CN104830958B - L-苏氨酸的分析方法和l-苏氨酸脱氢酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含在被分析物中的L‑苏氨酸的分析方法，将含有被分析物的样品与来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的L‑苏氨酸脱氢酶以及辅酶NAD+混合，经过预定的时间后，分析NADH的量或2‑氨基‑3‑氧代丁酸的量；可用于该分析方法中的新型L‑苏氨酸脱氢酶(TDH；EC 1.1.1.103)——来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的L‑苏氨酸脱氢酶；用于制备该酶的基因等和酶的制备方法；还提供了包括(A)上述L‑苏氨酸脱氢酶和(B)辅酶NAD+的用于分析L‑苏氨酸脱氢酶的试剂盒，其是在缓冲液中含有上述L‑苏氨酸脱氢酶且用于分析L‑苏氨酸脱氢酶的酶制品；使用上述L‑苏氨酸脱氢酶的酶传感器。

Description

L-苏氨酸的分析方法和L-苏氨酸脱氢酶
本申请是申请日为2011年3月4日、申请号为201180012376.9的中国发明申请“L-苏氨酸的分析方法和L-苏氨酸脱氢酶”的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年3月4日提交的日本专利申请2010-48193号的优先权，兹将其全文援引到本文中。
技术领域
本发明涉及L-苏氨酸的分析方法和可用于该分析方法中的L-苏氨酸脱氢酶。
背景技术
L-苏氨酸是必需氨基酸，必须从食物中获取。L-苏氨酸对于保持体内的氮平衡是必需的，并促进正常的生长发育。此外，它对于保持心血管、肝脏、中枢神经、肠、免疫系统的功能也有作用。
由于缺乏维生素B12、II型瓜氨酸血症、败血症、氨基酸或氮失衡，可导致血液中的苏氨酸含量不足。此外，素食主义者由于食用缺少苏氨酸含量的谷类，可以导致苏氨酸不足。对于各种疾病或先天性代谢异常的诊断、患者的长期营养补充、氨基酸代谢异常疾病的相关研究等而言，L-苏氨酸的定量是必须的。
已报道过多种L-苏氨酸的定量方法。通过四乙酸铅使苏氨酸变为乙醛，用浓聚硫酸吸收，检测乙醛与对羟基联苯缩合的色素，来测量蛋白质水解产物、明胶、血清中的苏氨酸，可以通过HPLC、质谱、氨基酸分析装置等定量。这些方法存在操作危险，需要多个步骤，使用昂贵的仪器，不适合操作多个样品的大规模筛选方法的问题。
作为酶学手段，有使用苏氨酸脱氨酶(EC 4.2.1.16)的方法。报道了该酶将L-苏氨酸分解为α-酮基丁酸和氨，所生成的α-酮基丁酸变成腙衍生物的方法(非专利文献1)。
一个例子是用过碘酸氧化大鼠血浆中的苏氨酸，用醛脱氢酶(EC1.2.1.5)定量所生成的醛。通过添加D-半乳糖消耗多余的过碘酸(非专利文献2)。通过醛脱氢酶的作用，乙醛还原NAD+，生成NADH+，进一步通过使用荧光色素的方法进行定量。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Watanabe K,Itoh N,Tanaka A,Fukui S.Application of animmobilized Escherichia coli cell tube in analysis of L-threonine.Agric.Biol.Chem.(1982)46:119-126
非专利文献2：Nishida T,Kume S,Saito M,Suda M.A specific method for thedetermination of threonine in rat blood plasma using aldehyde dehydrogenase.JBiochem.(1977)81:1085-1090
上述非专利文献1和2的全文记载经特别明示援引到本文中。
发明内容
发明要解决的课题
但是，在非专利文献1记载的方法中，苏氨酸脱氨酶不仅对L-苏氨酸有活性，而且对L-丝氨酸、D-丝氨酸也有活性，因此该方法不适用于定量含有L-丝氨酸的样品。
此外，非专利文献2记载的方法必需添加D-半乳糖消化多余的过碘酸，不是借助单一的酶的定量方法。
因此，本发明的目的是提供可以借助单一的酶定量L-苏氨酸的分析方法，提供可用于该分析方法的新型L-苏氨酸脱氢酶(TDH；EC 1.1.1.103)及用于制备该酶的基因等和酶的制备方法，此外，提供用于上述L-苏氨酸分析的试剂盒、酶制品。
尚未报道过使用TDH定量L-苏氨酸。本发明人研究了适用于L-苏氨酸的分析方法的新型TDH，结果发现了来自钩虫贪铜菌的新型TDH，并发现使用该TDH的L-苏氨酸的酶学定量方法是可能的，从而完成了本发明。
为了解决课题的手段
本发明如下。
[1]、被分析物中包含的L-苏氨酸的分析方法，其中，将含有被分析物的样品与来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的L-苏氨酸脱氢酶或者具有下述(1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质以及辅酶NAD+混合，经过预定的时间后，分析NADH的量或2-氨基-3-氧代丁酸的量，
(1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1～30个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
[2]、[1]记载的分析方法，其中，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC102504。
[3]、[1]或[2]记载的分析方法，其中，所述NADH的量的分析是通过测定340nm处的吸光度(A340)、色素生成、或变换为荧光来进行的。
[4]、[1]或[2]记载的分析方法，其中，所述2-氨基-3-氧代丁酸的量的分析是通过将自2-氨基-3-氧代丁酸生成的氨基丙酮用单胺氧化酶氧化，并测定所产生的氨或过氧化氢来进行的。
[5]、来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶。
[6]、[5]记载的L-苏氨酸脱氢酶，其中，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC102504。
[7]、具有下述(1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质：
(1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1～30个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
[8]、来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶，其具有以下物理性质和特性：
分子量(SDS-PAGE和凝胶过滤色谱)：79400
亚基分子量(SDS-PAGE)：37200
最适pH：10.0
最适温度：75℃
底物特异性：仅对L-苏氨酸脱氢酶显示出活性
辅酶：NAD+(对NADP+为非活性)
抑制剂：被碘乙酰胺、PMS、NEM抑制。
[9]、编码[7]记载的蛋白质的基因。
[10]、重组载体，其是携带了[9]记载的基因的载体。
[11]、用[9]记载的基因或[10]记载的重组载体转化宿主细胞而得到的转化体。
[12]、具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质的生产方法，该方法包括在载体上携带[9]记载的基因，用该载体转化宿主细胞后，培养经转化的宿主细胞从而在培养物中积累由所述基因编码的蛋白质，收集所积累的蛋白质。
[13]、一种L-苏氨酸分析用试剂盒，其包含下述的(A)或(B)：
(A)来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶或者具有下述(1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质，和
(B)辅酶NAD+；
(1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
(2)序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1～30个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
[14]、[13]记载的试剂盒，其中，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC102504。
[15]、[13]记载的试剂盒，其还包括用于分析NADH的量的色素和/或酶。
[16]、L-苏氨酸分析用酶制剂，其是通过使缓冲液中包含来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶或具有下述(1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质而成的：
(1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1～30个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
[17]、[16]记载的酶制剂，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC 102504。
[18]、用于定量L-苏氨酸的酶传感器，其特征在于，在检测用电极上直接或间接地固定或布置了来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶或具有下述(1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质：
(1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1～30个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
发明的效果
通过本发明，由TDH将样品中的L-苏氨酸脱氢，还原辅酶NAD+，定量生成NADH，通过直接或间接的定量NADH，可以定量样品中的L-苏氨酸浓度。通过本发明的方法，可以通过单个步骤进行分析。或者也可以在上述酶促反应中定量从L-苏氨酸生成的2-氨基-3-氧代丁酸来定量L-苏氨酸浓度。
附图说明
图1：图1示出了来源于钩虫贪铜菌NBRC 102504的TDH的SDS-PAGE。泳道：M，分子量标准s；1，无细胞提取液；2，硫酸鱼精蛋白；3，30-60％硫酸铵级分；4，DEAE-TOYOPEARL；5，丁基-TOYOPEARL；6，Gigapite；7，Superdex-G200。
图2：图2示出了TDH的分子量确定结果。标准蛋白质(●)，TDH(〇)。
图3：图3示出了TDH在不同pH下的活性。(△)：乙酸钠缓冲液(pH5.0-6.0)；(▲)：磷酸钾缓冲液(pH 6.0-7.5)；(□)：HEPES缓冲液(pH7.0-8.0)；(■)：Tris-HCl缓冲液(pH7.5-9.0)；(〇)：Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 9.0-11.5)；(●)：甘氨酸-KCl-KOH缓冲液(pH10.0-12.0)。
图4：图4示出了在各种缓冲液中的TDH的pH稳定性。(△)：乙酸钠缓冲液(pH 4.0-6.0)；(▲)：磷酸钾缓冲液(pH 6.0-7.5)；(□),Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0)；(〇),Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 9.0-11.0)；(●),甘氨酸-KCl-KOH缓冲液(pH 10.0-12.0)。
图5：图5示出了pH对TDH活性的影响。
图6：图6示出了温度对酶稳定性的影响。
图7：图7示出了本发明的TDH对L-苏氨酸的Lineweaver Burk作图。
图8：图8示出了本发明的TDH对NAD+的Lineweaver Burk作图。
图9：图9示出了本发明的TDH的基因序列和氨基酸序列。
图10：图10示出了从含有CnTDHpET15b质粒的大肠杆菌纯化的TDH-His的SDS-PAGE。泳道M：低分子量标记物；泳道1：大肠杆菌BL21(DE3)的无细胞提取液；泳道2：来自大肠杆菌BL21(DE3)的CnTDH-His的无细胞提取液；泳道3：纯化的基因重组的TDH-His酶。
图11：图11示出了使用TDH对L-苏氨酸的酶定量的标准曲线。
图12：图12示出了人血液中的L-苏氨酸浓度的测量结果。使用TDH的酶的微量滴定板测定(□)、通过UPLC的定量(■)。样品：A，人血清A；B，人血清B；C，人汇合血清；D，人血浆D；E，人血浆E；F，人汇合血浆。
图13：图13示出了向人血浆中添加已知量的TDH时，L-苏氨酸酶的定量结果。
发明的具体实施方式
L-苏氨酸脱氢酶
L-苏氨酸脱氢酶(TDH；EC 1.1.1.103)是在微生物和动物中异化L-苏氨酸的重要的关键酶(参考文献1，2)。TDH催化L-苏氨酸到2-氨基-3-氧代丁酸的氧化反应。2-氨基-3-氧代丁酸经过非酶促的脱羧反应，分解为氨基丙酮和二氧化碳。再通过CoA-依赖性的2-氨基-3-氧代丁酸CoA裂合酶(EC2.3.1.29)的作用将氨基丙酮分解为甘氨酸和乙酰-CoA(参考文献3)。
【化学式1】
在微生物中发现了来源于微生物的TDH(表1)。所述微生物是节杆菌属(Arthrobacter sp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)K12、噬纤维菌(Cytophaga sp.)KUC-1、斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、Thermococcus kodakaraensis，和链霉菌139(参考文献4-10)。后四种的TDH基因已经克隆，解析了基因序列，并在大肠杆菌中表达了酶。
大肠杆菌(E.coli)、堀越氏热球菌和T.kodakaraensis的TDH需要NAD+和锌作为辅酶，属于含锌的中链醇脱氢酶超家族(参考文献8、11、12)。来源于噬纤维菌的TDH需要NAD+，其结构属于与UDP-葡萄糖-4-差向异构酶相似的短链脱氢酶还原酶超家族。已知将来源于大肠杆菌的TDH中导入到异种宿主中，可有效的生产L-苏氨酸。
本发明人从钩虫贪铜菌发现了新的NAD+依赖性L-TDH(下文简称为CnTDH)。纯化了均一状态的该酶，明确了其各种酶化学性质。该酶以NAD+为辅酶，催化L-苏氨酸特异性的脱氢反应。该酶不需要金属离子作为辅助因子。在克隆该酶的基因分析序列时，表现出与噬纤维菌KUC-1(现在的Flavobacterium frigidimaris)的TDH基因仅有57％的同一性。与作为来源于好热性细菌和E.coli的TDH报道的基因几乎没有同一性。该酶可以在大肠杆菌良好的表达。大量地表达了在N-末端添加了His-tag的该酶，并进行了高效的纯化。
表1.来源于各种微生物的L-苏氨酸脱氢酶及其用途
表中，X表示不能或无实际效果，0表示有实际效果。
本发明的L-苏氨酸脱氢酶是来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶，钩虫贪铜菌优选是钩虫贪铜菌NBRC 102504。钩虫贪铜菌NBRC 102504是市售的菌株。钩虫贪铜菌原分类于真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)中，后变更为钩虫贪铜菌的分类。钩虫贪铜菌NBRC102504原是作为真养产碱菌IAM 13533销售的菌株，现在作为钩虫贪铜菌NBRC 102504销售。此外，Rastonia eutropha和Wautersia eutropha也是与钩虫贪铜菌相同的菌株名。
此外，本发明的L-苏氨酸脱氢酶是具有下述(1)-(3)中的任一氨基酸序列，且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质：
(1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1～30个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)具有相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
序列表的序列号1记载的氨基酸序列如实施例1所示，是自钩虫贪铜菌NBRC102504获得的具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列。L-苏氨酸脱氢酶活性可以通过实施例1的“活性筛选和测定”一项记载的方法实施。以下同样。
本发明是在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1～30个氨基酸而得到的氨基酸序列，且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质。氨基酸取代、氨基酸缺失和/或氨基酸插入的个数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个中的任一个，只要所述蛋白质具有L-苏氨酸脱氢酶的活性。
本发明是具有相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质。从L-苏氨酸脱氢酶活性高的观点出发，由与序列号1记载的氨基酸序列具有优选95％以上，更优选96％以上，更优选97％以上，更优选98％以上，最优选99％以上的同一性的氨基酸序列组成是适当的。
此外，本发明的L-苏氨酸脱氢酶是具有以下物理性质或特性的来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶。实施例中详细说明了酶的物理化学性质。
分子量(SDS-PAGE)：79400
亚基分子量(SDS-PAGE)：37200
最适pH：10.0
最适温度：75℃
底物特异性：仅对L-苏氨酸表现活性
辅酶：NAD+(对NADP+为非活性)
抑制剂：被碘乙酰胺、PMS、NEM抑制。
本发明包括编码具有上述(1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质的基因。本发明的基因的代表性实例显示在序列号2中。
与序列号2记载的基因序列完全相同的序列是作为从Rastonia eutropha H16的全基因组序列中解读的NAD依赖性差向异构酶脱氢酶进行的基因登记。NAD依赖性差向异构酶脱氢酶的氨基酸序列与序列号1记载的氨基酸序列100％相同。但是，NAD依赖性差向异构酶脱氢酶的名称是未经实验自动赋予的，没有进行生物化学实验。根据本发明中的实验结果，首次明确了上述NAD依赖性差向异构酶脱氢酶的氨基酸序列和基因序列的认识是错误的。
获得本发明的L-苏氨酸脱氢酶的方法没有特殊的限制，可以是通过化学合成而合成的蛋白质，也可以是通过基因组重组技术制备的重组蛋白。在制备重组蛋白的情况下，如后文所述获得编码所述蛋白质的基因(DNA)。可以通过将该DNA导入恰当的表达体系中，生产本发明的蛋白质(L-苏氨酸脱氢酶)。
可以通过这样的生产方法制备本发明的蛋白质(L-苏氨酸脱氢酶)，所述生产方法包括在载体上携带编码本发明的蛋白质(L-苏氨酸脱氢酶)的基因，用该载体转化宿主细胞之后，培养转化的宿主细胞，在培养物中积累由上述基因编码的蛋白质，收集所积累的蛋白质。
获得编码本发明的L-苏氨酸脱氢酶的基因的方法没有特殊的限制。编码本发明的L-苏氨酸脱氢酶的基因可以例如基于序列号1记载的氨基酸序列或序列号2记载的碱基序列的信息，用化学合成、基因工程手段或诱导突变等本领域技术人员已知的任何方法来制备。
例如，对于具有序列表的序列号2记载的碱基序列的DNA，可以进行使其与作为诱变剂的药剂接触作用的方法、照射紫外线的方法、使用基因工程的方法。一种有效的基因工程手段是位点特异性的诱变方法，所述方法是可以在特定的位点导入特定的突变的方法，可以按Molecular Cloning：A laboratory Mannual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY.,1989(下文简称为分子克隆第2版)、CurrentProtocols in Molecular Biology,Supplement 1～38,John Wiley&Sons(1987-1997)(下文简称为最新分子生物学实验指南)等中记载的方法进行。
基于本说明书中的序列表的序列号1记载的氨基酸序列或序列号2显示的碱基序列的信息制备恰当的探针或引物，通过用其筛选钩虫贪铜菌NBRC102504的cDNA文库，可以分离本发明的基因。cDNA文库可以通过常规方法从钩虫贪铜菌NBRC 102504中制备。
可以通过PCR方法获得编码本发明的L-苏氨酸脱氢酶的基因。使用上述钩虫贪铜菌NBRC 102504的cDNA文库作为模板，使用所设计的能够扩增序列号2记载的碱基序列的引物对进行PCR。可以恰当地设置PCR的反应条件，例如可以列举以由在94℃下反应30秒(变性)，在55℃下30秒-1分钟(退火)，在72℃下2分钟(延伸)组成的反应步骤为1个循环，进行例如30个循环后，在72℃下反应7分钟的条件等。然后，可以将扩增的DNA片段克隆到能够在大肠杆菌等宿主中扩增的恰当载体中。
上述探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选和目的基因的克隆等操作是本领域技术人员已知的，例如可以按Molecular Cloning第2版、Current Protocolsin Molecular Biology等中记载的方法进行。
可以将本发明的基因插入到恰当的载体中使用。本发明使用的载体种类没有特殊的限制，例如，可以是自主复制的载体(如质粒等)，或者也可以是在导入到宿主细胞中时，整合到宿主细胞的基因组中，与整合的染色体一起复制。优选的，本发明使用的载体是表达载体。在表达载体中，本发明的基因与转录必需的元件(例如，启动子等)可操作地连接。启动子是在宿主细胞中表现出转录活性的DNA序列，可以根据宿主的种类恰当的选择。
可以在细菌细胞中发挥功能的启动子可列举嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BAN淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶基因或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因的启动子，或λ噬菌体的PR或PL启动子、大肠杆菌的lac、trp或tac启动子等。
可以在哺乳动物细胞中发挥功能的启动子的例子是SV40启动子、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子或腺病毒2主要晚期启动子等。可以在昆虫细胞中发挥功能的启动子的例子是多角体启动子、P10启动子、苜蓿银纹夜蛾多角体碱性蛋白启动子、杆状病毒立即早期基因1启动子或杆状病毒39K延迟早期基因启动子等。可以在酵母细胞中发挥功能的启动子可列举来源于酵母糖酵解系统基因的启动子、醇脱氢酶基因启动子、TPI1启动子、ADH2-4c启动子等。可以在丝状真菌细胞中发挥功能的启动子的例子是ADH3启动子或tpiA启动子等。
此外，在必要时，本发明的基因还可以与恰当的终止子可操作地连接。包含本发明的基因的重组载体还可以具有多聚腺苷酸信号(例如，来源于SV40或腺病毒5E1b区域的)、转录增强子序列(例如SV40增强子)等元件。包含本发明的基因的重组载体还可以具备使所述载体能够在宿主细胞内复制的DNA序列，一个例子可列举SV40复制起点(当宿主细胞是哺乳类细胞时)。
包含本发明的基因的重组载体还可以含有选择标记物。选择标记物可以列举例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)或栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)TPI基因等宿主细胞中缺少其互补体的基因，或者是例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素或潮霉素等抗药性基因。分别连接本发明的基因、启动子和根据需要的终止子和/或分泌信号序列，并将它们插入到恰当的载体中的方法是本领域技术人员普遍已知的。
可以通过将包含本发明的基因的重组载体导入到恰当的宿主中，来制备转化体。包含本发明的基因的重组载体导入的宿主细胞可以是任何能够表达本发明基因的细胞，可列举细菌、酵母、真菌和高等真核细胞等。
细菌细胞的例子可列举芽孢杆菌或链霉菌等革兰氏阳性菌，或大肠杆菌等革兰氏阴性菌。这些细菌的转化可以通过原生质体法或使用已知方法的感受态细胞来进行。哺乳动物细胞的例子可列举HEK293细胞、Hela细胞、COS细胞、BHK细胞、CHL细胞或CHO细胞等。哺乳动物细胞的转化、表达导入到该细胞内的DNA序列的方法都是已知的，例如可列举使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法等。
酵母细胞的例子可列举属于酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的细胞，例如可列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)等。向酵母宿主中导入重组载体的方法可列举例如电穿孔法、原生质体法、乙酸锂法等。
其他真菌细胞的例子是丝状真菌，例如属于曲霉、链孢霉、镰刀霉或木霉的细胞。在使用丝状真菌作为宿主细胞的情况下，可以通过将DNA构建体整合到宿主染色体中获得重组宿主细胞来进行转化。可以根据已知的方法将DNA构建体整合到宿主染色体中，例如通过同源重组或异源重组来进行。
在使用昆虫细胞作为宿主的情况下，可以将重组基因导入载体和杆状病毒共导入昆虫细胞中，在昆虫细胞培养上清液中获得重组病毒后，再用重组病毒感染昆虫细胞，表达蛋白质(例如，Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manua1；和CurrentProtocols in Molecular Biology,Bio/Technology,6,47(1988)等中记载的)。
作为杆状病毒，可使用例如感染夜蛾科昆虫的病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒等。
作为昆虫细胞，可使用草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞Sf9、Sf21(Baculovirus Expression Vectors,A Library Manual,(W.H.Freeman andCompany,New York,(1992))、粉状夜蛾的卵巢细胞HiFive(Invitrogen公司生产)等。
用于制备重组病毒的向昆虫细胞中共导入重组基因导入载体和上述杆状病毒的方法可列举例如磷酸钙法或脂质体转染法等。
上述转化体在可以表达所导入的基因的条件下，在恰当的营养培养基中培养。从转化体的培养物中分离纯化本发明的蛋白质可以使用通常的蛋白质分离、纯化方法。例如，在细胞内以溶解的状态表达本发明的蛋白质的情况下，在培养结束后，将通过离心分离回收的细胞悬浮在含水缓冲液中，之后通过超声波破碎机等破碎细胞，获得无细胞提取液。从通过离心分离该无细胞提取液获得的上清液中，通过普通的蛋白质分离纯化法，即，单独或组合使用溶剂提取法、硫酸铵等的盐析法、脱盐法、通过有机溶剂的沉淀法、使用二乙基胺乙基(DEAE)Sepharose等树脂的阴离子交换层析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司生产)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基Sepharose、苯基Sepharose等树脂的疏水层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、层析聚焦法、等电点电泳等电泳法等方法，可以获得本发明的L-苏氨酸脱氢酶的纯化标准品。
L-苏氨酸的分析方法
本发明的L-苏氨酸的分析方法包括将含有被分析物的样品与本发明的L-苏氨酸脱氢酶以及辅酶NAD+混合，经过预定的时间后，分析NADH的量。
本发明的L-苏氨酸脱氢酶优选是来源于上述的钩虫贪铜菌NBRC102504的L-苏氨酸脱氢酶。
被分析物没有特殊的限制，可以是例如人血液或饮食等。
含有被分析物的样品可以为例如被分析物与表现出L-苏氨酸脱氢酶的最适pH的缓冲液的混合物。L-苏氨酸脱氢酶的最适pH是10.0。分析时，向含有被分析物的样品中添加定量的L-苏氨酸脱氢酶。L-苏氨酸脱氢酶的添加量可以考虑L-苏氨酸脱氢酶的纯度、效价等恰当地确定，例如可以是0.001-1U/200μL的范围。
向含有被分析物的样品中添加L-苏氨酸脱氢酶，与辅酶NAD+混合。辅酶NAD+可以是NAD的盐，例如钠、钾等碱金属盐。辅酶NAD+的混合量可以考虑样品中的L-苏氨酸浓度、L-苏氨酸脱氢酶的效价等来恰当地确定，例如可以是0.001-3mM的范围。此外，NAD+是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，有时也标记为β-NAD+，两者是同义的。此外，NADP+有时也标记为β-NADP+，两者是同义的。
L-苏氨酸脱氢酶与辅酶NAD+混合后，经过预定的时间后，分析NADH的量。预定的时间可以考虑反应温度、被分析物中包含的L-苏氨酸浓度、分析精度等来恰当地确定。一般而言，可以是例如5秒-60分钟的范围，优选1分钟-60分钟的范围。
经过预定的时间后，分析由L-苏氨酸脱氢酶生成的NADH的量。分析NADH的量可以通过例如在340nm下测定吸光度(A340)的方法直接实施，此外，也可以使用由NADH生成色素的方法或由NADH产生荧光的方法。由NADH生成色素的方法可列举例如使用NADH-四唑体系的电子载体的方法，电子载体可以使用例如PMS(吩嗪硫酸甲酯，+0.08V)或麦尔多拉蓝。由NADH生成色素的方法可列举例如使用心肌黄酶的方法。在使用心肌黄酶的方法中，心肌黄酶催化NADH的氧化和色素的还原，导致颜色产生。色素可以使用INT(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯四唑盐氯化物)、NBT(氮蓝四唑盐)等。此外，在使用心肌黄酶的方法中，可以使用rezasurine(7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物)一类的荧光色素作为色素。
本发明的L-苏氨酸的分析方法适合使用微量滴定平板的所谓微量滴定平板测定。微量滴定平板可以使用例如96孔微量滴定平板，孔数没有特殊的限制。在使用如96孔微量滴定平板的情况下，例如使反应总体积为200μL，添加100mM甘氨酸KCl-KOH缓冲液(pH10.0)、2.5mM NAD+、去蛋白质的样品。添加本发明的酶开始反应。可以例如在30℃下保温10-30分钟，用UV微量滴定平板分光光度计测定终点的340nm处的吸光值。由最终的吸光值减去对照值，获得吸光值的变化(ΔA)。去蛋白质的样品的制备可以通过例如由CentriconYM-10超滤实现。
除上述分析NADH的量以外，本发明的L-苏氨酸的分析方法还可以通过分析由L-苏氨酸脱氢酶从L-苏氨酸生成的2-氨基-3-氧代丁酸的量来实施。如上述图1所示，从L-苏氨酸生成的2-氨基-3-氧代丁酸(α-氨基-β-氧代丁酸)经非酶促的脱羧，生成氨基丙酮。该氨基丙酮通过单胺氧化酶氧化成甲基乙醛酸，此时，生成氨和过氧化氢。通过已知的定量方法，定量所生成的氨或过氧化氢，可以定量L-苏氨酸的量。
除上述分析NADH或2-氨基-3-氧代丁酸的量以外，本发明的L-苏氨酸的分析方法还可以如上述图1所示，通过分析由L-苏氨酸脱氢酶与2-氨基-3-氧代丁酸和NADH同时生成的H+的量来实施。H+的量可以使用已知的方法来分析。
用于分析L-苏氨酸的试剂盒
本发明包括包含下列(A)或(B)的用于分析L-苏氨酸的试剂盒：
(A)来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶，或具有下述(1)-(3)中的任一氨基酸序列，且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质：
(1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1～30个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列；
(B)辅酶NAD+。
(A)的来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶是上述本发明的酶，优选地，钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC 102504。具有上述(1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质与上述说明的相同。
(B)的辅酶NAD+可以是例如NAD+。本发明的试剂盒还可以包含用于分析NADH的量的色素和/或酶。用于分析NADH的量的色素可以是通过上述电子载体或上述心肌黄酶还原产生的色素。进一步的，本发明的试剂盒还可以包含适合本发明的酶的缓冲液，该缓冲液也可以是含有上述本发明的酶的物质。
本发明的试剂盒还可以附带上述微量滴定平板或用于分析样品的去蛋白化所使用的超滤装置、或本发明的试剂盒的说明书。
进一步地，本发明还包括用于分析L-苏氨酸的酶制品，是包含在缓冲液中的来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶、或具有下述(1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质：
(1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1～30个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶与上文所述相同。具有上述(1)-(3)中的任一氨基酸序列，且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质与上文所说明的相同。此外，含有L-苏氨酸脱氢酶的缓冲液可以是具有适合本发明的L-苏氨酸脱氢酶的组成和pH的缓冲液。
酶传感器
本发明的酶传感器是用于定量L-苏氨酸的酶传感器，其将来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶、或具有下述(1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质直接或间接地固定或布置在用于检测的电极上：
(1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1～30个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
具有上述(1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质与上文所说明的相同。
本发明的酶传感器是在构成酶传感器的检测用电极上直接或间接地固定或布置L-苏氨酸脱氢酶而成的，用于定量L-苏氨酸。本发明的酶传感器优选能够直接地定量检测通过L-苏氨酸脱氢酶从L-苏氨酸生成的产物。此外，除上述酶以外，本发明的酶传感器也可以在上述检测用电极上直接或间接地固定或布置有使酶和电极之间的电子授受变得容易的电化学媒介物等。此外的结构可以直接使用公知的酶传感器中采用的结构，或者经过恰当改变的结构。本发明的酶传感器至少将检测用电极部分浸入含有被分析物的试验溶液中，用检测用电极检测试验溶液中通过L-苏氨酸脱氢酶从L-苏氨酸生成的产物。更具体而言，可以将能够检测NADH(从L-苏氨酸生成的产物之一)的电极与L-苏氨酸脱氢酶组合使用。能够检测NADH的电极也将上述的电化学媒介物(电子传递物)与心肌黄酶和NADH氧化酶组合。此外，L-苏氨酸脱氢酶和心肌黄酶、NADH氧化酶可以以其游离状态使用，或者通过公知的方法直接或间接地固定在电极上。其他能够检测NADH的电极可列举例如特开平7-280769号公报和特开平7-310194号公报中记载的内容，但不限于此。
本发明的酶传感器除如上所述分析NADH的量以外，还可以定量通过L-苏氨酸脱氢酶从L-苏氨酸生成的2-氨基-3-氧代丁酸的量。本发明的酶传感器也可以使用过氧化氢电极作为检测用电极，所述过氧化氢电极能够定量从L-苏氨酸生成的2-氨基-3-氧代丁酸(α-氨基-β-氧代丁酸)非酶促脱羧生成的氨基丙酮通过单胺氧化酶氧化而生成的过氧化氢。该酶传感器可以通过将L-苏氨酸脱氢酶和单胺氧化酶与过氧化氢电极组合而构成。
实施例
下文通过实施例进一步说明本发明，但本发明并非意在限于实施例。
实施例1
筛选L-苏氨酸同化细菌
L-苏氨酸同化细菌是从富山县立大学保藏的菌中筛选获得的。这些细菌以L-苏氨酸为唯一的碳源、氮源，在以下组成的培养基(5ml)中30℃、300rpm的好氧条件下预培养3天。每1升培养基含有以下成分：10g L-苏氨酸、2g K2HPO4、1g NaCl、0.1g MgSO4·7H2O、4μg硫胺素-HCl、2μg核黄素、4μg泛酸钙、4μg盐酸吡啶醇、20pg生物素、2μg对氨基苯甲酸、4μg烟酸、0.1μg叶酸、20μg肌醇、500μg Titriplex IV、200μg FeSO4·7H2O、10μg ZnSO4·7H2O、3μg MnCl2.4H2O、30μg H3BO4、20μg CoCl2·6H2O、1μg CuCl2.2H2O、2μg NiCl2.6H2O、3μgNa2MoO4。
使用上述培养基，在相同的条件下培养分离的克隆。在28,400×g离心分离细菌细胞10分钟，用0.85％NaCl水溶液洗涤2次，悬浮在1ml的100mM磷酸钙缓冲液(pH 7.4)中。用珠子破碎仪(Bead Shocker)(2,700rpm，开启60秒、关闭60秒，3个循环，YGB01玻璃珠0.1mm，4℃)破碎细胞后，在4℃、28,400×g离心10分钟。如此制备粗酶提取液，测定酶活性。
筛选和测定活性
使用Greiner公司生产的96孔培养板，在30℃下进行标准的脱氢酶活性测定。反应混合溶液的总体积为200μl，包括粗酶提取液20μl、NAD+(终浓度2.5mM)、L-苏氨酸(终浓度10mM)、甘氨酸-KCl-KOH缓冲液(pH 10.4，终浓度100mM)。用微量滴定平板读板器在340nm测量还原NAD+所生成的NADH。NADH的摩尔消光系数使用6.22mM-1cm-1。1单位(U)的酶活性定义为在上述标准条件下1分钟内生成1μmol的NADH的酶量。
定量蛋白质浓度
使用BioRad蛋白质测量试剂盒，以牛血清白蛋白为基准，通过281nm处的吸光值确定蛋白质浓度。
结果
在416株TPU(富山县立大学)保藏的细菌中，检测到6株具有TDH活性(表2)。在钩虫贪铜菌(NBRC 102504和IAM13549)中检测到强的TDH活性(分别是1.97和1.01U/mg)。在奈氏西地西菌(Cedecea neteri)(JCM 5909)、Arthrobacter bergerei(NBRC 12127)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)(NBRC 13534)和肿大地杆菌(Terrabacter tumescens)(NBRC12960)的无细胞提取液中，可以分别检测出0.12、0.08、0.08和0.13U/mg的TDH活性。通过对L-氨基酸(L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、牛磺酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸)标准微量滴定平板测定来试验对L-苏氨酸的特异性。对L-苏氨酸的特异性中的“有”表示对L-苏氨酸有活性。
表2：TPU保藏的细菌和从土壤中分离的细菌的无细胞提取液中的L-苏氨酸脱氢酶活性
*TPU编号：富山县立大学保藏菌种编号
因为钩虫贪铜菌(NBRC 102504)的粗提取液表现出最高的比活性，故下面对其进行了详细的研究。这些菌株都表现出对L-苏氨酸的高底物特异性。
钩虫贪铜菌(NBRC 102504)来源的生长条件和L-苏氨酸脱氢酶的纯化
作为钩虫贪铜菌(NBRC 102504)的预培养，用5ml的TGY-T培养基(0.5％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.1％葡萄糖、0.1％K2HPO4、0.5-1％L-苏氨酸，pH 7.0)在37℃下振荡培养过夜。用500ml与预培养的培养基(5ml)相同的培养基在37℃下培养12小时。收集细菌后，将菌体悬浮在100mM的磷酸钙缓冲液(pH 7.0)中。
纯化TDH
将细菌细胞用超声波处理装置在4℃下破碎20分钟后，在28,000×g离心15分钟，去除细胞残渣。将无细胞提取液分级，在30-60％饱和硫酸铵的部分获得酶活性。用磷酸钙缓冲液(10mM，pH7.0)透析该级分。酶溶液使用DEAE-Toyopearl 650M柱的离子交换树脂、丁基-Toyopearl柱层析的疏水层析、Superdex-200柱层析等常规方法纯化到均质。
活性测定
通过在30℃，340nm下测量辅酶NAD+的还原，确定L-苏氨酸的氧化活性。反应组成是总体积1ml，包含L-苏氨酸(终浓度10mM)、NAD+(终浓度2.5mM)、甘氨酸-KCl-KOH缓冲液(100mM、pH 10.0)。通过添加酶开始活性测定。在上述标准条件下，1单位(U)的酶活性定义为1分钟内生成1μmol的NADH的酶量。
结果
表3中总结了来源于钩虫贪铜菌的TDH纯化步骤。将酶纯化至6.4％的回收率和75.4倍纯化的均质状态。在标准条件下，纯化的TDH以NAD+为辅酶，催化L-苏氨酸的脱氢反应(比活42.2U/mg)。
表3：来源于钩虫贪铜菌NBRC 102504的TDH纯化步骤
测定TDH和亚基的分子量
使用各种标准蛋白质，按照SDS-PAGE或凝胶过滤层析的常规方法，进行分子量的测定。
结果
直至纯化的最终步骤所纯化的酶在SDS-PAGE上表现出单个条带，计算的分子量为37,200(图1)。用HPLC(图2)确定天然分子量为79,400。因此，认为具有活性的天然酶是2聚体。如表4所示，该酶表现出来源于斯氏梭菌或鸡肝的TDH的天然分子量和亚基分子量，但是具有与其他来源的酶不同的分子量。
表4：来源于钩虫贪铜菌NBRC 102504的L-苏氨酸脱氢酶的分子量和亚基分子量的比较
TDH 天然Mw 亚基Mw 结构 参考文献
CnTDH 79,400 37,200 同二聚体 本发明
CsTDH 67,000 33,000 同二聚体 6
GdTDH 62-74,000 36,000 同二聚体 2
PfTDH 155,000 37,823 同四聚体 7
EcTDH 140,000 35,000 同四聚体 11
CyTDH 139,000 35,000 同四聚体 5
缩写：ND，未确定；CsTDH，来自斯氏梭菌的TDH；GdTDH，来自鸡肝(家鸡)的TDH；PfTDH，来自激烈火球菌的TDH；EcTDH，来自大肠杆菌K-12的TDH；CyTDH，来自噬纤维菌KUC-1的TDH。
pH和温度对酶活性和稳定性的影响
在各种pH的缓冲液中进行酶反应。
结果
在各种缓冲液中研究pH对酶活性的影响。用100mM甘氨酸-KOH缓冲液(pH 10.0)获得了最适pH(图3)。
使用各种pH的缓冲液，研究TDH的稳定性。将TDH在各种pH下保温60分钟，在标准条件下测量酶的残留活性。在pH 6-11下，酶非常稳定(图4)。该酶在乙酸钠缓冲液中(pH 4-5)和Na2CO3-NaHCO3缓冲液中(pH10-11)略不稳定。
将温度从25℃升高至75℃，TDH活性随之增加。TDH的最适温度是75℃。在80℃丧失TDH活性(图5)。
在各温度下将TDH保温60分钟，然后确定酶的残留活性。该酶在40℃为止是稳定的(图6)。在45℃下保温60分钟时，残留60％的酶活性。在50℃下保温60分钟时，完全丧失酶活性。
底物特异性
以各种L-氨基酸、氨基醇、醇为底物，研究TDH。底物浓度为10mM，在标准条件下进行活性测定。
结果
表5显示了TDH的底物特异性。仅表现出对L-苏氨酸的活性(100％相对活性)。没有发现该酶对D-苏氨酸有活性。该酶不以其他L-氨基酸、甘油、氨基醇、醇等为底物。该酶以NAD+为辅酶，可确认对NADP+无活性。表5：来源于钩虫贪铜菌NBRC 102504的TDH和其他物种来源的TDH的底物特异性的比较
缩写：ND，未确定；CyTDH，来自噬纤维菌KUC-1的TDH；CsTDH，来自斯氏梭菌的TDH；EcTDH，来自大肠杆菌K-12的TDH；StTDH，来自链霉菌139的TDH；PfTDH，来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的TDH；AgTDH，来自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的TDH；GdTDH，来自鸡肝(家鸡)的TDH。
TDH的动力学常数
通过Lineweaver Burk作图确定对L-苏氨酸和NAD+的速度常数。NAD+浓度为2.5mM时，对于苏氨酸的最大速度(Vmax和米氏常数(Km))为11.6mM和66.3μmol/mg/分(图7)。计算L-苏氨酸浓度为10mM时对于NAD+的速度常数。对于NAD+的Km和Vmax的值分别是0.1mM和104.2μmol/mg/分(图8)。
各种化合物对酶活性的影响
在各种金属离子(终浓度1mM)或抑制剂(终浓度10mM)和30℃下，将纯化的TDH保温1小时。测量残留的活性，与不处理时的相对活性比较。在最适pH和温度下进行。
结果
金属离子的影响(表6)。酶受到FeCl3、FeCl2和SnCl2的部分抑制。保温1小时后的残留活性是27％、68％和84％。
表6：金属离子对TDH活性的影响
如表7所示，TDH活性不被EDTA、EGTA等金属螯合剂抑制。可认为不需要金属离子作为辅助因子。即使用含有10mM EDTA的缓冲液透析也保留了酶活性。还原剂β-巯基乙醇、DTT也不抑制酶活性。K[Fe(CN)6]、K3[Fe(CN)6]、泛酸钙略微抑制酶活性。碘乙酸、PMSF/异丙醇、PCMB、HgCl2、NaN3处理后的残留活性分别是48％、37％、6.2％、23％、12％。酶活性被碘乙酰胺、PMS、NEM抑制。
表7：抑制剂对TDH活性的影响
克隆来源于真养贪铜菌(Cupriavidus eutropha)NBRC 102504的L-苏氨酸脱氢酶 基因
基于纯化的TDH的N-端氨基酸序列(15个残基)的信息，成功地克隆和表达了基因。
克隆来源于钩虫贪铜菌的TDH基因
使用5ml的TGY培养基，在30℃、300转的条件下培养钩虫贪铜菌24小时。从该细胞中制备钩虫贪铜菌的基因组DNA。根据纯化的TDH酶的N-端氨基酸序列的分析结果，从数据库中搜索类似的序列，根据搜索结果，设计以下一组引物。
TDH-N1：5’-ATGGARGCNGGNAARCCNAAR-3’(序列号3)
TDH-C1：5’-RAADATRTCNACNGCRTARTC-3’(序列号4)
TDH-N1引物包括下划线的起始密码子ATG。用于PCR的溶液在50μl中包括200pmol的TDH-N1、100pmol的TDH-C1、23.5ng的基因组DNA、0.25μl的Takara Ex Taq(5单位/μl)、5μl的10x Ex Taq缓冲液、4μl的dNTP混合溶液(分别是2.5mM)。PCR是在98℃变性10秒(仅第一次是60秒)，55℃退火30秒，72℃延伸反应180秒，进行30个循环。从琼脂糖凝胶中提取所扩增的约550bp的PCR产物，使用Viogene(Sunnyvale、CA)公司生产的Gel-MTM凝胶提取试剂盒提取，使用T4连接酶(New England Biolabs Japan，Tokyo)连接到pT7-Blue T载体中。使用ABI PRISM 310基因解析装置(Applied Biosystems Japan，Tokyo)解析基因序列。为了解析该550bp区域的上下游基因序列，进行反向PCR。根据解读的基因组序列设计以下一组引物。
TDH-N1：5’-GTTGAGCATCTCGTGCGTCA-3’(序列号5)
TDH-C1：5’-ACGGTCTACGGCATCTCCAA-3’(序列号6)
用EcoRI消化钩虫贪铜菌的基因组DNA(15μg)，用苯酚·氯仿提取后，用乙醇沉淀。将其溶解在30μl的TE缓冲液中，在16℃下进行自身连接反应12小时。环化的DNA(2μl)以TDH-N1和TDH-C1为引物，使用GC缓冲液在以下条件下进行PCR。即，在94℃变性30秒(仅第一次是60秒)，60℃退火60秒，72℃延伸反应120秒，进行30个循环。用EcoRI消化所获得的5,000bp扩增片段，克隆后解析基因序列。该基因包括了包含N-末端和终止密码子的基因序列。使用引物步移技术，用以下一组引物扩增完整的基因。
CnTDH-F：5’-GAATTCATATGGAAGCTGGCAAACCGAAG-3’(序列号7)
CnTDH-R：5’-AGTATGGATCCTCAGCCCGCCAGCGTGGCCT-3’(序列号8)
CnTDH-F在Ndel的识别位点(双下划线)中具有起始密码子。CnTDH-R在BamHI的识别位点(双下划线)中具有终止密码子。如上所述，使用Takara Ex Taq进行PCR。将TDH基因(957bp)亚克隆到pET15b中，获得CnTDHpET15b质粒，用于转化大肠杆菌JM109。使用LB培养基在37℃培养该大肠杆菌转化株12小时。从菌体中提取质粒CnTDHpET15b，为了进一步表达酶，转化大肠杆菌BL21(DE3)。
结果
研究了TDH的DNA序列(序列号2)。TDH基因编码318个氨基酸(图9)。计算的分子量为34,627.85。通过SDS-PAGE分析，计算出亚基的分子量为37,200。
表达和纯化TDH酶蛋白
培养包含pET15bBL21的大肠杆菌转化株，纯化所表达的TDH。用5ml含有0.2mM氨苄青霉素的LB培养基在37℃需氧地预培养12小时。接种到500ml相同的培养基中，在37℃需氧地培养12小时。向其中加入IPTG至0.5mM，再培养4小时。用5,000×g、4℃离心大肠杆菌10分钟，用生理盐水洗涤2次。按常规方法超声波处理大肠杆菌，将获得的无细胞提取液通过Ni-SepharoseTM-6速流柱(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK.)，用含有75mM咪唑的相同缓冲液洗涤后，用含有500mM咪唑的相同缓冲液洗脱。用20mM磷酸钙缓冲液(pH 8.0)透析活性级分。
结果
通过包含CnTDHpET15b质粒的大肠杆菌BL21(DE3)表达的基因重组TDH-His在N末端具有His标签，如上所述用最适培养条件生产基因重组TDH。用500ml培养表达6,000U的TDH，在无细胞提取液中表现出比活为15.3U/mg。通过Ni-螯合柱层析，用一步纯化，在SDS-PAGE中也产生单一的酶条带(图10)。纯化的基因重组酶的比活性是64.5U/mg(表8)。该比活性比从野生株中纯化的酶(42.2U/mg)高约1.5倍。纯化收率是98％。
表8：基因重组CnTDH-His的纯化步骤
使用TDH定量L-苏氨酸
制备样品
人(血清和血浆)样品使用市售商品。通过在4℃超滤去除蛋白质等，在-20℃下保存至使用为止。
标准L-苏氨酸
L-苏氨酸溶液(0-3000μM)在-20℃下冷冻保存。
使用微量滴定平板读板器的L-苏氨酸定量
使用96孔UV微量滴定平板分光光度计进行定量。反应总体积为200μL，由100mM甘氨酸KCl-KOH缓冲液(pH 10.0)、2.5mM NAD+、去蛋白化样品组成。通过加入酶开始反应。在30℃下保温10-30分钟，用微量滴定平板分光光度计测定终点的340nm处的吸光值。从最终吸光值中减去对照值作为吸光值变化(ΔA)，进行重复3次的实验。
结果
使用TDH的L-苏氨酸的酶定量标准曲线在10-3,000μM之间表现为浓度的直线(图11)。
对于来自6个人的样品，比较了使用96孔UV微量滴定平板分光光度计的酶法定量与高效液相色谱(UPLC)定量(图12)，酶法测定和UPLC测量表现出几乎相同的值，表明该酶法测定是可靠的。
通过测定人血浆中的各种浓度的L-苏氨酸，考察酶法定量法的可靠性。如图13所示，获得了(R2＝0.9942)的良好的相关性。在该测定条件下，L-苏氨酸的回收率为99.5％。
在12次测定中人样品的L-苏氨酸浓度的精确度如表9所示，测定内的CV是2.2-6.2％，测定间的CV是1.4-2.9％。
表9：使用TDH定量L-苏氨酸的精确度
关于L-苏氨酸的酶法定量，比较了已报告的来源于大肠杆菌的苏氨酸脱氨酶(TD)、来源于酵母的乙醛脱氢酶(ALDH)测定、和使用TDH的方法(表10)。
表10：L-苏氨酸定量方法的比较
可见与使用HPLC的定量相比，本发明的使用TDH的新型微量滴定平板测定是非常可靠的定量方法。此外，TDH微量滴定平板方法比已知方法精度更高、定量范围更广。本发明的方法适合测量人血液等生物体或食品中的L-苏氨酸浓度。
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在此特别明示援引上述参考文献1-12的全文内容。
产业实用性
本发明在需要测量人血液等生物体或食品中的L-苏氨酸浓度的领域中是有效的。

Claims (6)

1.对含有L-苏氨酸和L-丝氨酸的被分析物中含有的L-苏氨酸的浓度进行定量的方法，该方法包括：使用由序列表的序列号1记载的氨基酸序列构成的蛋白质，该方法不用于疾病的诊断。
2.根据权利要求1所述的方法，其还使用辅酶NAD+对生成的NADH量、2-氨基-3-氧代丁酸量或H+量进行分析。
3.包含下述(A)和(B)的试剂盒在对含有L-苏氨酸和L-丝氨酸的被分析物中含有的L-苏氨酸浓度的定量中的用途，
(A)由序列表的序列号1记载的氨基酸序列构成的蛋白质、和
(B)辅酶NAD+。
4.权利要求3记载的用途，所述试剂盒还包括用于分析NADH的量的色素和/或酶。
5.酶制剂在对含有L-苏氨酸和L-丝氨酸的被分析物中含有的L-苏氨酸浓度的定量中的用途，所述酶制剂是通过使缓冲液中包含由序列表的序列号1记载的氨基酸序列构成的蛋白质而成的。
6.酶传感器在对含有L-苏氨酸和L-丝氨酸的被分析物中含有的L-苏氨酸浓度的定量中的用途，所述酶传感器在检测用电极上直接或间接地固定或布置了由序列表的序列号1记载的氨基酸构成序列的蛋白质。
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