JP2015112058A - 新規l−アミノ酸オキシダーゼとその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
L-アミノ酸+H2O+O2 2-オキソ酸+NH3+H2O2
[1]下記の酵素化学的性質を有するL-アミノ酸オキシダーゼ、
(1)作用:L-アミノ酸のα−アミノ基とL-リジンのε−アミノ基を脱アミノする反応を触媒する、
(2)分子量:SDS-PAGEによる分子量が約75.3kDa、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約290kDa、
(3)基質特異性:β−ラクトグロブリン、ミオグロビン、サケゼラチンに作用する。L-リジン、L-ロイシン、L-メチオニン、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-アルギニン、L-オルニチン、L-チロシン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-ヒスチジンに対して作用し、L-トレオニン、L-イソロイシン、L-セリン、L-バリン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-プロリン、グリシン、D-アミノ酸、モノアミン、ジアミン及びアミノアルコールには作用しない。
[2]下記の酵素化学的性質を更に有する、[1]に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ、
(4)至適pH:7〜8、
(5)pH安定性:pH5〜6の範囲で安定(40℃、30分間)、
(6)至適温度:50℃〜55℃、
(7)温度安定性:20℃〜40℃の範囲で安定(pH6.0、30分間)。
[3]下記の酵素化学的性質を更に有する、[2]に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ、
(8)等電点:3.2、
(9)阻害剤:カルボニル化合物、キレート剤及びFeCl3によりL-アミノ酸オキシダーゼ活性が強く阻害される、
(10)補酵素:フラビンを補酵素として含有する。
[4]アミノ酸配列ENIADVADAMGPWFDGVAYM(配列番号1)を構造の一部に含む、[3]に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ。
[5]N末端アミノ酸配列がENIADVADAMGPWFDGVAYM(配列番号1)である、[3]に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ。
[6]ペニシリウム ステッキイ由来である、[1]〜[5]のいずれか一項に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ。
[7]ペニシリウム ステッキイ AIU027由来である、[1]〜[6]のいずれか一項に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ。
[8][1]〜[7]のいずれか一項に記載のL-アミノ酸オキシダーゼを有効成分とする酵素剤。
[9]以下のステップ(1)及び(2)を含む、L-アミノ酸オキシダーゼの製造法:
(1)ペニシリウム ステッキイを、L-リジン又はL-リジン誘導体を窒素源として含有する培地で培養するステップ、
(2)培養後の培養液及び/又は菌体より、L-アミノ酸オキシダーゼを回収するステップ。
[10][1]〜[7]のいずれか一項に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ又は[8]に記載の酵素剤を蛋白質又はペプチドに作用させることを特徴とする、蛋白質又はペプチドの修飾方法。
[11]前記蛋白質及びペプチドが、L-リジンを構成アミノ酸として含有している、[10]に記載の修飾方法。
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。用語「単離された」は、天然の状態、即ち、自然界において存在している状態のものと区別するために使用される。単離するという人為的操作によって、天然の状態とは異なる状態である、「単離された状態」となる。単離されたものは、天然物自体と明確且つ決定的に相違する。
本発明の第1の局面はL-アミノ酸オキシダーゼ及びその生産菌を提供する。本発明のL-アミノ酸オキシダーゼ(以下、「本酵素」ともいう)は以下の酵素化学的性質を備えることを特徴とする。まず、本酵素は次の反応、即ち、L-アミノ酸のα−アミノ基とL-リジンのε−アミノ基を脱アミドする反応を触媒する。また、SDS-PAGEによる分子量が約75.3kDa、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約290kDaである。尚、本酵素は4量体からなる。
寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室)
寄託日:2013年10月11日
受託番号:NITE BP−01717
本酵素の至適pHは7〜8である。至適pHは、例えば、pH5.0〜8.5のpH域では0.2Mリン酸カリウム緩衝液、pH8.5〜9.0のpH域では0.2MのH3BO3-KCl-NaOH緩衝液中で測定した結果を基に判断される。
本酵素はpH5〜6のpH域で安定した活性を示す。即ち、処理に供する酵素溶液のpHがこの範囲内にあれば、40℃、30分の処理後、最大活性の80%以上の活性を示す。pH安定性は、例えば、pH5.0〜8.5のpH域では0.2Mリン酸カリウム緩衝液、pH8.5〜9.0のpH域では0.2MのH3BO3-KCl-NaOH緩衝液中で測定した結果を基に判断される。
本酵素の至適温度は50℃〜55℃である。至適温度は、リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を用い、β−ラクトグロブリンを基質とした測定法によって評価することができる。
本酵素は、リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)中、20℃〜40℃の条件で30分間処理しても80%以上の活性を維持する。
本酵素の等電点(pI)は3.2である。
カルボニル化合物(ヒドロキシルアミンやフェニルヒドラジン)、キレート剤(α,α’−ジピリジル(α,α'-Dipyridyl)や 8-ヒドロキシキノリン)及びFeCl3によりL-アミノ酸オキシダーゼ活性が強く阻害される。
本酵素はフラビンを補酵素として含有する。
本発明の第2の局面はL-アミノ酸オキシダーゼの製造法を提供する。本発明の製造法では、ペニシリウム ステッキイを、L-リジン又はL-リジン誘導体を窒素源として含有する培地で培養するステップ(ステップ(1))と培養後の培養液及び/又は菌体より、L-アミノ酸オキシダーゼを回収するステップ(ステップ(2))を行う。ステップ(1)に使用するペニシリウム ステッキイは、本酵素(L-アミノ酸オキシダーゼ)を生産するものであれば特に限定されない。好ましくは、ペニシリウム ステッキイAIU 027株を使用する。本発明では、目的の酵素、即ちL-アミノ酸オキシダーゼの生産を誘導するために、L-リジン又はL-リジン誘導体を窒素源として含有する培地を用いて培養する。その他の培養条件や培養法は、本酵素が生産されるものである限り特に限定されない。即ち、本酵素が生産されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。培養法としては液体培養、固体培養のいずれでも良いが、好ましくは液体培養が利用される。液体培養を例にとり、その培養条件を説明する。
本酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分(本酵素)の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては乳糖、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
本発明の更なる局面は、本酵素の用途として、本酵素(又は本酵素を含有する酵素剤)を用いた、蛋白質又はペプチドの修飾方法(物性改良方法)を提供する。本発明の修飾方法では蛋白質又はペプチドに対して本酵素を作用させる。本発明の修飾方法は、様々な蛋白質、ペプチドの修飾に利用可能である。基質となる蛋白質又はペプチドは特に限定されない。上記の通り本酵素はL-リジンのε−アミノ基を脱アミドする能力を持つ。従って、L-リジンを含む蛋白質又はペプチドは好適な基質となる。また、ペプチドの長さは特に限定されない。但し、後述の実施例に示すように、本酵素が高分子量のペプチドに対して効率的に作用することを考慮すれば、高分子ペプチド(例えば分子量が100〜4700)は好適な基質となる。
反応温度:20℃〜55℃
反応時のpH:pH5〜9
反応時間:10分〜12時間
本発明者は、リジン側鎖のε位にあたるアミノ基にも充分に作用でき、多種類の蛋白質やペプチドが基質となるL-アミノ酸オキシダーゼを見出すべく、以下のスクリーニングを実施した。
ペニシリウム ステッキイAIU 027のスクリーニングは、窒素源としてL-リジンの誘導体であるNα-Z-L-リジンを用いる特殊な条件で行った。本L-アミノ酸オキシダーゼの生産に窒素源の種類が影響している可能性が考えられたことから、単一窒素源としてL-リジン、Nα-Z-L-リジン、硝酸アンモニウム又は硫酸アンモニアを用い、ペニシリウム ステッキイAIU 027を培養した。培養後に回収した菌体から酵素を抽出し、酵素活性の違いを検討した。Nα-Z-L-リジン培地(培地組成:0.5% Nα-Z-L-リジン、0.5% グルコース、0.2% KH2PO4、0.1% Na2HPO4、0.05% MgSO4・7H2O、pH 7.0)の窒素源をL-リジン、Nα-Z-L-リジン、硝酸アンモニウム又は硫酸アンモニアに置き換えた培地(以下、各培地をL-リジン培地、Nα-Z-L-リジン培地、硝酸アンモニウム培地、硫酸アンモニア培地と呼ぶ)を調製し、ペニシリウム ステッキイAIU 027株を培養し、菌体中の酵素活性をβ−ラクトグロブリンを基質として測定した。その結果、硝酸アンモニウム培地又は硫酸アンモニア培地ではL-アミノ酸オキシダーゼ活性が検出できなかった。L-リジン培地又はNα-Z-L-リジン培地ではL-アミノ酸オキシダーゼ活性を検出でき、L-リジン培地の場合の方がNα-Z-L-リジン培地の場合よりも酵素活性が高かった。以上より、ペニシリウム ステッキイ AIU027株のL-アミノ酸オキシダーゼの生産は窒素源の種類に影響を受け、L-リジンやNα-Z-L-リジンで生産が誘導されることが明らかとなった。
ペニシリウム ステッキイAIU 027株のL-アミノ酸オキシダーゼ生産の経時的変化を検討した。ペニシリウム ステッキイAIU 027株を以下の通り培養した。500mlフラスコを用い、150mlのL-リジン培地でペニシリウム ステッキイAIU 027株を30℃、2日間振とう培養(115 strokes/min)した。培養後の培養液200mlを3Lフラスコに移し、2LのL-リジン培地を添加して30℃、4日間培養した。経時的に菌体を回収し、菌体中のL-アミノ酸オキシダーゼ活性をβ−ラクトグロブリンとサケゼラチンを基質として測定した。β−ラクトグロブリンとサケゼラチンを基質とした活性測定のいずれにおいても、L-アミノ酸オキシダーゼ活性は培養開始後1日目から上昇し始め3日目に最大値を示し、4日目には3日目の活性よりも低下した(図1)。酵素活性の上昇に伴い培地pHは7から次第に低下した。菌体量は酵素活性が最大になった3日目以降も増加し、培養4日目までは低下しなかった。以上より、菌体培養3日目に酵素生産量が最大になると考えられた。
ペニシリウム ステッキイAIU 027株由来のL-アミノ酸オキシダーゼの酵素学的な特性を解析するため、酵素の精製を行った。菌体の培養と回収は次のように行った。500mlフラスコを用い、150mlのL-リジン培地(0.5% L-リジン、0.5% グルコース、0.2% KH2PO4、0.1% Na2HPO4、0.05% MgSO4・7H2O、pH 7.0)でペニシリウム ステッキイAIU 027株を30℃、2日間振とう培養(115ストローク/分)した。培養後の培養液200mlを3Lフラスコに移し、2LのL-リジン培地を添加し、更に30℃、3日間培養を行った。培養後、菌体をろ過により回収し、10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)で洗浄後、−30℃で保存した。38LのL-リジン培地での培養に相当する菌体から酵素を精製した。酵素精製の全操作は5℃〜10℃の温度条件下で行った。また、緩衝液はリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を用いた。まず最初に菌体(湿潤重量66g)を560 mlの10 mMリン酸カリウム緩衝液に懸濁し、マルチビーズショッカー(安井器械社製)にて破砕した。遠心分離(10,000×g、10分)後、上清を回収し、残った菌体破砕物を500 mlの別の10 mMリン酸カリウム緩衝液に懸濁し、遠心分離により上清を回収した。この操作を繰り返し、合計3回の菌体破砕物からの抽出を行った。得られた抽出物をまとめて合計1,900 mlの溶液とした。この抽出液に対し309 gの硫酸アンモニウムを加えて40%飽和溶液とし、硫安沈殿を行った。沈殿物は遠心分離(10,000×g、10分)により取り除いた。遠心分離の上清を、2.0M硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸カリウム緩衝液で平衡化したPhenyl-Toyopearlカラム(20 cm×直径2.5 cm)に供した。2.0M硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸カリウム緩衝液でカラムを洗浄後、吸着成分を1.5M 硫酸アンモニアを含む10 mM リン酸緩衝液で溶出し、酵素活性を確認した。酵素活性が確認された画分を集めてゲルろ過で脱塩処理した。このようにして得られた酵素活性画分を、40mMリン酸緩衝液で平衡化したDEAE-Toyopearlカラム(20 cm×直径2.5 cm)に供した。40mMリン酸緩衝液でカラムを洗浄後、カラムに吸着した酵素成分を40 mM リン酸カリウム緩衝液と0.12 M食塩を含む40mMリン酸カリウム緩衝液を用いた食塩のグラジエントで溶出させた。溶出した酵素画分を30 mMのリン酸緩衝液で透析処理した。次に、透析処理した画分を、50mMリン酸カリウム緩衝液で平衡化されたAminooctyl-Toyopearlカラム(10 cm×直径2.5 cm)に供した。50mMリン酸緩衝液でカラムを洗浄後、カラムに吸着された酵素成分を50 mMリン酸カリウム緩衝液と0.2 M食塩を含む50mMリン酸カリウム緩衝液を用いた食塩のグラジエントで溶出した。酵素活性を示した画分を回収し、10mMリン酸カリウム緩衝液で透析処理を行った。更に、透析処理した酵素画分を、20 mMリン酸緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム(38 cm×直径1.0 cm)に供した。カラムを20 mMリン酸緩衝液で洗浄後、カラムに吸着された酵素成分を、20 mMリン酸カリウム緩衝液と0.12 M食塩を含む20mMリン酸カリウム緩衝液を用いた食塩のグラジエントで溶出した。酵素活性を示した画分を集め、限外ろ過により0.8mlまで濃縮した。次に、濃縮された酵素画分を、50mMリン酸カリウム緩衝液で平衡化したToyopearl HW-55 カラム(53 cm×直径1.3 cm)に供し、酵素活性を示す画分を回収した。精製結果を図2の表に示す。
精製酵素の分子量を推定するためにSDS-PAGEを実施した。SDS-PAGEはLaemmliの方法(Laemmli, U. K.: Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685 (1970).)に従い行った。ゲルの染色にはCoomassie Brilliant Blue R-250を用いた。分子量推定に用いるマーカー蛋白質には標準分子量マーカー(Standard markers of molecular mass(Sigma-Aldrich))を用いた。SDS-PAGEの結果を図3左に示した。SDS-PAGEの分析では、精製酵素は約75.3KDaのフラグメントからなると推察された。
本酵素の補酵素を特定するために精製酵素の吸収波長を調べた。その結果、波長275nm、390nm及び460 nmで吸収を観察した。この結果から、本酵素はフラビンを補酵素として含有すると考えられた。更に、ICPEスペクロメトリーにより、本酵素は鉄原子を含有していると考えられた。
Pharmalyteを用いた等電点電気泳動の結果より、精製酵素の等電点はpH 3.2であった。
精製酵素のアミノ酸配列を解析した。その結果、アミノ酸配列ENIADVADAMGPWFDGVAYM(配列番号1)を持つ酵素であることが判明した。本配列を有する微生物由来L-アミノ酸オキシダーゼの報告はなく、本酵素が新規の酵素であることが判明した。本配列は本酵素成熟体のN末端配列と考えられた。
本酵素の至適pHとpH安定性を検討した。至適pH検討にはpH5.0〜8.5域では0.2Mリン酸カリウム緩衝液、pH8.5〜9.0では0.2MのH3BO3-KCl-NaOH緩衝液を使用した。酵素活性はβ−ラクトグロブリンを基質として測定した。測定結果を図4に示した。酵素の至適pHは7〜8と推定された。
至適温度を検討するため、リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を用い、各温度での酵素活性を測定した。酵素活性はβ−ラクトグロブリンを基質として測定した。結果を図5に示した。至適温度は50〜55℃であり、60℃で急激に酵素活性を示さなくなった。温度安定性を検討するため、リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)中、各温度で30分間加熱後、β−ラクトアルブミンを基質として酵素活性を測定した。結果を図5に示した。20〜40℃で安定であり、活性は80%以上保持されていた。50℃以上で酵素は急激に失活した。
各種金属、キレート剤又はその他の化合物の酵素活性への影響を調べた。酵素活性測定系に各化合物を1mM濃度で添加後、酵素活性を測定し、各化合物による酵素活性への影響を調べた。結果を図6の表に示した。12種類の化合物について調べた結果、カルボニル化合物(ヒドロキシルアミンやフェニルヒドラジン)によりL-アミノ酸オキシダーゼ活性が強く阻害された。α,α’-ジピリジル(Dipyridyl)や8-ヒドロキシキノリンなどのキレート剤もまたL-アミノ酸オキシダーゼ活性を阻害した。金属ではFeCl3がL-アミノ酸オキシダーゼ活性を強く阻害した。
各種基質に対する本酵素の反応性を調べた。各種アミノ酸誘導体40mM溶液、又は各種アミノ酸基質1mMを用い、様々な基質に対する反応性を調べた。また、ポリ-L-リジン、フィッシュコラーゲンペプチド及びサケゼラチンについても、Toyopearl HW-55カラム(53 cm×直径1.3 cm)を使用してこれらの蛋白質を分画し、メインピークを集めて基質とし、反応性を調べた。ポリ-L-リジン、フィッシュコラーゲンペプチドI、フィッシュコラーゲンペプチドII及びサケゼラチンの分子量はTSK gel G3000SWXLカラムを用いたゲルろ過で算出した。
L-リジン、Nα-Z-L-リジン及びNε-Z-L-リジンに対するKm値を求め、L-リジンとL-リジン誘導体の各アミノ基(α-アミノ基、ε-アミノ基)に対するKm値を比較した。各種蛋白質、ペプチドにおけるリジン残基に対する作用を検討するためにKmとVmaxを算出した。0.055〜0.66 mMのβ−ラクトグロブリン、0.07〜0.55 mMのポリ-L-リジン、0.0021〜0.025 mMのフィッシュコラーゲンペプチドI、0.0018〜0.018 mMのフィッシュコラーゲンペプチドII、0.6〜20 mMのサケゼラチン、5.0〜80 mMのGly-Lys、5.0〜80 mMのAla-Lysを基質に用い、KmとVmaxを算出した。ポリ-L-リジン、フィッシュコラーゲンペプチド及び サケゼラチンToyopearl HW-55カラム(53 cm×直径1.3 cm)にて分画し、メインピークを集めて基質とした。ポリ-L-リジン、フィッシュコラーゲンペプチドI、フィッシュコラーゲンペプチドII及びサケゼラチンの分子量はTSK gel G3000SWXLカラムを用いたゲルろ過で算出した。
Claims (11)
- 下記の酵素化学的性質を有するL-アミノ酸オキシダーゼ、
(1)作用:L-アミノ酸のα−アミノ基とL-リジンのε−アミノ基を脱アミドする反応を触媒する、
(2)分子量:SDS-PAGEによる分子量が約75.3kDa、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約290kDa、
(3)基質特異性:β−ラクトグロブリン、ミオグロビン、サケゼラチンに作用する。L-リジン、L-ロイシン、L-メチオニン、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-アルギニン、L-オルニチン、L-チロシン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-ヒスチジンに対して作用し、L-トレオニン、L-イソロイシン、L-セリン、L-バリン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-プロリン、グリシン、D-アミノ酸、モノアミン、ジアミン及びアミノアルコールには作用しない。 - 下記の酵素化学的性質を更に有する、請求項1に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ、
(4)至適pH:7〜8、
(5)pH安定性:pH5〜6の範囲で安定(40℃、30分間)、
(6)至適温度:50℃〜55℃、
(7)温度安定性:20℃〜40℃の範囲で安定(pH6.0、30分間)。 - 下記の酵素化学的性質を更に有する、請求項2に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ、
(8)等電点:3.2、
(9)阻害剤:カルボニル化合物、キレート剤及びFeCl3によりL-アミノ酸オキシダーゼ活性が強く阻害される、
(10)補酵素:フラビンを補酵素として含有する。 - アミノ酸配列ENIADVADAMGPWFDGVAYM(配列番号1)を構造の一部に含む、請求項3に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ。
- N末端アミノ酸配列がENIADVADAMGPWFDGVAYM(配列番号1)である、請求項3に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ。
- ペニシリウム ステッキイ由来である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ。
- ペニシリウム ステッキイ AIU027由来である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のL-アミノ酸オキシダーゼを有効成分とする酵素剤。
- 以下のステップ(1)及び(2)を含む、L-アミノ酸オキシダーゼの製造法:
(1)ペニシリウム ステッキイを、L-リジン又はL-リジン誘導体を窒素源として含有する培地で培養するステップ、
(2)培養後の培養液及び/又は菌体より、L-アミノ酸オキシダーゼを回収するステップ。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載のL-アミノ酸オキシダーゼ又は請求項8に記載の酵素剤を蛋白質又はペプチドに作用させることを特徴とする、蛋白質又はペプチドの修飾方法。
- 前記蛋白質及びペプチドが、L-リジンを構成アミノ酸として含有している、請求項10に記載の修飾方法。
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