WO2013065763A1 - 幹細胞の培養方法 - Google Patents

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芳樹 笹井
英隆 須賀
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    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing differentiation in vitro from an embryoid body comprising a central nervous tissue and a non-neural ectoderm tissue from a stem cell.
  • the present invention relates to a method of inducing differentiation of a pituitary progenitor tissue and various pituitary hormone-producing cells in vitro as a central nervous tissue.
  • Non-patent Documents 1-4 and 1-3 several culture methods for inducing neural differentiation from pluripotent stem cells such as ES cells have been known (Non-patent Documents 1-4 and 1-3).
  • the present inventors have previously shown that dispersion suspension culture (SFEB method) in a serum-free medium is effective as a method for inducing neural differentiation from pluripotent stem cells such as animal and human ES cells. (See Non-Patent Documents 3 and 4 and Patent Document 1).
  • the present inventors formed uniform stem cell aggregates in a serum-free medium, and suspended the aggregates from pluripotent stem cells such as ES cells from cerebral cortical tissues and hypothalamus.
  • a method (SFEBq method) has been found that can efficiently induce differentiation of neurons and their progenitor cells (Non-patent Document 5 and Patent Document 3).
  • the pituitary gland and sensory organs are derived from placodes formed in the non-neural ectoderm tissue of the head facing the neural plate. It is known to occur through cell differentiation and morphogenesis.
  • the pituitary gland is an endocrine organ that produces and secretes many hormones.
  • the pituitary gland is largely divided into an adenohypophysis and a neurohypophysis (also referred to as the posterior pituitary gland).
  • the glandular pituitary gland is further divided into an anterior pituitary gland and an intermediate pituitary gland (intermediate part). Divided into two.
  • the glandular pituitary gland contains multiple types of cells that produce and secrete pituitary hormones.
  • This glandular pituitary gland is derived from a Ratoke pouch that is caused by invagination of the primitive oral cavity.
  • the anterior pituitary primordia are formed as placodes in the head non-neural ectoderm (rostral non-neural ectoderm) adjacent to the rostral side of the anterior neural plate boundary.
  • the cord invades to form a ratchet sac.
  • Ratoke sac is then separated from the ectoderm and becomes an epithelial microcyst.
  • the anterior wall of this small cyst becomes the anterior pituitary and the posterior wall becomes the pituitary midlobe.
  • the neural pituitary gland (posterior pituitary gland) is formed by a process at the bottom of the third ventricle.
  • axons from neurosecretory neuron cell bodies in the hypothalamus and paraventricular nucleus of the hypothalamus extend, and hormones (oxytocin and vasopressin) are axonal transported.
  • Non-Patent Document 6 Previous studies have shown that the interaction between the rostral hypothalamus and the rostral non-neural ectoderm is required for the induction of Ratoke sac at the developmental stage (Non-Patent Document 6).
  • the present invention provides a method for inducing differentiation in vitro of an embryonic body (hereinafter also referred to as an “aggregate”) comprising a central nervous tissue and a non-neural ectoderm tissue from a stem cell. For the purpose. It is another object of the present invention to provide a method for efficiently inducing differentiation in vitro into pituitary progenitor tissue and pituitary hormone-producing cells, particularly as a central nervous tissue.
  • the manufacturing method of the aggregate which becomes.
  • the hypothalamic tissue and head non-neural ectoderm are rostral hypothalamic tissue and rostral non-neural ectoderm tissue which is a sheet-like continuous epithelium.
  • the manufacturing method of crab [7] The production method according to [6], wherein the rostral hypothalamic tissue is Rx positive.
  • the serum-free medium is a serum-free medium substantially free of a Nodal signal promoter, a Wnt signal promoter, an FGF signal promoter, a BMP signal promoter, retinoic acid and insulins.
  • the manufacturing method as described.
  • the production method according to any one of [1] to [10], wherein the aggregate comprising both the hypothalamic tissue and the head non-neural ectoderm further comprises Lim3 positive cells.
  • the production method according to [11] wherein the Lim3-positive cells form epithelial microcysts in the aggregate.
  • a method for producing adrenocorticotropic hormone-producing cells which further comprises a step of suspension culture in 1.
  • a method for improving deficiency of adrenocorticotropic hormone secretion in a subject comprising transplanting the adrenocorticotropic hormone-producing cell produced by the method according to [16] or [17] to the subject.
  • An aggregate comprising both the hypothalamic tissue and the head non-neural ectoderm produced by the method according to any one of [1] to [15] is further added in a serum-free medium containing glucocorticoid.
  • a method for producing growth hormone-producing cells comprising a step of suspension culture.
  • a serum-free medium containing a GSK3 ⁇ inhibitor before or simultaneously with the suspension culture of the aggregate comprising both the hypothalamic tissue and the non-neural ectoderm of the head in a serum-free medium containing glucocorticoid The method for producing a growth hormone-producing cell according to [19] or [20], comprising a step of suspension culture in the method.
  • a method for improving growth hormone secretion failure in a subject comprising transplanting the growth hormone-producing cells produced by the method according to any one of [19] to [22] into the subject.
  • the aggregate comprising both the hypothalamic tissue and non-neural ectoderm produced by the method according to any one of [1] to [15] is further suspended in a serum-free medium containing estrogen.
  • a method for producing prolactin-producing cells comprising a step of culturing.
  • the production method according to [24] wherein the serum-free medium further contains insulin.
  • [29] culturing stromal cells in a serum-free medium with an aggregate comprising both the hypothalamic tissue and non-neural ectoderm produced by the production method of any one of [1] to [15]
  • a method for producing follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone and / or thyroid-stimulating hormone-producing cells which further comprises a step of suspension culture in a conditioned medium of stromal cells obtained by the above.
  • the production method of [29], wherein the stromal cell is a PA6 cell.
  • a method for improving the secretion of hormone or thyroid stimulating hormone including both a central nervous tissue and a head non-neuronal ectoderm tissue, comprising a step of forming an aggregate of stem cells in a serum-free medium, and a step of subjecting the formed aggregate to suspension culture in a serum-free medium The manufacturing method of the aggregate which consists of these.
  • pluripotent stem cells such as ES cells, central nervous tissue and non-neuronal ectoderm tissue, specifically rostral hypothalamus tissue and rostral temporal head that is a sheet-like continuous epithelium.
  • pluripotent stem cells such as ES cells, central nervous tissue and non-neuronal ectoderm tissue, specifically rostral hypothalamus tissue and rostral temporal head that is a sheet-like continuous epithelium.
  • Aggregates and pituitary progenitor tissues containing ectodermal tissues can be induced to differentiate in vitro, and various pituitary hormone-producing cells can be induced to differentiate.
  • the pituitary gland is a central endocrine organ that produces and secretes many hormones, and abnormal hormone secretion has a significant effect on the body.
  • the aggregate, pituitary progenitor tissue and pituitary hormone-producing cells obtained by the method of the present invention are used for the treatment of diseases caused by pituitary hormone secretion failure or diseases causing pituitary hormone secretion failure. can do.
  • FIG. 1 a is a schematic diagram (sagittal section) showing the occurrence of pituitary gland in a living body.
  • FIG. 1b is a diagram showing gene expression in rat sac and adjacent ventral hypothalamic tissues in vivo (E13) (hypothalamic marker Rx: green; head non-neural ectoderm marker Pitx1: red).
  • FIG. 1c shows the expression level of Pitx2 in ESCs cultured in SFEBq / gfCDM (3000 cells / aggregate). Pitx2 expression was hardly observed.
  • FIG. 1 a is a schematic diagram (sagittal section) showing the occurrence of pituitary gland in a living body.
  • FIG. 1b is a diagram showing gene expression in rat sac and adjacent ventral hypothalamic tissues in vivo (E13) (hypothalamic marker Rx: green; head non-neural ectoderm marker Pitx1: red).
  • FIG. 1c shows the expression level
  • FIG. 1d shows that Pitx2 expression of ESCs cultured in SFEBq / CDM was increased under large cell-aggregation (LCA; starting with 10000 cells / aggregate) conditions (red) or with BMP4 treatment (blue).
  • FIGS. 1e and f are diagrams showing expression of Pitx1 (red) and Rx (green) in aggregates obtained by seeding mouse ES cells at a high concentration (LCA condition) and culturing by SFEBq / gfCDM method. It is.
  • FIG. 1g is a schematic diagram of FIG. 1f.
  • FIG. 1h shows that the Rx + tissue is Chx10 ⁇ / Nestin + .
  • FIG. 1i is a graph showing the influence of the addition timing of the Shh signal promoter SAG on the expression level of Lim3 mRNA.
  • FIG. 1 j is the result of FACS analysis showing lim3 :: venus + population (green) in SAG-treated LCA aggregates.
  • FIG. 1k shows a comparison of lim3 expression in aggregates without SAG treatment (left) and with SAG treatment (right). Scale bar: 100 ⁇ m (b, e, f); 50 ⁇ m (h); 500 ⁇ m (k).
  • FIG. 2a is a diagram showing clusters of lim3 positive cells in aggregates on the 13th day of culture with SAG treatment.
  • FIG. 1i is a graph showing the influence of the addition timing of the Shh signal promoter SAG on the expression level of Lim3 mRNA.
  • FIG. 1 j is the result of FACS analysis showing lim3 :: venus + population (green) in SAG-treated LCA aggregates.
  • FIG. 1k shows
  • FIG. 2b shows that Lim3 positive cells in the aggregate do not express Tuj1 which is a neuronal marker (Lim3 (green), Tuj1 (red), Pitx1 (white)).
  • FIG. 2c shows that Brachyury, a mesoderm marker, is hardly expressed in aggregates.
  • FIGS. 2d-f show how the lim3 positive cells in the aggregates form a ratchetocyst-like microcyst (days 8-12).
  • FIG. 2g-j shows the expression of SAG-treated microcysts and the surrounding marker genes (Pitx1 (red), lim3 (green, g; white, h; red, j)), pancytokeratin (green) H), Rx (green, i, j)).
  • FIG. 21 is a schematic diagram showing expression of marker genes in the small cysts and their surroundings.
  • FIG. 21 is a diagram showing the expression of Ratoke sacs and surrounding Pitx1 (red) and aPKC (green) (apical markers) in vivo.
  • 2m and n are electron micrographs of microcysts. Tall epithelial cells (m, apex, upper), basal exfoliated cells (m, square brackets), apicia (n, arrowhead), apical junction (n, arrow).
  • FIG. 2o is a diagram showing Islet1-positive cells on the basal side of microcysts (Lim3 (green), Isl1 (red)).
  • FIG. 3a shows the differentiation of each pituitary hormone-producing cell.
  • FIG. 3b shows that Tbx19 expression is enhanced by DAPT treatment of pituitary progenitor tissue obtained by SAG treatment (day 20) (DAPT treatment (day 18-19) / BIO treatment (day 16-18). Eye)).
  • FIG. 3c shows the percentage of ACTH + cells in non-neural (N-cad ⁇ ) cells on day 22 (DAPT treatment (18-19 days) / BIO treatment (16-18 days)).
  • Figures 3d-g show gene marker expression in SAG + DAPT treated aggregates. Red: ACTH, Green: E-cadherin (e) / neurofilament (f) / PC2 (g).
  • FIG. 3h shows that shRNA-mediated knockdown of lim3 by doxycycline (Dox) treatment reduces Tbx19 and ACTH expression.
  • FIG. 3i shows the expression of Rx, lim3 and ACTH of DAPT treated LCA + SAG SFEBq aggregates.
  • FIG. 3 j schematically shows the generation of corticotropin producing cells from ESC-derived sac.
  • FIG. 3k is a graph showing the effect of DAPT, BIO and IWP2 on Pitx1 expression (day 26).
  • FIGS. 3l and m show the generation of GH + cells in LCA + SAG aggregates (day 33) (hydrocortisone and insulin added on days 20-30).
  • Figures 3n and o show the production of Prolactin + cells in LCA + SAG aggregates (day 33) (estradiol and insulin added on days 20-30).
  • FIG. 3p-s shows the generation of LH + cells, FSH + cells, and TSH + cells (PA6 conditioned medium (conditioned medium) added from day 10) in LCA + SAG aggregates (day 33).
  • FIG. 4a is a schematic diagram of an ACTH secretion test with a CRH load.
  • FIG. 4b shows the promotion of ACTH secretion by CRH loading.
  • FIG. 4c shows the enhancement of ACTH secretion by various doses of CRH loading.
  • FIG. 4d shows the effect of SAG, DAPT and CRH treatment on ACTH secretion from aggregates.
  • FIG. 4e shows that the promotion of ACTH secretion by CRH is suppressed by pretreatment with ACTH secretion negative feedback factor hydrocortisone (F).
  • FIG. 5a is a diagram showing the design of an experiment for transplantation of aggregates to pituitary-removed mice and the engraftment of aggregates (GFP-labeled) transplanted under the kidney capsule of pituitary-removed mice on the seventh day after surgery.
  • Red ACTH + cells
  • blue DAPI
  • scale bar 100 ⁇ m
  • Figures 5b and c show that ACTH is no longer produced by removal of the pituitary gland (no CRH loading (b), yes (c)).
  • FIG. 5d shows ACTH levels in transplanted mice with (right) or without (left) CRH loading.
  • FIG. 5e and f show the increase in ACTH and corticosterone production with CRH loading, respectively, and Figures 5g and h show basal levels of ACTH and corticosterone production without CRH loading.
  • Figures 5i and j show the improvement in locomotor activity of pituitary-depleted mice by transplantation of ACTH producing cells.
  • FIG. 5k shows the survival of pituitary-depleted mice after aggregate transplantation surgery analyzed by Kaplan-Meyer method.
  • FIG. 6 shows the expression of BMP2 and BMP4 in gfCDM / SFEBq cultures starting with 3000 cells / aggregate (LCA ⁇ ) or 10000 cells / aggregate (LCA +).
  • FIG. 7 shows the results of suspension aggregate culture using human ES cells 12000 cells / aggregates.
  • Rx + rostral hypothalamic tissue cells consisted of a single-layer sheet composed of E-cadherin + rostral non-neural ectoderm tissue cells. Aggregates encapsulated in the continuous epithelium were formed on the 17th day of culture. Furthermore, the formation of E-cadherin + thickened non-neuronal ectoderm was observed on the 25th day of culture.
  • Tissue and cells obtained by the production method of the present invention (A) Aggregate containing central nervous tissue and non-neural ectoderm tissue of the head
  • the central nervous tissue and non-neural ectoderm tissue particularly rostral Aggregates comprising both lateral hypothalamic tissue (also referred to simply as hypothalamic tissue) and rostral head non-neural ectoderm tissue (also referred to simply as head non-neural ectoderm tissue), which are sheet-like continuous epithelia, differentiated Be guided.
  • An aggregate including a rostral hypothalamus tissue and a rostral non-neural ectoderm tissue that is a sheet-like continuous epithelium is, for example, a rostral head composed of a sheet-like continuous epithelium-like layer of Pitx1-positive cells
  • a non-neural ectoderm tissue is present on the contact surface with the culture medium, and is a cell mass including a rostral hypothalamic tissue composed of a group of Rx-positive cells therein.
  • both a central nervous tissue and a head non-neural ectoderm tissue are simultaneously formed in one aggregate (specifically, in one aggregate, the central nervous tissue On the outside, sheet-like head non-neural ectoderm tissue is formed) so that these tissues can interact locally.
  • ectoderm head placodes that form sensory organs requires interaction between central nervous tissue and non-neural head ectoderm tissue.
  • the olfactory epithelium develops through a placode formed by the interaction between cerebral tissue and rostral head non-neural ectoderm tissue; the lens is retinal tissue and head non-neural. Occurs through a placode formed by interaction with ectoderm tissue; the inner ear is a placode formed by interaction between hindbrain tissue and head non-neural ectoderm tissue It occurs through.
  • these tissues can interact locally, and the formation of each placode and thus each sensory organ.
  • the rostral hypothalamic tissue is Rx + , N-cadherin + , Sox1 + neural tissue. In one embodiment, the rostral hypothalamic tissue is Rx + , Chx10 ⁇ , Nkx2.1 + , Nestin + neural tissue.
  • the rostral head ectoderm tissue (rostral non-neural ectoderm) is a sheet-like continuous epithelium composed of Pitx1-positive, N-cadherin + monolayer cells formed on the surface of the aggregate. It is an organization.
  • the glandular pituitary gland (anterior pituitary and middle pituitary) is derived from a tissue called the rat-like sac.
  • the Ratoke sac is formed by invading a placode formed in the rostral non-neural ectoderm at the very beginning of ontogeny, and later separated from the ectoderm into an epithelial microcyst.
  • a small cyst having an epithelial structure and polarity similar to that of the Ratoke sac is formed in the aggregate including the rostral hypothalamus tissue and the rostral non-neural ectoderm tissue.
  • This small cyst is present in the vicinity of the hypothalamic tissue, and is also adjacent to the rostral non-neural ectoderm tissue, as in the rat sac in vivo. That is, the method of the present invention can reproduce the microenvironment when a pituitary gland occurs in a living body (see FIG. 2p).
  • the “Ratke's sac-like tissue” or “pituitary precursor tissue” as used in the present invention has the same morphological characteristics (concave or small cystic shape) as that observed in the living body that is normally generated. It has the same gene expression profile as the rat sac in vivo, which is present in the vicinity of the hypothalamic tissue and the rostral non-neural ectoderm tissue. Specific gene expression profiles are described in (D) below.
  • the Ratoke sac-like tissue is a Lim3 positive epithelial microcyst.
  • C Pituitary hormone-producing cells From the anterior pituitary gland, adrenocorticotropic hormone (ACTH), growth hormone (GHhor), thyroid stimulating hormone (TSH), Prolactin (prolactin (PRL)), follicle-stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) (anterior pituitary hormone) is secreted, and from the pituitary midlobe, melanocyte stimulation The hormone (mesanocyte-stimulating homone (MSH)) (pituitary mesenchymal hormone) is secreted.
  • MSH is one of the ACTH-related peptides and is formed by enzymatic degradation of propiomelanocortin, a common precursor with ACTH.
  • the hormones oxytocin (OX) and vasopressin (VP) secreted by the posterior pituitary gland are hormones produced in the hypothalamus and are not included in the pituitary hormones in this specification.
  • the term “pituitary hormone” refers to anterior pituitary hormone.
  • Adrenocorticotropic hormone also called corticotropin. It is a 39-amino acid peptide hormone secreted from the corticotroph producing and secreting cells (corticotroph) of the anterior pituitary gland. ACTH exhibits a glucocorticoid secretion promoting action. ACTH secretion is facilitated by corticotropin-releasing hormone (CRH) secreted from the hypothalamus and negatively fed back by glucocorticoids.
  • CSH corticotropin-releasing hormone
  • GH Growth hormone
  • GHRH growth hormone-releasing hormone
  • Prolactin (Iii) It is a 199 amino acid peptide hormone secreted mainly from prolactin producing and secreting cells (lactotrophs) in the anterior pituitary gland. In humans, PRL promotes lactation and mammary gland differentiation / development in the presence of female hormones, and has effects such as pregnancy maintenance.
  • PRF prolactin-releasing factor
  • TRH thyroid-stimulating hormone-releasing hormone
  • VIP vasopressin
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • PHI peptide histidine isoleucine
  • PAF prolactin-releasing factor
  • GABA GABA
  • LH luteinizing hormone
  • gonadotropin gonadotropin
  • FSH gonadotropin-releasing hormone
  • FSH Follicle stimulating hormone
  • gonadotropin gonadotropin
  • GnRH gonadotropin-releasing hormone
  • FSH acts on the ovaries to make primordial follicles develop into follicles, and in cooperation with LH, develops into mature follicles to promote estrogen secretion from the follicles.
  • Thyroid-stimulating hormone It is a glycoprotein composed of ⁇ subunit and ⁇ subunit secreted from thyroid-stimulating hormone producing and secreting cells (thyrotroph) in the anterior pituitary gland ( ⁇ subunit is common to LH and FSH). TSH acts on the thyroid to promote the production and secretion of thyroid hormone. The secretion of TSH is stimulated by thyrotropin-releasing hormone (TRH) secreted from the hypothalamus and negatively fed back by thyroid hormone.
  • TRH thyrotropin-releasing hormone
  • pituitary hormone producing cells The cells obtained by the differentiation induction method of the present invention and capable of producing and secreting any of these pituitary hormones are collectively referred to as “pituitary hormone producing cells” in the present specification.
  • the diseases caused by the production or secretion failure of any of the above pituitary hormones include hypoadrenocorticism, growth hormone deficiency short stature, adult-onset GH deficiency, pituitary dwarfism, cretinism, Examples include infertility.
  • panhypopituitarism including empty sella syndrome, pituitary apoplexy, postoperative pituitary damage), partial hypopituitarism, anterior pituitary hormone deficiency (specifically, ACTH alone)
  • deficiency growth hormone single deficiency, TSH single deficiency, prolactin single deficiency, gonadotropin single deficiency
  • production or secretion of one or all of the above pituitary hormones is impaired.
  • tissue or cells obtained by the method of the present invention may be prepared by the presence or absence of marker gene expression or, in the case of pituitary hormone-producing cells, release of pituitary hormones into the medium or in the cells. By accumulating the precursor protein as an index and combining them as necessary, it is possible to confirm which tissue or cell has differentiated. Moreover, the obtained tissue or cell can also be specified by observing the form of the tissue or cell. Furthermore, a desired specific tissue or cell can also be isolated based on such marker expression pattern or tissue or cell morphology.
  • Markers used in the present invention include pituitary hormones such as ACTH, GH, PRL, LH, FSH, TSH, N-cadherin, Nkx2.1 (neural marker), Sox1 (neural ectoderm marker), nestin (neural Ectoderm marker), neurofilament and NSE (neuron-specific enolase) (neuron marker), Rx (hypothalamic marker), Pitx1 and Pitx2 (head non-neural ectoderm marker), Chx10 (retinal marker), Lim3 (early lower) Pituitary / pituitary progenitor tissue marker), Islet 1 and 2 (late ratchet sac marker), E-cadherin (epithelial cell marker), Prop1 and Pit1 (gonadotroph, somatotroph, lactotroph or caudodomedia) Specific markers thyrotroph precursor), Tbx19 (markers specific for corticotroph), PC2 (although Melanotropic
  • the tissue or cell obtained by the differentiation induction method of the present invention can be characterized according to the gene expression profile of the actual tissue or cell in vivo.
  • rostral hypothalamic tissue cells are Rx + , preferably Rx + , N-cadherin + , nestin + , Nkx2.1 + , Chx10 ⁇ .
  • the cells of the rostral head ectoderm tissue are Pitx1 + , preferably Pitx1 + , Pitx2 + , E-cadherin + .
  • Cells of the pituitary progenitor tissue are Lim3 + , Pitx1 + , Pitx2 + , Isl1 + , E-cadherin + (this is consistent with the expression profile of the pituitary primordia).
  • Hormone-producing cells of the pituitary is neurofilament -, NSE - a.
  • Pituitary ACTH producing cells are ACTH + , Tbx19 + , PC2 ⁇
  • the other pituitary hormone producing cells are Tbx19 ⁇ .
  • MSH producing cells in the pituitary midlobe are ACTH ⁇ , Tbx19 + , and PC2 + .
  • Pituitary GH-producing cells, PRL-producing cells, and TSH-producing cells differentiate into pituitary hormone-producing cells via Pitx1 + intermediate precursors.
  • the central nervous tissue and the non-neural head ectoderm tissue such as the rostral hypothalamus tissue and the rostral head ectoderm tissue (rostral non-neural ectoderm) are one. Differentiation is induced simultaneously in the aggregate. At this time, an aggregate is obtained in which the rostral head ectoderm tissue (head non-neural ectoderm) is on the surface and the central nervous tissue (rostral hypothalamic tissue) is present on the inside. According to a further method of the invention, Ratoke sac-like tissue is formed in the aggregate.
  • This small cyst shows the same marker expression as the pituitary progenitor tissue, and has a morphologically similar epithelial structure and polarity. Furthermore, like the pituitary progenitor tissue (Latke's sac) in vivo, it exists in the vicinity of the Rx-positive hypothalamic tissue and is formed adjacent to the rostral non-neural ectoderm tissue. This indicates that in the differentiation induction method of the present invention, the microenvironment of pituitary progenitor tissue development during the embryogenesis process was imitated. Therefore, in the present invention, this ratchet sac-like tissue is also called a pituitary progenitor tissue.
  • each of the pituitary hormone-producing cells is indicated by the release of ACTH, GH, PRL, LH, FSH, TSH into the medium or accumulation of the precursor protein in the cell as an index. Differentiation can be confirmed.
  • TSH-producing cells can be characterized with TSH expression as an index, FSH-producing cells with FSH expression as an index, and LH-producing cells with LH expression as an index.
  • Pituitary hormones can also be secreted from neurons, but each pituitary hormone-producing cell obtained by the production method of the present invention should be distinguished from such neurons in that the neuronal markers NSE and neurofilament are negative. Can do.
  • the expression of the marker gene is analyzed by performing quantitative PCR with, for example, 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) according to the manufacturer's instructions, and normalizing the data by GAPDH expression. Methods of quantitative PCR are known to those skilled in the art.
  • the cells may be manipulated so that the target marker gene is expressed as a fusion protein of the marker gene product and GFP or venus (knock-in). Protein expression can also be detected using antibodies specific for the marker gene product.
  • proteins can be detected by immunostaining or radioimmunoassay.
  • other pituitary hormones can be produced using the same assay using antibodies specific for the hormones produced. Such methods are known to those skilled in the art.
  • Stem cell refers to a cell that can maintain the same differentiation potential even after cell division.
  • stem cells include embryonic stem cells (ES cells) derived from fertilized eggs or cloned embryos, pluripotent embryonic stem cells, somatic stem cells and pluripotent stem cells present in tissues in the living body, liver that is the basis of each tissue Examples include stem cells, skin stem cells, germ stem cells, pluripotent stem cells derived from germ stem cells, and pluripotent stem cells derived from somatic cells and obtained by nuclear reprogramming.
  • pluripotent stem cells can be cultured in vitro and all cells constituting the living body excluding the placenta (tissues derived from the three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm)) Stem cells having the ability to differentiate (pluripotency) are included, and embryonic stem cells are also included in this.
  • a “pluripotent stem cell” is obtained from a fertilized egg, a cloned embryo, a germ stem cell, or a stem cell in tissue. It also includes cells (also referred to as induced pluripotent stem cells) that have been artificially provided with pluripotency similar to embryonic stem cells by introducing several types of genes into somatic cells.
  • Pluripotent stem cells can be prepared by a method known per se. For example, Cell 131 (5) pp. 861-872, Cell 126 (4) pp. And the method described in 663-676.
  • stem cells for example, cells derived from warm-blooded animals, preferably mammals, can be used.
  • mammals include, for example, laboratory animals such as rodents and rabbits such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, and sheep, pets such as dogs and cats, humans, monkeys, Primates such as orangutans and chimpanzees.
  • the stem cells used in the method of the present invention include, for example, embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as “embryonic stem cell I”), body, etc. established by culturing an early embryo before implantation.
  • embryonic stem cell I embryonic stem cell I
  • embryonic stem cells II Embryonic stem cells established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of cell nuclei (hereinafter abbreviated as “embryonic stem cells II”), introducing several types of genes into somatic cells, and Inducible pluripotent stem cells (iPS cells) established by the action of a compound, and genes on the chromosomes of embryonic stem cells I, embryonic stem cells II or iPS cells modified using genetic engineering techniques Capable stem cells (hereinafter abbreviated as “modified pluripotent stem cells”).
  • embryonic stem cells II Embryonic stem cells established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of cell nuclei
  • iPS cells Inducible pluripotent stem cells
  • the embryonic stem cell I includes the embryonic stem cells established from the inner cell mass constituting the early embryo, the EG cells established from the primordial germ cells, and the multipotency of the early embryo before implantation. Examples include cells isolated from a cell population (for example, primitive ectoderm) or cells obtained by culturing the cells. Embryonic stem cells I can be prepared by culturing early embryos prior to implantation according to a method described in the literature (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1994)). it can.
  • Embryonic stem cells II are described in, for example, Wilmut et al. (Nature 385, 810 (1997)), Ciberli et al. (Science, 280, 1256 (1998)), Akira Iriya et al. (Protein Nucleic Acid Enzyme, 44, 892 (1999)), Baguisi. (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999)), Wakayama et al. (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999).
  • Rideout III et al. Nature Genetics, 24, 109 (2000)
  • it can be produced as follows.
  • Initialization after removing the nucleus of the mammalian cell operation to return the nucleus to a state where it can be repeated again
  • initiating development using a method of injecting the enucleated mammal into an unfertilized egg By culturing an egg that has started development, an egg that has a nucleus of another somatic cell and has started normal development is obtained.
  • a plurality of methods are known as methods for initializing somatic cell nuclei.
  • the medium in which the cells providing the nucleus are cultured is changed from a medium containing 5-30%, preferably 10% fetal calf serum (eg, M2 medium) for 3-10 days, preferably 5 days.
  • Initialize by inducing cell cycle to resting state (G0 phase or G1 phase) by culturing in an oligotrophic medium containing 0-1%, more preferably 0.5% calf fetal serum can do.
  • the cell can be initialized by injecting the nucleus of the cell providing the nucleus into an enucleated unfertilized egg of a mammal of the same species and culturing for several hours, preferably about 1 to 6 hours.
  • Initialized nuclei can begin to develop in enucleated unfertilized eggs.
  • a plurality of methods are known as methods for initiating development in an unfertilized egg that has been enucleated from an initialized nucleus.
  • the nucleus is induced by inducing the cell cycle to the resting state (G0 phase or G1 phase) and transplanted into an enucleated unfertilized egg of the same species of mammal by electrofusion or the like to activate the egg and start development. Can be made.
  • the nucleus initialized by injecting the nucleus into an enucleated unfertilized egg of the same mammal is transplanted into the enucleated unfertilized egg of the same mammal by a method using a micromanipulator again, and the egg activity Generation
  • production can be started by treating with a chemical substance (for example, strontium etc.), and then treating with a cell division inhibitor (for example, cytochalasin B etc.) to suppress the release of the second polar body.
  • a chemical substance for example, strontium etc.
  • a cell division inhibitor for example, cytochalasin B etc.
  • Embryonic stem cells can be obtained using known methods described in Series 8 gene targeting, production of mutant mice using ES cells, Yodosha (1995) and the like.
  • iPS cells can be produced by introducing, for example, Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 (c-Myc or n-Myc as required) into somatic cells (eg, fibroblasts, skin cells, etc.) ( Cell, 126: pp. 663-676, 2006; Nature, 448: pp. 313-317, 2007; Nat Biotechnol, 26: pp. 101-106, 2008; Cell 131: 861-872, 2007), and Oct3 / 4 and Sox2, (if necessary, further Klf4) can also be produced by allowing valproic acid, a histone deacetylase inhibitor, to act (Nature Biotechnology, 26: p. 1269-1275). 2008) is not limited to these.
  • Modified pluripotent stem cells can be produced by using, for example, homologous recombination technology.
  • the chromosomal gene that is modified when the modified pluripotent stem cell is prepared include a histocompatibility antigen gene, a disease-related gene based on a neuronal cell disorder, and the like. Modification of the target gene on the chromosome is the following: Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harboratory Press (1994); Gene Targeting AP. Gene targeting, production of mutant mice using ES cells, methods described in Yodosha (1995) and the like can be used.
  • a target gene to be modified for example, a histocompatibility antigen gene or a disease-related gene
  • homologous recombination of the target gene using the isolated genomic gene Create a targeting vector.
  • genomic gene of the target gene can be isolated by using a genomic DNA library screening system (manufactured by Genome Systems) or Universal GenomeWalker TM Kits (manufactured by CLONTECH).
  • targeting vectors for homologous recombination of target genes and efficient selection of homologous recombinants are performed in Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); BioManual Series 8 Gene Targeting, A mutant mouse using ES cells can be prepared according to the method described in Yodosha (1995).
  • the targeting vector can be used in either a replacement type or an insertion type, and as a selection method, methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, poly A selection, and the like can be used.
  • Examples of a method for selecting a target homologous recombinant from the selected cell lines include Southern hybridization method and PCR method for genomic DNA.
  • stem cells can be obtained from a predetermined institution, and commercially available products can also be purchased.
  • human embryonic stem cells KhES-1, KhES-2, and KhES-3 are available from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • mouse embryonic stem cells include EB5 cells.
  • Stem cells can be maintained and cultured by a method known per se.
  • stem cells can be maintained by culture with feeder-free cells supplemented with fetal calf serum (FCS), Knockout TM Serum Replacement (KSR), LIF.
  • FCS fetal calf serum
  • KSR Knockout TM Serum Replacement
  • Forming uniform stem cell aggregates means “aggregating a certain number of dispersed stem cells rapidly” when stem cells are aggregated to form aggregates of stem cells and cultured (aggregate culture). To form a qualitatively uniform aggregate of stem cells. Furthermore, it refers to promoting the epithelialization of cells derived from stem cells, particularly by “aggregating cells rapidly”. That is, in the present specification, “aggregating cells rapidly” means that the epithelial structure of cells produced by uniformly aggregating stem cells is formed with good reproducibility.
  • “Suspension culture” or “cultivation as suspension aggregates (also referred to as aggregates)” refers to culturing a group of stem cells obtained in the above process and forming uniform aggregates. It means culturing in a medium under non-adhesive conditions with respect to a cell culture vessel (in the present specification, these steps are collectively referred to as “SFEBq method”).
  • SFEBq method When stem cells are cultured in suspension, a feeder is used to facilitate the formation of suspended aggregates and / or to induce efficient differentiation (for example, induction of differentiation into ectoderm cells such as neural cells). Culturing is preferably performed in the absence of cells.
  • Uniform stem cell aggregates can be formed as long as the cells can be rapidly aggregated to form uniform stem cell aggregates and reproducibly form epithelial structures of cells produced from stem cells. Any method may be adopted. Examples of such a method include a method of confining cells in a small space using a small well plate (96-well plate) or a micropore, or a small centrifuge tube. Examples include a method of aggregating cells by centrifuging for a short time.
  • the incubator used for the formation of the aggregate is not particularly limited as long as it can form uniform stem cell aggregates by “aggregating cells rapidly”, and can be appropriately determined by those skilled in the art. Is possible. Examples of such incubators include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi dishes, micro plates, micro well plates, micro pores, multi plates, multi well plates, chamber slides, Examples include petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles. In order to rapidly aggregate cells, it is preferable to use an incubator with a relatively small culture space as described above. These incubators are preferably non-cell-adhesive from the viewpoint of forming uniform aggregates. As the non-cell-adhesive incubator, those in which the surface of the incubator has not been artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion with cells can be used.
  • the incubator used in the suspension culture is not particularly limited as long as the suspension culture of cells is possible, and the same ones as described above can be used.
  • the incubator is preferably non-cell-adherent as described above.
  • the incubator used for aggregate formation may be used as it is.
  • the concentration of stem cells at the time of aggregate formation can be appropriately set by those skilled in the art so as to form aggregates of stem cells more uniformly and efficiently, but the expression of endogenous growth factors in the aggregates High cell concentration (HCD) so that both central nervous tissue and non-neural neuroectodermal tissue (especially rostral hypothalamic tissue and rostral head ectoderm tissue) are induced to differentiate simultaneously. ) (Also referred to as a large cell-aggregation (LCA) condition).
  • HCD High cell concentration
  • non-neural neuroectodermal tissue especially rostral hypothalamic tissue and rostral head ectoderm tissue
  • LCA large cell-aggregation
  • BMP4 BMP4
  • central nervous tissue and non-neural ectoderm tissue especially rostral thalamus in one aggregate
  • Both the lower tissue and rostral ectodermal tissue are difficult to induce differentiation at the same time.
  • endogenous growth factor refers to BMP (Bone Morphogenetic protein), in particular, BMP2, BMP4, or both BMP2 and BMP4.
  • the expression of the endogenous growth factor in the aggregate is “increased” means that at a time after 7 days from the start of the culture at a high cell concentration, the cell growth rate is low (for example, 3000 cells / aggregate). It means that it is increased compared to the expression of endogenous growth factor when aggregate formation is performed, at least 1.8 times or more, preferably 1.9 times or more, more preferably 2.0 times or more To do.
  • the increase in the expression of the endogenous growth factor is usually 5.0 times or less, preferably 4.0 times or less, more preferably Is 3.5 times or less.
  • Endogenous growth factor expression may be measured at either the mRNA level or the protein level, but is preferably measured at the mRNA level.
  • the quantification of mRNA or protein may be performed using a method known in the art. Quantification of mRNA is preferably performed by quantitative PCR (eg, real-time PCR).
  • the expression level of endogenous growth factor refers to the expression level of either BMP2 or BMP4.
  • the expression of either BMP2 or BMP4 in the aggregate is low when aggregate formation is performed at a high cell concentration at a time point on and after the seventh day after culturing at a high cell concentration is started. It is at least 1.8 times or more, preferably 1.9 times or more, more preferably 2.0 times or more, compared to the case where aggregate formation is performed at a cell concentration (eg, 3000 cells / aggregate). Further, at the same time, the expression of either BMP2 or BMP4 in the aggregate is usually 5.0 times or less, preferably 4.0 times or less, more preferably 3.5 times compared to the low cell concentration. It is as follows.
  • the expression of each of BMP2 and BMP4 in the aggregate when aggregate formation is performed at a high cell concentration at the time after the seventh day after culturing at a high cell concentration is started It is at least 1.8 times or more, preferably 1.9 times or more, more preferably 2.0 times or more, compared to the case where aggregate formation is performed (for example, 3000 cells / aggregate).
  • the expression of BMP2 and BMP4 in the aggregate is usually 5.0 times or less, preferably 4.0 times or less, more preferably 3.5 times or less, compared to the low cell concentration. is there.
  • both central nerve tissue and non-neural head ectoderm tissue are induced to differentiate simultaneously in the aggregate. Is a cell concentration (high cell concentration (HCD) or large cell-aggregation () that results in “increase” expression of endogenous growth factors (ie, BMP2 and / or BMP4) in the aggregate as described above. It is important to form aggregates under LCA) conditions).
  • the cell concentration increases the expression of endogenous growth factor (ie, BMP2 and / or BMP4) in the aggregate. It is preferable to form aggregates at a concentration (HCD) or large cell-aggregation (LCA) condition).
  • HCD concentration
  • LCA large cell-aggregation
  • a signal promoter for a protein belonging to the BMP subfamily is added at a concentration that does not cause neuronal differentiation inhibition or for a period that does not cause neuronal differentiation inhibition. You may add in a culture medium.
  • proteins belonging to the BMP subfamily include BMP (BMP2 / 4 group (BMP2, BMP4), OP-1 group (BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b), BMP9 group (BMP9, BMP10), GDF5 group ( GDF5, GDF6, GDF7)) or GDF (Growth and Differentiation Factor).
  • BMP2 and / or BMP4 are particularly preferable, and BMP4 is most preferable.
  • a signal promoter (eg, BMP4) of a protein belonging to the exogenous BMP subfamily (eg, BMP) may be included in the serum-free medium from the time of formation of the aggregate, or constant from the start of suspension culture of the aggregate. You may add to a serum-free culture medium after progress.
  • the period from the start of suspension culture to the addition of the signal promoter after the start of suspension culture of the aggregate is usually within 240 hours, preferably within 96 hours, and more preferably within 72 hours.
  • a signal promoter eg, BMP2 and / or BMP4 of a protein (eg, BMP) belonging to the BMP subfamily in a serum-free medium after a lapse of a certain period from the start of suspension culture.
  • the signal promoter is added to the serum-free medium at the latest 48 hours after the start of suspension culture.
  • concentration of a signal promoter of a protein (eg, BMP) belonging to an exogenous BMP subfamily is exemplified by a range of 0.01 to 10 nM when using BMP2 or BMP4, for example.
  • the medium may contain a Shh signal promoter.
  • the Shh signal promoter is not particularly limited as long as it can enhance signal transduction mediated by Shh.
  • Examples of the Shh signal promoter include proteins belonging to the Hedgehog family (for example, Shh, Shh-N), Shh receptors, Shh receptor agonists (eg, Purmorphamine, SAG), and SAG is most preferable.
  • SAG has several times stronger activity than Shh, and is relatively inexpensive and can be used up to a high concentration, so it can cause strong hedgehog signal activity (Danjo et al, JNS, 2010).
  • the Shh signal promoter may be included in the serum-free medium from the time of formation of the aggregate, or may be added to the serum-free medium after a lapse of a certain period from the start of suspension culture of the aggregate.
  • the period from the start of suspension culture to the start of suspension culture of aggregates until addition of the Shh signal promoter is usually within 192 hours, preferably within 168 hours, and more preferably within 144 hours.
  • the concentration of the Shh signal promoter used is both central nervous tissue and non-neuronal ectoderm tissue (especially rostral hypothalamic tissue and rostral temporal ectoderm tissue which is a sheet-like continuous epithelium) in aggregates. It is sufficient that the concentration is such that differentiation can be promoted.
  • the concentration is usually about 10 to 2000 nM, preferably about 50 to 1000 nM, and most preferably about 100 to 400 nM in the following serum-free medium.
  • aggregate formation and / or floatation in order to induce differentiation of both central nervous tissue and non-neural head ectoderm tissue (especially rostral hypothalamic tissue and rostral head ectoderm tissue) in the aggregate.
  • a serum-free medium used for culture is supplemented with a signal promoter (preferably BMP2 and / or BMP4) of a protein belonging to an exogenous BMP subfamily (eg, BMP2) and a Shh signal promoter (preferably SAG). Is done.
  • a signal promoter for a protein belonging to the BMP subfamily may be included in the serum-free medium from the time of formation of the aggregate, or after a certain period from the start of suspension culture of the aggregate. It may be added to the serum medium.
  • the period from the start of suspension culture to the addition of the signal promoter is within 240 hours, preferably within 96 hours, and more preferably within 72 hours.
  • the signal promoter is preferably added to the serum-free medium at least 48 hours after the start of suspension culture so as not to suppress neural differentiation.
  • the Shh signal promoter may be included in the serum-free medium from the time of formation of the aggregate, or may be added to the serum-free medium after a lapse of a certain period from the start of suspension culture of the aggregate.
  • the period from the start of suspension culture to the addition of the Shh signal promoter is usually within 192 hours, preferably within 168 hours.
  • the concentration range of each factor is as described above.
  • the concentration of the stem cells at the time of aggregate formation can be appropriately set by those skilled in the art so as to form stem cell aggregates more uniformly and efficiently.
  • both central nervous tissue and non-neural head ectoderm tissue eg, both rostral hypothalamic tissue and rostral head ectoderm tissue 1
  • Aggregate formation so that aggregates of stem cells containing 5 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 (preferably 8 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 ) stem cells per aggregate are formed
  • the concentration of stem cells at time is preferably started at a high cell concentration.
  • a 96-well microwell plate when using a 96-well microwell plate, about 4.5 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 4 cells per well (150 ⁇ l), preferably about 5 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 cells, most preferably about A solution prepared so as to be 8 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 cells is added, and the plate is allowed to stand to form aggregates.
  • a culture container having a sufficiently small culture space one aggregate can be formed per well.
  • the number of stem cells included in the formed aggregate (5 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 , preferably 8 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 ), or a little
  • 5 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 cells (preferably 8 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 cells) per target aggregate
  • An aggregate of stem cells containing the stem cells An aggregate of stem cells containing the stem cells).
  • a person skilled in the art takes into account conditions such as well size, shape, medium volume, and the like, and 5 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 (preferably 8 ⁇ 10 3 to 1.
  • the number of cells added per well that can form an aggregate of stem cells containing 5 ⁇ 10 4 stem cells can be easily adjusted as appropriate.
  • the concentration of stem cells at the time of aggregate formation can be appropriately set by those skilled in the art so as to form aggregates of stem cells more uniformly and efficiently.
  • Endogenous growth factor expression increases in both CNS and non-neural ectoderm tissues (especially both rostral hypothalamic and rostral head ectoderm tissues).
  • both central nerve tissue and non-neural head ectoderm tissue are simultaneously contained in one aggregate.
  • the high cell concentration in the case of a human is preferably a concentration at which an aggregate of stem cells containing about 0.9 ⁇ 10 4 to 3 ⁇ 10 4 stem cells per aggregate is formed.
  • the high cell concentration in the case of a human is preferably a concentration at which an aggregate of stem cells containing about 0.9 ⁇ 10 4 to 3 ⁇ 10 4 stem cells per aggregate is formed.
  • a 96-well microwell plate it is prepared so that about 0.9 ⁇ 10 4 to 3 ⁇ 10 4 cells per well (150 ⁇ l) or a little more than that is obtained. Aggregates of stem cells containing 0.9 ⁇ 10 4 to 3 ⁇ 10 4 stem cells can be formed.
  • a signal promoter eg, BMP2 and / or BMP4
  • a protein eg, BMP
  • the concentration is preferably such that an aggregate of stem cells containing 0.3 ⁇ 10 4 to 3 ⁇ 10 4 stem cells per aggregate is formed.
  • a person skilled in the art can appropriately adjust the number of cells in consideration of conditions such as the size and shape of the well and the volume of the medium.
  • the expression of endogenous growth factors in the aggregate is increased, and both central and head non-neural ectoderm tissues, particularly rostral hypothalamic tissues
  • the number of stem cells per aggregate can be appropriately adjusted so that both the rostral head ectoderm tissue, which is a sheet-like continuous epithelium, is induced to differentiate simultaneously. it can.
  • culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • the time until the formation of aggregates can be appropriately determined depending on the stem cells used as long as the cells can be rapidly aggregated, but it is desirable that the time is as early as possible in order to form uniform aggregates.
  • Such aggregate formation was carried out over a period of about 2 days (for example, Watanabe, K. et al., Nature Neurosci. 8, 288-296, Schuldiner M, Benvenity N. Factors controlling human embronic cell). difference. Methods Enzymol. 2003; 365: 446-461), shortening this time makes it possible to induce efficient differentiation of the target tissue or cells.
  • it is desirable to form aggregates preferably within 12 hours, more preferably within 6 hours.
  • “uniform” stem cell aggregates and the formation of an epithelial-like structure in each cell that forms the aggregates are attributed to the size and number of aggregates, macroscopic morphology, and tissue staining analysis. Those skilled in the art will judge based on visual morphology and uniformity thereof, expression and uniformity of differentiation and undifferentiation markers, expression control and differentiation of differentiation markers, reproducibility between aggregates of differentiation efficiency, etc. It is possible.
  • the formation of uniform stem cell aggregates includes, for example, maintenance culture of embryonic stem cells, followed by dispersion treatment (eg, trypsin / EDTA treatment) of embryonic stem cells in an appropriate medium (depending on the target tissue or cells)
  • dispersion treatment eg, trypsin / EDTA treatment
  • embryonic stem cells in an appropriate medium (depending on the target tissue or cells)
  • an appropriate medium depending on the target tissue or cells
  • a non-cell-adhesive U-bottom 96-well culture plate preferably 1 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 4 cells, more preferably 3 ⁇ 10 3 to 3 ⁇ .
  • the cells are suspended in 150 ⁇ L of the medium so as to form 10 4 cells, and aggregates are rapidly formed.
  • culture conditions such as the culture temperature and CO 2 concentration in suspension culture of aggregates can also be set as appropriate, and examples include the same conditions as described above as the culture conditions during aggregate formation.
  • time of this process is not specifically limited, Usually, it is 48 hours or more.
  • the medium used for the formation of the aggregate and the medium used for the suspension culture may be the same or different, but the medium used for the formation of the aggregate may be used for the suspension culture as it is.
  • the medium used for aggregate formation / floating culture can be prepared using a medium used for animal cell culture as a basal medium.
  • a basal medium for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, Ham medium, RPMI 1640 medium , Fischer's medium, and mixed media thereof are not particularly limited as long as they can be used for animal cell culture.
  • the serum-free medium used during aggregate formation / floating culture means a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum.
  • those described above are exemplified.
  • the above serum-free medium particularly a medium used for suspension culture (also referred to herein as “differentiation medium”) is a growth factor (Nodal signal promoter, Wnt signal promoter, FGF signal promoter, BMP signal promoter). , Retinoic acid and the like, but preferably any growth factor not limited thereto) and a serum-free medium substantially free of insulin.
  • the serum-free medium can contain, for example, a serum substitute.
  • the serum substitute may appropriately contain, for example, albumin, transferrin, fatty acid, insulin, collagen precursor, trace element, 2-mercaptoethanol or 3'thiolglycerol, or an equivalent thereof.
  • Such serum replacement can be prepared, for example, by the method described in WO98 / 30679.
  • a serum substitute can utilize. Examples of such commercially available serum substitutes include knockout Serum Replacement (KSR), Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco), and Glutamax (Gibco).
  • serum substitutes contain growth factors and insulins
  • inhibitors to the growth factors and insulins as described below, but the growth factors and insulins are included.
  • no serum replacement is used.
  • the serum replacement is preferably chemically-defined which is apparently free of growth factors and insulins.
  • the serum-free medium used in the method of the present invention may contain fatty acids or lipids, amino acids (for example, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers as necessary. However, it is most preferable not to contain a growth factor as described above.
  • “Serum-free medium substantially free of growth factors and insulins” is disadvantageous for selective differentiation into serum-free medium containing no growth factors and insulin, or pituitary progenitor tissues and pituitary hormone-producing cells.
  • Such a serum-free medium can be prepared, for example, by adding no growth factors and insulins as medium components or removing these factors from a medium containing growth factors and insulins.
  • the serum-free medium substantially free of growth factors and insulins can be a serum-free medium in which growth factors and insulins are substantially inactivated, and the medium is free of serum containing growth factors and insulins. Addition of growth factor signal inhibitor and / or insulin signal inhibitor to the medium increases the activity of growth factors and insulins to such an extent that they do not adversely affect the selective differentiation of pituitary progenitor tissues and pituitary hormone-producing cells. Refers to lost serum-free medium.
  • growth factor in the case of “medium substantially free of growth factor” is a factor generally added as a serum substitute in cell culture in a serum-free medium, and is an ES cell. Means any factor having an action of inhibiting / suppressing the selective differentiation of pituitary progenitor tissue and pituitary hormone-producing cells.
  • examples of the “growth factor” include, but are not limited to, Nodal signal promoter, Wnt signal promoter, FGF signal promoter, BMP signal promoter, retinoic acid and the like.
  • the “medium substantially free of growth factor” is a medium substantially free of all of Nodal signal promoter, Wnt signal promoter, FGF signal promoter, BMP signal promoter and retinoic acid.
  • Lipid-rich albumin is also included in the “growth factor”, and the medium used in the present invention is preferably a medium that does not contain lipid-rich albumin.
  • insulins means compounds that promote insulin signaling.
  • the insulin signal promoter is not particularly limited as long as it acts to promote signal transmission by insulins, and may act at any stage of the insulin signaling pathway (upstream of insulin). Or factors acting downstream, insulin agonists, analogs, etc.).
  • Insulin includes insulin and similar substances (analogues) of insulin.
  • An insulin analogue is an insulin-like action (in this specification, an action that inhibits / suppresses selective differentiation of pluripotent stem cells into pituitary progenitor tissues or pituitary hormone-producing cells). It includes any substance having, for example, IGF-I.
  • Examples of the growth factor for the removal of growth factor and insulin from the growth factor and insulin-containing medium to obtain the above serum-free medium , BMP signal promoter, retinoic acid, lipid-rich albumin, etc.
  • inactivation of a growth factor and insulins can be implemented by addition of a growth factor signal inhibitor and an insulin signal inhibitor.
  • an inhibitor can be any substance that inhibits the upstream or downstream of the signal transduction pathway by growth factors or insulin, such as antibodies to growth factors / insulin, soluble receptors for growth factors / insulin, growth Examples include antibodies to factor / insulin receptors, growth factor / insulin antagonists, and the like. These substances are added to the medium in an amount suitable for obtaining the desired effect (selective differentiation into pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cells).
  • the serum-free medium contains both central nervous tissue and non-nerve ectoderm tissue, particularly rostral hypothalamic tissue and rostral temporal ectoderm, which is a sheet-like continuous epithelium, in the aggregate.
  • An exogenous BMP2 and / or BMP4 signal promoter (for example, BMP2 and / or BMP4) may be included at a concentration that does not inhibit neuronal differentiation so that both tissues are induced to differentiate simultaneously. .
  • BMP2 and / or BMP4 it is preferable to add so that it may become a density
  • the Nodal signal inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by Nodal.
  • Examples of the Nodal signal inhibitor include SB431542 (Sigma), Lefty-A, Lefty-B, Lefty-1, Lefty-2, soluble Nodal receptor, Nodal antibody, and Nodal receptor inhibitor.
  • SB431542 (4- (5-benzo [1,3] dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl) -benzamide) is preferable.
  • the Wnt signal inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by Wnt.
  • Examples of the Wnt signal inhibitor include Dkk1, Cerberus protein, Wnt receptor inhibitor, soluble Wnt receptor, Wnt antibody, casein kinase inhibitor, and dominant negative Wnt protein, among which Dkk1 is preferable. .
  • the FGF signal inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by FGF.
  • the FGF signal inhibitor include an anti-FGF antibody, a soluble FGF receptor, and an FGF receptor inhibitor (for example, Su5402).
  • the BMP signal inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by BMP.
  • Examples of the BMP signal inhibitor include BMPRFc (R & D), anti-BMP antibody, soluble BMP receptor, and BMP receptor inhibitor, among which BMPRFc is preferable.
  • the retinoic acid (RA) inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by RA.
  • RA inhibitors include anti-RA antibodies, soluble RA receptors, and RA receptor inhibitors.
  • the concentration of each signal inhibitor used in suspension culture can be a concentration that allows selective differentiation of hypothalamic neurons into progenitor cells.
  • concentration is about 0.1-100 nM, preferably about 5-30 nM.
  • Dkk1 is about 10 to 1000 ng / ml, preferably about 100 to 1000 ng / ml.
  • BMPRFc is about 0.1 to 10 ⁇ g / ml, preferably about 0.5 to 3 ⁇ g / ml.
  • the above signal inhibitors are most preferably added to the medium at the start of pluripotent stem cell culture.
  • Insulin intracellular signal transduction involves two main pathways (MAPK pathway and PI3K-Akt pathway).
  • insulin signal inhibitor used in the suspension culture of the present invention, insulin signal transduction is possible.
  • Examples of PI3K inhibitors that can be used in the present invention include LY294002 (2- (4-morpholinyl) -8-phenyl-1 (4H) -benzopyran-4-one hydrochloride) (Cayman Chemical), Wortmannin (FERMENTEK) and the like.
  • LY294002 is preferred.
  • Akt inhibitor examples include Akt inhibitor I to X (Calbiochem), and preferably Akt inhibitor VIII (1,3-Dihydro-1- (1-((4- (6- phenyl-1H-imidazo [4,5-g] quinoxalin-7-yl) phenyl) methyl) -4-piperidinyl) -2H-benzimidazol-2-one).
  • one of the inhibitors selected from the above PI3K inhibitor and Akt inhibitor is added. It may be used alone, or a PI3K inhibitor and an Akt inhibitor may be used in combination. Two or more of these inhibitors can be selected and used in combination.
  • the concentration of the PI3K inhibitor / Akt inhibitor used for suspension culture can be a concentration that allows selective differentiation into pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cells.
  • concentration for example, for LY294002, such a concentration is about 0.5-30 ⁇ M, preferably about 2-10 ⁇ M.
  • the Akt inhibitor VIII is about 0.1 to 10 ⁇ M, preferably about 0.5 to 5 ⁇ M.
  • the differentiation medium used in the present invention is a chemically defined medium (called growth factor-free CDM; referred to as gfCDM) that does not contain the above-mentioned growth factors or insulins.
  • gfCDM growth factor-free CDM
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) / Hams F12 1: 1 (Invitrogen), 1 ⁇ Chemically-defined lipid concentrate (Invitrogen), M ) And bovine serum albumin (> 99% pure recrystallized product; Sigma) are used (Wataya et al., PNAS. 105 (33), 11796-11801).
  • This gfCDM medium is a modified version of the previously reported CDM medium (Mol. Cell. Biol. 15: 141-151 (1995)).
  • a growth factor inhibitor / insulin inhibitor may be further added to such a gfCDM medium or other medium.
  • the differentiation medium used in the present invention contains at least one inhibitor selected from the group consisting of a PI3K inhibitor and an Akt inhibitor, and insulins, and the above-mentioned growth factors other than insulin.
  • a serum-free medium substantially free of substantially free of
  • an insulin signal inhibitor for example, PI3K inhibitor / Akt inhibitor
  • an insulin signal inhibitor that antagonizes the insulin differentiation-inducing inhibitory effect at the same time that insulin is added to enhance cell proliferation is used. It is preferable to add.
  • the concentration of insulins contained in the differentiation medium is a concentration that can promote proliferation of pluripotent stem cells.
  • concentrations for insulin are usually about 0.02-40 ⁇ g / ml, preferably about 0.1-10 ⁇ g / ml.
  • concentration range of the PI3K inhibitor and the Akt inhibitor is as described above.
  • the PI3K inhibitor / Akt inhibitor is most preferably added to the medium at the start of the culture of pluripotent stem cells, but in the case of differentiation of rodent (eg, mouse) pluripotent cells, at least the sixth day of culture.
  • rodent eg, mouse
  • primate eg, human
  • a ROCK inhibitor (Y-27632 ((+)-(R) -trans-4- (1-aminoethyl) -N- (4- pyrylyl) cyclohexanecarbamide (dihydrochloride); Watanabe et al., Nature Biotechnology, 25, 681-686, 2007) is preferably added from the beginning of the culture.
  • the concentration of the ROCK inhibitor used for suspension culture is a concentration that can suppress cell death during dispersion suspension culture. For example, for Y-27632, such concentrations are usually about 0.1-200 ⁇ M, preferably about 2-50 ⁇ M.
  • expression of endogenous growth factors in the aggregates of stem cells by forming aggregates under conditions of pluripotent stem cells at a high cell concentration. Increases in both the rostral hypothalamic tissue and the rostral head ectoderm tissue, which is a sheet-like continuous epithelium, in one aggregate, but the Lim3 positive cells of the cells contained in the aggregate
  • the serum-free medium used for suspension culture may contain a Shh signal promoter.
  • the concentration of the Shh signal promoter used may be a concentration that can promote differentiation into Lim3-positive cells.
  • the concentration is usually about 10 to 2000 nM, preferably about 50 to 1000 nM, and most preferably about 100 to 400 nM in a serum-free medium (preferably gfCDM).
  • the timing of adding the Shh signal promoter to the serum-free medium is not particularly limited as long as the induction of Lim3-positive cells in the aggregate is promoted, and it may not be added to the medium at the start of suspension culture. However, as the time from the start of suspension culture to the addition of the Shh signal promoter increases, the expression level of Lim3 mRNA induced in the aggregate decreases (see FIG. 1i). It is preferably added from the beginning (also referred to as culture).
  • the Shh signal promoter is preferably from the beginning of suspension culture to 3 days after suspension culture, more preferably from the beginning of suspension culture to 2 days after suspension culture, more preferably from the beginning of suspension culture to 1 day after suspension culture, most preferably suspension. It is added to the medium at the start of culture.
  • the period of suspension culture in a serum-free medium containing a Shh signal promoter is not particularly limited as long as it is sufficient to induce Lim3-positive cells.
  • a serum-free medium containing a Shh signal promoter is usually 7 to 14 days.
  • it is usually about 10 to 30 days.
  • the concentration of the Shh signal promoter in the medium may be switched during the cultivation as necessary. For example, until the Lim3-positive cells are induced in the aggregate, the aggregate is suspended in a serum-free medium containing a Shh signal promoter, and once the Lim3-positive cells are induced, the Shh signal promoter is contained. Suspension culture can be continued in a serum-free medium that does not. In one embodiment, when using SAG, the promotion of differentiation induction of pituitary progenitor tissue is performed at a concentration of 100 nM to 400 nM from the start of suspension culture until the induction of Lim3 positive cells (eg, until day 10 of culture). Medium containing SAG and then medium without SAG can be used.
  • 400 nM SAG-containing medium when various pituitary hormone-producing cells are induced to differentiate from pituitary progenitor tissue, 400 nM SAG-containing medium from the start of suspension culture to 7 days of culture, and then 100 nM of SAG-containing medium until 10 days of culture. Then, a medium without SAG can be used. In another embodiment, 400 nM SAG-containing medium is used from the start of suspension culture to the 10th day of culture, and then the medium is exchanged by half and cultured for up to 8 days. However, as long as the induction of differentiation of the pituitary progenitor tissue is promoted, it is not limited to these conditions.
  • suspension culture can be continued in a serum-free medium containing a Shh signal promoter, and the differentiation of pituitary hormone-producing cells can be induced.
  • Aggregates were suspended in serum-free medium containing a Shh signal promoter until Lim3-positive cells were induced, and once the Lim3-positive cells were induced, they were cultured in serum-free medium containing no Shh signal promoter.
  • Lim3 positive cells in the aggregate form Lim3 positive epithelial microcysts (ie, pituitary progenitor tissue).
  • an aggregate of stem cells (in the case of mouse stem cells) comprising 8 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 stem cells per aggregate in serum-free medium or 9 ⁇ 10 per aggregate.
  • An aggregate of stem cells containing 3 to 3 ⁇ 10 4 stem cells (in the case of human stem cells) is formed, and the formed aggregates are suspended in a serum-free medium containing a Shh signal promoter, thereby producing a thalamus
  • an aggregate preferably further comprising Lim3 positive cells containing both hypothalamic tissue and head non-neural ectoderm is further suspended in a serum-free medium substantially free of a Shh signal promoter.
  • a serum-free medium substantially free of a Shh signal promoter.
  • the FGF signal promoter is not particularly limited as long as it can enhance signal transduction mediated by FGF.
  • Preferred examples of the FGF signal promoter include FGF (eg, FGF1-23), FGF agonist, and FGF receptor agonist peptide.
  • Preferred FGF signal promoters are FGF8 and / or FGF10.
  • the concentration of the FGF signal promoter used may be any concentration that can achieve an increase in the number of lim3-expressing cells formed or an increase in the expression level of Lim3 mRNA.
  • concentration is, for example, in the case of FGF8 or FGF10, about 2 to 1000 ng / ml, preferably about 20 to 400 ng / ml, most preferably about 200 ng / ml in a serum-free medium, preferably gfCDM.
  • the FGF signal promoter may be added to the medium at any point in the suspension culture of the aggregate, but preferably, an Shh signal promoter used after culturing in the serum-free medium containing the Shh signal promoter. Add to medium without. For example, until the Lim3-positive cells are induced in the aggregate, the aggregate is suspended in a serum-free medium containing a Shh signal promoter, and once the Lim3-positive cells are induced, the Shh signal promoter is contained. And suspension culture can be continued in a serum-free medium containing an FGF signal promoter (preferably FGF8 or FGF10).
  • an FGF signal promoter preferably FGF8 or FGF10
  • a SAG-containing medium for example, a medium containing 100 nM to 400 nM SAG is used until Lim3 positive cells are induced from the start of suspension culture (eg, until the 10th day of culture), and then SAG is added.
  • a medium containing an FGF signal promoter preferably FGF8 or FGF10.
  • the FGF signal promoter preferably FGF8 or FGF10
  • the FGF signal promoter is maintained within the above-mentioned concentration range for 18 days of culture, more preferably for 10 days to 13 days of culture, and preferably for 3 days.
  • (C) Induction of differentiation of ACTH-producing cells In order to induce differentiation of ACTH-producing cells from the formed pituitary progenitor tissue, after formation of pituitary progenitor tissue is achieved, in a serum-free medium containing a Notch signal inhibitor Thus, the pituitary progenitor tissue can be further cultured in suspension.
  • ACTH producing cells refers to pituitary ACTH producing cells and does not include ACTH + neurons.
  • the Notch signal inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by Notch.
  • Examples of the Notch signal inhibitor include DAPT, DBZ, MDL28170, etc. Among them, DAPT is preferable.
  • the concentration of the Notch signal inhibitor used can be a concentration that can achieve differentiation induction of ACTH-producing cells.
  • the concentration is about 0.1 to 1000 ⁇ M, preferably about 0.5 to 500 ⁇ M, more preferably about 1 to 100 ⁇ M, most preferably about 10 ⁇ M in a serum-free medium, preferably in gfCDM medium. It can be.
  • a serum-free medium containing a Notch signal inhibitor is used after the pituitary progenitor tissue is formed by the suspension culture. Such a medium may be used at any time after the pituitary precursor tissue is formed. It is preferable that the serum-free medium containing the Notch signal promoter does not contain a Shh signal promoter.
  • a SAG-containing medium for example, 400 nM SAG from the start of culture to the 7th day
  • the formation of Lim3-positive epithelial microcysts from the start of culture eg, until the 10th day of culture).
  • Notch signal inhibitors eg, DAPT
  • DAPT Notch signal inhibitors
  • a serum-free medium preferably gfCDM medium
  • a Notch signal inhibitor eg, DAPT
  • the pituitary progenitor tissue is cultured in suspension.
  • 10 ⁇ M DAPT is contained in the medium on the 18th day of culture, and the medium is changed half on the 19th day and cultured for 1 day.
  • a serum-free medium containing glucocorticoid For induction of differentiation of GH-producing cells, a serum-free medium containing glucocorticoid can be used.
  • the glucocorticoid include hydrocortisone (also referred to as cortisol), corticosterone, or a synthetic compound (such as dexamethasone) having the same biological activity.
  • this serum-free medium further contains insulins. Examples of insulins include those already listed in the present specification.
  • the medium that can be used to induce differentiation of GH producing cells in the present invention is about 2 to about 2000 ng / ml of hydrocortisone, preferably about 20 to 1000 ng / ml, most preferably about 200 ng / ml, or dexamethasone. From about 0.1 to about 100 ng / ml, preferably from about 1 to 50 ng / ml, most preferably 10 ng / ml, and insulins from about 0.2 to 30 nM, preferably from about 0.5 to 10 nM, most preferably A serum-free medium containing about 1 nM, preferably a gfCDM medium.
  • the medium is preferably used after treatment with a Shh signal inhibitor.
  • a SAG-containing medium for example, a medium containing 400 nM SAG from the start of culture to the 7th day, from the start of culture until Lim3-positive epithelial microcysts are formed (eg, until the 10th day of culture)
  • glucocorticoids and insulins form Lim3-positive epithelial microcysts in the aggregates. It may be added at any time after (ie, after the formation of the pituitary precursor tissue).
  • the pituitary progenitor tissue is cultured in suspension in a serum-free medium containing glucocorticoids and insulins.
  • a serum-free medium containing estrogen for induction of differentiation of PRL-producing cells, a serum-free medium containing estrogen can be used.
  • estrogens include estradiol, estrone, estriol, estetrol, or synthetic compounds having the same biological activity.
  • this serum-free medium further contains insulins.
  • insulins include those already listed in the present specification.
  • the medium that can be used for inducing differentiation of PRL-producing cells in the present invention contains estradiol in an amount of about 5 to about 500 ng / ml, preferably about 10 to 200 ng / ml, most preferably about 50 ng / ml, and insulins.
  • the medium is preferably used after treatment with a Shh signal inhibitor.
  • a medium containing SAG for example, a medium containing 400 nM SAG from the start of culture to the 7th day, 7 From day 10 to day 10
  • estradiol and insulin were formed after the formation of Lim3-positive epithelial microcysts in the aggregates It may be added at any time (ie, after the pituitary precursor tissue is formed).
  • 10 to 40 days from the start of suspension culture preferably 14 to 34 days from start of culture, preferably 20 to 33 days from start of suspension culture, most preferably 20 to 30 days from start of suspension culture.
  • pituitary progenitor tissues are cultured in suspension in a serum-free medium containing estradiol and insulins.
  • a culture supernatant (stroma) obtained by culturing stromal cells in a serum-free medium (preferably gfCDM) (4 to 10 days) LH-producing cells, FSH-producing cells, and TSH-producing cells can be induced to differentiate by suspension culture of the pituitary progenitor tissue in a serum-free medium containing a conditioned medium of cells).
  • a serum-free medium preferably gfCDM
  • the “conditioned medium for stromal cells” refers to a medium containing soluble factors derived from stromal cells, and can be prepared by collecting the supernatant of the medium after culturing stromal cells.
  • stromal cells examples include PA6 cells, MEF cells, and OP9 cells, and PA6 cells are particularly preferable.
  • the serum-free medium is preferably used after treatment with a Shh signal inhibitor.
  • a SAG-containing medium for example, a medium containing 400 nM SAG from the start of culture to the 7th day, from the start of culture until Lim3-positive epithelial microcysts are formed (eg, until the 10th day of culture)
  • Medium containing 100 nM SAG from day 7 to day 10, and then using medium without SAG, the conditioned medium of stromal cells forms Lim3-positive epithelial microcysts in the aggregates It may be added at any time after (ie, after the formation of the pituitary precursor tissue).
  • serum-free containing conditioned medium of stromal cells during the first 10 to 30 days of culture, preferably 10th to 20th day of culture, and most preferably 10th to 15th day of culture.
  • Pituitary precursor tissue is cultured in suspension in the medium.
  • each hormone-producing cell can be further increased by using a medium further supplemented with a Wnt signal promoter in a serum-free medium containing each component added for induction (see FIG. 3a).
  • a medium further supplemented with a Wnt signal promoter in a serum-free medium containing each component added for induction see FIG. 3a.
  • the above culture conditions preferably between the 10th and 30th days of the culture start, preferably between the 12th and 24th days of the culture start, and most preferably between the 16th and 18th days of the culture start.
  • the Wnt signal promoter may be added to the serum-free medium or simultaneously before the addition of glucocorticoid or estrogen (and insulin if necessary). Is preferably added to the serum-free medium prior to the addition of glucocorticoid or estrogen (and insulin if necessary).
  • the Wnt signal promoter is not particularly limited as long as it can enhance signal transduction mediated by Wnt.
  • the Wnt signal promoter include proteins belonging to the Wnt family (for example, Wnt 1 to 16), GSK3 ⁇ inhibitors, Wnt receptors, Li + ions, etc. Among them, GSK3 ⁇ inhibitors are preferable.
  • GSK3 ⁇ inhibitors include GSK-3 ⁇ Inhibitors I, VI, VII, VIII, XI, XII, CHIR 99021, Valproic Acid, TDZD-8, SB-216763, BIO (6-bromodirubin-3′-oxime) and the like. However, it is not limited to these.
  • the concentration of the Wnt signal promoter is not limited as long as it is a concentration that can increase the proportion of pituitary hormone-producing cells as compared to the case without the Wnt signal promoter.
  • the concentration thereof Is usually about 20-2000 nM, preferably about 50-500 nM, most preferably about 250 nM.
  • a serum-free medium containing 250 nM of BIO is used from the 16th day after the start of the culture, and the medium is exchanged by half on the 18th day and cultured for 2 days.
  • Promotion of pituitary hormone secretion Production of pituitary hormones is caused by causing each pituitary hormone-producing cell obtained by the above-described method to act on a substance that promotes production or secretion of pituitary hormones. Can stimulate secretion.
  • the substance that stimulates / promotes the production / secretion of pituitary hormones (also called hormone secretion-promoting substance) may be a substance that directly acts on each pituitary hormone-producing cell, for example, after transplantation, etc. In the case of acting in vivo, a substance that acts indirectly may be used.
  • ACTH production / secretion is promoted by CRH, etc.
  • GH production / secretion is promoted by GHRH, etc.
  • TSH production / secretion is promoted by TRH, etc.
  • PRL production / secretion is PRF (specifically Examples are as described above) and TRH and the like
  • production and secretion of FSH and LH are promoted by GnRH and the like.
  • These promoters may be those isolated from natural sources or synthesized by recombination or the like.
  • the culture conditions for secreting pituitary hormone from pituitary hormone-producing cells can be appropriately set as long as production and secretion of pituitary hormone are promoted without adversely affecting the survival and proliferation of pituitary hormone-producing cells.
  • HBSS solution 8 aggregates containing pituitary hormone-producing cells are added, and after 10 minutes of preincubation at 37 ° C., the appropriate final concentration of each stimulant is added, followed by an additional 10 minutes at 37 ° C. Incubate.
  • CRH When stimulating differentiated ACTH-producing cells with CRH, production and secretion of ACTH is significantly induced when CRH of about 10 ng / ml or more is used.
  • CRH is preferably used at a concentration of about 10-10000 ng / ml, more preferably about 100-10000 ng / ml, more preferably about 1000-10000 ng / ml.
  • the preferred concentration range is 100 nM to 500 nM, and when stimulating TSH production / secretion with TRH, the preferred concentration range is 1 nM to 5 nM, and PRL production / secretion.
  • PRF eg, prolactin-releasing peptide as described above
  • the preferred concentration range is 2 nM to 10 nM
  • FSH production / secretion is stimulated by GnRH
  • the preferred concentration range is 1 nM to 20 nM
  • LH production / secretion is stimulated by GnRH
  • the preferred concentration range is 1 nM to 20 nM.
  • Pituitary hormones produced from pituitary hormone-producing cells can be isolated and purified from the culture.
  • Pituitary hormone is isolated and purified from the culture supernatant by using a method known per se for peptide and protein isolation and purification (known methods such as gel filtration and ion exchange chromatography). can do.
  • the present invention also provides a cell culture obtained by the method of the present invention.
  • the cell culture of the present invention includes, for example, floating aggregates containing stem cells or cells differentiated from stem cells, cells obtained by dispersing suspended aggregates (for example, trypsin / EDTA treatment), cells obtained by culturing dispersed cells, etc. It can be.
  • the present invention also provides pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cells isolated and purified to such an extent that they can be administered to a subject from such cell culture.
  • “Culture” refers to a result obtained by culturing cells, and includes cells, medium, and in some cases, cell-secreting components. “Isolation” means removal of components (cells, proteins, media, etc.) other than the target tissue or cells.
  • the pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cell obtained by the method of the present invention is used as a therapeutic agent for the following diseases in the pituitary tissue or pituitary hormone-producing cell in a damaged state due to other causes. It can be used to replenish cells.
  • a pituitary hormone produced by a pituitary hormone-producing cell obtained by the method of the present invention is a therapeutic agent for the following diseases caused by any pituitary tissue or a damaged state of each pituitary hormone-producing cell. In pituitary hormone secretion insufficiency, it can be used to supplement an appropriate pituitary hormone (hormone replacement therapy).
  • Diseases that can be treated with pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cells or pituitary hormones obtained by the method of the present invention include hypoadrenocorticism, growth hormone deficiency short stature, adult-onset GH deficiency, Pituitary dwarfism, cretinism, infertility, panhypopituitarism (including empty sella syndrome, pituitary apoplexy, postoperative pituitary injury), partial hypopituitarism, anterior pituitary hormone alone Defects (specifically, ACTH single deficiency, growth hormone single deficiency, TSH single deficiency, prolactin single deficiency, gonadotropin single deficiency) and the like.
  • the pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cell obtained by the method of the present invention is used as a therapeutic agent for a disease based on a disorder of the pituitary tissue or pituitary hormone-producing cell
  • the pituitary progenitor tissue or cell It is preferable to transplant to a subject after increasing the purity of.
  • Any known cell separation and purification method can be used as a method for increasing cell purity.
  • a method using a flow cytometer for example, Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
  • Monoclonal Antibodies principals and practices, Third Edition, Acad. Press (1993), Int. Immunol., 10, 275 (1998)
  • panning methods for example, MonoclonalTepside: Acad.Press (1993 , See Cellular fractionation method using density difference of sucrose concentration (see, Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Pressat Oxford Press (1996), J. Immunol., 141, 2797 (1988)). Technology (3rd edition), Asakura Shoten (1996)).
  • the method for increasing the purity of cells of the present invention includes a step of culturing pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cells obtained by inducing differentiation of the stem cells as described above in a medium containing an anticancer agent.
  • a medium containing an anticancer agent obtained by inducing differentiation of the stem cells as described above in a medium containing an anticancer agent.
  • examples of the anticancer agent include mitomycin C, 5-fluorouracil, adriamycin, ara C or methotrexate. These anticancer agents are preferably used at concentrations that are more cytotoxic to cells in an undifferentiated state than cells that have been induced to differentiate. Specifically, in accordance with the culture method described above, culture using these anticancer agents can be carried out to determine the optimum concentration. For example, these anticancer agents can be used in living organisms for 100 minutes of the concentration described in the Japanese Pharmacopoeia. A method of culturing at 37 ° C. for several hours, preferably 2 hours in a CO 2 incubator in which 5% carbon dioxide is aerated is used.
  • any medium can be used as long as it can culture the differentiation-induced pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cells.
  • the above-mentioned culture medium etc. can be mentioned.
  • stem cells obtained by nuclear transfer of somatic cell nuclei or stem cells obtained by modifying genes on chromosomes.
  • pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cells can be obtained by inducing differentiation using stem cells obtained by nuclear transplantation of somatic cell nuclei.
  • Such an individual tissue or cell is useful not only as a transplantation medicine for the tissue or cell itself, but also as a diagnostic material for determining whether an existing drug is effective for the individual.
  • the evaluation data is useful for providing an effective prevention method for diseases diagnosed as having a high future incidence rate.
  • the subject transplanted with pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cells is a warm-blooded animal, preferably a mammal, more preferably an animal of the same species as the animal from which the original stem cells are derived.
  • mammals include, for example, laboratory animals such as rodents and rabbits such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, and sheep, pets such as dogs and cats, humans, monkeys, Primates such as orangutans and chimpanzees.
  • the subject is preferably a human patient.
  • the pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cells induced to differentiate from stem cells by the method of the present invention can be transplanted to the anterior pituitary gland or a corresponding site by a method known per se.
  • the pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cells can be transplanted to any part of the subject as long as the production / secretion of the hormone is induced.
  • the pituitary progenitor tissue or pituitary hormone-producing cells may be in or near the pituitary gland of the subject, or at the site where the pituitary gland should be present (ie, the Vietnamese anther), or It can be transplanted in the vicinity of the target organ on which the secreted pituitary hormone acts (for example, in the case of ACTH-producing cells, under the kidney capsule).
  • ACTH-producing cells can perform ACTH-producing functions even when transplanted ectopically.
  • Production and secretion of each pituitary hormone in a subject after transplantation may be stimulated by administering a hormone secretagogue as described above to the subject, or naturally stimulated by such endogenous substance. May be. It can be appropriately selected depending on the purpose of transplantation and the condition of the subject.
  • a method of transplanting pituitary hormone-producing cells to a test mouse about 1 to 1000 cell aggregates containing the cells obtained by the differentiation induction method of the present invention, preferably 5 to 500 are used.
  • a method of injecting about 1 piece, more preferably about 10 to 50 pieces under the kidney capsule using a Hamilton syringe or the like can be mentioned.
  • the method is not limited to this method.
  • a method of transplanting a cell aggregate in the vicinity of the subcutaneous tissue or the pituitary gland is exemplified, but the method is not limited thereto.
  • the engraftment of the transplanted tissue or cell is the fluorescence of the pituitary hormone or other suitable marker gene product produced and secreted by the cell after a sufficient time has elapsed (eg, 7 days after transplantation). This can be confirmed by histochemical staining using an antibody. Alternatively, by measuring the production of other hormones whose production and secretion are promoted by the pituitary hormone (for example, glucocorticoid (eg, costicosterone) in the case of ACTH), for example, by measuring the blood concentration Can be confirmed.
  • the other hormones that pituitary hormones promote production and secretion are as described above.
  • the effect of transplantation of ACTH-producing cells can also be evaluated by improving the recipient's spontaneous movement (Spontaneous locomotor activity).
  • the spontaneous movement of the mouse is evaluated by the spontaneous movement distance in the cage per day and the spontaneous rotation speed of the running wheel per day.
  • the movement distance of the mouse in the cage can be measured using an analysis system using an IR sensor such as MDC-W02 (Brain ScienceIdea, Osaka). ) Or the like. These measurements are carried out as separate experiments, and each device is installed in a cage (home cage) in which the mouse to be measured is kept flat. Thereby, the spontaneous exercise amount under low stress can be measured.
  • the effect of transplantation of ACTH-producing cells can also be evaluated by the survival rate of the recipient.
  • the survival rate after transplantation of ACTH-producing cells can be analyzed by the Kaplan- Mayer method.
  • the aggregate and pituitary progenitor tissue obtained by the method of the present invention closely reproduce the microenvironment at the time of pituitary generation in a living body, and therefore, pituitary generation, induction of pituitary hormone-producing cells, etc. It is also useful as a research material.
  • the method of the present invention is extremely useful in that it can provide a “tissue material” useful in the field of regenerative medicine, drug discovery such as the above-mentioned medicines, toxicity tests and the like.
  • the present invention provides a screening method for a test substance, which comprises using the cell culture of the present invention or the culture product of the present invention.
  • the culture product of the present invention constructs a pituitary progenitor tissue very similar to the initial process of pituitary progenitor tissue formation in a living body, and includes cells very similar to pituitary hormone-producing cells in the living body. Therefore, screening for therapeutic agents for diseases based on disorders of pituitary tissue or various pituitary hormone-producing cells, screening for therapeutic agents in cell damage due to other causes, or toxicity tests thereof, and further new neurological diseases It can be applied to the development of therapeutic methods.
  • test substance for example, a substance whose efficacy is to be confirmed as a therapeutic agent for the above-mentioned diseases, or a therapeutic agent for other diseases, which has an effect on pituitary tissues or various pituitary hormone-producing cells (for example, Substances that need to be confirmed (toxic).
  • the substance may be any substance such as a low molecular compound, a high molecular compound, a protein, a gene (DNA, RNA, etc.), and a virus. Such a substance can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Example 1 In vitro differentiation induction of forebrain tissue and non-neural ectoderm (method) by serum-free floating aggregate culture of ES cells 7 Aggregate culture using the SFEBq / gfCDM method (Wataya et al, 2008, PNAS vol.105, pp.11796-11801), which is a method for selectively differentiating mouse ES cells into the forebrain, particularly hypothalamic tissue. Performed for days. Specifically, mouse ES cells monodispersed by trypsin treatment were seeded with 3000, 8000, 10000 or 15000 cells per 96-well U-shaped well coated with low cell adsorption to form aggregates.
  • a chemically synthesized medium gfCDM (Wataya et al, 2008, PNAS vol.105, pp.11796-11801) was used. Detection was performed using Rx :: GFP (GFP knocked in to the Rx locus) as a marker of hypothalamic tissue and Pitx1 antibody as a head non-neural ectoderm marker. (result) ES cell floating aggregates cultured by the SFEBq / gfCDM method for 7 days contained hypothalamic tissue with hypothalamic marker Rx :: GFP positive, neuronal markers N-cadherin and Sox1 positive under all culture conditions.
  • the aggregate of the floating aggregate after 5 days of culture is 90% or more of Pitx1-positive sheet-like continuous epithelial tissue (FIG. 1f).
  • the Rx the Rx :: GFP positive further layer
  • Pitx1-positive sheet-like continuous epithelial tissue FIG. 1f.
  • aggregation from 3000 cells only a small number of Pitxl cells were scattered, and no continuous large epithelium was formed.
  • qPCR using another head non-neural ectoderm marker Pitx2 compared to aggregates from 3000 cells, aggregates from 10,000 cells induced four times the expression of Pitx2 RNA, and BMP2 and BMP4 The expression level of mRNA was increased about 2-3 times (FIG. 6). It was found that expression of Pitx2 was increased not only by increasing the number of cells at the time of aggregate formation but also by adding BMP4 to the medium at a concentration of 0.5 nM (FIG. 1d).
  • Example 2 In vitro differentiation induction of pituitary progenitor tissue by serum-free floating aggregate culture of ES cells and hedgehog signal treatment (method) Mouse ES cells were formed at 10,000 cells per aggregate using the SFEBq / gfCDM method (Wataya et al, 2008, PNAS vol.105, pp.11796-11801) and cultured in suspension as in Example 1. Immediately after the start of differentiation culture, SAG (Danjo et al, JNS, 2011, vol.31, pp.1919-1933), an agonist of hedgehog, was added at 100 or 400 nM and cultured for a total of 10-13 days.
  • SAG Sanjo et al, JNS, 2011, vol.31, pp.1919-1933
  • SAG has several times stronger activity than Shh, and is relatively inexpensive and can be used up to a high concentration, so that it can cause strong hedgehog signal activity (Danjo et al, JNS, 2011, vol. .31, pp.1919-1933).
  • Example 3 Production of ACTH-producing cells from pituitary progenitor tissue derived from ES cells and DAPT treatment (method)
  • Mouse ES cells were differentiated into pituitary progenitor tissues by SAG treatment (400 nM for 7 days, 100 nM for 3 days for a total of 10 days) using the method of Example 2.
  • SAG treatment 400 nM for 7 days, 100 nM for 3 days for a total of 10 days
  • the cells were cultured under 40% O 2 and 5% CO 2 for a total of 12 days (total of 22 days).
  • the cells were treated with DAPT 10 ⁇ M inhibitor of Notch signal for one day between 18-19 days or 20-21 days in culture.
  • Expression of Tbx19 and ACTH expressed in ACTH-producing cells was confirmed by cytochemical staining of frozen sections by the fluorescent antibody method.
  • Example 4 Production of pituitary hormone-producing cells other than ACTH from ES cell-derived pituitary progenitor tissue (method)
  • Mouse ES cells were differentiated into pituitary progenitor tissues by SAG treatment (400 nM for 7 days, 100 nM for 3 days for a total of 10 days) using the method of Example 2. Furthermore, suspension culture was continuously performed under 40% O 2 and 5% CO 2 .
  • the culture medium is a culture supernatant (conditioned medium) of gfCDM containing adrenocortical hormone (200 ng / ml hydrocortisone) and 1 nM insulin, gfCDM containing estrogen (50 ng / ml estradiol) and 1 nM insulin, or gfCDM of mouse feeder cells PA6 cells. ) was used.
  • the expression of growth hormone (GH), prolactin (PRL), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), and thyroid stimulating hormone (TSH) was confirmed by cytochemical staining of frozen sections by the fluorescent antibody method.
  • Example 5 In vitro ACTH secretion by CRH from ACTH-producing cells derived from ES cells (method) Mouse ES cells were differentiated into ACTH-producing cells by the SAG treatment and DAPT treatment using the method of Example 3 (22 days in total). ACTH secretion was quantified by allowing CRH (adrenocorticotropic hormone releasing factor) to act on the aggregate. Specifically, 8 aggregates per 500 ⁇ l of HBSS solution were added, and after 10 minutes pre-incubation at 37 ° C., CRH having a final concentration of 10-10000 ng / ml was added, and the culture supernatant after further incubation for 10 minutes Were collected and measured by ELISA (FIG. 4a).
  • CRH asdrenocorticotropic hormone releasing factor
  • Example 6 Secretion of ACTH and adrenocortical hormone in vivo by CRH from ACTH-producing cells derived from ES cells (method) Using the method of Example 3, mouse ES cells were transplanted under the kidney capsule of mice subjected to pituitary gland removal surgery, with the cell mass differentiated into ACTH-producing cells by SAG treatment and DAPT treatment (FIG. 5a right). . For these mice, it was confirmed before transplantation that ACTH secretion ability (reactivity to CRH) was lost (FIGS. 5b and 5c). Specifically, after a total of 22 days of culture, the cell aggregates were injected under the kidney capsule of pituitary-removed mice using a Hamilton syringe.
  • ACTH positive cell transplantation group derived from ES cells
  • ACTH reached a concentration of 25-30 pg / ml and Corticosterone reached 300 pg / ml after CRH loading (Fig. 5e, f: with CRH loading; Fig. 5g, h: CRH) No load).
  • Example 7 Improving survival and activity of pituitary-depleted mice by ectopic transplantation of ES cell-derived ACTH-producing cells (method)
  • mouse ES cell-derived ACTH-producing cells were transplanted under the kidney capsule of mice subjected to pituitary gland removal surgery (9 weeks old). The survival and weight gain of the transplanted mice were followed and compared with the sham operation. Spontaneous movement of mice was also examined. Spontaneous movement of the mice was measured using an IR sensor (MDC-W02 (BrainScienceIdea, Osaka)) to determine how much the mouse spontaneously moves in a cage in a day.
  • Example 8 Differentiation induction of pituitary progenitor cells from human ES cells (method) 12,000 human ES cells monodispersed with trypsin were cultured in the presence of 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y-27632 (Watanabe et al, Nature Neuroscience, 2007) as in Example 1 in suspension aggregate culture. As the culture solution, gfCDM added with 5% KSR was used. From the third day of culture, 0.5 nM, 1.5 nM, or 5.0 nM BMP4 was added to the culture solution, and from the sixth day of culture, 1000 nM SAG was added to continue the suspension culture.
  • each aggregate contains a large number of Rx-positive neural progenitor cells inside the aggregate, and E-cad and cytokeratin-positive non-neuronal ectoderm cells on the surface thereof are cultured with mouse ES cells. Similarly, a sheet-like epithelial structure composed of monolayer cells was formed (FIG. 7). According to qPCR analysis, the induction of Pitx1 expression was about 10 times that of the group not treated with 5 nM BMP (FIG. 8).
  • E-cad-positive non-neuronal ectoderm is present on the surface of the Rx-positive neuroepithelial structure after 25 days of culture, and a part of it, similar to pituitary placode formation in mouse culture. Thickened and exhibited a placode-like structure (FIG. 7).
  • ES cells from pluripotent stem cells such as ES cells, aggregates containing central nervous tissue and non-neural head ectoderm tissue, particularly rostral hypothalamic tissue and rostral head ectoderm tissue are included. Aggregates and pituitary progenitor tissues can be induced to differentiate in vitro, and various pituitary hormone-producing cells can be induced to differentiate.
  • the pituitary gland is a central endocrine organ that produces and secretes many hormones, and abnormal hormone secretion has a significant effect on the body.
  • the aggregates, pituitary progenitor tissues and pituitary hormone-producing cells obtained by the method of the present invention are particularly useful for treating diseases caused by pituitary hormone secretion failure and diseases causing pituitary hormone secretion failure, etc.
  • From aggregates including central nervous tissue and non-neural ectoderm tissue of the head not only the pituitary gland, but also placodes of sensory organs such as olfactory epithelium, lens, and inner ear can be formed.

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Abstract

　本発明は、無血清培地（好ましくは増殖因子及びインシュリン類を実質的に含まない）を用い、高細胞濃度で播種したＥＳ細胞等の多能性幹細胞から、均一な幹細胞の凝集体を形成し、形成された凝集体を浮遊培養することにより、吻側視床下部組織及び吻側頭部外胚葉組織を含む凝集体、下垂体前駆組織及び下垂体ホルモン産生細胞を得る方法を提供する。

Description

幹細胞の培養方法
　本発明は、幹細胞から、中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織とを含んでなる胚様体を試験管内で分化誘導する方法等に関する。また、特に中枢神経組織として、下垂体前駆組織及び各種下垂体ホルモン産生細胞を試験管内で分化誘導する方法等に関する。
　これまでに、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から神経分化誘導を行う培養法がいくつか知られている（非特許文献１－４、特許文献１－３）。
　本発明者らは、以前に、動物及びヒトのＥＳ細胞等の多能性幹細胞から神経分化誘導を行う方法として、無血清培地での分散浮遊培養（ＳＦＥＢ法）が有効であることを示した（非特許文献３、４及び特許文献１を参照）。その後、本発明者らは、無血清培地中で均一な幹細胞の凝集体を形成し、その凝集体を浮遊培養することにより、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から、大脳皮質組織、視床下部のニューロンやその前駆細胞等を効率的に分化誘導できる方法（ＳＦＥＢｑ法）を見出した（非特許文献５及び特許文献３）。
　脊椎動物において、下垂体や感覚器（嗅上皮、水晶体、内耳など）は神経板に面した頭部非神経外胚葉組織中に形成されるプラコードから、プラコードの誘導、プラコードの陥入、細胞の分化、形態形成を経て、発生する事が知られている。
　このうち下垂体は、多くのホルモンを産生・分泌する内分泌器官である。下垂体は腺性下垂体（ａｄｅｎｏｈｙｐｏｐｈｙｓｉｓ）と神経性下垂体（ｎｅｕｒｏｈｙｐｏｐｈｙｓｉｓ）（下垂体後葉ともいう）とに大きく二分され、腺性下垂体はさらに、下垂体前葉と下垂体中葉（中間部）とに二分される。腺性下垂体は、下垂体ホルモンを産生・分泌する複数種の細胞を含んでいる。
　この腺性下垂体は、原始口腔の陥入により生じたラトケ嚢（Ｒａｔｈｋｅ　ｐｏｕｃｈ）に由来する。哺乳動物の初期発生において、下垂体前葉原基は、前側神経板境界の吻側に隣接する頭部非神経外胚葉（吻側頭部非神経外胚葉）中のプラコードとして形成され、このプラコードが陥入してラトケ嚢を形成する。ラトケ嚢はその後外胚葉から分離して上皮性の小嚢胞となる。次いでこの小嚢胞の前壁が下垂体前葉となり、後壁が下垂体中葉となる。
　一方、神経性下垂体（下垂体後葉）は第三脳室の底部の突起から形成される。下垂体後葉には、視床下部の視索上核及び室傍核にある神経分泌ニューロン細胞体からの軸索が伸び、ホルモン（オキシトシン及びバソプレシン）が軸索輸送されている。
　これまでの研究によって、発生段階において、吻側視床下部と吻側頭部非神経外胚葉との相互作用がラトケ嚢の誘導に必要であることが示されている（非特許文献６）。
　このように、下垂体の後期発生プロセスは広く研究されているが、初期の外胚葉における下垂体原基の特定化については、依然理解されていない。さらに、大脳や視床下部等の神経細胞を分化誘導できる方法がこれまでに見出されているが（上記）、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から下垂体前駆組織や各種下垂体ホルモン産生細胞を試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で発生させることができる方法は、未だ知られていない。
　また、幹細胞を用いて糖尿病を治療することはこれまでにも検討されてきたが、視床下部－下垂体の機能不全に着目した再生医療の可能性に対しては、これまでほとんど注意が払われてこなかった。
ＷＯ２００５／１２３９０２号パンフレット 特開２００８－９９６６２号公報 ＷＯ２００９／１４８１７０号パンフレット
Watanabe, K. et al., Nature Biotechnology 25,681-686 (2007) Su, H.-L. et al., Developmental Biology 290,287-296 (2006) Ikeda, H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102,11331-11336 (2005) Watanabe, K. et al., Nature Neurosci.8,288-296 (2005) Wataya, T. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105, 11796-11801 (2008) Bharti, K. et al., Development 138, 873-878 (2011)
　本発明は、幹細胞から、中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織とを含んでなる胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｂｏｄｙ）（以下「凝集体」ともいう）を試験管内で分化誘導する方法を提供することを目的とする。また、特に中枢神経組織として、下垂体前駆組織及び下垂体ホルモン産生細胞へと試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で効率的に分化誘導する方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、下垂体前葉の発生をｉｎ　ｖｉｔｒｏで再現することに成功し、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から、下垂体前駆組織及び各下垂体ホルモン産生細胞を分化誘導することに成功した。具体的には、特許文献３及び非特許文献５に開示されたＳＦＥＢｑ法を用いて条件をさらに検討し、１つの凝集体中に中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織、特に吻側視床下部組織とシート状の連続上皮である吻側頭部非神経外胚葉組織の両方を同時に分化誘導できる条件を初めて見出した。さらにこの凝集体から、下垂体前駆組織（ラトケ嚢様の組織）を誘導し、この組織から各種下垂体ホルモン産生細胞を誘導することに成功した。このような知見に基づき、本発明者らは以下の発明を完成させた。
［１］無血清培地中で幹細胞の凝集体を形成させる工程、及び
　形成された凝集体を無血清培地中で浮遊培養する工程
を含む、視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体の製造方法。
［２］浮遊培養で用いる無血清培地がＳｈｈシグナル促進剤を含む、［１］に記載の製造方法。
［３］前記Ｓｈｈシグナル促進剤がＳＡＧである、［２］に記載の製造方法。
［４］浮遊培養で用いる無血清培地がＢＭＰシグナル促進剤を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］ＢＭＰシグナル促進剤がＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４である、［４］に記載の製造方法。
［６］前記視床下部組織及び頭部非神経外胚葉が、吻側視床下部組織及びシート状の連続上皮である吻側頭部非神経外胚葉組織である、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記吻側視床下部組織がＲｘ陽性である、［６］に記載の製造方法。
［８］シート状の連続上皮である吻側頭部非神経外胚葉組織がＰｉｔｘ１陽性である、［６］記載の方法。
［９］前記無血清培地が、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸及びインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地である、［１］に記載の製造方法。
［１０］前記幹細胞がヒト由来である、［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］前記視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体が、Ｌｉｍ３陽性細胞を更に含む、［１］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］前記Ｌｉｍ３陽性細胞が、凝集体中に上皮性の小嚢胞を形成することを特徴とする、［１１］に記載の製造方法。
［１３］浮遊培養により、幹細胞の凝集体における内因性の増殖因子の発現を増加させる、［１］に記載の製造方法。
［１４］前記内因性の増殖因子がＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４である、［１３］に記載の製造方法。
［１５］前記ＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４の発現が、低細胞濃度で幹細胞の凝集体を形成させた場合と比較して、ｍＲＮＡレベルで２倍以上増加することを特徴とする、［１４］に記載の製造方法。
［１６］［１］～［１５］のいずれかに記載の方法によって製造された視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む無血清培地中でさらに浮遊培養する工程を含む、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞の製造方法。
［１７］前記Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤がＤＡＰＴである、［１６］に記載の製造方法。
［１８］［１６］又は［１７］に記載の方法で製造された副腎皮質刺激ホルモン産生細胞を被験体に移植することを含む、被験体において副腎皮質刺激ホルモンの分泌不全を改善する方法。
［１９］［１］～［１５］のいずれかに記載の方法によって製造された視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、グルココルチコイドを含む無血清培地中でさらに浮遊培養する工程を含む、成長ホルモン産生細胞の製造方法。
［２０］前記無血清培地がインシュリンをさらに含む、［１９］に記載の製造方法。
［２１］前記視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、グルココルチコイドを含む無血清培地中で浮遊培養する工程の前又は同時に、ＧＳＫ３β阻害剤を含む無血清培地中で浮遊培養する工程を含む、［１９］又は［２０］に記載の成長ホルモン産生細胞の製造方法。
［２２］前記ＧＳＫ３β阻害剤がＢＩＯである、［２１］に記載の製造方法。
［２３］［１９］～［２２］のいずれかに記載の方法で製造された成長ホルモン産生細胞を被験体に移植することを含む、被験体において成長ホルモンの分泌不全を改善する方法。
［２４］［１］～［１５］のいずれかに記載の方法によって製造された視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、エストロゲンを含む無血清培地中でさらに浮遊培養する工程を含む、プロラクチン産生細胞の製造方法。
［２５］前記無血清培地がインシュリンをさらに含む、［２４］に記載の製造方法。
［２６］前記視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、エストロゲンを含む無血清培地中で浮遊培養する工程の前又は同時に、ＧＳＫ３β阻害剤を含む無血清培地中で浮遊培養する工程を含む、［２４］又は［２５］に記載のプロラクチン産生細胞の製造方法。
［２７］前記ＧＳＫ３β阻害剤がＢＩＯである、［２６］に記載の製造方法。
［２８］［２４］～［２７］のいずれかに記載の方法で製造されたプロラクチン産生細胞を被験体に移植することを含む、被験体においてプロラクチンの分泌不全を改善する方法。
［２９］［１］～［１５］のいずれかの製造方法で製造された視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、無血清培地中でストローマ細胞を培養することによって得られたストローマ細胞の馴化培地中でさらに浮遊培養する工程を含む、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン及び/又は甲状腺刺激ホルモン産生細胞の製造方法。
［３０］前記ストローマ細胞がＰＡ６細胞である、［２９］に記載の製造方法。
［３１］［２９］又は［３０］に記載の方法で製造された卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン又は甲状腺刺激ホルモン産生細胞を被験体に移植することを含む、被験体において卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン又は甲状腺刺激ホルモンの分泌不全を改善する方法。
［３２］無血清培地中で幹細胞の凝集体を形成させる工程、及び
　形成された凝集体を無血清培地中で浮遊培養する工程
を含む、中枢神経組織及び頭部非神経外胚葉組織を共に含んでなる凝集体の製造方法。
［３３］［３２］に記載の凝集体においてプラコードが自己形成される、嗅上皮、水晶体又は内耳を形成するプラコードの製造方法。
　本発明の方法によれば、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から、中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織、具体的には吻側視床下部組織及びシート状の連続上皮である吻側頭部外胚葉組織を含む凝集体や下垂体前駆組織を試験管内で分化誘導し、さらに各種下垂体ホルモン産生細胞を分化誘導することができる。下垂体は多くのホルモンを産生・分泌する中心的な内分泌器官であり、ホルモン分泌の異常は生体に対し重大な影響を及ぼす。従って、本発明の方法で得られた凝集体、下垂体前駆組織及び下垂体ホルモン産生細胞は、下垂体ホルモンの分泌不全によって引き起こされる疾患や下垂体ホルモンの分泌不全を引き起こす疾患の治療等に利用することができる。
図１ａは、生体内での下垂体発生を示す模式図（矢状断面）である。図１ｂは、生体内（Ｅ１３）におけるラトケ嚢及び隣接する腹側視床下部組織の遺伝子発現を示す図である（視床下部マーカーＲｘ：緑；頭部非神経外胚葉マーカーＰｉｔｘ１：赤）。図１ｃは、ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ培養（３０００細胞／凝集体）したＥＳＣにおけるＰｉｔｘ２の発現レベルを示す。Ｐｉｔｘ２の発現は殆ど見られなかった。図１ｄは、ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ－ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ（ＬＣＡ；１００００細胞／凝集体で開始）条件（赤）下又はＢＭＰ４処理（青）により、ＳＦＥＢｑ／ＣＤＭ培養したＥＳＣのＰｉｔｘ２発現が上昇したことを示す。図１ｅ及びｆは、マウスＥＳ細胞を高濃度（ＬＣＡ条件）で播種し、ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法で培養することによって得られた凝集体における、Ｐｉｔｘ１（赤）及びＲｘ（緑）の発現を示す図である。図１ｇは図１ｆの模式図である。図１ｈは、Ｒｘ＋組織がＣｈｘ１０－/Ｎｅｓｔｉｎ＋であることを示す。図１ｉは、Ｌｉｍ３のｍＲＮＡ発現量に対するＳｈｈシグナル促進剤ＳＡＧ添加のタイミングの影響を示すグラフである。図１ｊは、ＳＡＧ処理したＬＣＡ凝集体中のｌｉｍ３：：ｖｅｎｕｓ＋集団（緑）を示すＦＡＣＳ分析の結果である。図１ｋは、ＳＡＧ処理なし（左）及びＳＡＧ処理あり（右）の場合の、凝集体中のｌｉｍ３発現の比較を示す。スケールバー：１００μｍ（ｂ、ｅ、ｆ）；５０μｍ（ｈ）；５００μｍ（ｋ）。 図２ａは、ＳＡＧ処理した培養１３日目における凝集体中のｌｉｍ３陽性細胞のクラスターを示す図である。図２ｂは、凝集体中のＬｉｍ３陽性細胞が、神経細胞マーカーであるＴｕｊ１を発現していないことを示す図である（Ｌｉｍ３（緑）、Ｔｕｊ１（赤）、Ｐｉｔｘ１（白））。図２ｃは、凝集体において中胚葉マーカーであるＢｒａｃｈｙｕｒｙがほとんど発現していないことを示す。図２ｄ－ｆは、凝集体中のｌｉｍ３陽性細胞がラトケ嚢様の小嚢胞を形成していく様子を示している（８～１２日目）。図２ｇ－ｊは、ＳＡＧ処理した小嚢胞及びその周辺のマーカー遺伝子の発現を示す図である（Ｐｉｔｘ１（赤）、ｌｉｍ３（緑、ｇ；白、ｈ；赤、ｊ）、パンサイトケラチン（緑、ｈ）、Ｒｘ（緑、ｉ、ｊ））。図２ｋは、小嚢胞及びその周囲のマーカー遺伝子発現を示す模式図である。図２ｌは、生体内でのラトケ嚢及びその周辺のＰｉｔｘ１（赤）、ａＰＫＣ（緑）（ａｐｉｃａｌマーカー）の発現を示す図である。図２ｍ及びｎは、小嚢胞の電子顕微鏡写真である。ｔａｌｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ（ｍ、頂端、上方）、基底側の剥離細胞（ｍ、角括弧）、ａｐｉｃａｌ　ｃｉｌｉａ（ｎ、矢頭）、ａｐｉｃａｌ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ（ｎ、矢印）。図２ｏは、小嚢胞の基底側のＩｓｌｅｔ１陽性細胞を示す図である（Ｌｉｍ３（緑）、Ｉｓｌ１（赤））。図２ｐは、得られたラトケ嚢様小胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ生成の模式図を示す。スケールバー、１００μｍ（ａ－ｄ、ｆ、ｇ）；５０μｍ（ｅ、ｉ、ｌ）；２０μｍ（ｊ）；２μｍ（ｋ）。 図３ａは、各下垂体ホルモン産生細胞の分化を示す図である。図３ｂは、ＳＡＧ処理で得られた下垂体前駆組織をＤＡＰＴ処理するとＴｂｘ１９発現が増強されることを示す（２０日目）（ＤＡＰＴ処理（１８－１９日目）/ＢＩＯ処理（１６－１８日目））。図３ｃは、２２日目の非神経（Ｎ－ｃａｄ－）細胞中のＡＣＴＨ＋細胞の割合を示す（ＤＡＰＴ処理（１８－１９日目）/ＢＩＯ処理（１６－１８日目））。図３ｄ－ｇは、ＳＡＧ＋ＤＡＰＴ処理した凝集体における遺伝子マーカーの発現を示す。赤：ＡＣＴＨ、緑：Ｅ－カドヘリン（ｅ）/ニューロフィラメント（ｆ）/ＰＣ２（ｇ）。図３ｈは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処理によるｌｉｍ３のｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンにより、Ｔｂｘ１９及びＡＣＴＨの発現が低下することを示す。図３ｉは、ＤＡＰＴ処理したＬＣＡ＋ＳＡＧ　ＳＦＥＢｑ凝集体の、Ｒｘ、ｌｉｍ３及びＡＣＴＨの発現を示す。図３ｊは、ＥＳＣ由来の嚢からの副腎皮質刺激ホルモン産生細胞生成を模式的に示す。図３ｋは、Ｐｉｔｘ１発現に対するＤＡＰＴ、ＢＩＯ及びＩＷＰ２の影響を示すグラフである（２６日目）。図３ｌ及びｍは、ＬＣＡ＋ＳＡＧ凝集体（３３日目）における、ＧＨ＋細胞の生成を示す（ヒドロコーチゾン及びインスリンを２０－３０日目に添加）。図３ｎ及びｏは、ＬＣＡ＋ＳＡＧ凝集体（３３日目）における、Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ＋細胞の生成を示す（エストラジオール及びインスリンを２０－３０日目に添加）。図３ｐ－ｓは、ＬＣＡ＋ＳＡＧ凝集体（３３日目）における、ＬＨ＋細胞、ＦＳＨ＋細胞、ＴＳＨ＋細胞（ＰＡ６のコンディションメディウム（馴化培地）を１０日目から添加）の生成を示す。スケールバー、２０μｍ（ｄ、ｅ）；５０μｍ（ｆ、ｇ）；１００μｍ（ｍ、ｏ、ｑ、ｒ、ｓ）。 図４ａは、ＣＲＨ負荷によるＡＣＴＨ分泌試験の模式図である。図４ｂは、ＣＲＨ負荷によるＡＣＴＨ分泌の促進を示す。図４ｃは、種々の用量のＣＲＨ負荷によるＡＣＴＨ分泌の促進を示す。図４ｄは、凝集体からのＡＣＴＨ分泌に対する、ＳＡＧ、ＤＡＰＴ及びＣＲＨ処理の影響を示す。図４ｅは、ＣＲＨによるＡＣＴＨ分泌の促進が、ＡＣＴＨ分泌の負のフィードバック因子ヒドロコーチゾン（Ｆ）での前処理によって抑制されることを示す。図４ｆは、エストラジオール（Ｅ２）での前処理がＡＣＴＨ分泌に影響しないことを示す。 図５ａは、下垂体除去マウスへの凝集体の移植実験のデザイン及び術後7日目の、下垂体除去マウスの腎臓被膜下に移植した凝集体（ＧＦＰ標識）の生着を示す図である（赤：ＡＣＴＨ＋細胞；青：ＤＡＰＩ；スケールバー、１００μｍ）。図５ｂ及びｃは、下垂体除去によりＡＣＴＨが産生されなくなったことを示す（ＣＲＨ負荷なし（ｂ）、あり（ｃ））。図５ｄは、ＣＲＨ負荷あり（右）又はなし（左）での、移植マウスにおけるＡＣＴＨレベルを示す。図５ｅ及びｆはそれぞれ、ＣＲＨ負荷によるＡＣＴＨ産生及びコルチコステロン産生の増加を示し、図５ｇ及びｈは、ＣＲＨ負荷なしの基底レベルのＡＣＴＨ産生及びコルチコステロン産生を示す。図５ｉ及びｊは、ＡＣＴＨ産生細胞の移植による、下垂体除去マウスの自発運動能の改善を示す。図５ｋはKaplan-Meyer法によって分析した、凝集体移植手術後の下垂体除去マウスの生存を示す。 図６は、３０００細胞／凝集体（ＬＣＡ－）又は１００００細胞／凝集体（ＬＣＡ＋）で開始した、ｇｆＣＤＭ／ＳＦＥＢｑ培養物におけるＢＭＰ２及びＢＭＰ４の発現を示す。 図７は、ヒトＥＳ細胞１２０００細胞／凝集体を用い浮遊凝集塊培養を行った結果である。培養３日目にＢＭＰ４を５ｎＭ添加した凝集塊では、Ｒｘ＋の吻側視床下部組織の細胞が、Ｅ－カドヘリン＋の吻側頭部非神経外胚葉組織の細胞からなる単層のシート状の連続上皮に内包された凝集体が培養１７日目には形成されていた。さらに、培養２５日目にはＥ－カドヘリン＋の肥厚した非神経外胚葉の形成がみられた。 図８は、図７における培養１７日目の細胞凝集体を用い、吻側頭部非神経外胚葉組織のマーカーであるＰｉｔｘ１のｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲで測定した結果である。ＢＭＰ４を５ｎＭ添加した凝集体では無添加の凝集体に比べ、Ｐｉｔｘ１のｍＲＮＡ発現が約１０倍増加していた。
　以下に本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の製造方法によって得られる組織及び細胞
（Ａ）中枢神経組織及び頭部非神経外胚葉組織を含む凝集体
　本発明の製造方法（分化誘導方法という場合がある）によれば、中枢神経組織及び頭部非神経外胚葉組織、特に吻側視床下部組織（単に視床下部組織ともいう）及びシート状の連続上皮である吻側頭部非神経外胚葉組織（単に頭部非神経外胚葉組織ともいう）を共に含んでなる凝集体が分化誘導される。吻側視床下部組織及びシート状の連続上皮である吻側頭部非神経外胚葉組織を含む凝集体は、例えば、シート状の連続上皮様の一層のＰｉｔｘ1陽性の細胞群からなる吻側頭部非神経外胚葉組織が培養液との接触面に存在し、その内部にＲｘ陽性の細胞群からなる吻側視床下部組織を含む細胞塊である。本発明の分化誘導方法では、１つの凝集体中に中枢神経組織及び頭部非神経外胚葉組織の両方の組織が同時に形成される（具体的には、１つの凝集体中、中枢神経組織の外側に、シート状の頭部非神経外胚葉組織が形成される）ため、これらの組織は局所的に相互作用することができるようになる。
　個体の発生段階において、ラトケ嚢（下垂体の前駆組織）を誘導するには、吻側視床下部組織と吻側頭部非神経外胚葉組織との相互作用が必要であることが知られている（Bharti et al (2011) Development 138, 873-878）。
　例えば、１つの凝集体中、吻側視床下部組織の外側に、シート状の連続上皮である吻側頭部非神経外胚葉組織が形成されると、これらの組織は局所的に相互作用することができるようになり、下垂体前駆組織、ひいては下垂体ホルモン産生細胞を誘導する。
　また、感覚器を形成する外胚葉性の頭部プラコードの形成にも、中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織との相互作用が必要である。具体的には、嗅上皮は、大脳組織と吻側頭部非神経外胚葉組織との相互作用により形成されるプラコード（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　ｐｌａｃｏｄｅ）を経て発生し；水晶体は、網膜組織と頭部非神経外胚葉組織との相互作用により形成されるプラコード（Ｌｅｎｓ　ｐｌａｃｏｄｅ）を経て発生し；内耳は、後脳組織と頭部非神経外胚葉組織との相互作用により形成されるプラコード（Ｏｔｉｃ　ｐｌａｃｏｄｅ）を経て発生する。
　つまり、上述の組織の組み合わせが１つの凝集体中に上述の構成で形成されると、これらの組織は局所的に相互作用することができるようになり、各プラコードの形成、ひいては各感覚器の発生が導かれる。
　凝集体中の細胞が、中枢神経組織及び頭部非神経外胚葉組織のいずれに属する細胞であるかは、正常に発生している生体内で観察される、中枢神経組織及び頭部非神経外胚葉組織の遺伝子発現プロフィールに基づいて判定することができる。具体的な遺伝子発現プロフィールは以下の（Ｄ）に記載している。一態様において、吻側視床下部組織は、Ｒｘ＋、Ｎ－カドヘリン＋、Ｓｏｘ１＋の神経組織である。一態様において、吻側視床下部組織は、Ｒｘ＋、Ｃｈｘ１０－、Ｎｋｘ２．１＋、Ｎｅｓｔｉｎ＋の神経組織である。一態様において、吻側頭部外胚葉組織（吻側頭部非神経外胚葉）は、凝集体の表層に形成されるＰｉｔｘ１陽性、Ｎ－カドヘリン＋の単層の細胞からなるシート状の連続上皮組織である。
（Ｂ）ラトケ嚢様組織
　生体の発生では、腺性下垂体（下垂体前葉及び下垂体中葉）は、ラトケ嚢と呼ばれる組織から誘導される。ラトケ嚢は、個体発生のごく初期に吻側頭部非神経外胚葉に形成されたプラコードが陥入して形成され、後に外胚葉から分離して上皮性の小嚢胞となる。
　本発明の方法によれば、吻側視床下部組織及び吻側頭部非神経外胚葉組織を含む上記凝集体において、ラトケ嚢と同様の上皮構造や極性を持つ小嚢胞が形成される。この小嚢胞は、生体内のラトケ嚢と同様、視床下部組織の近傍に存在し、且つ吻側頭部非神経外胚葉組織とも隣接する。つまり、本発明の方法により、生体の下垂体発生時の微小環境を再現することができる（図２ｐを参照のこと）。
　従って、本発明でいう「ラトケ嚢様組織」又は「下垂体前駆組織」とは、正常に発生している生体内で観察されるラトケ嚢と同様の形態的特徴（凹状又は小嚢胞状）を有する、視床下部組織及び吻側頭部非神経外胚葉組織の近傍に存在する、生体内のラトケ嚢と同じ遺伝子発現プロフィールをもつ、などの特徴によって規定される。具体的な遺伝子発現プロフィールは以下の（Ｄ）に記載している。一態様において、ラトケ嚢様組織は、Ｌｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞である。
（Ｃ）下垂体ホルモン産生細胞
　下垂体前葉からは、副腎皮質刺激ホルモン（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ　ｈｏｒｍｏｎｅ（ＡＣＴＨ））及び、成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＨ））、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ（ＴＳＨ））、プロラクチン（ｐｒｏｌａｃｔｉｎ（ＰＲＬ））、卵胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ（ＦＳＨ））、黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ（ＬＨ））（下垂体前葉ホルモン）が分泌され、下垂体中葉からは、メラニン細胞刺激ホルモン（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ（ＭＳＨ））（下垂体中葉ホルモン）が分泌される。ＭＳＨは、ＡＣＴＨ関連ペプチドの１つであり、ＡＣＴＨと共通の前駆体であるプロピオメラノコルチンの酵素分解によって形成される。一方、下垂体後葉が分泌するホルモンのオキシトシン（ｏｘｙｔｏｃｉｎ（ＯＸ））及びバソプレシン（ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ（ＶＰ））は、視床下部で産生されるホルモンであるので、本明細書中では下垂体ホルモンに含めないものとする。本明細書で下垂体ホルモンという場合、下垂体前葉ホルモンを指すものとする。
（ｉ）副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）
　コルチコトロピンともいう。下垂体前葉の副腎皮質刺激ホルモン産生・分泌細胞（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈ）から分泌される、３９アミノ酸のペプチドホルモンである。ＡＣＴＨは、グルココルチコイド分泌促進作用を示す。ＡＣＴＨの分泌は、視床下部から分泌される副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ（ＣＲＨ））によって促進され、グルココルチコイドによってネガティブフィードバックされる。
（ｉｉ）成長ホルモン（ＧＨ）
　ソマトトロピンともいう。下垂体前葉の成長ホルモン産生・分泌細胞（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈ）から分泌される、ヒトの場合１９１アミノ酸のペプチドホルモンである。ＧＨは、タンパク質合成や軟骨発育の促進作用、脂肪分解作用などの、種々の生物活性を示す。ＧＨの分泌は、視床下部から分泌される成長ホルモン放出ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＨＲＨ））によって刺激され、ソマトスタチンによって抑制される。ＧＨの分泌は、ＧＨ自体及びＩＧＦ－１によってもネガティブフィードバックされる。
（ｉｉｉ）プロラクチン（ＰＲＬ）
　下垂体前葉のプロラクチン産生・分泌細胞（ｌａｃｔｏｔｒｏｐｈ）から主に分泌される、１９９アミノ酸のペプチドホルモンである。ＰＲＬは、ヒトでは女性ホルモンの存在下で乳汁分泌や乳腺の分化・発達を促進し、妊娠維持等の作用を持つ。ＰＲＬの分泌は、プロラクチン放出因子（ＰＲＦ）（例、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、バソプレシン、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、ペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩ））及びＴＲＨによって促進され、プロラクチン放出抑制因子（ＰＩＦ）（例、ドパミン、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ））によって抑制される。
（ｉｖ）黄体形成ホルモン（ＬＨ）
　性腺刺激ホルモン（ゴナドトロピン）の一種であり、下垂体前葉の性腺刺激ホルモン産生・分泌細胞（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈ）から分泌される、αサブユニットとβサブユニットからなる糖タンパク質である。ＬＨは、女性では、ＦＳＨと共に発育卵胞に作用して卵胞を発育させ、排卵及び黄体の形成を促し、エストロゲン及びプロゲステロンの産生を促進し、月経周期の形成に重要な役割を果たす。男性では、精巣のライディッヒ細胞に作用してテストステロンの分泌を促す。ＬＨの分泌も、視床下部から分泌される性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧｎＲＨ））によって促進される。
（ｖ）卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）
　性腺刺激ホルモン（ゴナドトロピン）の一種であり、下垂体前葉の性腺刺激ホルモン産生・分泌細胞（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈ）から分泌される、αサブユニットとβサブユニットからなる糖タンパク質である。ＦＳＨの分泌は、視床下部から分泌される性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧｎＲＨ））によって促進される。ＦＳＨは、女性においては卵巣に作用して原始卵胞を発育卵胞にし、ＬＨと協働して成熟卵胞へと発育させて、卵胞からのエストロゲン分泌を促進させる。エストロゲンが増加すると、視床下部へのフィードバックによってＧｎＲＨの分泌が抑制されてＦＳＨの分泌も抑制されるが、エストロゲンがさらに増加すると視床下部・下垂体へのポジティブフィードバックが働き、ＧｎＲＨが増加する。男性では、精巣のセルトリ細胞に作用して、テストステロンの分泌を促進し、精子形成を促進する。
（ｖｉ）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）
　下垂体前葉の甲状腺刺激ホルモン産生・分泌細胞（ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｈ）から分泌される、αサブユニットとβサブユニットからなる糖タンパク質である（αサブユニットはＬＨ、ＦＳＨと共通である）。ＴＳＨは、甲状腺に作用して、甲状腺ホルモンの産生・分泌を促進する。ＴＳＨの分泌は、視床下部から分泌される甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ（ＴＲＨ））によって刺激され、甲状腺ホルモンによってネガティブフィードバックされる。
　本発明の分化誘導方法によって得られた、これらの下垂体ホルモンのいずれかを産生し分泌し得る細胞を、本明細書中では「下垂体ホルモン産生細胞」と総称する。
　上記下垂体ホルモンのいずれかの産生・分泌の不全によって引き起こされる疾患としては、副腎皮質機能低下症、成長ホルモン分泌不全性低身長症、成人発症ＧＨ欠乏症、下垂体性小人症、クレチン病、不妊症等が挙げられる。また、汎下垂体機能低下症（エンプティセラ症候群、下垂体アポプレキシー、術後下垂体損傷が含まれる）、部分的下垂体機能低下症、下垂体前葉ホルモン単独欠損症（具体的には、ＡＣＴＨ単独欠損症、成長ホルモン単独欠損症、ＴＳＨ単独欠損症、プロラクチン単独欠損症、性腺刺激ホルモン単独欠損症）においては、上記下垂体ホルモンの１ないし全てのホルモンの産生・分泌の不全が生じる。
（Ｄ）組織及び細胞の同定
　本発明の方法により得られた組織又は細胞は、マーカー遺伝子の発現の有無、又は下垂体ホルモン産生細胞の場合には下垂体ホルモンの培地への放出若しくは細胞内におけるその前駆タンパク質の蓄積等を指標とし、必要に応じてそれらを組み合わせることにより、いずれの組織又は細胞に分化したかを確認することができる。また、組織や細胞の形態を観察することによって、得られた組織又は細胞を特定することもできる。更に、このようなマーカー発現パターンや組織又は細胞の形態に基づき、所望の特定の組織又は細胞を単離することもできる。
　本発明で使用されるマーカーとしては、ＡＣＴＨ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ等の下垂体ホルモン、Ｎ－カドヘリン、Ｎｋｘ２．１（神経マーカー）、Ｓｏｘ１（神経外胚葉マーカー）、ネスチン（神経外胚葉マーカー）、ニューロフィラメント及びＮＳＥ(ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ)（ニューロンマーカー）、Ｒｘ（視床下部マーカー）、Ｐｉｔｘ１及びＰｉｔｘ２（頭部非神経外胚葉マーカー）、Ｃｈｘ１０（網膜マーカー）、Ｌｉｍ３（初期下垂体/下垂体前駆組織マーカー）、Ｉｓｌｅｔ１及び２（後期ラトケ嚢マーカー）、Ｅ－カドヘリン（上皮細胞マーカー）、Ｐｒｏｐ１及びＰｉｔ１（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈ、ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈ、ｌａｃｔｏｔｒｏｐｈ又はｃａｕｄｏｍｅｄｉａｌ　ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｈ前駆体に特異的なマーカー）、Ｔｂｘ１９（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈに特異的なマーカー）、ＰＣ２（ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｃ　ｌｉｎｅａｇｅマーカー）等が挙げられるが、これらに限定されない。これら及び他のマーカー遺伝子の発現の有無を適宜組み合わせることにより、得られた細胞の正体を特定することができる。
　本発明の分化誘導方法によって得られる組織または細胞は、生体内の実際の組織又は細胞の遺伝子発現プロフィールに従って特徴付けることができる。
　例えば、上記マーカーを用いて規定すると、吻側視床下部組織の細胞は、Ｒｘ＋、好ましくはＲｘ＋、Ｎ－カドヘリン＋、ネスチン＋、Ｎｋｘ２．１＋、Ｃｈｘ１０-である。吻側頭部外胚葉組織（吻側頭部非神経外胚葉）の細胞は、Ｐｉｔｘ１＋、好ましくはＰｉｔｘ１＋、Ｐｉｔｘ２＋、Ｅ－カドヘリン＋である。下垂体前駆組織（ラトケ嚢様組織）の細胞は、Ｌｉｍ３＋、Ｐｉｔｘ１＋、Ｐｉｔｘ２＋、Ｉｓｌ１＋、Ｅ－カドヘリン＋である（これは、下垂体原基の発現プロフィールと一致する）。下垂体性（非ニューロン）のホルモン産生細胞は、ニューロフィラメント－、ＮＳＥ－である。下垂体性ＡＣＴＨ産生細胞は、ＡＣＴＨ＋、Ｔｂｘ１９＋、ＰＣ２－であり、その他の下垂体ホルモン産生細胞はＴｂｘ１９－である。また、下垂体中葉のＭＳＨ産生細胞はＡＣＴＨ－、Ｔｂｘ１９＋、ＰＣ２＋である。下垂体性のＧＨ産生細胞、ＰＲＬ産生細胞及びＴＳＨ産生細胞は、Ｐｉｔｘ１＋の中間前駆体を経て、各下垂体ホルモン産生細胞へと分化する。
　本発明の方法によれば、上記中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織、例えば吻側視床下部組織と吻側頭部外胚葉組織（吻側頭部非神経外胚葉）とが、１つの凝集体中に同時に分化誘導される。このとき、吻側頭部外胚葉組織（頭部非神経外胚葉）が表層に、その内側に中枢神経組織（吻側視床下部組織）が存在する凝集体が得られる。
　本発明のさらなる方法によれば、凝集体中にラトケ嚢様組織が形成される。この小嚢胞は、下垂体前駆組織と同一のマーカー発現を示し、形態学的にも類似した上皮構造や極性を有している。さらに、生体内の下垂体前駆組織（ラトケ嚢）と同じく、Ｒｘ陽性の視床下部組織の近傍に存在し、吻側頭部非神経外胚葉組織とも隣接して形成される。このことは、本発明の分化誘導法において、胚発生過程における下垂体前駆組織の発生の微小環境が模倣されたことを示す。従って、本発明においては、このラトケ嚢様組織を下垂体前駆組織とも呼ぶ。
　下垂体ホルモン産生細胞の場合には、ＡＣＴＨ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨのそれぞれの、培地への放出若しくは細胞内におけるその前駆タンパク質の蓄積等を指標として、各下垂体ホルモン産生細胞の分化を確認することができる。
　各下垂体ホルモン産生細胞に特異的なマーカー遺伝子の発現を指標とする場合、ＡＣＴＨ産生細胞はＡＣＴＨ及びＴｂｘ１９の発現を指標として、ＧＨ産生細胞はＧＨの発現を指標として、ＰＲＬ産生細胞はＰＲＬの発現を指標として、ＴＳＨ産生細胞はＴＳＨの発現を指標として、ＦＳＨ産生細胞はＦＳＨの発現を指標として、ＬＨ産生細胞はＬＨの発現を指標として、それぞれ特徴付けることができる。下垂体ホルモンはニューロンからも分泌され得るが、本発明の製造方法によって得られる各下垂体ホルモン産生細胞は、神経マーカーのＮＳＥやニューロフィラメントが陰性である点で、そのようなニューロンと区別することができる。
　マーカー遺伝子の発現は、定量ＰＣＲを、例えば、製造者の指示に従って７５００　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施し、ＧＡＰＤＨ発現によってデータを正規化することにより解析する。定量ＰＣＲの方法は当業者に公知である。或いは、目的とするマーカー遺伝子が、マーカー遺伝子産物とＧＦＰやｖｅｎｕｓなどとの融合タンパク質として発現されるように、細胞を操作してもよい（ノックイン）。マーカー遺伝子産物に対して特異的な抗体を用いて、タンパク質の発現を検出することもできる。
　これらのタンパク質の検出は、免疫染色又はラジオイムノアッセイにより実施することができる。また、その他の下垂体ホルモン産生についても、産生されるホルモン等に特異的な抗体等を用いて、同様のアッセイが可能である。このような方法は当業者に公知である。
（２）幹細胞
　「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持することができる細胞のことをいう。幹細胞の例としては、受精卵あるいはクローン胚由来で多能性を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、生体内の組織中に存在する体性幹細胞や多能性幹細胞、各組織の基になる肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、生殖幹細胞由来の多能性幹細胞、体細胞由来で核初期化によって得られる多能性幹細胞などが挙げられる。
　なかでも「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（分化万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいい、胚性幹細胞もこれに含まれる。「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞から得られる。また、体細胞に数種類の遺伝子を導入することにより、胚性幹細胞に似た分化万能性を人工的に持たせた細胞（人工多能性幹細胞ともいう）も含む。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作成することが可能である。例えば、Ｃｅｌｌ　１３１（５）ｐｐ．８６１－８７２や、Ｃｅｌｌ　１２６（４）ｐｐ．６６３－６７６に記載の方法などが挙げられる。
　幹細胞としては、例えば温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
　具体的に本発明の方法で用いられる幹細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞Ｉ」と省略）、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩ」と省略）、体細胞へ数種類の遺伝子を導入することにより、および／または化合物を作用させることにより樹立した誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、および胚性幹細胞Ｉ、胚性幹細胞ＩＩ又はｉＰＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した多能性幹細胞（以下、「改変多能性幹細胞」と省略）が挙げられる。
　より具体的には、胚性幹細胞Ｉとしては、初期胚を構成する内部細胞塊より樹立された胚性幹細胞、始原生殖細胞から樹立されたＥＧ細胞、着床以前の初期胚の多分化能を有する細胞集団（例えば、原始外胚葉）から単離した細胞、あるいはその細胞を培養することによって得られる細胞などが挙げられる。
　胚性幹細胞Ｉは、着床以前の初期胚を、文献（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４））に記載された方法に従って培養することにより調製することができる。
　胚性幹細胞ＩＩは、例えば、Ｗｉｌｍｕｔら（Ｎａｔｕｒｅ　３８５，８１０（１９９７））、Ｃｉｂｅｌｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６（１９９８））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素，４４，８９２（１９９９））、Ｂａｇｕｉｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４５６（１９９９））、Ｗａｋａｙａｍａら（Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１２７（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４９８４（１９９９））、ＲｉｄｅｏｕｔＩＩＩら（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１０９（２０００））等によって報告された方法を用いることにより、例えば以下のように作製することができる。
　哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）し、除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した卵を培養することによって、他の体細胞の核を有し、かつ正常な発生を開始した卵が得られる。
　体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。例えば、核を提供する側の細胞を培養している培地を、５～３０％、好ましくは１０％の仔ウシ胎児血清を含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３～１０日、好ましくは５日間、０～１％、より好ましくは０．５％の仔ウシ胎児血清を含む貧栄養培地に変えて培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導することで初期化することができる。
　また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、核を提供する側の細胞の核を注入し、数時間、好ましくは約１～６時間培養することで初期化することができる。
　初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することが可能となる。初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法としては複数の方法が知られている。細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることができる。
　同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した核を、再度マイクロマニピュレーターを用いた方法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植し、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激後、細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適である。
　いったん発生を開始した卵が得られれば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の公知の方法を用い、胚性幹細胞を取得することができる。
　ｉＰＳ細胞は、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）に例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（必要に応じて更にｃ－Ｍｙｃ又はｎ－Ｍｙｃ）を導入することにより製造することが出来（Ｃｅｌｌ，１２６：ｐ．６６３－６７６，２００６；Ｎａｔｕｒｅ，４４８：ｐ．３１３－３１７，２００７；Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２６：ｐ．１０１－１０６，２００８；Ｃｅｌｌ　１３１：８６１－８７２，２００７）、また、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２、（必要に応じて更にＫｌｆ４）を導入し、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるバルプロ酸を作用させることにより製造することも出来る（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６：ｐ．１２６９－１２７５，２００８）が、これらに限定されない。
　改変多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変多能性幹細胞の作製に際して改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法を用い、行うことができる。
　具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲティングベクターを作製する。作製したターゲティングベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲティングベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した幹細胞を作製することができる。
　標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ　Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。
　標的遺伝子を相同組換えするためのターゲティングベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。なお、ターゲティングベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができ、また、選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。
　選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。
　また、幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。マウス胚性幹細胞の例としては、ＥＢ５細胞などが挙げられる。
　幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ＬＩＦを添加した無フィーダー細胞による培養により維持できる。
（３）均一な幹細胞凝集体の形成及びその浮遊培養
　本発明の分化誘導方法で用いる、均一な幹細胞の凝集体を形成させる工程及び凝集体を浮遊培養する工程は、特許文献３及び非特許文献５に開示された「ＳＦＥＢｑ法」とほぼ同様のものである。
　「均一な幹細胞の凝集体を形成させる」とは、幹細胞を集合させて幹細胞の凝集体を形成させて培養させる（凝集体培養）際に、「一定の数の分散した幹細胞を迅速に凝集」させることで質的に均一な幹細胞の凝集体を形成することをいう。さらに、特に「細胞を迅速に凝集」させることによって、幹細胞から派生する細胞の上皮化を促進させることをいう。すなわち本明細書中、「細胞を迅速に凝集」させるとは、幹細胞を均一に凝集させることによって産生される細胞の上皮様構造を再現性よく形成させることをいう。
　均一な幹細胞の凝集体を「浮遊培養する」または「浮遊凝集体（凝集塊ともいう）として培養する」とは、上記工程で得られた集合し均一な凝集体を形成した幹細胞群を、培養培地中において、細胞培養器に対して非接着性の条件下で培養することをいう（本明細書中、これらの工程をあわせて、「ＳＦＥＢｑ法」と記載する）。幹細胞を浮遊培養する場合、浮遊凝集体の形成をより容易にするため、並びに／あるいは、効率的な分化誘導（例えば、神経系細胞等の外胚葉系細胞への分化誘導）のために、フィーダー細胞の非存在下で培養を行うのが好ましい。
　均一な幹細胞の凝集体の形成は、「細胞を迅速に凝集」させることで均一な幹細胞の凝集体が形成され、幹細胞から産生される細胞の上皮様構造を再現性よく形成することができる限りどのような方法を採用してもよく、このような方法としては、例えば、ウェルの小さなプレート（９６穴プレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法などが挙げられる。
　凝集体の形成時に用いられる培養器は、「細胞を迅速に凝集」させることで均一な幹細胞の凝集体形成が可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられるが、細胞を迅速に凝集させるためには、上述のとおり、培養スペースが比較的小さい培養器を使用することが好ましい。そしてこれらの培養器は、均一な凝集体を形成させる観点から、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものを使用できる。
　浮遊培養で用いられる培養器は、細胞の浮遊培養が可能なものであれば特に限定されず、上記と同様のものが使用され得る。凝集体を浮遊培養する場合も、上記同様、培養器は細胞非接着性であることが好ましい。浮遊培養において用いる培養器は、凝集体形成で使用した培養器をそのまま用いてもよい。
　凝集体形成時の幹細胞の濃度は、幹細胞の凝集塊をより均一に、効率的に形成させるように当業者であれば適宜設定することができるが、凝集体における内因性の増殖因子の発現が増加され、その結果、中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織（特に、吻側視床下部組織と吻側頭部外胚葉組織）の両方が同時に分化誘導されるように、高細胞濃度（ＨＣＤ）（large cell-aggregation(LCA)条件ともいう）とすることが好ましい。従来技術（例えば、非特許文献５、特許文献３等）では低細胞濃度で細胞を播種して凝集体形成が行われていたが、そのような低い細胞濃度では、凝集体中の内因性の増殖因子の発現増加が起こりにくく、外からＢＭＰシグナル促進剤（例、ＢＭＰ４）による刺激を加えない限り、１つの凝集体中に中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織（特に、吻側視床下部組織と吻側頭部外胚葉組織）の両方が同時に分化誘導され難い。
　上記「内因性の増殖因子」とは、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、特に、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、又はＢＭＰ２及びＢＭＰ４の両方を指す。凝集体における該内因性の増殖因子の発現が「増加する」とは、高細胞濃度での培養を開始してから７日目以降の時点において、低細胞濃度（例えば3000細胞/凝集体）で凝集体形成を行った場合の内因性増殖因子の発現と比較して増加していることをいい、少なくとも１．８倍以上、好ましくは１．９倍以上、より好ましくは２．０倍以上増加することをいう。また、内因性増殖因子の発現が高すぎると、逆に、下垂体や感覚器のプラコード形成を導く中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織、特に吻側視床下部組織と吻側頭部外胚葉組織（下垂体プラコードの場合）の形成を抑制するおそれがあるため、該内因性の増殖因子の発現の増加は、通常５．０倍以下、好ましくは４．０倍以下、より好ましくは３．５倍以下である。
　内因性増殖因子の発現は、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルのいずれで測定してもよいが、ｍＲＮＡレベルで測定することが好ましい。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、当該分野で公知の方法を用いて行えばよい。ｍＲＮＡの定量は、好ましくは定量的ＰＣＲ（例、リアルタイムＰＣＲ）で行う。一態様において、内因性増殖因子の発現量とは、ＢＭＰ２又はＢＭＰ４のいずれか一方の発現量を指す。
　一態様において、高細胞濃度での培養を開始してから７日目以降の時点において、高細胞濃度で凝集体形成を行った場合の凝集体におけるＢＭＰ２又はＢＭＰ４のいずれか一方の発現が、低細胞濃度（例えば3000細胞/凝集体）で凝集体形成を行った場合と比較して、少なくとも１．８倍以上、好ましくは１．９倍以上、より好ましくは２．０倍以上である。また、同時点において、低細胞濃度と比較して、凝集体におけるＢＭＰ２又はＢＭＰ４のいずれか一方の発現が、通常５．０倍以下、好ましくは４．０倍以下、より好ましくは３．５倍以下である。
　一態様において、高細胞濃度での培養を開始してから７日目以降の時点において、高細胞濃度で凝集体形成を行った場合の凝集体におけるＢＭＰ２及びＢＭＰ４のそれぞれの発現が、低細胞濃度（例えば3000細胞/凝集体）で凝集体形成を行った場合と比較して、少なくとも１．８倍以上、好ましくは１．９倍以上、より好ましくは２．０倍以上である。また、同時点において、低細胞濃度と比較して、凝集体におけるＢＭＰ２及びＢＭＰ４のそれぞれの発現が、通常５．０倍以下、好ましくは４．０倍以下、より好ましくは３．５倍以下である。
　一態様において、凝集体中に中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織（特に吻側視床下部組織とシート状の連続上皮である吻側頭部外胚葉組織）の両方を同時に分化誘導するには、凝集体における内因性増殖因子（即ち、ＢＭＰ２及び/又はＢＭＰ４）の発現が上述のように「増加する」結果が得られるような細胞濃度（高細胞濃度（ＨＣＤ）又はlarge cell-aggregation(LCA)条件）で、凝集体の形成を行うことが重要である。特に、外からＢＭＰシグナル促進剤（例、ＢＭＰ４）による刺激を加えない場合には、凝集体における内因性増殖因子（即ち、ＢＭＰ２及び/又はＢＭＰ４）の発現が増加するような細胞濃度（高細胞濃度（ＨＣＤ）又はlarge cell-aggregation(LCA)条件）で凝集体の形成を行うことが好ましい。
　必要に応じて、凝集体中に中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織（特に吻側視床下部組織と吻側頭部外胚葉組織）の両方を分化誘導するためには、上記条件に加えて、外因性のＴＧＦ－βスーパーファミリーのうちＢＭＰサブファミリーに属するタンパク質のシグナル促進剤を、神経分化抑制を起こさない程度の濃度であるいは神経分化抑制を起こさない程度の期間に、下記の無血清培地中に添加してもよい。ここで、ＢＭＰサブファミリーに属するタンパク質とはＢＭＰ（ＢＭＰ２／４グループ（ＢＭＰ２、ＢＭＰ４）、ＯＰ－１グループ（ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ）、ＢＭＰ９グループ（ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０）、ＧＤＦ５グループ（ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７））やＧＤＦ（Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ）に分類されるものを言い、特にＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４が好ましく、ＢＭＰ４が最も好ましい。
　外因性のＢＭＰサブファミリーに属するタンパク質（例、ＢＭＰ）のシグナル促進剤（例、ＢＭＰ４）は、凝集体の形成時から無血清培地へ含めていてもよいし、凝集体の浮遊培養開始から一定期間経過後に、無血清培地へ添加してもよい。浮遊培養開始から凝集体の浮遊培養開始後、上記シグナル促進剤を添加するまでの期間は、通常、２４０時間以内、好ましくは９６時間以内、より好ましくは７２時間以内である。
　一態様において、神経分化を抑制しない観点から、浮遊培養開始から一定期間経過後に、無血清培地中にＢＭＰサブファミリーに属するタンパク質（例、ＢＭＰ）のシグナル促進剤（例、ＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４）が添加される。即ち、上記シグナル促進剤は、浮遊培養開始から早くとも４８時間経過後に、無血清培地中へ添加される。
　外因性のＢＭＰサブファミリーに属するタンパク質（例、ＢＭＰ）のシグナル促進剤の濃度は、例えば、ＢＭＰ２又はＢＭＰ４を用いる場合、０．０１～１０ｎＭの範囲が例示される。
　また、凝集体中における中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織（特に吻側視床下部組織とシート状の連続上皮である吻側頭部外胚葉組織）の分化誘導を促進するため、無血清培地はＳｈｈシグナル促進剤を含んでいてもよい。
　Ｓｈｈシグナル促進剤は、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル促進剤としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｓｈｈ、Ｓｈｈ－Ｎ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト（例、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＳＡＧ）が挙げられるが、ＳＡＧが最も好ましい。
　ＳＡＧはＳｈｈより数倍以上強い活性を有し、また比較的安価で高濃度まで用いることができるため、強いヘッジホッグシグナルの活性を引き起こすことが可能である（Danjo et al, JNS, 2010)。
　Ｓｈｈシグナル促進剤は、凝集体の形成時から無血清培地へ含めていてもよいし、凝集体の浮遊培養開始から一定期間経過後に、無血清培地へ添加してもよい。浮遊培養開始から凝集体の浮遊培養開始からＳｈｈシグナル促進剤添加までの期間は、通常、１９２時間以内、好ましくは１６８時間以内、より好ましくは１４４時間以内である。
　用いられるＳｈｈシグナル促進剤の濃度は、凝集体中に中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織（特に吻側視床下部組織とシート状の連続上皮である吻側頭部外胚葉組織）の両方を分化促進可能であるような濃度であればよい。かかる濃度は、例えばＳＡＧを用いる場合、下記の無血清培地中、通常約１０～２０００ｎＭ、好ましくは約５０～１０００ｎＭであり、最も好ましくは約１００～４００ｎＭである。
　好ましい態様において、凝集体中に中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織（特に吻側視床下部組織と吻側頭部外胚葉組織）の両方を分化誘導するため、凝集体形成及び／又は浮遊培養に用いる無血清培地には、外因性のＢＭＰサブファミリーに属するタンパク質（例、ＢＭＰ）のシグナル促進剤（好ましくはＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４）、及びＳｈｈシグナル促進剤（好ましくは、ＳＡＧ）が添加される。この場合、ＢＭＰサブファミリーに属するタンパク質（例、ＢＭＰ）のシグナル促進剤は、凝集体の形成時から無血清培地へ含めていてもよいし、凝集体の浮遊培養開始から一定期間経過後に、無血清培地へ添加してもよい。浮遊培養開始から当該シグナル促進剤添加までの期間は、２４０時間以内、好ましくは９６時間以内、より好ましくは７２時間以内である。当該シグナル促進剤は、神経分化を抑制しないよう、浮遊培養開始から早くとも４８時間経過後に、無血清培地中へ添加するのが好ましい。また、Ｓｈｈシグナル促進剤は、凝集体の形成時から無血清培地へ含めていてもよいし、凝集体の浮遊培養開始から一定期間経過後に、無血清培地へ添加してもよい。浮遊培養開始からＳｈｈシグナル促進剤添加までの期間は、通常、１９２時間以内、好ましくは１６８時間以内である。各因子の濃度範囲は、上述の通りである。
　マウスの幹細胞を使用する場合、凝集体形成時の幹細胞の濃度は、幹細胞の凝集塊をより均一に、効率的に形成させるように当業者であれば適宜設定することができるが、凝集体における内因性の増殖因子の発現が増加し、中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織の両方、例えば吻側視床下部組織と吻側頭部外胚葉組織の両方が同時に分化誘導されるべく、１つの凝集体につき５×１０３～１．５×１０４個（好ましくは８×１０３～１．５×１０４個）の幹細胞を含む幹細胞の凝集体が形成されるように、凝集体形成時の幹細胞の濃度は、高細胞濃度で開始することが好ましい。例えば９６穴マイクロウェルプレートを用いる場合、１ウェル（１５０μｌ）あたり約４．５×１０３～５×１０４細胞、好ましくは約５×１０３～１．５×１０４細胞、最も好ましくは約８×１０３～１．５×１０４細胞となるように調製した液を添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。培養スペースが十分に小さい培養容器を使用することにより、ウェル１つにつき１個の凝集体を形成させることができる。この場合、形成される凝集体に含まれる幹細胞の数と同数（５×１０３～１．５×１０４個、好ましくは８×１０３～１．５×１０４個）か、それをやや上回る数の幹細胞を１ウェルに加え、培養することにより、目的とする１つの凝集体につき５×１０３～１．５×１０４個（好ましくは８×１０３～１．５×１０４個）の幹細胞を含む幹細胞の凝集体を形成させることができる。当業者であれば、ウェルの大きさ、形状、培地の体積等の条件を考慮し、１つの凝集体につき５×１０３～１．５×１０４個（好ましくは８×１０３～１．５×１０４個）の幹細胞を含む幹細胞の凝集体を形成させることができる、１ウェルあたりに加える細胞数を容易に適宜調節することが出来る。
　ヒトの幹細胞を使用する場合にも、凝集体形成時の幹細胞の濃度は、幹細胞の凝集塊をより均一に、効率的に形成させるように当業者であれば適宜設定することができ、凝集体における内因性の増殖因子の発現が増加し、中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織の両方（特に吻側視床下部組織と吻側頭部外胚葉組織の両方）が同時に分化誘導されるように、高い細胞濃度で開始することが好ましい。ヒトの場合、１つの凝集体中に中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織の両方（特に吻側視床下部組織とシート状の連続上皮である吻側頭部外胚葉組織）の両方が同時に分化誘導されるためには、上記マウスの場合の濃度よりもさらに細胞数を多くする必要が有り得る。例えば、ヒトの場合の高細胞濃度は、１つの凝集体につき約０．９×１０４～３×１０４個の幹細胞を含む幹細胞の凝集体が形成されるような濃度とすることが好ましい。例えば９６穴マイクロウェルプレートを用いる場合、１ウェル（１５０μｌ）あたり約０．９×１０４～３×１０４細胞かそれよりやや多い細胞となるように調製し、目的とする１つの凝集体につき０．９×１０４～３×１０４個の幹細胞を含む幹細胞の凝集体を形成させることができる。一方、上述のように、ＢＭＰサブファミリーに属するタンパク質（例、ＢＭＰ）のシグナル促進剤（例、ＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４）を、無血清培地に添加する場合、必ずしも高細胞濃度である必要は無く、１つの凝集体につき０．３×１０４～３×１０４個の幹細胞を含む幹細胞の凝集体が形成されるような濃度とすることが好ましい。当業者であれば、ウェルの大きさ、形状、培地の体積等の条件を考慮し、適切な細胞数を適宜調節することが出来る。
　マウス及びヒト以外の幹細胞を使用する場合であっても、凝集体における内因性の増殖因子の発現が増加し、中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織の両方、特に吻側視床下部組織とシート状の連続上皮である吻側頭部外胚葉組織の両方が同時に分化誘導されるように、その幹細胞が由来する動物種に応じて、１つの凝集体当たりの幹細胞数を適宜調節することができる。
　また凝集体形成時の培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１～１０％、好ましくは約５％である。
　凝集体形成までの時間は、細胞を迅速に凝集させることができる限り、用いる幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な凝集体を形成するために出来る限り早く行われることが望ましい。このような凝集体形成は２日間ほどの時間をかけて行なわれていたが（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，２８８－２９６、Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ　Ｍ，Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ　Ｎ．　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００３；３６５：４４６－４６１を参照のこと）、この時間を短くすることにより、目的の組織又は細胞等の効率よい分化誘導をもたらすことが可能となる。例えばマウス胚性幹細胞の場合、好ましくは１２時間以内、より好ましくは６時間以内に凝集体を形成させることが望ましい。一方ヒト胚性幹細胞の場合は、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内に凝集体を形成させることが望ましい。この時間を超えると、均一な幹細胞の凝集体が形成できず、後の分化効率が著しく低下する原因となり得る。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することで当業者であれば適宜調節することが可能である。
　幹細胞の凝集体が「均一に」形成されたことや、凝集体を形成する各細胞において上皮様構造が形成されたことは、凝集塊のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき、当業者であれば判断することが可能である。
　均一な幹細胞の凝集体の形成として具体的には、例えば胚性幹細胞の維持培養後、分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）した胚性幹細胞を適切な培地（目的とする組織又は細胞に応じて後述する培地に切り替える）に懸濁し、細胞非接着性のＵ底９６穴培養プレートに、１ウェルあたり好ましくは１×１０３～５×１０４細胞、より好ましくは３×１０３～３×１０４細胞になるように１５０μＬの上記培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させる方法が挙げられる。
　凝集体の浮遊培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件も適宜設定でき、例えば、凝集体形成時の培養条件として上記したのと同様の条件が挙げられる。本工程の時間は特に限定されないが、通常４８時間以上である。
　凝集体の形成時に用いられる培地と浮遊培養に用いられる培地とは、同じでも異なってもよいが、凝集体の形成で用いた培地をそのまま浮遊培養に用いても構わない。
　凝集体の形成時／浮遊培養時に用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
　凝集体の形成時／浮遊培養時に用いられる無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明においては、上述したようなものが挙げられる。
　無血清培地では、一般に血清の代替としていくつかの増殖因子（Ｗｎｔ、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、レチノイン酸、ＦＧＦ、ｌｉｐｉｄ－ｒｉｃｈアルブミンなど）を添加することが多い。しかし、下垂体前駆組織の分化には、これらの増殖因子はいずれも阻害的に働く。しかも、最も頻繁に無血清培地に添加されるインシュリンも強く下垂体前駆組織の分化を阻害する。この阻害は、インシュリンの下流シグナルであるＡｋｔという細胞内酵素（リン酸化酵素）の活性化が原因であると考えられる（特許文献３及び非特許文献５）。
　従って、上記無血清培地、特に浮遊培養に用いる培地（本明細書中で「分化培地」とも呼ぶ）は、増殖因子（Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸等が挙げられるが、好ましくはこれらに限定されない任意の増殖因子）並びにインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地であることが好ましい。
　上記無血清培地は、例えば、血清代替物を含有するものであり得る。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インシュリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。
　これらの血清代替物が増殖因子及びインシュリン類を含む場合には、以下に記載するように、当該増殖因子及びインシュリン類に対する阻害剤を培地に添加することが好ましいが、増殖因子及びインシュリン類を含む血清代替物を用いないことが最も好ましい。血清代替物は、増殖因子及びインシュリン類を含まないことが明らかな、化学的に規定された（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ）ものであることが好ましい。
　ただし、ヒトを含む霊長類の多能性幹細胞の場合には、以下に記載するように、インシュリン類なしで浮遊培養すると生存が悪くなる場合があるので、このような場合には必要に応じてインシュリン類を培地に添加することもまた好ましい。
　また、本発明の方法で用いられる無血清培地は、必要に応じて、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できるが、上記と同様、増殖因子を含有しないことが最も好ましい。
　「増殖因子及びインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地」とは、増殖因子及びインシュリン類を全く含有しない無血清培地、あるいは下垂体前駆組織及び下垂体ホルモン産生細胞への選択的分化に不利な影響を与えない程度の量の増殖因子及び／又はインシュリン類を含有する無血清培地をいう。このような無血清培地は、例えば、培地成分としての増殖因子及びインシュリン類の未添加、または増殖因子及びインシュリン類を含有する培地からのこれらの因子の除去処理により調製できる。
　或いは、増殖因子及びインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地は、増殖因子及びインシュリン類が実質的に不活化された無血清培地であり得、この培地は、増殖因子及びインシュリン類含有無血清培地に対する増殖因子シグナル阻害剤及び／又はインシュリンシグナル阻害剤の添加により、下垂体前駆組織及び下垂体ホルモン産生細胞の選択的分化に不利な影響を与えない程度にまで増殖因子及びインシュリン類の活性が喪失した無血清培地をいう。
　本明細書中で「増殖因子を実質的に含有しない培地」という場合の「増殖因子」とは、無血清培地での細胞培養において、血清代替物として一般に添加される因子であって、ＥＳ細胞からの下垂体前駆組織及び下垂体ホルモン産生細胞の選択的分化を阻害／抑制する作用を有する任意の因子を意味する。例えば、この「増殖因子」としては、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸等を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、「増殖因子を実質的に含有しない培地」は、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤及びレチノイン酸の全てを、実質的に含有しない培地である。また、ｌｉｐｉｄ－ｒｉｃｈアルブミンも「増殖因子」に含まれ、本発明において使用される培地は好ましくはｌｉｐｉｄ－ｒｉｃｈアルブミンを含有しない培地である。
　本明細書中で使用する場合、「インシュリン類」とは、インシュリンシグナルを促進する化合物を意味する。インシュリンシグナル促進剤とは、インシュリン類によるシグナルの伝達に対して促進的に作用するものである限り特に限定されず、インシュリンシグナル伝達経路のどの段階で作用するものであってもよい（インシュリンの上流または下流に対して作用する因子、インシュリンのアゴニスト、類似物質など）。
　インシュリン類には、インシュリン及びインシュリンの類似物質（アナログ）が含まれる。インシュリンの類似物質とは、インシュリン様の作用（本明細書中では、多能性幹細胞からの、下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞への選択的分化を阻害／抑制する作用をいう）を有する任意の物質をいい、例えば、ＩＧＦ－Ｉ等が挙げられる。
　上記無血清培地を得るための増殖因子及びインシュリン類含有培地からの増殖因子及びインシュリン類の除去処理には、例えば、上記増殖因子（例えば、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸、ｌｉｐｉｄ－ｒｉｃｈアルブミンなど）及びインシュリン類に対する抗体を用いることができる。また、増殖因子及びインシュリン類の不活化は、増殖因子シグナル阻害剤及びインシュリンシグナル阻害剤の添加によって実施され得る。このような阻害剤は、増殖因子又はインシュリンによるシグナル伝達経路の上流又は下流を阻害する任意の物質であり得、例えば、増殖因子／インシュリンに対する抗体、増殖因子／インシュリンの可溶型受容体、増殖因子／インシュリン受容体に対する抗体、増殖因子／インシュリンのアンタゴニストなどが挙げられる。これらの物質は、所望の効果（下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞への選択的分化）を得るのに適した量で培地に添加される。
　ただし、上述の通り、上記無血清培地は、凝集体中に中枢神経組織と頭部非神経外胚葉組織の両方、特に吻側視床下部組織とシート状の連続上皮である吻側頭部外胚葉組織の両方が同時に分化誘導されるように、神経分化抑制を起こさない程度の濃度で、外因性のＢＭＰ２及び/又はＢＭＰ４のシグナル促進剤（例えば、ＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４）を含んでいてもよい。ＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４を添加する場合、神経分化を抑制しにくいように０．０１～１０ｎＭの濃度となるように添加することが好ましい。
　以下、上に具体的に列挙した増殖因子／インシュリン類の除去処理に使用され得る物質について説明するが、それ以外の増殖因子／インシュリン類についても、それらの除去処理に使用され得る物質の選択や使用量の調整などは、当業者の通常の技術範囲内であることは言うまでもない。
　Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、Ｎｏｄａｌにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤としては、例えば、ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ）、Ｌｅｆｔｙ－Ａ、Ｌｅｆｔｙ－Ｂ、Ｌｅｆｔｙ－１、Ｌｅｆｔｙ－２、可溶型Ｎｏｄａｌ受容体、Ｎｏｄａｌ抗体、Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤が挙げられるが、なかでも、ＳＢ４３１５４２（４－（５－ｂｅｎｚｏ［１，３］ｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ－４－ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）－ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）が好ましい。
　Ｗｎｔシグナル阻害剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル阻害剤としては、例えば、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質、Ｗｎｔ受容体阻害剤、可溶型Ｗｎｔ受容体、Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷｎｔタンパク質が挙げられるが、なかでも、Ｄｋｋ１が好ましい。
　ＦＧＦシグナル阻害剤は、ＦＧＦにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。ＦＧＦシグナル阻害剤としては、例えば、抗ＦＧＦ抗体、可溶型ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体阻害剤（例えば、Ｓｕ５４０２）が挙げられる。
　ＢＭＰシグナル阻害剤は、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。ＢＭＰシグナル阻害剤としては、例えば、ＢＭＰＲＦｃ（Ｒ＆Ｄ）、抗ＢＭＰ抗体、可溶型ＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体阻害剤が挙げられるが、なかでもＢＭＰＲＦｃが好ましい。
　レチノイン酸（ＲＡ）阻害剤は、ＲＡにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。ＲＡ阻害剤としては、例えば、抗ＲＡ抗体、可溶型ＲＡ受容体、ＲＡ受容体阻害剤が挙げられる。
　浮遊培養に用いられる上記各シグナル阻害剤の濃度は、視床下部ニューロンの前駆細胞への選択的分化を達成可能であるような濃度であり得る。例えば、ＳＢ４３１５４２について、このような濃度は、約０．１～１００ｎＭ、好ましくは約５～３０ｎＭである。Ｄｋｋ１については、約１０～１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００～１０００ｎｇ／ｍｌである。また、ＢＭＰＲＦｃについては、約０．１～１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５～３μｇ／ｍｌである。
　上記各シグナル阻害剤は、多能性幹細胞の培養開始時に培地に添加しておくことが最も好ましい。
　インシュリンの細胞内シグナル伝達には、大きく分けて２つの経路（ＭＡＰＫ経路とＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路）が関与しているが、本発明の浮遊培養で使用されるインシュリンシグナル阻害剤としては、インシュリンシグナル伝達経路の下流因子であるＰＩ３Ｋの阻害剤、そしてさらに下流の因子であるＡｋｔの阻害剤が挙げられる。本発明において使用され得るＰＩ３Ｋ阻害剤としては、ＬＹ２９４００２（２－（４－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）－８－ｐｈｅｎｙｌ－１（４Ｈ）－ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ－４－ｏｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ（ＦＥＲＭＥＮＴＥＫ）などが挙げられるが、好ましくはＬＹ２９４００２である。本発明において使用され得るＡｋｔ阻害剤としては、Ａｋｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｉ～Ｘ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）などが挙げられるが、好ましくはＡｋｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＶＩＩＩ（１，３－Ｄｉｈｙｄｒｏ－１－（１－（（４－（６－ｐｈｅｎｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｇ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ－７－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ）－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）－２Ｈ－ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｏｎｅ）である。
　インシュリンシグナルが阻害され、下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞の選択的分化が達成される限り、浮遊培養においては、上記ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＡｋｔ阻害剤から選択されるいずれか一方の阻害剤を単独で用いてもよく、あるいはＰＩ３Ｋ阻害剤とＡｋｔ阻害剤とを併用してもよい。各阻害剤から２種以上を選択して併用することもできる。
　浮遊培養に用いられるＰＩ３Ｋ阻害剤／Ａｋｔ阻害剤の濃度は、下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞への選択的分化を達成可能であるような濃度であり得る。例えば、ＬＹ２９４００２について、このような濃度は、約０．５～３０μＭ、好ましくは約２～１０μＭである。Ａｋｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＶＩＩＩについては、約０．１～１０μＭ、好ましくは約０．５～５μＭである。
　好ましい態様において、本発明で使用される分化培地は、上述の増殖因子もインシュリン類も含有しない、化学的に規定された（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ）培地（ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ｆｒｅｅ　ＣＤＭ；ｇｆＣＤＭと呼ぶ）である。具体的には、この分化培地として、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）／Ｈａｍｓ　Ｆ１２　１：１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、１×Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、モノチオグリセロール（４５０μＭ；Ｓｉｇｍａ）および牛血清アルブミン（＞９９％の純度の再結晶精製品；Ｓｉｇｍａ）を添加したものが用いられる（Ｗａｔａｙａら、ＰＮＡＳ．１０５（３３），１１７９６－１１８０１）。このｇｆＣＤＭ培地は、以前に報告されたＣＤＭ培地（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１４１－１５１（１９９５））を改変したものである。
　内因性の増殖因子／インシュリンの作用を抑制するため、このようなｇｆＣＤＭ培地あるいは他の培地に増殖因子阻害剤／インシュリン阻害剤をさらに添加してもよい。
　別の好ましい態様において、本発明で使用される分化培地は、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＡｋｔ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの阻害剤並びにインシュリン類を含有し、且つインシュリン以外の上述の増殖因子を実質的に含有しない無血清培地である。例えば、特に霊長類の多能性幹細胞の分化誘導においては、インシュリンを含有しない培地により浮遊培養を行うと、細胞が死滅して増殖しにくい場合がある。このような細胞死を回避するために、細胞増殖を亢進させるためのインシュリン添加を実施し、同時にインシュリンの分化誘導阻害効果に拮抗するインシュリンシグナル阻害剤（例、ＰＩ３Ｋ阻害剤／Ａｋｔ阻害剤）を添加することが好ましい。この場合、分化培地に含まれるインシュリン類の濃度は、多能性幹細胞の増殖を促進し得る濃度である。例えば、インシュリンについてこのような濃度は、通常約０．０２～４０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１～１０μｇ／ｍｌである。ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＡｋｔ阻害剤の濃度範囲は上述の通りである。
　ＰＩ３Ｋ阻害剤／Ａｋｔ阻害剤は、多能性幹細胞の培養開始時に培地に添加しておくことが最も好ましいが、げっ歯類（例えばマウス）多能性細胞の分化の場合は少なくとも培養６日目まで（好ましくは少なくとも培養２日目までに添加する）の時期に、霊長類（例えばヒト）多能性細胞の分化の場合は少なくとも培養２４日目まで（好ましくは少なくとも培養９日目までに添加する）の時期には、分化培地に添加すべきである。
　分散浮遊培養時の細胞死を抑制するために、インシュリン添加に加えて、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２（（＋）－（Ｒ）－ｔｒａｎｓ－４－（１－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；渡辺ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５，６８１－６８６，２００７）を培養開始時から添加することが好ましい。浮遊培養に用いられるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、分散浮遊培養時の細胞死を抑制し得る濃度である。例えば、Ｙ－２７６３２について、このような濃度は、通常約０．１～２００μＭ、好ましくは約２～５０μＭである。
（４）さらなる分化誘導
　本発明では、上述のように、高細胞濃度の多能性幹細胞の条件で凝集体を形成させることにより、幹細胞の凝集体における内因性の増殖因子の発現が増加して、吻側視床下部組織とシート状の連続上皮である吻側頭部外胚葉組織の両方が同時に分化誘導される。このような凝集体において、Ｌｉｍ３陽性細胞の分化誘導を促進するため、ラトケ嚢様組織（下垂体前駆組織）の分化誘導を促進するため、或いは得られた下垂体前駆組織から下垂体ホルモン産生細胞をさらに分化させるために、以下に記載する培地を用いて浮遊培養を行なうことができる。
　生体内での下垂体発生の模式図は図１ａに、各種下垂体ホルモン産生細胞の発生の模式図は図３ａに示す。
（Ａ）Ｌｉｍ３陽性細胞及び下垂体前駆組織の分化誘導
　本発明においては、高細胞濃度の多能性幹細胞の条件で凝集体を形成させることにより、幹細胞の凝集体における内因性の増殖因子の発現が増加して、１つの凝集体に吻側視床下部組織とシート状の連続上皮である吻側頭部外胚葉組織の両方が分化誘導されるが、該凝集体内に含まれる細胞のＬｉｍ３陽性細胞への分化を促進し、下垂体前駆組織（ラトケ嚢）への分化を促進するために、浮遊培養に用いる無血清培地中はＳｈｈシグナル促進剤を含んでいてもよい。
　用いられるＳｈｈシグナル促進剤の濃度は、Ｌｉｍ３陽性細胞への分化を促進可能であるような濃度であればよい。かかる濃度は、例えばＳＡＧを用いる場合、無血清培地（好ましくはｇｆＣＤＭ）中、通常約１０～２０００ｎＭ、好ましくは約５０～１０００ｎＭであり、最も好ましくは約１００～４００ｎＭである。
　Ｓｈｈシグナル促進剤を無血清培地に添加する時期は、凝集体中におけるＬｉｍ３陽性細胞の誘導を促進する限り特に限定されず、浮遊培養開始時に培地に添加されていなくてもよい。しかしながら、浮遊培養開始からＳｈｈシグナル促進剤の添加までの時間が長くなるほど、凝集体中に誘導されるＬｉｍ３　ｍＲＮＡの発現量が少なくなるので（図１ｉ参照）、Ｓｈｈシグナル促進剤を浮遊培養（分化培養ともいう）開始時から添加することが好ましい。例えば、Ｓｈｈシグナル促進剤は、好ましくは浮遊培養開始時～浮遊培養３日後、より好ましくは浮遊培養開始時～浮遊培養２日後、より好ましくは浮遊培養開始時～浮遊培養１日後、最も好ましくは浮遊培養開始時に、培地中に添加する。
　Ｓｈｈシグナル促進剤を含む無血清培地中での浮遊培養の期間は、Ｌｉｍ３陽性細胞を誘導するのに十分な期間であれば特に限定されないが、例えばマウスの凝集体の場合、通常７～１４日程度、ヒト凝集体の場合、通常１０～３０日程度である。
　培地中のＳｈｈシグナル促進剤の濃度は、必要に応じて培養途中で切り替えてもよい。例えば、凝集体中にＬｉｍ３陽性細胞が誘導されるまで、凝集体をＳｈｈシグナル促進剤を含む無血清培地中で浮遊培養し、一旦Ｌｉｍ３陽性細胞が誘導された後は、Ｓｈｈシグナル促進剤を含有しない無血清培地中で浮遊培養を継続することができる。一実施態様において、ＳＡＧを使用する場合、下垂体前駆組織の分化誘導の促進には、浮遊培養開始時からＬｉｍ３陽性細胞が誘導されるまで（例、培養１０日目まで）１００ｎＭ乃至４００ｎＭの濃度のＳＡＧ含有培地、その後ＳＡＧなしの培地を用いることができる。一実施態様において、下垂体前駆組織から各種下垂体ホルモン産生細胞を分化誘導させる場合には、浮遊培養開始～培養７日目まで４００ｎＭのＳＡＧ含有培地、その後培養１０日目まで１００ｎＭのＳＡＧ含有培地、その後ＳＡＧなしの培地を用いることができ、別の実施形態において、浮遊培養開始～培養１０日目まで４００ｎＭのＳＡＧ含有培地を用い、その後培地を半分交換して８日間まで培養してもよいが、下垂体前駆組織の分化誘導が促進される限り、これらの条件に限定されない。Ｌｉｍ３陽性細胞が誘導された後、引き続きＳｈｈシグナル促進剤を含有する無血清培地中で浮遊培養を継続して、下垂体ホルモン産生細胞の分化誘導まで行うこともできるが、好ましくは、凝集体中にＬｉｍ３陽性細胞が誘導されるまで、凝集体をＳｈｈシグナル促進剤を含む無血清培地中で浮遊培養し、一旦Ｌｉｍ３陽性細胞が誘導された後は、Ｓｈｈシグナル促進剤を含有しない無血清培地中で浮遊培養を継続することにより、凝集体中のＬｉｍ３陽性細胞が、Ｌｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞（即ち、下垂体前駆組織）を形成する。
　一態様において、無血清培地中に、１つの凝集体につき８×１０３～１．５×１０４個の幹細胞を含む幹細胞の凝集体（マウス幹細胞の場合）或いは１つの凝集体につき９×１０３～３×１０４個の幹細胞を含む幹細胞の凝集体（ヒト幹細胞の場合）を形成させ、形成された凝集体をＳｈｈシグナル促進剤を含有する無血清培地中で浮遊培養することにより、視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含む凝集体が形成され、該凝集体中にＬｉｍ３陽性細胞が誘導され、その結果、視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含み、且つＬｉｍ３陽性細胞を含む凝集体を得ることができる。
　一態様において、視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含む凝集体（好ましくは、Ｌｉｍ３陽性細胞を更に含む）をＳｈｈシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地中で更に浮遊培養することにより、該凝集体中にＬｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞が形成され、下垂体前駆組織を得ることができる。
（Ｂ）下垂体前駆組織の分化誘導の促進
　下垂体前駆組織の分化誘導において、下垂体前駆組織の分化誘導を促進するため、即ち、凝集体におけるＬｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞の形成数を増加させるため又はＬｉｍ３　ｍＲＮＡの発現量を増加させるために、上記Ｓｈｈシグナル促進剤を含む無血清培地での浮遊培養後、ＦＧＦシグナル促進剤を含む培地を用いることもできる。
　ＦＧＦシグナル促進剤は、ＦＧＦにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。ＦＧＦシグナル促進剤としては、好ましくは、ＦＧＦ（例、ＦＧＦ１～２３）、ＦＧＦアゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストペプチドが挙げられる。好ましいＦＧＦシグナル促進剤は、ＦＧＦ８および／又はＦＧＦ１０である。
　用いられるＦＧＦシグナル促進剤の濃度は、ｌｉｍ３発現細胞の形成数増加又はＬｉｍ３　ｍＲＮＡの発現量増加が達成可能であるような濃度であればよい。かかる濃度は、例えばＦＧＦ８又はＦＧＦ１０の場合、無血清培地、好ましくはｇｆＣＤＭ中、約２～１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２０～４００ｎｇ／ｍｌであり、最も好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌである。
　ＦＧＦシグナル促進剤は、凝集体の浮遊培養の任意の時点で培地に添加してもよいが、好ましくは、上記Ｓｈｈシグナル促進剤を含む無血清培地中での培養後に使用するＳｈｈシグナル促進剤を含まない培地中に添加する。例えば、凝集体中にＬｉｍ３陽性細胞が誘導されるまで、凝集体をＳｈｈシグナル促進剤を含む無血清培地中で浮遊培養し、一旦Ｌｉｍ３陽性細胞が誘導された後は、Ｓｈｈシグナル促進剤を含有せず、且つＦＧＦシグナル促進剤（好ましくはＦＧＦ８又はＦＧＦ１０）を含有する無血清培地中で浮遊培養を継続することができる。一実施態様において、浮遊培養開始からＬｉｍ３陽性細胞が誘導されるまで（例、培養１０日目まで）ＳＡＧ含有培地（例えば、１００ｎＭ乃至４００ｎＭのＳＡＧを含有する培地）を用い、その後ＳＡＧを含有せず、且つＦＧＦシグナル促進剤（好ましくはＦＧＦ８又はＦＧＦ１０）を含有する培地を用いる。この場合、ＦＧＦシグナル促進剤（好ましくはＦＧＦ８又はＦＧＦ１０）は、Ｌｉｍ３陽性細胞の誘導後（例、培養１０日目以降）のいずれの時点で添加してもよいが、好ましくは培養１０日目～培養１８日目の間、より好ましくは培養１０日目～培養１３日目の間に、好ましくは３日間、ＦＧＦシグナル促進剤（好ましくはＦＧＦ８又はＦＧＦ１０）を上記濃度範囲内で維持する。
（Ｃ）ＡＣＴＨ産生細胞の分化誘導
　形成された下垂体前駆組織からＡＣＴＨ産生細胞を分化誘導するために、下垂体前駆組織の形成が達成された後、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含有する無血清培地中で、下垂体前駆組織をさらに浮遊培養することができる。本明細書中で使用する「ＡＣＴＨ産生細胞」は、下垂体性ＡＣＴＨ産生細胞を指し、ＡＣＴＨ＋ニューロンは含まれない。
　Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤は、Ｎｏｔｃｈにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤としては、例えば、ＤＡＰＴ、ＤＢＺ、ＭＤＬ２８１７０などが挙げられるが、なかでも、ＤＡＰＴが好ましい。
　用いられるＮｏｔｃｈシグナル阻害剤の濃度は、ＡＣＴＨ産生細胞の分化誘導を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＤＡＰＴの場合は、無血清培地中、好ましくはｇｆＣＤＭ培地中、約０．１～１０００μＭ、好ましくは約０．５～５００μＭ、より好ましくは約１～１００μＭ、最も好ましくは約１０μＭであり得る。
　Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む無血清培地は、上記浮遊培養によって下垂体前駆組織が形成された後に使用する。このような培地は、下垂体前駆組織が形成された後のいずれの時点で使用してもよい。Ｎｏｔｃｈシグナル促進剤を含む無血清培地は、Ｓｈｈシグナル促進剤を含有しないことが好ましい。例えば、上記のように、培養開始時からＬｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞が形成されるまで（例、培養１０日目まで）ＳＡＧ含有培地（例えば、培養開始時～７日目まで４００ｎＭのＳＡＧを含有する培地、７日目～１０日目まで１００ｎＭのＳＡＧを含有する培地）を用い、その後ＳＡＧなしの培地を用いる場合、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤（例、ＤＡＰＴ）は、凝集体中にＬｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞が形成された後（即ち、下垂体前駆組織が形成された後）のいずれの時点で添加してもよい。好ましくは浮遊培養１０日目～培養３０日目、より好ましくは培養１４日目～培養２２日目、より好ましくは培養１８日目～培養２２日目、最も好ましくは培養１８～１９日目の間又は培養２０日目～２１日目の間に、約３日間、好ましくは約１日間にわたり、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤（例、ＤＡＰＴ）を上記濃度範囲内で含有する無血清培地（好ましくはｇｆＣＤＭ培地）中で、下垂体前駆組織を浮遊培養する。一実施形態では、ＳＡＧ含有培地での培養後、培養１８日目に１０μＭのＤＡＰＴが培地中に含まれるようにし、１９日目に培地を半分交換して１日間培養する。
（Ｄ）ＡＣＴＨ産生細胞以外の下垂体ホルモン産生細胞の分化誘導
　形成された下垂体前駆組織から、ＡＣＴＨ産生細胞以外の下垂体ホルモン産生細胞（ＧＨ産生細胞、ＰＲＬ産生細胞、ＬＨ産生細胞、ＦＳＨ産生細胞及びＴＳＨ産生細胞）を分化誘導するために、下垂体前駆組織の形成が達成された後、それぞれ以下の培地を用いて、下垂体前駆組織をさらに浮遊培養することができる。
（ｉ）ＧＨ産生細胞の分化誘導
　ＧＨ産生細胞の分化誘導には、グルココルチコイドを含む無血清培地が使用され得る。グルココルチコイドの例としては、ハイドロコーチゾン（コルチゾールともいう）、コルチコステロン、或いはそれらと同様の生物活性を有する合成化合物（デキサメタゾンなど）などが挙げられる。ＧＨ産生細胞の分化誘導の効率を上昇させるためには、この無血清培地がインシュリン類をさらに含むことが好ましい。インシュリン類の例としては、既に本明細書中で列挙したものなどが挙げられる。
　例えば、本発明においてＧＨ産生細胞を分化誘導するために使用され得る培地は、ハイドロコーチゾンを約２～約２０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２０～１０００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌ、あるいはデキサメタゾンを約０．１～約１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１～５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ含み、インシュリン類を約０．２～３０ｎＭ、好ましくは約０．５～１０ｎＭ、最も好ましくは約１ｎＭ含む、無血清培地、好ましくはｇｆＣＤＭ培地である。
　上記培地は、Ｓｈｈシグナル阻害剤処理の後に使用することが好ましい。例えば、培養開始時からＬｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞が形成されるまで（例、培養１０日目まで）ＳＡＧ含有培地（例えば、培養開始時～７日目まで４００ｎＭのＳＡＧを含有する培地、７日目～１０日目まで１００ｎＭのＳＡＧを含有する培地）を用い、その後ＳＡＧなしの培地を用いる場合、グルココルチコイド及びインシュリン類は、凝集体中にＬｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞が形成された後（即ち、下垂体前駆組織が形成された後）のいずれの時点で添加してもよい。好ましくは、浮遊培養開始１０日目～４０日目、好ましくは浮遊培養開始１５日目～３５日目、好ましくは浮遊培養開始２０～３３日目の間、最も好ましくは浮遊培養開始２０日目～３０日目の間、グルココルチコイド及びインシュリン類を含有する無血清培地中で下垂体前駆組織を浮遊培養する。
（ｉｉ）ＰＲＬ産生細胞の分化誘導
　ＰＲＬ産生細胞の分化誘導には、エストロゲンを含む無血清培地が使用され得る。エストロゲンの例としては、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エステトロール、或いはそれらと同様の生物活性を有する合成化合物などが挙げられる。ＰＲＬ産生細胞の分化誘導の効率を上昇させるためには、この無血清培地がインシュリン類をさらに含むことが好ましい。インシュリン類の例としては、既に本明細書中で列挙したものなどが挙げられる。
　例えば、本発明においてＰＲＬ産生細胞を分化誘導するために使用され得る培地は、エストラジオールを約５～約５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０～２００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌ含み、インシュリン類を約０．２～３０ｎＭ、好ましくは約０．５～１０ｎＭ、最も好ましくは約１ｎＭ含む、無血清培地、好ましくはｇｆＣＤＭ培地である。
　上記培地は、Ｓｈｈシグナル阻害剤処理の後に使用することが好ましい。例えば、培養開始からＬｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞が形成されるまで（例、培養１０日目まで）ＳＡＧ含有培地（例えば、培養開始時～７日目まで４００ｎＭのＳＡＧを含有する培地、７日目～１０日目まで１００ｎＭのＳＡＧを含有する培地）を用い、その後ＳＡＧなしの培地を用いる場合、エストラジオール及びインシュリン類は、凝集体中にＬｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞が形成された後（即ち、下垂体前駆組織が形成された後）のいずれの時点で添加してもよい。好ましくは、浮遊培養開始１０日目～４０日目、好ましくは培養開始１４日目～３４日目、好ましくは浮遊培養開始２０～３３日目の間、最も好ましくは浮遊培養開始２０日目～３０日目の間、エストラジオール及びインシュリン類を含有する無血清培地中で下垂体前駆組織を浮遊培養する。
（ｉｉｉ）ＬＨ産生細胞、ＦＳＨ産生細胞及びＴＳＨ産生細胞の分化誘導
　例えば、ストローマ細胞を無血清培地（好ましくはｇｆＣＤＭ）中で（４～１０日間）培養することによって得られた培養上清（ストローマ細胞の馴化培地）を含有する無血清培地中で下垂体前駆組織を浮遊培養することにより、ＬＨ産生細胞、ＦＳＨ産生細胞及びＴＳＨ産生細胞を分化誘導することができる。
　ここで「ストローマ細胞の馴化培地」とは、ストローマ細胞由来の可溶性因子を含む培地をいい、ストローマ細胞の培養後培地の上清を回収することにより調製することができる。
　ストローマ細胞としては、ＰＡ６細胞、ＭＥＦ細胞、ＯＰ９細胞などが挙げられるが、ＰＡ６細胞が特に好ましい。
　上記無血清培地は、Ｓｈｈシグナル阻害剤処理の後に使用することが好ましい。例えば、培養開始時からＬｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞が形成されるまで（例、培養１０日目まで）ＳＡＧ含有培地（例えば、培養開始時～７日目まで４００ｎＭのＳＡＧを含有する培地、７日目～１０日目まで１００ｎＭのＳＡＧを含有する培地）を用い、その後ＳＡＧなしの培地を用いる場合、ストローマ細胞の馴化培地は、凝集体中にＬｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞が形成された後（即ち、下垂体前駆組織が形成された後）のいずれの時点で添加してもよい。好ましくは、培養開始１０日目～３０日目、好ましくは培養開始１０日目～２０日目、最も好ましくは培養開始１０日目～１５日目の間、ストローマ細胞の馴化培地を含有する無血清培地中で下垂体前駆組織を浮遊培養する。
　上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の下垂体ホルモン産生細胞のうち、Ｐｉｔｘ１陽性の中間前駆細胞を経て分化する細胞（即ち、ＧＨ産生細胞、ＰＲＬ産生細胞及びＴＳＨ産生細胞）を分化誘導する場合、分化誘導のために添加される各成分を含有する無血清培地中に、Ｗｎｔシグナル促進剤を更に添加した培地を用いることにより、各ホルモン産生細胞の割合をさらに増加させることができる（図３ａを参照）。例えば、上記培養条件において、培養開始１０日目～３０日目の間、好ましくは培養開始１２日目～２４日目の間、最も好ましくは培養開始１６日目～１８日目の間に、好ましくは少なくとも２日間にわたり、Ｗｎｔシグナル促進剤を含む培地を用いることができる。ＧＨ産生細胞又はＰＲＬ産生細胞を分化誘導する場合、Ｗｎｔシグナル促進剤は、グルココルチコイド又はエストロゲン（及び必要に応じてインシュリン）の添加前に無血清培地中に添加しても同時に添加してもよいが、グルココルチコイド又はエストロゲン（及び必要に応じてインシュリン）の添加前に無血清培地中に添加することが好ましい。
　Ｗｎｔシグナル促進剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル促進剤としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属する蛋白（例えば、Ｗｎｔ１～１６）、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｗｎｔ受容体、Ｌｉ＋イオンなどが挙げられるが、なかでもＧＳＫ３β阻害剤が好ましい。
　ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＧＳＫ－３β　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｉ，ＶＩ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ，ＸＩ，ＸＩＩ、ＣＨＩＲ　９９０２１、Ｖａｌｐｒｏｉｃ　Ａｃｉｄ、ＴＤＺＤ－８、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ（６－ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　Ｗｎｔシグナル促進剤の濃度は、Ｗｎｔシグナル促進剤なしの場合と比較して下垂体ホルモン産生細胞の割合を増加させることができる濃度である限り限定されないが、例えば、ＢＩＯを使用する場合、その濃度は、通常約２０～２０００ｎＭ、好ましくは約５０～５００ｎＭ、最も好ましくは約２５０ｎＭである。
　一実施形態において、培養開始１６日目からＢＩＯを２５０ｎＭ含む無血清培地を用い、１８日目に培地を半分交換して２日間培養を行う。
（５）下垂体ホルモン分泌の促進
　上述の方法により得られた各下垂体ホルモン産生細胞に対し、それぞれの下垂体ホルモンの産生・分泌を促進する物質を作用させることにより、下垂体ホルモンの産生・分泌を刺激することができる。下垂体ホルモンの産生・分泌を刺激・促進する物質（ホルモン分泌促進物質ともいう）としては、各下垂体ホルモン産生細胞を直接的に作用する物質であってもよいし、例えば、移植等の後でｉｎ　ｖｉｖｏで作用する場合などには、間接的に作用する物質であってもよい。
　具体的には、ＡＣＴＨの産生・分泌はＣＲＨ等によって促進され、ＧＨの産生・分泌はＧＨＲＨ等によって促進され、ＴＳＨの産生・分泌はＴＲＨ等によって促進され、ＰＲＬの産生・分泌はＰＲＦ（具体例は上述のとおり）及びＴＲＨ等によって促進され、ＦＳＨ及びＬＨの産生・分泌はＧｎＲＨ等によって促進される。これらの促進物質は、天然の供給源から単離したものを用いてもよいし、組換えなどによって合成してもよい。
　下垂体ホルモン産生細胞から下垂体ホルモンを分泌させるための培養条件は、下垂体ホルモン産生細胞の生存や増殖に悪影響を与えず、下垂体ホルモンの産生・分泌が促進される限り、適宜設定できる。例えば、５００μｌのＨＢＳＳ液当たり、下垂体ホルモン産生細胞を含む凝集体８個を入れ、３７℃で１０分間のプレインキュベーション後、適切な最終濃度の各刺激物質を添加し、３７℃でさらに１０分間インキュベーションする。
　分化したＡＣＴＨ産生細胞をＣＲＨで刺激する場合、通常約１０ｎｇ／ｍｌ以上のＣＲＨを用いるとＡＣＴＨの産生・分泌が顕著に誘導される。ＣＲＨは、好ましくは約１０～１００００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００～１００００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０００～１００００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。
　ＧＨの産生・分泌をＧＨＲＨによって刺激する場合、好ましい濃度範囲は１００ｎＭ～５００ｎＭであり、ＴＳＨの産生・分泌をＴＲＨによって刺激する場合、好ましい濃度範囲は、１ｎＭ～５ｎＭであり、ＰＲＬの産生・分泌をＰＲＦ（例、上記したようなプロラクチン放出ペプチド）によって刺激する場合、好ましい濃度範囲は２ｎＭ～１０ｎＭであり、ＦＳＨの産生・分泌をＧｎＲＨによって刺激する場合、好ましい濃度範囲は１ｎＭ～２０ｎＭであり、ＬＨの産生・分泌をＧｎＲＨによって刺激する場合、好ましい濃度範囲は１ｎＭ～２０ｎＭである。
　下垂体ホルモン産生細胞から産生された下垂体ホルモンは、培養物から単離・精製することができる。下垂体ホルモンは、例えば培養上清から、ペプチド及びタンパク質の単離・精製のための自体公知の方法（ゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィーのような公知の方法）を用いることによって、単離・精製することができる。
（６）細胞培養物、及び医薬としての使用
　本発明はまた、本発明の方法により得られる細胞培養物を提供する。本発明の細胞培養物は、例えば、幹細胞又は幹細胞から分化した細胞を含む浮遊凝集体、浮遊凝集体を分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）した細胞、分散処理細胞の培養により得られる細胞などであり得る。また、本発明は、かかる細胞培養物より被験体に投与し得る程度に単離・精製された下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞を提供する。
　「培養物」とは、細胞を培養することにより得られる結果物をいい、細胞、培地、場合によっては細胞分泌性成分等が含まれる。「単離」とは目的とする組織又は細胞以外の成分（細胞、タンパク質、培地等）を除去することを意味する。
　本発明の方法により得られた下垂体前駆組織若しくは下垂体ホルモン産生細胞は、下記疾患の治療薬として、その他の原因による下垂体組織又は下垂体ホルモン産生細胞の損傷状態において、当該下垂体組織又は細胞を補充するためなどに用いることができる。
　或いは、本発明の方法により得られた下垂体ホルモン産生細胞によって産生される下垂体ホルモンは、下記疾患の治療薬として、任意の下垂体組織又は各下垂体ホルモン産生細胞の損傷状態によって引き起こされる下垂体ホルモン分泌不全において、適切な下垂体ホルモンを補充するため（ホルモン補充療法）などに用いることができる。
　本発明の方法によって得られる下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞又は下垂体ホルモンによって治療され得る疾患としては、副腎皮質機能低下症、成長ホルモン分泌不全性低身長症、成人発症ＧＨ欠乏症、下垂体性小人症、クレチン病、不妊症、汎下垂体機能低下症（エンプティセラ症候群、下垂体アポプレキシー、術後下垂体損傷が含まれる）、部分的下垂体機能低下症、下垂体前葉ホルモン単独欠損症（具体的には、ＡＣＴＨ単独欠損症、成長ホルモン単独欠損症、ＴＳＨ単独欠損症、プロラクチン単独欠損症、性腺刺激ホルモン単独欠損症）などが挙げられる。
　また、本発明の方法により得られた下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞を、下垂体組織又は下垂体ホルモン産生細胞の障害に基づく疾患の治療薬として用いる場合、当該下垂体前駆組織又は細胞の純度を高めた後に被験体に移植することが好ましい。
　細胞の純度を高める方法は、公知となっている細胞分離精製の方法であればいずれも用いることができるが、例えば、フローサイトメーターを用いる方法（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，２７５（１９９８）参照）、パニング法（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，２７９７（１９８８）参照）、ショ糖濃度の密度差を利用する細胞分画法（例えば、組織培養の技術（第三版），朝倉書店（１９９６）参照）が挙げられる。
　本発明の細胞の純度を高める方法は、上述のような幹細胞を分化誘導して得られた下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞を、抗癌剤を含む培地中で培養する工程を含む。これにより、未分化な状態の細胞を除去することができ、より純度の高い分化細胞を得ることが可能で、医薬としてより好適となる。即ち、抗癌剤で処理することにより、目的とする分化細胞以外の細胞、例えば未分化な細胞を除去することができる。
　ここで、抗癌剤としては、マイトマイシンＣ、５－フルオロウラシル、アドリアマイシン、アラＣまたはメトトレキセートなどが挙げられる。これら抗癌剤は、分化誘導した細胞よりも未分化な状態の細胞に、より細胞毒性を示す濃度で用いることが好ましい。具体的には、上述した培養方法に準じて、これら抗癌剤を用いた培養を行い、至適濃度を決定することができ、例えば、これら抗癌剤を生体に用いる日本薬局方記載の濃度の１００分の１～１倍の濃度で含む培地を用い、５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターで、３７℃で数時間、好ましくは２時間培養する方法を挙げることできる。
　ここで使用する培地としては、分化誘導した下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞を培養することが可能な培地であればいかなるものも用いることができる。具体的には、上述の培地等を挙げることができる。
　移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、体細胞の核を核移植した幹細胞、又は染色体上の遺伝子を改変した幹細胞を用いることで当該問題を克服できる。
　また、体細胞の核を核移植した幹細胞を用いて分化誘導することで、体細胞を提供した個体の下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞を得ることができる。このような個体の組織又は細胞は、その組織又は細胞自身が移植医療として有効のみならず、既存の薬物がその個体に有効か否かを判断する診断材料としても有用である。さらに、分化誘導した組織又は細胞を長期に培養することで酸化ストレスや老化に対する感受性の判定が可能であり、他の個体由来の細胞と機能や寿命を比較することで上記疾患等に対する個体のリスクを評価することができ、それら評価データは将来の発病率が高いと診断される疾患の効果的な予防法を提供するために有用である。
　下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞を移植する被験体は、温血動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは元の幹細胞が由来する動物と同種の動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。疾患の治療目的で移植する場合、被験体としてはヒト患者が好ましい。
　本発明の方法により幹細胞から分化誘導された下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞は、自体公知の方法により下垂体前葉やそれに相当する部位に移植できる。
　下垂体ホルモンの産生・分泌を目的とした場合には、下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞は、そのホルモンの産生・分泌が誘導される限り、被験体の任意の部位に移植できる。例えば、下垂体前駆組織又は下垂体ホルモン産生細胞は、被験体の下垂体中又はその近傍、或いは下垂体が除去されている場合には下垂体が存在すべき部位（即ちトルコ鞍）に、或いは分泌された下垂体ホルモンが作用する対象器官の近傍などに（例えば、ＡＣＴＨ産生細胞の場合、腎臓被膜下等）、移植することができる。実施例に示されるように、ＡＣＴＨ産生細胞は、異所的に移植してもＡＣＴＨ産生機能を果たすことができる。
　移植後の被験体における各下垂体ホルモンの産生・分泌は、上述のようなホルモン分泌促進物質を被験体に投与することによって刺激してもよいし、内因性のそのような物質によって自然に刺激されてもよい。移植の目的及び被験体の状態等に依存して適宜選択され得る。
　具体的には、被験マウスに下垂体ホルモン産生細胞を移植する方法としては、本発明の分化誘導方法によって得られた当該細胞を含む細胞凝集体として１個～１０００個程度、好ましくは５～５００個程度、より好ましくは１０個～５０個程度、ハミルトンシリンジ等を用いて、腎臓被膜下に注入する方法が挙げられる。移植された細胞の生着が確保できる限り、この方法に限定されない。下垂体前駆組織（ラトケ嚢様組織）として移植する場合、ラトケ嚢様組織を細胞凝集体より単離し、それをハミルトンシリンジ等を用いて、腎臓皮膜下に注入する方法が挙げられる。
　被験体がヒトである場合、皮下組織あるいは下垂体近傍に細胞凝集体を移植する方法が挙げられるが、この方法に限定されない。
　移植された組織又は細胞の生着は、移植後十分な時間が経過した後に（例えば、移植の７日後）、その細胞が産生・分泌する下垂体ホルモン又はその他の適切なマーカー遺伝子産物の、蛍光抗体を用いた組織化学染色等によって、確認することができる。
　或いは、当該下垂体ホルモンによってその産生・分泌が促進される他のホルモン等（例えば、ＡＣＴＨの場合にはグルココルチコイド（例、コスチコステロン））の産生、例えば血中濃度を測定することによっても、確認することができる。その他の下垂体ホルモンが産生・分泌を促進する他のホルモン等は、上述のとおりである。
　特に、ＡＣＴＨ産生細胞の移植の効果は、レシピエントの自発的運動（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）の改善によって評価することもできる。例えば、マウスの自発的運動は、１日当たりのケージ内での自発的移動距離や、１日当たりの回し車（ｒｕｎｎｉｎｇ　ｗｈｅｅｌ）の自発的回転数によって評価する。ケージ内でのマウスの移動距離は、ＭＤＣ－Ｗ０２（ＢｒａｉｎＳｃｉｅｎｃｅＩｄｅａ，Ｏｓａｋａ）というＩＲセンサーを用いた解析システムなどを用いて計測することができ、回し車の回転数は、ＥＮＶ－０４４（ＭｅｄＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ）などを用いて計測することができる。これらの計測は、別々の実験として行ない、計測するマウスが平素飼育されているケージ（ホームケージ）内にそれぞれの装置を設置して行なう。これにより、低ストレス下での自発運動量を測定することが出来る。
　ＡＣＴＨ産生細胞の移植の効果は、レシピエントの生存率によっても評価できる。例えば、ＡＣＴＨ産生細胞の移植後の生存率は、Ｋａｐｌａｎ－Ｍａｙｅｒ法によって分析できる。
　また、本発明の方法によって得られる凝集体及び下垂体前駆組織は、生体内での下垂体発生時の微小環境をよく再現しているので、下垂体の発生や下垂体ホルモン産生細胞の誘導等に関する研究材料としても有用である。
　さらに本発明の方法は、再生医療の分野や上述の医薬等の創薬、毒性試験などに有用な「組織材料」を提供することができる点でも極めて有用である。
（７）スクリーニング方法
　本発明は、本発明の細胞培養物または本発明の培養産物を用いることを特徴とする、被検物質のスクリーニング方法を提供する。特に本発明の培養産物は、生体における下垂体前駆組織の組織形成の初期過程と極めて類似した下垂体前駆組織を構築し、また、生体における下垂体ホルモン産生細胞ときわめて類似した細胞を含んでいるので、下垂体組織又は各種下垂体ホルモン産生細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬のスクリーニング、またはそれらの毒性試験、さらには神経系疾患の新たな治療方法の開発などに適用することができる。
　ここで「被検物質」としては、例えば上記疾患の治療薬として有効性を確認したい物質や、その他の疾患の治療薬であって下垂体組織又は各種下垂体ホルモン産生細胞への影響（例えば、毒性）を確認することが必要な物質が挙げられる。当該物質は、低分子化合物、高分子化合物、タンパク質、遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、ウイルスなど、どのようなものであってもよい。このような物質は、当業者が適宜選択することができる。
　以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１：ＥＳ細胞の無血清浮遊凝集塊培養による、前脳組織と頭部非神経外胚葉の同時の試験管内分化誘導
（方法）
　マウスＥＳ細胞を前脳、特に視床下部組織への選択分化させる方法であるＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法（Wataya et al, 2008, PNAS vol.105, pp.11796-11801）を用いて、凝集体培養を７日間行なった。具体的には、トリプシン処理で単一分散させたマウスＥＳ細胞を、細胞低吸着コーティングした９６穴Ｕ字型ウェルあたり３０００、８０００、１００００あるいは１５０００細胞を播種して、凝集塊を形成させた。培地には、化学合成培地ｇｆＣＤＭ（Wataya et al, 2008, PNAS vol.105, pp.11796-11801）を用いた。視床下部組織のマーカーとしてＲｘ：：ＧＦＰ（ＧＦＰをＲｘ遺伝子座にノックイン）、頭部非神経外胚葉マーカーとしてＰｉｔｘ１抗体を用いて検出した。
（結果）
　７日間ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法で培養したＥＳ細胞浮遊凝集塊は、すべての培養条件で、視床下部マーカーＲｘ：：ＧＦＰ陽性、神経マーカーＮ－ｃａｄｈｅｒｉｎおよびＳｏｘ１陽性の視床下部組織を含んでいた。ウェルあたり８０００～１５０００細胞を凝集させた培養では、５日間培養以降の浮遊凝集塊の表層（Ｒｘ：：ＧＦＰ陽性のさらに表層）にＰｉｔｘ１陽性のシート状の連続上皮組織が９割以上の凝集塊で形成された（図１ｆ）。３０００細胞からの凝集では、Ｐｉｔｘ１の細胞は少数散在するのみで、連続的な大きな上皮を形成しなかった。また別の頭部非神経外胚葉マーカーＰｉｔｘ２を用いたｑＰＣＲでは、３０００細胞からの凝集塊に比して、１００００細胞からの凝集塊は４倍のＰｉｔｘ２　ＲＮＡの発現が誘導され、ＢＭＰ２及びＢＭＰ４のｍＲＮＡの発現量が約２～３倍に増大していた（図６）。凝集塊形成時の細胞数を増加させることだけでなく、ＢＭＰ４を０．５ｎＭの濃度で培地中に添加することによっても、Ｐｉｔｘ２の発現が上昇することが見出された（図１ｄ）。
実施例２：ＥＳ細胞の無血清浮遊凝集塊培養とヘッジホッグシグナル処理による下垂体前駆組織の試験管内分化誘導
（方法）
　マウスＥＳ細胞をＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法（Wataya et al, 2008, PNAS vol.105, pp.11796-11801）を用いて、１凝集体あたり１００００細胞で形成させ、実施例１のように浮遊培養した。分化培養開始直後より、ヘッジホッグのアゴニストであるＳＡＧ（Danjo et al, JNS, 2011, vol.31, pp.1919-1933）を１００あるいは４００ｎＭ添加し、合計１０－１３日間培養した。ＳＡＧはＳｈｈより数倍以上強い活性を有し、また比較的安価で高濃度まで用いることができるため、強いヘッジホッグシグナルの活性を引き起こすことが可能である（Danjo et al, JNS, 2011, vol.31, pp.1919-1933）。下垂体前駆組織（ラトケ嚢）のマーカーであるＬｉｍ３などの発現をＰＣＲあるいは蛍光抗体法による凍結切片の細胞化学染色で確認した。Ｌｉｍ３の発現は、Ｌｉｍ３：：ＧＦＰのノックインＥＳ細胞を用いても確認した。
（結果）
　ＳＡＧを１００あるいは４００ｎＭ添加した群では、１０日以降にＬｉｍ３の著明な遺伝子発現（未分化ＥＳ細胞の１５倍、ＳＡＧ非添加群の７倍）がＰＣＲで確認された（図１ｊ，ｋも参照）。このＬｉｍ３の誘導は、ヘッジホッグ受容体のアンタゴニストであるＳＡＮＴ－１で阻害されたため、ＳＡＧの作用はヘッジホッグシグナルを介した効果であることが判った。
　さらに３日間ｇｆＣＤＭで培養すると（合計１３日間）、ＳＡＧ添加群では、凝集塊の中に数個（１－７個）のＬｉｍ３陽性の上皮性の小嚢胞が形成された（図２ａ）。小嚢胞が形成されていく様子は図２ｄ－ｆに示されている（ｄ８～ｄ１０）。ｌｉｍ３陽性組織は、肥厚したプラコード上皮としてまず出現し、次いで陥入し、最後に中空の上皮小胞を形成した。これらの小嚢胞は、ＲｘやＳｏｘ１やＮｅｓｔｉｎ陰性で、Ｐｉｔｘ１やＰｉｔｘ２陽性であり（図２ｇ－ｊ）、下垂体前駆組織と同一のマーカー発現を示し、また１３日目までには、Ｌｉｍ３に加えて、後期ラトケ嚢マーカーＩｓｌｅｔ１／２を発現し始めた（図２ｏ）。形態学的にも下垂体前駆組織と類似した上皮構造や極性を有していた（図２ｍ、ｎ）。しかも、生体内の下垂体前駆組織（ラトケ嚢）と同じく、Ｒｘ陽性の視床下部組織の近傍に存在し、またＰｉｔｘ１陽性でＬｉｍ３陰性の頭部非神経外胚葉組織とも隣接して形成されていた（図２ｈ、ｋ）。このことは、このＥＳ細胞の浮遊凝集塊培養系において、胚発生過程の下垂体前駆組織の発生の微小環境が模倣されたことを示唆した。このようなラトケ嚢様の組織の形成は、３０００細胞の凝集塊から開始した培養では、ほとんど形成されなかった。
　なお、培養１０－１３日の間はＳＡＧを含まないｇｆＣＤＭで培養した。この間にＦＧＦ８を２００ｎｇ／ｍｌ添加したところ、Ｌｉｍ３の発現組織が３－５割増加した。
実施例３：ＥＳ細胞由来の下垂体前駆組織からのＡＣＴＨ産生細胞の産生とＤＡＰＴ処理
（方法）
　マウスＥＳ細胞を実施例２の方法を用いて、ＳＡＧ処理（４００ｎＭ　７日間、１００ｎＭ　３日間の計１０日間）により下垂体前駆組織に分化させた。さらにｇｆＣＤＭ培地を用いて、４０％Ｏ２、５％ＣＯ２下で合計１２日間培養した（合計２２日間）。さらに培養１８－１９日の間又は２０－２１日の間の１日間、Ｎｏｔｃｈシグナルの阻害剤ＤＡＰＴ　１０μＭで処理した。ＡＣＴＨ産生細胞に発現するＴｂｘ１９やＡＣＴＨの発現を蛍光抗体法による凍結切片の細胞化学染色で確認した。
（結果）
　蛍光抗体法での解析の結果、ＤＡＰＴ処理をした上記の凝集塊では、ＤＡＰＴ処理なしの場合と比較してＴｂｘ１９発現が増強され（図３ｂ）、ＡＣＴＨ陽性細胞の割合が増加し（図３ｃ）、Ｔｂｘ１９やＡＣＴＨ強陽性の多数細胞（＞３０細胞以上）の集合が複数箇所に含まれていた。ＤＡＰＴ処理をしていないものでは、Ｔｂｘ１９やＡＣＴＨ陽性の少数細胞が散在しているだけであった。このＡＣＴＨ陽性細胞は、ＮＳＥ及びニューロフィラメントなどの神経マーカーが陰性であったことから、脳のＡＣＴＨ＋ニューロンではないと考えられ（図３ｆ）、またメラニン産生細胞系統のマーカーＰＣ２も発現していなかった（図３ｇ）。さらに、このＡＣＴＨ＋細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏの場合と同様、Ｅ－カドヘリン陰性であった（図３ｅ）。
　ｉｎ　ｖｉｖｏでは、下垂体の発生時、Ｔｂｘ１９陰性の前駆体はＰｉｔｘ１陽性の中間前駆体を生じ、この前駆体がその後ＧＨ産生細胞、ＰＲＬ産生細胞、ＴＳＨ産生細胞へと分化する。Ｐｉｔｘ１の発現を確認したところ、ＤＡＰＴ処理では発現は増加せずにむしろ減少し、ＢＩＯ処理では大きく増加した。ＷｎｔインヒビターＩＷＰ２処理では、Ｐｉｔｘ１の発現は低下傾向であった（図３ｋ）。
実施例４：ＥＳ細胞由来の下垂体前駆組織からのＡＣＴＨ以外の下垂体ホルモン産生細胞の産生
（方法）
　マウスＥＳ細胞を実施例２の方法を用いて、ＳＡＧ処理（４００ｎＭ　７日間、１００ｎＭ　３日間の計１０日間）により下垂体前駆組織に分化させた。さらに４０％Ｏ２、５％ＣＯ２下で継続的に浮遊培養した。培地は、副腎皮質ホルモン（２００ｎｇ／ｍｌ　ハイドロコーチゾン）と１ｎＭインスリンを含むｇｆＣＤＭ、エストロゲン（５０ｎｇ／ｍｌエストラジオール）と１ｎＭインスリンを含むｇｆＣＤＭ、あるいはマウスのフィーダー細胞ＰＡ６細胞のｇｆＣＤＭによる培養上清（馴化培地）のいずれかを用いた。
　成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の発現を蛍光抗体法による凍結切片の細胞化学染色で確認した。
（結果）
　副腎皮質ホルモン（２００ｎｇ／ｍｌ　ハイドロコーチゾン）と１ｎＭ　インスリンを含むｇｆＣＤＭで培養２０日より１０日間培養したものでは、多数のＧＨ陽性細胞が凝集塊の中に確認された（図３ｌ、ｍ）。さらに、ＧＳＫ３βの阻害剤で、Ｗｎｔ経路を刺激するＢＩＯ（２５０ｎＭ）を培養１６－１８日の間に処理すると、ＧＨ陽性細胞が３－５割さらに増加した。エストロゲン（５０ｎｇ／ｍｌ　エストラジオール）と１ｎＭ　インスリンを含むｇｆＣＤＭで培養２０日より１０日間培養したものでは、多数のＰｒｏｌａｃｔｉｎ陽性細胞が凝集塊の中に確認された（図３ｎ、ｏ）。ＰＡ６細胞のｇｆＣＤＭによる培養上清で培養１０日より１５日間培養したものでは、多数のＬＨ陽性細胞及びＦＳＨ陽性細胞が確認されるとともに、少数のＴＳＨ陽性細胞が認められた（ＬＨ陽性細胞＞ＦＳＨ陽性細胞＞ＴＳＨ陽性細胞）（図３ｐ－ｓ）。
実施例５：ＥＳ細胞由来のＡＣＴＨ産生細胞からのＣＲＨによる試験管内のＡＣＴＨ分泌
（方法）
　マウスＥＳ細胞を実施例３の方法を用いて、ＳＡＧ処理とＤＡＰＴ処理によりＡＣＴＨ産生細胞に分化させた（合計２２日間）。この凝集塊に対して、ＣＲＨ（副腎皮質刺激ホルモン放出因子）を作用させて、ＡＣＴＨの分泌を定量した。具体的には、５００μｌのＨＢＳＳ液あたり、８個の凝集体を入れ、３７度で１０分間プレインキュベーション後、最終濃度１０－１００００ｎｇ／ｍｌのＣＲＨを添加し、さらに１０分間インキュベーション後の培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法で計測した(図４ａ)。
（結果）
　ＣＲＨを加えない群では、培養上清のＡＣＴＨの濃度は０．２ｐｇ／ｍｌ以下であったが、１０ｎｇ／ｍｌ　ＣＲＨ群では１．４ｐｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ　ＣＲＨ群では４ｐｇ／ｍｌ、１０００および１００００ｎｇ／ｍｌ　ＣＲＨ群では８．５－９．５ｐｇ／ｍｌのＡＣＴＨが検出された（図４ｃ）。一方、ＳＡＧ処理をしなかった凝集塊では、１０００ｎｇ／ｍｌ　ＣＲＨの添加によっても、ＡＣＴＨの分泌の有意な上昇は認められず、ＳＡＧ処理したがＤＡＰＴ処理をしなかった凝集塊では、ＣＲＨを加えてもＡＣＴＨの分泌はあまり高くならなかった（図４ｄ）。なお、このＡＣＴＨの分泌の誘導はＣＲＨ特異的であり、他の放出ホルモンを加えても観察されなかった（図４ｂ）。
　さらに、下垂体からのＡＣＴＨ分泌を抑制することが知られているハイドロコーチゾン（１００ｎｇ／ｍｌ）で６０分間前処理を行なった場合、ＣＲＨによるＡＣＴＨの分泌促進効果をほぼ完全に抑制した（図４ｅ）が、エストラジオールによる前処理はＡＣＴＨ分泌に影響しなかった（図４ｆ）。
実施例６：ＥＳ細胞由来のＡＣＴＨ産生細胞からのＣＲＨによる生体内でのＡＣＴＨと副腎皮質ホルモンの分泌
（方法）
　マウスＥＳ細胞を実施例３の方法を用いて、ＳＡＧ処理とＤＡＰＴ処理によりＡＣＴＨ産生細胞に分化させた細胞塊を、下垂体除去手術を施したマウスの腎臓被膜下に移植した（図５ａ右）。これらのマウスについては、ＡＣＴＨの分泌能（ＣＲＨへの反応性）が失われたことを移植前に確認した（図５ｂ、ｃ）。
　具体的には、合計２２日間の培養後に、細胞凝集塊をハミルトンシリンジにより、下垂体除去マウスの腎臓被膜下に注入した。移植７日後に、ＣＲＨ腹腔内投与による負荷のもと、血漿を回収し、ＡＣＴＨおよび副腎皮質ホルモン（Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎ）濃度をＥＬＩＳＡ法で計測した。
（結果）
　腎臓皮下移植したＥＳ細胞由来のＡＣＴＨ陽性細胞は、移植後７日後も局所に生着していることが、蛍光抗体法による組織化学染色で確認された（図５ａ左）。対照群（ｓｈａｍ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）では、ＣＲＨ負荷後も血中ＡＣＴＨは１ｐｇ／ｍｌ未満、Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎも３ｐｇ／ｍｌ未満であった。一方、ＥＳ細胞由来のＡＣＴＨ陽性細胞移植群では、ＡＣＴＨは２５－３０ｐｇ／ｍｌ、Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎは３００ｐｇ／ｍｌの濃度にＣＲＨ負荷後に達した（図５ｅ、ｆ：ＣＲＨ負荷あり；図５ｇ、ｈ：ＣＲＨ負荷なし）。
実施例７：ＥＳ細胞由来のＡＣＴＨ産生細胞の異所性移植による下垂体除去マウスの生存及び活動性の改善
（方法）
　マウスＥＳ細胞由来のＡＣＴＨ産生細胞を実施例６と同様に、下垂体除去手術を施したマウス（９週齢）の腎臓被膜下に移植した。移植マウスの生存および体重の増加を経過観察し、対照群（ｓｈａｍ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）と比較した。マウスの自発的運動についても検討した。マウスの自発的運動は、IRセンサー（ＭＤＣ－Ｗ０２（ＢｒａｉｎＳｃｉｅｎｃｅＩｄｅａ，Ｏｓａｋａ））を用いて、ケージの中でマウスが１日にどのくらい自発的に移動するかを計測した。また、ＥＮＶ－０４４（ＭｅｄＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ）を用いて、マウスが自発的にｒｕｎｎｉｎｇ　ｗｈｅｅｌを１日に何回転させたかも別途計測した。
（結果）
　対照群の下垂体除去マウスでは、ｓｈａｍ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ後８週までに全個体が死亡したが、ＥＳ細胞由来のＡＣＴＨ産生細胞の移植群では、その時点で約８５％の個体が生存していた（図５ｋ）。また、対照群がすべて死亡した８週の段階で、移植群では６割のマウスが、移植時より体重が増加していた。
　また、移植群のマウスは、コントロールよりも高いレベルの自発的運動を示した(図５ｉ、ｊ)。
実施例８：ヒトＥＳ細胞からの下垂体前駆細胞の分化誘導
（方法）
　トリプシンにて単一分散したヒトＥＳ細胞１２０００細胞をＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２　１０μＭ存在下に（Watanabe et al, Nature Neuroscience, 2007）実施例１のように浮遊凝集塊培養を行なった。培養液には、ｇｆＣＤＭに５％ＫＳＲを加えたものを用いた。培養３日目より０．５ ｎＭ、１．５ ｎＭまたは５.０ ｎＭのＢＭＰ４を培養液に添加し、培養６日目より１０００ ｎＭのＳＡＧを添加し浮遊培養を継続した。
（結果）
　培養１７日後には、いずれの凝集塊も多数のＲｘ陽性の神経前駆細胞を凝集塊内部に含み、またその表面にE-cadおよびサイトケラチン陽性の非神経外胚葉細胞がマウスＥＳ細胞の培養と同様に、単層の細胞からなるシート状の上皮構造を形成していた（図７）。ｑＰＣＲ解析により、Ｐｉｔｘ１の発現誘導も5 nM BMP処理をした群でしていない群に比して、約10倍の誘導を認めた（図８）。BMP処理した群では、培養２５日後には、Rx陽性の神経上皮構造の表面にE-cad陽性の非神経外胚葉が存在し、マウス培養での下垂体プラコード形成と同様に、その一部が肥厚してプラコード様の構造を呈していた（図７）。
　トリプシンにて単一分散したヒトＥＳ細胞３０００個及び６０００個からスタートした場合でも、同等の結果が得られた。従って、培地中にＢＭＰ４を添加した場合には、比較的少数の細胞からなる凝集塊を用いても、吻側視床下部組織とシート状の連続上皮である吻側頭部非神経外胚葉組織の両方を同時に分化誘導できる可能性が示された。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本発明の方法によれば、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から、中枢神経組織及び頭部非神経外胚葉組織を含む凝集体、特に吻側視床下部組織及び吻側頭部外胚葉組織を含む凝集体や下垂体前駆組織を試験管内で分化誘導し、さらに各種下垂体ホルモン産生細胞を分化誘導することができる。下垂体は多くのホルモンを産生・分泌する中心的な内分泌器官であり、ホルモン分泌の異常は生体に対し重大な影響を及ぼす。従って、本発明の方法で得られた凝集体、下垂体前駆組織及び下垂体ホルモン産生細胞は、特に、下垂体ホルモンの分泌不全によって引き起こされる疾患や下垂体ホルモンの分泌不全を引き起こす疾患の治療等に利用することができる。
　中枢神経組織及び頭部非神経外胚葉組織を含む凝集体からは、下垂体だけでなく、嗅上皮、水晶体、内耳等の感覚器のプラコードも形成され得る。
　本出願は日本で出願された特願２０１１－２３９８０３（出願日：２０１１年１０月３１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (33)

  1. 　無血清培地中で幹細胞の凝集体を形成させる工程、及び
    　形成された凝集体を無血清培地中で浮遊培養する工程
    を含む、視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体の製造方法。
  2. 　浮遊培養で用いる無血清培地がＳｈｈシグナル促進剤を含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記Ｓｈｈシグナル促進剤がＳＡＧである、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　浮遊培養で用いる無血清培地がＢＭＰシグナル促進剤を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　ＢＭＰシグナル促進剤がＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４である、請求項４に記載の製造方法。
  6. 　前記視床下部組織及び頭部非神経外胚葉が、吻側視床下部組織及びシート状の連続上皮である吻側頭部非神経外胚葉組織である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　前記吻側視床下部組織がＲｘ陽性である、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　シート状の連続上皮である吻側頭部非神経外胚葉組織がＰｉｔｘ１陽性である、請求項６記載の方法。
  9. 　前記無血清培地が、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸及びインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地である、請求項１に記載の製造方法。
  10. 　前記幹細胞がヒト由来である、請求項１～９のいずれか１項に記載の製造方法。
  11. 　前記視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体が、Ｌｉｍ３陽性細胞を更に含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　前記Ｌｉｍ３陽性細胞が、凝集体中に上皮性の小嚢胞を形成することを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　浮遊培養により、幹細胞の凝集体における内因性の増殖因子の発現を増加させる、請求項１に記載の製造方法。
  14. 　前記内因性の増殖因子がＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４である、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 　前記ＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４の発現が、低細胞濃度で幹細胞の凝集体を形成させた場合と比較して、ｍＲＮＡレベルで２倍以上増加することを特徴とする、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法によって製造された視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む無血清培地中でさらに浮遊培養する工程を含む、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞の製造方法。
  17. 　前記Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤がＤＡＰＴである、請求項１６に記載の製造方法。
  18. 　請求項１６又は１７に記載の方法で製造された副腎皮質刺激ホルモン産生細胞を被験体に移植することを含む、被験体において副腎皮質刺激ホルモンの分泌不全を改善する方法。
  19. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法によって製造された視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、グルココルチコイドを含む無血清培地中でさらに浮遊培養する工程を含む、成長ホルモン産生細胞の製造方法。
  20. 　前記無血清培地がインシュリンをさらに含む、請求項１９に記載の製造方法。
  21. 　前記視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、グルココルチコイドを含む無血清培地中で浮遊培養する工程の前又は同時に、ＧＳＫ３β阻害剤を含む無血清培地中で浮遊培養する工程を含む、請求項１９又は２０に記載の成長ホルモン産生細胞の製造方法。
  22. 　前記ＧＳＫ３β阻害剤がＢＩＯである、請求項２１に記載の製造方法。
  23. 　請求項１９～２２のいずれか１項に記載の方法で製造された成長ホルモン産生細胞を被験体に移植することを含む、被験体において成長ホルモンの分泌不全を改善する方法。
  24. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法によって製造された視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、エストロゲンを含む無血清培地中でさらに浮遊培養する工程を含む、プロラクチン産生細胞の製造方法。
  25. 　前記無血清培地がインシュリンをさらに含む、請求項２４に記載の製造方法。
  26. 　前記視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、エストロゲンを含む無血清培地中で浮遊培養する工程の前又は同時に、ＧＳＫ３β阻害剤を含む無血清培地中で浮遊培養する工程を含む、請求項２４又は２５に記載のプロラクチン産生細胞の製造方法。
  27. 　前記ＧＳＫ３β阻害剤がＢＩＯである、請求項２６に記載の製造方法。
  28. 　請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法で製造されたプロラクチン産生細胞を被験体に移植することを含む、被験体においてプロラクチンの分泌不全を改善する方法。
  29. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の製造方法で製造された視床下部組織及び頭部非神経外胚葉を共に含んでなる凝集体を、無血清培地中でストローマ細胞を培養することによって得られたストローマ細胞の馴化培地中でさらに浮遊培養する工程を含む、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン及び/又は甲状腺刺激ホルモン産生細胞の製造方法。
  30. 　前記ストローマ細胞がＰＡ６細胞である、請求項２９に記載の製造方法。
  31. 　請求項２９又は３０に記載の方法で製造された卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン又は甲状腺刺激ホルモン産生細胞を被験体に移植することを含む、被験体において卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン又は甲状腺刺激ホルモンの分泌不全を改善する方法。
  32. 　無血清培地中で幹細胞の凝集体を形成させる工程、及び
    　形成された凝集体を無血清培地中で浮遊培養する工程
    を含む、中枢神経組織及び頭部非神経外胚葉組織を共に含んでなる凝集体の製造方法。
  33. 　請求項３２に記載の凝集体においてプラコードが自己形成される、嗅上皮、水晶体又は内耳を形成するプラコードの製造方法。
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