JP2012200217A - 新規l−アミノ酸オキシダーゼ、l−リジンの測定方法、キット及び酵素センサー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】シュードモナス(Pseudomonas)属細菌由来の、L-リジン,L-アルギニン,L-オルニチンに特異的なL-アミノ酸オキシダーゼが,L-リジン,L-アルギニン,L-オルニチンを酸化的に脱アミノ反応により対応するケト酸に変換してアンモニアと過酸化水素を生成し,さらにL-リジン,L-アルギニン,L-オルニチンに対する反応pH領域が違うことを利用して,他のアミノ酸が共存していても、pH6.5以下の範囲では、L-リジンに特異的に反応して、検出可能な、L-リジンの定量方法。
【選択図】なし
Description
(i)L-リジン、L-オルニチン、L-アルギニンを基質とする。
(ii)pH6.5以下の範囲では、L-リジンのみを基質とする。
[1]
下記の(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
(1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、
但し、前記L-アミノ酸オキシダーゼ活性は、酸素及び水の存在下、pH 7.0-8.5においてL-リジン、L-オルニチン及びL-アルギニンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成し、かつpH 5.5-6.5においてはL-リジンに対しては上記作用を示すが、L-オルニチン及びL-アルギニンに対しては上記作用を示さないことを意味する。
[2]
下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
(1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;
但し、前記L-アミノ酸オキシダーゼ活性は、酸素及び水の存在下、pH 7.0-8.5においてL-リジン、L-オルニチン及びL-アルギニンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成し、かつpH 5.5-6.5においてはL-リジンに対しては上記作用を示すが、L-オルニチン及びL-アルギニンに対しては上記作用を示さないことを意味する。
[3]
検体とL-アミノ酸オキシダーゼとを水と酸素の存在下に所定時間放置する工程(A)、
放置後の反応液中に存在する前記L-アミノ酸オキシダーゼの作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程(B)
を含む、前記検体中のL-リジンの定量方法であって、
前記L-アミノ酸オキシダーゼが、[1]に記載のタンパク質である、前記方法。
[4]
工程(A)における放置を、pH 5.5-6.5にて行う、[3]に記載の方法。
[5]
前記工程(B)で計測する反応生成物が過酸化水素である[3]または[4]に記載の方法。
[6]
過酸化水素を、ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する[5]に記載の方法。
[7]
過酸化水素を、過酸化水素電極を用いた電流検出型センサーにより測定する[5]に記載の方法。
[8]
前記工程(B)で計測する反応生成物がアンモニアである[3]または[4]に記載の方法。
[9]
アンモニアを、アンモニア検出薬を用いて測定する[8]に記載の方法。
[10]
前記工程(B)で計測する反応生成物がL-リジンの脱アミノ化生成物である[3]または[4]に記載の方法。
[11]
以下の試薬を含むL-リジンの定量用キット。
(K1)L-アミノ酸オキシダーゼ
但し、前記L-アミノ酸オキシダーゼは、[1]に記載のタンパク質である、前記キット。
[12]
(K2)反応用緩衝液、(K3)過酸化水素検出用試薬、(K4)アンモニア検出薬および(K5) L-リジンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つをさらに含む、[11]に記載のキット。
[13]
L-アミノ酸オキシダーゼを検出用電極の表面または検出用電極の近傍に配置したL-リジンの検出または定量用酵素センサーであって、
前記検出用電極は過酸化水素検出用電極であり、かつ
前記L-アミノ酸オキシダーゼは、[1]に記載のタンパク質である、前記センサー。
[14]
過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極である[12]に記載の酵素センサー。
本発明は、下記の(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。このタンパク質は、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有する。
(1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、
但し、前記L-アミノ酸オキシダーゼ活性は、酸素及び水の存在下、pH 7.0-8.5においてL-リジン、L-オルニチン及びL-アルギニンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成し、かつpH 5.5-6.5においてはL-リジンに対しては上記作用を示すが、L-オルニチン及びL-アルギニンに対しては上記作用を示さないことを意味する。
(1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;
但し、前記L-アミノ酸オキシダーゼ活性は、前述の通りである。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHiFive(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
本発明のL-リジンの定量方法は、
検体とL-アミノ酸オキシダーゼとを水と酸素の存在下に所定時間放置する工程(A)、
放置後の反応液中に存在する前記L-アミノ酸オキシダーゼの作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程(B)
を含む。但し、前記L-アミノ酸オキシダーゼは、上記本発明のタンパク質(酵素)である。
L-アミノ酸オキシダーゼの混合量は、10 mU/ml(リジン1 μmolを1分間で消費する活性を1 Uとする)以上とすることが適当であり、水の混合量は、サンプル中のLys濃度に応じて適宜決定できるが、例えば、5〜95%の範囲とすることができる。L-アミノ酸オキシダーゼの混合量の上限は特にないが、実用的には、例えば、100 mU/ml以下であることができる。しかし、L-アミノ酸オキシダーゼの混合量および水の混合量は、この範囲に限定する意図ではなく、適宜調整できる。
工程(B)では、放置後の反応液中に存在する前記酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する。
定量に用いられる生成物が過酸化水素である場合、例えばペルオキシダーゼ反応を用いて測定する方法等の公知の方法により、過酸化水素定量可能である。ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する場合、使用可能なペルオキシダーゼは過酸化水素の定量に利用可能な酵素であればよく、例えば西洋わさび由来ペルオキシダーゼが挙げられる。また、使用するペルオキシダーゼの基質となり得るものであれば発色剤として使用可能であり、西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる場合には4-アミノアンチピリン:フェノールなどが挙げられる。西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる過酸化水素定量のための反応は以下に示す通りである。
本発明は、以下の試薬を含むL-リジンの定量用キットを包含する。
(K1)L-アミノ酸オキシダーゼ
上記L-アミノ酸オキシダーゼは、前記本発明のL-アミノ酸オキシダーゼである。
本発明は、L-アミノ酸オキシダーゼを検出用電極の表面または検出用電極の近傍に配置したL-リジンの検出または定量用酵素センサーを包含する。この酵素センサーに用いるL-アミノ酸オキシダーゼは、前記本発明のL-アミノ酸オキシダーゼである。
L-アミノ酸オキシダーゼ活性は、L-アミノ酸の酸化で生成される過酸化水素量を、表1の発色液を用いて比色法で求めた。マイクロプレートを用いる活性測定は、発色液 100μL に表2に示すアミノ酸の100mM 溶液100μLおよび50μL の酵素液を加えて、氷上で分注した後30℃で0、0.5、1、1.5、2、3、4、5時間反応し、マイクロプレートリーダーで550nmの吸光度を測定した。L-アミノ酸オキシダーゼ活性の基質は、表2に示した20種類のアミノ酸(100mM溶液)を用い、ブランクでは、基質の代わりに100mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)を添加した。
活性値(U/ml)={ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank)×3.1(ml)×希釈倍率}/{13×1.0(cm)×0.1(ml)}
3.1(ml):全液量
13:ミリモル吸光係数
1.0cm:セルの光路長
0.1(ml):酵素サンプル液量
(i)シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H-8-1-3株の培養法
シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H8-1-3株を、前培養として5mlのTGY培地(0.5%ポリペプトン、0.5%イースト抽出物、0.1%KH2PO4、0.1%D-グルコース、pH 7.0)に植菌し、30℃、200rpmで12時間培養した。その後、500mlのTGY培地を含む2Lの坂口フラスコに植菌し、30℃、96rpmで48時間培養した。培養後、5000 x g、20分間遠心分離し、菌体を得た。
5mLのTGY培地でH8-1-3株を前培養(200rpm、30℃、12時間)して、前培養液を500mLのTGY培地に植菌し、2L坂口フラスコを用いて、30℃で2日間振とう培養(96rpm)した(全量20L)。大型遠心機で集菌し(5,000rpm、10分間、4℃)、生理食塩水(0.9% NaCl)で洗浄した後、培地5L分の菌体を100mLの20mM リン酸緩衝液(pH 7.0)(KPB)に懸濁した。100mLの菌体液を15分間超音波処理し、遠心分離(8,000rpm、20分間、4℃)で得られた上清を無細胞抽出液とした。
無細胞抽出液に、プロタミン硫酸ナトリウムを0.5%加え、30分間攪伴した後、大型遠心機で分離して(3,000rpm、10分間、4℃)、上清を得た。
除核酸処理をした無細胞抽出液を氷中にてスターラーで撹拌しながら、30%飽和となるように粉末状硫安を少しずつ加えた。30分間撹拌した後、遠心分離した(8,000rpm、10分間、4℃)。上清を氷中で撹拌しながら、60%飽和となるように粉末状硫安を加え、30分間撹拌した後、遠心分離した。同様に、90%飽和となるように粉末状硫安を加え、遠心分離した。各画分で得られた沈殿(0-30%画分、30-60%画分及び60-90%画分)を10mlの20mM KPB(pH 7.0)に懸濁し、5Lの同緩衝液(×3回)で、1晩透析を行った。
20mM KPBにより平衡化したDEAE-トヨパール樹脂15mlをカラムに充填し、透析した30-60%画分の酵素液を吸着させた。100mLの20mM KPBでカラムを洗浄した後、20mM KPB 200ml及び500mM NaCl を含む20mM KPB 200mlを用いて、グラジエントによりNaCl濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、15mLずつ試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集め、同緩衝液により1晩透析した。
20mM リン酸緩衝液により平衡化したGIGA-PITE樹脂5mlをカラムに充填し、酵素液を吸着させた。50mLの20mM KPBでカラムを洗浄した後、20mM KPB 50ml及び500mM KPB 200mlを用いて、グラジエントによりKPB濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。活性が確認された非吸着画分を5Lの同緩衝液(x3回)で、1晩透析を行った。
中圧高速液体クロマトグラフィー(FPLC、カラム:20mM KPBで平衡化したMonoQ HR 10/100カラム)を用いた。サンプルループに限外ろ過(セントリコンチューブ)により濃縮した酵素液200μLを注入し、20mM KPB及び0.5mM NaClを含む20mM KPBの2つの溶媒を用いて、FPLCのグラジエントシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション(0.5mL)の活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。透析した後、セントリコンを用いて酵素液を200μLまで濃縮した。
中圧高速液体クロマトグラフィー(FPLC、カラム:150mM NaClを含む20mM KPBで平衡化したSuperdex 200 10/30カラムを用いた。サンプルループに酵素液200μLを注入し、150mM NaClを含む20mM KPBの溶媒を用いて、FPLCのシステムにより酵素を溶出させた。活性が認められたフラクションを集め1晩透析した。
各精製ステップのタンパク質量と酵素活性を表3に示した。
泳動ゲルとして、36%アクリルアミド 5.25ml、0.68M トリス‐HCL緩衝液(pH 8.8)8.25mL、1% SDS 1.58mL、10% TEMED 187μL、2% APS562.5μL組成のゲルに36% ポリアクリルアミド 0.5mL、0.179 M トリス-HCl(pH 6.8)3.5mL、1% SDS 0.5mL、10% TEMED 125μL、2% APS 375μL組成の濃縮ゲルを重層したものを用い、緩衝液(グリセロール200μL、1M トリス-HCl(pH 8.0)40μL、水360μL、2-メルカプトエタノール200μL及び10% SDS 200μL)と等量混合した精製酵素サンプル10μLをランニング緩衝液(トリス3.0g、グリシン 14.1g及びSDS 10g)中、30mAで電気泳動を行い、その後、1時間タンパク染色液(CBB 2.5g、メタノール 500mL、酢酸 50mL及び水450mL)で染色し、脱色液(メタノール:酢酸:水=3:1:6)でバンドが鮮明になるまで脱色した。
分子量マーカー(Bio-Rad)は、phosphorylase (97,400), bovine serum albumin (66,267), aldolase (42,200), carbonic anhydrase (30,000) and soybean trypsin inhibitor (20,000)のものを用いた。
図1にシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H8-1-3株由来L-アミノ酸オキシダーゼのSDS-PAGEの写真を示した。
精製したシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株由来L-アミノ酸オキシダーゼをEdman分解法によりN末端側から8残基決定した。
(i)シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H-8-1-3株の染色体DNAの抽出
シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株をTGY培地3mLに植菌し、30℃、200rpmで、12時間培養した。培養液1mLから菌体を遠心分離して(15,000rpm、5分間、4℃)、集菌した。STE緩衝液(NaCl 0.58g、1Mトリス-HCl(pH 8.0)1mL及び0.5M EDTA(pH8.0)200μLを水で100mLに定量したもの)1mLで洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。68℃で、15分間加熱した後、遠心分離し(15,000rpm、5分間、4℃)、上清を除き、リゾチーム-RNase液(リゾチーム 5mg、10mg/mL RNase 10mLを1液:グルコース0.9g、1Mトリス-HCl(pH8.0)2.5 ml、0.5M EDTA(pH8.0)2mLを超純水で100mLに定量したもの1mLで溶解したもの)300μLに懸濁した。37℃で30分間インキュベートした後、プロテイナーゼK液 (プロテイナーゼK 10mg/1液1mL)6μLを加え、穏やかに混合し、37℃で10分間インキュベートした。N-ラウロイルザリコシン3mgを加えて、穏やかに混合した後、37℃で3時間インキュベートし、フェノール-クロロホルム処理を穏やかに2回行った。上清300μLに5M NaCl溶液10μLとエタノール600μLを加えて混合した後、遠心分離した(15,000rpm、10分間、4℃)。70%エタノールで洗浄した後、風乾し、TE緩衝液100μLに溶解し、目的とする染色体DNAを得た。
PCR反応液の組成は,水35μL、10×Ex Taq buffer 5μL、2mM dNTP 5μL、100pmolプライマー1(5'-ATGAACAANAANAACCGCCACCCSGCCGAC-3')(配列番号3)1μL、100pmolプライマー2(5'-TCARTCYGCCAGGGCGATYGGSCCGATYTC-3') (配列番号4)1μL、鋳型DNA2μL及びEx Taq 1μLとした。PCR反応の条件は、(i)98℃で5分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)60℃で4分間及び(ii)までを31サイクルとした。増幅した遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子をVIOGENE(USA)社のGel-Mゲル抽出キットを用いて抽出した。
遺伝子の両方の鎖についてシーケンシングを行うため、プライマー1、プライマー2、プライマー3(5'- AGCACGGTAATCGATCTGGA-3') (配列番号5)及び、プライマー4(5'- CATCGAGTGCCAGTTGCACG-3') (配列番号6)を用いてシーケンス反応を行った。反応液組成は、1.6μLの各プライマー、1.6μLの、1μLのBigDyeプレミックスソリューション、1.6μLの5xBigDye シーケンシングバッファーと2.8μLの滅菌水とし、全量10μLとした。PCR反応の条件は、(i)96℃で2分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)60℃で4分間、(v)(ii)〜(iv)を25回及び(vi)72℃で5分間とした。PCR産物に、1μLの3M 酢酸ナトリウム(pH 5.2)、1μLの0.125M EDTAと25μLのエタノールを加え、室温で15分間放置した後、遠心分離により(15,000rpm、8分間、4℃)、沈殿させた。上清を廃棄した後、10μLの Hi Di Formamideを加え、100℃で5分間加熱した後に、氷水で急冷したものをABI PRISM 310 Genetic Analyzerで塩基配列の解読をした。得られたシーケンスデータの解析はGenetyxで行い、それぞれのプライマーで増幅した断片を連結した。図2に、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株由来L-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子配列から予測される1次構造を示した。
ライゲーション反応の組成は、PCR産物 5μL、pT7 Blue T-Vecter (Novagen)1μL、ライゲーションミックス(Takara)6μLとし、16℃で30分間反応させた。大腸菌(E.coli JM 109)のコンピテントセル100μLに12μLのライゲーション反応液を加え、ヒートショック法で形質転換を行った。80μg/mLのアンピシリンを含むLB培地 (1.0% ポリペプトン、0.5%イースト抽出物及び1.0% NaCl)に生育したコロニーを数株選抜してプラスミド抽出し、0.7%アガロース電気泳動により、インサートの有無の確認を行った。
(i)シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株由来L-アミノ酸オキシダーゼ酵素遺伝子の増幅
上記クローニングで得られたプラスミドを鋳型DNAとし、PCRを行った。PCR反応液の組成は、水35μL、10×Ex Taq buffer 5μL、2mM dNTP 5μL、100pmol/μL プライマー5(5'- TATAATCATATGAACAAGAACAACCGCCA-3') (配列番号7)1μL、100 pmol/μLプライマー6 (5'- TATTACTCGAGTCAGTCCGCCAGGGCGATTG-3') (配列番号8)1μL、鋳型DNA 100ng及びEx Taq 5unitとした。プライマー5およびプライマー6にはそれぞれNdeIおよびXhoIの制限酵素サイトを設けた。PCR反応の条件は、(i)98℃で5分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)60℃で4分間及び(ii)までを31サイクルとした。
PCR反応で得られた、PCR産物5μLに、1μL NdeIと1μL XhoIを加え、37℃で1時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。ライゲーション反応は、5μL DNA、1μL pET15b(増幅遺伝子と同様の制限酵素処理を行ったもの)、6μLライゲーションMixとし、16℃で30分間インキュベートした。得られたライゲーション反応液全量を、ヒートショック法により、大腸菌(E. coli BL21)に導入した。尚、本組換え大腸菌が生成するL-アミノ酸オキシダーゼは、N末端側にヒスチジンtag6が付加した融合タンパクとして生成されるように発現用プラスミドを構築した。
80μg/mLのアンピシリンを含む4LのLB培地(1.0% ポリペプトン、0.5% イースト抽出物、1.0% NaCl、pH 7.0)に組換え大腸菌(BL21)を植菌し、37℃で12時間培養後、0.5mM IPTGを添加して引き続き30℃で12時間培養してL-アミノ酸オキシダーゼを誘導した。大型遠心機で集菌し(5,000rpm、10分間、4℃)、生理食塩水(0.9% NaCl)で洗浄した後、100mLの20mM リン酸緩衝液(pH 7.0)(KPB)に懸濁した。100mLの菌体液を15分間超音波処理し、遠心分離(8,000rpm、20分間、4℃)で得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液を20mM KPBで置換したNi-Sepharoseカラムに吸着させ、20mM KPBでカラムを洗浄後、500mM イミダゾールを含む20mM KPBで酵素液を溶出させた。
精製酵素標品の酵素活性を、表2におけるアミノ酸をそれぞれ単独に含有する測定試薬にて測定し、本酵素標品が以下の性質を有するものであることを確認した:
(a)L-リジン、L-アルギニン、L-オルニチンを基質とする(表4)。これら以外のタンパク質構成アミノ酸(L-チロシン、L-アラニン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-メチオニン、L-アスパラギン、L-プロリン、L-グルタミン、L-アルギニン、L-セリン、L-スレオニン、L-バリン)に対してはL-アミノ酸オキシダーゼは活性を示さなかった。
実施例2にて精製したL−アミノ酸オキシダーゼ標品を用いて、上述のL−リジン測定用試薬組成物を調製した。本試薬組成物を用い、L−リジン測定を実施した。検体としては、1〜6mMのL−リジン水溶液を調製した。
Claims (14)
- 下記の(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
(1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、
但し、前記L-アミノ酸オキシダーゼ活性は、酸素及び水の存在下、pH 7.0-8.5においてL-リジン、L-オルニチン及びL-アルギニンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成し、かつpH 5.5-6.5においてはL-リジンに対しては上記作用を示すが、L-オルニチン及びL-アルギニンに対しては上記作用を示さないことを意味する。 - 下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
(1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列;
但し、前記L-アミノ酸オキシダーゼ活性は、酸素及び水の存在下、pH 7.0-8.5においてL-リジン、L-オルニチン及びL-アルギニンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成し、かつpH 5.5-6.5においてはL-リジンに対しては上記作用を示すが、L-オルニチン及びL-アルギニンに対しては上記作用を示さないことを意味する。 - 検体とL-アミノ酸オキシダーゼとを水と酸素の存在下に所定時間放置する工程(A)、
放置後の反応液中に存在する前記L-アミノ酸オキシダーゼの作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程(B)
を含む、前記検体中のL-リジンの定量方法であって、
前記L-アミノ酸オキシダーゼが、請求項1に記載のタンパク質である、前記方法。 - 工程(A)における放置を、pH 5.5-6.5にて行う、請求項3に記載の方法。
- 前記工程(B)で計測する反応生成物が過酸化水素である請求項3または4に記載の方法。
- 過酸化水素を、ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する請求項5に記載の方法。
- 過酸化水素を、過酸化水素電極を用いた電流検出型センサーにより測定する請求項5に記載の方法。
- 前記工程(B)で計測する反応生成物がアンモニアである請求項3または4に記載の方法。
- アンモニアを、アンモニア検出薬を用いて測定する請求項8に記載の方法。
- 前記工程(B)で計測する反応生成物がL-リジンの脱アミノ化生成物である請求項3または4に記載の方法。
- 以下の試薬を含むL-リジンの定量用キット。
(K1)L-アミノ酸オキシダーゼ
但し、前記L-アミノ酸オキシダーゼは、請求項1に記載のタンパク質である、前記キット。 - (K2)反応用緩衝液、(K3)過酸化水素検出用試薬、(K4)アンモニア検出薬および(K5) L-リジンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つをさらに含む、請求項11に記載のキット。
- L-アミノ酸オキシダーゼを検出用電極の表面または検出用電極の近傍に配置したL-リジンの検出または定量用酵素センサーであって、
前記検出用電極は過酸化水素検出用電極であり、かつ
前記L-アミノ酸オキシダーゼは、請求項1に記載のタンパク質である、前記センサー。 - 過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極である請求項12に記載の酵素センサー。
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