JP2013153674A - 新規l−アミノ酸オキシダーゼ、l−リジンの測定方法、キット及び酵素センサ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】所定のアミノ酸変異を有し、かつL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有する変異型L-アミノ酸オキシダーゼ、並びにこの変異型酵素を利用したL-リジンの測定方法、L-リジン測定用キット及び酵素センサ。
【選択図】なし
Description
〔1〕
下記の(1)から(3)の何れかに記載のタンパク質:
(1)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第254番目のシステインがメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン又はプロリンで置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質;
(2)上記(1)に規定されるタンパク質において上記第254番目のアミノ酸を除く領域中に1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質;または
(3)上記(1)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも67%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質、但し、該タンパク質のアミノ酸配列において上記第254番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は変異しないものとする。
〔2〕
上記254番目のアミノ酸がメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はセリンである、〔1〕に記載のタンパク質。
〔3〕
上記254番目のアミノ酸がイソロイシン又はチロシンである、〔1〕又は〔2〕に記載のタンパク質。
〔4〕
上記(2)又は(3)に規定されるタンパク質において、該タンパク質のL-リジンに対するオキシダーゼ活性を100%とした場合、上記タンパク質のL-アルギニンに対するオキシダーゼ活性が15%以下であり、かつL-オルニチンに対するオキシダーゼ活性が80%以下である、〔1〕から〔3〕の何れかに記載のタンパク質。
〔5〕
〔1〕から〔4〕の何れかに記載のタンパク質をコードする核酸。
〔6〕
〔5〕に記載の核酸を含む、ベクター。
〔7〕
〔6〕に記載のベクターにより形質転換された、形質転換体。
〔8〕
以下の工程を含む、L-リジンを検出又は定量する方法:
(A)水と酸素の存在下で、検体と〔1〕から〔4〕の何れかに記載のタンパク質とを保持する工程;及び
(B)上記タンパク質のL-リジンに対するオキシダーゼ活性の作用により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを検出又は定量する工程
を含む、上記方法。
〔9〕
工程(B)において検出又は定量する反応生成物が過酸化水素である、〔8〕に記載の方法。
〔10〕
上記過酸化水素を、ペルオキシダーゼを用いて検出又は定量する、〔9〕に記載の方法。
〔11〕
工程(B)において検出又は定量する反応生成物がアンモニアである、〔8〕に記載の方法。
〔12〕
アンモニアを、アンモニア検出試薬を用いて検出又は定量する、〔11〕に記載の方法。
〔13〕
工程(B)において検出又は定量する反応生成物がL-リジンの脱アミノ化生成物である、〔8〕に記載の方法。
〔14〕
〔1〕から〔4〕の何れかに記載のタンパク質を含む、L-リジンの検出又は定量用キット。
〔15〕
反応用緩衝液、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬、及びL-リジンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つをさらに含む、〔14〕に記載のキット。
〔16〕
過酸化水素検出用電極を含む、L-リジンの検出又は定量用酵素センサであって、
上記過酸化水素検出用電極の表面又は近傍に〔1〕から〔4〕の何れかに記載のタンパク質が配置してなる、上記センサ。
〔17〕
上記過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極又は隔膜式過酸化水素電極である、〔16〕に記載のセンサ。
本発明は、下記の(1)から(3)の何れかに記載のタンパク質に関する。
(1)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第254番目のシステインがメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン又はプロリンで置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質;
(2)上記(1)に規定されるタンパク質において上記第254番目のアミノ酸を除く領域中に1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質;または
(3)上記(1)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも67%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質、但し、該タンパク質のアミノ酸配列において上記第254番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は変異しないものとする。
野生型酵素のアミノ酸配列、本発明のタンパク質である変異型酵素C254Iのアミノ酸配列、並びに表1に示す既知遺伝子のアミノ酸配列についてアライメント解析を行った結果を図4及び5に示す。図4において、矢印で示される位置のアミノ酸が上記254番目のアミノ酸に対応するアミノ酸である。図4に示される通り、上記野生型酵素と同様に表1に示される既知遺伝子も上記254番目のアミノ酸に対応するアミノ酸はシステインである。本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、これら既知遺伝子の配列に基づいて設計してもよいし、その他公知のホモログ遺伝子の配列情報に基づいて設計してもよい。
本発明のL-リジンの定量方法は、以下の通りである。
以下の工程を含む、L-リジンを検出又は定量する方法:
(A)水と酸素の存在下で、検体と本発明のタンパク質とを保持する工程;及び
(B)上記タンパク質のL-リジンに対するオキシダーゼ活性の作用により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを検出又は定量する工程
を含む、上記方法。
工程(A)における本発明のタンパク質の混合量は、10 mU/ml(リジン1μmolを1分間で消費する活性を示す酵素量を1 Uとする)以上とすることが適当であり、水の混合量は、サンプル中のリジン濃度に応じて適宜決定できるが、例えば、5〜95%の範囲とすることができる。本発明のタンパク質の混合量の上限は特にないが、実用的には、例えば、100 mU/ml以下であることができる。しかし、本発明のタンパク質の混合量および水の混合量は、この範囲に限定する意図ではなく、適宜調整できる。
工程(B)では、工程(A)における上記保持後の反応液中に存在する、本発明のタンパク質の作用による反応生成物の少なくとも一種を検出又は定量する。
検出又は定量に用いられる生成物が過酸化水素である場合、例えばペルオキシダーゼ反応を用いて測定する方法等の公知の方法により、過酸化水素を検出又は定量することが出来る。ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する場合、使用可能なペルオキシダーゼは過酸化水素の検出又は定量に利用可能な酵素であればよく、例えば西洋わさび由来ペルオキシダーゼが挙げられる。また、使用するペルオキシダーゼの基質となり得るものであれば発色剤として使用可能であり、西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる場合には4-アミノアンチピリン:フェノールなどが挙げられる。西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる過酸化水素の検出又は定量のための反応は以下に示す通りである。
さらに、本発明は、本発明の上記タンパク質を含む、L-リジンの検出又は定量用キットを包含する。
本発明は、過酸化水素検出用電極を含む、L−リジンの検出又は定量用酵素センサであって、上記過酸化水素検出用電極の表面又は近傍に本発明のタンパク質が配置してなる、上記センサをも包含する
L-アミノ酸オキシダーゼ活性は、L-アミノ酸の酸化で生成される過酸化水素量を、表2の発色液を用いて比色法で求めた。マイクロプレートを用いる活性測定は、発色液100μLに表3に示すアミノ酸の100mM溶液100μLおよび50μLの酵素液を加えて、氷上で分注した後30℃で0、0.5、1、1.5、2、3、4、5時間反応し、マイクロプレートリーダーで550nmの吸光度を測定した。L-アミノ酸オキシダーゼ活性の基質は、表3に示した20種類のアミノ酸(100mM溶液)を用い、ブランクでは、基質の代わりに100mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)を添加した。
活性値(U/ml)={ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank)×3.1(ml)×希釈倍率}/{13×1.0(cm)×0.1(ml)}
3.1(ml):全液量
13:ミリモル吸光係数
1.0cm:セルの光路長
0.1(ml):酵素サンプル液量
(i)シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H-8-1-3株の培養法
シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)H8-1-3株を、前培養として5mlのTGY培地(0.5%ポリペプトン、0.5%イースト抽出物、0.1%KH2PO4、0.1%D-グルコース、pH 7.0)に植菌し、30℃、200rpmで12時間培養した。その後、500mlのTGY培地を含む2Lの坂口フラスコに植菌し、30℃、96rpmで48時間培養した。培養後、5000 x g、20分間遠心分離し、菌体を得た。
5mLのTGY培地でH8-1-3株を前培養(200rpm、30℃、12時間)して、前培養液を500mLのTGY培地に植菌し、2L坂口フラスコを用いて、30℃で2日間振とう培養(96rpm)した(全量20L)。大型遠心機で集菌し(5,000rpm、10分間、4℃)、生理食塩水(0.9% NaCl)で洗浄した後、培地5L分の菌体を100mLの20mM リン酸緩衝液(pH 7.0)(KPB)に懸濁した。100mLの菌体液を15分間超音波処理し、遠心分離(8,000rpm、20分間、4℃)で得られた上清を無細胞抽出液とした。
無細胞抽出液に、プロタミン硫酸ナトリウムを0.5%加え、30分間攪伴した後、大型遠心機で分離して(3,000rpm、10分間、4℃)、上清を得た。
除核酸処理をした無細胞抽出液を氷中にてスターラーで撹拌しながら、30%飽和となるように粉末状硫安を少しずつ加えた。30分間撹拌した後、遠心分離した(8,000rpm、10分間、4℃)。上清を氷中で撹拌しながら、60%飽和となるように粉末状硫安を加え、30分間撹拌した後、遠心分離した。同様に、90%飽和となるように粉末状硫安を加え、遠心分離した。各画分で得られた沈殿(0−30%画分、30−60%画分及び60−90%画分)を10mlの20mM KPB(pH 7.0)に懸濁し、5Lの同緩衝液(×3回)で、1晩透析を行った。
20mM KPBにより平衡化したDEAE-トヨパール樹脂15mlをカラムに充填し、透析した30-60%画分の酵素液を吸着させた。100mLの20mM KPBでカラムを洗浄した後、20mM KPB 200ml及び500mM NaClを含む20mM KPB 200mlを用いて、グラジエントによりNaCl濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、15mLずつ試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集め、同緩衝液により1晩透析した。
20mM リン酸緩衝液により平衡化したGIGA-PITE樹脂5mlをカラムに充填し、酵素液を吸着させた。50mLの20mM KPBでカラムを洗浄した後、20mM KPB 50ml及び500mM KPB 200mlを用いて、グラジエントによりKPB濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。活性が確認された非吸着画分を5Lの同緩衝液(x3回)で、1晩透析を行った。
中圧高速液体クロマトグラフィー(FPLC、カラム:20mM KPBで平衡化したMonoQ HR 10/100カラム)を用いた。サンプルループに限外ろ過(セントリコンチューブ)により濃縮した酵素液200μLを注入し、20mM KPB及び0.5mM NaClを含む20mM KPBの2つの溶媒を用いて、FPLCのグラジエントシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション(0.5mL)の活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。透析した後、セントリコンを用いて酵素液を200μLまで濃縮した。
中圧高速液体クロマトグラフィー(FPLC、カラム:150mM NaClを含む20mM KPBで平衡化したSuperdex 200 10/30カラムを用いた。サンプルループに酵素液200μLを注入し、150mM NaClを含む20mM KPBの溶媒を用いて、FPLCのシステムにより酵素を溶出させた。活性が認められたフラクションを集め1晩透析した。
各精製ステップのタンパク質量と酵素活性を表4に示した。
泳動ゲルとして、36%アクリルアミド 5.25ml、0.68M トリス‐HCL緩衝液(pH 8.8)8.25mL、1% SDS 1.58mL、10% TEMED 187μL、2% APS562.5μL組成のゲルに36% ポリアクリルアミド 0.5mL、0.179 M トリス-HCl(pH 6.8)3.5mL、1% SDS 0.5mL、10% TEMED 125μL、2% APS 375μL組成の濃縮ゲルを重層したものを用い、緩衝液(グリセロール200μL、1M トリス-HCl(pH 8.0)40μL、水360μL、2-メルカプトエタノール200μL及び10% SDS 200μL)と等量混合した精製酵素サンプル10μLをランニング緩衝液(トリス3.0g、グリシン 14.1g及びSDS 10g)中、30mAで電気泳動を行い、その後、1時間タンパク染色液(CBB 2.5g、メタノール 500mL、酢酸 50mL及び水450mL)で染色し、脱色液(メタノール:酢酸:水=3:1:6)でバンドが鮮明になるまで脱色した。
図2にシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H8-1-3株由来L-アミノ酸オキシダーゼ(野生型酵素)のSDS-PAGEの写真を示した。
精製したシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株由来L-アミノ酸オキシダーゼをEdman分解法によりN末端側から8残基決定した。
(i)シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株の染色体DNAの抽出
シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株をTGY培地3mLに植菌し、30℃、200rpmで、12時間培養した。培養液1mLから菌体を遠心分離して(15,000rpm、5分間、4℃)、集菌した。STE緩衝液(NaCl 0.58g、1Mトリス-HCl(pH 8.0)1mL及び0.5M EDTA(pH8.0)200μLを水で100mLに定量したもの)1mLで洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。68℃で、15分間加熱した後、遠心分離し(15,000rpm、5分間、4℃)、上清を除き、リゾチーム-RNase液(リゾチーム 5mg、10mg/mL RNase 10mLを1液:グルコース0.9g、1Mトリス-HCl(pH8.0)2.5 ml、0.5M EDTA(pH8.0)2mLを超純水で100mLに定量したもの1mLで溶解したもの)300μLに懸濁した。37℃で30分間インキュベートした後、プロテイナーゼK液 (プロテイナーゼK 10mg/1液1mL)6μLを加え、穏やかに混合し、37℃で10分間インキュベートした。N-ラウロイルザリコシン3mgを加えて、穏やかに混合した後、37℃で3時間インキュベートし、フェノール-クロロホルム処理を穏やかに2回行った。上清300μLに5M NaCl溶液10μLとエタノール600μLを加えて混合した後、遠心分離した(15,000rpm、10分間、4℃)。70%エタノールで洗浄した後、風乾し、TE緩衝液100μLに溶解し、目的とする染色体DNAを得た。
PCR反応液の組成は,水35μL、10×Ex Taq buffer 5μL、2mM dNTP 5μL、100pmolプライマー1(5’-ATGAACAANAANAACCGCCACCCSGCCGAC-3’)(配列番号17)1μL、100pmolプライマー2(5’-TCARTCYGCCAGGGCGATYGGSCCGATYTC-3’) (配列番号18)1μL、鋳型DNA2μL及びEx Taq 1μLとした。PCR反応の条件は、(i)98℃で5分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)60℃で4分間及び(ii)までを31サイクルとした。増幅した遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子をVIOGENE(USA)社のGel-Mゲル抽出キットを用いて抽出した。
遺伝子の両方の鎖についてシーケンシングを行うため、プライマー1、プライマー2、プライマー3(5’- AGCACGGTAATCGATCTGGA-3’) (配列番号19)及び、プライマー4(5’- CATCGAGTGCCAGTTGCACG-3’) (配列番号20)を用いてシーケンス反応を行った。反応液組成は、1.6μLの各プライマー、1.6μLの鋳型DNA、1μLのBigDyeプレミックスソリューション、1.6μLの5xBigDye シーケンシングバッファーと2.8μLの滅菌水とし、全量10μLとした。PCR反応の条件は、(i)96℃で2分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)60℃で4分間、(v)(ii)〜(iv)を25回及び(vi)72℃で5分間とした。PCR産物に、1μLの3M 酢酸ナトリウム(pH 5.2)、1μLの0.125M EDTAと25μLのエタノールを加え、室温で15分間放置した後、遠心分離により(15,000rpm、8分間、4℃)、沈殿させた。上清を廃棄した後、10μLの Hi Di Formamideを加え、100℃で5分間加熱した後に、氷水で急冷したものをABI PRISM 310 Genetic Analyzerで塩基配列の解読をした。得られたシーケンスデータの解析はGenetyxで行い、それぞれのプライマーで増幅した断片の塩基配列を連結した。図3に、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株由来L-アミノ酸オキシダーゼ(野生型酵素)の塩基配列から予測される1次構造を示した。
ライゲーション反応の組成は、PCR産物 5μL、pT7 Blue T-Vecter (Novagen)1μL、ライゲーションミックス(Takara)6μLとし、16℃で30分間反応させた。大腸菌(E.coli JM 109)のコンピテントセル100μLに12μLのライゲーション反応液を加え、ヒートショック法で形質転換を行った。80μg/mLのアンピシリンを含むLB培地(1.0% ポリペプトン、0.5%イースト抽出物及び1.0% NaCl)に生育したコロニーを数株選抜してプラスミド抽出し、0.7%アガロース電気泳動により、インサートの有無の確認を行った。
(i)シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株由来L-アミノ酸オキシダーゼ酵素遺伝子の増幅
上記クローニングで得られたプラスミドを鋳型DNAとし、PCRを行った。PCR反応液の組成は、水35μL、10×Ex Taq buffer 5μL、2mM dNTP 5μL、100pmol/μL プライマー5(5’- TATAATCATATGAACAAGAACAACCGCCA-3’) (配列番号21)1μL、100 pmol/μLプライマー6 (5’- TATTACTCGAGTCAGTCCGCCAGGGCGATTG-3’) (配列番号22)1μL、鋳型DNA 100ng及びEx Taq 5unitとした。プライマー5およびプライマー6にはそれぞれNdeIおよびXhoIの制限酵素サイトを設けた。PCR反応の条件は、(i)98℃で5分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)60℃で4分間及び(ii)までを31サイクルとした。
PCR反応で得られた、PCR産物5μLに、1μL NdeIと1μL XhoIを加え、37℃で1時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。ライゲーション反応は、5μL DNA、1μL pET15b(増幅遺伝子と同様の制限酵素処理を行ったもの)、6μLライゲーションMixとし、16℃で30分間インキュベートした。得られたライゲーション反応液全量を、ヒートショック法により、大腸菌(E. coli BL21)に導入した。尚、本組換え大腸菌が生成するL-アミノ酸オキシダーゼは、N末端側に6×ヒスチジン・タグが付加した融合タンパクとして生成されるように発現用プラスミドを構築した。
80μg/mLのアンピシリンを含む4LのLB培地(1.0% ポリペプトン、0.5% イースト抽出物、1.0% NaCl、pH 7.0)に組換え大腸菌(BL21)を植菌し、37℃で12時間培養後、0.5mM IPTGを添加して引き続き30℃で12時間培養してL-アミノ酸オキシダーゼを誘導した。大型遠心機で集菌し(5,000rpm、10分間、4℃)、生理食塩水(0.9% NaCl)で洗浄した後、100mLの20mM リン酸緩衝液(pH 7.0)(KPB)に懸濁した。100mLの菌体液を15分間超音波処理し、遠心分離(8,000rpm、20分間、4℃)で得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液を20mM KPBで置換したNi-Sepharoseカラムに吸着させ、20mM KPBでカラムを洗浄後、500mM イミダゾールを含む20mM KPBで酵素液を溶出させた。
精製酵素標品の酵素活性を、表3におけるアミノ酸をそれぞれ単独に含有する測定試薬にて測定し、本酵素標品が以下の性質を有するものであることを確認した:
(a)L-リジン、L-アルギニン、L-オルニチンを基質とする(表5)。これら以外のタンパク質構成アミノ酸(L-チロシン、L-アラニン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-メチオニン、L-アスパラギン、L-プロリン、L-グルタミン、L-アルギニン、L-セリン、L-スレオニン、L-バリン)に対してはL-アミノ酸オキシダーゼは活性を示さなかった。
上記(8)(iii)にて精製した、N末端側にヒスチジン・タグが付加されたL−アミノ酸オキシダーゼ標品を用いて、上述のL−リジン測定用試薬組成物を調製した。本試薬組成物を用い、L−リジン測定を実施した。検体としては、1〜6mMのL−リジン水溶液を調製した。
結果として、L−リジン水溶液を検体とした場合には反応性が認められ、L−リジン濃度と測定データは良好な正の相関を示した(図7参照)。
以下の手順に従い、上記L−アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列において第254番目のシステインの飽和変異を行うことにより、L-リジンに対する基質特異性の高いオキシダーゼ活性を有する変異型L−アミノ酸オキシダーゼを作製した。
結果として、L−リジン水溶液を検体とした場合には反応性が認められ、L−リジン濃度と測定データは良好な正の相関を示した(図10参照)。
上記変異型酵素C254Iについて、L-リジン、L-オルニチン、又はL-アルギニンを添加したヒト血漿サンプルを用いてオキシダーゼ活性の測定を行った。ヒト血漿として、アミコンウルトラ-0.5(UFC501096、Millipore)を用い、16,100 xg、4℃、30分間の遠心分離により除蛋白液を調製した。調製したヒト血漿に、最終濃度0、5、10、15、20、25、30、35、40、45μMとなるようにL-リジン、L-オルニチン、又はL-アルギニンを添加し、血漿サンプルとした。測定試薬の組成及び測定方法は、上記(1)及び(2)に示す通りであり、反応条件はpH7.0、及び30℃とした。結果を図14に示す。なお、比較の対象として野生型酵素についても同様にヒト血漿サンプルを用いてオキシダーゼ活性の測定を行った。その結果を図13に示す。
Claims (17)
- 下記の(1)から(3)の何れかに記載のタンパク質:
(1)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第254番目のシステインがメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン又はプロリンで置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質;
(2)上記(1)に規定されるタンパク質において上記第254番目のアミノ酸を除く領域中に1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質;または
(3)上記(1)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも67%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸オキシダーゼと比較してL-リジンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するタンパク質、但し、該タンパク質のアミノ酸配列において上記第254番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は変異しないものとする。 - 上記254番目のアミノ酸がメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はセリンである、請求項1に記載のタンパク質。
- 上記254番目のアミノ酸がイソロイシン又はチロシンである、請求項1又は2に記載のタンパク質。
- 上記(2)又は(3)に規定されるタンパク質において、該タンパク質のL-リジンに対するオキシダーゼ活性を100%とした場合、上記タンパク質のL-アルギニンに対するオキシダーゼ活性が15%以下であり、かつL-オルニチンに対するオキシダーゼ活性が80%以下である、請求項1から3の何れか1項に記載のタンパク質。
- 請求項1から4の何れか1項に記載のタンパク質をコードする核酸。
- 請求項5に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項6に記載のベクターにより形質転換された、形質転換体。
- 以下の工程を含む、L-リジンを検出又は定量する方法:
(A)水と酸素の存在下で、検体と請求項1から4の何れか1項に記載のタンパク質とを保持する工程;及び
(B)上記タンパク質のL-リジンに対するオキシダーゼ活性の作用により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを検出又は定量する工程
を含む、上記方法。 - 工程(B)において検出又は定量する反応生成物が過酸化水素である、請求項8に記載の方法。
- 上記過酸化水素を、ペルオキシダーゼを用いて検出又は定量する、請求項9に記載の方法。
- 工程(B)において検出又は定量する反応生成物がアンモニアである、請求項8に記載の方法。
- アンモニアを、アンモニア検出試薬を用いて検出又は定量する、請求項11に記載の方法。
- 工程(B)において検出又は定量する反応生成物がL-リジンの脱アミノ化生成物である、請求項8に記載の方法。
- 請求項1から4の何れか1項に記載のタンパク質を含む、L-リジンの検出又は定量用キット。
- 反応用緩衝液、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬、及びL-リジンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つをさらに含む、請求項14に記載のキット。
- 過酸化水素検出用電極を含む、L-リジンの検出又は定量用酵素センサであって、
上記過酸化水素検出用電極の表面又は近傍に請求項1から4の何れか1項に記載のタンパク質が配置してなる、上記センサ。 - 上記過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極又は隔膜式過酸化水素電極である、請求項16に記載のセンサ。
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