WO2013115180A1 - 新規ｌ－アミノ酸オキシダーゼ、ｌ－リジンの測定方法、キット及び酵素センサ - Google Patents

新規ｌ－アミノ酸オキシダーゼ、ｌ－リジンの測定方法、キット及び酵素センサ Download PDF

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WO2013115180A1
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amino acid
lysine
protein
oxidase
enzyme
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PCT/JP2013/051894
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浅野　泰久
大亮 松井
Original Assignee
富山県
味の素株式会社
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    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
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    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2533/00—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used

Definitions

  • the present invention relates to a novel L-amino acid oxidase, a method for measuring L-lysine using the novel L-amino acid oxidase, a kit used therefor, and an enzyme sensor. More specifically, the present invention relates to a mutant L-amino acid oxidase having a high substrate specificity for L-lysine, a method for measuring L-lysine using this mutant enzyme, a kit for measuring L-lysine, and an enzyme sensor.
  • L-Lysine is an amino acid that is one of the protein constituent amino acids but cannot be produced in the body. Concentrations of amino acids containing L-lysine maintain homeostasis in vivo, but blood levels vary greatly due to inborn errors of metabolism and visceral diseases. In addition to L-lysine, the in vivo amino acid concentration can be a useful means for detecting diseases. Therefore, these diseases can be detected by measuring the blood concentration of one or more amino acids (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • the method using an enzyme has an advantage that it can be carried out inexpensively and easily as compared with an instrumental analytical method.
  • the enzyme for quantification for example, dehydrogenase or oxidase is often used.
  • oxidase a method of detecting and quantifying hydrogen peroxide produced by allowing oxidase to act on amino acids with peroxidase is mentioned (Patent Document 2).
  • Patent Document 2 any of the colorimetric method, the fluorescence method, and the electrode method can be used.
  • a method using an enzyme is also known as a method for quantifying L-lysine.
  • L-lysine ⁇ oxidase [EC 1.4.3.14] has been used for oxidase quantification. Since L-lysine ⁇ oxidase derived from Trichoderma viride has higher substrate specificity than other L-amino acid oxidases and is commercially available, it has been used as an element such as an enzyme sensor (Non-patent Document 2). Non-patent document 3 and Non-patent document 4).
  • L-lysine monooxygenase derived from Pseudomonas fluorescens has L-lysine oxidase activity (Non-patent Documents 5 and 6).
  • This enzyme uses L-lysine, L-ornithine, and L-arginine as substrates.
  • Patent Document 1 International Publication WO 2006/129513
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 55-43409
  • Non-Patent Document 1 Anal. Chem. 81: 307-314 (2009)
  • Non-Patent Document 2 Sens. Actuators, B 126: 424-430 (2007)
  • Non-Patent Document 3 Anal. Bioanal. Chem. 391: 1255-1261 (2008)
  • Non-Patent Document 4 Anal. Bioanal. Chem. 406: 19-23 (2010)
  • Non-Patent Document 5 J. Biol. Chem. 249: 2579-2586 (1974)
  • Non-Patent Document 6 J. Biol. Chem. 249: 2587-2592 (1974)
  • L-lysine ⁇ -oxidase derived from Trichoderma viride exhibits oxidase activity against amino acids other than L-lysine. Therefore, when a sample containing many kinds of amino acids such as plasma is quantified using L-lysine ⁇ -oxidase, it tends to be overestimated.
  • Non-patent Document 3 L-lysine ⁇ -oxidase derived from seawater fish mucus having higher substrate specificity than the above-mentioned L-lysine ⁇ -oxidase has been reported (Non-patent Document 3).
  • this L-lysine ⁇ -oxidase is derived from seawater fish mucus and there is no report on enzyme production by culture. Therefore, it is difficult to mass-produce this enzyme and use it for quantification of L-lysine.
  • L-lysine monooxygenase derived from Pseudomonas fluorescens for L-lysine quantification. Even when this enzyme is used for L-lysine quantification, it has oxygenase activity against L-ornithine and L-arginine other than L-lysine as described above. For samples containing amino acids, L-lysine cannot be quantified strictly.
  • the L-lysine oxidase quantification method is useful from the viewpoint that if it can be realized, it can be carried out cheaply and easily compared to the instrumental analysis method.
  • enzymes that can be used to date have low substrate specificity, or problems with enzyme productivity, It was not a situation that could be put to practical use.
  • the present invention provides an enzyme having a high substrate specificity for L-lysine as an enzyme capable of specifically quantifying L-lysine even in a biological sample containing many kinds of amino acids.
  • An object of the present invention is to provide an enzymatic measurement method for L-lysine using this enzyme.
  • Another object of the present invention is to provide a measurement kit that can be used when carrying out the above enzymatic measurement method.
  • an object of the present invention is to provide an enzyme sensor that can be used in the above enzymatic determination method.
  • the present inventors have found that the 254th cysteine in the amino acid sequence of the L-amino acid oxidase derived from Pseudomonas sp. H-8-1-3 strain. It was found that a mutant L-amino acid oxidase obtained by substituting a predetermined amino acid has a high substrate specificity for L-lysine. The present invention has been completed based on such knowledge.
  • the present invention is as follows.
  • [3] The protein according to [1] or [2], wherein the 254th amino acid is isoleucine or tyrosine.
  • [4] In the protein defined in the above (2) or (3) and having an amino acid sequence in which the 254th cysteine is substituted with an amino acid other than tryptophan, glycine, lysine, arginine, histidine, threonine, asparagine, glutamine or proline, When the oxidase activity for L-lysine of the protein is 100%, the oxidase activity for L-arginine of the protein is 15% or less, and the oxidase activity for L-ornithine is 80% or less, from [1] [3] The protein according to any one of [3].
  • [5] A nucleic acid encoding the protein according to any one of [1] to [4].
  • [6] A vector comprising the nucleic acid according to [5].
  • [7] A transformant transformed with the vector according to [6].
  • [8] A method for detecting or quantifying L-lysine comprising the following steps: (A) a step of holding the specimen and the protein according to any one of [1] to [4] in the presence of water and oxygen; and (B) a reaction by the action of oxidase activity on L-lysine of the protein. The said method including the process of detecting or quantifying at least one of the reaction products produced
  • a kit for detecting or quantifying L-lysine comprising the protein according to any one of [1] to [4].
  • the kit according to [14] further comprising at least one of a reaction buffer, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and an L-lysine deamination product detection agent.
  • An enzyme sensor for detecting or quantifying L-lysine comprising an electrode for hydrogen peroxide detection, The sensor, wherein the protein according to any one of [1] to [4] is disposed on or near the surface of the hydrogen peroxide detection electrode.
  • the hydrogen peroxide detection electrode is an enzyme hydrogen peroxide electrode or a diaphragm hydrogen peroxide electrode.
  • a novel mutant L-amino acid oxidase having a high substrate specificity for L-lysine can be provided.
  • L-lysine can be easily and quickly detected and quantified specifically and accurately even in a sample containing many impurities such as other amino acids.
  • the present invention is effective for biological samples such as plasma, serum or urine, and not only can L-lysine be quantified by a color development method or a fluorescence method by coupling with an enzyme such as peroxidase, but also an electrode type.
  • An enzyme sensor can also be provided.
  • FIG. 1 shows the reaction mechanism of monooxygenase reaction and oxidase reaction using L-lysine as a substrate catalyzed by L-amino acid oxidase (wild type enzyme) derived from Pseudomonas sp. H-8-1-3. And the ratio.
  • FIG. 2 shows a SDS-PAGE photograph of the wild-type enzyme.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence predicted from the base sequence encoding the wild-type enzyme.
  • FIG. 4 shows the results of alignment analysis of the amino acid sequence of the wild-type enzyme, the amino acid sequence of the mutant enzyme C254I, which is the protein of the present invention, and the amino acid sequence of a known homologous gene.
  • FIG. 1 shows the reaction mechanism of monooxygenase reaction and oxidase reaction using L-lysine as a substrate catalyzed by L-amino acid oxidase (wild type enzyme) derived from Pseudomonas sp. H
  • LysOX Wild type represents an L-amino acid oxidase derived from Pseudomonas sp. H-8-1-3
  • LysOX C254I represents the mutant enzyme C254I of the present invention, and others are known.
  • the amino acid sequence is indicated by the accession number.
  • FIG. 5 shows the continuation of the alignment analysis shown in FIG.
  • FIG. 6 shows the enzyme activities (pH dependency) of L-lysine (Lys), L-ornithine (Orn), and L-arginine (Arg) of the wild-type enzyme purified in the examples.
  • FIG. 5 shows the continuation of the alignment analysis shown in FIG.
  • FIG. 6 shows the enzyme activities (pH dependency) of L-lysine (Lys), L-ornithine (Orn), and L-arginine (Arg) of the wild-type enzyme purified in the examples.
  • FIG. 7 shows the correlation between the L-lysine concentration and the absorbance at 492 nm (absorbance) when a 1 to 6 mM L-lysine aqueous solution is used as a specimen using the wild-type enzyme preparation purified in the examples.
  • FIG. 8 shows the results of examining enzyme activity (pH dependence) of wild-type enzyme and mutant enzyme C254I of the present invention using L-lysine, L-ornithine, and L-arginine as substrates.
  • FIG. 9 shows the results of examining substrate specificity for the wild-type enzyme and the mutant enzyme C254I of the present invention.
  • FIG. 10 shows the relationship between the L-lysine concentration and the absorbance (absorbance) when a 1 to 10 mM L-lysine aqueous solution is used as a specimen using the wild type enzyme and the mutant enzyme C254I of the present invention.
  • LysOX Wild type shows the result of the wild type enzyme
  • LysOX C254I shows the result of the mutant enzyme C254I of the present invention.
  • FIG. 11 shows the results of examining the substrate specificity of various mutant enzymes obtained by mutating the 254th cysteine in the amino acid sequence of the wild-type enzyme to various amino acids.
  • FIG. 12 shows the relative activities of L-arginine and L-ornithine with respect to the results of FIG. FIG.
  • FIG. 13 shows the results of quantifying each amino acid using a wild-type enzyme in a plasma sample to which L-lysine, L-arginine, and L-ornithine were added.
  • FIG. 14 shows the result of quantifying each amino acid in plasma samples added with L-lysine, L-arginine, and L-ornithine using the mutant enzyme C254I of the present invention.
  • the present invention relates to the protein according to any one of (1) to (3) below.
  • the 254th cysteine is methionine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, alanine, glycine, valine, isoleucine, leucine, lysine, arginine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, serine, threonine
  • amino acid oxidase comprising an amino acid sequence having at least 67% sequence identity to the amino acid sequence of the protein defined in (1) above and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 -A protein having oxidase activity with high substrate specificity to lysine, provided that the amino acid corresponding to the 254th amino acid in the amino acid sequence of the protein is not mutated.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 newly isolates a Pseudomonas genus strain from nature and clones a gene encoding an L-amino acid oxidase produced by a microorganism belonging to the genus Pseudomonas. It was obtained by this. This point will be described in detail in Examples.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a protein having L-amino acid oxidase activity as confirmed in the Examples.
  • the L-amino acid oxidase activity of the protein acts on each of L-lysine, L-ornithine and L-arginine at pH 7.0 (30 ° C.) in the presence of oxygen and water, and produces hydrogen peroxide and ammonia. Activity to produce.
  • the oxidase activity for L-lysine, L-ornithine, and L-arginine is referred to as L-lysine oxidase activity, L-ornithine oxidase activity, and L-arginine oxidase activity, respectively.
  • These oxidase activities can be measured by using the measuring reagents and measuring methods described in the following examples.
  • the protein defined in the above (1) of the present invention is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, wherein the 254th cysteine is methionine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, alanine, glycine, valine, isoleucine, leucine, lysine, arginine. , Mutidine, aspartic acid, glutamic acid, serine, threonine, asparagine, glutamine or a proline mutant L-amino acid oxidase obtained by substitution.
  • the protein obtained by substituting the amino acid at position 254 with these amino acids has specificity for oxidase activity against L-lysine as compared with the amino acid oxidase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, as shown in the Examples. Is expensive.
  • the protein of the present invention having “oxidase activity with high substrate specificity for L-lysine compared to the amino acid oxidase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” is compared with wild-type amino acid oxidase (hereinafter referred to as wild-type enzyme).
  • wild-type enzyme A protein having a relatively high substrate specificity for L-lysine.
  • the ratio of L-arginine oxidase activity to L-lysine oxidase activity, the ratio of L-ornithine oxidase activity to L-lysine oxidase activity, or L-arginine to L-lysine oxidase activity compared to wild-type enzyme It means that both the ratio of oxidase activity and the ratio of L-ornithine oxidase activity to L-lysine oxidase activity are low.
  • a protein having “oxidase activity with high substrate specificity for L-lysine compared to the amino acid oxidase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” is said to have higher substrate specificity for L-lysine.
  • a protein in which both the ratio of the L-arginine oxidase activity to the L-lysine oxidase activity and the ratio of the L-ornithine oxidase activity to the L-lysine oxidase activity is low compared to the wild-type enzyme is preferable.
  • the 254th amino acid is methionine, phenylalanine, Tyrosine, alanine, valine, isoleucine, leucine, aspartic acid, glutamic acid or serine are preferred.
  • the amino acid at position 254 is substituted with these amino acids, the ratio of L-arginine oxidase activity to L-lysine oxidase activity and L-ornithine oxidase to L-lysine oxidase activity are shown in the following examples. This is because both ratios of activity are low compared to the wild-type enzyme.
  • the 254th amino acid is preferably isoleucine or tyrosine.
  • the protein of the present invention is not particularly limited as long as it has an oxidase activity with a high substrate specificity for L-lysine within the range defined in (2) and (3) above.
  • the L-arginine oxidase activity of the protein is preferably 15% or less, more preferably 10% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% Below, they are 1% or less, 0.5% or less, 0.01% or less, and 0%.
  • the L-ornithine oxidase activity of the protein is preferably 80% or less, more preferably 60% or less, still more preferably 50% or less, still more preferably 20% or less, 15% or less, 10% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, 1% or less, 0.5% or less, 0.01% or less, 0%.
  • the L-lysine oxidase activity is 100% at pH 7.0 and 30 ° C.
  • the L-arginine oxidase activity is about 20%
  • the L-ornithine oxidase activity is It is about 83%.
  • the absolute value of the L-lysine oxidase activity is not particularly limited as long as the protein of the present invention exhibits the above-mentioned “oxidase activity with high substrate specificity for L-lysine”.
  • the L-lysine oxidase activity of the protein of the present invention is preferably at least equivalent to or higher than the L-lysine oxidase activity of the wild-type enzyme.
  • the protein of the present invention preferably has an L-lysine oxidase activity of 0.6 U / mg or more, more preferably 1.0 U / mg or more at pH 7.0.
  • Type L-amino acid oxidase shows no activity.
  • the protein defined in (2) above is: “in the protein defined in (1) above, one or several amino acids are deleted, substituted and / or removed in the region excluding the 254th amino acid.
  • it is a protein having an oxidase activity consisting of an added amino acid sequence and having a higher substrate specificity for L-lysine than an amino acid oxidase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the range of “1 to several” in the “amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted and / or added” indicates that the protein having the deletion is substrate-specific for the above L-lysine. It is not particularly limited as long as it has high oxidase activity.
  • the range of “1 to several” is, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably, since the ratio of the protein having oxidase activity with high substrate specificity to L-lysine is high.
  • the protein defined in (3) above is “consisting of an amino acid sequence having at least 67% sequence identity to the amino acid sequence of the protein defined in (1) above, and represented by SEQ ID NO: 2.
  • sequence identity in the “amino acid sequence having at least 67% sequence identity to the amino acid sequence of the protein defined in (1) above” refers to a protein having the identity of the amino acid sequence.
  • the enzyme is not particularly limited as long as the enzyme has an oxidase activity with high substrate specificity for L-lysine.
  • sequence identity of the amino acid sequence is not particularly limited as long as it is 67% or more, preferably 68% or more, 69% or more, 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, or 74% or more, More preferably 75% or more, more preferably 80% or more, 85% or more, 90% or more, still more preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more.
  • sequence identity refers to the degree of amino acid identity with respect to each other of two or more amino acid sequences.
  • “mutation” in “however, the amino acid corresponding to the 254th amino acid in the amino acid sequence of the protein is not mutated” specifically refers to deletion or substitution of amino acids.
  • Means. That is, “however, the amino acid corresponding to the 254th amino acid in the amino acid sequence of the protein is not mutated” means that the determination of sequence identity in the amino acid sequence of the protein defined in (3) above. This means that the amino acid corresponding to the 254th amino acid in the amino acid sequence of the protein of the above (1) serving as the reference is the same as the 254th amino acid in the amino acid sequence of the protein of the above (1). Therefore, if the substituted amino acid in the protein of (1) is isoleucine, the amino acid corresponding to the 254th amino acid in the amino acid sequence of the protein of (3) is isoleucine.
  • the amino acid corresponding to the 254th amino acid in the amino acid sequence of the protein in (1) which is a criterion for determining the sequence identity, It can be examined by homology analysis. Specifically, when an alignment analysis of the amino acid sequence to be analyzed is performed on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of the protein of (1) above using commercially available sequence analysis software or the like, It is possible to search for an amino acid corresponding to the 254th amino acid. Such alignment analysis techniques are widely known to those skilled in the art.
  • the origin of the protein of the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the range defined in (1) to (3) above.
  • the protein of the present invention may be a recombinant protein produced by various genetic engineering techniques, a synthetic protein produced by chemical synthesis, or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a mutant capable of producing the mutant enzyme of the present invention is obtained by giving a mutagen to a specific species (for example, bacteria) having a gene homologue of L-amino acid oxidase, and a protein produced by the mutant is obtained. It may be a protein produced by extraction and production.
  • nucleic acid DNA or RNA
  • the protein of the present invention can be expressed.
  • the 254th cysteine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid corresponding to the cysteine is substituted with the predetermined amino acid described in (1) above.
  • a protein having a predetermined identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is encoded.
  • any base deletion, substitution and / or insertion can be performed by, for example, error-prone PCR method, DNA shuffling method, various site-specific mutagenesis methods and the like.
  • the protein of the present invention can be produced by introducing the nucleic acid encoding the protein of the present invention thus prepared into an appropriate expression system.
  • the expression system that can be used for producing the protein of the present invention is not particularly limited.
  • an expression vector that enables expression of a recombinant protein in various biological species can be used.
  • various expression vectors that enable protein expression in a host such as a microorganism such as bacteria and fungi (for example, yeast), a plant, an insect cell, and a mammalian cell can be used.
  • Viral vectors (including phage vectors) or plasmid vectors may be used.
  • the protein of the present invention may be produced using a cell-free protein expression system using rabbit reticulocyte lysate, wheat germ lysate, E. coli lysate or the like.
  • a nucleic acid encoding the protein of the present invention is mounted on a vector, and after host cells are transformed with this vector, It can be prepared by a production method including culturing transformed host cells, accumulating the protein encoded by the gene in the culture, and collecting the accumulated protein.
  • a nucleic acid encoding the protein of the present invention, a vector containing the nucleic acid, and a transformant transformed with the vector are one embodiment of the present invention.
  • the method for obtaining a nucleic acid encoding the protein of the present invention is not particularly limited.
  • a nucleic acid encoding an L-amino acid oxidase gene (SEQ ID NOs: 1 and 2) isolated from Pseudomonas sp. H-8-1-3 is used as a material.
  • a nucleic acid encoding the protein of the present invention may be obtained, or a gene having homology to the protein of the present invention or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (L-amino acid oxidase) is isolated from various bacteria, A nucleic acid encoding the protein of the present invention may be produced by preparing a nucleic acid encoding the gene and substituting the amino acid corresponding to the 254th amino acid.
  • the nucleic acid encoding the protein of the present invention is a known nucleotide sequence having a certain identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of L-amino acid oxidase (wild type enzyme) derived from Pseudomonas sp. H-8-1-3 isolated from nature by the present inventors.
  • L-amino acid oxidase wild type enzyme
  • many genes showing a certain homology are known for this L-amino acid oxidase.
  • the bacteria-derived genes shown in Table 1 are known.
  • amino acid sequence of the wild-type enzyme shows the results of alignment analysis of the amino acid sequence of the wild-type enzyme, the amino acid sequence of the mutant enzyme C254I which is the protein of the present invention, and the amino acid sequences of known genes shown in Table 1.
  • the amino acid at the position indicated by the arrow is the amino acid corresponding to the 254th amino acid.
  • the amino acid corresponding to the 254th amino acid in the known gene shown in Table 1 is cysteine as well as the wild type enzyme.
  • the amino acid sequence of the protein of the present invention may be designed based on the sequences of these known genes, or may be designed based on the sequence information of other known homologous genes.
  • the nucleic acid encoding the protein of the present invention is, for example, a method of contacting a DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing with a drug that becomes a mutagen, a method of irradiating with ultraviolet rays, It can be performed using genetic engineering techniques.
  • site-directed mutagenesis which is one of genetic engineering techniques, is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position. Therefore, in producing a nucleic acid encoding the protein of the present invention, Useful for introducing site-specific mutations.
  • an appropriate probe or primer is prepared based on the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing in this specification or the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 2, and Pseudomonas sp. .)
  • a nucleic acid By screening a bacterial cDNA or genomic library containing H-8-1-3 strain, a nucleic acid can be prepared as a material for producing a nucleic acid encoding the protein of the present invention.
  • a cDNA or genomic library can be prepared by a conventional method.
  • a material for producing a nucleic acid encoding the protein of the present invention can be obtained by the PCR method.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 1 can be amplified.
  • PCR is performed using the pair of primers.
  • PCR reaction conditions can be set as appropriate. For example, one cycle of a reaction step consisting of 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 55 ° C. for 30 seconds to 1 minute (annealing), and 72 ° C. for 2 minutes (extension) For example, after 30 cycles, a condition of reacting at 72 ° C.
  • the amplified DNA fragment can be used as a material for producing a nucleic acid encoding the protein of the present invention.
  • the vector obtained by cloning the amplified DNA fragment into an appropriate vector that can be amplified in a host such as E. coli is also used to produce a nucleic acid encoding the protein of the present invention. It can be used as a material.
  • the base sequence (codon) encoding the amino acid corresponding to the 254th amino acid is substituted with a base using various mutagenesis methods.
  • a nucleic acid encoding the protein of the present invention or a vector containing the nucleic acid.
  • the nucleic acid encoding the protein of the present invention can be used in a state inserted in a suitable vector.
  • the type of vector used in the present invention is not particularly limited.
  • the vector may be a self-replicating vector (for example, a plasmid), or may be integrated into the host cell genome when introduced into the host cell. It may be replicated together with other chromosomes.
  • the vector is an expression vector.
  • elements necessary for transcription for example, a promoter and the like
  • a promoter is a DNA sequence that exhibits transcriptional activity in a host cell, and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • Promoters that can operate in bacterial cells include the Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene, the Bacillus licheniformis alpha-amylase gene, and the Bacillus amyloliquefaction.
  • Enns-BAN amylase gene Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene
  • Bacillus subtilis alkaline protease gene Bacillus subtilis alkaline protease gene
  • promoters of the Bacillus pumilus-xylosidase gene Bacillus pumilus-xylosidase gene
  • phage lambda P R or P L promoters
  • lac E. coli (E. coli) such as trp or tac promoter and the like.
  • promoters that can operate in mammalian cells include the SV40 promoter, the MT-1 (metallothionein gene) promoter, and the adenovirus 2 major late promoter.
  • promoters operable in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, autographa caliornica polyhedrosic basic protein promoter, baculovirus immediate early gene 1 promoter, or baculovirus 39K delayed early gene.
  • Examples of a promoter operable in a yeast host cell include a promoter derived from a yeast glycolytic gene, an alcohol dehydrogenase gene promoter, a TPI1 promoter, an ADH2-4c promoter, and the like.
  • promoters that can operate in filamentous fungal cells include the ADH3 promoter or the tpiA promoter.
  • the nucleic acid encoding the protein of the present invention may be operably linked to an appropriate terminator as necessary.
  • the vector containing the nucleic acid encoding the protein of the present invention may further have elements such as a polyadenylation signal (for example, derived from SV40 or adenovirus 5E1b region), a transcription enhancer sequence (for example, SV40 enhancer) and the like.
  • the recombinant vector containing the gene for L-amino acid oxidase may further comprise a DNA sequence that allows the vector to replicate in the host cell, such as the SV40 origin of replication (host cell is a mammalian cell). ).
  • the vector containing the nucleic acid encoding the protein of the present invention may further contain a selection marker.
  • Selectable markers include, for example, genes that lack their complement in host cells, such as dihydrofolate reductase (DHFR) or Schizosaccharomyces pombe TPI genes, or such as ampicillin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, Mention may be made of drug resistance genes such as neomycin or hygromycin.
  • the transformant of the present invention can be produced by introducing a vector containing a nucleic acid encoding the protein of the present invention into an appropriate host.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced may be any cell as long as the vector of the present invention is replicated in the cell.
  • when producing a transformant that expresses the protein of the present invention it is an arbitrary cell that allows expression of the protein of the present invention in addition to the replication of the vector. Examples of such host cells include bacteria, yeast, fungi and higher eukaryotic cells.
  • Examples of bacterial cells include Gram-positive bacteria such as Bacillus or Streptomyces, or Gram-negative bacteria such as E. coli. Transformation of these bacteria may be performed by using competent cells by a protoplast method or a known method.
  • Examples of mammalian cells include HEK293 cells, HeLa cells, COS cells, BHK cells, CHL cells, or CHO cells. Methods for transforming mammalian cells and expressing DNA sequences introduced into the cells are also known, and for example, electroporation method, calcium phosphate method, lipofection method and the like can be used.
  • yeast cells include cells belonging to Saccharomyces or Schizosaccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae or Saccharomyces kluyveri.
  • Examples of the method for introducing a recombinant vector into a yeast host include an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, and the like.
  • filamentous fungi examples include Aspergillus, Neurospora, Fusarium, or Trichoderma.
  • transformation can be performed by integrating the DNA construct into the host chromosome to obtain a recombinant host cell. Integration of the DNA construct into the host chromosome can be performed according to known methods, for example, by homologous recombination or heterologous recombination.
  • the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into the insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected with the insect cells.
  • the protein can be expressed.
  • baculovirus for example, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects Coleoptera insects, can be used.
  • Sf9, Sf21 which are ovary cells of Spodoptera frugiperda, HiFive (manufactured by Invitrogen) which is an ovary cell of Trichoplusia ni, and the like can be used.
  • Examples of a method for co-introducing a recombinant gene introduction vector into an insect cell and the baculovirus for preparing a recombinant virus include a calcium phosphate method and a lipofection method.
  • the above-described transformant is cultured in an appropriate nutrient medium under conditions that allow replication of the vector of the present invention or conditions that allow expression of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention is expressed, in order to isolate and purify the protein of the present invention from the transformant culture (including the transformant and the culture medium), normal protein isolation and purification
  • the method may be used.
  • the protein of the present invention is expressed in a dissolved state in the cell, after the culture is completed, the cell is collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then disrupted by an ultrasonic crusher or the like. A cell-free extract is obtained.
  • an ordinary protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using resin such as diethylaminoethyl (DEAE) Sepharose, cation exchange chromatography using resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), resin such as butyl sepharose and phenyl sepharose Using the hydrophobic chromatography method used, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatofocusing method, electrophoresis method such as isoelectric focusing etc. alone or in combination, the protein of the present invention is used. It can be obtained as a purified sample.
  • a solvent extraction method such as diethylaminoethyl (DEAE) Sepharose
  • cation exchange chromatography using resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia)
  • the method for quantifying L-lysine of the present invention is as follows.
  • a method for detecting or quantifying L-lysine comprising the following steps: (A) a step of holding the specimen and the protein of the present invention in the presence of water and oxygen; and (B) a reaction product produced in the reaction solution by the action of oxidase activity on L-lysine of the protein.
  • the above method comprising the step of detecting or quantifying at least one.
  • the biological sample used as the specimen in the method of the present invention may be any sample as long as it may contain L-lysine.
  • the biological sample can be appropriately selected depending on which product produced by allowing the protein of the present invention to act on the biological sample to measure the concentration of L-lysine in the biological sample.
  • the product is quantified using a color former or a fluorescent agent, it is preferably a colorless aqueous solution, and examples thereof include serum and plasma.
  • the above-mentioned protein used in the method of the present invention catalyzes the reaction represented by the above formula A.
  • Step (A) The mixing amount of the protein of the present invention in the step (A) is suitably 10 mU / ml (the amount of enzyme showing the activity of consuming 1 ⁇ mol of lysine in 1 minute is 1 U) or more, and the mixing of water
  • the amount can be appropriately determined depending on the concentration of lysine in the sample, but can be in the range of 5 to 95%, for example.
  • the upper limit of the amount of the protein of the present invention is not particularly limited, but practically, for example, it can be 100 mU / ml or less.
  • the mixing amount of the protein of the present invention and the mixing amount of water are not intended to be limited to this range, and can be adjusted as appropriate.
  • a reaction buffer solution can be preferably contained.
  • the pH of the reaction buffer is not particularly limited as long as the oxidase activity having a high substrate specificity for L-lysine of the protein of the present invention described above is ensured, and the optimum pH of the oxidase activity for L-lysine. And may be adjusted as appropriate in consideration of the relationship between L and lysine substrate specificity. For example, from the pH range of 1.0 to 14, the oxidase activity for L-lysine and the high substrate specificity for L-lysine that can detect L-lysine are set in consideration of the properties of each enzyme. be able to.
  • the pH of the reaction buffer is, for example, from pH 6.0 to pH in consideration of the range in which oxidase activity with high substrate specificity for L-lysine can be obtained.
  • the pH can be adjusted to 10.5, preferably pH 6.5 to 10, more preferably pH 7 to 9, and still more preferably pH 7.0 to 8.0.
  • the reaction solution obtained by the mixing is held in the presence of oxygen for a predetermined time.
  • 2-oxo-6-aminohexanoic acid which is an L-lysine deamination product
  • ammonia NH 3
  • peroxidation NH 3
  • Hydrogen H 2 O 2
  • the oxygen is supplied as dissolved oxygen in the reaction solution. It is not usually necessary to forcibly supply an oxygen-containing gas such as air to the reaction solution for the purpose of supplying oxygen in the reaction solution.
  • the holding time for the enzyme reaction depends on, for example, the amount of enzyme used (the amount of the protein of the present invention), but can be, for example, in the range of 10 minutes to 1 hour.
  • the holding temperature for the enzyme reaction is not particularly limited as long as the catalytic reaction by the protein of the present invention shown in the reaction formula A can occur when L-lysine is present in the sample. It may be medium constant or may vary.
  • the holding temperature depends on, for example, the optimum temperature of the enzyme to be used (the protein of the present invention) and the substrate specificity to L-lysine exhibited at that temperature, but a suitable reaction from a range of 10 to 60 ° C., for example.
  • the temperature can be selected and can be, for example, in the range of 20-55 ° C or in the range of 25-40 ° C.
  • the holding time and holding temperature are not intended to be limited to these ranges, and can be adjusted as necessary.
  • step (B) at least one reaction product produced by the action of the protein of the present invention present in the reaction solution after the retention in step (A) is detected or quantified.
  • the product used for detection or quantification is hydrogen peroxide
  • hydrogen peroxide can be detected or quantified by a known method such as a method using a peroxidase reaction.
  • the peroxidase which can be used should just be an enzyme which can be utilized for the detection or fixed_quantity
  • a color former such as 4-aminoantipyrine and a fluorescent agent can be appropriately selected depending on the type of peroxidase used.
  • Hydrogen peroxide which is a product of the L-amino acid oxidase reaction by the protein of the present invention, can also be measured using a current detection sensor using a hydrogen peroxide electrode.
  • the hydrogen peroxide electrode include a sensor that uses a membrane in which peroxidase is immobilized in glutaraldehyde together with bovine serum albumin and a carbon paste containing ferrocene as an electrode.
  • ammonia detection agent When the product used for detection or quantification is ammonia, it can be measured using an ammonia detection agent.
  • ammonia detection agent include an indophenol method using a combination of phenol and hypochlorous acid. Specifically, ammonia can be detected or quantified by mixing a sample with a phenol / nitroprusside solution and a perchloric acid solution to develop a color, and measuring the absorbance at 635 nm.
  • 2-oxo-6-aminohexanoic acid which is a deamination product of L-lysine
  • 2-oxo-6-aminohexanoic acid is converted to 3-methyl-2
  • 2-Oxo-6-aminohexanoic acid can be determined by spectrophotometric determination of hydrazone derivatives by reaction with 3-benzothiazolone hydrazine hydrochloride (3-methyl-2-benzothiazolone hydrazine hydrochloride) .
  • the present invention includes a kit for detecting or quantifying L-lysine containing the protein of the present invention.
  • the kit of the present invention further comprises at least one of a reaction buffer, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a 2-oxo-6-aminohexanoic acid detection reagent that is a deamination product of L-lysine. Can be included.
  • the reaction buffer solution is used to maintain the reaction solution at a pH suitable for the enzyme reaction with the protein of the present invention.
  • the pH of the reaction buffer is not particularly limited as long as the oxidase activity having a high substrate specificity for L-lysine of the protein of the present invention described above is ensured, and the optimum pH of the oxidase activity for L-lysine. And may be adjusted as appropriate in consideration of the relationship between L and lysine substrate specificity. For example, from the pH range of 1.0 to 14, the oxidase activity for L-lysine and the high substrate specificity for L-lysine that can detect L-lysine are set in consideration of the properties of each enzyme. be able to.
  • the pH of the reaction buffer is, for example, from pH 6.0 to pH in consideration of the range in which oxidase activity with high substrate specificity for L-lysine can be obtained.
  • the pH can be adjusted to 10.5, preferably pH 6.5 to 10, more preferably pH 7 to 9, and still more preferably pH 7.0 to 8.0.
  • the hydrogen peroxide detection reagent is used when hydrogen peroxide is detected by, for example, color development or fluorescence.
  • the hydrogen peroxide detection reagent can be, for example, a combination of peroxidase and a color former that can be a substrate thereof. Specifically, a combination of horseradish peroxidase and 2-aminoantipyrine / phenol can be mentioned.
  • ammonia detection agents include the indophenol method using a combination of phenol and hypochlorous acid.
  • Examples of the 2-oxo-6-aminohexanoic acid detection agent which is a deamination product of L-lysine, include 2-oxo-6-aminohexanoic acid and 3-methyl-2-benzothiazolone hydrazine hydrochloride (A method of spectroscopically quantifying a hydrazone derivative by reacting 3-methyl-2-benzothiazolone hydrazine hydrochloride) can be used.
  • the present invention is an enzyme sensor for detecting or quantifying L-lysine including an electrode for detecting hydrogen peroxide, wherein the protein of the present invention is disposed on or near the surface of the hydrogen peroxide detecting electrode.
  • the detection electrode is a hydrogen peroxide detection electrode.
  • the hydrogen peroxide detection electrode can be an enzymatic hydrogen peroxide electrode or a diaphragm hydrogen peroxide electrode. Since the protein of the present invention reacts with L-lysine to generate hydrogen peroxide, this hydrogen peroxide can be detected with an electrode for hydrogen peroxide detection.
  • the enzyme-type hydrogen peroxide electrode include a sensor using, as an electrode, a membrane in which peroxidase is immobilized on glutaraldehyde together with bovine serum albumin and carbon paste containing ferrocene.
  • the diaphragm type hydrogen peroxide electrode is a type of electrode in which an electrode that reacts with hydrogen peroxide is isolated by a diaphragm.
  • the protein of the present invention is preferably arranged on the surface of the detection electrode or in the vicinity of the detection electrode.
  • the protein of the present invention is arranged on the surface of the detection electrode, it is fixed even if immobilized on the surface of the detection electrode. It does not have to be converted.
  • immobilized on the surface of the detection electrode there is an advantage that the sensor of the present invention can be used repeatedly.
  • the activity measurement reagent and the L-lysine measurement reagent composition were prepared as follows.
  • the measurement conditions were as follows.
  • the activity of L-amino acid oxidase was measured as follows.
  • L-amino acid oxidase activity was determined by a colorimetric method using the color developing solution shown in Table 2 to determine the amount of hydrogen peroxide produced by oxidation of L-amino acid.
  • the activity measurement using a microplate was performed by adding 100 ⁇ L and 100 ⁇ L of an enzyme solution of 100 mM of amino acids shown in Table 3 to 100 ⁇ L of the color developing solution, and dispensing on ice, followed by 0, 0.5, 1, 1.5 at 30 ° C. The reaction was performed for 2, 3, 4, and 5 hours, and the absorbance at 550 nm was measured with a microplate reader.
  • As the substrate for L-amino acid oxidase activity 20 types of amino acids (100 mM solution) shown in Table 3 were used, and in the blank, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) was added instead of the substrate.
  • the total amount of the reaction solution was 1 mL.
  • the L-lysine oxidase enzyme activity was calculated from the obtained absorbance change based on the following formula.
  • the amount of enzyme that gives 1 micromole of substrate per minute under the above conditions was 1 U.
  • the enzyme activity of L-amino acid oxidase was calculated based on the following formula.
  • the cells were inoculated into a 2 L Sakaguchi flask containing 500 ml of TGY medium and cultured at 30 ° C. and 96 rpm for 48 hours. After cultivation, the cells were centrifuged at 5000 ⁇ g for 20 minutes to obtain bacterial cells.
  • FIG. 2 shows an SDS-PAGE photograph of L-amino acid oxidase (wild type enzyme) derived from Pseudomonas sp. Strain H8-1-3.
  • the PCR reaction conditions were (i) 98 ° C for 5 minutes, (ii) 96 ° C for 10 seconds, (iii) 50 ° C for 5 seconds, (iv) 60 ° C for 4 minutes, and (ii) 31 cycles. did.
  • the amplified gene was confirmed by agarose gel electrophoresis.
  • the amplified gene was extracted using the Gel-M gel extraction kit of VIOGENE (USA).
  • the PCR reaction conditions were (i) 96 ° C for 2 minutes, (ii) 96 ° C for 10 seconds, (iii) 50 ° C for 5 seconds, (iv) 60 ° C for 4 minutes, (v) (ii) to ( iv) 25 times and (vi) 72 ° C. for 5 minutes.
  • 1 ⁇ L of 3M sodium acetate (pH 5.2), 1 ⁇ L of 0.125M EDTA and 25 ⁇ L of ethanol were added to the PCR product, and left at room temperature for 15 minutes, followed by centrifugation (15,000 rpm, 8 minutes, 4 ° C. ). After discarding the supernatant, 10 ⁇ L of Hi Di Formamide was added, and after heating at 100 ° C.
  • FIG. 3 shows the primary structure predicted from the base sequence of L-amino acid oxidase (wild-type enzyme) derived from Pseudomonas sp. H-8-1-3.
  • the composition of the PCR reaction solution was 35 ⁇ L of water, 10 ⁇ Ex Taq buffer 5 ⁇ L, 2 mM dNTP 5 ⁇ L, 100 pmol / ⁇ L primer 5 (5′-TATAATCATATGAACAAGAACAACCGCCA-3 ′) (SEQ ID NO: 21) 1 ⁇ L, 100 pmol / ⁇ L primer 6 (5 '-TATTACTCGAGTCAGTCCGCCAGGGCGATTG-3') (SEQ ID NO: 22) 1 ⁇ L, template DNA 100 ng and Ex Taq 5 unit.
  • Primers 5 and 6 were provided with NdeI and XhoI restriction enzyme sites, respectively.
  • the PCR reaction conditions were (i) 98 ° C for 5 minutes, (ii) 96 ° C for 10 seconds, (iii) 50 ° C for 5 seconds, (iv) 60 ° C for 4 minutes, and (ii) 31 cycles. did.
  • the expression plasmid was constructed so that the L-amino acid oxidase produced by this recombinant Escherichia coli was produced as a fusion protein with a 6 ⁇ histidine tag added to the N-terminal side.
  • Bacteria are collected in a large centrifuge (5,000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.), washed with physiological saline (0.9% NaCl), and then 100 mL of 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) (KPB) It was suspended in. 100 mL of the bacterial cell solution was sonicated for 15 minutes, and the supernatant obtained by centrifugation (8,000 rpm, 20 minutes, 4 ° C.) was used as a cell-free extract.
  • KPB 20 mM phosphate buffer
  • the cell-free extract was adsorbed on a Ni-Sepharose column substituted with 20 mM KPB, washed with 20 mM KPB, and then the enzyme solution was eluted with 20 mM KPB containing 500 mM imidazole.
  • PCR for mutagenesis was performed using the expression plasmid introduced with the L-amino acid oxidase gene constructed in (8) (ii) above as a template.
  • the PCR reaction used the QuikChange (R) Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene).
  • the composition of the PCR reaction solution was 16.5 ⁇ L of sterilized water (MilliQ), 10 ⁇ QuikChange Lightining Multi reaction buffer 2.5 ⁇ L, 100 ng / ⁇ L template DNA 1.0 ⁇ L, 100 ng / ⁇ L primer 7 (5'-GTGGTGATGACCAATNNSGACGACCACCAACAC-3 ') ( SEQ ID NO: 23) 1.0 ⁇ L, 100 ng / ⁇ L primer 8 (5′-GCGGTGCTGACGACCNNSCAGAGTTGGCTGCTG-3 ′) (SEQ ID NO: 24) 1.0 ⁇ L, and 100 ng / ⁇ L primer 9 (5′-AAGCCAGGGGTGATCNNSCTGTCCTACGCGTGG-3 ′) (SEQ ID NO: 25 ) 1.0 ⁇ L, dNTP mix 1.0 ⁇ L, QuikChange Lightning Multi enzyme blend 1.0 ⁇ L.
  • the PCR reaction conditions were (i) 95 ° C for 2 minutes, (ii) 95 ° C for 20 seconds, (iii) 55 ° C for 30 seconds, (iv) 65 ° C for 4 minutes, (v) (ii) to (ii) iv) 5 minutes at 65 ° C.
  • 1.0 ⁇ L of DpnI was added and left at 37 ° C. for 5 minutes (Sample 1).
  • primer 10 (5′-CATGTGCCAGAGCGTNNSGCGCACTGGCCCGAA-3 ′) (SEQ ID NO: 26) 1.0 ⁇ L and 100 ng / ⁇ L primer 11 (5′-ACCACCCAGATCGACNNSGAAGAGTCGTTGTTC-3 ′) (SEQ ID NO: 27) 1.0 ⁇ L
  • primer 11 5′-ACCACCCAGATCGACNNSGAAGAGTCGTTGTTC-3 ′
  • Samples 1 and 2 were each transformed into Escherichia coli JM109 and cultured in 5 ml of LB liquid medium containing 500 ⁇ g of ampicillin at 37 ° C. for 12 hours. After completion of the culture, each sample was collected with a centrifuge (13,000 rpm, 4 ° C., 5 minutes). Plasmids were extracted from the collected bacterial cells by the alkali-miniminprep method. The alkali-mini prep method was performed according to the following procedure. (1) The Escherichia coli culture solution holding the plasmid DNA is transferred to a 1.5 mL tube and centrifuged to collect the cells as pellets.
  • the solution containing the obtained plasmid DNA is subjected to phenol / chloroform extraction to remove proteins. (7) Add twice as much ethanol as the plasmid solution and let stand on dry ice for 5 minutes. (8) A plasmid DNA precipitate is obtained by centrifugation. (9) The obtained plasmid DNA precipitate is dissolved in TE [10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA] to prepare a sample.
  • the product obtained from PCR1 was designated as plasmid1
  • the product obtained from PCR2 was designated as plasmid2
  • each was transformed into E. coli BL21 (DE3) by the heat shock method.
  • the procedure of the heat shock method is as follows. 5 ⁇ l of each plasmid was mixed with 50 ⁇ l of E. coli BL21 (DE3) and allowed to stand on ice for 60 minutes. Then, after heat shocking at 42 degrees for 90 seconds, 1 ml of LB liquid medium was added and incubated at 37 degrees for 1 hour. It was applied to a plate containing ampicillin and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
  • the activity of the obtained colony supernatant was again measured using p-chloromercuribenzoate (PCMB).
  • SH groups in proteins react with metal ions to form mercaptides. Although this reaction is reversible, in general, the equilibrium is large and biased toward mercaptides. Hg2 + has high hydrophilicity to the SH group. It is known in the art that an enzyme having oxidase activity or monooxygenase activity depends on the oxidase activity by adding a PCMB reagent.
  • mutant enzyme C254I the mutant enzyme
  • the mutant enzyme obtained from the results of these screenings was purified by the method described in (8) (iii) above. As shown in FIG. 1, the wild-type enzyme accounts for the majority of the monooxygenase reaction compared to the oxidase reaction, but the purified mutant enzyme C254I is not affected by PCMB, and the production of monooxygenase by HPLC No object was detected.
  • FIG. 8 shows the effect of pH on each of the wild type enzyme and the mutant type enzyme.
  • the wild-type enzyme catalyzes not only L-lysine but also L-arginine and L-ornithine at pH 7.0, so that L-lysine can be accurately quantified with the wild-type enzyme.
  • the reaction must be performed at pH 6.5 or lower.
  • the mutant enzyme C254I has high substrate specificity for L-lysine even in the vicinity of pH 7.0, so that L-lysine is not dependent on the pH of the reaction system. It is possible to detect specifically.
  • FIG. 8A the wild-type enzyme catalyzes not only L-lysine but also L-arginine and L-ornithine at pH 7.0, so that L-lysine can be accurately quantified with the wild-type enzyme.
  • the mutant enzyme C254I has high substrate specificity for L-lysine even in the vicinity of pH 7.0, so that L-lysine is not dependent on the pH of the reaction system. It is possible to detect specifically.
  • FIG. 8A the mutant enzyme C254I
  • the specific activity of the wild-type enzyme at pH 6.5 is 0.56 U / mg, whereas the specific activity of the mutant enzyme C254I at pH 7.5 is 2.5 U / mg. Met.
  • the mutant enzyme C254I had higher oxidase activity than the wild-type enzyme.
  • mutant enzyme C254I was measured using amino acids other than L-lysine, L-arginine and L-ornithine as substrates.
  • the activity measuring reagent and activity measuring method are as shown in the above (1) and (2).
  • the reaction conditions were pH 7.0 and 30 ° C.
  • the result is shown in FIG. 9B.
  • FIG. 9A shows the results for the wild type enzyme.
  • the mutant enzyme C254I has no activity against L-arginine and L-ornithine, and also has no activity against other amino acids, and oxidase only against L-lysine. Showed activity. It was shown that the mutant enzyme of the present invention exhibits oxidase activity with high substrate specificity for L-lysine and can specifically detect L-lysine.
  • the above-described reagent composition for L-lysine measurement was prepared using the wild-type enzyme purified in (8) (iii) above and the mutant enzyme C254I. L-lysine measurement was performed using this reagent composition. As a specimen, a 1 to 10 mM L-lysine aqueous solution was prepared. As a result, when an L-lysine aqueous solution was used as a specimen, reactivity was observed, and the L-lysine concentration and measurement data showed a good positive correlation (see FIG. 10).
  • oxidase activity for L-lysine, L-arginine and L-ornithine was also measured for the mutants obtained by the saturation mutation described above in which the 254th cysteine was replaced with an amino acid other than isoleucine.
  • the activity measuring reagent and activity measuring method are as shown in the above (1) and (2).
  • the reaction conditions were pH 7.0 and 30 ° C.
  • the results are shown in Tables 6 and 7 and FIGS.
  • each of the mutant-type enzymes also has L-ornithine and L-arginine when the oxidase activity for L-lysine is 100% compared to the wild-type enzyme.
  • mutant enzymes also showed high oxidase activity with high substrate specificity for L-lysine in that their relative activities were low.
  • methionine (Met) methionine (Met), phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr), alanine (Ala), valine (Val), isoleucine (Ile), leucine (Leu), aspartic acid (Asp) )
  • the mutant enzyme substituted with glutamic acid (Glu) or serine (Ser) both of the above relative activities of L-arginine oxidase activity and L-ornithine oxidase activity are lower than those of the wild type enzyme.
  • the mutant enzyme had a particularly high substrate specificity for L-lysine (see Table 7 and FIG. 12). Furthermore, in the mutated enzyme substituted with tyrosine or isoleucine, none of the oxidase activities for L-ornithine and L-arginine was detected, and these enzymes have very high substrate specificity for L-lysine. (Tables 6 and 7, and FIGS. 11 and 12).
  • those in which the 254th cysteine is replaced with an amino acid other than isoleucine are the amino acids constituting the protein, L-tyrosine, L-alanine, L-cysteine, L -Aspartic acid, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-methionine, L-asparagine, L-proline, L-glutamine, L-serine, L-threonine, L-valine, L-amino acid oxidase activity was measured using each of L-phenylalanine and L-tryptophan as substrates.
  • the oxidase activity of the mutant enzyme C254I was measured using a human plasma sample to which L-lysine, L-ornithine, or L-arginine was added.
  • human plasma Amicon Ultra-0.5 (UFC501096, Millipore) was used, and a deproteinized solution was prepared by centrifugation at 16,100 ⁇ g, 4 ° C. for 30 minutes.
  • L-lysine, L-ornithine, or L-arginine was added to the prepared human plasma so that the final concentration was 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ⁇ M, and did.
  • the composition of the measurement reagent and the measurement method were as shown in (1) and (2) above, and the reaction conditions were pH 7.0 and 30 ° C. The results are shown in FIG. As a comparison target, the oxidase activity of wild-type enzyme was similarly measured using a human plasma sample. The result is shown in FIG.
  • oxidase activity was detected in ornithine and arginine, although lysine could be quantified in the wild-type enzyme.
  • mutant enzyme C254I as shown in FIG. 14, oxidase activity was detected only for L-lysine, and a linear calibration curve could be drawn.

Abstract

変異型酵素を利用したL-リジンの測定方法、L-リジン測定用キット及び酵素センサを提供する。 所定のアミノ酸変異を有し、かつL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有する変異型L-アミノ酸オキシダーゼ、並びにこの変異型酵素を利用したL-リジンの測定方法、L-リジン測定用キット及び酵素センサ。

Description

新規Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ－リジンの測定方法、キット及び酵素センサ 関連出願の相互参照
　本出願は、２０１２年１月３０日出願の日本特願２０１２－１６１６５号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、新規L-アミノ酸オキシダーゼ、並びにこの新規L-アミノ酸オキシダーゼを用いるL-リジンの測定方法、それに用いるキット及び酵素センサに関する。より詳しくは、本発明は、L-リジンに対する基質特異性の高い変異型L-アミノ酸オキシダーゼ、並びにこの変異型酵素を利用したL-リジンの測定方法、L-リジン測定用キット及び酵素センサに関する。
　L-リジンは、タンパク質構成アミノ酸の一つであるが、体内で生産できない必須アミノ酸である。L-リジンを含むアミノ酸の濃度は、生体内では、恒常性が維持されているが、先天性代謝異常や内臓疾患により、血中濃度が大きく変動する。L-リジンに限らず、生体内のアミノ酸濃度は疾病を検出する有用な手段となり得る。このため、1種類もしくは多種類のアミノ酸の血中濃度を測定することにより、これらの疾病を検出することが可能となる（特許文献１、及び非特許文献１）。
　近年、アミノ酸の定量法として酵素を用いる方法が多数知られている。酵素を用いる方法は、機器分析的手法と比べ安価で簡易的に行うことができるという利点がある。定量用酵素としては、例えば、デヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼが多く用いられる。オキシダーゼを用いる場合、アミノ酸にオキシダーゼを作用させることで生成される過酸化水素をペルオキシダーゼで検出し、定量する方法が挙げられる（特許文献２）。この検出および定量には、比色法、蛍光法、電極法のいずれの方法も利用可能である。
　L-リジンの定量法としても酵素を用いる方法が知られている。例えば、オキシダーゼによる定量には、L-リジンαオキシダーゼ[EC 1.4.3.14]が用いられてきた。トリコデルマ・ビリデ由来のL-リジンαオキシダーゼは、他のL-アミノ酸オキシダーゼに比べ、基質特異性が高く、市販もされていることから、酵素センサなどの素子として利用されてきた（非特許文献２、非特許文献３、及び非特許文献４）。
　また、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）由来のL-リジンモノオキシゲナーゼにL-リジンオキシダーゼ活性があるという報告がある（非特許文献５、及び非特許文献６）。この酵素は、L-リジン、L-オルニチン、L-アルギニンを基質とする。
特許文献１：国際公開WO2006/129513号公報
特許文献２：日本特開昭55-43409号公報
非特許文献１：Anal. Chem. 81: 307-314 (2009)
非特許文献２：Sens. Actuators, B 126: 424-430 (2007)
非特許文献３：Anal. Bioanal. Chem. 391: 1255-1261 (2008)
非特許文献４：Anal. Bioanal. Chem. 406: 19-23 (2010)
非特許文献５：J. Biol. Chem. 249: 2579-2586 (1974)
非特許文献６：J. Biol. Chem. 249: 2587-2592 (1974)
　しかしながら、トリコデルマ・ビリデ由来のL-リジンαオキシダーゼは、L-リジン以外のアミノ酸に対してもオキシダーゼ活性を示す。そのため、血漿のような多種類のアミノ酸を含有する試料をL-リジンα-オキシダーゼを用いて定量した場合、過剰評価になる傾向がある。
　また、最近、上記L-リジンα-オキシダーゼに比べて、基質特異性が高い海水魚の粘液由来のL-リジンα-オキシダーゼが報告されている(非特許文献３)。しかし、このL-リジンα-オキシダーゼは、海水魚の粘液由来のであり、培養による酵素生産についての報告はない。従って、この酵素を大量生産してL-リジンの定量に用いることは困難である。
　さらに、シュードモナス・フルオレッセンス由来のL-リジンモノオキシゲナーゼをL-リジン定量に用いた報告はない。また、この酵素をL-リジン定量に用いたとしても、上述のように、L-リジン以外のL-オルニチンおよびL-アルギニンに対してもオキシゲナーゼ活性を有することから、血漿のような多種類のアミノ酸を含有する試料については、L-リジンの定量を厳密に行うことはできない。
　L-リジンのオキシダーゼによる定量法は、実現できれば、機器分析的手法と比べ安価で簡易的に行うことができるという観点から有用である。しかし、上述の通り、血漿のような多種類のアミノ酸を含有する試料については、現在までに利用可能な酵素では、基質特異性が低いか、あるいは酵素生産性に問題があるなどの点から、実用に供することができる状況ではなかった。
　そこで、本発明は、多種類のアミノ酸を含有する生体試料であってもL-リジンを特異的に定量可能である酵素として、L-リジンに対する基質特異性が高い酵素を提供すること、さらにはこの酵素を用いたL-リジンの酵素的測定法を提供することを目的とする。
　さらに本発明は、上記酵素的測定法を実施する際に利用できる測定用のキットを提供することも目的とする。
　加えて本発明は、上記酵素的定測定法に利用できる酵素センサを提供することも目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株に由来する上記Ｌ－アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列において第２５４番目のシステインを所定のアミノ酸に置換することにより得られる変異型Ｌ－アミノ酸オキシダーゼが、Ｌ－リジンに対して高い基質特異性を有することを見出した。本発明は、係る知見により完成されたものである。
　即ち、本発明は、以下に示すとおりである。
〔１〕
下記の（１）から（３）の何れかに記載のタンパク質：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２５４番目のシステインがメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン又はプロリンで置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質； 
（２）上記（１）に規定されるタンパク質において上記第２５４番目のアミノ酸を除く領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質;または 
（３）上記（１)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６７％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質、但し、該タンパク質のアミノ酸配列において上記第２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は変異しないものとする。
〔２〕
上記２５４番目のアミノ酸がメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はセリンである、〔１〕に記載のタンパク質。
〔３〕
上記２５４番目のアミノ酸がイソロイシン又はチロシンである、〔１〕又は〔２〕に記載のタンパク質。
〔４〕
上記（２）又は（３）に規定され、かつ第２５４番目のシステインがトリプトファン、グリシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン又はプロリン以外のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質において、該タンパク質のL-リジンに対するオキシダーゼ活性を１００％とした場合、上記タンパク質のL-アルギニンに対するオキシダーゼ活性が１５％以下であり、かつL-オルニチンに対するオキシダーゼ活性が８０％以下である、〔１〕から〔３〕の何れかに記載のタンパク質。
〔５〕
〔１〕から〔４〕の何れかに記載のタンパク質をコードする核酸。
〔６〕
〔５〕に記載の核酸を含む、ベクター。
〔７〕
〔６〕に記載のベクターにより形質転換された、形質転換体。
〔８〕
以下の工程を含む、L-リジンを検出又は定量する方法：
（Ａ）水と酸素の存在下で、検体と〔１〕から〔４〕の何れかに記載のタンパク質とを保持する工程；及び
（Ｂ）上記タンパク質のL-リジンに対するオキシダーゼ活性の作用により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを検出又は定量する工程
を含む、上記方法。
〔９〕
工程（Ｂ）において検出又は定量する反応生成物が過酸化水素である、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕
上記過酸化水素を、ペルオキシダーゼを用いて検出又は定量する、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕
工程（Ｂ）において検出又は定量する反応生成物がアンモニアである、〔８〕に記載の方法。
〔１２〕
アンモニアを、アンモニア検出試薬を用いて検出又は定量する、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕
工程（Ｂ）において検出又は定量する反応生成物がＬ-リジンの脱アミノ化生成物である、〔８〕に記載の方法。
〔１４〕
〔１〕から〔４〕の何れかに記載のタンパク質を含む、Ｌ-リジンの検出又は定量用キット。
〔１５〕
反応用緩衝液、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬、及びＬ-リジンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つをさらに含む、〔１４〕に記載のキット。
〔１６〕
過酸化水素検出用電極を含む、Ｌ-リジンの検出又は定量用酵素センサであって、
上記過酸化水素検出用電極の表面又は近傍に〔１〕から〔４〕の何れかに記載のタンパク質が配置してなる、上記センサ。
〔１７〕
上記過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極又は隔膜式過酸化水素電極である、〔１６〕に記載のセンサ。
　本発明によれば、Ｌ－リジンに対する基質特異性の高い新規の変異型Ｌ－アミノ酸オキシダーゼを提供できる。この変異型Ｌ－アミノ酸オキシダーゼを用いることにより、他のアミノ酸など多くの夾雑物を含む試料においても、Ｌ－リジンを特異的かつ精度良い簡便・迅速な検出及び定量が可能となる。特に、血漿、血清又は尿のような生体試料に対して本発明は有効であり、ペルオキシダーゼ等の酵素とカップリングさせることにより発色法や蛍光法でＬ－リジンを定量できるのみならず、電極型酵素センサをも提供することが可能である。
図１は、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来のＬ－アミノ酸オキシダーゼ（野生型酵素）が触媒するＬ－リジンを基質としたモノオキシゲナーゼ反応及びオキシダーゼ反応の反応機構とその割合とを示す。 図２は、上記野生型酵素のＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真を示す。 図３は、上記野生型酵素をコードする塩基配列から予測されるアミノ酸配列を示す。 図４は、上記野生型酵素のアミノ酸配列、本発明のタンパク質である変異型酵素Ｃ２５４Ｉのアミノ酸配列、並びに公知のホモログ遺伝子のアミノ酸配列についてアライメント解析を行った結果を示す。図４において、LysOX Wild typeは、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来のＬ－アミノ酸オキシダーゼ、LysOX C254Iは、本発明の変異型酵素Ｃ２５４Ｉを示し、その他は公知のアミノ酸配列はアクセション番号で示されている。 図５は、図４に示すアラインメント解析の続きを示す。 図６は、実施例において精製した野生型酵素のＬ－リジン(Lys)、Ｌ－オルニチン（Orn）、及びＬ－アルギニン（Arg）に対する酵素活性（ｐＨ依存性）を示す。 図７は、実施例において精製した野生型酵素標品を用いた、１～６ｍＭのＬ－リジン水溶液を検体とした場合のＬ－リジン濃度と４９２nmにおける吸光度（アブソーバンス）との相関関係を示す。 図８は、野生型酵素及び本発明の変異型酵素Ｃ２５４Ｉについて、Ｌ－リジン、Ｌ－オルニチン、及びＬ－アルギニンを基質として酵素活性（ｐＨ依存性）を調べた結果を示す。 図９は、野生型酵素及び本発明の変異型酵素Ｃ２５４Ｉについて、基質特異性を調べた結果を示す。 図１０は、野生型酵素及び本発明の変異型酵素Ｃ２５４Ｉを用いて、１～１０ｍＭのＬ－リジン水溶液を検体とした場合のＬ－リジン濃度と吸光度（アブソーバンス）との関係を示す。図１０において、LysOX Wild typeが野生型酵素の結果を示し、LysOX C254Iが本発明の変異型酵素Ｃ２５４Ｉの結果を示す。 図１１は、野生型酵素のアミノ酸配列における第２５４番目のシステインを各種アミノ酸に変異させて得られた各種変異型酵素の基質特異性を調べた結果を示す。 図１２は、図１１の結果に関し、Ｌ－リジンに対するオキシダーゼ活性を１００％として、Ｌ－アルギニン及びＬ－オルニチンの相対活性を示す。 図１３は、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、及びＬ－オルニチンを添加した血漿サンプルについて、野生型酵素を用いて各アミノ酸を定量した結果を示す。 図１４は、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、及びＬ－オルニチンを添加した血漿サンプルについて、本発明の変異型酵素Ｃ２５４Ｉを用いて各アミノ酸を定量した結果を示す。
＜変異型Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ＞
　本発明は、下記の（１）から（３）の何れかに記載のタンパク質に関する。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２５４番目のシステインがメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン又はプロリンで置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質； 
（２）上記（１）に規定されるタンパク質において上記第２５４番目のアミノ酸を除く領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質;または 
（３）上記（１)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６７％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質、但し、該タンパク質のアミノ酸配列において上記第２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は変異しないものとする。
　上記（１）に記載のタンパク質において、配列番号２に示すアミノ酸配列は、シュードモナス属菌株を新たに自然界より分離し、本シュードモナス属に属する微生物が産生するＬ－アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子をクローニングすることにより得られたものである。この点については実施例において詳述する。
　上記配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、実施例において確かめられている通り、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質である。該タンパク質が有するＬ－アミノ酸オキシダーゼ活性は、酸素及び水の存在下、ｐＨ７．０（３０℃）においてＬ－リジン、Ｌ－オルニチン及びＬ－アルギニンのそれぞれに作用して過酸化水素とアンモニアとを生成する活性である。本明細書では、以下、Ｌ－リジン、Ｌ－オルニチン及びＬ－アルギニンに対する上記オキシダーゼ活性を、それぞれＬ－リジンオキシダーゼ活性、Ｌ－オルニチンオキシダーゼ活性、及びＬ－アルギニンオキシダーゼ活性と言う。なお、これらオキシダーゼ活性は、以下の実施例に記載の測定試薬及び測定方法を用いることにより測定することが出来る。
　本発明の上記（１）に規定されるタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２５４番目のシステインをメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン又はプロリンに置換することにより得られる変異型Ｌ－アミノ酸オキシダーゼである。上記第２５４番目のアミノ酸をこれらアミノ酸に置換して得られるタンパク質は、実施例で示される通り、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対するオキシダーゼ活性の特異性が高い。
　「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性」を有する本発明のタンパク質は、野生型アミノ酸オキシダーゼ（以下、野生型酵素）と比較してＬ－リジンに対する基質特異性が相対的に高いタンパク質を言う。具体的には、野生型酵素と比較してＬ－リジンオキシダーゼ活性に対するＬ-アルギニンオキシダーゼ活性の比率、Ｌ－リジンオキシダーゼ活性に対するＬ－オルニチンオキシダーゼ活性の比率、又はＬ－リジンオキシダーゼ活性に対するＬ-アルギニンオキシダーゼ活性の比率及びＬ－リジンオキシダーゼ活性に対するＬ－オルニチンオキシダーゼ活性の比率の両方が低いことを意味する。本発明において、「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性」を有するタンパク質としては、Ｌ-リジンに対する基質特異性がより高いという観点では、Ｌ－リジンオキシダーゼ活性に対するＬ-アルギニンオキシダーゼ活性の比率、及びＬ－リジンオキシダーゼ活性に対するＬ－オルニチンオキシダーゼ活性の比率の両方が、上記野生型酵素と比較して低いタンパク質が好ましい。
　さらに、野生型酵素と比較して、「L-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性」を与えるという点では、上記（１）に規定させるタンパク質において、上記第２５４番目のアミノ酸はメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はセリンであることが好ましい。上記第２５４番目のアミノ酸をこれらアミノ酸に置換した場合には、以下の実施例で示される通り、Ｌ－リジンオキシダーゼ活性に対するＬ-アルギニンオキシダーゼ活性の比率、並びにＬ－リジンオキシダーゼ活性に対するＬ－オルニチンオキシダーゼ活性の比率の両方が、上記野生型酵素と比較して低いからである。さらに加えて、L-リジンに対するオキシダーゼ活性の基質特異性が顕著に向上したタンパク質（アミノ酸オキシダーゼ）であるという観点では、上記第２５４番目のアミノ酸はイソロイシン又はチロシンであることが好ましい。
　本発明のタンパク質は、上記（２）及び（３）に規定される範囲において、上記L-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有する限り特に限定されるものではないが、該タンパク質のＬ-リジンオキシダーゼ活性を１００％とした場合に、該タンパク質のＬ－アルギニンオキシダーゼ活性は１５％以下であることが好ましく、さらに好ましくは１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．０１％以下、０％である。加えて、該タンパク質のＬ－オルニチンオキシダーゼ活性は、８０％以下であることが好ましく、さらに好ましくは６０％以下、より一層好ましくは５０％以下、さらにより一層好ましくは２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．０１％以下、０％である。因みに、基準となる野生型酵素の場合、ｐＨ７．０、３０℃においてＬ-リジンオキシダーゼ活性を１００％とした場合に、Ｌ－アルギニンオキシダーゼ活性は２０％程度であり、及びＬ－オルニチンオキシダーゼ活性は８３％程度である。
　さらに、本発明のタンパク質は、上述の「L-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性」を示す限り、そのL-リジンオキシダーゼ活性の絶対値は特に限定されるものではない。例えば、本発明のタンパク質のL-リジンオキシダーゼ活性は、少なくとも野生型酵素のL-リジンオキシダーゼ活性と同等であるか、或いはそれ以上であることが好ましい。具体的には、本発明のタンパク質は、pＨ７．０においてL-リジンオキシダーゼ活性が０．６Ｕ／ｍｇ以上であることが好ましく、さらに好ましくは１．０Ｕ／ｍｇ以上である。
　また、L-リジン、L-オルニチン及びL-アルギニン以外のタンパク質構成アミノ酸である、L-チロシン、L-アラニン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-メチオニン、L-アスパラギン、L-プロリン、L-グルタミン、L-セリン、L-スレオニン、L-バリン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファンに対し、本発明のタンパク質の変異型L-アミノ酸オキシダーゼは活性を示さない。
　本発明において、上記（２）に規定されるタンパク質は、「上記（１）に規定されるタンパク質において上記第２５４番目のアミノ酸を除く領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質」である。ここで、「１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は、欠失等を有するタンパク質が、上記L-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有する限り特に限定されるものではない。前記「１から数個」の範囲は、上記L-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質である割合が高いことから、例えば、１から３０個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から７個、一層好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個、１から２個、１個程度であることができる。
　本発明において、上記（３）に規定されるタンパク質は、「上記（１)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６７％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質、但し、該タンパク質のアミノ酸配列において上記第２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は変異しないものとする。」である。
　本発明において、「上記（１)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６７％の配列同一性を有するアミノ酸配列」における「配列同一性」は、該アミノ酸配列の同一性を有するタンパク質が、上記Ｌ－リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の配列同一性は、６７％以上であれば特に限定されないが、好ましくは６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上又は７４％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、より一層好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上である。本発明において「配列同一性」という語は、２以上のアミノ酸配列の互いに対するアミノ酸の同一性の程度を指す。したがって、ある二つのアミノ酸配列の同一性が高い程、それらの配列の同一性ないし類似性は高い。２種類のアミノ酸配列が同一性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
　さらに、本発明において、「但し、該タンパク質のアミノ酸配列において上記第２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は変異しないものとする。」における「変異」とは、具体的にはアミノ酸の欠失又は置換を意味する。つまり、「但し、該タンパク質のアミノ酸配列において上記２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は変異しないものとする。」とは、上記（３）に規定されるタンパク質のアミノ酸配列において、配列同一性の判断の基準となる上記（１）のタンパク質のアミノ酸配列における第２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が、上記（１）のタンパク質のアミノ酸配列における第２５４番目のアミノ酸と同一であることを意味する。従って、上記（１）のタンパク質における置換されたアミノ酸がイソロイシンであれば、上記（３）のタンパク質のアミノ酸配列における上記第２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸はイソロイシンとなる。
　上記（３）に規定されるタンパク質のアミノ酸配列において、配列同一性の判断の基準となる上記（１）のタンパク質のアミノ酸配列における第２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、上述した配列同一性ないし相同性の解析により調べることができる。具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて、配列番号２に示されるアミノ酸配列又は上記（１）のタンパク質のアミノ酸配列に対して解析対象のアミノ酸配列のアライメント解析を行えば、上記第２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸を検索することが可能である。このようなアライメント解析の手法は当業者に広く知られている。
　本発明の上記タンパク質は、上記（１）から（３）に規定される範囲に属するものである限りその由来は特に限定されるものではない。例えば、本発明のタンパク質は、各種遺伝子工学的技術により製造した組換えタンパク質であってもよいし、化学合成により製造した合成タンパク質であってもよく、或いは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＬ－アミノ酸オキシダーゼの遺伝子ホモログを有する特定の生物種（例えば、細菌）に変異原を与えることにより本発明の変異型酵素を産生し得る変異体を獲得して、該変異体が産生するタンパク質を抽出及び生成することによって製造したタンパク質であってもよい。
　遺伝子工学技術により本発明の組換えタンパク質を製造する場合には、上述のタンパク質（１）、（２）又は（３）をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を作成し、各種発現ベクターに組み込むことにより、本発明のタンパク質を発現させることができる。本発明のタンパク質をコードする核酸を作製するに当たり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第２５４番目のシステイン又は該システインに相応するアミノ酸を上記（１）に記載の所定のアミノ酸に置換するため、或いは上記（２）に規定のタンパク質においてアミノ酸の欠失、置換及び／または付加を施すため、或いは上記（３）に規定のタンパク質において配列番号２のアミノ酸配列と所定の同一性を有するタンパク質をコードする核酸を準備するためには、例えば、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法、各種部位特異的変異導入法などにより、任意の塩基の欠失、置換及び／または挿入を行うことができる。このようにして作製した本発明のタンパク質をコードする核酸を適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を製造することができる。
　本発明のタンパク質を製造するために利用可能な発現系としては、特に限定させるものではないが、例えば各種生物種（ホスト）において組換えタンパク質の発現を可能とする発現ベクターを利用することができる。利用可能な発現ベクターとしては、細菌、菌類（例えば、酵母類）等の微生物、植物、昆虫細胞、哺乳類細胞などのホストにおいてタンパク質の発現を可能とする各種発現ベクターを用いることが可能であり、ウイルスベクター（ファージベクターを含む）でもプラスミドベクターであってもよい。或いは、ウサギ網状赤血球ライセート、小麦胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いた無細胞タンパク質発現系を用いて、本発明のタンパク質を製造してもよい。
　特定の生物種をホストとして用いた発現系で本発明のタンパク質を発現させる場合には、上記本発明のタンパク質をコードする核酸をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む、製造方法により調製することができる。
　本発明のタンパク質をコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体は本発明の一態様である。
　本発明のタンパク質をコードする核酸の取得方法は特に限定されない。例えば、以下の実施例に記載の通り、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H-８-１-３株から単離したL-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子（配列番号１及び２）をコードする核酸を材料として本発明のタンパク質をコードする核酸を取得してもよいし、或いは本発明のタンパク質ないし配列番号２に記載のアミノ酸配列（L-アミノ酸オキシダーゼ）と相同性を有する遺伝子を各種細菌から単離し、該遺伝子をコードする核酸を調製して、上記２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を行って、本発明のタンパク質をコードする核酸を製造してもよい。また、本発明のタンパク質をコードする核酸は、配列番号１に記載の塩基配列若しくは配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載の塩基配列と一定の同一性を有する公知の塩基配列若しくは配列番号２に記載のアミノ酸配列と一定の同一性を有する公知のアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
　配列番号２に示されるアミノ酸配列は、本発明者らが自然界から単離したシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来のＬ－アミノ酸オキシダーゼ（野生型酵素）のアミノ酸配列であるが、本Ｌ－アミノ酸オキシダーゼには一定の相同性を示す遺伝子が多数知られている。例えば、表１に示す細菌由来の遺伝子が知られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　野生型酵素のアミノ酸配列、本発明のタンパク質である変異型酵素Ｃ２５４Ｉのアミノ酸配列、並びに表１に示す既知遺伝子のアミノ酸配列についてアライメント解析を行った結果を図４及び５に示す。図４において、矢印で示される位置のアミノ酸が上記２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸である。図４に示される通り、上記野生型酵素と同様に表１に示される既知遺伝子も上記２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸はシステインである。本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、これら既知遺伝子の配列に基づいて設計してもよいし、その他公知のホモログ遺伝子の配列情報に基づいて設計してもよい。
　本発明のタンパク質をコードする核酸は、具体的には、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。また、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから、本発明のタンパク質をコードする核酸を製造する上で、核酸に部位特異的な変異を導入するために有用である。
　例えば、本明細書中の配列表の配列番号１に記載した塩基配列または配列番号２に示すアミノ酸配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H-８-１-３株を含む細菌のcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のタンパク質をコードする核酸を製造するための材料となる核酸を準備することができる。cDNAまたはゲノムライブラリーは、常法により作製することができる。
　また、ＰＣＲ法により本発明のタンパク質をコードする核酸を製造するための材料を取得することもできる。例えば、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H-８-１-３株を含む細菌のゲノムＤＮＡ、cDNA又はゲノムライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒～１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。増幅されたＤＮＡ断片は、本発明のタンパク質をコードする核酸を製造するための材料として用いることができる。さらに、増幅されたＤＮＡ断片を、次いで、大腸菌（E. coli）等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることにより得られたベクターも本発明のタンパク質をコードする核酸を製造するための材料として用いることができる。
　上述の通り準備した、本発明のタンパク質をコードする核酸を製造するための材料において、上記２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）に各種変異導入法を用いて塩基の置換を施し、本発明のタンパク質をコードする核酸、又は該核酸を含むベクターを製造することが出来る。なお、上記したプローブ又はプライマーの調製、ゲノムライブラリーの構築、ゲノムライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知である。
　本発明のタンパク質をコードする核酸は適当なベクター中に挿入した状態で使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記核酸には、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
　細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、ゲオバチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus subtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌（E. coli）のlac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
　哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ－１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
　また、上記ベクターにおいて、本発明のタンパク質をコードする核酸は、必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明のタンパク質をコードする核酸を含むベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。L-アミノ酸オキシダーゼの遺伝子を含む組換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
　本発明のタンパク質をコードする核酸を含むベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明のタンパク質をコードする核酸、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
　さらに、本発明のタンパク質をコードする核酸を含むベクターを適当な宿主に導入することによって、本発明の形質転換体を作製することができる。本発明のベクターを導入される宿主細胞は、細胞内で本発明のベクターが複製されるものであれば任意の細胞でもよい。さらに、本発明のタンパク質を発現する形質転換体を作製する場合には、ベクターの複製に加えて、言うまでもなく本発明のタンパク質の発現が可能となる任意の細胞である。このような宿主細胞の例としては、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
　細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌（E. coli）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
　酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
　他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
　昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
　バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
　昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
　組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
　上記の形質転換体は、本発明のベクターの複製を可能にする条件下、或いは本発明のタンパク質の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。本発明のタンパク質を発現させた場合には、形質転換体の培養物（形質転換体及び培養培地を含む）から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明のタンパク質を精製標品として得ることができる。
＜L-リジンの定量方法＞
　本発明のL-リジンの定量方法は、以下の通りである。
以下の工程を含む、L-リジンを検出又は定量する方法：
（Ａ）水と酸素の存在下で、検体と本発明のタンパク質とを保持する工程；及び
（Ｂ）上記タンパク質のL-リジンに対するオキシダーゼ活性の作用により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを検出又は定量する工程
を含む、上記方法。
　本発明の方法で、検体として用いられる生体試料は、L-リジンを含む可能性のある試料であれば、如何なるものでもよい。生体試料に本発明のタンパク質を作用させて生じる、どの生成物を定量することで生体試料中のL-リジンの濃度を測定するのかにより、生体試料は適宜選択することができる。例えば、発色剤や蛍光剤を利用して上記生成物を定量する場合には無色の水溶液であることが好ましく、血清及び血漿などが例として挙げられる。
　本発明のタンパク質によるL-リジン(L-Lysine)の酸化反応を以下の反応式Aに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本発明の方法で用いる上述のタンパク質は、上記式Aに示す反応を触媒する。
工程（Ａ）
　工程（Ａ）における本発明のタンパク質の混合量は、10 mU/ml（リジン1μmolを1分間で消費する活性を示す酵素量を1 Uとする）以上とすることが適当であり、水の混合量は、サンプル中のリジン濃度に応じて適宜決定できるが、例えば、5～95%の範囲とすることができる。本発明のタンパク質の混合量の上限は特にないが、実用的には、例えば、100 mU/ml以下であることができる。しかし、本発明のタンパク質の混合量および水の混合量は、この範囲に限定する意図ではなく、適宜調整できる。
　さらに、本発明のタンパク質および水に加えて、好ましくは、反応用緩衝液を含むことができる。反応用緩衝液のｐＨは、上述した本発明のタンパク質が有するＬ－リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性が確保される限り特に限定されるものではなく、L-リジンに対するオキシダーゼ活性の至適pHとL-リジンに対する基質特異性との関係を考慮して適宜調整すればよい。例えばｐＨ１．０～１４の範囲から、各酵素の性質を考慮してL-リジンの検出を可能とするＬ－リジンに対するオキシダーゼ活性とL-リジンに対する高い基質特異性とを確保できる範囲に設定することができる。以下の実施例に示す変異型酵素Ｃ２５４Ｉを用いる場合には、Ｌ－リジンに対する基質特異性の高いオキシダーゼ活性が得られる範囲を考慮して、反応用緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ６．０～１０．５、好ましくはｐＨ６．５～１０、さらに好ましくはｐＨ７～９、より一層好ましくはｐＨ７．０～８．０の範囲に調整することができる。
　次いで、前記混合により得られた反応液を酸素の存在下に所定時間保持する。本発明のタンパク質によるL-リジン酸化反応においては、反応式Aに示すように、L-リジン脱アミノ化生成物である２-オキソ-６-アミノヘキサン酸と共に、アンモニア（NH3）と過酸化水素（H2O2）が生成物として得られる。上記反応を空気中で実施することで、反応液中の溶存酸素として上記酸素は供給される。反応液中酸素を供給する目的で反応液に空気などの酸素含有気体を強制的に供給する必要は通常はない。本発明のタンパク質による酵素反応に必要とされる酸素量が微量であり、溶存酸素により十分に賄えるためである。酵素反応のための保持時間は、例えば、使用する酵素量（本発明のタンパク質量）にもよるが、例えば、10分～1時間の範囲とすることができる。加えて、酵素反応のための保持温度は、検体中にＬ－リジンが存在する場合に反応式Ａに示す本発明のタンパク質による触媒反応が生じ得る限り、特に限定されるものでは無く、保持期間中一定であってもよいし、或いは変動してもよい。保持温度は、例えば、使用する酵素（本発明のタンパク質）の至適温度やその温度で発揮されるＬ－リジンに対する基質特異性にもよるが、例えば、１０～６０℃の範囲から好適な反応温度を選択することができ、例えば、２０～５５℃の範囲、又は２５～４０℃の範囲とすることができる。しかし、保持時間及び保持温度をこれらの範囲に限定する意図ではなく、必要に応じて適宜調整できる。
工程(Ｂ)
　工程（Ｂ）では、工程（Ａ）における上記保持後の反応液中に存在する、本発明のタンパク質の作用による反応生成物の少なくとも一種を検出又は定量する。
　検出又は定量に用いられる生成物が過酸化水素である場合、例えばペルオキシダーゼ反応を用いて測定する方法等の公知の方法により、過酸化水素を検出又は定量することが出来る。ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する場合、使用可能なペルオキシダーゼは過酸化水素の検出又は定量に利用可能な酵素であればよく、例えば西洋わさび由来ペルオキシダーゼが挙げられる。また、使用するペルオキシダーゼの基質となり得るものであれば発色剤として使用可能であり、西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる場合には4-アミノアンチピリン：フェノールなどが挙げられる。西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる過酸化水素の検出又は定量のための反応は以下に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　4-アミノアンチピリン等の発色剤や蛍光剤は、使用されるペルオキシダーゼの種類によって適宜選択することが可能である。
　本発明のタンパク質によるL-アミノ酸オキシダーゼ反応の生成物である過酸化水素は、過酸化水素電極を用いた電流検出型センサを用いて測定することもできる。過酸化水素電極としては、例えば、ペルオキシダーゼを牛血清アルブミンとともにグルタルアルデヒドに固定化した膜とフェロセンをカーボンペーストに含有させたものを電極として用いるセンサを挙げることができる。
　検出又は定量に用いられる生成物がアンモニアである場合には、アンモニア検出薬を用いて測定することができる。アンモニア検出薬としては、例えば、フェノールと次亜塩素酸の組み合わせによるインドフェノール法を挙げることができる。具体的には、サンプルをフェノール・ニトロプルシド溶液および過塩素酸溶液と混合して発色させ、635 nmの吸光度を測定することにより、アンモニアの検出又は定量が可能である。
　検出又は定量に用いられる生成物がL-リジンの脱アミノ化生成物である２-オキソ-６-アミノヘキサン酸である場合には、２-オキソ-６-アミノヘキサン酸を３-メチル-２-ベンゾチアゾロンヒドラジンハイドロクロライド（３-methyl-２-benzothiazolone hydrazine hydrochloride）と反応させてヒドラゾン（hydrazone）誘導体を分光定量することにより、２-オキソ-６-アミノヘキサン酸の定量を行うことができる。
＜L-リジンの定量用キット＞
　さらに、本発明は、本発明の上記タンパク質を含む、L-リジンの検出又は定量用キットを包含する。
　本発明のキットは、反応用緩衝液、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出薬、及びL-リジンの脱アミノ化生成物である２-オキソ-６-アミノヘキサン酸検出薬の少なくとも一つをさらに含むことができる。
　反応用緩衝液は、反応液中を本発明のタンパク質による酵素反応に適したpHに維持するために用いられる。反応用緩衝液のｐＨは、上述した本発明のタンパク質が有するＬ－リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性が確保される限り特に限定されるものではなく、L-リジンに対するオキシダーゼ活性の至適pHとL-リジンに対する基質特異性との関係を考慮して適宜調整すればよい。例えばｐＨ１．０～１４の範囲から、各酵素の性質を考慮してL-リジンの検出を可能とするＬ－リジンに対するオキシダーゼ活性とL-リジンに対する高い基質特異性とを確保できる範囲に設定することができる。以下の実施例に示す変異型酵素Ｃ２５４Ｉを用いる場合には、Ｌ－リジンに対する基質特異性の高いオキシダーゼ活性が得られる範囲を考慮して、反応用緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ６．０～１０．５、好ましくはｐＨ６．５～１０、さらに好ましくはｐＨ７～９、より一層好ましくはｐＨ７．０～８．０の範囲に調整することができる。
　過酸化水素検出試薬は、過酸化水素の検出を、例えば、発色もしくは蛍光によって行う場合に用いる。過酸化水素検出試薬としては、例えば、ペルオキシダーゼとその基質となり得る発色剤の組合せであることができる。具体的には、西洋わさびペルオキシダーゼと2-アミノアンチピリン・フェノールの組み合わせを挙げることができる。
　アンモニア検出薬としては、例えば、フェノールと次亜塩素酸の組み合わせによるインドフェノール法を挙げることができる。
　L-リジンの脱アミノ化生成物である２-オキソ-６-アミノヘキサン酸検出薬としては、例えば、２-オキソ-６-アミノヘキサン酸と３-メチル-２-ベンゾチアゾロンヒドラジンハイドロクロライド（３-methyl-２-benzothiazolone hydrazine hydrochloride）を反応させて、ヒドラゾン（hydrazone）誘導体を分光定量する方法を用いることができる。
＜酵素センサ＞
　本発明は、過酸化水素検出用電極を含む、Ｌ－リジンの検出又は定量用酵素センサであって、上記過酸化水素検出用電極の表面又は近傍に本発明のタンパク質が配置してなる、上記センサをも包含する
　前記検出用電極は過酸化水素検出用電極である。過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極であることができる。本発明のタンパク質がL-リジンと反応することで、過酸化水素が生成するので、この過酸化水素を過酸化水素検出用電極で検出することができる。酵素式過酸化水素電極としては、例えば、ペルオキシダーゼを牛血清アルブミンとともにグルタルアルデヒドに固定化した膜とフェロセンをカーボンペーストに含有させたものを電極として用いるセンサを挙げることができる。隔膜式過酸化水素電極は、隔膜により過酸化水素と反応する電極が隔離されたタイプの電極である。
　本発明のタンパク質は、検出用電極の表面または検出用電極の近傍に配置されることが好ましく、検出用電極の表面に配置される場合には、検出用電極の表面に固定化されても固定化されなくてもよい。検出用電極の表面に固定化されることで、本発明のセンサを繰り返し利用できる利点はある。
　以下、本発明について、実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　実施例中、活性測定試薬、L-リジン測定用試薬組成物は以下のような組成で調製した。測定条件は、以下のように行った。また、L-アミノ酸オキシダーゼの活性は、以下のように測定した。
（１）L-アミノ酸オキシダーゼ活性測定用試薬の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（２）L-アミノ酸オキシダーゼの活性測定法
　L-アミノ酸オキシダーゼ活性は、L-アミノ酸の酸化で生成される過酸化水素量を、表２の発色液を用いて比色法で求めた。マイクロプレートを用いる活性測定は、発色液１００μLに表３に示すアミノ酸の１００ｍM溶液１００μLおよび５０μLの酵素液を加えて、氷上で分注した後３０℃で０、０．５、１、１．５、２、３、４、５時間反応し、マイクロプレートリーダーで５５０nmの吸光度を測定した。L-アミノ酸オキシダーゼ活性の基質は、表３に示した２０種類のアミノ酸（１００mＭ溶液）を用い、ブランクでは、基質の代わりに１００mＭリン酸カリウム緩衝液（pH ７．０）を添加した。
　また、酵素精製における1cm石英セルをいた吸光度計での測定では、反応液の全量は1mLとした。得られた吸光度変化により、下記計算式に基づきL-リジンオキシダーゼ酵素活性を算出した。尚、上記条件で1分間に1マイクロモルの基質を与える酵素量を1Uとした。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づきL-アミノ酸オキシダーゼの酵素活性を算出した。
（３）L-アミノ酸オキシダーゼ活性の計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ－ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．１（ｍｌ）：全液量
１３：ミリモル吸光係数
１．０ｃｍ：セルの光路長
０．１（ｍｌ）：酵素サンプル液量
(４)シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼの酵素精製
（ｉ）シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H-８-１-３株の培養法
　シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H８-１-３株を、前培養として５mlのTGY培地（０．５％ポリペプトン、０．５％イースト抽出物、０．１％KH２PO４、０．１％D-グルコース、pH ７．０）に植菌し、３０℃、２００rpmで１２時間培養した。その後、５００mlのTGY培地を含む２Lの坂口フラスコに植菌し、３０℃、９６rpmで４８時間培養した。培養後、５０００ x g、２０分間遠心分離し、菌体を得た。
（ｉｉ）無細胞抽出液の調製
　５mLのTGY培地でH８-１-３株を前培養（２００rpm、３０℃、１２時間）して、前培養液を５００mLのTGY培地に植菌し、２L坂口フラスコを用いて、３０℃で２日間振とう培養（９６rpm）した（全量２０L）。大型遠心機で集菌し（５，０００rpm、１０分間、４℃）、生理食塩水（０．９％ NaCl）で洗浄した後、培地５Ｌ分の菌体を１００mLの２０mM リン酸緩衝液（pH ７．０）（KPB）に懸濁した。１００mLの菌体液を１５分間超音波処理し、遠心分離（８，０００rpm、２０分間、４℃）で得られた上清を無細胞抽出液とした。
（ｉｉｉ）プロタミン硫酸による除核酸処理
　無細胞抽出液に、プロタミン硫酸ナトリウムを０．５％加え、３０分間攪伴した後、大型遠心機で分離して（３，０００rpm、１０分間、４℃）、上清を得た。
（ｉｖ）硫安分画
　除核酸処理をした無細胞抽出液を氷中にてスターラーで撹拌しながら、３０％飽和となるように粉末状硫安を少しずつ加えた。３０分間撹拌した後、遠心分離した（８，０００rpm、１０分間、４℃）。上清を氷中で撹拌しながら、６０％飽和となるように粉末状硫安を加え、３０分間撹拌した後、遠心分離した。同様に、９０％飽和となるように粉末状硫安を加え、遠心分離した。各画分で得られた沈殿（０－３０％画分、３０－６０％画分及び６０－９０％画分）を１０mlの２０mM KPB（pH ７．０）に懸濁し、５Ｌの同緩衝液（×３回）で、１晩透析を行った。
（ｖ）陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（DEAE-トヨパール）
　２０ｍＭ KPBにより平衡化したDEAE-トヨパール樹脂１５mlをカラムに充填し、透析した３０-６０％画分の酵素液を吸着させた。１００mLの２０mM KPBでカラムを洗浄した後、２０mM KPB ２００ml及び５００mM NaClを含む２０mM KPB ２００mlを用いて、グラジエントによりNaCl濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、１５ｍＬずつ試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集め、同緩衝液により１晩透析した。
（ｖｉ）ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー（GIGA-PITE）
　２０ｍＭ リン酸緩衝液により平衡化したGIGA-PITE樹脂５mlをカラムに充填し、酵素液を吸着させた。５０mLの２０mM KPBでカラムを洗浄した後、２０mM KPB ５０ml及び５００mM KPB ２００mlを用いて、グラジエントによりKPB濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。活性が確認された非吸着画分を５Ｌの同緩衝液（ｘ３回）で、１晩透析を行った。
（ｖｉｉ）強イオン交換カラムクロマトグラフィー（MonoQ HR１０/１００）
　中圧高速液体クロマトグラフィー（FPLC、カラム：２０mM KPBで平衡化したMonoQ HR １０/１００カラム）を用いた。サンプルループに限外ろ過（セントリコンチューブ）により濃縮した酵素液２００μLを注入し、２０mM KPB及び０．５mM NaClを含む２０mM KPBの２つの溶媒を用いて、FPLCのグラジエントシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション（０．５mL）の活性が認められたフラクションを集め、１晩透析した。透析した後、セントリコンを用いて酵素液を２００μLまで濃縮した。
（ｖｉｉｉ）ゲルろ過クロマトグラフィー（Superdex ２００ １０/３０）
　中圧高速液体クロマトグラフィー（FPLC、カラム：１５０mM NaClを含む２０mM KPBで平衡化したSuperdex ２００ １０/３０カラムを用いた。サンプルループに酵素液２００μＬを注入し、１５０mM NaClを含む２０mM KPBの溶媒を用いて、FPLCのシステムにより酵素を溶出させた。活性が認められたフラクションを集め1晩透析した。
各精製ステップのタンパク質量と酵素活性を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
(５)SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によるH-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼの分子量測定
　泳動ゲルとして、３６％アクリルアミド ５．２５ml、０．６８M トリス‐HCL緩衝液（pH ８．８）８．２５mL、１％ SDS １．５８mL、１０％ TEMED １８７μL、２％ APS５６２．５μL組成のゲルに３６％ ポリアクリルアミド ０．５mL、０．１７９ M トリス-HCl（pH ６．８）３．５mL、１％ SDS ０．５mL、１０％ TEMED １２５μＬ、２％ APS ３７５μＬ組成の濃縮ゲルを重層したものを用い、緩衝液（グリセロール２００μＬ、１M トリス-HCl（pH ８．０）４０μＬ、水３６０μＬ、２-メルカプトエタノール２００μＬ及び１０％ SDS ２００μＬ）と等量混合した精製酵素サンプル１０μＬをランニング緩衝液（トリス３．０ｇ、グリシン １４．１ｇ及びSDS １０g）中、３０mAで電気泳動を行い、その後、１時間タンパク染色液（CBB ２．５ｇ、メタノール ５００mL、酢酸 ５０mL及び水４５０mL）で染色し、脱色液（メタノール：酢酸：水＝３：１：６）でバンドが鮮明になるまで脱色した。
　分子量マーカー（Bio-Rad）は、phosphorylase (９７，４００), bovine serum albumin (６６，２６７), aldolase (４２，２００), carbonic anhydrase (３０，０００) and soybean trypsin inhibitor (２０，０００)のものを用いた。
　図２にシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H８-１-３株由来Ｌ-アミノ酸オキシダーゼ（野生型酵素）のＳＤＳ-PAGEの写真を示した。
（６）シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼのN末端アミノ酸配列の決定
　精製したシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼをEdman分解法によりN末端側から８残基決定した。
（７）シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のクローニング
（ｉ）シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株の染色体DNAの抽出
　シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株をTGY培地3mLに植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで、１２時間培養した。培養液１mLから菌体を遠心分離して（１５，０００rpm、５分間、４℃）、集菌した。STE緩衝液（NaCl ０．５８ｇ、１Mトリス-HCl（pH ８．０）1mL及び０．５M EDTA（pＨ８．０）２００μLを水で１００mLに定量したもの）１mLで洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。６８℃で、１５分間加熱した後、遠心分離し（１５，０００rpm、５分間、４℃）、上清を除き、リゾチーム-RNase液（リゾチーム ５mｇ、１０mｇ/mL RNase １０mLを1液：グルコース０．９ｇ、1Mトリス-HCl（pH８．０）２．５ ml、０．５M EDTA（pH８．０）２mLを超純水で１００mLに定量したもの１mLで溶解したもの）３００μＬに懸濁した。３７℃で３０分間インキュベートした後、プロテイナーゼK液 （プロテイナーゼK 10mg/1液1mL）6μLを加え、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。N-ラウロイルザリコシン３mgを加えて、穏やかに混合した後、３７℃で３時間インキュベートし、フェノール-クロロホルム処理を穏やかに2回行った。上清３００μＬに５M NaCl溶液１０μLとエタノール６００μLを加えて混合した後、遠心分離した（１５，０００rpm、１０分間、４℃）。７０％エタノールで洗浄した後、風乾し、ＴＥ緩衝液１００μLに溶解し、目的とする染色体DNAを得た。
（ｉｉ）PCRによるシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の増幅
　PCR反応液の組成は，水３５μL、１０×Ex Taq buffer ５μL、２mM dNTP ５μL、１００pmolプライマー１（５’-ATGAACAANAANAACCGCCACCCSGCCGAC-３’）(配列番号１７)１μL、１００pmolプライマー２（５’-TCARTCYGCCAGGGCGATYGGSCCGATYTC-３’） (配列番号１８)１μL、鋳型ＤＮＡ２μL及びEx Taq １μLとした。PCR反応の条件は、（ｉ）９８℃で５分間、（ii）９６℃で１０秒間、（iii）５０℃で５秒間、（iv）６０℃で４分間及び（ii）までを３１サイクルとした。増幅した遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子をVIOGENE（USA）社のGel-Mゲル抽出キットを用いて抽出した。
（ｉｉｉ）H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子配列のシーケンシング
　遺伝子の両方の鎖についてシーケンシングを行うため、プライマー１、プライマー２、プライマー３（５’- AGCACGGTAATCGATCTGGA-３’） (配列番号１９)及び、プライマー４（５’- CATCGAGTGCCAGTTGCACG-３’） (配列番号２０)を用いてシーケンス反応を行った。反応液組成は、１．６μＬの各プライマー、１．６μＬの鋳型ＤＮＡ、１μＬのBigDyeプレミックスソリューション、１．６μＬの５ｘBigDye シーケンシングバッファーと２．８μLの滅菌水とし、全量１０μＬとした。PCR反応の条件は、（ｉ）９６℃で２分間、（ii）９６℃で１０秒間、（iii）５０℃で５秒間、（iv）６０℃で４分間、（ｖ）（ii）～（iv）を２５回及び（vi）７２℃で５分間とした。PCR産物に、１μＬの３M 酢酸ナトリウム（pH ５．２）、１μＬの０．１２５M EDTAと２５μLのエタノールを加え、室温で１５分間放置した後、遠心分離により（１５，０００rpm、８分間、４℃）、沈殿させた。上清を廃棄した後、１０μLの Hi Di Formamideを加え、１００℃で５分間加熱した後に、氷水で急冷したものをABI PRISM ３１０ Genetic Analyzerで塩基配列の解読をした。得られたシーケンスデータの解析はGenetyxで行い、それぞれのプライマーで増幅した断片の塩基配列を連結した。図３に、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼ（野生型酵素）の塩基配列から予測される１次構造を示した。
（ｉｖ）シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の大腸菌（E.coli JM １０９）への形質転換
　ライゲーション反応の組成は、PCR産物 ５μL、pT７ Blue T-Vecter （Novagen）１μL、ライゲーションミックス（Takara）６μLとし、１６℃で３０分間反応させた。大腸菌（E.coli JM １０９）のコンピテントセル１００μLに１２μLのライゲーション反応液を加え、ヒートショック法で形質転換を行った。８０μｇ/mLのアンピシリンを含むLB培地（１．０％ ポリペプトン、０．５％イースト抽出物及び１．０％ NaCl）に生育したコロニーを数株選抜してプラスミド抽出し、０．７%アガロース電気泳動により、インサートの有無の確認を行った。
（８）シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の大腸菌（E.coli BL２１）における発現
（ｉ）シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼ酵素遺伝子の増幅
　上記クローニングで得られたプラスミドを鋳型DNAとし、PCRを行った。PCR反応液の組成は、水３５μL、１０×Ex Taq buffer ５μL、２mM dNTP ５μL、１００pmol/μL プライマー５（５’- TATAATCATATGAACAAGAACAACCGCCA-３’） (配列番号２１)１μＬ、１００ pmol/μLプライマー６ （５’- TATTACTCGAGTCAGTCCGCCAGGGCGATTG-３’） (配列番号２２)１μL、鋳型DNA １００ng及びEx Taq ５unitとした。プライマー５およびプライマー６にはそれぞれNdeIおよびXhoIの制限酵素サイトを設けた。PCR反応の条件は、（ｉ）９８℃で５分間、（ii）９６℃で１０秒間、（iii）５０℃で５秒間、（iv）６０℃で４分間及び（ii）までを３１サイクルとした。
（ｉｉ）シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のpET１５bベクターへの組換えと大腸菌（E. coli BL２１）への形質転換
　PCR反応で得られた、PCR産物５μＬに、１μＬ NdeIと１μL XhoIを加え、３７℃で１時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。ライゲーション反応は、５μＬ DNA、１μL pET１５b（増幅遺伝子と同様の制限酵素処理を行ったもの）、６μLライゲーションMixとし、１６℃で３０分間インキュベートした。得られたライゲーション反応液全量を、ヒートショック法により、大腸菌（E. coli BL２１）に導入した。尚、本組換え大腸菌が生成するL-アミノ酸オキシダーゼは、N末端側に６×ヒスチジン・タグが付加した融合タンパクとして生成されるように発現用プラスミドを構築した。
（ｉｉｉ）シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の発現とNi-Sepharoseを用いたヒスチジンtag６融合酵素の精製
　８０μg/mLのアンピシリンを含む４LのLB培地（１．０％ ポリペプトン、０．５% イースト抽出物、１．０％ NaCl、pH ７．０）に組換え大腸菌（BL２１）を植菌し、３７℃で１２時間培養後、０．５mM IPTGを添加して引き続き３０℃で１２時間培養してL-アミノ酸オキシダーゼを誘導した。大型遠心機で集菌し（５，０００rpm、１０分間、４℃）、生理食塩水（０．９％ NaCl）で洗浄した後、１００mLの２０mM リン酸緩衝液（pH ７．０）（KPB）に懸濁した。１００mLの菌体液を１５分間超音波処理し、遠心分離（８，０００rpm、２０分間、４℃）で得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液を２０mM KPBで置換したNi-Sepharoseカラムに吸着させ、２０mM KPBでカラムを洗浄後、５００mM イミダゾールを含む２０mM KPBで酵素液を溶出させた。
（９）シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼの活性測定
　精製酵素標品の酵素活性を、表３におけるアミノ酸をそれぞれ単独に含有する測定試薬にて測定し、本酵素標品が以下の性質を有するものであることを確認した：
（ａ）L-リジン、L-アルギニン、L-オルニチンを基質とする（表５）。これら以外のタンパク質構成アミノ酸（L-チロシン、L-アラニン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-メチオニン、L-アスパラギン、L-プロリン、L-グルタミン、L-セリン、L-スレオニン、L-バリン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン）に対してはL-アミノ酸オキシダーゼは活性を示さなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（ｂ）pH６．５以下の範囲ではL-リジンのみに作用する（図６）。
（１０）シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H-８-１-３株由来L-アミノ酸オキシダーゼを用いたＬ－リジンの定量
　上記（８）(iii)にて精製した、Ｎ末端側にヒスチジン・タグが付加されたＬ－アミノ酸オキシダーゼ標品を用いて、上述のＬ－リジン測定用試薬組成物を調製した。本試薬組成物を用い、Ｌ－リジン測定を実施した。検体としては、１～６ｍＭのＬ－リジン水溶液を調製した。
　結果として、Ｌ－リジン水溶液を検体とした場合には反応性が認められ、Ｌ－リジン濃度と測定データは良好な正の相関を示した（図７参照）。
（１１）シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）H８－１－３株由来L-アミノ酸オキシダーゼの遺伝子への変異導入
　以下の手順に従い、上記Ｌ－アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列において第２５４番目のシステインの飽和変異を行うことにより、L-リジンに対する基質特異性の高いオキシダーゼ活性を有する変異型Ｌ－アミノ酸オキシダーゼを作製した。
　上記（８）（ii）で構築した、L-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子が導入された発現用プラスミドを鋳型として、変異導入のためのPCRを行った。PCR反応には、QuikChange（Ｒ） Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いた。PCR反応液の組成は、滅菌水（MilliQ）16.5μL、10×QuikChange Lightining Multi reaction buffer 2.5 μL、100 ng/μL鋳型DNA 1.0μL、100 ng/μLプライマー７(5’-GTGGTGATGACCAATNNSGACGACCACCAACAC-3’)(配列番号２３) 1.0μL、100 ng/μLプライマー８(5’-GCGGTGCTGACGACCNNSCAGAGTTGGCTGCTG -3’)(配列番号２４) 1.0μL、及び100 ng/μLプライマー９(5’- AAGCCAGGGGTGATCNNSCTGTCCTACGCGTGG-3’)(配列番号２５) 1.0μL、dNTP mix 1.0μL、QuikChange Lightning Multi enzyme blend 1.0μLとした。PCR反応の条件は、（i）95℃で2分間、（ii）95℃で20秒間、（iii）55℃で30秒間、（iv）65℃で4分間、（v）（ii）～（iv）65℃で5分間とした。PCR産物に、1.0μLのDpnIを加え37℃で5分間放置した(サンプル１）。同様にして、プライマー１０(5’-CATGTGCCAGAGCGTNNSGCGCACTGGCCCGAA -3’)(配列番号２６) 1.0μL、及び100 ng/μLプライマー１１(5’-ACCACCCAGATCGACNNSGAAGAGTCGTTGTTC-3’)(配列番号２７) 1.0μLを用いて、上記の処理を行った（サンプル2）。
　サンプル１、サンプル２を各々、Escherichia coli JM109に形質転換を行い、アンピシリン５００μgの入ったLB液体培地５mlで、３７℃１２時間培養を行った。培養終了後、各々のサンプルを遠心分離機（１３，０００ｒｐｍ、４℃、５分）で集菌を行った。得られた集菌菌体をアルカリ－ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ法により、プラスミドの抽出を行った。なお、アルカリ－ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ法は、以下の手順に従って行った。（１）プラスミドＤＮＡを保持する大腸菌培養液を１．５ｍＬのチューブに移して遠心操作を行い、菌体をペレットとして回収する。（２）菌体ペレットに１００μＬのｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．９％グルコース］を加えて懸濁する。（３）２００μＬのｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ［０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ ＳＤＳ］を加えて菌体を溶解し、タンパク質、核酸を変性状態とする。（４）１５０μＬのｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩ［３Ｍ 酢酸カリウム、１１．５％酢酸］を加えて溶液の中和とＳＤＳの除去を行う。この操作により、染色体ＤＮＡ、タンパク質は凝集沈殿物となるが、プラスミドＤＮＡは溶液部分に留まる。（５）凝集沈殿物を遠心分離により溶液から除去し、プラスミドＤＮＡを含む溶液を回収する。（６）得られたプラスミドＤＮＡを含む溶液に対して、フェノール・クロロホルム抽出を行ってタンパク質を除去する。（７）プラスミド溶液の２倍量のエタノールを加えてドライアイス上に５分静置する。（８）遠心操作によってプラスミドＤＮＡの沈殿を得る。（９）得られたプラスミドＤＮＡの沈殿をＴＥ［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ］に溶解して試料とする。
　得られたプラスミドにおいて、PCR１から得られた産物をplasmid1、PCR２から得られた産物をplasmid2とし、それぞれをE. coli BL21(DE3)にヒートショック法により、形質転換を行った。ヒートショック法の手順は以下の通りである。E.coli BL21(DE3) ５０μlに対し、各々のプラスミド５μlを混合し、６０分間、氷上静置した。その後、４２度で９０秒間のヒートショックを行った後、LB液体培地を１ｍｌ添加し、３７度で１時間インキュベートした。アンピシリン入りのプレートに塗布し、３７度１６時間培養を行った。
　９６穴ディープウェルに１００μl/mlのアンピシリン入りのLB液体培地を３００μlずつ分注し、コロニーピッカーを用いて、得られたコロニーを各ウェルの培地に植菌した。植菌後、振盪機を用いて、700ｒｐｍ、３７度１２時間培養後、IPTG７．５mMを２０μl添加し、再度３０度１２時間の振盪培養を行った。培養後、遠心分離（2,500 rpm, 4℃, 20分間）により集菌を行った。各々の集菌菌体に対し、10 mM KPB （pH7.0）を200μLを添加、懸濁し、96穴丸底プレートに移し替え、８連超音波破砕機により菌体破砕（output 3, 30秒間）を行った。同上の条件で遠心分離後、得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液50μLを用いて、上記活性測定法を用いて、Ｌ－リジンを基質として比活性を測定した。
　これら形質転換体の中から活性を著しく高いもののスクリーニングを行った結果、PCR１から得られた4,000コロニー中175コロニー、PCR２から得られた500コロニー中50コロニー得られた。
　得られたコロニーの上清を用いて、再度p-chloromercuribenzoate（PCMB）を用いた活性測定を行った。タンパク質中のSH基は、金属イオンと反応して、メルカプチドを形成する。本反応は可逆的であるが、一般に平衡は大きくメルカプチドに偏っている。Hg2+はSH基に対して高い親水性を有している。オキシダーゼ活性、或いはモノオキシゲナーゼ活性を有する酵素においては、PCMB試薬を添加する事でオキシダーゼ活性にかたよることが当業者において知られている。
　上記の事から、PCMBを添加した無細胞抽出液と添加していない無細胞抽出液との活性に差がないもののスクリーニングを行った結果、PCR1から175コロニー中4コロニー、PCR２から50コロニー中4コロニー得られた。BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)及び DNAシーケンサー３１０Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、得られたコロニーに含まれるプラスミドのシーケンシングを行った。その結果、コーディング領域中の第７６０～７６２番目の塩基配列TGCがATCに変異しており、この変異によりアミノ酸配列中の第２５４番目のシステインがイソロイシンに置換されたことが確認された。この変異体酵素を変異型酵素Ｃ２５４Ｉと称する。
　これらのスクリーニングの結果から得られた変異型酵素を、上記（８）(iii)に記載の方法により精製した。図１に示す通り、野生型酵素では、オキシダーゼ反応と比較してモノオキシゲナーゼ反応の割合が大半を占めるが、精製した変異型酵素Ｃ２５４Ｉについて、PCMBによる影響は見られず、HPLCによるモノオキシゲナーゼの生成物の検出も見られなかった。
　変異型酵素Ｃ２５４Ｉについて反応時のｐＨの影響を調べるために、試薬組成物のpHを変化させて、L-リジン、L-オルニチン、又はL-アルギニンを基質として各ｐＨにおけるオキシダーゼ活性を測定した。野生型酵素と変異型酵素のそれぞれについて、pHによる影響を図８に示す。
　図８Ａに示される通り、野生型酵素は、pH7.0において、L-リジンのみならず、L-アルギニンやL-オルニチンを触媒することから、野生型酵素でL-リジンを正確に定量するためには、pH6.5以下で反応させなければならないと言う制約がある。一方、図８Ｂに示される通り、変異型酵素Ｃ２５４Ｉは、ｐH7.0付近においても、L-リジンに対して高い基質特異性を有することから、反応系のｐＨに依存することなくL-リジンを特異的に検出することが可能である。さらに、図８に示される通り、ｐＨ６．５における野生型酵素の比活性は０．５６ Ｕ／ｍｇであるのに対し、ｐＨ７．５における変異型酵素Ｃ２５４Ｉの比活性は２．５ Ｕ／ｍｇであった。変異型酵素Ｃ２５４Ｉは、野生型酵素と比較してオキシダーゼ活性が高かった。
　さらに、変異型酵素Ｃ２５４Ｉについて、L-リジン、Ｌ-アルギニン及びL-オルニチン以外のアミノ酸を基質としてオキシダーゼ活性を測定した。活性測定試薬及び活性測定法は、上記（１）及び（２）に示す通りである。反応条件はｐＨ７．０、及び３０℃とした。その結果を、図９Ｂに示す。図９Ａは、野生型酵素の結果を示す。
　図９に示される通り、変異型酵素Ｃ２５４Ｉは、Ｌ-アルギニン及びL-オルニチンに対して活性を示さない上に、その他のアミノ酸に対しても活性を示さず、Ｌ－リジンに対してのみオキシダーゼ活性を示した。本発明の変異型酵素が、Ｌ－リジンに対して基質特異性が高いオキシダーゼ活性を示し、Ｌ－リジンを特異的に検出できることが示された。
　さらに、上記（８）(iii)にて精製した野生型酵素、及び上記変異型酵素Ｃ２５４Ｉを用いて、上述のＬ－リジン測定用試薬組成物を調製した。本試薬組成物を用い、Ｌ－リジン測定を実施した。検体としては、１～１０ｍＭのＬ－リジン水溶液を調製した。
　結果として、Ｌ－リジン水溶液を検体とした場合には反応性が認められ、Ｌ－リジン濃度と測定データは良好な正の相関を示した（図１０参照）。
　さらに、上記飽和変異により得られた変異体において第２５４番目のシステインがイソロイシン以外のアミノ酸に置換したものについても、L-リジン、Ｌ-アルギニン及びL-オルニチンのそれぞれに対するオキシダーゼ活性を測定した。活性測定試薬及び活性測定法は、上記（１）及び（２）に示す通りである。反応条件はｐＨ７．０、及び３０℃とした。その結果を、表６及び７、並びに図１１及び１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表６及び図１１に示されるように、上記変異型酵素Ｃ２５４Ｉに加えて、メチオニン（Met）、フェニルアラニン(Phe)、チロシン（Tyr）、トリプトファン(Trp)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、リジン(Lys)、アルギニン(Arg)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)、グルタミン（Gln）、及びプロリン(Pro)のそれぞれに置換した変異型酵素は、野生型酵素と比較して、L-リジンに対するオキシダーゼ活性が上昇する傾向が確認された。さらに、表７及び図１２に示される通り、上記変異型酵素Ｃ２５４Ｉに加えて、メチオニン（Met）、フェニルアラニン(Phe)、チロシン（Tyr）、トリプトファン(Trp)、アラニン（Ala）、グリシン(Gly)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、リジン(Lys)、アルギニン(Arg)、ヒスチジン（His）、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、セリン（Ser）、トレオニン(Thr)、アスパラギン(Asn)、グルタミン（Gln）、及びプロリン(Pro)のそれぞれに置換した変異型酵素も、野生型酵素と比較して、Ｌ－リジンに対するオキシダーゼ活性を１００％とした場合におけるＬ－オルニチン及びＬ－アルギニンのそれぞれに対する相対活性が低い点で、それら変異型酵素についてもL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性が示された。さらに加えて、これらのアミノ酸置換のうち、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、チロシン(Tyr)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)又はセリン(Ser)に置換した変異型酵素では、野生型酵素と比較して、L-アルギニンオキシダーゼ活性及びL-オルニチンオキシダーゼ活性の上記相対活性の両方が低いことから、これら変異型酵素はＬ－リジンに対して特に高い基質特異性を有していた（表７、及び図１２参照）。さらに、チロシン又はイソロイシンに置換した変異型酵素では、上記Ｌ－オルニチン及びＬ－アルギニンのそれぞれに対するオキシダーゼ活性はいずれも検出されず、これら酵素はL-リジンに対して極めて高い基質特異性を有していることが確認された（表６及び７、並びに図１１及び１２）。
　さらに、上記飽和変異により得られた変異体において第２５４番目のシステインがイソロイシン以外のアミノ酸に置換したものについても、タンパク質を構成するアミノ酸である、L-チロシン、L-アラニン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-メチオニン、L-アスパラギン、L-プロリン、L-グルタミン、L-セリン、L-スレオニン、L-バリン、L-フェニルアラニン、及びL-トリプトファンのそれぞれを基質としてL-アミノ酸オキシダーゼ活性の測定を行った。その結果、全ての変異型酵素において、これらアミノ酸を基質とした場合にはL-アミノ酸オキシダーゼ活性は検出されなかった。加えて、D-リジン、D-アルギニン、又はD-オルニチンを基質とした場合にも、全ての変異型酵素においてL-アミノ酸オキシダーゼ活性は検出されなかった。
（１２）血漿サンプルの測定
　上記変異型酵素Ｃ２５４Ｉについて、L-リジン、L-オルニチン、又はL-アルギニンを添加したヒト血漿サンプルを用いてオキシダーゼ活性の測定を行った。ヒト血漿として、アミコンウルトラ-０．５（UFC501096、Millipore）を用い、16,100 xg、4℃、３０分間の遠心分離により除蛋白液を調製した。調製したヒト血漿に、最終濃度０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５μＭとなるようにL-リジン、L-オルニチン、又はL-アルギニンを添加し、血漿サンプルとした。測定試薬の組成及び測定方法は、上記（１）及び（２）に示す通りであり、反応条件はｐＨ７．０、及び３０℃とした。結果を図１４に示す。なお、比較の対象として野生型酵素についても同様にヒト血漿サンプルを用いてオキシダーゼ活性の測定を行った。その結果を図１３に示す。
　図１３に示される通り、野生型酵素においては、リジンの定量は可能なものの、オルニチンやアルギニンにおいてもオキシダーゼ活性が検出された。一方、変異型酵素Ｃ２５４Ｉにおいては、図１４に示される通り、Ｌ－リジン対してのみオキシダーゼ活性が検出され、直線的な検量線を描くことが可能であった。
　上記試験例により、本発明による変異型酵素を用いれば、L-リジン以外のアミノ酸が混入した臨床サンプルであっても、L-リジンを正確に検出又は定量できることが示された。

Claims (15)

  1. 下記の（１）から（３）の何れかに記載のタンパク質：
    （１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２５４番目のシステインがメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン又はプロリンで置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質； 
    （２）上記（１）に規定されるタンパク質において上記第２５４番目のアミノ酸を除く領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質;または 
    （３）上記（１)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６７％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質、但し、該タンパク質のアミノ酸配列において上記第２５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は変異しないものとする。
  2. 上記２５４番目のアミノ酸がメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はセリンである、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 上記２５４番目のアミノ酸がイソロイシン又はチロシンである、請求項１又は２に記載のタンパク質。
  4. 上記（２）又は（３）に規定され、かつ第２５４番目のシステインがトリプトファン、グリシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン又はプロリン以外のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質において、該タンパク質のL-リジンに対するオキシダーゼ活性を１００％とした場合、上記タンパク質のL-アルギニンに対するオキシダーゼ活性が１５％以下であり、かつL-オルニチンに対するオキシダーゼ活性が８０％以下である、請求項１から３の何れか１項に記載のタンパク質。
  5. 請求項１から４の何れか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
  6. 請求項５に記載の核酸を含む、ベクター。
  7. 請求項６に記載のベクターにより形質転換された、形質転換体。
  8. 以下の工程を含む、L-リジンを検出又は定量する方法：
    （Ａ）水と酸素の存在下で、検体と請求項１から４の何れか１項に記載のタンパク質とを保持する工程；及び
    （Ｂ）上記タンパク質のL-リジンに対するオキシダーゼ活性の作用により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを検出又は定量する工程
    を含む、上記方法。
  9. 工程（Ｂ）において検出又は定量する反応生成物が過酸化水素であり、上記過酸化水素を、ペルオキシダーゼを用いて検出又は定量する、請求項８に記載の方法。
  10. 工程（Ｂ）において検出又は定量する反応生成物がアンモニアであり、アンモニアを、アンモニア検出試薬を用いて検出又は定量する、請求項８に記載の方法。
  11. 工程（Ｂ）において検出又は定量する反応生成物がＬ-リジンの脱アミノ化生成物である、請求項８に記載の方法。
  12. 請求項１から４の何れか１項に記載のタンパク質を含む、Ｌ-リジンの検出又は定量用キット。
  13. 反応用緩衝液、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬、及びＬ-リジンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つをさらに含む、請求項１２に記載のキット。
  14. 過酸化水素検出用電極を含む、Ｌ-リジンの検出又は定量用酵素センサであって、
    上記過酸化水素検出用電極の表面又は近傍に請求項１から４の何れか１項に記載のタンパク質が配置してなる、上記センサ。
  15. 上記過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極又は隔膜式過酸化水素電極である、請求項１４に記載のセンサ。
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