KR20130004321A

KR20130004321A - Ｌ-트레오닌의 분석 방법 및 ｌ-트레오닌 탈수소효소

Info

Publication number: KR20130004321A
Application number: KR1020127025723A
Authority: KR
Inventors: 야스히사 아사노; 테카와레 우에트롱치트
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤; 토야마켄
Priority date: 2010-03-04
Filing date: 2011-03-04
Publication date: 2013-01-09
Also published as: CN102834516B; CN102834516A; JP4979822B2; JP2011200227A; US8785147B2; CN104830958A; WO2011108727A1; KR101843591B1; US20130052679A1; CN104830958B

Abstract

본 발명은, 피검체를 함유하는 샘플과 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소 및 보효소 NAD⁺를 혼합하고, 소정 시간 후에 NADH량 또는 2-아미노-3-옥소부티르산량을 분석하는, 피검체에 포함되는 L-트레오닌의 분석 방법, 이 분석 방법에 이용할 수 있는 신규한 L-트레오닌 탈수소효소(TDH; EC 1.1.1.103)인 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소, 이 효소의 조제에 이용하는 유전자 등 및 효소의 조제 방법, 나아가서 (A) 상기 L-트레오닌 탈수소효소 및 (B) 보효소 NAD⁺를 포함하는 L-트레오닌 분석용 키트, 상기 L-트레오닌 탈수소효소를 완충액 중에 함유시킨 것인 L-트레오닌 분석용 효소 제제, 상기 L-트레오닌 탈수소효소를 이용하는 효소 센서를 제공한다.

Description

Ｌ-트레오닌의 분석 방법 및 Ｌ-트레오닌 탈수소효소{L-THREONINE ANALYSIS METHOD AND L-THREONINE DEHYDROGENASE}

본 출원은, 2010년 3월 4일 출원된 일본 특허출원 제2010-48193호의 우선권을 주장하고, 그 전체 기재는 여기에 특별히 개시로서 원용한다.

본 발명은, L-트레오닌의 분석 방법 및 이 분석 방법에 이용할 수 있는 L-트레오닌 탈수소효소에 관한 것이다.

L-트레오닌은 필수 아미노산이며, 식품으로부터 채취되어야 한다. L-트레오닌은, 체내의 질소 밸런스를 유지하기 위해서 필요하여, 정상적인 생육을 촉진한다. 또한, 심장 혈관, 간 중추 신경, 장, 면역 시스템 기능의 유지에 도움이 된다.

비타민 B12 부족, II형 시트룰린혈증, 패혈증, 아미노산 혹은 질소의 임밸런스에 의해서 혈액 중의 트레오닌 함량의 부족이 발생한다. 또한, 채식주의자가 트레오닌 함유가 적은 곡류를 먹음으로써, 트레오닌 부족이 되는 일이 있다. L-트레오닌의 정량은, 각종 질병이나 선천성 대사 이상의 진단, 환자에 대한 장기간의 영양 보급, 아미노산 대사 이상의 질병에 관한 연구의 연구 등에 필요하다.

L-트레오닌 정량 방법은 여러 가지 보고되어 있다. 단백질 가수 분해물, 젤라틴, 혈청 중의 트레오닌은, 사아세트산납에 의한 트레오닌의 아세트알데히드로의 변환, 농축 황산으로의 흡수, 그리고 p-히드록시비페닐과 아세트알데히드의 축합에 의한 색소의 측정, HPLC, 질량 분석, 아미노산 분석 장치 등에 의한 것으로 정량할 수 있다. 이들 방법은, 조작이 위험한, 많은 스텝이 필요한, 고액 기기를 사용하는, 다수의 샘플을 취급하는 매스 스크리닝에 적합하지 않은 등의 문제점을 갖는다.

효소적 수법으로서 트레오닌 데아미나아제(EC 4.2.1.16)를 이용하는 방법이 있다. 본 효소는, L-트레오닌을 α-케토부티르산과 암모니아로 분해하기 때문에, 생성된 α-케토부티르산을 히드라존 유도체로 변환하는 방법이 보고되어 있다[비특허문헌 1].

래트 혈장 중의 트레오닌을 과요오드산으로 산화하고, 생성된 알데히드를 알데히드탈수소효소(EC 1.2.1.5)로 정량하는 예가 있다. 여분의 과요오드산은, D-갈락토스를 더함으로써 소비시킨다[비특허문헌 2]. 아세트알데히드는, 알데히드 탈수소효소의 작용에 의해, NAD⁺의 환원에 의해 NADH를 생성시키고, 또한 형광 색소를 이용하는 방법에 의해 정량을 행한다.

[비특허문헌]

상기 비특허문헌 1 및 2의 전체 기재는, 여기에 특별히 개시로서 원용한다.

그러나, 비특허문헌 1에 기재된 방법으로는, 트레오닌 데아미나아제는, L-트레오닌뿐만 아니라, L-세린, D-세린에 대해서도 활성이 있기 때문에, 이 방법은 L-세린 등을 포함하는 샘플의 정량에 적합하지 않다.

또한, 비특허문헌 2에 기재된 방법도, 여분의 과요오드산은, D-갈락토스를 더함으로써 소비시킬 필요가 있어, 단일의 효소에 의한 정량법이 아니다.

따라서 본 발명은, 단일의 효소에 의한 정량이 가능한 L-트레오닌의 분석 방법을 제공하는 것, 이 분석 방법에 이용할 수 있는 신규인 L-트레오닌 탈수소효소(TDH; EC 1.1.1.103)와 이 효소의 조제에 이용하는 유전자 등 및 효소의 조제 방법을 제공하는 것, 나아가서는 상기 L-트레오닌의 분석에 이용되는 키트, 효소 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

TDH를 이용하는 L-트레오닌 정량은 아직 보고되어 있지 않다. 본 발명자들은, L-트레오닌의 분석 방법에 알맞은 신규한 TDH를 탐색하고, 그 결과, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)로부터 신규한 TDH를 발견하고, 이 TDH를 이용함으로써 L-트레오닌의 효소적 정량법이 가능한 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

본 발명은 이하와 같다.

[1] 피검체를 함유하는 샘플과 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소 또는 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질 및 보효소 NAD⁺를 혼합하며, 소정 시간 후에 NADH량 또는 2-아미노-3-옥소부티르산량을 분석하는, 피검체에 포함되는 L-트레오닌의 분석 방법:

(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;

(2) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 30개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열;

(3) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.

[2] 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)가 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504인 [1]에 기재된 분석 방법.

[3] NADH량의 분석을 340 ㎚에서의 흡광도(A₃₄₀) 측정, 색소 생성, 또는 형광으로의 변환에 의해 행하는 [1] 또는 [2]에 기재된 분석 방법.

[4] 2-아미노-3-옥소부티르산량의 분석은, 2-아미노-3-옥소부티르산으로부터 생성되는 아미노아세톤을 모노아민옥시다아제에 의해 산화하여, 생성되는 암모니아 또는 과산화수소를 측정함으로써 행해지는 [1] 또는 [2]에 기재된 분석 방법.

[5] 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소.

[6] 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)가 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504인 [5]에 기재된 L-트레오닌 탈수소효소.

[7] 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질:

(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;

[8] 이하의 물성 및 성질을 갖는 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소:

분자량(SDS-PAGE): 79,400

서브유닛 분자량(SDS-PAGE): 37,200

최적 pH: 10.0

최적 온도: 75℃

기질 특이성: L-트레오닌에만 활성을 나타냄

보효소: NAD⁺(NADP⁺에는 불활성)

저해제: 요오도아세트아미드, PMS, NEM으로 저해됨

[9] [7]에 기재된 단백질을 코드하는 유전자.

[10] [7]에 기재된 유전자를 탑재한 벡터인 재조합 벡터.

[11] 숙주 세포를 [9]에 기재된 유전자 또는 [10]에 기재된 재조합 벡터로 형질전환시킨 형질전환체.

[12] [9]에 기재된 유전자를 벡터 상에 탑재하고, 이 벡터에 의해서 숙주 세포를 형질전환한 후, 형질전환시킨 숙주 세포를 배양하여 배양물 중에 상기 유전자가 코드하는 단백질을 축적하고, 축적된 단백질을 수집하는 것을 포함하는, L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질의 생산 방법.

[13] 이하의 (A) 및 (B)를 포함하는 L-트레오닌 분석용 키트.

(A) 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소 또는 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질 및

(B) 보효소 NAD⁺

(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;

[14] 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)가 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504인 [13]에 기재된 키트.

[15] NADH량 분석용의 색소 및/또는 효소를 더 포함하는 [13]에 기재된 키트.

[16] 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소 또는 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 완충액 중에 함유시킨 것인, L-트레오닌 분석용 효소 제제:

(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;

[17] 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)가 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504인 [16]에 기재된 효소 제제.

[18] 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소 또는 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 검출용 전극에 직접 또는 간접적으로 고정화 또는 배치한 것을 특징으로 하는 L-트레오닌 정량에 이용하기 위한 효소 센서:

(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;

(3) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열

본 발명에 따르면, 샘플 중의 L-트레오닌을 TDH에 의해서 탈수소하고, 보효소 NAD⁺를 환원하여 NADH를 정량적으로 생성시키며, NADH를 직접 또는 간접적으로 정량함으로써, 샘플 중의 L-트레오닌 농도를 정량할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 단일 스텝에 의해서 분석이 가능하다. 혹은 상기 효소 반응으로 L-트레오닌으로부터 생성되는 2-아미노-3-옥소부티르산을 정량함으로써도 L-트레오닌 농도를 정량할 수 있다.

도 1은 C. 네카토르 NBRC 102504 유래 TDH의 SDS-PAGE를 나타낸다. 레인: M, 분자량 표준 s; 1, 무세포 추출액; 2, 프로타민 황산; 3, 30-60% 유안 분획; 4, DEAE-토요펄; 5, 부틸-토요펄; 6, Gigapite; 7, Superdex-G200.
도 2는 TDH의 분자량 결정 결과를 나타낸다. 표준 단백질(●), TDH (0).
도 3은 상이한 pH에서의 TDH 활성을 나타낸다. (△), 나트륨아세트산 완충액 (pH 5.0-6.0); (▲), 인산칼륨 완충액 (pH 6.0-7.5); (□), HEPES 완충액 (pH 7.0-8.0); (■), Tris-HCl 완충액 (pH 7.5-9.0); (○), Na₂CO₃-NaHCO₃ 완충액 (pH 9.0-11.5); (●), 글리신-KCl-KOH 완충액 (pH 10.0-12.0).
도 4는 각종 완충액 중에서의 TDH의 pH 안정성을 나타낸다.(△), 나트륨아세트산 완충액 (pH 4.0-6.0); (▲), 인산칼륨 완충액 (pH 6.0-7.5); (□), Tris-HCl 완충액 (pH 7.0-9.0); (○), Na₂CO₃-NaHCO₃ 완충액 (pH 9.0-11.0); (●), 글리신-KCl-KOH 완충액 (pH 10.0-12.0).
도 5는 TDH 활성에 대한 pH의 영향을 나타낸다.
도 6은 온도의 효소 안정성에의 영향을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 TDH의 L-트레오닌에 대한 Lineweaver Burk plot을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 TDH의 NAD⁺에 대한 Lineweaver Burk plot을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 TDH의 유전자 서열과 아미노산 서열을 나타낸다.
도 10은 CnTDHpET15b 플라스미드를 포함하는 대장균 E. coli에서 정제한 TDH-His의 SDS-PAGE를 나타낸다. 레인 M, 저분자량 마커; 레인 1, 대장균 E. coli BL21(DE3)의 무세포 추출액; 레인 2, 대장균 E. coli BL21(DE3)로부터의 CnTDH-His의 무세포 추출액; 레인 3, 정제된 유전자 재조합 TDH-His 효소
도 11은 TDH를 이용하는 L-트레오닌의 효소적 정량의 검량선을 나타낸다.
도 12는 인간 혈액 중의 L-트레오닌 농도의 측정 결과를 나타낸다. TDH를 이용하는 효소적 마이크로 플레이트 분석(□), UPLC에 의한 정량(■). 샘플: A, 인간혈청-A; B, 인간 혈청-B; C, 인간 혈청; D, 인간 혈장-D; E, 인간 혈장-E; F, 인간 푸울 혈장.
도 13은 인간 혈장에 기지량의 L-트레오닌을 첨가했을 때의 L-트레오닌 효소적 정량 결과를 나타낸다.

<L-트레오닌 탈수소효소>

L-트레오닌 탈수소효소(TDH; EC 1.1.1.103)는, 미생물이나 동물에 있어서 L-트레오닌의 이화에 중요한 열쇠 효소이다[참고 문헌 1,2]. TDH는, L-트레오닌의 2-아미노-3-옥소부티르산으로의 산화 반응을 촉매한다. 2-아미노-3-옥소부티르산은 비효소적으로 탈탄산 반응을 받고, 아미노아세톤과 이산화탄소로 분해된다. 아미노아세톤은, 또한 CoA-의존성의 2-아미노-3-옥소부티르산 CoA 리아제(EC 2.3.1.29)의 작용에 의해 글리신과 아세틸-CoA로 분해된다[참고 문헌 3].

[반응식 1]

미생물 유래의 TDH가 하기의 미생물에서 발견되어 있다(표 1). 이들은 아스로박터속(Arthrobacter sp .), 대장균(Escherichia coli) K12, 사이토파가속(Cytophaga sp). KUC-1, 클로스트리디움 스틱란디(Clostridium sticklandii), 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii), 써모코커스 코다카라엔시스(Thermococcus kodakaraensis), 그리고 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp .) 139이다[참고 문헌 4-10]. 마지막 4개의 TDH 유전자는 클론화되고, 유전자 서열이 명확하게 되어, 효소가 E.coli(대장균)에서 발현되어 있다.

대장균(E.coli), P. 호리코시 및 T. 코다카라엔시스의 TDH는, NAD⁺ 및 아연을 보효소로서 요구하고, 이들은 아연을 포함하는 중쇄 알코올 탈수소효소의 수퍼패밀리에 속한다[참고 문헌 8, 11, 12]. 사이토파가 유래의 TDH는, NAD⁺을 요구하고, 그 구조는 UDP-글루코오스-4-에피머라아제에 유사인 단쇄 탈수소효소 환원 효소의 수퍼패밀리에 속한다. 대장균(E. coli) 유래의 TDH를 이종 호스트에 도입하면, L-트레오닌의 생산에 유효한 것이 알려져 있다.

본 발명자들은, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)로부터, 새로운 NAD⁺ 의존성의 L-TDH를(이하, CnTDH라 약기하는 일이 있음) 발견하였다. 본 효소를 균일 상태로 정제하고, 효소 화학적 모든 성질을 밝혀내었다. 본 효소는, NAD⁺를 보효소로 하고, L-트레오닌에 특이적인 탈수소 반응을 촉매하였다. 본 효소는, 금속 이온을 보인자로서 요구하지 않는다. 본 효소의 유전자를 클론화하여, 서열을 분석한 바, 사이토파가 속(현재 플라보박테리움 프리지디마리스(Flavobacterium frigidimaris)) KUC-1의 TDH 유전자와 57%의 상동성밖에 나타내지 않았다. 호열성 세균이나 대장균 유래의 TDH로서 보고되어 있는 유전자와는 거의 상동성이 없었다. 본 효소는, 대장균(E. coli)에 있어서 양호하게 발현되었다. N-말단에 His-tag를 붙인 본 효소를 대량 발현하여, 효율적으로 정제할 수 있었다.

표 중, X는 불가 또는 실적 없음, ○는 실적 있음을 각각 의미한다.

본 발명의 L-트레오닌 탈수소효소는, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소이며, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)는, 바람직하게는, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504이다. 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504는 시판의 균주이다. 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)는, 알칼리제네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)로 분류되어 있었지만, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)로 분류 변경이 되었다. 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504는, 알칼리제네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus) IAM 13533으로서 시판되고 있던 균주이지만, 현재는 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504로서 시판되고 있다. 또한, 라스토니아 유트로파(Rastonia eutropha) 및, 워터시아 유트로파(Wautersia eutropha)도, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)와 동일 균주명이다.

또한 본 발명의 L-트레오닌 탈수소효소는, 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질이다.

(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;

서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열은, 실시예에 있어서 나타낸 바와 같이, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504로부터 얻어진 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열이다. L-트레오닌 탈수소효소 활성은, 실시예 1의「활성의 스크리닝 및 어세이」의 항에 기재된 방법에 의해 실시할 수 있다. 이하 동일하다.

본 발명은, 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 30개의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖고, L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질이다. 아미노산 치환, 아미노산 결실, 및/또는 아미노산 삽입의 수는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30개의 어느 것이라도, 단백질이 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 한, 넣을 수 있다.

본 발명은, 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질이다. 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열이란, 바람직하게 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 또한 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것이, L-트레오닌 탈수소효소 활성이 높다는 관점에서 적당하다.

또한 본 발명의 L-트레오닌 탈수소효소는, 이하의 물성 및 성질을 갖는 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소이다. 효소의 물리 화학적 성질은, 실시예에 있어서 상세하게 설명한다.

분자량(SDS-PAGE): 79,400

서브유닛 분자량(SDS-PAGE): 37,200

최적 pH: 10.0

최적 온도: 75℃

기질 특이성: L-트레오닌에만 활성을 나타냄

보효소: NAD⁺(NADP⁺에는 불활성)

저해제: 요오도아세트아미드, PMS, NEM으로 저해됨

본 발명은, 상기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 유전자의 대표예를 서열 번호 2에 나타낸다.

서열 번호 2로서 기재한 유전자 서열과 완전히 동일한 서열이, 라스토니아 유트로파(Rastonia eutropha) H16의 전체 게놈 서열의 해독에 의해, NAD 의존성 에피머라제_데히드라타제(NAD dependent epimerase_ dehydratase)로서, 유전자 등록되어 있다. NAD 의존성 에피머라제_데히드라타제의 아미노산 서열은, 서열 번호 1로서 기재한 아미노산 서열과 100% 동일하다. 그러나, NAD 의존성 에피머라제_데히드라타제의 이름은, 실험없이 자동적으로 붙여진 것이고, 생화학 실험은 행해지고 있지 않다. 본 발명에 있어서의 실험 결과로부터, 상기 NAD 의존성 에피머라제_데히드라타제의 아미노산 서열 및 유전자 서열이라는 인식은 잘못된 것이 처음으로 명확해졌다.

본 발명의 L-트레오닌 탈수소효소의 취득 방법은 특별히 제한되지 않고, 화학 합성에 의해 합성한 단백질이라도 좋으며, 유전자 재조합 기술에 의해 제작한 재조합 단백질이라도 좋다. 재조합 단백질을 제작하는 경우에는, 후술하는 바와 같이 해당 단백질을 코드하는 유전자(DNA)를 취득한다. 이 DNA를 적당한 발현계에 도입함으로써, 본 발명의 단백질(L-트레오닌 탈수소효소)을 생산할 수 있다.

본 발명의 단백질(L-트레오닌 탈수소효소)은, 상기 본 발명의 단백질(L-트레오닌 탈수소효소)을 코드하는 유전자를 벡터 상에 탑재하고, 이 벡터에 의해서 숙주 세포를 형질전환한 후, 형질전환시킨 숙주 세포를 배양하여 배양물 중에 상기 유전자가 코드하는 단백질을 축적하고, 축적한 단백질을 수집하는 것을 포함하는, 생산 방법에 의해 조제할 수 있다.

본 발명의 L-트레오닌 탈수소효소를 코드하는 유전자의 취득 방법은 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 L-트레오닌 탈수소효소를 코드하는 유전자는, 예컨대, 서열 번호 1에 기재한 아미노산 서열 및 서열 번호 2에 기재한 염기 서열의 정보에 기초하여, 화학 합성, 유전자 공학적 수법 또는 돌연 변이 유발 등의 당업자에게 기지의 임의의 방법으로 제작할 수 있다.

예컨대, 서열 목록의 서열 번호 2에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA에 대하여, 변이원이 되는 약제와 접촉 작용시키는 방법, 자외선을 조사하는 방법, 유전자 공학적 수법 등을 이용하여 행할 수 있다. 유전자 공학적 수법의 하나인 부위 특이적 변이 유발법은 특정한 위치에 특정한 이변을 도입할 수 있는 수법이기 때문에 유용하며, Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989(이하, 모리큘러 클로닝 제2판이라 함), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1∼38, John Wiley & Sons (1987-1997)(이하, 커런트 프로토콜즈 인 모리큘러 바이올로지라 함) 등에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.

본 명세서 중의 서열 목록의 서열 번호 1에 기재한 아미노산 서열 또는 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열의 정보에 기초하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 이들을 이용하여 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 본 발명의 유전자를 단리할 수 있다. cDNA 라이브러리는, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504로부터 통상법에 의해 제작할 수 있다.

PCR법에 의해 본 발명의 L-트레오닌 탈수소효소를 코드하는 유전자를 취득할 수도 있다. 상기 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504의 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 서열 번호 2에 기재한 염기 서열을 증폭할 수 있도록 설계한 한 쌍의 프라이머를 이용하여 PCR을 행한다. PCR의 반응 조건은 적절하게 설정할 수 있고, 예컨대, 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초∼1분간(어닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어지는 반응 공정을 1사이클로 하여, 예컨대 30사이클 행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 예로 들 수 있다. 계속해서, 증폭된 DNA 단편을, 대장균(E. coli) 등의 숙주에서 증폭 가능한 적절한 벡터 중에 클로닝할 수 있다.

상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝, 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에 기지이며, 예컨대, 모리큘러 클로닝 제2판, 커턴트 프로토콜즈 인 모리큘러 바이올로지 등에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.

본 발명의 유전자는 적당한 벡터 중에 삽입하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 이용하는 벡터의 종류는 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 자립적으로 복제하는 벡터(예컨대 플라스미드 등)라도 좋고, 혹은, 숙주 세포에 도입되었을 때에 숙주 세포의 게놈에 삽입되고, 삽입된 염색체와 함께 복제되는 것이라도 좋다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 벡터는 발현 벡터이다. 발현 벡터에 있어서 본 발명의 유전자는, 전사에 필요한 요소(예컨대, 프로모터 등)가 기능적으로 연결되어 있다. 프로모터는 숙주 세포에 있어서 전사 활성을 나타내는 DNA 서열이며, 숙주의 종류에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.

세균 세포에서 작동 가능한 프로모터로서는, 바실러스 스테아로써모필러스 말토게닉 아밀라아제 유전자(Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene), 바실러스 리체니포르미스 α 아밀라아제 유전자(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene), 바실러스 아밀로리케파시엔스 BAN 아밀라아제 유전자(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene), 바실러스 서브틸리스 알칼리 프로테아제 유전자(Bacillus Subtilis alkaline protease gene) 혹은 바실러스 푸밀러스 자일로시다아제 유전자(Bacillus pumilus xylosidase gene)의 프로모터 또는 파지 람다의 P_R 혹은 P_L 프로모터, 대장균(E. coli)의 lac, trp 혹은 tac 프로모터 등을 들 수 있다.

포유 동물 세포에서 작동 가능한 프로모터의 예로서는, SV40 프로모터, MT-1(메탈로티오네인 유전자) 프로모터, 또는 아데노바이러스 2주 후기 프로모터 등이 있다. 곤충 세포에서 작동 가능한 프로모터의 예로서는, 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터, 오토그라파 캘리포니카 폴리헤드로시스 염기성 단백 프로모터, 바큘로바이러스 즉시형 초기 유전자 1 프로모터, 또는 바큘로바이러스 39K 지연형 초기 유전자 프로모터 등이 있다. 효모 숙주 세포에서 작동 가능한 프로모터의 예로서는, 효모 해당계 유전자 유래의 프로모터, 알코올 데히드로게나제 유전자 프로모터, TPI1 프로모터, ADH2-4c 프로모터 등을 들 수 있다. 사상균 세포에서 작동 가능한 프로모터의 예로서는, ADH3 프로모터 또는 tpiA 프로모터 등이 있다.

또한, 본 발명의 유전자는 필요에 따라서, 적절한 터미네이터에 기능적으로 결합되어도 좋다. 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 또한, 폴리아데닐레이션 시그널(예컨대 SV40 또는 아데노바이러스 5E1b 영역 유래의 것), 전사 인핸서 서열(예컨대 SV40 인핸서) 등의 요소를 갖고 있어도 좋다. 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 또한, 해당 벡터가 숙주 세포 내에서 복제하는 것을 가능하게 하는 DNA 서열을 구비해도 좋고, 그 일례로서는 SV40 복제 기점(숙주 세포가 포유류 세포일 때)을 들 수 있다.

본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 또한 선택 마커를 함유해도 좋다. 선택 마커로서는, 예컨대, 디히드로엽산 리덕타아제(DHFR) 또는 시조사카로마이세스 폼베 TPI 유전자 등과 같은 그 보체가 숙주 세포에 결여되어 있는 유전자, 또는 예컨대 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 네오마이신 혹은 히글로마이신과 같은 약제 내성 유전자를 예로 들 수 있다. 본 발명의 유전자, 프로모터, 및 소망에 따라 터미네이터 및/또는 분비 시그널 서열을 각각 연결하고, 이들을 적절한 벡터에 삽입하는 방법은 당업자에 주지이다.

본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 적당한 숙주에 도입함으로써 형질전환체를 제작할 수 있다. 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입하는 숙주 세포는, 본 발명의 유전자를 발현할 수 있으면 임의의 세포로 좋고, 세균, 효모, 진균 및 고등 진핵세포 등을 들 수 있다.

세균 세포의 예로서는, 바실러스 또는 스트렙토마이세스 등의 그램 양성균 또는 대장균(E. coli) 등의 그램 음성균을 들 수 있다. 이들 세균의 형질전환은, 프로토플라스트법, 또는 공지의 방법으로 컴피턴트 세포를 이용함으로써 행하면 좋다. 포유류 세포의 예로서는, HEK293 세포, HeLa 세포, COS 세포, BHK 세포, CHL 세포 또는 CHO 세포 등을 들 수 있다. 포유류 세포를 형질전환하고, 해당 세포에 도입된 DNA 서열을 발현시키는 방법도 공지이며, 예컨대, 일렉트로포레이션법, 인산칼슘법, 리포펙션법 등을 이용할 수 있다.

효모 세포의 예로서는, 사카로마이세스 또는 시조사카로마이세스에 속하는 세포를 들 수 있고, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)또는 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri) 등을 들 수 있다. 효모 숙주로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예컨대, 일렉트로포레이션법, 스페로블라스트법, 아세트산리튬법 등을 예로 들 수 있다.

다른 진균 세포의 예는, 사상균, 예컨대 아스페르길루스, 뉴로스포라, 프자리움, 또는 토리코델마에 속하는 세포이다. 숙주 세포로서 사상균을 이용하는 경우, DNA 구축물을 숙주 염색체에 삽입하여 재조합 숙주 세포를 얻음으로써 형질전환을 행할 수 있다. DNA 구축물의 숙주 염색체로의 삽입은, 공지의 방법에 따라서, 예컨대 상동 재조합 또는 이종 재조합에 의하여 행할 수 있다.

곤충 세포를 숙주로서 이용하는 경우에는, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로바이러스를 곤충 세포에 함께 도입하여 곤충 세포 배양 상청 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 또한 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜, 단백질을 발현시킬 수 있다(예컨대, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1; 및 커런트 프로토콜즈 인 모리큘러 바이올로지, Bio/Technology, 6, 47(1988) 등에 기재).

바큘로바이러스로서는, 예컨대, 밤나방과 곤충에게 감염되는 바이러스인 오토그라파 캘리포니카 뉴클레아 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 이용할 수 있다.

곤충 세포로서는, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)의 난소 세포인 Sf9, Sf21〔바큘로바이러스 익스프레션 벡터즈, 어 라보라토리 메뉴얼, W H 프리맨 앤드 컴패니(W. H. Freeman and Company), 뉴욕(New York),(1992)〕, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)의 난소 세포인 HiFive(인비토로젠사 제조) 등을 이용할 수 있다.

재조합 바이러스를 조제하기 위해, 곤충 세포로 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 바큘로바이러스를 함께 도입하는 방법으로서는, 예컨대, 인산칼슘법 또는 리포펙션법 등을 예로 들 수 있다.

상기의 형질전환체는, 도입된 유전자의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 적절한 영양 배지 중에서 배양한다. 형질전환체의 배양물로부터, 본 발명의 단백질을 단리 정제하기 위해서는, 통상의 단백질의 단리, 정제법을 이용하면 좋다. 예컨대, 본 발명의 단백질이, 세포 내에 용해 상태로 발현된 경우에는, 배양 종료 후, 세포를 원심 분리에 의해 회수하여 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻는다. 해당 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어진 상청으로부터, 통상의 단백질의 단리 정제법, 즉, 용매 추출법, 유안 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE) 세파로스 등의 레진을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-세파로스(Sepharose) FF(파마시아사 제조) 등의 레진을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피법,(부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 레진을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 이용한 겔 여과법, 아피니티 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 수법을 단독 혹은 조합하여 이용하고, 본 발명의 L-트레오닌 탈수소효소를 정제 표품으로서 얻을 수 있다.

<L-트레오닌의 분석 방법>

본 발명의 L-트레오닌의 분석 방법은, 피검체를 함유하는 샘플과 본 발명의 L-트레오닌 탈수소효소 및 보효소 NAD⁺를 혼합하고, 소정 시간 후에 NADH량을 분석하는 것을 포함하는 것이다.

본 발명의 L-트레오닌 탈수소효소는, 바람직하게는 상기 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504 유래의 L-트레오닌 탈수소효소이다.

피검체는, 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 인간 혈액이나 음식품 등일 수 있다.

피검체를 함유하는 샘플은, 피검체를 예컨대, L-트레오닌 탈수소효소의 최적 pH를 나타내는 완충액에 혼합한 것일 수 있다. L-트레오닌 탈수소효소의 최적 pH는 10.0이다. 분석 시에는, 피검체를 함유하는 샘플에 소정량의 L-트레오닌 탈수소효소를 첨가한다. L-트레오닌 탈수소효소의 첨가량은, L-트레오닌 탈수소효소의 정제도나 역가 등을 고려하여 적절하게 결정할 수 있고, 예컨대, 0.001∼1 U/200 μL의 범위로 할 수 있다.

피검체를 함유하는 샘플에는, L-트레오닌 탈수소효소에 더하여 보효소 NAD⁺를 혼합한다. 보효소 NAD⁺는, NAD의 염, 예컨대, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속염일 수 있다. 보효소 NAD⁺의 혼합량은, 샘플 중의 L-트레오닌 농도나 L-트레오닌 탈수소효소의 역가 등을 고려하여 적절하게 결정할 수 있고, 예컨대, 0.001∼3 mM 범위로 할 수 있다. 또한, NAD⁺은 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드로서, β-NAD⁺라 표기되는 일도 있고, 양자는 동의이다. 또한, NADP⁺는 β-NADP⁺라 표기되는 일도 있고, 양자는 동의이다.

L-트레오닌 탈수소효소 및 보효소 NAD⁺를 혼합한 후, 소정 시간 후에 NADH량을 분석한다. 소정 시간은, 반응 온도나 피검체에 포함되는 L-트레오닌 농도, 분석의 정밀도 등을 고려하여 적절하게 결정할 수 있다. 통상은, 예컨대, 5초∼60분의 범위, 바람직하게는 1분∼60분의 범위일 수 있다.

소정 시간 경과 후, L-트레오닌 탈수소효소에 의해 생성된 NADH량을 분석한다. NADH량의 분석은, 예컨대, 340 ㎚에서의 흡광도(A₃₄₀) 측정에 의해 직접적으로 실시할 수 있는 것 외에, NADH에 의해 색소를 생성시키는 방법이나, NADH에 의해 형광을 발생시키는 방법을 이용할 수도 있다. NADH에 의해 색소를 생성시키는 방법으로서는, 예컨대, NADH-테트라졸륨계의 전자 캐리어를 이용하는 방법을 예로 들 수 있고, 전자 캐리어로서는, 예컨대, PMS(페나진메토설페이트, +0.08V)나 멜돌라블루를 이용할 수 있다. NADH에 의해 색소를 생성시키는 방법으로서는, 예컨대, 디아포라아제를 이용하는 방법도 예를 들 수 있다. 디아포라아제를 이용하는 방법에서는, 디아포라아제가 NADH의 산화와 색소의 환원을 촉매하여 발색을 얻는다. 색소로서는, INT(2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐테트라졸륨 클로라이드), NBT(니트로블루 테트라졸룸) 등을 이용할 수 있다. 또한, 디아포라아제를 이용하는 방법에서는, 색소로서 레자스린[rezasurine(7-히드록시-3H-페녹사진-3-온 10-옥시드)]과 같은 형광 색소를 이용할 수도 있다.

본 발명의 L-트레오닌의 분석 방법은, 마이크로플레이트를 이용한, 소위, 마이크로플레이트 분석에 적합하다. 마이크로플레이트로서는, 예컨대, 96-구멍 마이크로플레이트를 이용할 수 있고, 구멍수는, 특별히 제한은 없다. 96-구멍 마이크로플레이트를 이용하는 경우에는, 반응 총용량을 예컨대, 200 μL로 하고, 100 mM 글리신 KCl-KOH 완충액(pH 10.0), 2.5 mM NAD⁺, 탈단백질화된 샘플을 첨가한다. 반응은 본 발명의 효소를 첨가함으로써 시작된다. 예컨대, 30℃에서 10-30분 보온하고, 엔드 포인트의 340 ㎚에서의 흡광도를 UV 마이크로플레이트 분광 광도계로 측정할 수 있다. 흡광도의 변화(ΔA)는, 최종 흡광도로부터 대조값을 뺀 값으로서 얻어진다. 탈단백질화된 샘플의 조제는, 예컨대, Centricon YM-10에 의한 한외 여과에 의해 실시할 수 있다.

본 발명의 L-트레오닌의 분석 방법은, 상기한 바와 같이 NADH량을 분석하는 것 이외에, L-트레오닌 탈수소효소에 의해 L-트레오닌으로부터 생성된 2-아미노-3-옥소부티르산의 양을 분석함으로써도 실시할 수 있다. 상기 반응식 1에 나타내는 바와 같이, L-트레오닌으로부터 생성된 2-아미노-3-옥소부티르산(α-아미노-β-케토부티르산)은, 비효소적으로 탈탄산하여 아미노아세톤을 생성한다. 이 아미노아세톤은, 모노아민옥시다아제에 의해 산화함으로써 메틸글리옥살이 되지만, 그 때, 암모니아와 과산화수소가 생성된다. 이들 생성된 암모니아 또는 과산화수소를 기지의 정량 방법으로 정량함으로써, L-트레오닌을 정량할 수 있다.

본 발명의 L-트레오닌의 분석 방법은, 상기한 바와 같이 NADH량 또는 2-아미노-3-옥소부티르산의 양을 분석하는 것 이외에, 상기 반응식 1에 나타내는 바와 같이 L-트레오닌 탈수소효소에 의해, 2-아미노-3-옥소부티르산 및 NADH와 함께 생성되는 H⁺의 양을 분석함으로써도 실시할 수 있다. H⁺의 양의 분석은 기지의 방법을 이용할 수 있다.

<L-트레오닌 분석용 키트>

본 발명은, 이하의 (A) 및 (B)를 포함하는 L-트레오닌 분석용 키트를 포함한다.

(B) 보효소 NAD⁺

(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;

(A)의 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소는, 상기 본 발명의 효소이며, 바람직하게는, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)가 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504이다. 상기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질은, 상기에서 설명한 것과 동일하다.

(B)의 보효소 NAD⁺는, 예컨대, NAD⁺일 수 있다. 본 발명의 키트는, NADH량 분석용의 색소 및/또는 효소를 또한 포함할 수도 있다. NADH량 분석용의 색소로서는, 상기 전자 캐리어나 상기 디아포라아제에 의해 환원되어 발색하는 색소일 수 있다. 또한 본 발명의 키트는, 본 발명의 효소에 알맞은 완충액을 또한 포함할 수도 있고, 이 완충액은, 상기 본 발명의 효소를 함유하는 것일 수도 있다.

본 발명의 키트는, 또한, 상기 마이크로플레이트나 분석용 샘플의 탈단백질화에 이용되는 한외 여과 장치나, 본 발명의 키트의 설명서도 수반할 수 있다.

또한, 본 발명은, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소 또는 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 완충액 중에 함유시킨 것인, L-트레오닌 분석용 효소 제제도 포함한다.

(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;

쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소는 상기와 동일하다. 상기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질은, 상기에서 설명한 것과 동일하다. 또한, L-트레오닌 탈수소효소를 함유시키는 완충액은, 본 발명의 L-트레오닌 탈수소효소에 알맞은 조성과 pH를 가질 수 있다.

<효소 센서>

본 발명의 효소 센서는, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소 또는 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 검출용 전극에 직접 또는 간접적으로 고정화 또는 배치한 것을 특징으로 하는 L-트레오닌 정량에 이용하기 위한 효소 센서이다.

(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;

상기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질은, 상기에서 설명한 것과 동일하다.

본 발명의 효소 센서는, 효소 센서를 구성하는 검출용 전극에 L-트레오닌 탈수소효소를 직접 또는 간접적으로 고정화 또는 배치한 것으로, L-트레오닌의 정량에 이용하기 위한 것이다. 본 발명의 효소 센서는, 바람직하게는, L-트레오닌 탈수소효소에 의해 L-트레오닌으로부터 생성되는 생성물을 직접적으로 정량적으로 검출할 수 있는 것이 바람직하다. 덧붙여, 본 발명의 효소 센서는, 상기 효소 이외에, 효소와 전극 사이의 전자의 교환을 용이하게 하는 전기 화학 메디에이터 등을, 상기 검출용 전극에 직접 또는 간접적으로 고정화 또는 배치한 것일 수도 있다. 그 이외의 구성은, 공지의 효소 센서에서 채용되어 있는 구성을 그대로, 또는 적절하게 개변하여 이용할 수 있다. 본 발명의 효소 센서는, 피검체를 함유하는 시험 용액에 적어도 검출용 전극 부분을 침지하고, 시험 용액에, L-트레오닌 탈수소효소에 의해 L-트레오닌으로부터 생성되는 생성물을 검출용 전극으로 검출한다. 보다 구체적으로는, L-트레오닌으로부터 생성되는 생성물의 하나인 NADH를 검출할 수 있는 전극을 L-트레오닌 탈수소효소와 조합시켜 이용할 수 있다. NADH를 검출할 수 있는 전극으로서는, 전술의 전기 화학 메디에이터(전자 전달체)에 디아포라아제나 NADH 옥시다아제를 조합시킨 것일 수도 있다. 또한, L-트레오닌 탈수소효소 및 디아포라아제, NADH 옥시다아제는, 유리의 상태로 사용할 수도 있지만, 공지의 방법에 의해 직접 혹은, 간접적으로 전극에 고정화할 수도 있다. 그 밖의 NADH를 검출할 수 있는 전극으로서는, 예컨대, 일본 특허공개 평7-280769호 공보 및 일본 특허공개 평7-310194호 공보에 기재된 것을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 의도는 아니다.

본 발명의 효소 센서는, 상기한 바와 같이 NADH량을 분석하는 것 이외에, L-트레오닌 탈수소효소에 의해 L-트레오닌으로부터 생성된 2-아미노-3-옥소부티르산의 양을 정량하는 것일 수도 있다. 상기 반응식 1에 나타내는 바와 같이, L-트레오닌으로부터 생성된 2-아미노-3-옥소부티르산(α-아미노-β-케토부티르산)으로부터 비효소적으로 탈탄산하여 생성하는 아미노아세톤을, 모노아민옥시다아제에 의해 산화함으로써 생성되는 과산화수소를 정량할 수 있는 과산화수소 전극을 검출용 전극으로서 이용하는 효소 센서일 수도 있다. 이 효소 센서는, 과산화수소 전극에 L-트레오닌 탈수소효소 및 모노아민옥시다아제를 조합함으로써 구성할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 다시 설명하지만, 본 발명은 실시예에 한정되는 의도가 아니다.

실시예 1

L-트레오닌 자화성 세균의 스크리닝

L-트레오닌 자화성 세균은, 도야마현립대학보존균으로부터 스크리닝함으로써 얻었다. 이들 세균은, L-트레오닌을 단일 탄소·질소원으로 하는 이하의 조성의 배지(5 ml)에서 3일간, 30℃, 300 rpm에서 호기적으로 전배양하였다. 배지는, 1 리터 당, 이하를 포함하고 있었다(10 gL-트레오닌, 2 g K₂HPO₄, 1 g NaCl, 0.1 g MgSO₄, 7H₂O, 4 ㎍ 티아민-HCl, 2 ㎍ 리보플라빈, 4 ㎍ 판토텐산칼슘, 4 ㎍ 피리독신-HCl, 20 pg 비오틴, 2 ㎍ p-아미노벤조산, 4 ㎍ 니코틴산, 0.1 ㎍ 폴산, 20 ㎍ 이노시톨, 500 ㎍ Titriplex IV, 200 ㎍ FeSO₄·7H₂O, 10 ㎍ ZnSO₄·7H₂O, 3 ㎍ MnCl₂·4H₂O, 30 ㎍ H₃BO₄, 20 ㎍ CoCl₂·6H₂O, 1 ㎍ CuCl₂·2H₂O, 2 ㎍ NiCl₂·6H₂O, 3 ㎍ Na₂MoO₄).

분리된 콜로니를, 상기의 배지를 이용하는 동일 조건으로 배양하였다. 세균의 세포를 28,400×g에서 10분간 원심 분리하고, 0.85% NaCl 수용액을 이용하여 두번 세정하고, 1 ml의 100 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.4)에 현탁하였다. 세포를 Bead Shocker(2,700 rpm, 온타임 60초, 오프타임 60초, 3사이클, YGB01 글라스비드 0.1 ㎜, 4℃)를 이용하여 파쇄 후, 4℃, 28,400×g으로 10분 원심하였다. 이와 같이 하여 조효소 추출액을 조제하고, 효소 활성을 분석하였다.

활성의 스크리닝 및 분석

표준적인 탈수소효소 활성의 분석은, Greiner사 제조의 96웰 배양 플레이트를 이용하여 30℃에서 행하였다. 반응 혼액은 조효소 추출액 20 μl, NAD⁺(최종 농도 2.5 mM), L-트레오닌(최종 농도 10 mM), 글리신-KCl-KOH 완충액(pH 10.4, 최종 농도 100 mM)을, 총용량 200 μl가 되도록 포함한다. NAD⁺가 환원되어 생성한 NADH를 마이크로플레이트 리더에 의해서 340 ㎚에서 계측하였다. NADH의 분자 흡광 계수로서, 6.22 mM^-1㎝^- ¹를 이용하였다. 1유닛(U)의 효소 활성은, 상기 표준적인 조건에 있어서, 1분간에 1 μmol의 NADH를 생성하는 효소량으로 정의하였다.

단백질 농도의 정량

단백질 농도는, BioRad 단백질 분석 키트를 이용하거나, 소혈청 알부민을 표준으로 하여 281 ㎚에서의 흡광도로부터 결정하였다.

결과

TDH 활성은, TPU(도야마현립대학)의 세균 보존균 416주 중, 6주에 검출할 수 있었다(표 2). 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) (NBRC 102504 및 IAM13549)에 강한 TDH 활성을 검출할 수 있었다(각각, 1.97 및 1.01 U/㎎). 세데세아 네테리(Cedecea neteri)(JCM 5909), 아스로박터 버게레이(Arthrobacter bergerei)(NBRC 12127), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes)(NBRC 13534), 및 테라박터 투메센스(Terrabacter tumescens)(NBRC 12960)의 무세포 추출액에는, 각각 0.12, 0.08, 0.08 및 0.13 U/㎎의 TDH 활성을 검출할 수 있었다. L-트레오닌에 대한 특이성은, L-아미노산(L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-시스테인, L-글루타민산, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-오르니틴, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, 타우린, L-트립토판, L-티로신, L-트레오닌, L-발린)에 대한 표준 마이크로플레이트 분석에 의해 시험하였다. L-트레오닌에 대한 특이성에 있어서「있음」이란, L-트레오닌에 대하여 활성인 것을 나타낸다.

쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)(NBRC 102504)의 조추출액이 최고의 비활성을 나타냈기 때문에, 이하에 상세한 검토를 행하였다. 이들 균주는, 모두 L-트레오닌에 대하여 높은 기질 특이성을 나타내었다.

쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)(NBRC 102504) 유래의 생육 조건과 L-트레오닌 탈수소효소의 정제

C. 네카토르(NBRC 102504) 전배양으로서, 5 ml의 TGY-T 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.1% 글루코오스, 0.1% K₂HPO₄, 0.5-1% L-트레오닌, pH 7.0)에서 37℃, 하룻밤 진탕 배양하였다. 전배양의 배지(5 ml)를 500 ml의 동일 배지에서, 37℃, 12시간 배양하였다. 집균 후 균체를 100 mM 인산칼슘 완충액(pH 7.0)에 현탁하였다.

TDH의 정제

세균의 세포는, 4℃에서 20분간 초음파 처리 장치로 파쇄 후, 28,000×g으로 15분간 원심하고, 세포 잔사를 제거하였다. 무세포 추출액을 분획하고, 효소 활성을 30-60% 유안 포화 부분에 얻었다. 이 분획을 인산칼슘 완충액(10 mM, pH7.0)에 투석하였다. 효소 용액은, DEAE-토요펄 650 M 컬럼의 이온 교환 수지나 부틸-토요펄 컬럼 크로마토그래피의 소수 크로마토그래피, Superdex-200 컬럼 크로마토그래피 등에 의한 정법을 이용하여 단일로 정제하였다.

활성 분석

L-트레오닌의 산화 활성은, 보효소 NAD⁺의 환원을 30℃, 340 ㎚에서 측정함으로써 결정하였다. 반응 조성은 총용량 1 ml이며, L-트레오닌(최종 농도 10 mM), NAD⁺(최종 농도 2.5 mM), 글리신-KCl-KOH 완충액(100 mM, pH 10.0)을 포함하고 있었다. 활성 측정은, 효소의 첨가에 의해 개시하였다. 1유닛(U)의 효소 활성은, 표준 조건에 있어서, 1분간에 1 μmol의 NADH를 생성하는 효소량으로 정의하였다.

결과

C. 네카토르 유래의 TDH 정제 스텝을 표 3에 정리하였다. 효소를 6.4%의 수율, 및 75.4배의 정제로 균일 상태까지 정제하였다. 정제된 TDH는, 표준 조건에 있어서, NAD⁺를 보효소로 하여 L-트레오닌의 탈수소 반응을 촉매하였다(비활성 42.2 U/㎎).

TDH 및 서브유닛의 분자량의 측정

각종 표준 단백질을 이용하여, SDS-PAGE나 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정법에 따라서 분자량 측정을 행하였다.

결과

정제의 최종 스텝까지 정제된 효소는, SDS-PAGE 상에서 단일 밴드를 나타내고, 분자량은 37,200으로 산출되었다(도 1). 천연의 분자량은, HPLC(도 2)에서, 79,400으로 결정하였다. 따라서 활성이 있는 천연형의 효소는, 2량체라고 생각된다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 효소는, 클로스트리디움 스틱란디(Clostridium sticklandii)나 닭간 유래의 TDH와 천연 및 서브유닛 분자량을 나타내었지만, 다른 유래의 효소와는 상이한 분자량을 갖고 있었다.

pH 및 온도의 효소 활성과 안정성에의 영향

각종 pH의 완충액 중에서 효소 반응을 행하였다.

결과

pH의 효소 활성에의 영향을 각종 완충액 중에서 검토하였다. 최적 pH는 100 mM 글리신-KOH 완충액(pH 10.0)에서 얻어졌다(도 3).

각종 pH의 완충액을 이용하여, TDH의 안정성을 검토하였다. TDH를 각종 pH로 60분간 보온하고, 표준 조건에서의 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 효소는 pH 6-11로, 매우 안정이었다(도 4). 본 효소는, 아세트산나트륨 완충액 중(pH 4-5)이나 Na₂CO₃-NaHCO₃ 완충액 중(pH10-11)에서는 약간 불안정하였다.

온도를 25℃에서 75℃까지 상승시키면, TDH 활성은, 그것에 따라서 증가하였다. TDH의 최적 온도는, 75℃였다. TDH 활성은, 80℃에서는 상실되었다(도 5).

TDH를 각종 온도에서 60분간 보온하고, 그 후의 잔존 활성을 결정하였다. 본 효소는 40℃까지 안정이었다(도 6). 45℃에서 60분간 보온한 바, 효소 활성의 60%는 잔존하였다. 50℃에서 60분간 보온한 바, 효소 활성은 완전히 상실되었다.

기질 특이성

TDH가 각종 L-아미노산, 아미노알코올, 알코올을 기질로 할지에 대하여 검토하였다. 기질 농도를 10 mM로 하고, 표준의 분석 조건으로 활성 측정하였다.

결과

표 5에 TDH의 기질 특이성을 나타내었다. L-트레오닌에만 활성을 나타내었다(100% 상대 활성). 본 효소는, D-트레오닌에 대해서는 활성이 발견되지 않았다. 본 효소는, 다른 L-아미노산, 글리세롤, 아미노알코올, 알코올 등을 기질로 하지 않았다. 본 효소는, NAD⁺을 보효소로 하고, NADP⁺에는 활성이 발견되지 않았다.

[표 5 계속]

TDH의 동력학 상수

L-트레오닌 및 NAD⁺에 대한 속도 상수를 Lineweaver Burk plot에 의해 결정하였다. NAD⁺ 농도 2.5 mM에서 L-트레오닌에 대한 최대속 (Vmax) 및 미카엘리스 상수(Km)는, 11.6 mM 및 66.3 μmol/㎎/분이었다(도 7). L-트레오닌 농도 10 mM에서 NAD⁺에 대한 속도 상수를 구하였다. NAD⁺에 대한 Km 및 Vmax값은 각각, 0.1 mM 및 104.2 μmol/㎎/분이었다(도 8).

각종 화합물의 효소 활성에의 영향

정제된 TDH를 각종의 금속 이온(최종 농도 1 mM) 혹은 저해제(최종 농도 10 mM)와 30℃에서 1시간 보온하였다. 잔존 활성을 측정하고, 무처리와의 상대 활성으로서 비교하였다. 최적 pH 및 온도에서 행하였다.

결과

금속 이온의 영향(표 6). 효소는 FeCl₃, FeCl₂ 및 SnCl₂에 의해서 부분적으로 저해되었다. 1시간 보온한 후의 잔존 활성은, 27, 68, 및 84%였다.

표 7에 나타내는 바와 같이, TDH 활성은 EDTA나 EGTA 등의 금속 킬레이트제에 의해서는 저해되지 않았다. 금속 이온을 보인자로서 요구하지 않는다고 생각된다. 10 mM EDTA를 포함하는 완충액에서 투석해도 효소 활성이 잔존하였다. 환원제의 β-머캅토에놀이나 DTT에서도 효소 활성은 저해되지 않았다. K[Fe(CN)₆], K₃[Fe(CN)₆], 판토텐산칼슘으로 간신히 저해되었다. 요오도아세트산, PMSF/이소프로판올, PCMB, HgCl₂, NaN₃ 처리 후의 잔존 활성은, 각각 48%, 37%, 6.2%, 23%, 12%였다. 효소 활성은, 요오도아세트아미드, PMS, NEM으로 저해되었다.

쿠프리아비두스 유트로파(Cupriavidus eutropha) NBRC 102504 유래 L-트레오닌 탈수소효소 유전자의 클로닝

정제된 TDH의 N-말단 아미노산 서열(15잔기)의 정보를 바탕으로 유전자 클로닝 및 유전자 발현에 성공하였다.

쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)로부터의 TDH 유전자의 클로닝

C. 네카토르는, 5 ml의 TGY 배지를 이용하여, 30℃, 300회전으로, 24시간 배양하였다. C. 네카토르의 게놈 DNA는, 그 세포로부터 조제하였다. 정제한 TDH 효소를 N-말단 아미노산 서열의 분석, 및 그 결과로부터 데이터베이스에 의한 유사의 서열을 검색한 결과로부터, 이하와 같은 일조의 프라이머를 설계하였다.

TDH-N1 프라이머는, 하선과 같이 개시 코돈 ATG를 포함하고 있다. PCR용의 용액은, 200 pmol의 TDH-N1, 100 pmol의 TDH-C1, 23.5 ng의 게놈 DNA, 0.25 μl의 다카라 Ex Taq(5 units/μl), 5 μl의 10×Ex Taq 완충액, 4 μl의 dNTP 혼합액(각각 2.5 mM)을 50 μl 중에 포함하고 있다. PCR은, 변성을 98℃, 10초(첫회만 60초), 어닐링을 55℃, 30초, 신장 반응을 72℃, 180초로 하고, 30사이클 행하였다. 증폭된 약 550 bp의 PCR 산물은, 아가로스겔로부터 추출하고, Viogene(Sunnyvale, CA)사 제조의 Gel-M^TM 겔 추출 키트를 이용하여 추출하고, T4 리가아제(New England Biolabs Japan, Tokyo)를 이용하여 pT7-Blue T 벡터에 라이게이션하였다. 유전자 서열은, ABI PRISM 310 유전자 해석 장치(Applied Biosystems Japan, Tokyo)를 이용하여 해석하였다. 이 550 bp의 영역의 상류 및 하류의 유전자 서열을 해석하기 위해서, 인버스 PCR을 행하였다. 해독한 유전자 서열로부터, 이하와 같은 일조의 프라이머를 설계하였다.

C. 네카토르의 게놈 DNA(15 ㎍)는, EcoRI로 소화하고, 페놀 클로로포름으로 추출 후, 에탄올로 침전시켰다. 그것을 30 μl의 TE 완충액에 용해하고, 16 ℃에서 12시간, 자기 연결 반응을 행하였다. 고리화한 DNA(2 μl)는, TDH-N1 및 TDH-C1을 프라이머로 하고, GC 완충액을 이용한 PCR를 이하의 조건으로 행하였다. 즉, 변성을 94℃, 30초(첫회만 60초), 어닐링을 60℃, 60초, 신장 반응을 72℃, 120초로 하고, 30사이클로 행하였다. 얻어진 5,000 bp의 증폭 단편은, EcoRI로 소화하고, 클로닝 후, 유전자 서열을 해석하였다. 이 유전자는, N-말단 및 스톱 코돈을 포함하는 유전자 서열을 포함하고 있었다. 프라이머 보행의 기술을 이용하여, 전체의 유전자를, 이하와 같은 일조의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.

CnTDH-F는, 개시 코돈을 NdeI의 인식 부위(이중 하선)에 가지고 있다. CnTDH-R은, 종지 코돈를 BamHI의 인식 부위(이중 하선)에 가지고 있다. PCR은, 다카라 Ex Taq를 이용하여 전술과 같이 행하였다. TDH 유전자(957 bp)는, pET15b에 서브클로닝하고, CnTDHpET15b 플라스미드를 얻고, 그것을 이용하여 대장균(E.coli) JM109를 형질전환하였다. 이 대장균(E. coli) 형질전환주는 LB 배지를 이용하여 37℃, 12시간 배양하였다. 균체에서 플라스미드 CnTDHpET15b를 추출하고, 또한 효소를 발현하기 위해서, 대장균(E.coli) BL21(DE3)을 형질전환하였다.

결과

TDH의 DNA 서열(서열 번호 2)을 검토하였다. TDH 유전자는, 318 아미노산을 코드하고 있었다(도 9). 분자 질량은 34,627.85으로 산출되었다. 서브유닛의 분자 질량은, SDS-PAGE 분석에 의해 37,200로 산출하였다.

TDH 효소 단백질의 발현 및 정제

pET15bBL21을 포함하는 대장균(E.coli) 형질전환주를 배양하고, 발현된 TDH를 정제하였다. 5 ml의 0.2 mM 암피실린을 포함하는 LB 배지에서, 37℃, 12시간 호기적으로 전배양하였다. 500 ml의 동일배지에 심고, 37℃, 12시간 호기적으로 배양하였다. 여기에 0.5 mM이 되도록 IPTG을 더하고, 4 시간 더 배양하였다. 대장균(E.coli)은, 5,000×g, 4℃에서 10분간 원심하고, 생리적 식염수로 2번 세정하였다. 대장균(E.coli)은, 정법에 따라서 초음파 처리하고, 얻어진 무세포 추출액을 Ni-세파로스(Sepharose) TM-6 Fast Flow 컬럼(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK.)에 통과시켜, 75 mM 이미다졸을 포함하는 동일한 완충액으로 세정 후, 500 mM 이미다졸을 포함하는 동일한 완충액으로 용출하였다. 활성 획분은, 20 mM 인산칼슘 완충액(pH 8.0)에서 투석하였다.

결과

CnTDHpET15b 플라스미드를 포함하는 E. coli BL21(DE3)에 의해 발현된 유전자 재조합 TDH-His는, N-말단에 His-tag를 갖고, 기재한 바와 같은 최적 배양 조건에서 유전자 재조합 TDH를 생산하였다. 500 ml 배양으로 6,000 U의 TDH가 발현되고, 무세포 추출액에 있어서도 비활성 15.3 U/㎎을 나타내었다. Ni-킬레이팅 컬럼 크로마토그래피에 의해, 일회의 스텝으로 정제하고, SDS-PAGE에서도 단일의 효소의 밴드를 부여하였다(도 10). 정제된 유전자 재조합 효소 비활성은, 64.5 U/㎎이었다(표 8). 이 비활성은, 야생주에서 정제한 효소(42.2 U/㎎)보다, 약 1.5배 높았다. 정제 수율은 98%였다.

TDH를 이용하는 L-트레오닌의 정량

샘플 조제

인간(혈청 및 혈장) 샘플은 시판품을 이용하였다. 단백질 등은 4℃에서 한외 여과(Centriprep YM-10)에 의해 제거하고, 사용할 때까지 -20℃에서 보존하였다.

표준 L-트레오닌

L-트레오닌 용액(0-3000 μM)은 -20℃에서 동결 보존하였다.

마이크로플레이트 리더를 이용하는 L-트레오닌의 정량

96-구멍 UV 마이크로플레이트 분광 광도계를 이용하여 정량이 행해졌다. 반응 총용량을 200 μL로 하고, 100 mM 글리신 KCl-KOH 완충액(pH 10.0), 2.5 mM NAD⁺, 탈단백질화된 샘플로 이루어진다. 반응은 효소 첨가에 의해 개시되었다. 30℃에서 10-30분 보온하여 엔드 포인트의 340 ㎚에서의 흡광도를 마이크로플레이트 분광 광도계로 측정하였다. 흡광도 변화(ΔA)는, 최종 흡광도로부터 대조값을 뺀 값으로 하고, 3연속으로 실험을 행하였다.

결과

TDH를 이용하는 L-트레오닌의 효소적 정량의 검량선은, 10-3,000 μM에서 농도 직선을 나타내었다(도 11).

6개의 인간 유래의 샘플에 관해서, 효소적 UV 마이크로플레이트 분광 광도계를 이용하는 정량과, 고속 액체 크로마토그래피(UPLC)에 의한 정량을 비교한(도 12) 효소적 분석과 UPLC 분석은, 거의 동일한 값을 나타내며, 본 효소적 분석이 신뢰성이 있는 것을 나타내었다.

효소적 정량법의 신뢰성은, 인간 혈장 중의 각종 농도의 L-트레오닌을 측정함으로써 검토하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, (R²=0.9942)의 좋은 상관 관계가 얻어졌다. 본 분석 조건에서의 L-트레오닌의 회수율은 99.5%였다.

인간 샘플의 L-트레오닌 농도의 정밀도는 12회의 분석으로 표 9에 나타낸 바와 같이, 분석 내의 (CVs)는 2.2-6.2%. 분석 사이의 CV는, 1.4-2.9%였다.

L-트레오닌의 효소적 정량으로서 보고되어 있는 대장균(Escherichia coli) 유래의 트레오닌 데아미나아제(TD), 효모 유래의 알데히드 탈수소효소(ALDH)의 분석을 TDH를 이용하는 방법과 비교하였다(표 10).

TDH를 이용하는 본 발명의 새로운 마이크로플레이트 분석은, UPLC를 이용하는 정량과 비교해도 매우 신뢰성 있는 정량법인 것을 알 수 있었다. 또한, TDH 마이크로플레이트 방법은, 기지의 방법과 비교해도 높은 정밀도와 넓은 정량 범위를 나타내었다. 본 발명의 방법은, 인간 혈액중 등의 생체나 식품 중의 L-트레오닌 농도를 측정하는 데 적합하다.

상기 참고 문헌 1∼12의 전체 기재는, 여기에 특히 개시로서 원용된다.

산업상의 이용 가능성

본 발명은, 인간 혈액중 등의 생체나 식품 중의 L-트레오닌 농도의 측정을 필요로 하는 분야에 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> Toyama prefecture, Ajinomoto <120> L-threonine analysis and L-threonine dehydrogenase <130> 115042H <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 318 <212> PRT <213> Cupriavidus necator <400> 1 Met Glu Ala Gly Lys Pro Lys Ile Leu Ile Val Gly Ala Asn Gly Gln 1 5 10 15 Ile Gly Ser Glu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Glu Arg Tyr Gly Arg Thr 20 25 30 Asn Val Ile Thr Ser Asp Val Val Pro Thr Gly Arg His Val His Leu 35 40 45 Thr His Glu Met Leu Asn Ala Thr Asp Arg Gly Glu Leu Ala Thr Val 50 55 60 Val Glu Arg His Gly Ile Thr Gln Val Tyr Leu Leu Ala Ala Ala Leu 65 70 75 80 Ser Ala Thr Gly Glu Lys Ala Pro Gln Trp Ala Trp Asn Leu Asn Met 85 90 95 Thr Ser Leu Leu Asn Val Leu Glu Leu Ala Arg Gln Thr Gly Leu Glu 100 105 110 Arg Val Phe Trp Pro Ser Ser Ile Ala Ala Phe Gly Pro Thr Thr Pro 115 120 125 Ala Gly Gln Thr Pro Gln Lys Thr Val Met Glu Pro Thr Thr Val Tyr 130 135 140 Gly Ile Ser Lys Gln Ala Gly Glu Gly Trp Cys Arg Trp Tyr His Ala 145 150 155 160 Asn His Gly Val Asp Val Arg Ser Val Arg Tyr Pro Gly Leu Ile Ser 165 170 175 His Lys Thr Pro Pro Gly Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Val Asp Ile 180 185 190 Phe His Ala Ala Val Thr Gly Glu Pro Tyr Thr Cys Phe Leu Lys Glu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Met Met Tyr Met Pro Asp Ala Ile Arg Ala Thr 210 215 220 Ile Glu Leu Met Glu Ala Pro Ala Asp Lys Leu Ser Glu Arg Gly Ser 225 230 235 240 Tyr Asn Ile Ala Gly Met Ser Phe Thr Pro Ala Gln Ile Ala Ala Ala 245 250 255 Ile Arg Glu Gln Val Pro Gly Phe Gln Ile Arg Tyr Glu Pro Asp Tyr 260 265 270 Arg Gln Ala Ile Ala Gln Gly Trp Pro Asp Ser Ile Asp Asp Ser Val 275 280 285 Ala Arg Ala Asp Trp Gly Trp Lys Ala Gln Tyr Gly Leu Lys Glu Met 290 295 300 Val Ala Asp Met Leu Ala Asn Leu Lys Ala Thr Leu Ala Gly 305 310 315 <210> 2 <211> 957 <212> DNA <213> Cupriavidus necator <400> 2 atggaagctg gcaaaccgaa gatcctgatt gtcggcgcca acggccagat cgggtctgaa 60 ctggcactgg cgctggccga gcgctacggg cgcaccaacg tgatcacctc cgacgtggtg 120 cccaccggcc gccatgtgca tctgacgcac gagatgctca acgccaccga ccgcggcgag 180 ctggccaccg tggtcgagcg ccatggcatc acccaggtct acctgctggc cgccgcgctg 240 tccgccaccg gcgaaaaggc gccacagtgg gcctggaacc tcaatatgac cagcctgctc 300 aatgtgctgg agctggcgcg gcagaccggg ctggagcggg tgttctggcc aagctcgatt 360 gcagccttcg gcccgaccac gcctgccgga cagacaccgc agaagaccgt gatggagccc 420 accacggtct acggcatctc caagcaggcg ggcgagggtt ggtgccgctg gtatcacgcc 480 aaccacggcg tggatgtgcg cagcgtgcgc tatccgggcc tgatctcgca caagacgcca 540 cccggcggcg gcaccaccga ctatgcggtc gacatcttcc atgcggcggt gacgggcgag 600 ccctacacct gcttcctgaa ggaagacgaa gccctgccga tgatgtatat gcccgatgcg 660 atccgcgcca ccatcgaact gatggaagcc ccggcggaca agctgagcga gcgcggcagc 720 tacaacatcg ccggcatgag cttcacgccc gcgcagatcg ccgcggccat ccgcgagcag 780 gtgccgggct tccagatccg ctatgaaccc gactatcgcc aggcgattgc gcagggctgg 840 ccggattcga tcgatgattc ggtcgcgcgc gcggactggg ggtggaaggc ccagtatgga 900 ctgaaggaga tggtcgcgga catgcttgcc aacctgaagg ccacgctggc gggctga 957 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 atggargcng gnaarccnaa r 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 raadatrtcn acngcrtart c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 5 gttgagcatc tcgtgcgtca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 6 acggtctacg gcatctccaa 20 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 7 gaattcatat ggaagctggc aaaccgaag 29 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 8 agtatggatc ctcagcccgc cagcgtggcc t 31

Claims

피검체를 함유하는 샘플과 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소 또는 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질 및 보효소 NAD⁺를 혼합하고, 소정 시간 후에 NADH량 또는 2-아미노-3-옥소부티르산량을 분석하는, 피검체에 포함되는 L-트레오닌의 분석 방법:
(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;
(2) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 30개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열;
(3) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
제1항에 있어서, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)가 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504인 분석 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, NADH량의 분석을 340 ㎚에서의 흡광도(A₃₄₀) 측정, 색소 생성, 또는 형광으로의 변환에 의해 행하는 분석 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 2-아미노-3-옥소부티르산량의 분석은, 2-아미노-3-옥소부티르산으로부터 생성하는 아미노아세톤을 모노아민옥시다아제에 의해 산화하여, 생성되는 암모니아 또는 과산화수소를 측정함으로써 행해지는 분석 방법.
쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소.
제5항에 있어서, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)가 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504인 L-트레오닌 탈수소효소.
하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질:
(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;
(2) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 30개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열;
(3) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
이하의 물성 및 성질을 갖는 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)유래의 L-트레오닌 탈수소효소:
분자량(SDS-PAGE): 79,400
서브유닛 분자량(SDS-PAGE): 37,200
최적 pH: 10.0
최적 온도: 75℃
기질 특이성: L-트레오닌에만 활성을 나타냄
보효소: NAD⁺(NADP⁺에는 불활성)
저해제: 요오도아세트아미드, PMS, NEM으로 저해됨
제7항에 기재된 단백질을 코드하는 유전자.
제6항에 기재된 유전자를 탑재한 벡터인 재조합 벡터.
숙주 세포를 제9항에 기재된 유전자 또는 제10항에 기재된 재조합 벡터로 형질전환시킨 형질전환체.
제9항에 기재된 유전자를 벡터 상에 탑재하고, 이 벡터에 의해서 숙주 세포를 형질전환한 후, 형질전환시킨 숙주 세포를 배양하여 배양물 중에 상기 유전자가 코드하는 단백질을 축적하고, 축적한 단백질을 수집하는 것을 포함하는, L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질의 생산 방법.
이하의 (A) 및 (B)를 포함하는 L-트레오닌 분석용 키트:
(A) 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소 또는 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질, 및
(B) 보효소 NAD⁺:
(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;
(2) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 30개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열;
(3) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
제13항에 있어서, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)가 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504인 키트.
제14항에 있어서, NADH량 분석용의 색소 및/또는 효소를 더 포함하는 키트.
쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소 또는 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 완충액 중에 함유시킨 것인, L-트레오닌 분석용 효소 제제:
(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;
(2) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 30개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열;
(3) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
제16항에 있어서, 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)가 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) NBRC 102504인 효소 제제.
쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 유래의 L-트레오닌 탈수소효소 또는 하기 (1)∼(3)의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 또한 L-트레오닌 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 검출용 전극에 직접 또는 간접적으로 고정화 또는 배치한 것인 것을 특징으로 하는 L-트레오닌 정량에 이용하기 위한 효소 센서:
(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열;
(2) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 30개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열;
(3) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.