WO2013053480A1 - Zusammensetzung zur einbringung von nukleinsäuren in zellen - Google Patents

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WO2013053480A1
WO2013053480A1 PCT/EP2012/004265 EP2012004265W WO2013053480A1 WO 2013053480 A1 WO2013053480 A1 WO 2013053480A1 EP 2012004265 W EP2012004265 W EP 2012004265W WO 2013053480 A1 WO2013053480 A1 WO 2013053480A1
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nucleic acid
cells
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complexes
organic
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PCT/EP2012/004265
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Hans Kosak
Marcus WEICHERT
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Secutech International Pte. Ltd.
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    • A61K2800/10—General cosmetic use

Definitions

  • the present application relates to pharmaceutical and / or cosmetic compositions comprising at least one organic solvent in which complexes of at least one nucleic acid and organic cations are present dissolved.
  • the compositions are useful e.g. advantageously for use in introducing nucleic acid into cells and / or tissue, especially a mammal.
  • nucleic acids such as deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) has been extensively researched by the pharmaceutical industry for a long time.
  • the aim of the effort is to develop a new class of nucleic acid-based therapeutics, which show a highly selective activity in the control of numerous diseases.
  • nucleic acid-based therapeutics usually exert their action inside cells (e.g., in the cytosol or in the nucleus).
  • cells e.g., in the cytosol or in the nucleus.
  • diffusion of the nucleic acid through the cell membrane, which confines the cells to the outside takes place only to a very limited extent.
  • methods include, for example, electroporation, the use of liposomes and synthetic particles, or the direct injection of naked nucleic acid into the blood for the purpose of subsequent uptake by the corresponding target cells.
  • viral vector systems are used.
  • the vector systems used in these methods are developed from naturally occurring viruses, which have typically been modified so that they are no longer able to replicate in the cells.
  • the viral vectors are produced by special packaging cell lines and can be purified from the culture supernatant of appropriate cell cultures.
  • Concerns about the safety of such vector systems are due, among other things, to possible recombination with naturally occurring viruses. It is not excluded that such a recombination could give rise to recombinant pathogenic viruses which pose a risk to the therapeutically treated organism.
  • non-viral vectors are also common in gene therapy. Suitable non-viral vectors are prepared by recombinant DNA techniques and introduced either in the form of "naked DNA” or in complexed form into the respective target cell.
  • the nucleic acids are coupled to polylysine for transport via the cell membrane, for example.
  • these systems are unsatisfactory in their efficiency since only small amounts of nucleic acid are taken up by the corresponding target cells.
  • nucleic acid which is complexed with organic cations in a certain way and dissolved in organic solvents, can be administered directly into the cell interior, for example, through the skin of a living mammal. As can be determined by means of fluorescent labeling, the nucleic acids can surprisingly penetrate into the cell nuclei of the skin cells.
  • the present invention thus relates, in a first aspect, to a composition
  • a composition comprising at least one organic solvent in which complexes of at least one nucleic acid and at least one organic cation are present in solution for use in introducing nucleic acid into cells or tissue, in particular into cells or tissue of a mammal.
  • the compositions can be used for transepithelial administration.
  • the compositions of the present invention are particularly preferably suitable for application to the skin.
  • compositions and their preparation
  • the present invention provides compositions comprising at least a first organic solvent.
  • the first organic solvent contains dissolved therein one or more complexed with one or more organic cations nucleic acids.
  • the nucleic acids are usually so complexed that the negative charges of the nucleic acids are substantially completely compensated by positive charges of the organic cations.
  • the ratio of the number of positive charges of the cations to negative charges of the nucleic acid is preferably greater than or equal to 0.5, preferably greater than or equal to 0.6, preferably greater than or equal to 0.7, is preferably greater than or equal to 0.8, preferably greater than or equal to 0.9, preferably greater than or equal to 0.91, preferably greater than or equal to 0.92, preferably greater than or equal to 0.93, preferably greater than or equal to zero Is 94, preferably greater than or equal to 0.95, preferably greater than or equal to 0.96, preferably greater than or equal to 0.97, preferably greater than or equal to 0.98, preferably greater than or equal to 0.985, preferably greater than or equal to 0.95 is 0.99, preferably greater than or equal to 0.995, or even equal to 1.
  • the ratio of the number of positive charges of the cations to negative charges of the nucleic acid can be, for example, in the range 0.5-2, for example in the range 0.6-1.8, in the range 0.7-1.3 in the range 0 , 8 - 1, 2 are in the range 0.9 - 1, 1 lie, im Range from 0.91 to 1.10, range from 0.92 to 1.08, range from 0.93 to 1.70, range from 0.94 to 1.06, range from 0.95 to 1 , Lie in the range 0.96 - 1, 04, lie in the range 0.96 - 1, 04, in the range 0.97 - 1, 03 lie, in the range 0.98 - 1, 02 lie, in the range 0,99 - 1, 01 are in the range 0,995 - 1, 005, or even equal to 1.
  • the latter value is achieved in particular if, in the preparation (see later), cations are present in excess in the precipitation of the nucleic acid and the precipitate of organic cation and nucleic acid is washed with water (see below).
  • nucleic acids which are otherwise insoluble in organic solvents, into such solvents.
  • Nucleic acids e.g. DNA or RNA
  • anionic polymers that have a high number of negatively charged phosphate groups. Due to the charge of the polymers, these are readily soluble in aqueous solution, while the solubility in organic solvents is extremely low.
  • the complexed nucleic acids dissolved in organic solvents can be effectively absorbed into cells and / or tissue, e.g. of a mammal.
  • the dermal, transepithelial and / or transdermal incorporation of the nucleic acids complexed according to the invention has proved to be highly efficient. Just a few hours after application to the skin, correspondingly labeled nucleic acids could be detected in various skin cells and in the connective tissue underneath.
  • the nucleic acids complexed according to the invention are therefore particularly suitable as a constituent of cosmetic and / or pharmaceutical compositions for use in the introduction of nucleic acid into cells and / or tissue.
  • At least one organic cation means that at least one type of organic cation is present (eg, CTAB), but there may also be cation mixtures of two or more, three or more, four or more, five or more, etc. different organic cations ( For example, CTAB besides DDAB.) Usually, the at least one organic cation is simply positively charged, and it will be apparent to those skilled in the art that the term is not indicative of the amount of substance.
  • At least one organic solvent means that at least one organic solvent is present, but there may also be solvent mixtures of two or more, three or more, four or more, five or more, etc., of different organic solvents. The nucleic acids are then dissolved accordingly in these solvent mixtures.
  • At least one nucleic acid means that at least one nucleic acid is present, but there may also be nucleic acid mixtures of two or more, three or more, four or more, five or more, etc. different nucleic acids.
  • the at least one nucleic acid in the compositions of the present invention dissolves in the organic solvents due to charge compensation in the complexes formed.
  • the solution of the nucleic acid therefore does not require the formation of micelles, liposomes or similar nanoparticulate structures.
  • complexes of at least one nucleic acid and at least one organic cation are dissolved, wherein the complexes are not located inside a micelle, a liposome or similar nanoparticulate structures.
  • the compositions of the present invention even contain no micelles, liposomes, or similar nanoparticulate structures.
  • a suitable process for preparing complexes of nucleic acid and organic cation which are suitable according to the invention comprises dissolving at least one nucleic acid in an aqueous liquid, in particular water (eg demineralized water), precipitating the at least one nucleic acid by adding at least one organic cation containing the nucleic acid forming an insoluble complex in the aqueous solution, followed by incorporation of the precipitate in at least one organic solvent.
  • water eg demineralized water
  • Such a method may include the following steps:
  • the organic solvent (second liquid) is not an oil or fat.
  • waxes, fats and / or oils but also aqueous liquids are particularly suitable as the third liquid.
  • Suitable organic cations in the context of the present invention are, for example, cationic detergents, lipids and nitrogen compounds with quaternary nitrogen, for example organic ammonium salts.
  • one or more compounds of the formula NR 4 X may be used as the source of organic cations, each R independently being a hydrocarbon radical having from 1 to 20 carbon atoms, which may be branched or unbranched, and X is a halogen selected from the group consisting of from chlorine, bromine, iodine, in particular chlorine or bromine, preferably bromine.
  • the hydrocarbon radical preferably contains only C and H atoms.
  • the source of the at least one organic cation may be one or more compounds of the formula NR 1 R 2 R 3 R 4 X, where R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are organic radicals, in particular hydrocarbon radicals as defined above, and wherein at least R 1 is a C 1 radical and R 2 to R 4 are longer chain radicals or
  • R 1 and R 2 are each a C 1 radical and R 3 and R 4 are longer chain radicals or
  • R 1 , R 2 and R 3 are each a C 1 radical and R 4 is a longer chain radical.
  • radicals R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each and independently of one another as defined below for "R".
  • R in the compounds of the formula NR 4 X is preferably an alkyl radical having 1 to 20 carbon atoms, which may be branched or unbranched.
  • one or more, especially two or three, of R may be relatively short chain radicals such as C1 to C3, such as methyl, ethyl and propyl, while an R may be a longer radical such as C8 or C10 to C20, in particular C10 to C16, such as octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, cetyl, heptadecyl, icosanyl, stearyl or nonadecyl.
  • radicals R is three methyl radicals and one long-chain radical, in particular a C10 to C20 hydrocarbon radical as defined above, in particular a cetyl radical as in cetyltrimethylammonium bromide (CTAB).
  • R does not comprise aromatic and / or non-aromatic ring systems.
  • the at least one organic cation is one or more quaternary amines, with CTAB being particularly preferred.
  • CTAB is one or more quaternary amines
  • Other compounds which are suitable according to the invention for complexing the nucleic acids include benzethonium chloride, benzalkonium, benzalkonium chloride, didecyldimethylammonium bromide (DCAB), dodecyltrimethylammonium bromide (DCTAB), DOTAP, lipofectin, lipofectamine N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] - N, N, N-trimethylammonium chlorides (DOTMA), dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB), dioleyldimethylammonium chlorides (DODAC), 2,3-dioleoyloxy-N- [2- (spermidinecarboxamido) ethyl] -N-N-dimethyl-1-
  • the complexing agent is added to the first liquid in step b) in dissolved form.
  • the nucleic acid is thereby preferably complexed with the at least one organic cation such that a ratio of substantially 1: 1 (ie substantially completely compensated) between the negative charges (ie the anionic groups) of the at least one nucleic acid and the charges of the at least one organic cation is present.
  • organic cations such as those mentioned above, e.g. CTAB, are able to approximate the positively charged group in a sufficiently small distance to the negatively charged oxygen atom of the nucleic acid, so that a sufficient (local) shielding of the total charge of both ions is effected.
  • An advantage of the setting of such a ratio is that the total of organic cations and nucleic acid is approximately charge neutral, that is essentially completely complexed.
  • the complexed nucleic acid is therefore insoluble in an aqueous medium and, when prepared in aqueous media, may be an insoluble precipitate be separated. This property thus facilitates the production of the desired, stoichiometrically complexed nucleic acid.
  • the separation of the complexes according to step c) therefore preferably takes place by means of centrifugation or filtration.
  • the precipitate may be separated by centrifugation for 1 to 10 minutes, preferably 5 minutes, at 10,000 to 20,000 g, preferably 15,000 g. If necessary, this process can be carried out several times after re-inclusion of the precipitate precipitated in water.
  • An advantage of setting such a ratio is further that upon contact of the thus complexed nucleic acid with a living cell or an organ of a living organism no or only a few free organic cations can interact with the cells or the organism. As a result, the organic cations can not elicit cytotoxic effects or other metabolic disorders in the cells, which otherwise can be common.
  • the complexes obtained by precipitation can then be dissolved in a wide variety of organic solvents (including those generally considered to be aqueous solution precipitants). After incorporation into a solvent, these substantially essentially do not contain any organic cations which go beyond the amount required to compensate for the negative charges of the nucleic acid. This means that the number of total positive charges of the organic cations in the solvent is substantially identical to the number of negative charges of the nucleic acid.
  • Organic solvents which are suitable for receiving the complexed nucleic acid include in particular mono- or polyhydric alcohols or partially etherified alcohols.
  • the solvent therefore preferably contains at least one ether group and / or at least one hydroxyl group.
  • Particularly suitable as solvents (amphiphilic) compounds can be described by the formula HO-R1 -O-R2.
  • R 1 and R 2 are each a hydrocarbon radical having 1 to 100 carbon atoms.
  • C1 to C5 alcohols suitable such as methanol, ethanol, 1-propanol or 2-propanol, butanol, such as 1-butanol, or pentadiol, such as 1-pentadiol.
  • polyhydric alcohols such as ethylene glycol or partially etherified derivatives thereof, such as ethylene glycol, which is etherified with methanol, ethanol, propanol or butanol, such as ethylene glycol ethers, in particular ethylene glycol monobutyl ether, ethyl ether or methyl ether, usable.
  • saturated or unsaturated hydrocarbons such as pentane, hexane or heptane, or benzene-based aromatic hydrocarbons, such as styrene, can be used, ie in particular C1-C3-substituted benzenes.
  • halogen-containing solvents such as chloroform, dichloromethane or carbon tetrachloride or other heteroatom-containing solvents such as dimethylformamide or tetrahydrofuran may be used.
  • DMSO can also be used.
  • a concentration of dissolved nucleic acid of more than 1 mg / ml by first mixing the nucleic acid in a first solvent with high solubility (such as, for example, methanol, ethanol, Butanol, 2-propanol, 1-pentanol, ethylene glycol monobutyl ether or mixtures thereof) is dissolved, and the first solvent containing the complexed nucleic acids is then mixed with a second solvent having a lower solubility for the complexed according to the invention nucleic acids.
  • a concentration of 10 ⁇ g / ml could be achieved.
  • Other usable oils are given below.
  • nucleic acid complexes are characterized by an extremely high stability. This is essentially due to the fact that nucleases are inactive in non-aqueous environment. This is especially true when using Ribonucleic acid (RNA) of importance, since in all aqueous systems with a high RNAse activity must be expected. Outside of an RNAse-free environment, which can be realized practically only under special laboratory conditions, is expected in principle with a rapid degradation of the RNA, which in particular significantly hampers the use of therapeutically effective RNA as a pharmaceutical agent. This problem is solved by complexing the nucleic acid to the complexes described herein.
  • RNA Ribonucleic acid
  • the stability of the nucleic acids complexed according to the invention is also increased by the fact that no acid or alkaline environment is present in the organic solvent used. This avoids any acidic or alkaline hydrolysis of the nucleic acids.
  • the organic solvent may be mixed with any other water-immiscible liquids, e.g. with another of the above-mentioned organic solvents.
  • the at least one organic solvent accounts for less than 70% (v / v), preferably less than 50% (v / v), more preferably less than 20% (v / v).
  • the at least one organic solvent may also be present in a concentration of more than 1% (v / v), preferably more than 5% (v / v), more preferably more than 10% (v / v).
  • the organic solvent may be in a range of 1-70% (v / v), 5-50%, or even 10-20% (v / v).
  • the water content, in particular of the phase comprising the nucleic acid complexes, or else of the total compositions to be used according to the invention is preferably less than about 50% (v / v), more preferably less than about 30% (v / v), even more preferably less than about 10% (v / v).
  • a higher water content leads to the formation of larger aggregates which do not possess optimal penetration properties.
  • the average diameter of the complexes of nucleic acid and organic cation in the compositions to be used according to the invention is smaller than 200nm, preferably less than 100nm, more preferably less than 50nm, most preferably less than 1m.
  • compositions of the present invention are excellently formulated as cosmetic and / or therapeutic compositions.
  • the nucleic acid is a therapeutically effective nucleic acid, i. a nucleic acid which, upon administration to an individual, exerts a biological function and thereby provides a therapeutic benefit.
  • a variety of nucleic acids have been described as therapeutically effective. Frequently, in such cases, the nucleic acid will have sequences of a genome or gene.
  • the nucleic acid may be a diagnostically useful nucleic acid, such as e.g. to be a Molecular Beacon.
  • the nucleic acid is a cosmetically active nucleic acid, i. a nucleic acid which, after administration to an individual, does not generally lead to any therapeutic but to a cosmetic benefit.
  • the nucleic acid will not have sequences of a (human) genome or (human) gene.
  • nucleic acids can be used as a source of allantoin.
  • allantoin is the final product of the breakdown of nucleic acids, especially of purine bases, in various animal species, especially mammals. Allantoin is used in cosmetics in skin creams, sunscreens, shampoos, toothpaste and anti-sweating (hyperhidrosis) and skin irritants. It accelerates cell building, cell formation or cell regeneration and calms the skin.
  • the nucleic acid complexes which are present dissolved in one of the above-described organic solvents or solvent mixtures are brought into direct contact with the cells or tissues intended for cosmetic and / or therapeutic treatment, for example by dripping or brushing on Nucleic acid-containing solvent or solvent mixture.
  • an organic solvent is used which is compatible with respect to the cells and / or tissue to be treated.
  • the cosmetic and / or for example if the therapeutic compositions of the present invention are intended for the treatment of the skin, eg, human skin, the corresponding organic solvent will be selected such that no toxic or skin integrity properties are associated with the solvent.
  • Numerous organic solvents are known in the art which are useful as pharmaceutical carriers, especially for dermal administration.
  • compositions of the invention include lotions, creams, ointments, gels and pastes.
  • compositions to be used according to the invention are not emulsions and / or lotions, creams, ointments, gels and pastes.
  • the nucleic acid complexes dissolved in an organic solvent may be mixed with a pharmaceutical carrier suitable for the particular administration.
  • the pharmaceutical carrier can be any water-immiscible lipophilic compound which can be mixed with the organic solvent comprising the nucleic acid complexes.
  • the pharmaceutical carrier is a liquid compound, e.g. one (possibly additional) oil.
  • compositions to be used according to the invention comprise at least one oil and / or at least one wax and / or at least one fat.
  • Suitable oils which can be used to prepare the compositions of the present invention include synthetic, animal and vegetable oils.
  • suitable waxes or fats comprise synthetic, animal and / or vegetable waxes or synthetic, animal and / or vegetable fats.
  • Suitable vegetable oils are, for example, nut oils and seed oils.
  • Suitable vegetable oils include, in particular, peanut oil, walnut oil, almond oil, hazelnut oil, coconut oil, soybean oil, olive oil, poppy seed oil, hemp oil, pumpkin seed oil, sunflower seed oil, Sesame seed oil, cottonseed oil, thistle oil, linseed oil, rapeseed oil, castor oil and the like.
  • Germ oil derived from grain can also be used herein as a carrier.
  • Preferred seed oils include, for example, those derived from corn, wheat, oats, rye, rice and triticale.
  • coconut fat or cocoa butter may be used as suitable vegetable fats.
  • Possible vegetable waxes include, for example, sugarcane wax, carnauba wax, jojoba oil, candelilla wax and Japan wax.
  • oils In addition to vegetable oils, waxes and fats, animal fats, waxes and oils, e.g. Fish oils or oils and fats derived from mink or deer. Cod liver oil and whale oil (such as spermaceti) are examples of fish oils that may be used herein. Possible sources of animal waxes include spermaceti, wool wax and beeswax. Suitable methods for obtaining pure oils of animal origin are known in the art.
  • Suitable synthetic oils and fats are based, for example, on silicone or paraffin compounds.
  • An example is Vaseline.
  • Soya wax can be obtained by hydrogenation from soy and is an example of a synthetic wax.
  • compositions of the present invention when present in an oil, wax or fat, comprise at least one other solvent which is not an oil, wax or fat.
  • the compositions to be used according to the invention comprise, in addition to a (conventional) organic solvent such as ethanol, ethylene glycol monobutyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol monomethyl ether, and / or DMSO, an oil, fat or wax.
  • a particularly preferred combination is a combination of DMSO with at least one oil, fat and / or wax.
  • compositions of the invention may have an oil, wax and / or fat content greater than or equal to 25% (v / v), for example greater than or equal to about 30% (v / v), greater than or equal to about 40% (v / v ), greater than or equal to about 50% (v / v), greater than or equal to about 60% (v / v), greater than or equal to about 70% (v / v), greater than or equal to about 80% (v / v), or greater than or equal to about 85% (v / v).
  • compositions have an oil, wax and / or fat content of greater than about 90%, preferably about 91% (v / v) or greater, about 92% (v / v) or greater, about 93% (v / v) or greater , about 94% (v / v) or more, about 95% (v / v) or more, about 96% (v / v) or more, about 97% (v / v) or more, about 98% (v / v) or more, about 99% (v / v) or more.
  • compositions according to the invention may contain further auxiliaries.
  • auxiliaries include diluents, dyes, preservatives, emulsifiers, thickeners, fragrances, vitamins, and other agents known in the pharmaceutical arts.
  • cell-permeable substances which are known to increase the permeability of the cell membrane and thus facilitate the penetration of the nucleic acid complexes into the cells or tissues.
  • substances which facilitate the entry of DNA or RNA into cells are in particular fatty acids, fatty acid esters, glycerol diesters, glycerol triesters, glycerol monoesters and urea.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the organic solvent used to dissolve the complexed nucleic acid is DMSO. If another organic solvent has been used to take up the complexed nucleic acid, it may be mixed with DMSO to increase the amount and / or rate of uptake of the complexed nucleic acid by the cells and / or tissues.
  • the amount of DMSO in the composition of the invention is preferably from about 1 to about 50% by volume, with a level of from about 5 to about 30% by volume, e.g. 10% by volume is particularly preferred.
  • compositions to be used according to the invention are in the form of a liquid which has a lower vapor pressure than water. This can prevent the liquid composition from evaporating after application to the cells and / or tissues such as the skin.
  • Liquid compositions having complexed nucleic acids having a higher vapor pressure than water may be prepared by the type and amount of the particular solvent or solvents of the compositions.
  • the properties of the pharmaceutical and / or cosmetic compositions of the invention can be influenced accordingly by using solvents having a higher vapor pressure than water, such as DMSO or higher alcohols such as butanol, pentanol, etc.
  • Another way to obtain nucleic acid-containing fluids having a higher vapor pressure than water is to mix a solution of complexed nucleic acids in a first solvent having a lower vapor pressure than water (such as ethanol) with a second solvent which has a higher vapor pressure than water.
  • a first solvent having a lower vapor pressure than water such as ethanol
  • the complexed nucleic acids are incubated in a first solvent, e.g. in butanol, dissolved. Subsequently, the nucleic acid-containing solvent is mixed with one or more oils, so that a liquid is formed, which consists of complexed nucleic acids, solvents and oil.
  • a first solvent e.g. in butanol
  • the nucleic acid The nucleic acid
  • nucleic acid to be introduced into the cells or tissue according to the invention is a charged nucleic acid.
  • nucleic acid is understood to mean a nucleic acid whose nucleosides are linked to one another by phosphodiester bonds, the phosphate residues participating in the phosphodiester bonds being negatively charged, as is the case with naturally occurring DNA or RNA the charged nucleic acids to polyanionic acids (polyelectrolytes), in which the anionic groups by the negatively charged oxygen radicals of the phosphate groups which form the Phosphordiesteritatien be formed.
  • the residues of the nucleic acids carrying the negative charges may also be the negative residues of phosphorothioates or phosphorodithioates or also other negatively charged groups of nucleic acids.
  • nucleic acids dissolve well in water, but not in water-immiscible organic liquids such as hydrocarbons or other organic solvents such as chloroform, etc.
  • a nucleic acid is considered to be dissolved in the sense of the invention if it differs Do not centrifuge for 5 minutes at 15000 xg.
  • the nucleic acids to be introduced may be single-stranded or double-stranded nucleic acids, e.g. single-stranded or double-stranded DNA or RNA.
  • a double-stranded nucleic acid may be in the form of two separate single strands or as a hairpin loop structure.
  • the size of the nucleic acid to be introduced is not critical according to the invention. It was shown that both oligonucleotides with a chain length of 10 to 100 nucleotides, as well as linear and circular plasmids with a size of several kb (for example, with a size of 1-10 kb) could be efficiently introduced into human and murine skin cells.
  • compositions of the present invention open up new opportunities both in the field of gene therapy, in which nucleic acids encoding certain polypeptides are introduced into cells of a living mammal, as well as in the field of RNA interference, in which the targeted Expression of certain genes is affected.
  • the nucleic acid to be introduced is an oligonucleotide, i. single-stranded or double-stranded DNA or RNA (or DNA / RNA hybrids) having a chain length of from about 5 to about 150 nucleotides, preferably from about 7 to about 100 nucleotides, preferably from about 10 to about 80 nucleotides, more preferably from about 20 to about 60 nucleotides.
  • the oligonucleotide is preferably a synthetically produced oligonucleotide of known sequence.
  • the nucleic acids may be, for example, DNA, cDNA, mRNA, sRNA, ribozymes, antisense DNA, RNA, antisense RNA, siRNA, decoys, tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, or act miRNA.
  • the nucleic acid is not siRNA.
  • the nucleic acid to be introduced is a vector or a plasmid with a size of more than 1 kb (1000 nucleotides).
  • the size of the vector or plasmid will typically be greater than 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 1k, 12kb, 13kb, 14 kb, 15 kb or even more than 20 kb. It may be with the nucleic acid to be introduced into the cells, e.g. is a gene therapy vector which is administered for expression in a mammal.
  • Examples of gene therapy vectors suitable for introduction into tissue of a living mammal according to the invention include viral and non-viral vectors.
  • Viral vectors are derived from various viruses, e.g. of retroviruses, herpesviruses, adenoviruses or adeno-associated viruses (AAV), see Lundstrom, Trends Biotechnol. (2003), 21 (3): 1 1 7-22.
  • the viral vectors are those that are no longer able to replicate in the cells transfected therewith.
  • non-viral vectors e.g. eukaryotic expression vectors as described herein are introduced into the cells or tissues.
  • the vectors or plasmids preferably comprise a eukaryotic promoter that is active in the mammal.
  • compositions according to the invention are advantageously suitable for example for use in medicine, e.g. for therapy or diagnostics or in cosmetics, in particular when nucleic acids have to be introduced into cells or tissue.
  • the cells or tissues to be treated by the incorporation of the nucleic acid complexes are cells and / or tissues of a mammal, e.g. around cells and / or tissues of rat, hamster, guinea pig, dog, cat, horse, cattle, pig, sheep, goat and others.
  • the composition is formulated for the introduction of nucleic acid into human cells and / or tissue.
  • nucleic acids with which after administration, eg after application to the skin of humans and animals, transport the nucleic acids in different cell types is possible.
  • nucleic acids can be introduced into epithelial cells, endothelial cells, hair cells (such as hair root cells and / or hair follicle cells), muscle cells, fat and connective tissue cells and capillary cells of living mammals with the described compositions.
  • hair cells such as hair root cells and / or hair follicle cells
  • muscle cells such as hair root cells and / or hair follicle cells
  • capillary cells of living mammals with the described compositions.
  • human cells are concerned, these are preferably not embryonic stem cells.
  • Tissues into which nucleic acids can be introduced according to the invention include e.g. Epithelial tissue, connective tissue and muscle tissue.
  • Epithelial tissue e.g. Epithelial tissue, connective tissue and muscle tissue.
  • the introduction into the skin in particular in the epidermis, dermis and / or subcutis is preferred.
  • introduction via other types of epithelium e.g., intestinal epithelium is preferred.
  • compositions are useful not only for delivery of nucleic acid into cells or tissues but also, in particular, for transepithelial administration. That is, the compositions of the present invention are capable of penetrating epithelial layers and reaching adjacent, deeper tissue layers. This allows treatment by a non-invasive route, e.g. without the use of syringes.
  • the pharmaceutical composition is for this purpose brought into contact with the cells and / or tissues to be treated.
  • the contact with the complexed nucleic acids preferably takes place without injury to the respective tissue surface, such as e.g. the skin of the mammal.
  • the composition is applied to the cells and / or tissues, e.g. by dripping or painting.
  • the tissue intended for uptake of the complexed nucleic acid according to the invention is epithelial tissue of a mammal, for example the skin of a mammal.
  • the residence time of the (pharmaceutical or cosmetic) composition on the cells or tissues will generally be in the range of minutes or hours. However, in some applications it may also be advantageous to provide a residence time of several days, especially if it is desired to introduce a large amount of nucleic acid into the cells or tissues. Applications where a longer residence time is set may, in particular, involve the introduction of nucleic acids into deeper skin layers, such as the dermis or subcutis.
  • the complexed nucleic acid When introducing the complexed nucleic acid into the cells and / or tissue, in particular into the skin, it may be necessary or expedient to repeat the application of the composition according to the invention once or even several times.
  • the plot will be 2, 3, 4, 5, 10, 15 or 20 times, e.g. repeated in the course of a month until the intracellular concentration of the nucleic acid in the cells or in the cell nuclei is sufficiently high.
  • complexed nucleic acid could be introduced into epidermal, dermal and subcutaneous tissue cells by using a composition of the invention.
  • the cell nuclei also had absorbed a significant amount of the nucleic acids.
  • the period of treatment before histological examination of the tissue was 1 to 4 days. During this time, the animals were vital, and no behavioral or morphological changes could be observed. The treatment with the compositions according to the invention thus shows no side effects.
  • the amount of complexed nucleic acid and the duration of the treatment are determined by the cells or tissues into which the complexed nucleic acids are to be introduced. In the context of the present invention, it was possible by experiments with mice to show that the nucleic acids were already present in the cells of the subcutis after three days.
  • compositions of the present invention may be administered in principle in any manner known to those skilled in the art.
  • the compositions can be administered, for example, parenterally, enterally, and / or topically.
  • Routes of administration therefore include, for example, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal or transdermal administration, oral or rectal administration, epicutaneous, dermal, inhalative, nasal, or intranasal administration.
  • Particularly preferred are topical, dermal, and / or transdermal administration.
  • the present invention relates to a method of treating a patient or a method for introducing at least one nucleic acid into cells and / or tissue of a patient, the method comprising the following step:
  • composition of the present invention a composition of the present invention with cells or (tissue) of a patient.
  • the patient may be a human or an animal, in particular a mammal.
  • the complexed nucleic acids continuously to the respective cells and / or tissue over several days.
  • This can e.g. by administering the complexed nucleic acid by means of a patch which is adhered to the skin.
  • the nucleic acid complexed in the organic solvent may be applied to an absorbent material, such as e.g. a nonwoven or a cellulose matrix, to be dropped.
  • the absorbent material is then sealed by covering with a suitable fixative, e.g. with a self-adhesive film, fixed on the surface of the individual to be treated (e.g., a mammal).
  • Fixing agents are preferably used which prevent leakage of the compositions to be used according to the invention on the side of the plaster facing away from the tissue surface.
  • high oil content compositions e.g. Sheets of thermoplastic materials, such as e.g. Polyethylene terephthalate, polyethylene, polyvinyl chloride or polypropylene use find.
  • thermoplastic materials such as e.g. Polyethylene terephthalate, polyethylene, polyvinyl chloride or polypropylene use find.
  • the dosage of the complexed nucleic acid can be effected via the volume of the organic solvent and via the concentrations of the nucleic acid in the solvent.
  • the surface to be treated for example the skin surface
  • the administration of the compositions according to the invention by means of a plaster also has the advantage that abrasion or smearing of the applied composition is prevented.
  • the tissue surface to be treated can be precisely adjusted.
  • the patch may be targeted to the surface to be treated by selecting a suitable size of the absorbent material which will release the complexed nucleic acid.
  • An advantage of using patches to apply the compositions of the present invention is the ability to prefabricate large numbers of patches and store them under suitable conditions (e.g., at 4 ° C or at room temperature). Such prefabricated patches can be used quickly and easily when needed. Methods of making suitable patches are described, for example, in U.S. Patents 4,983,395 and 4,849,224.
  • the patches can be sealed in a tight-fitting material.
  • the plasters are easily stable for several months, in particular for up to about 6 months, 12 months, 18 months, 24 months, 30 months or 36 months, without significant changes in the nucleic acid-containing compositions.
  • a (pharmaceutical or cosmetic) composition comprising at least one organic solvent in which dissolved complexes of at least one nucleic acid and CTAB cations are present (wherein the nucleic acid is preferably complexed such that the negative charges of the nucleic acid by CTAB cations substantially fully compensated) for use in introducing nucleic acid into human cells or tissue.
  • a (pharmaceutical or cosmetic) composition comprising at least one organic solvent in which dissolved complexes of a nucleic acid and at least one organic cation are present (wherein the nucleic acid is preferably complexed such that the negative charges of the nucleic acid by the positive charges of the organic Cations are substantially completely compensated) for use in introducing nucleic acid into cells of the human skin, in particular for introducing the nucleic acid into the cell nuclei of cells of the epidermis, dermis and / or subcutis.
  • a (pharmaceutical or cosmetic) composition comprising at least one organic solvent in which dissolved complexes of at least one nucleic acid and at least one organic cation are present, wherein the nucleic acid is siRNA or miRNA (wherein the nucleic acid is preferably complexed in that the negative charges of the nucleic acid are substantially completely compensated by positive charges of the organic cations, for use in the introduction of nucleic acid into cells of the human skin, whereby the nucleic acid enters the cell nuclei of cells of the epidermis, dermis and / or subcutis.
  • a pharmaceutical or cosmetic composition comprising at least one organic solvent in which dissolved complexes of at least one nucleic acid and CTAB cations are present, wherein the nucleic acid is siRNA or miRNA, which is preferably complexed such that the negative charges the nucleic acid is substantially completely compensated by CTAB cations, for use in the introduction of nucleic acid into cells of the human skin, in particular for introducing the nucleic acid into the cell nuclei of cells of the epidermis, dermis and / or subcutis.
  • Fig. 1 shows the thin section of human skin after treatment with fluorescent oligonucleotides from Example 3.
  • Fig. 1 the cell nuclei by staining with Bisbenzimid shown and were visible in the blue channel of the fluorescence microscope (light areas) ..
  • Fig. 2 shows the same section as Figure 1, wherein the green channel is shown.
  • the green fluorescence (bright areas) indicate the fluorescence of the applied FAM oligonucleotide.
  • the fluorescence is observed on the surface of the skin (right margin) in the underlying cells.
  • the bright areas behind the skin surface coincide with the areas of the cell nuclei in FIG. 1.
  • Fig. 3 shows the longitudinal section of a hair from a skin portion of a mouse after treatment with fluorescent oligonucleotides from Example 9. Shown are the cell nuclei by staining with bisbenzimide (Figure 3A) as well as the green fluorescence (bright areas) of the applied FAM oligonucleotide on ( Figure 3B).
  • FIG. 4 shows the cross section of a hair from a section of the skin of a mouse after treatment with fluorescent oligonucleotides from Example 9. Shown are the cell nuclei by staining with Bisbenzimid ( Figure 4A) and the green fluorescence (bright areas) of the applied FAM oligonucleotide ( Figure 4B).
  • Fig. 5 Photograph of a mouse four weeks after treatment with siRNA-1 (tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-propylene glycol formulation.
  • Fig. 6 Photograph of a mouse four weeks after treatment with siRNA-1 (tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-propylene glycol formulation.
  • Fig. 7 Photograph of a mouse three weeks after treatment with siRNA-1 (tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-ethanol castor formulation.
  • Fig. 8 Photograph of a mouse three weeks after treatment with siRNA-1 (tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-ethanol castor formulation.
  • FIG. 9 Photograph of a mouse five weeks after treatment with siRNA-1 (tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-ethanol castor formulation.
  • Fig. 10 Fluorescence microscopic images of a thin section of a skin area five weeks after treatment with siRNA-1 (SEQ ID NO: 2) in dimethyl sulfoxide / propylene glycol. A skin area is prepared showing the transition between the hairless and the hairy area.
  • Flg. 10A Representation of cell nuclei with bisbenzimide.
  • Fig. 10B Representation of tyrosinase by means of anti-tyrosinase antibodies.
  • oligonucleotides were intended for transdermal administration to human skin or mouse skin.
  • oligonucleotide (3'-GAT CCT GCA TAT GGT AGT G -5 '(SEQ ID NO: 1), molecular weight 5938.82 g / mole) was labeled with the fluorescent dye TAMRA (oligonucleotide 1). Oligonucleotide 2 (molecular weight 5938.82 g / mole) having the same sequence was labeled with the fluorescent dye fluorescein 6FAM to allow detection of the oligonucleotide in the skin cells.
  • the oligonucleotides were obtained from Biolegio (6545 CG Nijmegen, The Netherlands).
  • oligonucleotide complexes For the preparation of CTAB oligonucleotide complexes, 1 mg of the oligonucleotides were dissolved in 200 .mu.l water and mixed with 400 .mu.10m CTAB. The sample was incubated on ice for 30 min and the resulting precipitate was centrifuged for 5 min at 10,000 xg. The supernatant was removed and the precipitate was suspended with 200 ⁇ water and centrifuged again. The precipitate was dried overnight in the Speedvac.
  • CTAB-nucleic acid complexes prepared in Example 2 were weighed and ethylene glycol monoethyl ether (EGE) or butanol was taken up in the organic solvent, the final concentration of the complexed nucleic acid being approximately 1 mg / ml.
  • EGE ethylene glycol monoethyl ether
  • the CTAB-nucleic acid complexes dissolved in ethylene glycol monoethyl ether were then mixed with almond oil in a volume ratio of 9: 1 ecethylene glycol monoethyl ether (90% (v / v) oil, 10% (v / v) EGE).
  • the final concentration of the complexed nucleic acid in the respective mixture was thus about 100 ⁇ g / ml.
  • the appropriately prepared skin fragment was transferred to a Petri dish with 5 ml Ringer's solution and incubated overnight at 37 ° C in the C0 2 -lnkubator. Subsequently, the skin fragment was carefully dissected with a scalpel so that partial fragments were obtained, each having a nonwoven paper on their surfaces. The partial fragments were frozen in liquid nitrogen for further storage. The frozen partial fragments were used for the production of thin sections with a thickness of about 8 pm. A nuclear staining with bisbenzimide (5 min, 1 ⁇ g / ml bisbenzimide in PBS) was carried out by fluorescence microscopy.
  • FIG. 1 shows a fluorescence micrograph of a thin section of a skin fragment treated as described above. Clearly visible are the cell nuclei visualized by bisbenzimide staining, which appear as blue colored areas.
  • FIG. 2 shows the same thin section as FIG. 1, in which green channel (fluorescence of the FAM oligos) is shown. The bright areas show the fluorescent oligonucleotide. It can be seen that the bright areas coincide with the blue areas of FIG. This correspondence shows that the fluorescent oligonucleotides were able to penetrate into the cell nuclei of the skin cells.
  • Skin fragments treated with TAMRA-labeled oligonucleotide showed a corresponding red fluorescence of the cell nuclei. Skin fragments that had been treated only with the control (without oligonucleotide) showed no fluorescence of nuclei in the green or red channel.
  • CTAB complexes of oligonucleotide 1 were prepared as in Example 2 and dissolved in ethylene glycol monobutyl ether (EGE) to a final concentration of approximately 1 pg / ⁇ l. Subsequently, the solvent containing the complexes was diluted 1:10 with almond oil (90% (v / v) oil, 10% EGE) to give a final concentration of 100 pg / ml CTAB nucleic acid.
  • EGE ethylene glycol monobutyl ether
  • mice were prepared for dermal application of the composition by shaving a fur area in the neck. Once 50 ⁇ of the composition was applied to the shaved neck area.
  • the preparation of the treated skin area was carried out after 0, 1, 2 or 3 days.
  • the preparations were frozen in liquid nitrogen and thin sections approximately 8 ⁇ m thick were prepared for fluorescence microscopy.
  • the nuclear staining was carried out as described in Example 3 with bisbenzimide. Evaluation of the fluorescence microscopy showed after 3 days cell nuclei of epidermal cells, which appeared green by the fluorescein-labeled oligonucleotide.
  • CTAB complexes of oligonucleotide 1 were prepared as in Example 2 and dissolved in to give a final concentration of about 1 ⁇ ⁇ in butanol. Subsequently, the solvent mixture containing the complexes was diluted 1:10 with almond oil or walnut oil (90% (v / v) oil, 10% butanol to give a final concentration of CTAB-nucleic acid complexes of 100 g / ml.
  • mice were prepared for dermal application of the composition by shaving a fur area in the neck. In each case 40 ⁇ of the composition was applied once a day to the shaved neck area for three days.
  • the preparation of the treated skin area was done after 3 days after the last treatment.
  • the preparations were frozen in liquid nitrogen and thin sections approximately 8 ⁇ m thick were prepared for fluorescence microscopy.
  • the nuclear staining was carried out as described in Example 3 with bisbenzimide.
  • the evaluation of the fluorescence microscopy showed after 3 days cell nuclei of epidermal cells and of cells of the hair follicle and bulge region, which appeared green by the fluorescein-labeled oligonucleotide.
  • CTAB complexes of oligonucleotide 1 were prepared as in Example 2 and dissolved in ethylene glycol monobutyl ether (EGE) to a final concentration of approximately 0.5 pg / ⁇ . Subsequently, the solvent containing the complexes was mixed 1: 1 with almond oil (50% (v / v) oil, 50% EGE) to give a final concentration of CTAB-nucleic acid complexes of 250pg / ml.
  • EGE ethylene glycol monobutyl ether
  • mice were prepared for dermal application of the composition by shaving a fur area in the neck. In each case 40 ⁇ of the composition was applied once a day to the shaved neck area for three days. The preparation of the treated skin area was done after 3 days after the last treatment. The preparations were frozen in liquid nitrogen and thin sections approximately 8 ⁇ m thick were prepared for fluorescence microscopy. The nuclear staining was carried out as described in Example 3 with bisbenzimide. Evaluation of fluorescence microscopy revealed cell nuclei of epidermal cells and cells of the hair follicle and bulge region, muscle cells, fat cells, connective tissue cells and capillary cells which appeared green by the fluorescein-labeled oligonucleotide.
  • CTAB DNA particle size is important. Smaller particles can easily penetrate the skin and be absorbed by the cell membrane. Therefore, CTAB DNA particle size was determined by dynamic light scattering
  • the CTAB DNA solution in DMSO was diluted 1:10 with DMSO and water to produce various DMSO-water mixtures in the concentration range with a DMSO content (v / v) of between 10-100%.
  • a DMSO content (v / v) of between 10-100% 0.5 ml each of the different CTAB-DNA solutions in the DMSO-water mixtures was transferred to plastic cuvettes and the particle size was measured by means of dynamic light scattering with a (Zetasizer, Malvern Instruments GmbH, 71083 Berlinberg).
  • 5 mg of the fluorescent DNA oligonucleotide 2 was dissolved in 1 ml of water and mixed with 300 ⁇ l of 100 mM cetyltrimethylammonium bromide solution. The result was a yellowish turbidity, which was precipitated by centrifugation at 10,000 xg for 5 min. The supernatant was discarded and the precipitate suspended in 1 ml of water and again centrifuged as above. The supernatant was discarded and the precipitate dried under vacuum. The precipitate was taken up in 1 ml of ethanol. The result was a yellow, clear solution. 100 ⁇ of the fluorescent DNA was mixed in a plastic tube with 1 ml of castor oil. The result was a homogeneous, viscous fluid containing 90% (v / v) rinin citrus oil and 10% (v / v) ethanol and dissolved DNA.
  • mice C27 / Black were prepared for dermal application of the composition by shaving a fur area in the neck. In each case 10 .mu. ⁇ , 20 .mu. ⁇ and 40 .mu. ⁇ of the composition according to Example 8 were applied to the shaved neck area for each mouse. After three Days were the mice killed and the treated skin areas cut out. As a control skin areas were used, which were not treated with nucleic acid complexes. The preparations were fixed by overnight incubation at 4 ° C in 10% (w / v) formaldehyde in phosphate buffered saline (PBS) and frozen in liquid nitrogen. From the skin areas, thin sections approximately 8 ⁇ m thick were made on slides for fluorescence microscopy.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Nuclear staining was carried out by incubation for 5 minutes in 2 ⁇ g / ml bisbenzimide in PBS.
  • the thin sections were coated with Fluoromount and examined by fluorescence microscopy.
  • the thin sections of the areas treated with fluorescent DNA oligonucleotide 2 showed a green fluorescence within the skin which was detectable particularly in the cell nuclei. No fluorescence was observed in thin sections of untreated skin areas.
  • Figures 3 and 4 show in the longitudinal ( Figure 3) and cross-section ( Figure 4) hair, wherein the cell nuclei of hair cells were colored green by the fluorescein-labeled oligonucleotide 2. Hair cells from areas that were not treated with fluorescent DNA did not show any green fluorescence within the cells.
  • siRNAs were obtained as double-stranded products with 3 'deoxythymidine overhangs (dTdT) from Eurofins MWG Operon (85560 Ebersberg, Germany).
  • siRNA-1 tyrosinase-specific
  • siRNA-2 nonspecific control
  • siRNA oligonucleotide SEQ ID NO: 2 (tyrosinase-specific) and 2 (nonspecific control; SEQ ID NO: 3) were each dissolved in 200 ⁇ water and 600 ⁇ 10mM Cetyltrimethylammonium bromide solution mixed. The result was a white turbidity, which was deposited by centrifugation for 5 min at 10,000 xg. The supernatants were discarded and the precipitates suspended in 200 ⁇ water and again centrifuged as above. The supernatants were discarded and the precipitates dried under vacuum. 200 ⁇ ethanol was added to the precipitates and the suspension was vortexed. The suspension remained cloudy. In 200 ⁇ steps more ethanol was added and mixed.
  • the complexed siRNA was completely dissolved.
  • 50 ⁇ , 10 ⁇ , 200 ⁇ of the complexed siRNA in ethanol were mixed with 950 ⁇ , 900 ⁇ and 800 ⁇ castor oil (total volume 1 ml each) by pipetting up and down. Clear solutions were generated with siRNAs.
  • siRNA oligonucleotide 1 SEQ ID NO: 2
  • 2 SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 3 2 mg
  • the precipitate was taken up in 200 ⁇ dimethyl sulfoxide. 10 ⁇ , 20 ⁇ and 50 ⁇ of the complexed siRNA in dimethyl sulfoxide were mixed with 90 ⁇ , 80 ⁇ and 50 ⁇ propylene glycol (total volume 100 ⁇ each). Clear solutions with dissolved siRNAs were generated.
  • mice 14 mice were used to study the effect of lipophilic siRNA-Tyr complexes.
  • 3 mice were applied to the unshaven head or back skin, each 20 ⁇ l of the siRNA-1 dissolved in dimethyl sulfoxide / propylene glycol (samples 1 d, 1 f and 1 g from Example 1 2).
  • 20 ⁇ of the dissolved in ethanol / castor oil siRNA-1 (samples 1 a, 1 b and 1 c of Example 1 1) were applied to the unshaven head or back skin.
  • mice were in the same places per 20 ⁇ of dissolved in ethanol / castor oil siRNA 2 (nonspecific controls, samples 2a, 2b and 2c of Example 1 1) and 3 other mice dissolved in dimethylsulfoxide / propylene glycol siRNA 2 (nonspecific control, samples 2d, 2f and 2g of Example 1 2).
  • uncomplexed siRNA-1 was immediately dissolved in sterile TE (10 mM TrisCl, pH 8, 2 mM EDTA) or TE with 20% (v / v) dimethylsulfoxide to a final concentration of siRNA-1 of 2pg / ⁇ l and 20 ⁇ of each Solution also applied to each one mouse.
  • mice were kept ad libitum with water and dry diet.
  • the hairs of the mice treated with siRNA-1 (tyrosinase-specific) turned white and precipitated.
  • the siRNA-2 control hairs as well as the uncomplexed siRNA-1 treated mice remained dense and black.
  • the hair grew again with siRNA-1 (tyrosinase-specific), so that the effect was completely abolished after approx. 7 weeks after application.
  • no variation was compared with the siRNA-1 (tyrosinase-specific) treated mice observable to the control group. Over the entire period, the mice were vital and showed no pathological changes.
  • tyrosinase protein in the skin of the treated mice was examined in thin sections using anti-tyrosinase antibodies.
  • a mouse treated with complexed siRNA-1 in dimethyl sulfoxide / propylene glycol (20%: 80%) was sacrificed at 5 weeks and cut out of a skin area that included both part of a hairless and part hairy area of the skin.
  • a skin area was used which had not been treated with complexed siRNA-1.
  • the skin fragments were fixed overnight at 4 ° C in PBS with 10% formaldehyde, frozen in liquid nitrogen and cut into 8 ⁇ m thin sections.
  • the sections were incubated in 1 to 200 rabbit anti-tyrosinase antibodies diluted in PBS (Antibody-online.com, Atlanta, GA 30346, USA) for 1 hr at room temperature.
  • the sections were rinsed in PBS and incubated with rhodamine-coupled anti-rabbit antibodies for 1 hour at room temperature.
  • the sections were then rinsed with PBS and incubated for nuclear staining with 2 ⁇ g / ml bisbenzimide in PBS.
  • the sections were then rinsed again with PBS and capped with a drop of Fluoromount.
  • the thin sections were evaluated by means of a fluorescence microscope.
  • the controls which had not been treated with complexed siRNA-1, showed a clear red fluorescence in the area of the hair cells and epithelial cells.
  • the red fluorescence indicates the presence of tyrosinase in the thin sections.
  • Skin areas treated with complexed siRNA-1 showed no or greatly reduced red fluorescence.

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind pharmazeutische und/oder kosmetische Zusammensetzungen, die mindestens ein organisches Lösungsmittel umfassen, in dem Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und organischen Kationen gelöst vorliegen. Die Zusammensetzungen eignen sich in vorteilhafter Weise zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in Zellen und/oder Gewebe, insbesondere eines Säugetiers.

Description

Zusammensetzung zur Einbringung von Nukleinsäuren in Zellen
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind pharmazeutische und/oder kosmetische Zusammensetzungen, die mindestens ein organisches Lösungsmittel umfassen, in dem Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und organischen Kationen gelöst vorliegen. Die Zusammensetzungen eignen sich z.B. in vorteilhafter Weise zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in Zellen und/oder Gewebe, insbesondere eines Säugetiers.
Stand der Technik
Die therapeutische Verwendung von Nukleinsäuren wie Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) wird seit langer Zeit von der pharmazeutischen Industrie intensiv erforscht. Ziel der Bemühungen ist es, eine neue Klasse von Nukleinsäure-basierten Therapeutika zu entwickeln, die eine hochselektive Wirksamkeit bei der Bekämpfung zahlreicher Erkrankungen zeigen.
Ein grundsätzliches Problem bei der Entwicklung von Nukleinsäure-basierten Therapeutika besteht darin, dass diese ihre Wirkung in der Regel im Inneren von Zellen entfalten (z.B. im Zytosol oder im Zellkern). Aufgrund der Ladung der Nukleinsäuren findet jedoch eine Diffusion der Nukleinsäure durch die Zellmembran, welche die Zellen nach außen hin begrenzt, nur in äußerst beschränktem Ausmaß statt. Zur Überwindung dieser Barriere wurde eine Vielzahl von verschiedenen Verfahren entwickelt, um Nukleinsäure in Zellen einzubringen. Diese Verfahren umfassen beispielsweise die Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und synthetischen Partikeln oder die direkte Injektion von nackter Nukleinsäure ins Blut zum Zwecke der anschließenden Aufnahme derselben durch die entsprechenden Zielzellen.
Im Stand der Technik sind darüber hinaus zahlreiche Verfahren zur Einbringung von Nukleinsäure in Zellen im Rahmen von gentherapeutischen Ansätzen bekannt, wobei üblicherweise virale Vektorsysteme zum Einsatz kommen. Die in diesen Verfahren eingesetzten Vektorsysteme werden aus natürlich vorkommenden Viren entwickelt, die in der Regel so modifiziert wurden, dass sie nicht länger in der Lage sind, sich in den Zellen zu replizieren. Die viralen Vektoren werden von speziellen Verpackungszelllinien hergestellt und lassen sich aus dem Kulturüberstand entsprechender Zellkulturen reinigen. Bedenken hinsichtlich der Sicherheit solcher Vektorsysteme bestehen u.a. aufgrund der möglichen Rekombination mit natürlich vorkommenden Viren. Es ist nicht ausgeschlossen, dass bei einer solchen Rekombination rekombinante pathogene Viren entstehen könnten, die ein Risiko für den therapeutisch behandelten Organismus darstellen.
Neben den viralen Vektorsystemen sind auch nicht-virale Vektoren in der Gentherapie üblich. Geeignete nicht-virale Vektoren werden mit Hilfe von rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt und entweder in Form von "nackter DNA" oder in komplexierter Form in die jeweilige Zielzelle eingebracht. Dabei werden die Nukleinsäuren für den Transport über die Zellmembran beispielsweise an Polylysin gekoppelt. Diese Systeme sind allerdings hinsichtlich ihrer Effizienz unbefriedigend, da lediglich geringe Mengen an Nukleinsäure von den entsprechenden Zielzellen aufgenommen werden.
Die Möglichkeit der Einbringung von nackter Nukleinsäure wird seit langer Zeit auch intensiv im Zusammenhang mit einer DNA-Vakzinierung erforscht. So konnte gezeigt werden, dass durch direkte intramuskuläre Injektion von RNA- oder DNA-Vektoren, die für verschiedene Enzyme kodierten, eine Gen-Expression im lebenden Organismus erreicht werden kann (Wolff et al. (1990), Science, 247, 1465-1468).
Trotz der oben dargestellten Entwicklungen besteht weiterhin ein Bedürfnis nach einem einfachen und kostengünstigen Verfahren zur Einbringung von Nukleinsäure in Zellen oder Gewebe von lebenden Organismen. Das Verfahren sollte vorzugsweise mit einem geringen gesundheitlichen Risiko verbunden sein und möglichst auf virale Vektorsysteme und ähnliche Hilfsmittel verzichten. Es wurde nunmehr überraschenderweise festgestellt, dass Nukleinsäure, die in bestimmter Weise mit organischen Kationen komplexiert und in organischen Lösungsmitteln gelöst ist, direkt beispielsweise durch die Haut eines lebenden Säugetiers in das Zellinnere verabreicht werden kann. Wie sich mittels Fluoreszenzmarkierung feststellen lässt, können die Nukleinsäuren dabei überraschenderweise bis in die Zellkerne der Hautzellen eindringen. Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem ersten Aspekt eine Zusammensetzung, die mindestens ein organisches Lösungsmittel umfasst, in dem Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organisch Kation gelöst vorliegen zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in Zellen oder Gewebe, insbesondere in Zellen oder Gewebe eines Säugetiers. Ebenso können die Zusammensetzungen zur transepithelialen Verabreichung verwendet werden. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eignen sich besonders bevorzugt zur Auftragung auf die Haut.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in der nachfolgenden Beschreibung und den abhängigen Ansprüchen offenbart.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Zusammensetzungen und deren Herstellung
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die mindestens ein erstes organisches Lösungsmittel umfassen. Das erste organische Lösungsmittel enthält darin gelöst eine oder mehrere mit einem oder mehreren organischen Kationen komplexierte Nukleinsäuren. Die Nukleinsäuren sind in der Regel derart komplexiett, dass die negativen Ladungen der Nukleinsäuren durch positive Ladungen der organischen Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert sind. Im Wesentlichen vollständig kompensiert bedeutet hier insbesondere, dass das Verhältnis der Anzahl an positiven Ladungen der Kationen zu negativen Ladungen der Nukleinsäure vorzugsweise größer oder gleich 0,5 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,6 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,7 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,8 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,9 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,91 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,92 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,93 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,94 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,95 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,96 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,97 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,98 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,985 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,99 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,995 ist, oder sogar gleich 1 ist. Das Verhältnis der Anzahl an positiven Ladungen der Kationen zu negativen Ladungen der Nukleinsäure kann beispielsweise im Bereich 0,5 - 2 liegen, z.B. im Bereich 0,6 - 1 ,8 liegen, im Bereich 0,7 - 1 ,3, im Bereich 0,8 - 1 ,2 liegen, im Bereich 0,9 - 1 ,1 liegen, im Bereich 0,91 - 1 ,09 liegen, im Bereich 0,92 - 1 ,08 liegen, im Bereich 0,93 - 1 ,07 liegen , im Bereich 0,94 - 1 ,06 liegen, im Bereich 0,95 - 1 ,05 liegen, im Bereich 0,96 - 1 ,04 liegen, im Bereich 0,96 - 1 ,04 liegen, im Bereich 0,97 - 1 ,03 liegen, im Bereich 0,98 - 1 ,02 liegen, im Bereich 0,99 - 1 ,01 liegen, im Bereich 0,995 - 1 ,005 liegen, oder sogar gleich 1 sein. Letzterer Wert wird insbesondere dann erzielt, wenn bei der Herstellung (siehe später) Kationen bei der Fällung der Nukleinsäure im Überschuss vorliegen und das Präzipitat aus organischen Kation und Nukleinsäure mit Wasser gewaschen wird (siehe später).
Es wurde festgestellt, dass es durch diese Form der Komplexierung möglich ist, Nukleinsäuren, die ansonsten in organischen Lösungsmitteln nicht löslich sind, in hohen Mengen in solche Lösungsmittel einzubringen. Nukleinsäuren, wie z.B. DNA oder RNA, sind unter physiologischen Bedingungen anionische Polymere, die über eine hohe Anzahl von negativ geladenen Phosphat-Gruppen verfügen. Aufgrund der Ladung der Polymere sind diese in wässriger Lösung gut löslich, während die Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln äußerst gering ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass sich die in organischen Lösungsmitteln gelösten, komplexierten Nukleinsäuren in wirksamer Weise in Zellen und/oder Gewebe z.B. eines Säugetiers einbringen lassen. Insbesondere die dermale, transepitheliale und/oder transdermale Einbringung der erfindungsgemäß komplexierten Nukleinsäuren (d.h. z.B. die Einbringung über die Haut eines Säugetiers) hat sich als hoch effizient erwiesen. Bereits wenige Stunden nach dem Auftragen auf die Haut konnten entsprechend markierte Nukleinsäuren in verschiedenen Hautzellen und im Bindegewebe darunter nachgewiesen werden. Die erfindungsgemäß komplexierten Nukleinsäuren eignen sich daher in besonderer Weise als Bestandteil von kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in Zellen und/oder Gewebe.
„Mindestens ein organisches Kation" bedeutet, dass mindestens ein Typ an organischem Kation vorliegt (z.B. CTAB). Es können aber auch Kationengemische von zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. unterschiedlichen organischen Kationen vorliegen (z.B. CTAB neben DDAB). Üblicherweise ist das mindestens eine organische Kation einfach positiv geladen. Dem Fachmann ist klar, dass der Ausdruck nicht auf die Stoffmenge abstellt.
„Mindestens ein organisches Lösungsmittel" bedeutet, dass mindestens ein organisches Lösungsmittel vorliegt. Es können aber auch Lösungsmittelgemische von zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. unterschiedlichen organischen Lösungsmitteln vorliegen. Die Nukleinsäuren sind dann entsprechend in diesen Lösungsmittelgemischen gelöst.
„Mindestens eine Nukleinsäure" bedeutet, dass mindestens eine Nukleinsäure vorliegt. Es können aber auch Nukleinsäuregemische von zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. unterschiedlichen Nukleinsäuren vorliegen.
Die mindestens eine Nukleinsäure in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung löst sich in den organischen Lösungsmitteln aufgrund der Ladungskompensation in den gebildeten Komplexen. Die Lösung der Nukleinsäure benötigt daher nicht die Bildung von Micellen, Liposomen oder ähnlichen nanopartikulären Strukturen. Üblicherweise liegen daher in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation gelöst vor, wobei die Komplexe sich nicht im Inneren einer Micelle, eines Liposoms oder ähnlichen nanopartikulären Strukturen befinden. In einigen Ausführungsformen enthalten die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sogar keine Micellen, Liposomen oder ähnlichen nanopartikulären Strukturen.
Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäß geeigneter Komplexe aus Nukleinsäure und organischem Kation umfasst die Lösung mindestens einer Nukleinsäure in einer wässrigen Flüssigkeit, insbesondere Wasser (z.B. demineralisiertes Wasser) , Präzipitation der mindestens einen Nukleinsäure durch Zugabe von mindestens einem organischem Kation, das mit der Nukleinsäure einen in der wässrigen Lösung unlöslichen Komplex bildet, und anschließende Aufnahme des Präzipitats in mindestens einem organischen Lösungsmittel.
Ein solches Verfahren kann folgende Schritte umfassen:
a) Bereitstellen einer Lösung mit mindestens einer in einer wässrigen ersten Flüssigkeit gelösten Nukleinsäure,
b) Präzipitieren der mindestens einen Nukleinsäure durch Zusatz mindestens eines mit der Nukleinsäure in der ersten Flüssigkeit unlösliche Komplexe bildenden organischen Kations (Komplexbildner) zu der ersten Flüssigkeit,
c) Abtrennen der Komplexe von der ersten Flüssigkeit,
d) Lösen der Komplexe in mindestens einem organischen Lösungsmittel (zweite Flüssigkeit) e) optional Mischen der zweiten Flüssigkeit mit einer dritten Flüssigkeit.
In einer besonderen Ausführungsform ist das organische Lösungsmittel (zweite Flüssigkeit) kein Öl oder Fett. Als dritte Flüssigkeit bieten sich aber insbesondere Wachse, Fette und/oder Öle aber auch wässrige Flüssigkeiten an.
Geeignete organische Kationen im Rahmen der vorliegenden Erfindung (bzw. Quellen für die Kationen) sind dabei beispielsweise kationische Detergenzien, Lipide und Stickstoffverbindungen mit quartärem Stickstoff, wie z.B. organische Ammoniumsalze. Insbesondere kann als Quelle für organische Kationen eine oder mehrere Verbindungen der Formel NR4X verwendet werden, wobei R jeweils unabhängig voneinander ein Kohlenwasserstoff rest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, der verzweigt oder unverzweigt sein kann, ist und X ein Halogen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlor, Brom, lod ist, insbesondere Chlor oder Brom, vorzugsweise Brom. Insbesondere enthält der Kohlenwasserstoffrest jedoch vorzugsweise nur C- und H-Atome.
Gemäß weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann die Quelle für das mindestens eine organische Kation eine oder mehrere Verbindungen der Formel NR1R2R3R4X sein, wobei R1, R2, R3 und R4 organische Reste darstellen, insbesondere Kohlenwasserstoff reste wie vorstehend definiert, und wobei zumindest R1 ein C1 -Rest ist und R2 bis R4 längerkettige Reste sind oder
R1 und R2 jeweils ein C1 -Rest sind und R3 sowie R4 längerkettige Reste sind oder
R1, R2 und R3 jeweils ein C1 -Rest sind und R4 ein längerkettiger Rest ist.
Insbesondere sind die Reste R1, R2, R3 und R4 jeweils und unabhängig voneinander wie nachstehend für "R" definiert.
R ist in den Verbindungen der Formel NR4X vorzugsweise ein Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, der verzweigt oder unverzweigt sein kann. Insbesondere können einer oder mehrere, insbesondere zwei oder drei, von R relativ kurzkettige Reste wie C1 bis C3, wie Methyl, Ethyl und Propyl sein, während ein R ein längerer Rest wie C8 oder C10 bis C20, insbesondere C10 bis C16, wie Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Cetyl, Heptadecyl, Icosanyl, Stearyl oder Nonadecyl ist. Eine bevorzugte Kombination von Resten R ist drei Methylreste und ein längerkettiger Rest, insbesondere ein wie vorstehend definierter C10 bis C20-Kohlenwasserstoffrest wie insbesondere ein Cetylrest wie in Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB). Vorzugsweise umfasst R keine aromatischen und/oder nicht-aromatischen Ringsysteme.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem mindestens einen organischen Kation (bzw. der Quelle für das Kation) um ein oder mehrere quartäre Amine, wobei CTAB besonders bevorzugt ist. Andere Verbindungen, die sich erfindungsgemäß für die Komplexierung der Nukleinsäuren eignen, umfassen Benzethoniumchlorid, Benzalkonium, Benzalkoniumchlorid, Didecyldimethylammoniumbromid (DCAB), Dodecyltrimethylammoniumbromid (DCTAB), DOTAP, Lipofectin, Lipofectamin N-[1 -(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium- chloride (DOTMA), Dimethyldioctadecyl-ammoniumbromid (DDAB), dioleyldimethylammoniumchloride (DODAC), 2,3-Dioleoyloxy-N-[2-(spermidin carboxyamido)ethyl]-N-Ndimethyl-1 -propaniniumtrifluoracetat (DOSPA), Diheptadecylamidoglycylspermidin (DHGS) und Ähnliche. Vorzugsweise ist das organische Kation nicht Polylysin und/oder TC-Chol.
Vorzugsweise wird der Komplexbildner der ersten Flüssigkeit in Schritt b) in gelöster Form zugesetzt. Dadurch wird eine schnellere Präzipitation ermöglicht als beim Zusatz eines ungelösten Komplexbildners. Die Nukleinsäure wird dabei mit dem mindestens einen organischen Kation vorzugsweise so komplexiert, dass ein Verhältnis von im Wesentlichen 1 :1 (d.h. im Wesentlichen vollständig kompensiert) zwischen den negativen Ladungen (d.h. den anionischen Gruppen) der mindestens einen Nukleinsäure und den Ladungen des mindestens einen organischen Kations vorliegt. Insbesondere organischen Kationen wie die oben erwähnten, z.B. CTAB, sind in der Lage, die positiv geladene Gruppe in einen ausreichend kleinen Abstand an das negativ geladene Sauerstoffatom der Nukleinsäure anzunähern, sodass eine ausreichende (lokale) Abschirmung der Gesamtladung beider Ionen bewirkt wird.
Vorteilhaft an der Einstellung eines solchen Verhältnisses ist, dass der Komplex aus organischen Kationen und Nukleinsäure insgesamt annähernd ladungsneutral ist, d.h. im Wesentlichen vollständig komplexiert ist. Die komplexierte Nukleinsäure ist daher in einem wässrigen Medium unlöslich und kann bei der Herstellung in wässrigen Medien als unlösliches Präzipitat abgetrennt werden. Diese Eigenschaft erleichtert somit die Herstellung der gewünschten, stöchiometrisch komplexierten Nukleinsäure. Das Abtrennen der Komplexe gemäß Schritt c) erfolgt daher vorzugsweise mittels Zentrifugation oder Filtration. Diese Verfahren stellen eine besonders einfache und effiziente Art der Abtrennung der präzipitierten Komplexe dar. Das Präzipitat kann z.B. durch Zentrifugation zum Beispiel für 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, bei 10000 bis 20000 g, vorzugsweise 15000 g, abgetrennt werden. Gegebenenfalls kann dieser Vorgang nach erneuter Aufnahme des gefällten Niederschlags in Wasser mehrmals durchgeführt werden. Vorteilhaft an der Einstellung eines solchen Verhältnisses ist ferner, dass bei Kontakt der so komplexierten Nukleinsäure mit einer lebenden Zelle oder einem Organ eines Lebewesens keine bzw. nur wenige freie organische Kationen mit den Zellen oder dem Organismus wechselwirken können. Als Folge davon können die organischen Kationen keine cytotoxischen Effekte oder andere Störungen des Metabolismus bei den Zellen auslösen, was ansonsten häufig vorkommen kann.
Im Zuge der Komplexierung der mindestes einen Nukleinsäuren können selbstverständlich wie oben erwähnt auch verschiedene organische Kationen Verwendung finden, indem man Mischungen unterschiedlicher organischer Kationen zu der Nukleinsäure-haltigen wässrigen Flüssigkeit gibt, um die Nukleinsäure-Komplexe zu präzipitieren.
Die durch Präzipitation erhaltenen Komplexe können anschließend in einer großen Vielzahl von organischen Lösungsmitteln (einschließlich solchen, die allgemein als Fällungsmittel für Nukleinsäure aus wässriger Lösung gelten) gelöst werden. Nach Aufnahme in ein Lösungsmittel enthalten diese im Wesentlichen vorzugsweise keine organischen Kationen, die über die zur Kompensation der negativen Ladungen der Nukleinsäure erforderliche Menge hinaus gehen. Dies bedeutet, dass die Anzahl der gesamten positiven Ladungen der organischen Kationen in dem Lösungsmittel im Wesentlichen mit der Anzahl der negativen Ladungen der Nukleinsäure identisch ist.
Organische Lösungsmittel, die zur Aufnahme der komplexierten Nukleinsäure geeignet sind, umfassen insbesondere ein- oder mehrwertige Alkohole oder teilweise veretherte Alkohole. Bevorzugt enthält das Lösungsmittel daher mindestens eine Ether-Gruppe und/oder mindestens eine Hydroxyl-Gruppe. Als Lösungsmittel besonders gut geeignete (amphiphile) Verbindungen können durch die Formel HO-R1 -O-R2 beschrieben werden. Dabei ist R1 und R2 jeweils ein Kohlenwasserstoff rest mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen. Insbesondere sind C1 bis C5-Alkohole geeignet, wie z.B. Methanol, Ethanol, 1 -Propanol oder 2-Propanol, Butanol, wie 1 -Butanol, oder Pentadiol, wie 1 -Pentadiol. Ferner sind mehrwertige Alkohole, wie Ethylenglykol oder teilweise veretherte Derivate davon, wie z.B. Ethylenglykol, das mit Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol verethert ist, wie beispielsweise Ethylenglykolether, wie insbesondere Ethylenglykolmonobutylether, -ethylether oder methylether, verwendbar. Alternativ können gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan oder Heptan oder auf Benzol basierende aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Styrol, verwendet werden, also insbesondere mit C1 bis C3-Resten substituierte Benzole. Alternativ können halogenhaltige Lösungsmittel wie Chloroform, Dichlormethan oder Tetrachlorkohlenstoff oder andere heteroatomhaltige Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, verwendet werden. DMSO kann ebenfalls verwendet werden.
Insbesondere bei Verwendung von niederen Alkoholen wie Ethanol, Propanol oder Butanol als Lösungsmittel lassen sich Konzentrationen an komplexierter Nukleinsäure erreichen, die ansonsten nur in neutralen oder wässrigen Medien erreicht werden. So konnten bei Lösung von Heringssperma-DNA, die in einem ladungs-stöchiometrischen Verhältnis von etwa 1 :1 mit CTAB komplexiert war, in den Lösungsmitteln Methanol, Ethanol, 1 -Butanol, 2-Propanol, 1 - Pentanol und Ethylenglykolmonobutylether jeweils eine Löslichkeit von mehr als 10 mg DNA pro ml Lösungsmittel erreicht werden.
In Lösungsmitteln, die eine geringere Löslichkeit für die erfindungsgemäß komplexierten Nukleinsäuren zeigten, können ebenfalls Konzentration an gelöster Nukleinsäure von mehr als 1 mg/ml erreicht werden, indem die Nukleinsäure zunächst in einem ersten Lösungsmittel mit hoher Löslichkeit (wie z.B. Methanol, Ethanol, 1 -Butanol, 2-Propanol, 1 -Pentanol, Ethylenglykolmonobutylether oder Mischungen derselben) gelöst wird, und das die komplexierten Nukleinsäuren enthaltende erste Lösungsmittel anschließend mit einem zweiten Lösungsmittel vermischt wird, das eine geringere Löslichkeit für die erfindungsgemäß komplexierten Nukleinsäuren aufweist. In den Ölen Walnussöl, Weizenkeimöl, Leinöl, Distelöl, Rapsöl und Mandelöl konnte so eine Konzentration von l OOpg/ml erreicht werden. Weitere einsetzbare Öle sind weiter unten angegeben.
Die in organischen Lösungsmitteln gelösten Nukleinsäure-Komplexe zeichnen sich durch eine außerordentlich hohe Stabilität aus. Dies ist im Wesentlichen darauf zurückzuführen, dass Nukleasen in nicht-wässriger Umgebung inaktiv sind. Dies ist vor allem bei Verwendung von Ribonukleinsäure (RNA) von Bedeutung, da in allen wässrigen Systemen mit einer hohen RNAse-Aktivität gerechnet werden muss. Außerhalb einer RNAse-freien Umgebung, die praktisch nur unter speziellen Laborbedingungen realisiert werden kann, ist grundsätzlich mit einem schnellen Abbau der RNA zu rechnen, was insbesondere den Einsatz von therapeutisch wirksamer RNA als pharmazeutisches Mittel deutlich erschwert. Dieses Problem wird durch die Komplexierung der Nukleinsäure zu den vorliegend beschriebenen Komplexen gelöst.
Ferner ist die Stabilität der erfindungsgemäß komplexierten Nukleinsäuren auch dadurch erhöht, dass in dem eingesetzten organischen Lösungsmittel keine saure oder alkalische Umgebung mehr vorliegt. Dies vermeidet eine etwaige saure oder alkalische Hydrolyse der Nukleinsäuren.
Nach Lösung der Nukleinsäuren in dem mindestens einen organischen Lösungsmittel kann das organische Lösungsmittel beispielsweise mit beliebigen weiteren mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeiten vermischt werden, z.B. mit einem weiteren der oben genannten organischen Lösungsmittel.
Vorzugsweise macht in den erfindungsgemäß zu verwendenden Zusammensetzungen das mindestens eine organische Lösungsmittel weniger als 70% (v/v), bevorzugt weniger als 50% (v/v), besonders bevorzugt weniger als 20% (v/v) aus. Das mindestens eine organische Lösungsmittel kann auch in einer Konzentration von mehr als 1 % (v/v), bevorzugt mehr als 5%(v/v), besonders bevorzugt mehr als 10% (v/v) vorliegen. So kann das organische Lösungsmittel beispielsweise in einem Bereich von 1 -70% (v/v), 5-50% oder auch 10-20% (v/v) vorliegen.
Der Wassergehalt insbesondere der die Nukleinsäurekomplexe umfassenden Phase, oder aber auch der gesamten erfindungsgemäß zu verwendenden Zusammensetzungen ist vorzugsweise geringer als etwa 50% (v/v), besonders bevorzugt geringer als etwa 30% (v/v), noch mehr bevorzugt geringer als etwa 10% (v/v). Ein höherer Wasseranteil führt zu Bildung größerer Aggregate die keine optimalen Penetrationseigenschaften besitzen.
Vorzugsweise ist der durchschnittliche Durchmesser der Komplexe aus Nukleinsäure und organischem Kation in den erfindungsgemäß zu verwendenden Zusammensetzungen kleiner als 200nm, bevorzugt kleiner als 100nm, besonders bevorzugt kleiner als 50nm, ganz besonders bevorzugt kleiner als l Onm.
Pharmazeutische/kosmetische Zusammensetzungen
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung lassen sich exzellent als kosmetische und oder therapeutische Zusammensetzungen formulieren.
Für eine pharmazeutische Zusammensetzung ist die Nukleinsäure eine therapeutisch wirksame Nukleinsäure, d.h. eine Nukleinsäure, die nach Verabreichung an ein Individuum eine biologische Funktion ausübt und dadurch einen therapeutischen Nutzen herbeiführt. Im Stand der Technik sind eine Vielzahl von Nukleinsäuren als therapeutisch wirksam beschrieben worden. Häufig wird die Nukleinsäure in solchen Fällen Sequenzen eines Genoms bzw. Gens aufweisen. Ebenso kann die Nukleinsäure eine diagnostisch nutzbare Nukleinsäure sein, wie z.B. ein Molecular Beacon sein.
Für eine kosmetische Zusammensetzung ist die Nukleinsäure eine kosmetisch wirksame Nukleinsäure, d.h. eine Nukleinsäure, die nach Verabreichung an ein Individuum zwar in der Regel zu keinem therapeutischen aber zu einem kosmetischen Nutzen führt. Üblicherweise wird die Nukleinsäure hier möglichst nicht Sequenzen eines (humanen) Genoms bzw. (humanen) Gens aufweisen. Nukleinsäuren können beispielsweise als Quelle für Allantoin genutzt werden. Allantoin ist bei verschiedenen Tierarten, vor allem bei Säugetieren, neben der Harnsäure das Endprodukt des Abbaus von Nukleinsäuren, speziell von Purinbasen. Allantoin wird in der Kosmetik in Hautcremes, Sonnenschutzmitteln, Rasierwässern, in Zahncreme und in Mitteln gegen übermäßige Schweißabsonderung (Hyperhidrose) und Hautirritationen eingesetzt. Es bewirkt die Beschleunigung des Zellaufbaus, der Zellbildung oder der Zellregeneration und beruhigt die Haut.
Gemäß einer einfachen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Nukleinsäure- Komplexe, die gelöst in einem der oben beschriebenen organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische vorliegen, direkt mit den zur kosmetischen und/oder therapeutischen Behandlung vorgesehenen Zellen oder Geweben in Kontakt gebracht, z.B. durch Auftropfen oder Aufstreichen des Nukleinsäure-haltigen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemischs. Vorzugsweise wird dazu ein organisches Lösungsmittel verwendet, das im Hinblick auf die zu behandelnden Zellen und/oder Gewebe kompatibel ist. Sofern die kosmetischen und/oder therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für die Behandlung der Haut, z.B. der menschlichen Haut, vorgesehen sind, wird das entsprechende organische Lösungsmittel so ausgewählt werden, dass keine toxischen oder für die Integrität der Haut abträglichen Eigenschaften mit dem Lösungsmittel assoziiert sind. Im Stand der Technik sind zahlreiche organische Lösungsmittel bekannt, die als pharmazeutische Träger, insbesondere für die dermale Verabreichung, geeignet sind.
Es ist natürlich auch möglich, die Flüssigkeit z.B. mit Wasser zu einer Emulsion verarbeiten und in dieser Form auf die Haut aufzubringen. Andere übliche Darreichungsformen für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen Lotionen, Cremes, Salben, Gele und Pasten. In einer etlichen Ausführungsformen der Erfindung sind die erfindungsgemäß zu verwendenden Zusammensetzungen jedoch keine Emulsion und/oder Lotionen, Cremes, Salben, Gele und Pasten.
Sofern dies für die gewählte Verabreichung vorteilhaft ist, können die in einem organischen Lösungsmittel gelösten Nukleinsäure-Komplexe mit einem für die jeweilige Verabreichung geeigneten pharmazeutischen Träger vermischt werden. Bei dem pharmazeutischen Träger kann es sich beispielsweise um eine beliebige mit Wasser nicht mischbare lipophile Verbindung handeln, die mit dem organischen Lösungsmittel, welches die Nukleinsäure- Komplexe umfasst, gemischt werden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem pharmazeutischen Träger um eine flüssige Verbindung, wie z.B. ein (ggf. zusätzliches) Öl.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die erfindungsgemäß zu verwendenden Zusammensetzungen mindestens ein Öl und/oder mindestens ein Wachs und/oder mindestens ein Fett.
Geeignete Öle, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden können, umfassen synthetische, tierische und pflanzliche Öle. Ebenso umfassen geeignete Wachse bzw. Fette synthetische, tierische und/oder pflanzliche Wachse bzw. synthetische, tierische und/oder pflanzliche Fette.
Geeignete pflanzliche Öle sind z.B. Nussöle und Samenöle. Geeignete pflanzliche Öle umfassen insbesondere Erdnussöl, Walnussöl, Mandelöl, Haselnussöl, Kokosnussöl, Sojabohnenöl, Olivenöl, Mohnöl, Hanföl, Kürbiskernöl, Sonnenblumensamenöl, Sesamsamenöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Leinöl, Rapsöl, Ricinusöl und Ähnliche. Auch aus Getreide gewonnene Keimöle können vorliegend als Träger verwendet werden. Bevorzugte Keimöle umfassen z.B. solche, die aus Mais, Weizen, Hafer, Roggen, Reis und Triticale gewonnen werden. Als geeignete pflanzliche Fette können beispielsweise Kokosfett oder Kakaobutter verwendet werden. Mögliche pflanzliche Wachse umfassen bspw. Zuckerrohrwachs, Carnaubawachs, Jojobaöl, Candelillawachs und Japanwachs.
Neben pflanzlichen Ölen, Wachsen und Fetten können auch tierische Fette, Wachse und Öle, wie z.B. Fischöle oder aus Nerzen oder Hirschen gewonnene Öle und Fette, eingesetzt werden. Lebertran und Walöl (wie beispielsweise aus Spermaceti) sind Beispiele für Fischöle, die vorliegend verwendet werden können. Mögliche Quellen für tierische Wachse sind beispielsweise Walrat, Wollwachs und Bienenwachs. Geeignete Verfahren zur Gewinnung reiner Öle tierischen Ursprungs sind im Stand der Technik bekannt.
Ggf. können auch pharmazeutisch bzw. kosmetisch verträgliche synthetische Öle, Fette und Wachse eingesetzt werden. Geeignete synthetische Öle und Fette basieren zum Beispiel auf Silikon- oder Paraffinverbindungen. Ein Beispiel ist Vaseline. Sojawachs kann durch Hydrierung aus Soja gewonnen werden und ist ein Beispiel für ein synthetisches Wachs.
Bevorzugt umfassen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wenn darin ein Öl, Wachs oder Fett vorliegt, mindestens ein weiteres Lösungsmittel, das kein Öl, Wachs oder Fett ist. Oder anders formuliert: besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäß zu verwendenden Zusammensetzungen neben einem (konventionellen) organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Ethylenglykolmonobuty lether, Ethylenglykolmonoethylether, Ethylenglykolmonomethylether, und/oder DMSO noch ein Öl, Fett oder Wachs. Eine besonders bevorzugte Kombination ist eine Kombination von DMSO mit mindestens einem Öl, Fett und/oder Wachs.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können einen Öl-, Wachs und/oder Fettanteil aufweisen, der größer oder gleich 25% (v/v), beispielsweise größer oder gleich etwa 30% (v/v), größer oder gleich etwa 40% (v/v), größer oder gleich etwa 50% (v/v), größer oder gleich etwa 60% (v/v), größer oder gleich etwa 70% (v/v), größer oder gleich etwa 80% (v/v), oder größer oder gleich etwa 85% (v/v) ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen die erfindungsgemäß zu verwendenden (pharmazeutischen oder kosmetischen) Zusammensetzungen einen Öl-, Wachs und/oder Fettanteil von mehr als etwa 90%, vorzugsweise etwa 91 % (v/v) oder mehr, etwa 92% (v/v) oder mehr, etwa 93% (v/v) oder mehr, etwa 94% (v/v) oder mehr, etwa 95% (v/v) oder mehr, etwa 96% (v/v) oder mehr, etwa 97% (v/v) oder mehr, etwa 98% (v/v) oder mehr, etwa 99% (v/v) oder mehr auf.
Neben einem pharmazeutischen Träger können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weitere Hilfsstoffe enthalten. Übliche Hilfsstoffe umfassen Verdünnungsmittel, Farbstoffe, Konservierungsmittel, Emulgatoren, Verdickungsmittel, Duftstoffe, Vitamine und andere aus der Galenik bekannte Mittel. Es ist beispielsweise vorteilhaft, den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zellpermeable Substanzen beizufügen, von denen bekannt ist, dass sie die Permeabilität der Zellmembran erhöhen und damit das Eindringen der Nukleinsäure- Komplexe in die Zellen oder Gewebe erleichtern. Beispiele für Substanzen, welche den Eintritt von DNA oder RNA in Zellen erleichtern, sind insbesondere Fettsäuren, Fettsäureester, Glyceroldiester, Glyceroltriester, Glycerolmonoester und Harnstoff. Ein weiteres Beispiel für eine erfindungsgemäß geeignete Substanz, welche die Permeabilität der Zellmembran erhöht, ist Dimethylsulfoxid (DMSO). Gleichzeitig kann DMSO wie erwähnt im Rahmen der Erfindung auch als organisches Lösungsmittel verwendet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich daher bei dem organischen Lösungsmittel, das zur Lösung der komplexierten Nukleinsäure verwendet wird, um DMSO. Sofern ein anderes organisches Lösungsmittel zur Aufnahme der komplexierten Nukleinsäure verwendet wurde, kann dieses mit DMSO vermischt werden, um die Menge und/oder die Geschwindigkeit der Aufnahme der komplexierten Nukleinsäure durch die Zellen und/oder Gewebe zu erhöhen. Der Anteil an DMSO an der erfindungsgemäßen Zusammensetzung beträgt vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 50 Vol. %, wobei ein Anteil von etwa 5 bis etwa 30 Vol.%, z.B. 10 Vol.% besonders bevorzugt wird.
Weitere geeignete Hilfsstoffe umfassen auf dem Gebiet der Pharmazie und/oder Kosmetik bekannte Konservierungsstoffe, wie z.B. lineare aliphatische 1 ,3-Diole, Phenoxyethanol und Chlorphenesin. Durch Zusatz dieser Verbindungen kann die Lagerfähigkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erhöht werden, ohne dass es zu einem mikrobiellen Wachstum kommt, welches die Zusammensetzungen unbrauchbar machen würde. Weitere in kosmetischen und pharmazeutischen Präparaten übliche Hilfsstoffe sind dem Fachmann ohne weiteres bekannt. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn die erfindungsgemäß zu verwendenden Zusammensetzungen in Form einer Flüssigkeit vorliegen, die einen geringeren Dampfdruck als Wasser aufweist. Dadurch kann verhindert werden, dass die flüssige Zusammensetzung nach Aufbringung auf die Zellen und/oder Gewebe, wie z.B. der Haut, verdunstet. Eine vollständige Verdunstung der Lösungsmittel der Zusammensetzung könnte theoretisch dazu führen, dass die in der Flüssigkeit enthaltene komplexierte Nukleinsäure präzipitiert, noch bevor ein wirksames Eindringen in die Zellen und/oder Gewebe stattfinden kann. Flüssige Zusammensetzungen mit komplexierten Nukleinsäuren, die einen höheren Dampfdruck als Wasser besitzen, können durch die Art und Menge des oder der jeweiligen Lösungsmittel der Zusammensetzungen hergestellt werden. So lassen sich die Eigenschaften der pharmazeutischen und/oder kosmetischen Zusammensetzungen der Erfindung durch Verwendung von Lösungsmitteln mit einem höheren Dampfdruck als Wasser, wie z.B. DMSO oder höheren Alkoholen wie Butanol, Pentanol, usw. entsprechend beeinflussen.
Eine weitere Möglichkeit zur Gewinnung von Nukleinsäure-haltigen Flüssigkeiten mit einem höheren Dampfdruck als Wasser besteht darin, eine Lösung von komplexierten Nukleinsäuren in einem ersten Lösungsmittel, das einen geringeren Dampfdruck aufweist als Wasser (wie z.B. Ethanol), mit einem zweiten Lösungsmittel zu mischen, welches einen höheren Dampfdruck als Wasser aufweist.
Als besonders geeignet hat es sich in diesem Zusammenhang erwiesen, ein Öl oder Fett in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einzubringen. Dabei werden zunächst wie oben beschrieben die komplexierten Nukleinsäuren in einem ersten Lösungsmittel, wie z.B. in Butanol, gelöst. Anschließend wird das Nukleinsäure-haltige Lösungsmittel mit einem oder mehreren Ölen gemischt, so dass eine Flüssigkeit entsteht, die aus komplexierten Nukleinsäuren, Lösungsmittel und Öl besteht.
Die Nukleinsäure
Die erfindungsgemäß in die Zellen oder Gewebe einzubringende Nukleinsäure ist eine geladene Nukleinsäure. Der Begriff „Nukleinsäure" ist erfindungsgemäß eine Nukleinsäure zu verstehen, deren Nukleoside durch Phosphodiesterbindungen miteinander verknüpft sind, wobei die an den Phosphodiesterbindungen beteiligten Phosphatreste negativ geladen sind, wie es bei natürlich vorkommender DNA oder RNA der Fall ist. Mit anderen Worten handelt es sich bei den geladenen Nukleinsäuren um polyanionische Säuren (Polyelektrolyte), in denen die anionischen Gruppen durch die negativ geladenen Sauerstoffreste der Phosphatgruppen, die die Phosphordiesterbindungen bilden, gebildet werden. Grundsätzlich kann es sich bei den die negativen Ladungen tragenden Resten der Nukleinsäuren auch um die negativen Reste von Phosphorthioaten oder Phosphordithioaten oder auch um andere negativ geladene Gruppen von Nukleinsäuren handeln.
Üblicherweise lösen sich Nukleinsäuren auf Grund ihrer Ladung gut in Wasser, nicht jedoch in mit Wasser nicht mischbaren organischen Flüssigkeiten, wie Kohlenwasserstoffen oder anderen organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, etc. Eine Nukleinsäure wird im Sinne der Erfindung als gelöst erachtet, wenn sie sich durch eine 5-minütige Zentrifugation bei 15000 x g nicht abzentrifugieren lässt.
Bei den einzubringenden Nukleinsäuren kann es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäuren handeln, wie z.B. um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA. Eine doppelsträngige Nukleinsäure kann in Form zweier separater Einzelstränge oder als Haarnadelschleifenstruktur vorliegen. Die Größe der einzubringenden Nukleinsäure ist erfindungsgemäß unkritisch. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Oligonukleotide mit einer Kettenlänge von 10 bis 100 Nukleotiden, als auch lineare und zirkuläre Plasmide mit einer Größe von mehreren kb (z.B. mit einer Größe von 1 -10 kb) wirksam in humane und murine Hautzellen eingebracht werden konnten. Damit eröffnen die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung neue Möglichkeiten sowohl auf dem Gebiet der Gentherapie, bei der Nukleinsäuren, welche für bestimmte Polypeptide kodieren, in Zellen eines lebenden Säugetiers eingebracht werden, als auch auf dem Gebiet der RNA-Interferenz, bei der zielgerichtet die Expression bestimmter Gene beeinflusst wird.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der einzubringenden Nukleinsäure um ein Oligonukleotid, d.h. um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA (oderDNA/RNA Hybride) mit einer Kettenlänge von etwa 5 bis etwa 150 Nukleotiden, bevorzugt von etwa 7 bis etwa 100 Nukleotiden, bevorzugt etwa 10 bis etwa 80 Nukleotiden, besonders bevorzugt etwa 20 bis etwa 60 Nukleotiden. Das Oligonukleotid ist vorzugsweise ein synthetisch hergestelltes Oligonukleotid mit bekannter Sequenz.
Bei den Nukleinsäuren kann es sich beispielsweise um DNA, cDNA, mRNA, sRNA, Ribozyme, Antisense-DNA, RNA, Antisense RNA, siRNA, Decoys, tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, oder miRNA handeln. In einer besonderen Ausführungsform ist die Nukleinsäure keine siRNA. Für eine therapeutische Anwendung ist es besonders vorteilhaft, wenn die Nukleinsäuren zumindest einen Teil einer Sequenz eines (humanen) Genoms oder auch Gens enthalten.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der einzubringenden Nukleinsäure um einen Vektor oder um ein Plasmid mit einer Größe von mehr als 1 kb (1000 Nukleotide). Die Größe des Vektors oder des Plasmids wird in der Regel mehr als 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 1 1 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 1 5 kb oder sogar mehr als 20 kb betragen. Es kann sich bei der Nukleinsäure, die in die Zellen eingebracht werden soll, z.B. um einen Gentherapie-Vektor handeln, der für die Expression in einem Säugetier verabreicht wird. Beispiele für Gentherapie-Vektoren, die sich für die erfindungsgemäße Einschleusung in Gewebe eines lebenden Säugetiers eignen, umfassen virale und nicht-virale Vektoren. Virale Vektoren leiten sich von verschiedenen Viren ab, z.B. von Retroviren, Herpesviren, Adenoviren oder von Adeno-assoziierten Viren (AAV), siehe Lundstrom, Trends Biotechnol. (2003), 21 (3):1 1 7-22. Vorzugsweise handelt es sich bei den viralen Vektoren um solche, die nicht mehr in der Lage sind, sich in den damit transfizierten Zellen zu replizieren. Neben den viralen Vektoren können auch nicht-virale Vektoren, z.B. eukaryontische Expressionsvektoren, wie vorliegend beschrieben in die Zellen oder Gewebe eingebracht werden. Die Vektoren oder Plasmide umfassen vorzugsweise einen eukaryotischen Promotor umfasst, der in dem Säugetier aktiv ist.
Anwendungen
Die Zusammensetzungen eignen sich erfindungsgemäß in vorteilhafter Weise zum Beispiel zur Verwendung in der Medizin, z.B. zur Therapie oder Diagnostik oder in der Kosmetik, insbesondere wenn dabei Nukleinsäuren in Zellen oder Gewebe eingebracht werden müssen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Zellen oder Geweben, die durch die Einbringung der Nukleinsäure-Komplexe behandelt werden sollen, um Zellen und/oder Gewebe eines Säugetiers, z.B. um Zellen und/oder Gewebe von Ratte, Hamster, Meerschweinchen, Hund, Katze, Pferd, Rind, Schwein, Schaf, Ziege und anderen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung für die Einbringung von Nukleinsäure in menschliche Zellen und/oder Gewebe formuliert.
Die vorliegende Erfindung offenbart Formulierungen von Nukleinsäuren, mit denen nach Verabreichung, z.B. nach einem Aufbringen auf die Haut von Mensch und Tier ein Transport der Nukleinsäuren in verschiedenen Zelltypen möglich ist. Insbesondere können mit den beschriebenen Zusammensetzungen Nukleinsäuren in Epithelzellen, Endothelzellen, Haarzellen (wie z.B. Haarwurzelzellen und/oder Haarbalgzellen), Muskelzellen, Fett- und Bindegewebszellen sowie Kapillarzellen von lebenden Säugern eingeführt werden. Soweit es sich um menschliche Zellen handelt, sind diese vorzugsweise keine embryonalen Stammzellen.
Gewebe, in die Nukleinsäuren erfindungsgemäß eingebracht werden können, umfassen z.B. Epithelgewebe, Bindegewebe und Muskelgewebe. Für die Einbringung ist die Einbringung in die Haut, insbesondere in die Epidermis, Dermis und/oder Subkutis bevorzugt. Auch die Einbringung über andere Epitheltypen (z.B. Darmepithel) ist bevorzugt.
Wie aus den nachstehenden Beispielen deutlich wird, eignen sich die Zusammensetzungen nicht nur zur Einbringung von Nukleinsäure in Zellen oder Gewebe, sondern insbesondere auch zur transepithelialen Verabreichung. Das bedeutet, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, Epithelschichten zu durchdringen und angrenzende, tieferliegende Gewebeschichten zu erreichen. Das ermöglicht eine Behandlung auf nichtinvasivem Weg, z.B. ohne die Verwendung von Spritzen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung wird dazu mit den zu behandelnden Zellen und/oder Geweben in Kontakt gebracht. Dabei erfolgt der Kontakt mit den komplexierten Nukleinsäuren vorzugsweise ohne Verletzung der jeweiligen Gewebe-Oberfläche, wie z.B. der Haut des Säugetiers. In einer einfachen Ausführungsform der Erfindung wird die Zusammensetzung auf die Zellen und/oder Gewebe aufgetragen, z.B. durch Auftropfen oder Aufstreichen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Gewebe, das für die Aufnahme der erfindungsgemäß komplexierten Nukleinsäure vorgesehen ist, um Epithelgewebe eines Säugetiers, beispielsweise die Haut eines Säugetiers.
Abhängig von den Zellen oder Geweben, in die die komplexierten Nukleinsäuren eingebracht werden sollen, sowie von der Größe und Menge der Nukleinsäuren wird die Verweildauer der (pharmazeutischen oder kosmetischen) Zusammensetzung auf den Zellen oder Geweben in der Regel im Bereich von Minuten oder Stunden liegen. Bei einigen Anwendungen kann es allerdings auch vorteilhaft sein, eine Verweildauer von mehreren Tagen vorzusehen, insbesondere wenn das Einbringen einer großen Menge Nukleinsäure in die Zellen oder Gewebe erwünscht ist. Anwendungen, bei denen eine längere Verweildauer eingestellt werden kann, betreffen insbesondere die Einbringung von Nukleinsäuren in tiefere Hautschichten, wie z.B. in die Dermis oder Subcutis.
Bei der Einbringung der komplexierten Nukleinsäure in die Zellen und/oder Gewebe, insbesondere in die Haut, kann es erforderlich oder zweckmäßig sein, die Auftragung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung einmal oder sogar mehrfach zu wiederholen. Vorzugsweise wird die Auftragung 2, 3, 4, 5, 10, 15 oder 20 Mal, z.B. im Verlaufe eines Monats wiederholt, bis die intrazelluläre Konzentration der Nukleinsäure in den Zellen bzw. in den Zellkernen ausreichend hoch ist.
Wie in den Beispielen gezeigt ist, konnte komplexierte Nukleinsäure durch Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung in Gewebezellen der Epidermis, Dermis und Subcutis eingeschleust werden. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass auch die Zellkerne eine deutliche Menge der Nukleinsäuren aufgenommen hatten. Der Zeitraum der Behandlung vor der histologischen Untersuchung des Gewebes betrug 1 bis 4 Tage. Während dieser Zeit waren die Tiere vital, und es konnten keine Verhaltensauffälligkeiten oder morphologische Veränderungen beobachtet werden. Die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zeigt somit keine Nebenwirkungen.
Die Menge an komplexierter Nukleinsäure sowie die Dauer der Behandlung werden von den Zellen oder Geweben bestimmt, in die die komplexierten Nukleinssäuren eingebracht werden sollen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte anhand von Experimenten mit Mäusen gezeigt werden, dass die Nukleinsäuren bereits nach drei Tagen in den Zellen der Subcutis vorhanden waren.
Im Zuge der guten Aufnahme der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in verschiedene Zell- und Gewebetypen, können die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung im Prinzip auf jede dem Fachmann bekannte Art und weise verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können beispielsweise parenteral, enteral, und/oder topisch verabreicht werden. Verabreichungswege umfassen daher zum Beispiel die intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intradermale oder transdermale Verabreichung, orale oder rektale Verabreichung, epikutane, dermale, inhalative, nasale, oder intranasale Verabreichung. Besonders bevorzugt sind die topische, dermale, und/oder transdermale Verabreichung. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Behandlungsverfahren an einem Patienten bzw. ein Verfahren zur Einbringung mindestens einer Nukleinsäure in Zellen und/oder Gewebe einen Patienten, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst:
a) In-Kontakt-Bringen einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit Zellen oder(Gewebe(n) eines Patienten.
Der Patient kann ein Mensch oder ein Tier, insbesondere ein Säugetier sein.
Für bestimmte Anwendungen ist es insbesondere vorteilhaft, die komplexierten Nukleinsäuren kontinuierlich an die jeweiligen Zellen und/oder Gewebe über mehrere Tage hinweg zu verabreichen. Dies kann z.B. durch Verabreichung der komplexierten Nukleinsäure mittels eines Pflasters erfolgen, das auf die Haut aufgeklebt wird. Zu diesem Zweck kann die in dem organischen Lösungsmittel komplexierte Nukleinsäure auf ein saugfähiges Material, wie z.B. ein Vlies oder eine Zellulosematrix, aufgetropft werden. Das saugfähige Material wird anschließend durch Abdeckung mit einem geeigneten Fixierungsmittel z.B. mit einer selbstklebenden Folie, auf der Oberfläche des zu behandelnden Individuums (z.B. ein Säugetier) fixiert.
Vorzugsweise werden Fixierungsmittel verwendet, die einen Austritt der erfindungsgemäß zu verwendenden Zusammensetzungen an der der Gewebeoberfläche abgewandten Seite des Pflasters verhindern. Bei Zusammensetzungen mit hohem Öl-Anteil können z.B. Folien aus thermoplastischen Kunststoffen, wie z.B. Polyethylenterephthalat, Polyethylen, Polyvinylchlorid oder Polypropylen Verwendung finden. Es ist jedoch ausreichend, nur den Bereich des Pflasters, der die äußere Abgrenzung des saugfähigen Materials darstellt, durch eine impermeable Sperrschicht zu schützen, während andere Anteile der Abdeckung für Luft und Flüssigkeit durchlässig ausgestaltet sind.
Die Dosierung der komplexierten Nukleinsäure kann dabei über das Volumen des organischen Lösungsmittels sowie über die Konzentrationen der Nukleinsäure in dem Lösungsmittel erfolgen. Durch Ausfall geeigneter Abmessungen des Pflasters kann die zu behandelnde Oberfläche, z.B. die Hautoberfläche, zugestimmt werden. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mittels eines Pflasters hat darüber hinaus den Vorteil, dass ein Abrieb oder Verschmieren der aufgetragenen Zusammensetzung verhindert wird. Somit kann sicher gestellt werden, dass die komplexierte Nukleinsäure tatsächlich über den vorbestimmten Zeitraum auf das zu behandelnde Haut-Areal einwirken kann.
Durch die Verwendung von Pflastern lässt sich die zu behandelnde Gewebeoberfläche exakt einstellen. Das Pflaster kann durch Auswahl einer geeigneten Größe des saugfähigen Materials, welches die komplexierte Nukleinsäure freisetzt, auf die zu behandelnde Oberfläche abgestellt werden. Somit wird bei Verwendung eines Pflasters verhindert, dass andere Körperoberflächen des Säugetiers, die nicht für eine Behandlung mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen vorgesehen sind, mit den komplexierten Nukleinsäuren in Kontakt kommen.
Vorteilhaft bei der Verwendung von Pflastern zur Aufbringung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist die Möglichkeit, große Stückzahlen der Pflaster vorzukonfektionieren und unter geeigneten Bedingungen zu lagern (z.B. bei 4°C oder bei Raumtemperatur). Derartig vorgefertigte Pflaster können bei Bedarf schnell und einfach zum Einsatz gebracht werden. Verfahren zur Herstellung geeigneter Pflaster sind beispielsweise in den US-Patenten 4,983,395 und 4,849,224 beschrieben.
Bis zur Verwendung können die Pflaster in einem dicht schließenden Material versiegelt werden. Dadurch können Kontaminationen der Nukleinsäure-haltigen Zusammensetzungen oder andere unerwünschte Veränderungen, z.B. durch Verdunstung, verhindert werden. In dieser Form sind die Pflaster problemlos über mehrere Monate, insbesondere für bis zu etwa 6 Monaten, 12 Monaten, 18 Monaten, 24 Monaten, 30 Monaten oder 36 Monaten haltbar, ohne dass es zu signifikanten Veränderungen der der Nukleinsäure-haltigen Zusammensetzungen kommt.
Spezifische Ausführungsformen
Spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen insbesondere:
• eine (pharmazeutische oder kosmetische) Zusammensetzung, die mindestens ein organisches Lösungsmittel umfasst, in dem gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und CTAB-Kationen vorliegen (wobei die Nukleinsäure vorzugsweise derart komplexiert ist, dass die negativen Ladungen der Nukleinsäure durch CTAB- Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert sind), zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in humane Zellen oder Gewebe. • eine (pharmazeutische oder kosmetische) Zusammensetzung, die mindestens ein organisches Lösungsmittel umfasst, in dem gelöste Komplexe aus einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation vorliegen (wobei die Nukleinsäure vorzugsweise derart komplexiert ist, dass die negativen Ladungen der Nukleinsäure durch die positiven Ladungen der organische Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert sind) zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in Zellen der humanen Haut, insbesondere zur Einbringung der Nukleinsäure in die Zellkerne von Zellen der Epidermis, Dermis und/oder Subcutis.
• eine (pharmazeutische oder kosmetische) Zusammensetzung, die mindestens ein organisches Lösungsmittel umfasst, in dem gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation vorliegen, wobei es sich bei der Nukleinsäure um siRNA oder miRNA handelt (wobei die Nukleinsäure vorzugsweise derart komplexiert ist, dass die negativen Ladungen der Nukleinsäure durch positive Ladungen der organischen Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert sind, zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in Zellen der humanen Haut, wobei die Nukleinsäure in die Zellkerne von Zellen der Epidermis, Dermis und/oder Subcutis gelangt.
• eine pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung, die mindestens ein organisches Lösungsmittel umfasst, in dem gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und CTAB-Kationen vorliegen, wobei es sich bei der Nukleinsäure um siRNA oder miRNA handelt, die vorzugsweise derart komplexiert ist, dass die negativen Ladungen der Nukleinsäure durch CTAB-Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert sind, zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in Zellen der humanen Haut, , insbesondere zur Einbringung der Nukleinsäure in die Zellkerne von Zellen der Epidermis, Dermis und/oder Subcutis gelangt.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt den Dünnschnitt humaner Haut nach Behandlung mit fluoreszierenden Oligonukleotiden aus Beispiel 3. In Fig. 1 sind die Zellkerne durch Färbung mit Bisbenzimid dargestellt und waren im blauen Kanal des Fluoreszenzmikroskops (helle Bereiche) sichtbar..
Fig. 2 zeigt den gleichen Schnitt wie Figur 1 , wobei der grüne Kanal dargestellt ist. Die grüne Fluoreszenz (helle Bereiche) zeigen die Fluoreszenz des aufgetragenen FAM- Oligonukleotids an. Die Fluoreszenz ist auf der Oberfläche der Haut (rechter Rand) in den darunterliegenden Zellen zu beobachten. Die hellen Bereiche hinter der Hautoberfläche decken sich mit den Bereichen der Zellkerne in Figur 1 .
Fig. 3 zeigt den Längsschnitt eines Haars aus einem Hautabschnitt einer Maus nach Behandlung mit fluoreszierenden Oligonukleotiden aus Beispiel 9. Dargestellt sind die Zellkerne durch Färbung mit Bisbenzimid (Figur 3A) als auch die grüne Fluoreszenz (helle Bereiche) des aufgetragenen FAM-Oligonukl-eotids an (Figur 3B).
Fig. 4 zeigt den Querschnitt eines Haars aus einem Hautabschnitt einer Maus nach Behandlung mit fluoreszierenden Oligonukleotiden aus Beispiel 9. Dargestellt sind die Zellkerne durch Färbung mit Bisbenzimid (Figur 4A) als auch die grüne Fluoreszenz (helle Bereiche) des aufgetragenen FAM-Oligonukleotids an (Figur 4B).
Fig. 5 Fotografie einer Maus vier Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (Tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-Propylenglycol-Formulierung.
Fig. 6 Fotografie einer Maus vier Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (Tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-Propylenglycol-Formulierung.
Fig. 7 Fotografie einer Maus drei Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (Tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-Ethanol-Rizinus-Formulierung.
Fig. 8 Fotografie einer Maus drei Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (Tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-Ethanol-Rizinus-Formulierung.
Fig. 9 Fotografie einer Maus fünf Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (Tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-Ethanol-Rizinus-Formulierung. Fig. 10 Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen eines Dünnschnitts eines Hautbereichs fünf Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (SEQ ID NO: 2) in Dimethylsulfoxid/Propylenglycol. Es ist ein Hautbereich präpariert, der den Übergang zwischen der haarlosen und dem behaarten Bereich zeigt. Flg. 10A: Darstellung der Zellkerne mit Bisbenzimid. Fig. 10B: Darstellung von Tyrosinase mittels anti-Tyrosinase- Antikörpern.
Die folgenden Ausführungsbeispiele veranschaulichen weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wobei die vorliegende Erfindung nicht auf diese spezifischen Ausführungsbeispiele beschränkt ist.
Beispiel 1
Herstellung von Oligonukleotiden
Folgende Oligonukleotide wurden für die transdermale Verabreichung an menschliche Haut bzw. Mäusehaut vorgesehen.
Ein Oligonukleotid (3'-GAT CCT GCA TAT GGT AGT G -5' (SEQ ID NO: 1 ), Molekulargewicht 5938,82g/Mol ) war mit dem fluoreszenten Farbstoff TAMRA markiert (Oligonukleotid 1 ). Oligonukleotid 2 (Molekulargewicht 5938,82g/Mol ) mit der selben Sequenz war mit dem fluoreszenten Farbstoff Fluorescein 6FAM markiert, um einen Nachweis des Oligonukleotids in den Hautzellen zu ermöglichen.
Die Oligonukleotide wurden von der Firma Biolegio (6545 CG Nijmegen, Niederlande) bezogen.
Beispiel 2
Zur Herstellung von CTAB-Oligonukleotid-Komplexen wurde 1 mg der Oligonukleotide in 200μΙ Wasser gelöst und mit 400μΙ 10mM CTAB versetzt. Die Probe wurde 30min auf Eis inkubiert und der entstandene Niederschlag 5min bei 10000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde abgezogen und der Niederschlag mit 200μΙ Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Der Niederschlag wurde über Nacht im Speedvac getrocknet. Beispiel 3
Einbringen von DNA in humane Hautzellen
Die in Beispiel 2 hergestellten CTAB-Nukleinsäure- omplexe wurden nach dem Trocknen gewogen und in dem organische Lösungsmittel Ethylenglycolmonoethylether (EGE) bzw. Butanol aufgenommen, wobei die Endkonzentration der komplexierten Nukleinsäure etwa 1 mg/ml betrug. Die in Ethylenglycolmonoethylether gelösten CTAB-Nukleinsäure-Komplexe wurden anschließend mit Mandelöl in einem Volumenverhältnis von ÖkEthylenglycolmonoethylether von 9:1 vermischt (90% (v/v) Öl, 10% (v/v) EGE). Die Endkonzentration der komplexierten Nukleinsäure in der jeweiligen Mischung betrug somit etwa 100pg/ml.
Jeweils 5 μΙ der obigen Mischung aus Öl und EGE bzw. Butanol wurden auf Stücke aus Vliespapier (2 mm x 2 mm, Whatman) aufgebracht, die eine Dicke von 1 mm aufwiesen. Die mit dem Nuklei nsäure-haltigen Lösungsmittel getränkten Vliespapierstücke wurden auf humane Hautfragmente (ca. 1 cm x 4 cm) aufgebracht, welche aus einer frischen Bauchoperation erhalten wurden. Die Papierstücke wurden getrennt voneinander in verschiedenen Bereichen des Hautfragments mit Klebeband fixiert. Als Kontrolle wurde eine Mischung von 90% (v/v) Öl, 10% (v/v) EGE, bzw. Butanol verwendet.
Das entsprechend vorbereitete Hautfragment wurde in eine Petrischale mit 5 ml Ringerlösung überführt und über Nacht bei 37°C im C02-lnkubator inkubiert. Anschließend wurde das Hautfragment vorsichtig mit einem Skalpell zerteilt, so dass Teilfragmente erhalten wurden, die jeweils ein Vliespapier auf ihrer Oberflächen aufwiesen. Die Teilfragmente wurden für die weitere Lagerung in flüssigen Stickstoff eingefroren. Die eingefrorenen Teilfragmente wurden für die Herstellung von Dünnschnitten mit einer Dicke von etwa 8 pm verwendet. Es wurde eine Kernfärbung mit Bisbenzimid (5min, 1 pg/ml Bisbenzimid in PBS) Die Auswertung erfolgte durch Fluoreszenzmikroskopie.
Die Ergebnisse der Fluoreszenzmikroskopie sind in den Figuren 1 -2 dargestellt. Die von den markierten Oligonukleotiden emittierte Fluoreszenz konnte in den Epithelzellen und darüber hinaus auch in den darunter liegenden Bindegewebszellen nachgewiesen werden. Auch die Zellkerne zeigten eine Fluoreszenz, was darauf verweist, dass die markierten Oligonukleotide in die Zellkerne der Hautzellen vordringen konnten. Figur 1 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines Dünnschnitts eines Hautfragments, das wie oben beschrieben behandelt wurde. Deutlich sind die mittels Bisbenzimid-Färbung sichtbar gemachten Zellkerne zu erkennen, die als blau gefärbte Bereiche auftreten. Figur 2 zeigt den gleichen Dünnschnitt wie Figur 1 , bei der grünen Kanal (Fluoreszenz des FAM-Oligos) gezeigt ist. Die hellen Bereiche zeigen das fluoreszierend Oligonukleotid. Es ist zu erkennen, dass die hellen Bereiche sich mit den blauen Bereichen aus Figur 1 decken. Diese Übereinstimmung zeigt, dass die fluoreszierenden Oligonukleotide in die Zellkerne der Hautzellen eindringen konnten.
Hautfragmente, die mit TAMRA-markierten Oligonukleotid behandelt worden waren, zeigten eine entsprechende rote Fluoreszenz der Zellkerne. Hautfragmente, die lediglich mit der Kontrolle (ohne Oligonukleotid) behandelt worden waren, zeigten keine Fluoreszenz der Zellkerne im grünen oder roten Kanal.
Beispiel 4
Einbringen von DNA in Hautzellen von Mäusen
CTAB-Komplexe von Oligonukleotid 1 wurden wie in Beispiel 2 hergestellt und in zu einer Endkonzentration von etwa 1 pg/pl in Ethylenglycolmonobutylether (EGE) gelöst. Anschließend wurde das die Komplexe enthaltende Lösungsmittel 1 :10 mit Mandelöl verdünnt (90% (v/v) Öl, 10% EGE), sodass eine Endkonzentration von 100 pg/ml CTAB-Nukleinsäure erhalten wurde.
Mäuse wurden für die dermale Applikation der Zusammensetzung durch Rasur eines Fellbereichs im Nacken vorbereitet. Es wurden einmalig 50 μΙ der Zusammensetzung auf den rasierten Nackenbereich aufgetragen.
Die Präparation des behandelten Hautbereichs erfolgte nach 0, 1 , 2 bzw. 3 Tagen. Die Präparate wurden in flüssigen Stickstoff eingefroren, und es wurden Dünnschnitte mit einer Dicke von etwa 8 pm für die Fluoreszenzmikroskopie hergestellt. Die Kernfärbung erfolgte wie in Beispiel 3 beschrieben mit Bisbenzimid. Die Auswertung der Fluoreszenzmikroskopie zeigte nach 3 Tagen Zellkerne von Epidermiszellen, die durch das Fluoreszein-markierte Oligonukleotid grün erschienen. Beispiel 5
Einbringen von DNA in murine Hautzellen
CTAB-Komplexe von Oligonukleotid 1 wurden wie in Beispiel 2 hergestellt und in zu einer Endkonzentration von etwa 1 β Ι in Butanol gelöst . Anschließend wurde das die Komplexe enthaltende Lösungsmittelgemisch 1 :10 mit Mandelöl oder Walnussöl verdünnt (90% (v/v) Öl, 10% Butanol, so dass eine Endkonzentration der CTAB-Nukleinsäure-Komplexe von 100 g/ml erhalten wurde.
Mäuse wurden für die dermale Applikation der Zusammensetzung durch Rasur eines Fellbereichs im Nacken vorbereitet. Es wurden jeweils 40 μΙ der Zusammensetzung über drei Tage einmal täglich auf den rasierten Nackenbereich aufgetragen.
Die Präparation des behandelten Hautbereichs erfolgte nach 3 Tagen nach der letzten Behandlung. Die Präparate wurden in flüssigen Stickstoff eingefroren, und es wurden Dünnschnitte mit einer Dicke von etwa 8 pm für die Fluoreszenzmikroskopie hergestellt. Die Kernfärbung erfolgte wie in Beispiel 3 beschrieben mit Bisbenzimid. Die Auswertung der Fluoreszenzmikroskopie zeigte nach 3 Tagen Zellkerne von Epidermiszellen und von Zellen der Haarfollikel und Bulge-Region, die durch das Fluoreszein-markierte Oligonukleotid grün erschienen.
Beispiel 6
Einbringen von DNA in murine Hautzellen
CTAB-Komplexe von Oligonukleotid 1 wurden wie in Beispiel 2 hergestellt und in zu einer Endkonzentration von etwa 0,5 pg/μΙ in Ethylenglycolmonobutylether (EGE) gelöst. Anschließend wurde das die Komplexe enthaltende Lösungsmittel 1 :1 mit Mandelöl gemischt (50% (v/v) Öl, 50% EGE), sodass eine Endkonzentration der CTAB-Nukleinsäure-Komplexe von 250pg/ml erhalten wurde.
Mäuse wurden für die dermale Applikation der Zusammensetzung durch Rasur eines Fellbereichs im Nacken vorbereitet. Es wurden jeweils 40 μΙ der Zusammensetzung über drei Tage einmal täglich auf den rasierten Nackenbereich aufgetragen. Die Präparation des behandelten Hautbereichs erfolgte nach 3 Tagen nach der letzten Behandlung. Die Präparate wurden in flüssigen Stickstoff eingefroren, und es wurden Dünnschnitte mit einer Dicke von etwa 8 pm für die Fluoreszenzmikroskopie hergestellt. Die Kernfärbung erfolgte wie in Beispiel 3 beschrieben mit Bisbenzimid. Die Auswertung der Fluoreszenzmikroskopie zeigte Zellkerne von Epidermiszellen und von Zellen der Haarfollikel und Bulge-Region, Muskelzellen, Fettzellen, Bindegewebezellen und Kapillarzellen, die durch das Fluoreszein-markierte Oligonukleotid grün erschienen.
Beispiel 7
Bestimmung der CTAB-DNA-Partikelgröße in DMSO-Wasser Mischungen
Für die Einbringung der Nukleinsäuren in Säugerzellen über die Haut ist die Partikelgröße der CTAB-DNA-Partikel von Bedeutung. Kleinere Partikel können leichte die Haut durchdringen und von der Zellmembran aufgenommen werden. Daher wurde die CTAB-DNA-Partikelgröße mittels dynamischer Lichtstreuung bestimmt
200pl einer 1 % (w/v) Lachssperma-DNA - entsprechend 2mg - in Wasser wurden in ein 2ml Röhrchen eingefüllt. Die DNA wurde mit einem gleichem Volumen 100mM CTAB ausgefällt und der Niederschlag durch Zentrifugation (5min, 10.000 x g) präzipitiert. Das Pellet wurde in 500μΙ Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde über Nacht im Speedvac getrocknet. In das Röhrchen wurde ein Volumen von 2ml DMSO eingefüllt und das CTAB-DNA-Pellet über Nacht geschüttelt (800 Upm). Es entstand eine klare Lösung. Die CTAB- DNA-Lösung in DMSO wurde 1 :10 mit DMSO und Wasser verdünnt, so dass verschiedene DMSO-Wasser-Mischungen im Konzentrationsbereich mit einem DMSO-Gehalt (v/v) zwischen 10 - 100% entstanden. Je 0,5 ml der verschiedenen CTAB-DNA Lösungen in den DMSO- Wasser Mischungen wurde in Kunststoffküvetten überführ und die die Partikelgröße mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung mit einem (Zetasizer, Malvern Instruments GmbH, 71083 Herrenberg) gemessen.
Es ergab sich bei hohen DMSO-Konzentrationen größer als 80% (v/v) DMSO ein mittlerer Partikeldurchmesser von ca. 10nm, der sich bei zunehmendem Wassergehalt auf mehr als das 10fache erhöhte. DMSO H20
Konzentration mittlerer Konzentration
Vol. Konz. Partikeldurchmesser Vol. Konz.
% (v/v) Nm (SD) % (v/V)
10 227 (6,7) 90
20 139 (7,1 ) 80
33 154 (5,5) 66
40 183 (6,2) 60
50 168 (4,0) 50
60 8 (3) 40
60 10 (3,1 ) 40
70 60 (4,5) 30
80 7 (1 ,5) 20
90 13 (2,1 ) 10
100 10 (1 ,2) 0
Beispiel 8
Herstellung von lipophiler Nlukleinsäure-Komplexe mit Rizinusöl
5mg des fluoreszierenden DNA-Oligonukleotid 2 wurde in 1 ml Wasser gelöst und mit 300μΙ 100mM Cetyltrimethylammoniumbromid-Lösung gemischt. Es entstand eine gelbliche Trübung, die durch 5min Zentrifugation bei 10.000 xg niedergeschlagen wurde. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag in 1 ml Wasser suspendiert und erneut wie oben zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag unter Vakuum getrocknet. Der Niederschlag wurde in 1 ml Ethanol aufgenommen. Es entstand eine gelbe, klare Lösung. 100μΙ der fluoreszierenden DNA wurden in einem Kunststoffröhrchen mit 1 ml Rizinusöl gemischt. Es entstand eine homogene, zähe Flüssigkeit, die 90% (v/v) Rinizinusöl und 10% (v/v) Ethanol und gelöste DNA enthielt.
Beispiel 9
Einbringung von fluoreszierender DNA in Haarzellen durch Applikation der lipophilen Nukleinsäurekomplexen auf die Haut von Mäusen
3 Mäuse (C27/Black) wurden für die dermale Applikation der Zusammensetzung durch Rasur eines Fellbereichs im Nacken vorbereitet. Je einer Maus wurden jeweils 10μΙ, 20μΙ und 40 μΙ der Zusammensetzung nach Beispiel 8 auf den rasierten Nackenbereich aufgetragen. Nach drei Tagen wurden die Mäuse getötet und die behandelten Hautbereiche herausgeschnitten. Als Kontrolle wurden Hautbereiche verwendet, die nicht mit Nuklei nsäurekomplexen behandelt waren. Die Präparate wurden durch Inkubation über Nacht bei 4°C in 10% (w/v) Formaldehyd in mit Phosphat gepufferter Saline (PBS) fixiert und in flüssigen Stickstoff eingefroren. Aus den Hautbereichen wurden Dünnschnitte einer Dicke von etwa 8 μηη auf Objektträgern für die Fluoreszenzmikroskopie hergestellt. Eine Kernfärbung erfolgte durch 5min Inkubation in 2pg/ml Bisbenzimid in PBS. Die Dünnschnitte wurden mit Fluoromount beschichtet und mittels Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Dünnschnitte, der mit fluoreszierenden DNA- Oligonukleotid 2 behandelten Bereiche zeigten eine grüne Fluoreszenz innerhalb der Haut, die im Besonderen in den Zellkernen nachweisbar war. In Dünnschnitten von nicht behandelten Hautbereichen war keine Fluoreszenz zu beobachten. Die Figuren 3 und 4 zeigen im Längs- (Figur 3) und Querschnitt (Figur 4) Haare, wobei die Zellkerne von Haarzellen durch das Fluoreszein-markierte Oligonukleotid 2 grün gefärbt waren. Haarzellen aus Bereichen, die nicht mit fluoreszierender DNA behandelten waren, zeigten keinerlei grüne Fluoreszenz innerhalb der Zellen.
Beispiel 10
Herstellung von Oligonukleotiden zur Beeinflussung des Haarwachstums und Pigmentbildung der Haut
siRNAs wurden als doppelsträngige Produkte mit 3' Desoxythymidinüberhängen (dTdT) von Eurofins MWG Operon (85560 Ebersberg, Deutschland) bezogen. siRNA-1 (Tyrosinase-spezifisch) (5'-CUA UCU GAA UCA GAU UCU A dTdT-3'; SEQ ID NO:
2) , mit zwei Desoxythymidinen am 3'-Ende und entsprechend komplementären RNA- Gegenstrang ebenfalls mit zwei Desoxythymidinen am 3'-Ende. siRNA-2 (unspezifische Kontrolle) (5'-GCU GAC CCU GAA GUU CAU C dTdT-3'; SEQ ID NO:
3) , mit zwei Desoxythymidinen am 3'-Ende und entsprechend komplementären RNA- Gegenstrang ebenfalls mit zwei Desoxythymidinen am 3'-Ende.
Beispiel 11
Herstellung von komplexierter siRNA in Ethanol/Rizinusöl
2mg der siRNA-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 2) (Tyrosinase-spezifisch) und 2 (unspezifische Kontrolle; SEQ ID NO: 3) wurden jeweils in 200μΙ Wasser gelöst und mit 600μΙ 10mM Cetyltrimethylammoniumbromid-Lösung gemischt. Es entstanden eine weiße Trübungen, die durch 5min Zentrifugati on bei 10.000 xg niedergeschlagen wurden. Die Überstände wurden verworfen und die Niederschläge in je 200μΙ Wasser suspendiert und erneut wie oben zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und die Niederschläge unter Vakuum getrocknet. Zu den Niederschlägen wurde zunächst 200μΙ Ethanol gegeben und die Suspension gevortext. Die Suspension blieb trübe. In 200μΙ Schritten wurde weiterer Ethanol zugefügt und gemischt. Bei der Zugabe von insgesamt 1200μΙ Ethanol war die komplexierte siRNA komplett gelöst. 50μΙ, 10ΟμΙ, 200μΙ der komplexierten siRNA in Ethanol wurden mit 950μΙ, 900μΙ und 800μΙ Rizinusöl (Gesamtvolumen jeweils 1 ml) durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Es entstanden klare Lösungen mit siRNAs.
Figure imgf000032_0001
Beispiel 12
Herstellung von komplexierter siRNA in Dimethylsulfoxid/Propylenglycol
2mg der siRNA-Oligonukleotid 1 (SEQ ID NO: 2) und 2 (SEQ ID NO: 3) wurden jeweils in 200μΙ Wasser gelöst und mit 600μΙ 10mM Cetylammoniumbromid-Lösung gemischt. Es entstand eine weisse Trübung, die durch 5min Zentrifugation bei 10.000 xg niedergeschlagen wurde. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag in 200μΙ Wasser suspendiert und erneut wie oben zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag unter Vakuum getrocknet. Der Niederschlag (Cetylammonium-siRNA) wurde in 200μΙ Dimethylsulfoxid aufgenommen. 10μΙ, 20μΙ und 50μΙ der komplexierten siRNA in Dimethylsulfoxid wurde mit 90μΙ, 80μΙ und 50μΙ Propylenglykol (Gesamtvolumen jeweils 100μΙ) gemischt. Es entstanden klare Lösungen mit gelösten siRNAs .
Figure imgf000033_0001
Beispiel 13
Effekt von dermaler Applikation lipophilen siRNA-1 (Tyrosinase-spezifischen)-Komplexen in Mäusen
14 Mäuse wurden zur Untersuchung des Effekts von lipophilen siRNA-Tyr-Komplexen verwendet. 3 Mäusen wurden auf die unrasierte Kopf- bzw. Rückenhaut je 20μΙ der in Dimethylsulfoxid/Propylenglycol gelösten siRNA-1 (Proben 1 d, 1 f und 1 g aus Beispiel 1 2) aufgetragen. 3 weiteren Mäusen wurden auf die unrasierte Kopf- bzw. Rückenhaut je 20μΙ der in Ethanol/Rizinusöl gelösten siRNA-1 (Proben 1 a, 1 b und 1 c des Beispiel 1 1 ) aufgetragen. 3 weiteren Mäusen wurden auf die gleichen Stellen je 20μΙ der in Ethanol/Rizinusöl gelösten siRNA 2 (unspezifische Kontrollen, Proben 2a, 2b und 2c des Beispiel 1 1 ) und 3 weiteren Mäusen die in Dimethylsulfoxid/Propylenglycol gelöste siRNA 2 (unspezifische Kontrolle, Proben 2d, 2f und 2g des Beispiel 1 2) aufgetragen. Als weitere Kontrollen wurde unkomplexierte siRNA-1 unmittelbar in sterilem TE (1 0mM TrisCl, pH8, 2mM EDTA) bzw. TE mit 20% (v/v) Dimethylsulfoxid zu einer Endkonzentration an siRNA-1 von 2pg/pl gelöst und je 20μΙ dieser Lösung ebenfalls auf jeweils eine Maus aufgebracht. Danach wurden die Mäuse mit Wasser und Trockenfutter ad libitum gehalten. Nach ca. 2 Wochen färbten sich die Haare der Mäuse, die mit siRNA-1 (Tyrosinase-spezifisch) behandelt waren, weiß und fielen aus. Die Haare der zur Kontrolle mit siRNA-2 wie auch die mit unkomplexierter siRNA-1 behandelten Mäuse blieben unverändert dicht und schwarz. Nach weiteren 3 Wochen wuchsen die Haare, der mit siRNA-1 (Tyrosinase-spezifisch) wieder nach, so dass der Effekt nach ca. 7 Wochen nach Applikation vollkommen aufgehoben war. Abgesehen von der Haarveränderung war keine Abweichung der mit siRNA-1 (Tyrosinase-spezifisch) behandelten Mäuse im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtbar. Über den gesamten Zeitraum waren die Mäuse vital und zeigten keinerlei pathologische Veränderungen.
Beispiel 14
Nachweis der Reduktion der Tyrosinase in Dünnschnitten siRNA-1 behandelter Hautbereiche Zum Nachweis der spezifischen Reaktion der Tyrosinase-spezifischen siRNA-1 wurde das Tyrosinase-Protein in der Haut der behandelten Mäuse in Dünnschnitten mittels Anti- Tyrosinase-Antikörpern untersucht. Dazu wurde eine Maus, die mit komplexierter siRNA-1 in Dimethylsulfoxid/Propylenglycol (20%:80%) behandelt worden war, nach 5 Wochen getötet und ein Hautbereich heraus geschnitten, der sowohl einen Teil eines haarlosen wie auch einen Teil behaarten Hautbereich einschloss. Als Kontrolle wurde ein Hautbereich verwendet, der nicht mit komplexierter siRNA-1 behandelt worden war. Die Hautfragmente wurden über Nacht bei 4°C in PBS mit 10% Formaldehyd fixiert, in Flüssigstickstoff eingefroren und in 8 pm Dünnschnitte geschnitten. Die Schnitte wurden in 1 zu 200 in PBS verdünnten Kaninchen anti- Tyrosinase-Antikörpern (Antibody-online.com, Atlanta, GA 30346, USA) 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schnitte wurden in PBS gespült und mit Rhodamin-gekoppelten anti-Kaninchen-Antikörpern 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Darauf wurden die Schnitte mit PBS gespült und zur Kernfärbung mit 2pg/ml Bisbenzimid in PBS inkubiert. Darauf wurden die Schnitte wieder mit PBS gespült und mit einem Tropfen Fluoromount eingedeckelt. Die Dünnschnitte wurden mittels Fluorezenzmikroskop ausgewertet. Es zeigte sich in den Kontrollen, die nicht mit komplexierter siRNA-1 behandelt worden waren eine deutliche rote Fluoreszenz in Bereich der Haarzellen und Epithelzellen. Die rote Fluoreszenz zeigt das Vorhandensein von Tyrosinase in den Dünnschnitten an. Hautbereiche, die mit komplexierter siRNA-1 behandelt waren, zeigten keine bzw. stark reduzierte rote Fluoreszenz.

Claims

Patentansprüche
1 . Pharmazeutische und/oder kosmetische Zusammensetzung, die mindestens ein organisches Lösungsmittel umfasst, in dem Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation gelöst vorliegen, zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers oder zur Verwendung in einem Diagnostizierverfahren, das am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen wird, wobei das Verfahren die Einbringung der Nukleinsäure in Zellen oder Gewebe des menschlichen oder tierischen Körpers umfasst, insbesondere die Einbringung in Zellen oder Gewebe eines Säugetiers.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1 , wobei die Nukleinsäure derart komplexiert ist, dass die negativen Ladungen der Nukleinsäure durch organische Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert sind, insbesondere wobei das Molverhältnis zwischen den anionischen Ladungen der mindestens einen Nukleinsäure und den Ladungen des mindestens einen organischen Kations im Wesentlichen 1 :1 beträgt.
3. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung eine Nukleinsäurekonzentration von mehr als 1 pg/ml, vorzugsweise mehr als 10 pg/ml, besonders bevorzugt mehr als 100 g/ml aufweist.
4. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die organischen Kationen quartäre Amine umfassen, insbesondere wobei die organischen Kationen Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) umfassen.
5. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, die ferner mindestens ein synthetisches, pflanzliches oder tierisches Öl; und/oder synthetisches, pflanzliches oder tierisches Fett; und/oder synthetisches, pflanzliches oder tierisches Wachs umfasst.
6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, die einen Öl-, Wachs- bzw. Fettanteil von 30% oder mehr, vorzugsweise 50% oder mehr, besonders bevorzugt von 80% oder mehr besitzt.
7. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus einem oder mehreren Mitgliedern der Gruppe bestehend aus:
a) Alkohol, wie Ethanol, 1 -Butanol, 2-Propanol, 1 -Pentanol,
b) DMSO, oder
c) Glycolether wie z.B. Ethylenglykolmonobutylether.
8. Zusammensetzung nach Anspruch nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das mindestens eine Lösungsmittel mit mindestens einem weiteren organischen Lösungsmittel vermischt ist.
9. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das mindestens eine organische Lösungsmittel in einer Konzentration von weniger als 70% (v/v), bevorzugt, weniger als 50% (v/v), besonders bevorzugt weniger als 20% (v/v) vorliegt.
10. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das organische Lösungsmittel in einer Konzentration von mehr als 1 % (v/v), bevorzugt mehr als 5% (v/v), besonders bevorzugt mehr als 10% (v/v) vorliegt.
1 1. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Wassergehalt in der Zusammensetzung geringer als 50% (v/v), bevorzugt geringer als 30% (v/v), besonders bevorzugt geringer als 10% (v/v) ist.
12. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der durchschnittliche Durchmesser der Komplexe aus Nukleinsäure und organischem Kation in der Zusammensetzung kleiner als 200nm, bevorzugt kleiner als l OOnm, besonders bevorzugt kleiner als 50nm, ganz besonders bevorzugt kleiner als 10nm beträgt.
13. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Komplexe in einer homogenen, zusammenhängenden Phase gelöst vorliegen.
14. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Komplexe nicht innerhalb von Liposomen vorliegen.
15. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zellen Zellen der Epidermis, Dermis und/oder Subcutis sind.
1 6. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in Zellkerne, insbesondere in Zellkerne von Zellen der Epidermis, Dermis und/oder Subcutis.
1 7. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei der Nukleinsäure um DNA, RNA, oder DNA/RNA Hybride handelt, insbesondere wobei es sich bei der Nukleinsäure um DNA, RNA, oder DNA/RNA Hybride einer Größe von 1 - 100 b bzw. bp handelt.
18. Transdermales Pflaster, das eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 -1 7 umfasst.
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