心分離機に１２，０００ｒｐｍで２０分間かけ、上澄み除去した。この洗浄をエタノールと水で行なった。
　得られた粒子０．１ｍｇをＥｔＯＨ１．５ｍＬ中に分散し、アミンプロピルトリメトキシシランＬＳ－３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。
　得られた色素内包ナノ粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－［（Ｎ－ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）－ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付いた蛍光色素内包ナノ粒子を得た。
　一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をＮ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、色素内包ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
　上記の蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包メラミンナノ粒子を得た。
　（蛍光標識４：ペリレン色素内包メラミンナノ粒子）
　蛍光色素として上記色素２に記載のペリレンジイミドスルホン酸誘導体を用いた。
　それ以外は上記蛍光色素３の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合ペリレン色素内包メラミンナノ粒子を得た。
　（蛍光標識５：ＦＩＴＣ色素内包メラミンナノ粒子）
　蛍光色素としてフルオレセインイソチオシアネート（同仁化学社製、ＦＩＴＣ）を用いた。それ以外は上記蛍光色素３の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合ＦＩＴＣ色素内包メラミンナノ粒子を得た。
　（蛍光標識６：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子）
　蛍光標識１で用いたＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素３．４ｍｇと３－アミノプロピルトリメトキシシラン（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ、信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬとをＤＭＦ中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物０．６ｍＬを、４８ｍＬのエタノール、０．６ｍＬのＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）、２ｍＬの水、２ｍＬの２８％アンモニア水と３時間混合した。上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を２回ずつ行なった。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子を得た。
　得られた色素内包ナノ粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－［（Ｎ－ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）－ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付いた蛍光色素内包ナノ粒子を得た。
　一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をＮ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、色素内包ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
　上記の蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子を得た。
　（蛍光標識７：ペリレン色素内包シリカナノ粒子）
　蛍光色素として蛍光標識２で用いたペリレンジイミドを用いた。それ以外は上記蛍光色素６の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合ペリレン色素内包シリカナノ粒子を得た。
　（蛍光標識８：ＦＩＴＣ色素内包シリカ内包ナノ粒子）
　蛍光色素として蛍光色素３で用いたＦＩＴＣを用いた。それ以外は上記蛍光色素６の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合ペリレン色素内包シリカナノ粒子を得た。
　（蛍光標識９：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包ポリスチレンナノ粒子）
　Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ色素内包ポリスチレン粒子はソープフリー乳化重合法により作製した。蛍光色素Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１０１　ａｃｉｄ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ（同仁社製、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素）を４－アミノスチレン（東京化成工業社製）と室温条件で１時間混合し、色素結合スチレンを作製した。アルゴンバブリングした純水中５ｍＬにグリシジルメタクリレート(東京化成工業社製)０．１８ｇとスチレン（和光純薬社製）０．０５ｇ、ジビニルベンゼン０．０５ｇ、上記色素結合スチレン０．００５ｇを加えた。撹拌しながら７０℃に昇温し、水溶性アゾ重合開始剤であるＶ－５０（和光純薬社性）を０．０１２ｇ加え、１２時間反応した。反応液を１００００Ｇで２０分遠心分離し、粒子を回収した。回収した粒子を純水に分散し再度遠心分離で回収する事で精製を行なった。得られた粒子を過剰のアンモニア水に加え、粒子末端のエポキシ基をアミノ基へと変換し、末端にアミノ基を持つ色素内包ポリスチレンナノ粒子を得た。
　得られた色素内包ナノ粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－［（Ｎ－ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）－ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付いた蛍光色素内包ナノ粒子を得た。
　一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をＮ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、色素内包ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
　上記の蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包ポリスチレンナノ粒子を得た。
　（蛍光標識１０：ペリレン色素内包ポリスチレンナノ粒子）
　蛍光色素として蛍光標識２で用いたペリレンジイミドを用いた。それ以外は上記蛍光色素９の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合ペリレン色素内包シリカナノ粒子を得た。
　（蛍光標識１１：ＦＩＴＣ色素内包ポリスチレンナノ粒子）
　蛍光色素として蛍光色素３で用いたＦＩＴＣを用いた。それ以外は上記蛍光色素９の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合ペリレン色素内包シリカナノ粒子を得た。
　（蛍光標識１２：ＣｄＳｅ）
　蛍光ナノ粒子として、カルボン酸末端のＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社：Ｑｄｏｔ６０５）を用いた。これをＥＤＴＡ（サーモサイエンス社製）で活性化させた後、蛍光標識１の方法と同様にしてストレプトアビジンと結合させ、ストレプトアビジン結合蛍光ナノ粒子を得た。
　（蛍光標識１３：ＣｄＳｅ内包ナノ粒子）
　ＣｄＳｅ／ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社：Ｑｄｏｔ６０５）１０μＬにＴＥＯＳ０．１ｍｇ、エタノール０．０１ｍＬ、濃アンモニア水０．０３ｍＬを加え３時間攪拌して加水分解を行った。得られた混合液を１０，０００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を２回ずつ行い、ＣｄＳｅ内包ナノ粒子６０ｍｇを得た。
　得られたＣｄＳｅ内包ナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１０８ｎｍ、変動係数は１４％であった。
　得られたＣｄＳｅ内包ナノ粒子は、蛍光色素３との方法と同様に、表面アミノ化、ＰＥＧ化、ストレプトアビジン修飾を行ない、ストレプトアビジン結合ＣｄＳｅ内包ナノ粒子を得た。
　使用した蛍光標識の一覧を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜封入剤の作製＞
　封入剤として、以下に示す封入剤１－１～１－１０、２－１～２－５および３－１を準備した。
　［退色防止剤含有封入剤］
　（封入剤１－１：ルチン含有封入剤）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製。主成分：アクリル樹脂、キシレン約６０％）またはパラマウントＮ（ファルマ社。主成分：アクリル樹脂、脂肪族炭化水素）を用いた。エンテランニュー、パラマウントＮは、購入したものをそのまま希釈せずに用いた。
　封入剤に対して退色防止剤として、ルチンを１重量％（以下「ｗｔ％」と略記する。）添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤１－２：2,6-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシメチルフェノール含有封入剤）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、2,6-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシメチルフェノールを１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤１－３：セバシン酸ビス(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル)含有封入剤）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、セバシン酸ビス(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル)を１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤１－４：フェノチアジン含有封入剤）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、フェノチアジンを１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤１－５：2-メルカプトベンゾイミダゾール）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、2-メルカプトベンゾイミダゾールを１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤１－６：亜りん酸トリフェニル含有封入剤）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、亜りん酸トリフェニルを１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤１－７：ジベンジルジスルフィド含有封入剤）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）を用いた。封入剤に対して退色防止剤としてジベンジルジスルフィドを１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤１－８：3,3'-チオジプロピオン酸ジドデシル含有封入剤）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、3,3'-チオジプロピオン酸ジドデシルを１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤１－９：DL-α-リポ酸含有封入剤）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、DL-α-リポ酸を１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤１－１０：レチノイン酸含有封入剤）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、レチノイン酸を１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤２－１：退色防止剤含有しない封入剤）
封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）をそのまま用いた。退色防止剤は加えなかった。
　（封入剤２－２：シアニジン含有封入剤）
　封入剤に対して退色防止剤として、シアニジンを１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤２－３：p-フェニルアゾフェノール含有封入剤）
　封入剤に対して退色防止剤として、p-フェニルアゾフェノールを１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤２－４：４－ニトロアニリン含有封入剤）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、４－ニトロアニリンを１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤２－５：リコピン含有封入剤）
　封入剤として、エンテランニュー（メルク社製）またはパラマウントＮ（ファルマ社）を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、リコピンを１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　（封入剤３－１：ＤＡＢＣＯ含有水性封入剤）
　封入剤として、フルオロマウント（コスモ・バイオ社製；水性封入剤）を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）を１ｗｔ％添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
　使用した封入剤の一覧を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜組織染色工程＞
　［免疫組織染色］
　蛍光標識１～１３を用いて、ヒト乳房組織の免疫染色を行なった。染色切片はコスモ・バイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ－Ａ７１２）を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理後、水に置換洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドをＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液を用いて湿潤箱中で１時間ブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに希釈したビオチン化トラスツズマブを組織切片と２時間反応させ、その後洗浄した。さらに、蛍光標識１～１３と０．５時間反応させ、その後洗浄を行うことにより、免疫組織化学染色切片が得られた。得られた免疫組織化学染色切片を４％中性パラホルムアルデヒド水系バッファ溶液中に１０分間浸漬することにより、固定処理を行った。
　［形態染色］
　上記で固定処理した免疫組織化学染色切片に対してＨＥ染色を行い、染色後の切片をエタノールに浸漬することにより脱水し、脱水切片をさらにキシレンに浸漬し風乾させることにより透徹を行ったところ、二重染色切片が得られた。なお、形態染色としてＨＥ染色を行なっても、後述の耐光性評価に影響は無い。
　［封入］
　上記形態染色を行なったものについて、封入を行なった。蛍光標識１～１３を用い、封入剤として、１－１～１－１０、２－１～２－５および３－１をそれぞれ用いた。
　＜組織サンプルの評価＞
　［評価１：退色防止剤吸収］
　退色防止剤吸収は、退色防止剤の１ｍｇ／ｍＬ濃度のキシレン溶液を調整し、１０ｍｍセルに入れて吸光度測定を行なった際に、４５０ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度がともに０．５以下であることを退色防止剤吸収無しと、いずれかまたは両方が０．５を超えるものを退色防止剤吸収有りとした。吸光度測定には日立社製分光光度計Ｕ－４１００を用いた。なお、退色防止剤のキシレン溶解性が悪い場合には、０．５ｗｔ％キシレン溶液として、１０ｍｍセルに入れて測定を行なった。さらにキシレン溶解性が悪い場合は、溶媒をキシレンとＥｔＯＨ等との混合溶媒に替えて測定を行なった。
　［評価２：３０分光照射前後の耐光性評価、改善割合］
　蛍光標識１～１３で免疫染色し、その後に封入剤１－１～１－１０または封入剤２－１～２－５で封入した組織切片に対し、励起光を照射して蛍光発光させ、その組織切片から、正立型蛍光顕微鏡（カールツァイス社製Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ ２、モノクロカメラＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｍ装備）を用いて画像を取得した。
　励起波長（ｎｍ）および蛍光波長（ｎｍ）は光学フィルターにより設定し、テキサスレッドならびにペリレンイミド、およびその内包ナノ粒子は励起波長５７５～６００ｎｍ、蛍光波長６１２～６８２ｎｍとした。フルオレセインおよびその内包ナノ粒子は励起波長４５０～４９０ｎｍ、蛍光波長５００～５５０ｎｍとした。ＣｄＳｅおよびその内包ナノ粒子は励起波長３４５～３９５ｎｍ、蛍光波長６００～７００ｎｍとした。
　顕微鏡観察および画像取得時の励起波長条件は、励起５７５～６００ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が９００Ｗ／ｃｍ2、励起４５０～４９０ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が９００Ｗ／ｃｍ2、励起３６５ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が５００Ｗ／ｃｍ2、励起３４５～３９５ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が５００Ｗ／ｃｍ2、になるようにした。なお、照射光強度は対物４０倍レンズ装着時の光エネルギー値をアドバンテスト社製パワーメータ８２３０で測定し、４０倍レンズ照射視野面積（約φ４５０μｍ）で割る事で算出している。画像取得時の露光時間は画像の輝度が飽和しないよう任意に設定し画像を取得した。例えば１０００ｍ秒で測定を行なった。なお、取得画像は補正を加えず、輝度値がフルレンジでリニアとなるようにした。
　取得画像より画像解析ソフトであるＩｍａｇｅ－Ｊ（米国国立衛生研究所製）を用いて各画素の輝度を算出し、蛍光標識体によって染色された部位（免疫染色部）の平均輝度（免疫染色部輝度）を算出した。当該平均輝度は信号値（Ｓ）に対応する。２５６階調のデータにおいて、輝度は「０」を黒（一番暗い）と、「２５５」を白（一番明るい）としている。なお、２５６階調よりも高階調な画像を用いる場合は、輝度値を算出後、最大階調値で割り、２５５を掛けることで、２５６階調での値と比較できるようにした。
　蛍光標識の耐光性評価は、３０分間視野を動かさない状態として励起光を照射し続け、照射直後（照射開始時点、０分）および照射後（３０分）の顕微鏡画像の両方から、免疫染色部輝度を取得し、（式：３０分照射後の輝度／照射直後の輝度×１００）、で表される輝度保持率（％）を算出することにより行った。
　また、退色防止剤の効果の比較のため、退色防止剤を含まない対応する封入剤を用いて同様の処理を行い、（式：退色防止剤を入れた場合の輝度保持率／退色防止剤を入れない場合の輝度保持率×１００）、で表わされる改善割合（％）を算出した。
　［評価３：保存性］
　封入し作製した切片スライドについて、３ヵ月保存後の輝度を評価した。輝度の評価は評価２と同様におこなった。元の輝度に対し、７０％以上の輝度を保持している場合は保存性あり（○）、７０％未満に低下している場合は保存性なし（×）、とした。
　［評価４：透明性］
　封入し作製した切片スライドについて、分光光度計Ｕ－４１００（日立社製）で、４５０～６００ｎｍの吸光度測定を行ない評価した。４５０ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度がともに０．１以下を透明（○）と、いずれかまたは両方が０．１を超えるものを不透明（×）とした。封入剤に着色がある場合、透明性が低下する。また、切片が白濁した場合も透明性は低下する。蛍光標識の輝度を維持する観点から、切片スライドは透明であることが好ましい。
　［評価５：染色維持性］
　油系封入剤で染色ができている事の確認のため、染色時に切片の固定処理工程を行わないサンプルを準備し、固定処理工程を行なったものと比較を行なった。固定処理工程を行なわないサンプルに対して、初期輝度が１．１倍以上となっているものを、蛍光染色性を維持している（○）、１．１倍未満となっているものを、蛍光染色性を維持していない（×）とした。
　以上の評価結果を表３－１～３－７、表４、表５－１～５－３および表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 　これらについて評価を行なった結果、固定化処理を行うことで、水と自由混和しない溶媒を含む封入剤（油系封入剤）を用いても、蛍光染色性の低下（発光部分の減少）および染色のにじみが起きず、実際の観察に用いることができる蛍光染色標本を作製できることが示された。また、退色防止剤を加えることで、輝度保持率が向上することが示された。さらに、吸収のない退色防止剤を用いることで、蛍光観察により適した透明な切片スライドが得られることが示された。

Claims (13)

  1. 　病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法であって、蛍光標識体を用いた免疫染色工程と、切片の固定処理工程と、水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤を用いて切片を封入する封入処理工程とを有する生体物質検出方法。
  2. 　前記蛍光標識体が、蛍光色素内包ナノ粒子および蛍光ナノ粒子内包粒子からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１に記載の生体物質検出方法。
  3. 　前記水と自由混和しない有機溶媒が、芳香族炭化水素、不飽和炭化水素、ケトン、エステル、エーテルおよびアルコールからなる群より選ばれる少なくとも1種を含む、請求項１または２に記載の生体物質検出方法。
  4. 　前記水と自由混和しない有機溶媒が、キシレン、トルエンおよびリモネンからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
  5. 　前記封入剤が退色防止剤を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
  6. 　前記退色防止剤が、吸収波長４５０～６００ｎｍの波長域で吸光をしない、請求項５に記載の生体物質検出方法。
  7. 　前記退色防止剤を含む封入剤を用いて作製した切片スライドが透明である、請求項５または６に記載の生体物質検出方法。
  8. 　前記退色防止剤が、フェノール、アミン、チオール、スルフィド、ジスルフィドおよび不飽和炭化水素からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
  9. 　前記退色防止剤が、フェノールおよびアミンからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
  10. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の生体物質検出方法に用いるキットであって、
    水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤と、
    前記生体物質検出方法を記載した使用説明書と
    を有する生体物質検出用キット。
  11. 　請求項５～９のいずれか一項に記載の生体物質検出方法に用いるキットであって、
    水と自由混和しない有機溶媒および退色防止剤を含む封入剤と、
    前記生体物質検出方法を記載した使用説明書と
    を有する生体物質検出用キット。
  12. 　さらに、免疫染色用の蛍光標識体および蛍光標識化試薬を含む、請求項１０または１１に記載の生体物質検出用キット。
  13. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の生体物質検出方法に用いる病理切片であって、生体物質を特異的に検出するための蛍光標識体を用いた免疫染色処理、固定処理、および水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤を用いた封入処理がなされた病理切片。
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