JPS5869818A - ヒト下垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法 - Google Patents

ヒト下垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法

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JPS5869818A
JPS5869818A JP56168723A JP16872381A JPS5869818A JP S5869818 A JPS5869818 A JP S5869818A JP 56168723 A JP56168723 A JP 56168723A JP 16872381 A JP16872381 A JP 16872381A JP S5869818 A JPS5869818 A JP S5869818A
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human
human pituitary
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博 石川
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  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 10発明の背景 技術分野 本発明はヒト下垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法に関
するものである。
さらに詳しくは、本発明線人体から摘出し九ヒト下垂体
組織を特定の培地で培養し、得られ良上皮性細胞群を免
疫能が低下した動物体内に移植し、骸動物体内で増殖し
た移植細胞を摘出して再び特定の培地で培養することに
よりヒト下垂体ホルモン産生細胞株を樹立する新規な方
法に関するものである。
先行技術 従来、ヒト下重体ホルモン、例えばヒト成長ホルモン社
、ヒト屍体から摘出した下垂体を溶媒で抽出処理するこ
とによって得られていた。しかし、この方法では入手し
うる下垂体の量に限りがあるため、医療上必要とされる
ヒト成長ホルモンを十分供給することができなかった。
そこで、ヒト成長ホルモンを大量に得る方法が種々研究
され、遺伝子操作技術を用いる方法が開発されつつある
が、現在までのところ、収量が低くコストも高いためま
だ実用化されていない。また、ヒト下垂体細胞を培養し
てヒト成長ホルモンを得る試みも多数なされているがい
ずれの場合も該ホルモンの分泌能が培養早期に失われ、
該ホルモンを安定して産生する株細胞の樹立に成功した
例は報告されていない。
■3発明の目的 本発明の目的は、長期にわた9安定して下垂体ホルモン
を産生ずるヒト下垂体細胞株を樹立化する方法を提供す
ることにある。
■0発明の詳細な説明 本発明昧、第1に、人体から摘出したヒト下画体組織を
蛋白分解酵素溶液で分散し、得られ九分散細胞を血清お
よびノ・五F−10培地を含む培養液に加えて該細胞を
培養し、増殖した上皮性細胞群を免疫能の低下した動物
体内に移植し、該動物体内で増殖した移植細胞を摘出し
、摘出した移植細胞を蛋白分解酵素溶液および上記の培
養液を用いて再び分散し培養し、樹立したヒト下垂体組
織由来細胞を得ることを特徴とするヒト下垂体ホルモン
産生細胞株の樹立方法からなる。
本発明ヰ、第2に、上記培養液中の血清の比率が1〜2
5ノ臂−セント(容量)であるヒト下垂体ホルモン産生
細胞株の樹立方法からなる。
本発明紘第3に、上記血清がウシ新生児血清、ウシ胎児
血清およびウマ血清の混合血清であるヒト下垂体ホルモ
ン産生細胞株の樹立方法からなる。
本発明社第4に、上記ウシ新生児血清、ウシ胎児血清お
よびウマ血清の混合比(容量)が4=2:lであるヒト
下垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法からなる。
本発明ヰ第5に、上記培養液が抗生物質、好適にはペニ
シリンおよび(tたヰ)ストレプトiイシンを含有する
ヒト下垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法からなる・ 本発明祉第6に、上記蛋白分解酵素溶液が50〜j20
0 、好適には300プロテア−ぜエエット/wtのデ
ィスノ臂−ゼ溶液であるヒト下垂体ホルモン浬生細胞株
の樹立方法からなる。上記組成の蛋白分解酵素溶液を使
用することにより分散が効率的に行なわれまた細胞の生
存率が良くなる・本発明は第7に、上記免疫能を低下せ
しめた動物が好適にaヌードマウスまたはヌードラット
であるヒト下垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法からな
る・さらに本発明妹第7に、上記摘出した移植細胞の培
養が該移植動物の膵臓抗体および補体を用いた免疫学的
選択培養であるヒト下垂体ホルモン重化細胞株の樹立方
法からなる。
上記免疫学的選択培養によプヒト下垂体組織由来細胞の
移植動物由来細胞からの分離が容易に行なわれる。
本発明の方法を実施するに際して扛、先ず人体から摘出
したヒト下垂体組織を必要に応じて細切して蛋白分解酵
素溶液に入れ、同溶液中に下垂体組繊細胞を分散させる
・ ヒト下垂体組織としては、巨人症また線末端肥大症尋の
下垂体腺腫患者から手術時に摘出したもの、流産死した
ヒト胎児又はヒト屍体から摘出したものであり活性を有
するものが用いられる。
細胞の分散剤として使用される蛋白分解薄紫の例として
ayイスノ母−ゼ等が挙げられる。該酵素溶液の濃[U
、50〜12007”ロチアーゼユニット/ ssg 
s 好適には約300プロテアーゼ&ニット/−である
かくして得られた分散細胞を血清およびハムF−10培
地を含む培養液に加えて該細胞を培養する。
培地として昧このほかハムF−12、DM160、RP
M11640等も使用可能で線あるが、))ムF−10
が最も好ましい。
本工程で使用される培養液は血清およびハムF−10培
地を含み、文献未然の新規な培地である。
培養液中の血清の比率線特に限定−ないが1〜25ノ譬
−セント(容量)が好適である。血清として社、ウシ新
生児血清、ウシ′胎児血清およびウマ血清等が用いられ
、特にこれらの混合血清が望ましい。
混合比はウシ新生児血清:ウシ胎児血清:ウマ血清−4
:2:1が好ましい。培養液は血清および/%AF−1
0培地のほか、ペニシリンおよびストレゾ)wイシンの
ような抗生物質を含有するのが望ましい。
本発明にいうハムF−10培地の組成1次の通りである
NaC17400 KC4285 CaCj2−2120         44Ng80
4−711,0        153Na、HPO4
−7120zs。
Kn、PO483 NaHCOl           1200F@80
4              0.834Cu 80
a              OoOO25Z n 
BOa           O,028gグルコース
        11GO L−アラニン        8.9 L−アルギニン塩酸    211 L−アスノ譬うギンー820   15.OL−アス/
臂うギン酸     13.3L −S’J? 47塩
ml      315L−ダルタ建ン酸      
14.7L−グルタζン       146.2グリ
シン           7.5L−ヒスチジン  
     21.OL−イソロイシン       2
.6L−ロイシン        13.1L−リジン
塩酸       29,3L−メチオニン     
   4.48L−フェニルアラニン     4.9
6L−プロリン        11.5L−セリン 
       1O05 L−スレオニン        3.57L−トリプト
ファン      o、60L−チロシン      
   1・81L−バリン        3.5 ビオチン           0.024/fントテ
ン酸カルシウム    0.715コリン塩酸    
      0.698集酸      1.32 ヒ4キサンチン        4.082オイノシト
ール       0.3541ナイアシンア電ド  
     0.61!Sピリドキシン塩II     
   O,206すIフッビン         0.
376チアζy塩II          1.012
チtゾ/          0.727ビタ建ンB、
、          1.36す4酸       
      0.2ピルビン酸ソーダ      11
G フエノールレツド       1.2本工程の培養祉
、上記培養液を使用する以外ヰ、通常の組織培養と同様
にして行なわれる。即ち、好気的条件下、−約7.0〜
7.5、好適にtUJ(7,3〜7.4、温度37℃で
培養する。空気95〜97嚢、CO□3〜!s嚢の環境
で培養するのが最も望ましい。
本工程の培養によシ、上皮性細胞と線維芽細胞がそれぞ
れを層をなして増殖するので、ホルモン産生細胞である
上皮性細胞を分離し、免疫能を低下せしめた動物体内に
移植し、該動物体内で増殖させる。移植の際に、線維芽
細胞が混入していても、この細胞は移植動物体内で増殖
せず死滅するので特に障害とLならない、免疫能を低下
せしめた動物の例としてり、ヌードマウスまたキヌード
ラットがあげられる。移植拡通常背部皮下または腹腔内
に行なわれる・増殖し九細胞をさらに新しい動物に移植
継代することもできる。かくして得られた増殖細胞を摘
出し、蛋白分解酵素溶液および紡速した培養液を用いて
再び分散し培養し、樹立したヒト下喬体組織由来細胞を
得る。
樹立し九細胞に移植動物由来の細胞が混入している場合
には、骸移植動物の肺臓抗体と補体を用いた免疫学的選
択培養によりその細胞を除く0例えばウサギを用いて調
製した抗牌臓血清と補体を細胞培養中の培養液に加え、
数時間培養し、その後常法に従って継代する。移植動物
由来の細胞眸、抗血清中の抗体および補体によって破壊
され、ヒト由来細胞のみが増殖する。
かくして得られた樹立ヒト下垂体ホルモン産生細胞株を
培養することにより培養液中に成長ホルモン、乳[1激
ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激、ホルモン
、甲状腺刺激ホルモン等各種の下垂体ホルモンを産生さ
せることができ1これらはそれ自体公知の方法によって
培養液中から採取される。
次に実施例を示して本錦明をさらに具体的に説明する。
実施例 末端肥大症患者から手術時に摘出した下垂体腺腫組織を
、第1表に示す組成の培養液に300!ロテアー讐エエ
ット/−のテ(スノ譬−ゼ(合同酒精社製)を加えた培
養液に入れ、37℃で20分間インキ、ペートシ、細胞
を分散した。この細胞浮遊液を遠心分離して細胞を集め
、上記培養液に分散し、60%シャーレ(チル篭株式会
社製)に植え込み初代培養を行った。これによって上皮
性細胞と線維芽細胞が混在した細胞シートがつくられる
* 0.2 s %トリプシン溶液を浸み込ませた滅菌
濾紙片に上皮性細胞のみを吸着させて線維芽細胞から分
離し培養した。継代培養後、ヌードマウス(BALB/
eA−nu日本クりア社製)皮下へ1頭当シ3x10 
個の細胞を移植した。細胞移植後1〜3ケ月でヌードマ
ウス皮下に腫瘤が形成され、移植・継代可能な細胞系2
種類が得られた。腫瘤を摘出し、細切し、上記と同様に
してディス/ダーゼ処理をし、上記培養液で培養し九、
ヌードマウス由来細胞を除去するために、抗ヌードマウ
スNIII抗体および補体を用い九免疫学的選択培養を
行ない、ヒト下垂体腺腫由来細胞を分離した。この細胞
を培養し、培養液中のヒト成長ホルモン量をラジオイム
ノアッセイによシ測定したところヒト成長ホルモンの分
泌を確認した。
第  1  表 培養液組成(lJ中) ハムF−10825m ウシ新生児血清       100−ウシ胎児血清 
       5〇− ウシ血清          25sIgペニシリン 
          50エニ、トン−ストレプトマイ
シン      50μV−■0発明の作用効果 本発明によれば、上述した如く、比較的容易にヒト下垂
体ホルモン産生細胞を樹立することができ、樹立した細
胞は、長期に亘る安定したホルモン産生、能を維持して
いる。従ってこの細胞を培養することによ)ヒト成長ホ
ルモン等医療上重要なホルモ/を安価にかつ大量に得る
ことができるため治療に上記ホルモンを必要とする患者
に対して十分な量を供給することができる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 (1)  人体から摘出したヒト下垂体組織を蛋白分解
    酵素溶液で分散し、得られた分散細胞を血清およびハム
    F−10培地を含む培養液に加えて該細胞を培養し、増
    殖した上皮性細胞群を免疫能の低下した動物体内に移植
    し、該動物体内で増殖した移植細胞を摘出し、摘出した
    移植細胞を蛋白分解酵素溶液および上記の培養液を用い
    て再び分散し培養し、樹立したヒト下一体組織由来細胞
    を得ることを特徴とするヒト下垂体ホルモン産生細胞株
    の樹立方法。 (2)  培養液中の血清の比率が1〜25パーセント
    (容量)である特許請求の範囲第1項記載のヒト下画体
    ホルモン重生細胞株の樹立方法。 (3)血清がウシ新生児血清、ウシ胎児血清およびウマ
    血清の混合血清である特許請求の範囲第1項また線第2
    項記載のしF下一体ホル篭ン産生細胞株の樹立方法。 (4)  ウシ新生児血清、ウシ胎児血清およびウマ血
    清の混合比(容量)が4:2:1である特許請求の範囲
    第3項記載のヒト下垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法
    。 (5)  培養液が抗生物質を含有する特許請求の範囲
    第1項記載のヒト下垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法
    。 (6)培養液が次の組成を有する特許請求の範囲第5項
    記載のヒト下垂体ホル(ン重生細胞株の樹立方法。 ハムF−10825部(容量) ウシ新生児血清     1001 ウシ胎児血清       501 ウマ血清         251 ペニシリン         50エニット/−ストレ
    プトマイシン     50 μ?鷹(7)  蛋白分
    解酵素溶液が50〜1200デロテアーゼエエツト/−
    のディス/臂−ゼ溶液である特許請求の範囲第1項記載
    のヒト下垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法。 (8)蛋白分解酵素溶液が30Ofロテアーぜエエ、)
    /−のディス/臂−せ溶液である特許請求の範囲第7項
    記載のヒト下垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法。 (9)  免疫能の低下した動物がヌードマウスまた祉
    ヌードラ、トである特許請求の範囲第1項記載のヒト下
    垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法。 (ト)摘出した移植細胞の培養が骸移植動物の膵臓抗体
    および補体を用いた免疫学的選択培養である特許請求の
    範囲第1項記載のヒト下垂体ホルモン産生細胞株の樹立
    方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2018038401A (ja) * 2011-10-31 2018-03-15 国立研究開発法人理化学研究所 幹細胞の培養方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2018038401A (ja) * 2011-10-31 2018-03-15 国立研究開発法人理化学研究所 幹細胞の培養方法
US10808224B2 (en) 2011-10-31 2020-10-20 Riken Method for culturing stem cell
US11834672B2 (en) 2011-10-31 2023-12-05 Riken Method for producing hypophysis precursor tissue

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