WO2012077053A1 - Procede de preparation de jus de noni - Google Patents

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WO2012077053A1
WO2012077053A1 PCT/IB2011/055494 IB2011055494W WO2012077053A1 WO 2012077053 A1 WO2012077053 A1 WO 2012077053A1 IB 2011055494 W IB2011055494 W IB 2011055494W WO 2012077053 A1 WO2012077053 A1 WO 2012077053A1
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noni
juice
acid
fruit
minutes
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PCT/IB2011/055494
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Pierre Brat
Yanine Chan
Christian Mertz
Max Reynes
Ana M. Perez
Fabrice Vaillant
Original Assignee
Centre De Cooperation Internationale En Recherche Agronomique Pour Le Developpement (Cirad)
Universidad De Costa Rica
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Definitions

  • the present invention relates to the field of the preparation of noni juice and its use for human and animal health.
  • the nono or apple-dog is a tropical tree of the family Rubiaceae; it gives fruit (noni) less than a year after planting ( Figure 1); they are recognizable by their acrid smell and bitter taste.
  • the shrub reaches full maturity at two years, and provides up to 8 kg of fruit per month throughout the year.
  • noni Given the interest that noni has for health, it is prepared and sold in the form of juice; it is a traditional remedy used for the treatment of multiple disorders including diabetes, cardiac disorders, hypertension; its therapeutic virtues are attributed to the presence of an alkaloid precursor, xeronine, with its antioxidant properties and its varied polyphenol content.
  • the juice is obtained by spontaneous flow during the conservation (senescence) of the ripe fruits.
  • the juice thus prepared has the disadvantage of having a very unpleasant odor and a limited shelf life because of its fermentation.
  • Noni extracts such as its juice for various therapeutic applications: Application WO 02/45734 as anti-pain and anti-inflammatory, Application WO 2009/006565 for inhibiting the growth of bacteria anaerobic gram-, protozoan and other microbes and US Application 2008/0206376 for treating hypertension.
  • the extracts that can be used for its applications are, for example, decoctions or infusions of leaves, or pulp or noni juice.
  • Application FR 2,783,137 describes the preparation of a composition based on noni which consists in picking the fruit at a ripening stage which corresponds to the moment when the color of the fruit turns from green to whitish yellow, then the fruits are washed and milled in a grinder-centrifuge, the pulp is then pressed to recover the juice, the juice obtained is filtered through a fine sieve and then treated by depectinisation in order to obtain a clear juice; the juice is then pasteurized.
  • the disadvantage of this method is that the juice yield obtained by pressing the fruit early is low.
  • the Applicant has thus developed a new process for the preparation of deodorized noni juice having a good microbiological stability and whose biochemical composition in polyphenolic compounds is preserved compared to fruit juice prepared according to the traditional method thus preserving the therapeutic virtues of said juice. .
  • the present invention thus relates to a process for the preparation of noni juice comprising the steps of:
  • step d) sieving or coarse filtration of said first juice obtained at the end of step c) leading to a second juice
  • microfiltration or ultrafiltration tangential tubular ceramic membrane cutoff threshold less than or equal to 0.5 ⁇ of said second juice obtained at the end of step d).
  • the enzymatic activities are expressed in IU, that is to say in micromoles of reducing groups released from the substrate; said substrate being polygalacturonic acid for polygalacturonase activity (EC 3.2.1.15); esterified citric pectin 80% for pectin-lyase activity (EC 4.2.2.10); carboxymethylcellulose for endocellulase activity (EC 3.2.1.4) and crystalline cellulose for exo-cellulase activity (EC 3.2.1.91) and the standard experimental conditions are respectively: pH 4, 30 ° VS ; pH 6 at 40 ° C; pH 4.6 at 38 ° C and pH 4.8 at 50 ° C.
  • disinfection can be carried out by any means known to those skilled in the art, for example, with an aqueous solution of chlorine or a solution of sodium hypochlorite;
  • step b) of enzymatic treatment is carried out with stirring
  • the pressing step c) can be carried out by any means, for example, using a packer, a screw press, a belt press, etc. ;
  • Step d) sieving or coarse filtration can be performed for example with a sieve of 1.5 mm.
  • This step advantageously makes it possible to reduce the turbidity of the juice obtained after pressing.
  • Turbidity is defined as the reduction of the transparency of a liquid due to the presence of undissolved matter; in this case, it is less than 2000 NTU at the end of step d) (Nephelometric Turbidity Unit, the measurement of which is carried out on the light scattered at an angle of 90 ° with respect to the sample to be evaluated and at a wavelength of 860 nm).
  • the enzymatic treatment step leads to the liquefaction of the noni fruit puree; it allows fruit to be used at an early maturity stage during which the fruit has not yet developed too strong a smell; it also makes it possible to increase the fraction of juice recovered and thus the production yield of juice.
  • This step can be carried out with an enzymatic mixture, possibly commercial, designed to hydrolyze the fruit walls and facilitate pressing and selected for its enzymatic pectinase and cellulase activities; such preparations may in particular be selected as described in Example 1.13.
  • the enzymatic preparations may have all or part of the following enzymatic activities in the indicated activity ranges (expressed in IU, ⁇ of products / min), it being understood that said preparations exhibit at least the pectinase and cellulases as defined above:
  • These preparations may be used at a concentration of between 50 and 300 ml / ton of fruit, preferably 200 ml / ton of fruit, and between 120 and 200 minutes of maceration, preferably 150 minutes, with gentle stirring.
  • Step e) of micro- or ultrafiltration makes it possible to totally retain the insoluble compounds and the vegetative forms of the microorganisms and their spores; it also makes it possible to retain long-chain hydrophobic volatile fatty acids responsible for the unpleasant smell of noni juice.
  • the microfiltration step may be carried out with ceramic membranes (for example, made of alumina zirconia) or organic membranes with a pore diameter of between 0.05 and 0.5 ⁇ for microfiltration membranes and a threshold cutoff between 10 and 50 kD for ultrafiltration membranes; this step is preferably carried out by applying a transmembrane pressure of between 0.5 and 3 bar, preferably between 1 and 1.5 bar.
  • ceramic membranes for example, made of alumina zirconia
  • organic membranes with a pore diameter of between 0.05 and 0.5 ⁇ for microfiltration membranes and a threshold cutoff between 10 and 50 kD for ultrafiltration membranes; this step is preferably carried out by applying a transmembrane pressure of between 0.5 and 3 bar, preferably between 1 and 1.5 bar.
  • the juice thus obtained is preferably conditioned aseptically; it then has a life of at least 1 year.
  • a control of the nutritional quality of the juice thus obtained shows that its biochemical composition in non-volatile compounds is not impaired and that the juice retains all its therapeutic virtues.
  • the process according to the invention does not affect the composition of phenolic compounds present in the initial juice as well as its antioxidant power.
  • this process advantageously makes it possible to reduce the content of volatile fatty acids responsible for the bad odor of noni juice (in particular the rancid odor) by 50 to 70% by weight relative to their initial content.
  • volatile fatty acids responsible for the bad odor of noni juice in particular the rancid odor
  • senescence or aging traditionally used to obtain noni juice appears useless or even detrimental to the organoleptic qualities of juice (development of a very strong smell).
  • the use of enzymatic preparations, especially commercial mixtures advantageously replaces the very slow action of the natural enzymes of the fruit on the liquefaction of the cellulosic walls.
  • the present invention also relates to noni fruit juice obtained by the process according to the invention. More specifically, the present invention relates to a noni juice which is characterized by a low content of undesirable compounds responsible for an unpleasant odor; in particular, an octanoic acid (or caprylic acid) content of less than 200 ⁇ g / g, preferably less than 180 ⁇ g / g of noni juice, and a hexanoic acid content of less than 200 ⁇ g / g, preferably less than at 190 of noni juice.
  • a noni juice which is characterized by a low content of undesirable compounds responsible for an unpleasant odor; in particular, an octanoic acid (or caprylic acid) content of less than 200 ⁇ g / g, preferably less than 180 ⁇ g / g of noni juice, and a hexanoic acid content of less than 200 ⁇ g / g, preferably less than at 190 of noni juice.
  • this juice is further characterized by a content of 2-methylpropanoic acid of less than 6 ⁇ g / g of noni juice and / or a decanoic acid content of less than 1 ⁇ g / g of noni juice.
  • Figure 1 shows two shots of green noni fruit harvested from the EARTH University plantation, Costa Rica.
  • Figure 2 shows several images that illustrate the evolution of the color of the noni epicarp during its maturation and senescence.
  • Figure 3 shows the methodological scheme for determining total polyphenols and vitamin C (A, obtaining the different extracts, B, optimized Folin-Ciocalteu protocol).
  • Figure 4 represents the protocol followed for the determination of the filterability of the samples.
  • Figure 5 shows the process flow diagram followed for obtaining enzymatically treated noni juice; it is the juice used for tangential microfiltration.
  • Figure 6 is a diagram of the tangential microfiltration pilot; Legend: 1. Feed pump, 2. Circulation pump, 3. Microfiltration module, 4. Heat exchanger, 5. Manometer, 6. Flow meter.
  • Figure 7 is a histogram showing the evolution of the concentration of scopoletin and rutin in noni fruits during ripening and senescence.
  • the values presented are the means and standard deviations of three samples analyzed independently. a ' b ' °
  • the values in the columns followed by the same letter are not significantly different at P ⁇ 0.05 (Duncan's test).
  • Figure 8 shows the CG-MS chromatogram of the aromatic compounds found in the non-ripe pulp.
  • the compounds identified with corresponding numbers are those found in greater concentration (legend: 1: hexanoic acid methyl ester, 2: hexanoic acid ethyl ester, 3: octanoic acid methyl ester, 4: octanoic acid ethyl ester, 5: hexanoic acid, 6: octanoic acid).
  • Figure 9 groups together three graphs representing the evolution of some volatile compounds identified in noni pulp during senescence (A: hexanoic acid and octanoic acid, B: esters of hexanoic and octanoic acids, C: alcohols and acetic acid).
  • Figure 10 illustrates the volume of noni juice obtained during 25 minutes of filtration after enzymatic treatment (200 ⁇ l of enzymatic mixture.kg- 1 noni pulp for 60 minutes at room temperature), the numerical values represent the increase of volume relative to the volume of the untreated control.
  • Figure 11 is a graphical representation of the response surface of the yield of the Klerzyme-150 ® enzyme mixture in relation to the concentration and time of activity in the non-mature pulp.
  • Figure 12 is a graph showing the effect of three transmembrane pressure values on the flow during the microfiltration of noni juice.
  • the fruits of noni used come from the experimental plantation of the University EARTH (Escuela de Agricultura Humeda Tropical Region), Limon, Costa Rica. This University is located in tropical humid zone between 100 and 150 m of altitude, the temperature varies between 25 and 30 ° C and the humidity between 80 and 90%. The fruits were harvested at the "green” stage of maturity (light yellow-green epidermis, very hard texture, slight odor) ( Figure 1).
  • Green fruits (green noni) were washed and disinfected with a 200 mg.l- 1 solution of chlorine and stored in closed containers at room temperature. days later, the fruits are mature and a second sample of non-ripe noni is then taken. From that day, a sample is taken weekly until the eighth week ( Figure 2, Table I).
  • Noni green Noni green (harvested fruit) Light green - pale yellow, very hard, light odor
  • Noni ripe Noni ripe (3 days after harvest) Translucent - greyish, soft, strong odor
  • Noni 1 Noni to a week of storage Light brown, soft, strong smell
  • Noni 2 Noni two weeks storage Light brown, very soft, stronger smell
  • the pH was measured with a glass electrode and a pH meter (Model 530) by the official method (AOAC, 1990) on an aliquot of juice obtained by filtration of the puree on paper No. 4.
  • Soluble solids concentration was measured by refractometry.
  • the deviation of the luminous angle is related to the content of soluble elements present in the middle.
  • Soluble solids were measured using an Abbe refractometer (Milton Roy Company LR45227) on an aliquot of juice obtained by filtration of the mash. The reading was performed at room temperature.
  • the dry matter of the samples was determined gravimetrically.
  • the fresh samples were weighed before and after drying in an oven at 50 ° C for 3 h and then overnight at 60 ° C in a vacuum oven.
  • the results are expressed in g.100 g -1 pulp.
  • Protein levels were determined by nitrogen assay using the micro-Kjeldhal technique (Bietz, 1974).
  • the organic nitrogen is oxidized to ammonium sulfate by hot concentrated sulfuric acid in the presence of a suitable catalyst.
  • the ammonia nitrogen formed by the addition of phenol in an alkaline medium is colorimetrically determined by the addition of sodium hypochlorite.
  • the blue color due to indophenol formation is measured at 630 nm.
  • the protein content is obtained by multiplying the nitrogen content by 6.25.
  • Microbiological analyzes were performed on fruit pulp the day of its preparation. All analyzes were performed in triplicate.
  • the antioxidant power of the samples was evaluated from the measurement of the oxygen radical absorption capacity (ORAC), in the presence of fluorescein used as an indicator of attack of the peroxyl radical according to the method described by Ou et al. (2001) and modified by Vaillant et al. (2005).
  • ORAC oxygen radical absorption capacity
  • 0.5 g of freeze-dried sample was mixed with 20 ml of acetone / water solution (50:50, v / v) and stirred at room temperature for 1 hour. After filtration on filter paper, the extract was diluted 100-fold with 75 mM phosphate buffer, pH 7.4. 750 ⁇ l of this extract were then incubated for 15 min at 37 ° C. with 1.5 ml of fluorescein 8.1 ⁇ 10 -5 M (Sigma, USA) directly in the spectrophotometer tank (Shimadzu RF-1501 spectrophotometer equipped with 'a xenon lamp).
  • the antioxidant capacity was determined by measuring the absorbance of a colored complex generated by the reaction between the ferrous peroxide and chloride which form the ferric ions. Ferric ions react with ammonium thiocyanate and produce ferric thiocyanate which gives a red color.
  • the FTC method was adapted from the Osawa and Namiki (1981) and Mohd et al. (2002).
  • the antioxidant capacity of the samples was evaluated from the measurement of the absorbance of a red complex generated by the reaction between the thiobarbituric acid and the product obtained from the lipid peroxidation (malonaldehyde) of the extract under acidic conditions.
  • the TBA method was performed according to the adapted method of Kikuzaki and Nakatani (1993), Ottolenghi (1959) and Mohd et al. (2002).
  • This method applies to methanol and ethyl acetate extracts. 1 ml of sample was added to 2 ml of trichloroacetic acid and 2 ml of 20% thioarbituric acid solution. This mixture is then placed in a bath at 100 ° C for 10 minutes. After cooling, the mixture is centrifuged at 3000 g for 20 minutes and the absorbance of the supernatant is measured at 532 nm. The results are expressed as differences in absorbance which is inversely proportional to the antioxidant capacity.
  • 500 ⁇ l of crude extract are mixed with 3500 ⁇ l of water and 500 ⁇ l of this solution were deposited on an OASIS ® cartridge and rinsed twice with 2 ml of distilled water.
  • the cartridge retains the phenolic compounds while the other reducing compounds are eluted by washing with water.
  • 500 ⁇ l of this aqueous solution are then treated as the crude extract with Folin's reagent. Therefore, to find the actual concentration of polyphenols, the interference must be subtracted from the total content of polyphenols.
  • Figure 3 shows the methodological scheme for determining total polyphenols and vitamin C (A, obtaining the different extracts, B, optimized Folin-Ciocalteu protocol).
  • the stationary phase is deposited in the form of a very adherent film on a rigid solid flat surface such as glass or flexible such as aluminum or plastic.
  • the most used stationary phases are silica gel and cellulose powder. Depending on its nature, this phase acts as an adsorption phase or as a liquid support, which allows the implementation of variable separation phenomena.
  • the samples are deposited in small quantities on the plate and the latter is deposited in a tank in the presence of the mobile phase. This phase will then migrate through the stationary phase essentially by capillarity causing more or less rapidly different compounds of the mixture. The migration speed depends in fact on the affinity of the component for the stationary phase on the one hand, and on the other hand, its solubility in the mobile phase.
  • the migration was stopped 1.5 cm from the top edge, then the plate was dried and optionally treated with the appropriate developer (NEU: 2- aminoethyl diphenyborinate and PEG polyethylenglycol) before being observed under light or UV.
  • NEU 2- aminoethyl diphenyborinate and PEG polyethylenglycol
  • the identification of phenolic compounds has been made possible by the use of different standards (alizarin, aucubine, isoquercitrin, 1-kaempferol, kaempferol-3-glucoside, rutin, morine and quercetin).
  • the equipment used is a Waters chain (Millipore Corp. Milford, USA), comprising a loop injector, two model 510 high pressure pumps, an automatic gradient controller, a column oven, a Waters Model 990 diode array detector. with data processing software.
  • the separation was carried out at 40 ° C. on a 100 RP-18 column (inverse phase) (Merk, Lichspher), 5 ⁇ particle size, dimensions 4x250 mm. 20 ⁇ l of extract were injected and the elution was carried out by a gradient of the solvents A (100% acetonitrile) and B aqueous solution with 3% of formic acid whose characteristics are reported in Table II.
  • the detection was carried out at 350 nm and the concentrations of scopoletin, rutin and quercetin were determined by means of standard ranges made for each constituent between 20 and 50 ⁇ g / ml in a methanol mixture (50:50, v / v).
  • the identification and quantification of the aromatic components was performed using a Hewlett-Packard 6890 gas chromatograph coupled to a Hewlett-Packard 5973 mass spectrometer operating in electronic impact mode.
  • the column used is a DB-Wax capillary column (60 m ⁇ 0.32 mm, 0.25 ⁇ phase thickness, J / W Scientific, Folsom, CA, USA).
  • the injection conditions are as follows: Source temperature: 230 ° C, Quadrupole temperature: 150 ° C, Energy: 70 eV Oven temperature: 40 ° C for 3 minutes, then 3 ° C.min "1 up to at 250 ° C, finally 20 min at 250 ° C, carrier gas: He at 1, 1 ml.min -1 .
  • MIA alcohol insoluble materials
  • the method is based on the insolubility of the parietal polysaccharide components in 80% ethanol (v / v) and separates them from cytoplasmic and vacuolar constituents (Selvendran, 1975).
  • the samples (100 g of noni mash) were mixed with 400 ml of 95% ethanol boiling to inhibit endogenous enzyme activities (pectin methyl esterases, polygalacturonases) and to eliminate low molecular weight constituents such as soluble sugars ( glucose, fructose, sucrose), organic acids (tartaric acid, citric acid) and pigments.
  • the mixture was kept boiling for 30 minutes in order to inhibit the endogenous enzymatic activities and then was filtered on a No. 3 sieve.
  • the recovered precipitate was then washed with two volumes of 80% ethanol, then two volumes of absolute ethanol, two volumes of acetone and finally one volume of ether.
  • the final precipitate was dried at 60 ° C for 3 hours and then completely dehydrated in a vacuum oven at 55 ° C overnight.
  • the product was then pulverized and stored at -20 ° C.
  • MIA was washed with water at 5 ° C until there were no more sugars (negative anthrone test).
  • the water-insoluble precipitate was dried by lyophilization (MIA-E).
  • the wash water which contains the soluble pectins was also dried by lyophilization.
  • the lyophilisates obtained were then pulverized and stored at -20 ° C.
  • the polysaccharides are hydrolysed into neutral sugars formed by furfuric derivatives with the anthrone (9,10-hydro-9-oxoanthracene).
  • the latter condense with anthranol to form a blue-green compound with an absorption maximum of 625 nm (Dubois et al., 1956).
  • 10 mg of the samples (MIA, MIA-E, MIA-E enzymatically treated and enzymatic cocktails) were prepared by the addition of 10 ml of a pH 4.6 buffer solution.
  • samples enzymatically treated 100, 150 and 200 ⁇ . ⁇ 1 of an enzymatic cocktail were added.
  • the products obtained were then incubated with stirring at 30 ° C. for 60 minutes.
  • the enzymes were then inactivated by immersion in a water bath at 80 ° C for 2 minutes.
  • the products are filtered and stored at -20 ° C. until their analysis which was carried out according to the following protocol.
  • the filterability test makes it possible to rapidly identify the activity of the enzymatic mixture on the noni mash. 7 commercial enzyme mixtures
  • the mash of ripe noni was obtained using a refiner with a sieve of 1 mm. 1 kg of noni puree was mixed with 200 ⁇ kg- 1 of the enzyme cocktail and left at room temperature for 60 minutes, then the puree was placed in a filter bag and the volume of filtrate recovered in 25 minutes. This volume is proportional to the activity of the enzyme cocktail tested.
  • Figure 4 represents the protocol followed for the determination of the filterability of the samples. 1.13.2. Determination of the concentration and the optimal time of action of the enzyme mixture
  • Table IV First experimental plan for the determination of the concentration and the optimal time of action of the selected enzyme mixtures.
  • Fresh noni juice was produced from ripe noni fruit recovered three days after harvest.
  • the fruits were washed and disinfected with a chlorine solution at 200 mgl "1 and then pulped using a refiner with a 2.5 mm sieve.
  • the paste was treated with 200 ⁇ . 1 Product Commercial Klerzyme®-DSM for 150 minutes at room temperature The treated puree was then filtered through fabric and the resulting juice was stored at -20 ° C ( Figure 5).
  • Microfiltration tests were conducted with tangential microfiltration pilot equipment installed at CITA-UCR in Costa Rica ( Figure 6).
  • the pilot includes a 200 liter capacity feed tank connected to the feed pump. It is equipped with a micro filtration ceramic membrane (P19 40 membralox multichannel tube marketed by Pall Exekia). This ⁇ -alumina membrane has a mean pore diameter of 0.2 ⁇ , a total filtering area of 0.22 m.
  • the tests were carried out at a tangential speed (U) of 7 ms -1 , a temperature of 35 ° C. and a working volume of 50 l of enzymatically pre-treated noni juice The dead volume of the plant is 3, 9 1.
  • the feed tank was filled with 50 liters of noni juice, and the installation was fed continuously. Filtration was performed with continuous permeate extraction and continued until the retentate volume was equal to the dead volume of the plant.
  • V a is the volume of feed
  • V r is the volume of the retentate
  • V p is the volume of the permeat. I.14.3. Determination of turbidity
  • Turbidity of each sample was determined using a Hach 2100 AN turbidimeter (Hach Co., Loveland, CO). The results are reported in NTU units.
  • Table VII below shows the evaluation of the concentration of total phenols and vitamin C and the determination of antioxidant activity (ORAC) in noni fruits during ripening and senescence.
  • c ORAC is the absorbance capacity of the oxygen radical and is expressed in ⁇ of Trolox ® per gram of fresh seedless pulp
  • Figure 7 shows the evolution of the concentration of scopoletin and rutin in noni fruits during ripening and senescence.
  • the values presented are the means and standard deviations of three samples analyzed independently. a ' b ' °
  • the values in the columns followed by the same letter are not significantly different at P ⁇ 0.05 (Duncan's test).
  • Ripe fruit coconut, ethyl floral octanoate, oil
  • 2,3 fruity butanediol 1557 iss3 -0,92 8 (4,1) 11,82 (3,9) 4,37 (1,1) 1,80 (0,6) 6,24 (2,2) 5 , 84 (1-4 (1,5), 70 (2,3)
  • IR Kovats index DB-WAX
  • Kl * Kovats indices of the literature
  • Log P partition coefficient of the octanol-water of the literature
  • carboxylic acids and more particularly the hexanoic acid and octanoic acid represent the majority of volatile compounds (Table VIII). These two carboxylic acids represent 70% of the aromatic compounds present in the noni mature and about 45% of all the aromatic compounds present in the samples of noni during the period of senescence. The presence of these short-chain fatty acids explains the unpleasant smell, especially present in the ripe fruit. Descriptors of the smell of these two compounds, characterize them as unpleasant, rancid, oily and aged cheese smell. At the beginning of senescence, the concentrations of hexanoic acid and octanoic acid decrease slightly, but at the end of this period they increase again.
  • Esters of hexanoic and octanoic acid represent the major fraction of the esters found in non-mature and in the noni during the senescence. However, it is in the noni ripe that we find the highest concentration of these esters, a decrease in their concentration is observed during senescence (Table VIII). In addition, hexanoate and hexyl octanoate concentrations increased significantly during senescence, probably due to their production by natural metabolic pathways of the aging process.
  • Alcohols are volatile compounds found in noni especially during the period of senescence.
  • concentration of 1-hexanol increases significantly from 4.6 pulp in mature noni to about 116 g / g pulp in noni during senescence. That of 3-methyl-3-buten-1-ol rose from 22 g / g of pulp in noni ripe to 99 ⁇ g / g of pulp in the noni during senescence.
  • pectinolytic enzymes were added to improve juice production and facilitate its clarification.
  • the enzymatic pretreatment of the juices makes it possible to reduce both the viscosity to facilitate the post-filtration treatments; depectinization is therefore necessary to increase the flux when applying the membrane clarification technique.
  • the enzymatic cocktail to be preferred should contain significant amounts of pectinase (polygalacturonase and / or pectin-lyase) and cellulase (endo-cellulase and / or ex cellulases).
  • Figure 10 shows the volume of noni juice obtained during 25 minutes of filtration after the enzymatic treatment (200 ⁇ l of enzymatic mixture.kg "1 noni pulp for 60 minutes at room temperature) (the numerical values represent the increase in volume relative to the volume of the untreated control).
  • Table IX Yields of noni juice obtained in 25 minutes of filtration after enzymatic treatment with the tested cocktails (results of the second experimental plan).
  • the yield versus enzyme concentration analysis used and the incubation time allowed to establish the graph of Figure 11 which represents the response surface of the yield of the Klerzyme enzyme cocktail.
  • -150 ® in relation to the concentration and activity time in the pulp of noni ripe.
  • the juice yield of this first step was high (82%), the rejections corresponding essentially to the seeds and pulp residue adhering to them.
  • the recovered pulp was added with enzymes (200 ⁇ kg -1 Klerzyme-150 ® ) and left for 150 minutes at room temperature (28 ° ⁇ 1 ° C) and then pressed to obtain the microfilter juice.
  • the juice yield of this second stage was 73%, The total production yield of ripe noni juice treated enzymatically was 60% (Table XII below).
  • Step 1 recovery of the pulp 82 (2)
  • Step 2 enzymatic treatment of the pulp 73 (5)
  • the average supply temperature is set at 35 ° C.
  • the tangential velocity has been fixed here at 5 ms _1 .
  • the transmembrane pressure which is also an important factor for the performance of the microfiltration process, varied according to the experiments carried out. Table XIII summarizes the operating conditions of microfiltration tests carried out.
  • the values of the fluxes obtained for the three tests carried out at different Ptm are between 100 and 160 lh -1 m -2 . These values are important and much higher than those obtained during MFT trials with other fruits.
  • VRF Volume Reduction Factors
  • Green and healthy fruits were collected manually, then washed with drinking water and disinfected by immersion in a solution of sodium hypochlorite (200 ppm / 5 min).
  • the fruits were then stored at room temperature (25 ° C) for 3 days, during which time the fruit develops a whitish translucent color.
  • the fruits are then pulped with a rotating sieve (2 mm) to remove seeds and coarse fibers.
  • the puree obtained from noni is then macerated with commercial enzymes (dose of 50 and 200 ml / ton of puree) for a time of between 30 and 150 minutes and at a temperature between 30 and 50 ° C.
  • the macerated mash is then pressed into a filter press at a pressure between 2 and 10 bar.
  • the pulpy juice obtained is then microfiltered using semi-industrial equipment consisting of tubular ceramic membranes of 0.2 m 2 (Membralox®, Pall) and pore diameter of 0.2 ⁇ .
  • the transmembrane pressures used range between 1 and 3 MPa, the tangential velocity is around 5 ms -1 and the temperature is controlled between 30 and 40 ° C.
  • the permeate flow is maintained around 150 l / hm 2 for 2 MPa of transmembrane pressure up to a volume reduction factor of 10 corresponding to a microfiltered juice yield of 90% relative to the initial volume of juice This yield is obtained after one hour and a half of filtration.
  • the filtrate is extracted from the retentate (fiber-rich puree) at the rate of approximately 15 lh “ .m “ of filter surface and at the same time 150 lh “ .m “ of microfiltered clarified juice is extracted.
  • Extraction and continuous feeding can last several hours.In total the microfiltration equipment is fed continuously with 165 lh “ .m “ of pulpy juice coming from the filter press. The juice aseptically taken out of the filtration module is then you are conditioned in a glass bottle. Optionally it can be pasteurized. In both cases, a quarantine period is observed to check the quality of the bottled juice before marketing. Quality of the juices obtained by the process
  • Table XVI Determination of antioxidant potency, polyphenol content, L-ascorbic acid, scopoletin and rutin in feed juice, permeate and retentate at different Ptm.
  • compounds with a high log P octanol-water partition coefficient
  • esters such as esters: methyl decanoate, hexyl decanoate, butyl hexanoate, hexyl butanoate, methyl octanoate, ethyl octanoate and the acids Hexanoic, octanoic and decanoic are concentrated in the retentate, whereas compounds with a low Log P, such as alcohols and some acids and esters are not retained by the membrane.
  • the retention of compounds with high log P thus low polar can be explained by hydrophobic interactions between these compounds and the pulp retained by the membrane.
  • the MFT favorably modifies the composition of volatile compounds by allowing the reduction of compounds that give unpleasant odors.
  • Sensory analysis tests show, also a modification felt as positive compared to fresh juice.
  • Herbaceous 3-methyl-2-buten-1-ol 1268 1324 1.17 4.85 (1.08) 4.16 (0.20) 4.68 (1.24) 4.07 (0.87) 3.92 (1.62) 4.96 (0.39) 4.38 (0.42) 4.27 (0.32) 5.49 (0.82) resiniferous, flower,
  • benzyl alcohol roast 1838 1822 1.1 1.66 (0.39) 1.29 (0.37) 1.07 (0.52) 1.24 (0.48) 1.29 (0.83) 1.22 (0.62) 1.48 (0.14) 1.35 (0.28) 1.06 (0.21) ethyl phenyl alcohol 1873 1859 1 , 36 0.81 (0.20) 0.91 (0.14) 0.65 (0.22) 0.71 (0.09) 0.79 (0.29) 0.62 (0.18) 0.72 (0.07) 1.02 (0.24) 0.48 (0.15)
  • IR Kovats index DB-WAX
  • Kl * Kovats indices of the literature
  • Log P partition coefficient of the octanol-water of the literature

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de jus de noni comprenant les étapes de : a) broyage de fruits de noni lorsqu'ils sont au stade de maturité blanc translucide pour produire une purée de fruits de noni; b) traitement enzymatique de ladite purée de fruits de noni avec une préparation enzymatique présentant au moins une activité pectinase et au moins une activité cellulase à une teneur comprise entre 50 à 200 ml ou g/tonne de purée de fruits de noni à une température comprise entre 20 et 55°C pendant au moins 30 minutes; c) élimination de la pulpe et des graines présentes dans les fruits de noni par pressage de ladite purée conduisant à un premier jus; d) tamisage ou filtration grossière dudit premier jus obtenu à l'issue de l'étape c) conduisant à un second jus; e) microfïltration ou ultrafiltration tangentielle; la présente invention se rapporte également au jus de noni susceptible d'être obtenu par le procédé qui précède et tel qu'il présente une teneur en acide octanoïque inférieure à 200 de jus de noni et une teneur en acide hexanoïque inférieure à 200 μg/g de jus de noni.

Description

Procédé de préparation de jus de Noni
La présente invention se rapporte au domaine de la préparation de jus de noni et de son utilisation pour la santé humaine et animale.
Le nono ou pomme-chien (Morinda citrifolia) est un arbre tropical de la famille des Rubiaceae ; il donne des fruits (noni) moins d'un an après sa plantation (Figure 1) ; ils sont reconnaissables à leur odeur acre et leur goût amer. L'arbuste atteint sa pleine maturité à deux ans, et fournit jusqu'à 8 kg de fruits par mois, tout au long de l'année. Le mûrissement de ses fruits se caractérise par l'évolution de leur couleur (Figure 2) : ils sont verts (cliché 1 de la Figure 2), puis jaunes, et deviennent blanchâtres (cliché 2 de la Figure 2) lorsqu'ils sont mûrs ; s'ils conservés davantage, ils deviennent marron clair au bout d'une à trois semaines (cliché 3 de la Figure 2), marron foncé après 4 à 6 semaines de conservation (cliché 4 de la Figure 2) puis marron noir après 7 à 8 semaines (cliché 5 de la Figure 2).
Compte tenu de l'intérêt que présente le noni pour la santé, il est préparé et vendu sous forme de jus ; c'est un remède traditionnel utilisé pour le traitement de multiples désordres incluant le diabète, les troubles cardiaques, l'hypertension ; ses vertus thérapeutiques sont attribuées à la présence d'un précurseur d'un alcaloïde, la xéronine, à ses propriétés antioxydantes et à sa teneur en polyphénols variés.
Traditionnellement, le jus est obtenu par écoulement spontané lors de la conservation (sénescence) des fruits murs. Le jus ainsi préparé présente cependant l'inconvénient d'avoir une odeur très désagréable et une durée de conservation limitée à cause de sa fermentation.
Plusieurs documents décrivent l'intérêt d'utiliser des extraits de noni tels que son jus pour des applications thérapeutiques variées : la Demande WO 02/45734 comme anti-douleur et anti-inflammatoire, la Demande WO 2009/006565 pour inhiber la croissance de bactéries anaérobies gram-, protozoaires et autres microbes et la Demande US 2008/0206376 pour traiter l'hypertension. Les extraits utilisables pour ses applications sont par exemple des décoctions ou des infusions de feuilles, ou encore de la pulpe ou du jus de noni. Lorsqu'il s'agit de jus, il est préparé par filtration (décanteur-centrifugeuse, filtre presse ou filtration par osmose inverse) avec un seuil de coupure compris entre 1 et 2000 μιη (WO 02/45734 et WO 2009/006565) voire 0,01 à 2000 μηι (US 2008/0206376). Les jus ainsi obtenus sont ensuite pasteurisés. Ces procédés ne permettent toutefois pas de supprimer l'odeur désagréable du jus.
Afin de remédier à cet inconvénient, le brevet américain US 5,288,491 propose de préparer des extraits de noni sous forme de poudre ; mais ce mode de préparation altère les composés actifs du noni.
La Demande FR 2 783 137 décrit la préparation d'une composition à base de noni qui consiste à cueillir le fruit à un stade de mûrissement qui correspond au moment où la couleur du fruit vire du vert au jaune blanchâtre, puis les fruits sont lavés et broyés dans une broyeuse-centrifugeuse, la pulpe est ensuite pressée pour récupérer le jus, le jus obtenu est filtré sur tamis fin puis traité par dépectinisation dans le but d'obtenir un jus clair ; le jus est ensuite pasteurisé. L'inconvénient de cette méthode est que le rendement en jus obtenu en pressant précocement les fruits est faible.
Il demeure donc le besoin de préparer, avec un rendement satisfaisant, un jus de noni présentant des qualités nutritionnelles et thérapeutiques aussi bonnes que celles du jus de noni préparé traditionnellement mais avec des qualités organoleptiques améliorées et ayant une meilleure durée de conservation.
La Demanderesse a ainsi mis au point un nouveau procédé de préparation de jus de noni désodorisé présentant une bonne stabilité microbiologique et dont la composition biochimique en composés polyphénoliques est conservée par rapport au jus de fruit préparé selon la méthode traditionnelle préservant ainsi les vertus thérapeutiques dudit jus.
La présente invention se rapporte donc à un procédé de préparation de jus de noni comprenant les étapes de :
a) broyage de fruits de noni lorsqu'ils sont au stade de maturité blanc translucide pour produire une purée de fruits de noni ;
b) traitement enzymatique de ladite purée de fruits de noni avec une préparation enzymatique présentant au moins une activité pectmase, correspondant à une activité polygalacturonase (EC 3.2.1.15) supérieure à 4 ULml"1 et/ou une activité pectine- lyase (EC 4.2.2.10) supérieure à 3 ULml"1, et au moins une activité cellulase correspondant à une activité endo-cellulase (EC 3.2.1.4) supérieure à 20 ULml"1 et/ou activité exo cellulases (EC 3.2.1.91) supérieure à 4 ULml"1, à une teneur comprise entre 50 à 200 ml ou g/tonne de purée de fruits de noni à une température comprise entre 20 et 55°C pendant au moins 30 minutes ; c) élimination de la pulpe et des graines présentes dans les fruits de noni par pressage de ladite purée conduisant à un premier jus ;
d) tamisage ou filtration grossière dudit premier jus obtenu à l'issue de l'étape c) conduisant à un second jus ;
e) microfiltration ou ultrafiltration tangentielle sur membrane céramique tubulaire de seuil de coupure inférieur ou égal à 0,5 μιη dudit second jus obtenu à l'issu de l'étape d).
Les activités enzymatiques sont exprimées en UI, c'est-à-dire en micromoles de groupements réducteurs libérés à partir du substrat ; ledit substrat étant l'acide polygalacturonique pour l'activité polygalacturonase (EC 3.2.1.15) ; la pectine citrique estérifiée 80% pour l'activité pectine-lyase (EC 4.2.2.10) ; la carboxyméthyl- cellulose pour l'activité endo-cellulase (EC 3.2.1.4) et la cellulose cristalline pour l'activité exo-cellulase (EC 3.2.1.91) et les conditions expérimentales standards sont respectivement les suivantes : pH 4, à 30°C ; pH 6 à 40°C ; pH 4,6 à 38°C et pH 4,8 à 50°C.
De façon préférée :
- les fruits du noni sont lavés et désinfectés avant l'étape a) de broyage ; la désinfection peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple, avec une solution aqueuse de chlore ou une solution d'hypochlorite de sodium ;
- l'étape b) de traitement enzymatique est réalisée sous agitation ;
- l'étape c) de pressage peut être réalisée par tout moyen, par exemple, à l'aide d'une presse à paquet, d'une presse à vis, d'une presse à bande, etc. ;
- l'étape d) de tamisage ou filtration grossière peut être par exemple réalisée avec un tamis de 1,5 mm. Cette étape permet avantageusement de diminuer la turbidité du jus obtenu après pressage. La turbidité est définie comme la réduction de la transparence d'un liquide due à la présence de matières non dissoutes ; dans le cas présent, elle est inférieure à 2000 NTU à l'issue de l'étape d) (Nephelometric Turbidity Unit, dont la mesure s'effectue sur la lumière diffusée avec un angle de 90° par rapport à l'échantillon à évaluer et à une longueur d'onde de 860 nm).
L'étape de traitement enzymatique conduit à la liquéfaction de la purée de fruits de noni ; elle permet d'utiliser des fruits à un stade maturité précoce au cours duquel le fruit n'a pas encore développé d'odeur trop forte ; elle permet également d'augmenter la fraction de jus récupéré et ainsi le rendement de production de jus. Cette étape peut être réalisée avec un mélange enzymatique, éventuellement commercial, conçu pour hydrolyser les parois des fruits et faciliter le pressage et sélectionné pour ses activités enzymatiques pectinase et cellulase ; de telles préparations peuvent notamment être sélectionnées comme décrit à l'exemple 1.13.
5 A titre d'exemple, les préparations enzymatiques pourront présenter toute ou partie des activités enzymatiques suivantes dans les gammes d'activité indiquées (exprimées en UI, μηιοΐββ de produits/min), étant entendu que lesdites préparations présentent au moins les activités pectinase et cellulases telles que définies précédemment :
Figure imgf000005_0001
Ces préparations peuvent être utilisées à une concentration comprise entre 50 et 300 ml/tonne de fruits, de préférence 200 ml/tonne de fruits, et entre 120 et 200 minutes de macération, de préférence 150 minutes, avec une faible agitation.
L'étape e) de micro- ou d'ultrafiltration permet de retenir totalement les composés insolubles et les formes végétatives des microorganismes et leurs spores ; elle permet également de retenir les acides gras volatils hydrophobes à chaîne longue responsables de l'odeur désagréable du jus de noni.
L'étape de microfiltration peut être mise en œuvre avec des membranes en céramique (par exemple, en alumine zircone) ou des membranes organiques avec un diamètre de pores compris entre 0,05 et 0,5 μ pour les membranes de microfiltration et un seuil de coupure compris entre 10 et 50 kD pour les membranes d'ultrafiltration ; cette étape est de préférence conduite en appliquant une pression transmembranaire comprise entre 0,5 et 3 bars, de préférence entre 1 et 1,5 bar.
Enfin, le jus ainsi obtenu est préférentiellement conditionné aseptiquement ; il présente alors une durée de vie d'au moins 1 an.
Un contrôle de la qualité nutritionnelle du jus ainsi obtenu montre que sa composition biochimique en composés non volatils n'est pas altérée et que le jus conserve toutes ses vertus thérapeutiques. En particulier, le procédé selon l'invention n'affecte pas la composition en composés phénoliques présents dans le jus initial ainsi que son pouvoir antioxydant.
En outre, ce procédé permet avantageusement de réduire la teneur en acides gras volatils responsables de la mauvaise odeur du jus de noni (en particulier de l'odeur de rance) de 50 â 70 % en poids par rapport à leur teneur initiale. Ainsi, la sénescence ou le vieillissement pratiqué traditionnellement en vue de l'obtention du jus de noni apparaît inutile voire même préjudiciable pour les qualités organoleptiques des jus (développement d'une odeur très forte). L'utilisation de préparations enzymatiques, notamment de mélanges commerciaux, remplace de façon avantageuse l'action très lente des enzymes naturelles du fruit sur la liquéfaction des parois cellulosiques.
La présente invention se rapporte encore au jus de fruit de noni obtenu par le procédé selon l'invention. Plus spécifiquement, la présente invention se rapporte à un jus de noni qui se caractérise par une faible teneur en composés indésirables responsables d'une odeur désagréable ; en particulier, une teneur en acide octanoïque (ou caprylique) inférieure à 200 μg/g, de préférence, inférieure à 180 μg/g de jus de noni, et une teneur en acide hexanoïque inférieure à 200 μg/g, de préférence, inférieure à 190
Figure imgf000006_0001
de jus de noni. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ce jus se caractérise en outre par une teneur en acide 2-méthyle propanoïque inférieure à 6 μg/g de jus de noni et/ou une teneur en acide décanoïque inférieure à 1 μg/g de jus de noni.
Figures
La Figure 1 représente deux clichés de fruits de noni verts récoltés dans la plantation de l'Université EARTH, Costa Rica.
La Figure 2 regroupe plusieurs clichés qui illustrent l'évolution de la couleur de Pépicarpe du noni pendant sa maturation et sa sénescence.
La Figure 3 représente le schéma méthodologique de détermination des polyphénols totaux et de la vitamine C (A, obtention des différents extraits; B, protocole de Folin-Ciocalteu optimisé).
La Figure 4 représente le protocole suivi pour la détermination de la filtrabilité des échantillons.
La Figure 5 représente le schéma du flux de procédé suivi pour l'obtention de jus de noni traité enzymatiquement ; il s'agit du jus utilisé pour la microfiltration tangentielle.
La Figure 6 est un schéma du pilote de microfiltration tangentielle ; légende : 1. Pompe d'alimentation, 2. Pompe de circulation, 3. Module de microfiltration, 4. Echangeur thermique, 5. Manomètre, 6. Débitmètre.
La Figure 7 est un histogramme montrant l'évolution de la concentration de scopolétine et de rutine dans les fruits de noni pendant le mûrissement et la sénescence. Les valeurs présentées sont les moyennes et les écarts types de trois échantillons analysés d'une façon indépendante. a'b'° Les valeurs dans les colonnes suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes à P < 0.05 (Test de Duncan).
La Figure 8 représente le chromatogramme CG-MS des composés aromatiques trouvés dans la pulpe de noni mûr. Les composés identifiés avec des numéros correspondent sont ceux trouvés en plus grande concentration (légende : 1 : acide hexanoïque méthyle ester, 2 : acide hexanoïque éthyle ester, 3 : acide octanoïque méthyle ester, 4 : acide octanoïque éthyle ester, 5 : acide hexanoïque, 6 : acide octanoïque).
La Figure 9 regroupe trois graphiques représentant l'évolution de quelques composés volatils identifiés dans la pulpe de noni pendant la sénescence (A : Acide hexanoïque et acide octanoïque, B : Esters des acides hexanoïque et octanoïque, C : alcools et acide acétique).
La Figure 10 illustre le volume de jus de noni obtenu au cours de 25 minutes de filtration après traitement enzymatique (200 μΐ de mélange enzymatique.kg"1 pulpe de noni pendant 60 minutes à température ambiante) ; les valeurs numériques représentent l'augmentation de volume par rapport au volume du témoin non traité.
La Figure 11 est la représentation graphique de la surface de réponse du rendement du mélange enzymatique Klerzyme-150® en relation à la concentration et temps d'activité dans la pulpe de noni mûr.
La Figure 12 est un graphe représentant l'effet de trois valeurs de pression transmembranaire sur le flux pendant la microfiltration de jus de noni.
Exemples
I. MATERIELS ET METHODES
1.1. Matériel végétal
Les fruits de noni utilisés proviennent de la plantation expérimentale de l'Université EARTH (Escuela de Agricultura de la Région Tropical Humeda), Limon, Costa Rica. Cette Université est localisée en zone tropicale humide entre 100 et 150 m d'altitude, la température varie entre 25 et 30°C et l'humidité entre 80 et 90%. Les fruits ont été récoltés au stade de maturité « vert » (épiderme vert clair jaune pâle, texture très dure, odeur légère) (Figure 1).
1.2. Préparation des échantillons pour l'étude de vieillissement
Les fruits verts (noni vert) ont été lavés et désinfectés avec une solution de chlore à 200 mg.l"1 et stockés dans des containers fermés à température ambiante. Trois jours après, les fruits sont parvenus à maturité et un deuxième échantillon de noni mûr est alors prélevé. A partir de ce jour-là, un échantillon est prélevé chaque semaine et ce jusqu'à la huitième semaine (Figure 2, Tableau I).
Tableau I. Caractéristiques des échantillons utilisés
Nom Type échantillon Caractéristiques
échantillon
Noni vert Noni vert (fruit récolté) Vert clair - jaune pâle, très dur, odeur légère
Noni mûr Noni mûr (3 jours après la récolte) Translucide - grisâtre, mou, odeur forte
Noni 1 Noni à une semaine de stockage Marron clair, mou, odeur forte
Noni 2 Noni à deux semaines de stockage Marron clair, très mou, odeur plus forte
Noni 3 Noni à trois semaines de stockage Marron, très mou, odeur très forte
Noni 4 Noni à quatre semaines de stockage Marron foncé, très mou, odeur très forte
Noni 5 Noni à cinq semaines de stockage Marron foncé, très mou, odeur très forte
Noni 6 Noni à six semaines de stockage Marron foncé, très mou, odeur très forte
Noni 7 Noni à sept semaines de stockage Marron-noir, très mou, odeur très forte
Noni 8 Noni à huit semaines de stockage Marron-noir, très mou, odeur très forte
1.2.1. Préparation de la purée de noni
La purée a été obtenue à partir de la pulpe des fruits séparée manuellement des graines et broyée avec un Warring Blendor pendant 3 minutes. Pour les analyses où l'échantillon frais était requis, la pulpe a été conservé à 5°C. Pour les autres mesures, la pulpe a été congelée à l'azote liquide et lyophilisée. Les échantillons ont été conservés à -20°C.
1.3. Analyses chimiques
1.3.1 pH
Le pH a été mesuré avec une électrode de verre et un pH-mètre (Model 530) par la méthode officielle (AOAC, 1990) sur une fraction aliquote de jus obtenue par filtration de la purée sur papier N° 4.
1.3.2 Extrait sec soluble (°Brix)
La concentration en extrait sec soluble a été mesurée par réfractométrie. La déviation de l'angle lumineux est rapportée à la teneur en éléments solubles présents dans le milieu. Les sucres sont les constituants majoritaires de l'extrait sec de la plupart des fruits et l'indice réfractométrique est généralement directement converti en la teneur en sucre du milieu (1 degré Brix = 1 g de sucres pour 100 ml).
L'extrait sec soluble a été mesuré à l'aide d'un réfractomètre Abbe (Milton Roy Company LR45227) sur une fraction aliquote de jus obtenue par fîltration de la purée. La lecture a été effectuée à température ambiante.
1.3.3 Détermination de la matière sèche
La matière sèche des échantillons a été déterminée par gravimétrie. Les échantillons frais ont été pesés avant et après séchage dans une étuve à 50°C pendant 3 h puis une nuit à 60°C dans une étuve sous vide. Les résultats sont exprimés en g.100 g"1 pulpe.
1.3.4 Dosage des protéines
Les teneurs en protéines ont été déterminées par dosage de l'azote par la technique de micro-Kjeldhal (Bietz, 1974). L'azote organique est oxydé en sulfate d'ammonium par l'acide sulfurique concentré à chaud en présence d'un catalyseur approprié. L'azote ammoniacal formé par addition de phénol en milieu alcalin est dosé par colorimétrie suite à l'addition d'hypochlorite de sodium. La coloration bleue due à la formation d'indophénol est mesurée à 630 nm. La teneur en protéines est obtenue en multipliant la teneur en azote par 6,25.
1.4. Analyses microbiologiques
Les analyses microbiologiques ont été réalisées sur de la pulpe des fruits le jour même de sa préparation. Toutes les analyses ont été réalisées en triple.
1.4.1 Flore totale (bactéries mésophiliques)
Le contenu total en bactéries mésophiliques dans le noni a été évalué par la méthode AMCITA-M001 Galerie API « Aérobic Plate Count » décrite par l'AOAC (1998).
1.4.2 Moisissures et levures
Le contenu en moisissures et en levures dans le noni a été évalué par la méthode officielle AMCITA-M007 décrite par l'AOAC (1998).
1.4.3 Bactéries acides lactiques
Le contenu total en bactéries lactiques dans le noni a été évalué par la méthode AMCITA-M022 décrite par Downes et Ito (2001). 1.5. Détermination de l'activité antioxydante
1.5.1. Méthode O.R.A.C. (Oxygen Radical Absorbance Capacity)
Le pouvoir antioxydant des échantillons a été évalué à partir de la mesure de la capacité d'absorption du radical oxygène (ORAC), en présence de fluorescéine utilisée comme indicateur d'attaque du radical péroxyle selon la méthode décrite par Ou et al. (2001) et modifiée par Vaillant et al. (2005).
0,5 g d'échantillon lyophilisé ont été mélangés à 20 ml d'une solution d'acétone/eau (50:50, v/v) et maintenus sous agitation à température ambiante pendant 1 heure. Après filtration sur papier filtre, l'extrait a été dilué 100 fois avec du tampon phosphate 75 mM, pH 7,4. 750 μΐ de cet extrait ont été ensuite incubés pendant 15 min à 37°C avec 1,5 ml de fluorescéine 8,16 x 10~5 M (Sigma, USA) directement dans la cuve du spectrophotomètre (spectrophotomètre Shimadzu RF-1501 équipé d'une lampe de xénon). Puis 750□ μΐ d'une solution à 153 mM d'AAPH (2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride, Wako International, USA) ont été ajoutés. Une mesure de la fluorescence a été réalisée 30 secondes après cet ajout puis, toutes les minutes jusqu'à ce que la valeur de fluorescence soit inférieure ou égale à 10% de la valeur initiale. La longueur d'onde d'excitation a été fixée à 493 nm et la longueur d'onde d'émission à 515 nm. Pendant toute la mesure, la température de la cuve a été maintenue à 37°C. Les résultats sont donnés en équivalents du Trolox® (acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylique) par gramme grâce à une gamme étalon dont les concentrations sont comprises entre 10 à 50 μΜ.
1.5.2. Méthode FTC {Ferrie thiocyanate)
La capacité antioxydante a été déterminée par la mesure de P absorbance d'un complexe coloré généré par la réaction entre le péroxyde et le chlorure ferreux qui forment les ions ferriques. Les ions ferriques réagissent avec le thiocyanate d'ammonium et produisent le thiocyanate ferrique qui donne une couleur rouge. La méthode FTC a été adaptée de la méthode d'Osawa et Namiki (1981) et de Mohd et al. (2002).
Préparation des extraits : 5 g de purée de noni mûr lyophilisée ont été traités avec 30 ml de méthanol à température ambiante pendant 24 heures. Puis, ce mélange a été filtré (filtre n°4) et rincé deux fois avec 20 ml de méthanol. La fraction méthanolique a été évaporée sous vide jusqu'à l'obtention de l'extrait méthanolique d'une texture pâteuse au fond du ballon. Le filtrat a été traité avec 20 ml d'acétate d'éthyle, filtré (filtre n°4) et rincé deux fois avec 10 ml d'eau distillée. La fraction d'acétate d'éthyle a été évaporée sous vide jusqu'à l'obtention d'une texture pâteuse au fond du ballon (extrait d'acétate d'éthyle). Ces extraits sont les échantillons à utiliser pour la méthode FTC et TBA.
4 mg d'échantillon (extrait méthanolique et extrait d'acétate d'éthyle) ont été ajoutés à 4 ml d'éthanol 99,5% (p/v) et mélangés avec 4,1 ml d'acide linoléique à 2,51% dans l'éthanol, 8 ml de tampon phosphate (0,05 M, pH 7,0) et 3,9 ml d'eau distillée. Cette solution a été conservée dans un flacon opaque à l'obscurité à 40°C. 0,1 ml de cette solution a été alors ajouté à 9,7 ml d'éthanol à 75% (v/v) et 0,1 ml de thiocyanate d'ammonium 30% (p/v). Puis 3 minutes après avoir ajouté 0,1 ml de chlorure ferreux 20 mM en acide chlorhydrique à 3,5% (v/v) à ce mélange réactionnel, l'absorbance a été mesurée à 500 nm toutes les 24 h jusqu'à ce que l'absorbance du contrôle atteigne sa valeur maximum. Le contrôle négatif a été fait avec de l'éthanol pur et le contrôle positif avec 4 mg de BHT (SIGMA). Les résultats sont exprimés en différence d'absorbance laquelle est inversement proportionnelle à la capacité antioxydante.
1.5.3. Méthode TBA (Thiobarbituric Acid Test)
La capacité antioxydante des échantillons a été évaluée à partir de la mesure de l'absorbance d'un complexe rouge généré par la réaction entre l'acide thiobarbiturique et le produit obtenu de la péroxydation lipidique (malonaldéhyde) de l'extrait en conditions acides. La méthode TBA a été accomplie selon la méthode adaptée de Kikuzaki et Nakatani (1993), Ottolenghi (1959) et Mohd et al. (2002).
Cette méthode s'applique aux extraits méthanoliques et d'acétate d'éthyle. 1 ml d'échantillon a été ajouté à 2 ml d'acide trichloracétique et 2 ml d'une solution d'acide thioarbiturique 20%. Ce mélange est alors placé dans un bain à 100°C pendant 10 minutes. Après refroidissement, le mélange est centrifugé à 3000 g pendant 20 minutes et l'absorbance du surnageant est mesurée à 532 nm. Les résultats sont exprimés en différence d'absorbance laquelle est inversement proportionnelle à la capacité antioxydante.
1.6. Détermination de la teneur en polyphénols
1.6.1. Détermination de la teneur en polyphénols totaux La teneur en polyphénols totaux a été mesurée par une adaptation de la méthode Folin-Ciocalteu (Georgé et al., 2005) (Figure 3). Pour la préparation de l'échantillon, 0,3 g de noni lyophilisé a été ajouté à 10 ml d'une solution d'acétone/eau (70/30, v/v) et le mélange est maintenu sous agitation pendant 10 minutes avec un agitateur magnétique. La suspension a été ensuite broyée à l'aide d'un ultra-turax pendant 2 minutes puis agitée pendant 5 minutes avant d'être filtrée sur papier filtre N° 1. Ce filtrat est alors appelé extrait brut. Une fraction aliquote de 50 μΐ d'extrait brut a été ajoutée à 450 μΐ de méthanol contenu dans un tube à essai flacon. 2,5 ml de réactif de Folin (dilué 10 fois avec de l'eau distillée) ont été ajoutés et l'ensemble a été laisser à incuber 2 min à température ambiante. Ensuite, 2 ml d'une solution de carbonate de sodium (75 g.l"1) ont été ajoutés et l'ensemble a été placé 15 min dans un bain marie à 50°C. L'absorbance a été mesurée à 760 nm après refroidissement complet dans un bain d'eau glacé. Les résultats sont donnés en équivalents d'acide gallique (EAG) par 100 grammes grâce à une gamme étalon dont les concentrations d'acide gallique sont comprises entre 0 et 100 mg.l"1 (équation de la droite d'étalonnage = 0.021, R2 = 0,98).
Pour éliminer les interférences liées à la présence d'acide ascorbique et certains sucres dans l'extrait brut, 500 μΐ d'extrait brut sont mélangés avec 3500 μΐ d'eau et 500 μΐ de cette solution ont été déposés sur une cartouche OASIS® et rincés deux fois avec 2 ml d'eau distillée. La cartouche retient les composés phénoliques alors que les autres composés réducteurs sont élués par le lavage à l'eau. 500 μΐ de cette solution aqueuse sont alors traités comme l'extrait brut avec le réactif de Folin. Par conséquent, pour trouver la concentration réelle en polyphénols, il faut soustraire l'interférence au contenu total de polyphénols.
1.6.2. Dosage de l'acide ascorbique
Le dosage de l'acide ascorbique et de l'acide déhydroascorbique a été réalisé par CLHP d'après un protocole adapté de celui décrit par acem et al. (1986). L'analyse a été réalisée sur de la purée fraîche le jour même de sa préparation. Les échantillons ont été mis à l'abri de la lumière.
L'extraction des acides ascorbique et déhydroascorbique a été réalisée avec une solution d'acide métaphosphorique et d'EDTA pour éviter l'oxydation liée à l'air et à la lumière. 5 g de purée de noni ont été mélangés avec 40 ml d'une solution de dilution préparée par mélange en part égale d'une solution à 3% d'acide métaphosphorique et 8% d'acide acétique préparée dans l'eau et d'une solution renfermant 3,6 g.l"1 d'EDTA dans l'eau. Après 30 minutes d'agitation suivies d'une heure de repos, le mélange a été centrifugé à 2500 g pendant 5 min. Le surnageant et les lavages du culot réalisés avec la solution de dilution ont été transférés dans une fiole jaugée dont le volume a été ajusté à 100 ml. Cette solution a été microfiltrée sur une membrane de 0,45 μπι et 10 μΐ ont été injectés en CLHP (colonne Cl 8 Alltech Econosphera, granulométrie 5 μηι, 4,6 x250 mm, débit d'élution 0,7 ml.min 1 avec KH2P04 0,1 mol.l"1 (13,60 g.l"1) ajusté à pH 2,50 avec de l'acide phosphorique, température 40°C). L'acide ascorbique est détecté en sortie de colonne par spectrophotométrie UV (254 nm) et l'acide déhydroascorbique est détecté par fluorescence (430 nm de longueur d'onde d'émission, 350 nm de longueur d'onde d'excitation).
Les résultats ont été exprimés en mg.l"1 d'acide ascorbique et en mg.l"1 d'acide déhydroascorbique grâce à l'utilisation de gammes d'étalonnage de 10 à 200 mg.l"1 d'acide.
La Figure 3 représente le schéma méthodologique de détermination des polyphénols totaux et de la vitamine C (A, obtention des différents extraits; B, protocole de Folin-Ciocalteu optimisé).
1.7. Identification de composants phénoliques dans le noni par chromatographie sur plaque ou chromatographie sur couche mince
En chromatographie sur couche mince, la phase stationnaire est déposée sous la forme d'un film très adhérent sur une surface plane solide rigide comme le verre ou flexible comme l'aluminium ou le plastique. Les phases stationnaires les plus utilisées sont le gel de silice et la poudre de cellulose. Selon sa nature, cette phase agit comme une phase d'adsorption ou comme un support de liquide, ce qui permet la mise en œuvre de phénomènes de séparation variables. Les échantillons sont déposés en faible quantité sur la plaque puis celle-ci est déposée dans une cuve en présence de la phase mobile. Cette phase va alors migrer au travers de la phase stationnaire essentiellement par capillarité entraînant plus ou moins rapidement les différents composés du mélange. La vitesse de migration dépend en effet de l'affinité du composant pour la phase stationnaire d'une part, et d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile.
100 mg d'échantillon lyophilisé ont été mélangés avec 2 ml d'éthanol 80% et homogénéisés dans un bain à ultra-sons pendant 15 minutes. Ce mélange a été ensuite filtré sur papier filtre ou sur du coton puis stocké à 4°C avant d'être déposé (2 à 5 μΐ) sur une plaque de cellulose (Merck 1.05552.0001). La plaque a été ensuite placée dans la cuve à solvant en présence du solvant de travail (acide acétique 2%, solvant D : (CH2Cl2/CH3COOH/H20, 60 :40 :4, v/v/v), acide acétique 15% ou n-butanol/acide acétique/eau (40:10:22, v/v/v)). La migration a été arrêtée à 1,5 cm du bord supérieur, puis la plaque a été séchée et éventuellement traitée avec le révélateur approprié (NEU: 2- aminoéthyle diphényborinate et PEG polyéthylenglycol) avant d'être observée à la lumière ou sous UV. L'identification des composés phénoliques a été rendue possible grâce à l'utilisation de différents étalons (alizarine, aucubine, isoquercitrine, 1-kaempferol, kaempferol-3-glucoside, rutine, morine et quercetine).
1.8. Détermination des composants phénoliques dans le noni par
HPLC
500 mg de poudre de noni lyophilisée et 25 ml de méthanol ont été homogénéisés dans un bain à ultra-sons pendant 1 heure et puis sous agitation pendant 30 minutes. La suspension a été ensuite filtrée et séchée au rotavapor à 40°C. Les composants phénoliques ont alors été récupérés avec 2 ml d'un mélange méthanoheau (50:50, v/v) et microfiltrés sur une membrane de 0,45 μιη. L'extrait récupéré a été stocké à -20°C jusqu'à son analyse par HPLC (Dubber et Kanfer, 2004).
L'appareillage utilisé est une chaîne Waters (Millipore Corp. Milford, USA), comprenant un injecteur à boucle, deux pompes haute pression modèle 510, un contrôleur automatique de gradient, un four à colonnes, un détecteur à barrette de diodes Waters modèle 990 avec un logiciel de traitement de données. La séparation a été réalisée à 40°C sur une colonne 100 RP-18 (phase inverse) (Merk, Lichspher), granulométrie 5 μιτι, dimensions 4x250 mm. 20 μΐ d'extrait ont été injectés et l'élution a été réalisée par un gradient des solvants A (100 % acétonitrile) et B solution aqueuse à 3% d'acide formique dont les caractéristiques sont rapportées dans le Tableau II.
Tableau IL Gradient d'élution de la phase mobile.
Pourcentage du Pourcentage du
Temps (minutes) Débit (ml.min 1) solvant A solvant B
0 15 85 0,7
15 25 75 0,7
33 25 75 0,7
La détection a été réalisée à 350 nm et les concentrations en scopolétine, rutine et quercétine ont été déterminées grâce à des gammes étalon réalisées pour chaque constituant entre 20 et 50 μg/ml dans un mélange méthanoheau (50:50, v/v).
1.9. Détermination des composants aromatiques
Extraction des composants aromatiques
1 g de jus ou purée de noni et 45 μg de n-octanol ont été homogénéisés à l'aide d'un Porter Elvejhem en présence de 50 ml du mélange azéotropique (pentane/éther, 1 :1 v/v) pendant 5 minutes à température ambiante. La phase azéotropique est ensuite récupérée et déshydratée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée à 1 ml sur colonne Vigreux à 37°C. Les extraits ont été stockés à -20°C jusqu'à analyse.
Dosage des composants aromatiques
L'identification et la quantification des composants aromatiques ont été réalisées à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse Hewlett-Packard 6890 couplé à un spectromètre de masse Hewlett-Packard 5973 fonctionnant en mode impact électronique. La colonne utilisée est une colonne capillaire DB-Wax (60 m x 0,32 mm ; épaisseur de phase 0,25 μιη ; J/W Scientific, Folsom, CA, USA). Les conditions d'injections sont les suivantes : Température de la source : 230°C, Température du quadripole : 150°C, Energie : 70 eV Température du four : 40°C pendant 3 minutes, puis 3°C.min"1 jusqu'à 250°C, enfin 20 min à 250°C, Gaz vecteur : He à 1 ,1 ml.min"1.
2 μΐ d'extrait ont été injectés et les composants volatiles ont été identifiés sur leurs spectres de masse (homologie avec le spectre de référence > 90% des bibliothèques de Wiley 275 et MME NIST) et sur leurs indices de rétention linéaires (IRL) calculés à partir d'un mélange de «-alcanes (C5-C3o). Le log P (coefficient de partition de l'octanol-eau) a été obtenu à partir de la littérature. Les résultats ont été exprimes en μg.g"1 pulpe et développés par l'analyse de composés principales (ACP) en utilisant le logiciel XLSTAT Version 2007.1.
1.10. Préparation des matériels insolubles dans l'alcool (MIA)
La méthode est basée sur l'insolubilité des composants polysaccharides pariétaux dans l'éthanol à 80% (v/v) et permet de les séparer des constituants cytoplasmiques et vacuolaires (Selvendran, 1975).
Les échantillons (100 g de purée de noni) ont été mélangés avec 400 ml d'éthanol 95% bouillant pour inhiber les activités enzymatiques endogènes (pectine- méthylestérases, polygalacturonases) et d'éliminer les constituants de faibles masses moléculaires comme les sucres solubles (glucose, fructose, saccharose), les acides organiques (acide tartrique, acide citrique) et les pigments. Le mélange a été maintenu 30 minutes à ébullition afin d'inhiber les activités enzymatiques endogènes puis il a été filtré sur fiitté n°3. Le précipité récupéré a été ensuite lavé par deux volumes d'éthanol à 80%, puis deux volumes d'éthanol absolu, deux volumes d'acétone et enfin un volume d'éther. Le précipité final a été séché à 60°C pendant 3 heures puis entièrement déshydraté à l'étuve sous vide à 55°C pendant une nuit. Le produit a alors été pulvérisé et stocké à - 20°C.
1.11. Préparation de la matière insoluble dans l'alcool et dans l'eau
(MIA-E)
Le MIA a été lavée avec de l'eau à 5°C jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de sucres (test d'anthrone négatif). Le précipité insoluble dans l'eau a été séché par lyophilisation (MIA-E). L'eau de lavage qui contient les pectines solubles a également été séchée par lyophilisation. Les lyophilisais obtenus ont ensuite été pulvérisés et stockés à - 20°C.
1.12. Détermination des sucres (test d'anthrone)
Par chauffage en milieu acide, les polyosides sont hydrolysés en sucres neutres que forment des dérivés furfuriques avec l'anthrone (9,10-hydro-9-oxoanthracéne). Ces derniers se condensent avec l'anthranol pour former un composé bleu-vert dont le maximum d'absorption se situe à 625 nm (Dubois et al., 1956).
10 mg des échantillons (MIA, MIA-E, MIA-E traité enzymatiquement et cocktails enzymatiques) ont été préparés par l'adition de 10 ml d'une solution tampon à pH 4,6. Pour les échantillons traités enzymatiquement 100, 150 et 200 μΙ.Γ1 d'un cocktail enzymatique ont été additionnés. Les produits obtenus ont ensuite été incubés sous agitation à 30°C pendant 60 minutes. Puis les enzymes ont été inactivées par immersion dans un bain-marie à 80°C pendant 2 minutes. Les produits sont filtrés et stockés à -20°C jusqu'à leur analyse qui a été réalisée selon le protocole suivant.
100 μΐ de la solution à tester et 1,15 ml d'eau distillée ont été placés dans un bain d'eau glacée. Puis 2,5 ml de la solution d'anthrone (0,1 g d'anthrone dans 50 ml d'acide sulfurique) ont été ajoutés. Le mélange obtenu a ensuite été placé dans un bain marie porté à ébullition pendant 10 minutes exactement afin de permettre le développement de la couleur. La réaction a été arrêtée en plaçant le mélange dans un bain d'eau glacée pendant 5 minutes. Puis la mesure de l'absorbance à 625 nm a été réalisée. Les résultats sont exprimés en pourcentage grâce à l'utilisation d'une solution étalon de 10 et 50 μg.mΓ1 de glucose. 1.13. Sélection du mélange enzymatique pour la liquéfaction du jus de noni
1.13.1 Test de filtrabilité
Le test de filtrabilité permet d'identifier de manière rapide l'activité du mélange enzymatique sur la purée de noni. 7 mélanges enzymatiques commerciaux
(Tableau III) ont été testés.
Tableau III. Mélanges enzymatiques testés pour la liquéfaction de la pulpe de noni
Mélanges enzymatique Activités enzymatiques dominantes
Rapidase® -citrus UF Pectinase et hémicellulase
Rapidase®-pineapple Hémicellulase
Rapidase®-UF Pectinase
Rapidase®-vegetable juice Pectine cellulase
Clarex®-citrus 12XL Pectinase et cellulase
Rapidase®-TF Pectinase et cellulase
Kerzyme®-150 Pectinase et cellulase
Compositions détaillées des préparations à activités pectinase et cellulase :
Figure imgf000017_0001
La purée de noni mûr a été obtenue à l'aide d'une raffineuse avec un tamis de 1 mm. 1 kg de purée de noni a été mélangé avec 200 μΐ-kg"1 du cocktail enzymatique et laissé à température ambiante pendant 60 minutes. Ensuite, la purée a été placée dans un sac en toile filtrante et le volume de filtrat récupéré en 25 minutes a été déterminé. Ce volume est proportionnel à l'activité du cocktail enzymatique testé.
La Figure 4 représente le protocole suivi pour la détermination de la filtrabilité des échantillons. 1.13.2. Détermination de la concentration et du temps optimal d'action du mélange enzymatique
Pour la détermination de la concentration et du temps optimal d'action des mélanges enzymatiques, deux plans d'expérience central rotatif avec répétition du point central ont été utilisés (Tableaux IV et V).
Une quantité déterminée du mélange enzymatique à étudier a été ajoutée à 1 kg de purée ; le tout est laissé à température ambiante pendant le temps déterminé par le plan d'expérience. Ensuite, la pulpe a été filtrée grâce à l'aide d'un petit sac de tissu pendant 25 minutes. Le rendement d'extraction a été déterminé à partir de la mesure du volume récupéré. Les résultats ont été exprimés par la méthode de la surface de réponse (MSR) qui est la plus couramment utilisée à la suite de tels plans d'expériences (Gacula, 1984). Le logiciel de traitement statistique JMP version 4.0.4 a été utilisé pour analyser les résultats.
Tableau IV. Premier plan d'expérience pour la détermination de la concentration et du temps optimal d'action des mélanges enzymatiques sélectionnés.
Test (codifié)
Essai Facteur 1 Facteur 2
Temps (min) Concentration (ppm)
1 1 1
2 -1 -1
3 0 0
4 1 -1
5 0 0
6 0 0
7 -1,4142 0
8 -1 1
9 0 1,4142
10 1,4142 0
11 0 0
12 0 0
13 0 -1,4142
-1,4142 = 18 minutes et 29,3 ppm
-1 = 30 minutes et 50 ppm
0 = 60 minutes et 100 ppm 1 = 90 minutes et 150 ppm
1,4142 = 102,4 minutes et 170,7 ppm
Tableaux V. Deuxième plan d'expérience pour la détermination de la concentration et du temps optimal d'action des mélanges enzymatiques sélectionnés
Test (codifié)
Essai Facteur 1 Facteur 2
Temps (min) Concentration (ppm)
1 -1,4142 0
2 1 1
3 0 1,4142
4 1,4142 0
5 1 -1
6 0 -1,4142
7 0 0
8 -1 1
9 -1 -1
-1 ,4142 = 23 minutes et 8,6 ppm
-1 = 50 minutes et 50 ppm
0 = 115 minutes et 150 ppm
1 = 180 minutes et 250 ppm
1,4142 = 207 minutes et 291 ppm
1.14. Microfîltration tangentielle du jus de noni
1.14.1. Préparation du jus de noni
Le jus de noni frais a été produit à partir de fruits de noni mûrs récupérés trois jours après leur récolte. Les fruits ont été lavés et désinfectés avec une solution de chlore à 200 mg.l"1 puis dépulpés à l'aide d'une raffineuse avec un tamis de 2,5 mm. La purée a été traitée avec 200 μΙ. 1 du produit commercial Klerzyme®-DSM pendant 150 minutes à température ambiante. La purée traitée a ensuite été filtrée sur tissu et le jus obtenu a été stocké à -20 °C (Figure 5).
1.14.2. Protocole de microfîltration tangentielle
Les essais de microfîltration ont été réalisés avec un équipement pilote de microfîltration tangentielle installé au CITA-UCR au Costa Rica (Figure 6). Le pilote comprend une cuve d'alimentation de 200 litres de capacité reliée à la pompe d'alimentation. Il est équipé d'une membrane céramique de micro filtration (Tube multicanaux membralox P19 40 commercialisé par la société Pall Exekia). Cette membrane en a-alumine présente un diamètre moyen de pore de 0,2 μπι, une surface totale filtrante de 0,22 m . Les essais ont été réalisés à une vitesse tangentielle (U) de 7 m.s"1, une température de 35°C et un volume de travail de 50 1 de jus de noni prétraité enzymatiquement. Le volume mort de l'installation est de 3,9 1.
Trois pressions transmembranaires (Ptm) de travail ont été choisies pour déterminer l'effet de ce paramètre sur les caractéristiques du rétentat et du perméat obtenus (Tableau VI). '
Tableau VI. Pressions transmembranaires testées dans la microfiltration tangentielle du jus de noni.
Pression d'entrée Pression de sortie Ptm (tr/min) (bar) (bar) (bar)
Ptm faible 1,8 0 0,9 144
Ptm moyenne 2,2 0,45 1,3 444
Ptm élevée 3,0 1,25 2,1 804
La cuve d'alimentation a été remplie avec 50 1 de jus de noni, puis l'installation a été alimentée en continu. La filtration a été réalisée avec extraction continue du perméat et s'est poursuivit jusqu'à ce que le volume de rétentat soit égal au volume mort de l'installation.
Pendant les essais, le flux (Jp) et le facteur de réduction volumétrique (FRV) du procédé ont été déterminés. Les formules mathématiques permettant le calcul de ces deux paramètres sont données par les équations 1 et 2 : flux de pérmeat/ surface totale filtrante (1/h.: Equation 1
FRV = Va = vr+ Vp = 1 + vp Equation 2 vr vr vr
Où Va est le volume d'alimentation, Vr le volume du rétentat et Vp le volume du pérmeat. I.14.3. Détermination de la turbidité
La turbidité de chaque échantillon (jus de noni traité enzymatiquement, perméat et rétentat) a été déterminée en utilisant un turbidimètre Hach 2100 AN (Hach Co., Loveland, CO). Les résultats sont reportés en unités NTU.
II. Caractérisation de la composition biochimique du noni au cours de son mûrissement et de sa sénescence
II.1. Potentiel antioxydant
Le Tableau VII ci-dessous montre l'évaluation de la concentration en phénols totaux et en vitamine C et la détermination de l'activité antioxydante (ORAC) dans les fruits de noni pendant le mûrissement et la sénescence.
Vitamine CB
Phénols* ORACc
Echantillons (mg.100 g'1
(mg GAE.100 g"1 pulpe) (μηηοΙ Trolox.g"1) pulpe)
Noni vert
(Vert clair - jaune pâle) 41,4 (6,9)a'b 391 (22)a 7,4 (0,4)a'b
Noni mûr
(Translucide - grisâtre) 51,1 (l,8)a'b 316 (64) a'b 8,0 (0,8) a
S Semaine 1 43,9 (17,5) a'b 293 (79) b 7,8 (l,4) a*b e Semaine 2 27,5 (10,4) a 278 (44) M 6,8 (0,9) a'b n
Semaine 3 29,4 (19,3) a 223 (37) b'c'd 7,2 (2,1) a'b e
s Semaine 4 45,3 (12,4) a'b 318 (51) a'b 8,4 (0,8) a'b c Semaine 5 50,8 (12,4) a'b 294 (41) b 7,l (0,5) a'b e
Semaine 6 60,0 (12,5) b 148 (46) c 9,1 (1,0) b n
c Semaine 7 29,9 (10,6) a 284 (18) 9,4 (l,4) a'b e Semaine 8 29,2 (13,0) 3 193 (28) d'c 8,7 (0,9) a
Exprimés en milligrammes d'équivalent acide gallique (GAE) par 100 g de pulpe sans graines
B Somme d'acide ascorbique et d'acide déhydroascorbique par gramme de pulpe fraîche sans graines
c ORAC est la capacité d'absorbance du radical oxygène et elle est exprimé en μπιοΐ de Trolox ® par gramme de pulpe fraîche sans graines
a'b'c Les valeurs dans les colonnes suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes à P < 0.05 (Test de Duncan)
En utilisant la méthode ORAC, on montre que la capacité antioxydante des échantillons a varié entre 6,8 et 9,4 μπιοΐ Trolox®.g_1 (Tableau VII) pendant la période d'étude. Les variations obtenues ne montrent aucune tendance particulière. Les valeurs obtenues sur les extraits testés sont similaires à celles trouvées dans des fruits comme le pamplemousse, la banane, la pomme, la prune, l'orange, le raisin et le fruit de kiwi (Wang, 1996).
Les teneurs en polyphénols totaux et en vitamine C et les résultats de détermination du pouvoir antioxydant par les différentes méthodes testées ne montrent pas de tendances spécifiques pendant le mûrissement et la sénescence. Ce comportement montre que le traitement traditionnel n'améliore pas mais ne dégrade pas non plus les caractéristiques antioxydantes du fruit.
11.2. Composés phénoliques
Le suivi de l'évolution de la teneur en composés phénoliques est d'autant plus important que les effets biologiques constatés seraient dus principalement aux composés phénoliques. On constate qu'après la période de maturité, il n'y pas de différences significatives quant aux teneurs des différents composés.
La Figure 7 représente l'évolution de la concentration de scopolétine et de rutine dans les fruits de noni pendant le mûrissement et la sénescence. Les valeurs présentées sont les moyennes et les écarts types de trois échantillons analysés d'une façon indépendante. a'b'° Les valeurs dans les colonnes suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes à P < 0.05 (Test de Duncan).
Ces essais confirment que le choix d'utiliser des fruits au stade blanc translucide permet d'utiliser des fruits présentant une activité antioxydante et ayant une teneur en vitamine C et en composés phénoliques satisfaisantes.
11.3. Composés volatils aromatiques
L'identification et la détermination des concentrations des composés identifiés dans le fruit de noni mûr et pendant la sénescence sont présentées dans le Tableau VIII et sur la Figure 8 qui représente un chromatogramme CG-MS des composés aromatiques trouvés dans la pulpe de noni mûr. Les composés identifiés avec des numéros correspondent sont ceux trouves en majeure concentration (1 : acide hexanoïque méthyle ester, 2 : acide hexanoïque éthyle ester, 3 : acide octanoïque méthyle ester, 4 : acide octanoïque éthyle ester, 5 : acide hexanoïque, 6 : acide octanoïque). Tableau VIII. Composés volatils ^g.g" pulpe) identifiés dans le finit de noni mûr et pendant la sénescence
NONI
Log
Composés volatils Descripteur de l'odeur IR IR*
mûr Semaine 1 Semaine 2 Semaine 3 Semaine 4 Semaine 5 Semaine 6 Semaine 7 Semaine 8
Esters
2-méthyle
propanoate sucré méthyle butanoate sucré, fruit gâté, beurre
2-méthyle méthyle
butanoate Sucré
pomme, fruité, comme
éthyle butanoate à ester, sucré
2-méthyle éthyle noix de cajou, sucré,
butanoate puant, pomme
3-méthyle éthyle noix de cajou, sucré,
butanoate fruité, pomme
noix de cajou, sucré,
méthyle hexanoate eucalyptus, fruité
fruité, sucré, noix de
éthyle hexanoate cajou, menthe
4-pentenyle
butanoate méthyle lactate
éthyle lactate fruité
4-pentenyle
butanoate
sucré, fruité, pomme, héxyle iso butyrate raisin
méthyle octanoate orange, vert butyle hexanoate Fruit gâté
Fruit mûr, noix de coco, éthyle octanoate florale, huile
2,methyl butyl
hexanoate
éthyle 3- hydroxybutyrate marshmallow
3-[méthythio]
méthyle propanoate
4-pentenyle
hexanoate
diéthyle malonate pomme
3-méthyle 2-butenyle
hexanoate
méthyle decanoate vin, huileux
Pomme, peau de héxyle hexanoate pomme, pêche éthyle decanoate plaisant, raisin
3-méthyle butyle
OCtanOate
2-hydroxy méthyle
benzoate
éthyle phényle
acétate plaisant, fleuri
héxyle octanoate herbacé, vert, huile
éthyle pthalate
Alcools
Ethanol sucré
1-propanol alcoolique
l-propanol-2-méthyle
1-butanol médicinal, fruit
1-butanol 2-méthyle vin, malt, oignon
3-méthyle-3-buten-l- ol
3-méthyle-2-buten-l- ol herbacé
2-heptanol champignon
résinifère, fleur, vert,
1-hexanol herbe
1,3 butanediol
2,3 butanediol fruité 1557 iss3 -0,92 8 (4,1) 11,82(3,9) 4,37(1,1) 1,80(0,6) 6,24(2,2) 5,84(1 4 (1,5) ,70 (2,3)
propylène glycol
1 propanol, 3- [methythio] sucré benzyle alcool fleur, fruité, sucré, rôti phényle éthyle alcool
1,5 hexanediol
clou de girofle, miel, eugénol cannelle
Cétones
2-héptanone savonneux, à viande
3-hydroxy-2- butanone beurre, sucré
2[3H] furanone, 5
éthyle dihydro
Acides
vinaigre, fruit
Acide acétique fermenté, désagréable
2-méthyle
propanoïque acide beurre rance
Acide butanoïque rance, beurre, fromage
2-méthyle puant, sucré, séché, butenoïque acide rance acide hexanoïque Sucré, désagréable, rance, fromage,
huileuse
Sucré, désagréable,
rance, fromage,
acide octanoïque huileuse
acide decanoïque rance, huile
3-méthyle
thiopropanoïque
acide
acide palmitique
Miscellanées
hexanamide
phénol 2,4 bis [1,1-di
méthyle éthyle]
IR : indice de Kovats DB-WAX, Kl* : Indices de Kovats de la littérature, n,d,: non déterminé, Log P: coefficient de partition de l'octanol-eau de la littérature
Les descripteurs de l'odeur ont été pris de la littérature
Tout d'abord et ce quel que soit l'échantillon testé, on constate que les acides carboxyliques et plus particulièrement l'acide hexanoïque et l'acide octanoïque représentent la majorité des composés volatiles (Tableau VIII). Ces deux acides carboxyliques représentent 70% des composés aromatiques présents dans le noni mûr et environ 45% de tous les composés aromatiques présents dans les échantillons de noni au cours de la période de sénescence. La présence de ces acides gras à chaîne courte explique l'odeur désagréable, présente surtout dans le fruit mûr. Les descripteurs de l'odeur de ces deux composés, les caractérisent comme désagréables, rances, huileuse et odeur à fromage vieilli. Au début de la sénescence, les concentrations en acide hexanoïque et en acide octanoïque décroissent légèrement, mais à la fin de cette période elles augmentent à nouveau.
Les esters de l'acide hexanoïque et octanoïque, surtout le méthyle hexanoate, Péthyle hexanoate, le méthyle octanoate et l'éthyle octanoate (Figure 9, graphes A, B et C), représentent la fraction majoritaire des esters rencontrés dans le noni mûr et dans le noni au cours de la sénescence. Cependant, c'est dans le noni mûr que l'on retrouve la plus grande concentration de ces esters, une diminution de leur concentration est observée pendant la sénescence (Tableau VIII). Par ailleurs, les concentrations en héxyle hexanoate et héxyle octanoate ont augmenté significativement pendant la sénescence suite probablement à leur production par des voies métaboliques naturelles du processus de vieillissement.
Les alcools sont des composés volatils que l'on retrouve dans le noni surtout pendant la période de sénescence. La concentration en 1-hexanol augmente significativement de 4,6 de pulpe dans le noni mûr à environ 116 g/g de pulpe dans le noni pendant la sénescence. Celle du 3-méthyle-3-buten-l-ol passe de 22 g/g de pulpe dans le noni mûr à 99 μg/g de pulpe dans le noni pendant la sénescence.
En général, les changements les plus significatifs dans la composition en composés volatils identifiés sont observés au cours des premières semaines de sénescence. Pendant cette période, la concentration de quelques composés augmentent (hexyle hexanoate) ou diminuent (méthyle hexanoate) et d'autres composés apparaissent (3- méthyle butyle octanoate) ou disparaissent (diéthyle malonate). III. Choix de la préparation enzymatique pour la liquéfaction cnzymatique des parois cellulaires
Le but de ces essais est d'optimiser la liquéfaction enzymatique des parois cellulaires du noni mur au stade blanc translucide.
Au cours des traitements de clarification, des enzymes pectinolytiques ont été ajoutées pour améliorer la production du jus et faciliter sa clarification. Le prétraitement enzymatique des jus permet de réduire à la fois la viscosité pour faciliter les post-traitements de filtration ; la dépectinisation est donc nécessaire pour augmenter le flux lors de l'application de la technique de clarification par membranes.
En général des préparations commerciales de pectinases sont ajoutées à des concentrations variant de 0,005% à 0,015% et la durée du traitement varie de 6 à 8h à une température comprise entre 15 et 20°C ou de 1 à 2h à une température comprise entre 45 et 55°C. Le détail du plan d'expérience et du protocole mis en œuvre figure au paragraphe 1.16, ci-avant.
Dans le cas de noni et au regard des caractéristiques chimiques de la MIA (en particulier sa richesse en pectine, cellulose et acides galacturoniques), le cocktail enzymatique à privilégier devra contenir des quantités importantes de pectinase (polygalacturonase et/ou pectine-lyase) et de cellulase (endo-cellulase et/ou exo- cellulases).
Sept préparations enzymatiques commerciales utilisées dans l'industrie ont été testées en mesurant leur effet de solubilisation sur la filtrabilité des jus, la Figure 10 montre le volume de jus de noni obtenu au cours de 25 minutes de filtration après le traitement enzymatique (200 μΐ de mélange enzymatique.kg"1 pulpe de noni pendant 60 minutes à température ambiante) (les valeurs numériques représentent l'augmentation de volume par rapport au volume du témoin non traité).
Les meilleurs rendements d'extraction de la pulpe de noni mûr, sont obtenus avec les mélanges Clarex-citrus 12 XL®, Rapidase-TF® et Klerzym-150®. Par rapport au volume de filtrat récupéré à partir de pulpe de noni non traitée, ces trois mélanges enzymatiques ont produit plus de 18 fois le volume drainé pendant la filtration.
Afin d'optimiser le traitement de liquéfaction du jus, un plan d'expériences centrale composé a été mis en œuvre pour départager les trois préparations présélectionnées et en faisant varier la concentration en enzyme et le temps de réaction. Après hydrolyse, les échantillons ont été filtrés à 28±1°C pour la température pendant 25 minutes. L'efficacité du traitement enzymatique a été évaluée à la fois en terme de rendement d'extraction en jus (Tableau IX), en fonction de la turbidité du jus (Tableau X) qui est un indicateur pertinent de la filtrabilité en microfiltration tangentielle, puis finalement en fonction de la viscosité (Tableau XI).
Les résultats montrent que le traitement réalisé avec la préparation Klerzym-150® permet un rendement extraction supérieur et l'obtention de jus moins troubles.
Tableau IX. Rendements en jus de noni obtenus en 25 minutes de filtration après traitement enzymatique avec les cocktails testés (résultats du deuxième plan d'expérience).
Rendement (%)
Temps Concentration
(min) (ug/ml) Klerzym-150® Rapidase-TF® Clarex-citrus 12 XL®
23,08 150 7,9 6,2 10,5
50 50 5,8 4,8 8,7
50 250 18,3 11,5 16,4
115 8,58 3,3 2,1 3,2
115 150 26,3 17,15 22
115 291,42 24,2 20,6 22,7
180 50 13,6 8,5 14,6
180 250 25,5 21,1 23,5
206,92 150 27,4 24,2 25,7
Tableau X. Turbidité des jus de noni récupérés au cours des 25 minutes de filtration en fonction du traitement enzymatique testé (résultats du plan d'expérience utilisant comme point central 60 minutes et 100 μΐ-kg"1 de pulpe).
Turbidité (NTU)
Temps Concentration
(min) (μΙ/Kg pulpe) Klerzym-150® Rapidase-TF® Clarex-citrus 12 XL®
17,57 100 213 369 331
30 50 446 531 545
30 250 253 360 163 60 29,29 205 571 268
60* 100* 158* 498* 219*
60 170,71 267 453 164
90 50 253 282 288
90 150 143 271 170
102,43 100 153 125 178
* Moyenne de 5 répétitions
Tableau XI. Viscosité du jus de noni traité avec les trois mélanges enzymatiques testés (résultats du deuxième plan d'expérience).
, Clarex-citrus 12
Klerzym-150® Rapidase-TF11
XL®
Concentration
Temps (min) (μΙ/Kg pulpe) (cpoise)
23,08 150 40,26 41,61 40,95
50 50 41,49 43,80 41,45
50 250 41,25 43,70 39,73
115 8,59 52,44 59,81 42,63
115 150 39,62 44,54 40,41
115 291,42 38,96 42,87 39,51
180 50 43,39 49,12 41,76
180 250 39,67 40,18 41,45
206,92 150 39,37 42,97 39,79
Pour la préparation commerciale Klerzyme-150®, l'analyse rendement en fonction de la concentration en enzymes utilisée et le temps d'incubation a permis d'établir le graphe de la Figure 11 qui représente la surface de réponse du rendement du cocktail enzymatique Klerzyme-150® en relation à la concentration et temps d'activité dans la pulpe de noni mûr.
Ainsi, il apparaît que les conditions optimales de traitement ont été déterminées en utilisant les résultats du plan d'expérience précédent. Dans ces conditions, l'optimum correspond à l'utilisation de 200 ml. kg" de fruit et 150 minutes de macération avec une faible agitation.
IV. Microfîltration tangentielle du jus de noni
IV.1. Essais à l'échelle pilote
Après récolte, les fruits de noni verts ont été conservés pendant trois jours à température ambiante, puis ils ont été dépulpés à l'aide d'une raffineuse. Le rendement en jus de cette première étape a été élevé (82%), les rejets correspondant essentiellement aux graines et au résidu de pulpe adhérant à ces dernières. La pulpe récupérée a été additionnée d'enzymes (200 μΐ-kg"1 du produit Klerzyme-150®) et laissée 150 minutes à température ambiante (28°C±1°C) puis pressée pour obtenir le jus à microfiltrer. Le rendement en jus de cette seconde étape a été de 73%. Le rendement total de production de jus de noni mûr traité enzymatiquement a été de 60% (Tableau XII ci- dessous).
Tableau XII. Rendements de production du jus de noni mûr pour les essais de microfîltration (traitement enzymatique : Klerzyme-150® à 200 μΐ-kg"1 pulpe et 150 minutes d'action).
Etapes Rendement (%)
Etape 1 : récupération de la pulpe 82 (2)
Etape 2 : traitement enzymatique de la pulpe 73 (5)
Procédé global 60 (6)
Pour les conditions opératoires de la microfîltration tangentielle (MFT), la température moyenne d'alimentation est fixée à 35°C. La vitesse tangentielle a été fixée ici à 5 m.s_1. La pression transmembranaire, facteur également important pour les performances du procédé de microfîltration a variée en fonction des expériences réalisées. Le Tableau XIII récapitule les conditions opératoires des essais de microfîltration réalisées.
Tableau XIII. Conditions opératoires des essais de MFT du jus de noni mûr.
Paramètres Valeurs
Suspension filtrée : 50 1 de pulpe de noni prétraitée par voie enzymatique
(200 μ|.|¾_1 pulpe de Klerzyme-150®-DMS
150 minutes à 28 ± 1°C)
Vitesse tangentielle (U) 7 m. s 1 Température de filtration (T) 35 °C
Pression transmembranaire (Ptm) Variable
0,9 bar - 1,325 bar - 2,125 bar
Effet de la pression transmembranaire (Ptm)
Les flux de pérmeat en fonction du temps obtenus lors des essais de micro filtration sont présentés dans la Figure 12.
Les valeurs des flux obtenus pour les trois essais réalisés à différentes Ptm sont comprises entre 100 à 160 l.h"1. m"2. Ces valeurs sont importantes et très supérieures à celles obtenues lors d'essais de MFT avec d'autres fruits.
On constate qu'au-delà d'une valeur optimale (Ptaioptimaie) correspondant environ à 1,3 bar, le flux n'augmente plus avec la Ptm. Par conséquent, la mise en œuvre de la MFT à des pressions supérieures à cette valeur optimale, n'entraînera que des augmentations de coût de fonctionnement et des risques accrus de colmatage suite à la compaction des dépôts.
Par ailleurs, on constate que pour toutes les conditions opératoires testées il a été possible d'atteindre des Facteurs de Réduction Volumique (FRV) supérieurs à 10 correspondants à des rendements en jus clarifié supérieurs à 90% par rapport au jus initial.
En conclusion, on constate que globalement, les performances obtenues lors de la microfiltration du jus de noni sont très intéressantes si on les compare à celles obtenues lors de la microfiltration de jus de divers fruits (Tableau XIV). Les valeurs des flux (de l'ordre de 100 à 160 L.h" .m" ) de même que les rendements (93%) sont dans les plus élevées. L'importance de la mise en œuvre d'un prétraitement de la pulpe n'est pas à mettre en doute si on rappelle le résultat d'essais préliminaires réalisés sur de la pulpe non
1 traitée. Les performances obtenues alors étaient respectivement égales à 30 l.h" .m pour le flux de pérmeat, 3 pour le FRV et enfin de 67% pour le rendement.
Tableau XIV. Comparaison de différents jus de fruits microfiltrés
Jus de fruit clarifié Turbidité Flux FRV Rendement
(NTU) (l.h"\nf2) (%)
Noni 1,2 ± 0,2 100-160 10-12 92
Ananas (Gold) 0,9 ± 0,1 70 8 88
Orange (Valencia)b 1,0 ± 0,1 62 3,5 71
Citron (Messino) 0,7 ± 0,1 105 5,5 80
Pastèque 0,9 ± 0,1 120 6 85
Banana (Great Dwart) 0,7 ± 0,1 100 15 93
Melon (Cantaloupe)f 80 3 67 Mure (Vino) 0,6 ± 0,1 70 4 75
0,4 ± 0,1
bCisse et al., 2005., Vaillant et al., 2005.
IV.2. Essais à l'échelle semi-industrielle
Afin de valider le procédé dans sa globalité, des essais ont été réalisés à l'échelle semi-industrielle en intégrant toutes les étapes décrites précédemment.
Des fruits verts et sains ont été collectés manuellement, puis lavés avec de l'eau potable et désinfectés par immersion dans une solution d'hypochlorite de sodium (200 ppm / 5 min). Les fruits ont ensuite été stockés à température ambiante (25°C) pendant 3 jours, période pendant laquelle le fruit développe une couleur blanchâtre translucide. Les fruits sont alors dépulpés à l'aide d'une passoire rotative (2 mm) pour éliminer les graines et les fibres grossières. La purée obtenue de noni est alors macérée avec des enzymes commerciales (dose comprise 50 et 200 ml/tonne de purée) pour un temps compris entre 30 et 150 minutes et à une température entre 30 et 50°C. La purée macérée est ensuite pressée dans un filtre presse à une pression entre 2 et 10 bars. Le jus pulpeux obtenu est alors microfiltré en utilisant un équipement semi-industriel constitué par des membranes céramiques tubulaire de 0,2 m2 (Membralox®, Pall) et de diamètre de pore de 0,2 μιη. Les pressions transmembranaires utilisées s'échelonnent entre 1 et 3 MPa, la vitesse tangentielle avoisine les 5 m.s"1 et la température est contrôlée entre 30 et 40°C. Pendant la fîltration, le flux de perméat se maintient autour de 150 1/h.m2 pour 2 MPa de pression transmembranaire jusqu'à un facteur de réduction volumique de 10 correspondant à un rendement en jus microfiltré de 90% par rapport au volume de jus initial. Ce rendement est obtenu au bout d'une heure et demie de fîltration. Ensuite, en continu est extrait du rétentat (purée riche en fibre) à raison d'environ 15 l.h" .m" de surface filtrante et dans le même temps, on extrait 150 l.h" .m" de jus clarifié microfiltré. Ce régime d'extraction et d'alimentation continu peut durer plusieurs heures. Au total l'équipement de microfïltration est alimenté en continu avec 165 l.h" .m" de jus pulpeux provenant du filtre presse. Le jus prélevé de façon aseptique en sortie du module de fîltration est ensuite conditionné en bouteille de verre. Optionnellement il peut être pasteurisé. Dans les deux cas, une période de quarantaine est observée pour vérifier la qualité du jus embouteillé avant la commercialisation. Qualité des jus obtenus par le procédé
Les paramètres physico-chimiques du jus de noni initial, des permeat et rétentat obtenus en fin de MFT (FRV compris entre 10 et 12) sont rapportés dans le Tableau XV. Aucun effet de la pression transmembranaire sur les SST, le pH et l'humidité n'a été mis en évidence. Les valeurs des caractéristiques physico-chimiques étudiées sont similaires quelle que soit la valeur de la pression transmembranaire appliquée.
Tableau XV. Caractéristiques physico-chimiques de jus de noni microfiltré a trois pressions transmembranaires
Analyses Pression transmembranaire (bar)
0,9 1,3 2,1
SST (SBrix)
jus brut 7,2 (0,3)a 7,5 (0,5) a 6,9 (0,9) 3 pérmeat 7,3 (0,5) a 6,9 (0,1) b 6,8 (1) 3 rétentat 8,4 (0,7) b 7,8 (0,3) a 7,0 (1) 3
PH
jus brut 3,62 (0,02) a 3,56 (0,03) a 3,53 (0,08) 3 pérmeat 3,62 (0,01) a 3,56 (0,02) 3 3,52 (0,09) 3 rétentat 3,61 (0,02) a 3,55 (0,01) 3 3,57 (0,1) 3
Humidité (%)
jus brut 93,7 (0,4) a 93,2 (0,5) 3 93,5 (0,9) 3 pérmeat 94,0 (0,6) a 93,9 (0,4) 3 93,6 (0,8) 3 rétentat 92,5 (0,3) b 91,5 (0,2) b 91,4 (l) b
Matière sèche (g.100g 1)
jus brut 6,3 (0,4) a 6,8 (0,6) 3 6,5 (l) a pérmeat 6,0 (0,7) a 6,8 (0,7) 3 6,3 (0,9) 3 rétentat 7,5 (0,4) b 7,8 (0,8) b 8,6 (l) b V. Effet de la microfiltration tangentielle sur les propriétés du jus de noni
V.1. Composés phénoliques et propriétés antioxydantes du jus de Noni Les résultats de la détermination du pouvoir antioxydant (Tableau XVI) montrent qu'il n'y a pas de différences statistiquement significatives (P<0,05) entre le jus d'alimentation et le perméat, ce qui indique que la microfiltration quelle que soit la pression transmembranaire, ne retient pas de composés qui participent au pouvoir antioxydant du jus de noni. Même si on observe une légère rétention des composés phénoliques dans le rétentat, celle-ci n'a qu'un faible impact sur le pouvoir antioxydant du perméat. Cette rétention s'avère plus significative aux fortes pressions, alors qu'à faible Ptm de 0,9 bar, on n'observe pas de phénomènes de rétention significatifs (P<0,05).
L'analyse de l'acide L-ascorbique montre que la MFT n'a pas d'effet particulier sur ce composé, la MFT n'affectant que très peu la teneur en acide L-ascorbique dans le jus.
L'effet de la MFT à différentes Ptm sur la teneur en rutine et scopolétine est aussi mon significatif, ce qui corrobore également le fait que la capacité antioxydante du jus microfiltré reste similaire au jus d'alimentation.
La comparaison avec les propriétés antioxydantes des noni et leur composition en composés phénoliques permet de montrer que le procédé global de préparation de jus de noni selon l'invention ne présente aucun effet délétère sur ses propriétés antioxydantes et sur sa composition en composés phénoliques.
Tableau XVI. Détermination du pouvoir antioxydant, contenu de polyphénols, acide L-ascorbique, scopolétine et rutine dans le jus d'alimentation, le perméat et rétentat à différentes Ptm.
ORACA PolyhénolsB Acide L- Scopolétine Rutine (μηηοΙ (mg GAE.100 g-1 ascorbique c ^g-g-i)
Trolox®.g-l) jus) (mg.100 g-1 jus)
Pression 90 kPa
jus brut 6,9 (0,6)a 56,2 (19,6)a 28,8 (5,8)a 9,9 (1,8) a 21,8 (1,9) 3 perméat 6,1 (0,5)a,b 53,4 (6,6))a 40,5 (6,6)a 7,4 (1,4) a 21,2 (2,1) a rétentat à F V 10 7,5 (l,0)b 62,0 (ll,l)a 39,2 (13,l)a 9,4 (0,7) a 17,8 (0,9) a
Pression 130 kPa
jus brut 8,0 (0,3)a 64,2 (18,9)a 51,3 (36,2)a 7,8 (1,3) a 18,3 (0,7) a perméat 8,2 (0,8)a 44,4 (l,9)b 12,6 (4,8)b 7,5 (0,9) a 15,2 (1,5) a rétentat à FRV 10 8,5 (2,0)a 59,6 (9,0)a,b 34,4 (18,0)a,b 7,2 (1,5) a 17,2 (0,5) a
Pression 210 kPa
jus brut 6,3 (0,l)a 48,6 (7,9)a 17,6 (5,5)a 7,6 (0,4) a 22,8 (0,6) a perméat 6,2 (0,8)a 47,1 (12,3)a 25,6 (l,l)a 7,5 (0,2) a 21,6 (l,l) a rétentat à FRV 10 9,1 (l,0)b 61,9 (14,3)a 15,6 (ll,3)a 6,l (l,8) a 20,3 (0,9) a A ORAC est la capacité d'absorbance du radical oxygène et elle est exprimé en μτηοΐ de Trolox® par gramme de jus.
B Exprimés en milligrammes d'équivalent acide gallique (GAE) par 100 g de jus.
c Déterminé par la méthode de FOLIN.
a,b,c,d,e ^eg vaieurs ^ans les colonnes suivies par la même lettre ne sont pas signifïcativement différentes à P < 0,05 (Test de Duncan)
V.2. Impact sur les composés volatils du jus de noni
L'identification des composes volatiles dans le jus de noni après enzymage a mis en évidence la présence des composés identiques à ceux de la pulpe de noni mûr. On retrouve ainsi majoritairement des acides hexanoïque et octanoïque et leurs esters (Tableau XVII). Cependant au cours de la MFT, les composés avec un Log P (coefficient de partition de l'octanol-eau) élevé, comme les esters : méthyle décanoate, hexyle décanoate, butyle hexanoate, héxyle butanoate, méthyle octanoate, éthyle octanoate et les acides hexanoïque, octanoïque et decanoïque sont concentrés dans le retentat, alors que les composés avec un Log P faible, comme les alcools et certains acides et esters ne sont pas retenus par la membrane. La rétention des composés à Log P élevé donc peu polaires, peut s'expliquer par des interactions de type hydrophobe entre ces composés et la pulpe retenue par la membrane.
En conclusion, la MFT modifie favorablement la composition en composés volatils en permettant la réduction des composés qui donnent des odeurs désagréables. Des tests d'analyse sensorielle montrent, également une modification ressentie comme positive par rapport au jus frais.
V.3. Stabilité microbiologique
La flore aérobie totale a été évaluée sur une période d'un an. Cette étude montre que le jus de noni préparé selon le procédé selon l'invention reste stable microbiologiquement pendant au moins un an. Tableau XVII. Effet de la microfiltration sur les composés volatiles du jus de noni (exprimé en μξ/g de jus, de perméat ou de rétentat)
Pression 0,9 bar Pression 1,3 bar Pression 2,1 bar
Descripteur de
Composés volatils IR IR* Log P
l'odeur
Jus initial Perméat Rétentat Jus initial Perméat Rétentat Jus initial Perméat Rétentat
Esters
sucré, fruit gâté,
méthyle butanoate beurre
pomme, fruité,
comme à ester,
éthyle butanoate sucré
noix de cajou,
sucré, eucalyptus,
méthyle hexanoate fruité
fruité, sucré, noix
éthyle hexanoate de cajou, menthe
méthyle octanoate orange, vert ,
butyle hexanoate Fruit gâté
hexyl butanoate Peau de pomme
Fruit mûr, noix de
éthyle octanoate coco, florale, huile
4-pentenyle hexanoate
3-[méthythio] méthyle
propanoate
3-[methythio] propanoic
acid ethyl ester
3-méthyle 2-butenyle
hexanoate 1515 0.12 (0.05) n.d. 0.99 (0.38) 0.21 (0.01) n.d. 1.14 (1.00) 0.18 (0.03) n.d. 1.79 (0.64) méthyle decanoate vin, huileux 1521 1591 4,41 0.21 (0.10) n.d. 1.75 (0.92) 0.29 (0.09) n.d. 1.88 (1.70) 0.25 (0.04) n.d. 3.27 (1.31)
3-méthyle butyle
octanoate 1579 1671 5,21 0.37 (0.09) n.d. 1.42 (0.21) 0.37 (0.13) n.d. 1.54 (0.49) 0.45 (0.02) n.d. 3.17 (2.69) herbacé, vert,
héxyle octanoate huile 1731 1806 5,78 5.00 (1.59) 0.16 (0.02) 15.45 (2.19) 4.02 (2.78) n.d. 13.53 (0.14) 6.06 (0.09) 0.15 (0.05) 36.58 (39.7) éthyle phthalate 2322 2,42 3.40 (0.78) 2.31 (1.03) 3.93 (2.06) 2.58 (0.40) 3.73 (0.65) 3.19 (0.80) 3.12 (1.16) 2.90 (0.79) 3.92 (0.58)
Alcools
l-propanol-2-méthyle 1033 1054 0,76 0.47 (0.10) 0.40 (0.03) 0.32 (0.16) 0.41 (0.11) 0.45 (0.08) 0.34 (0.12) 0.44 (0.05) 0.39 (0.05) 0.28 (0.09)
1-butanol médicinal, fruit 1087 1113 0,84 9.37 (2.55) 7.23 (2.25) 5.38 (4.25) 6.67 (4.44) 7.78 (5.00) 5.74 (5.07) 8.68 (1.58) 6.87 (1.44) 3.38 (0.50)
1-butanol 2-méthyle vin, malt, oignon 1148 1167 1,29 2.53 (0.68) 1.85 (0.85) 1.47 (0.96) 1.78 (1.14) 1.98 (1.45) 1.88 (0.92) 2.32 (0.38) 1.77 (0.40) 1.33 (0.23)
3-méthyle-3-buten-l-ol 1226 1226 1,25 59.47 (11.2) 48.97 (5.0) 42.99 (20.8) 48.10 (15.5) 50.07 (24.4) 46.35 (19.2) 55.29 (5.31) 51.54 (4.9) 40.96 (2.61)
3-méthyle-2-buten-l-ol herbacé 1268 1324 1,17 4.85 (1.08) 4.16 (0.20) 4.68 (1.24) 4.07 (0.87) 3.92 (1.62) 4.96 (0.39) 4.38 (0.42) 4.27 (0.32) 5.49 (0.82) résinifère, fleur,
1-hexanol vert, herbe 1292 1339 2,03 27.20 (5.27) 16.04 (12.3) 14.70 (14.5) 17.59 (15.9) 18.67 (18.1) 16.64 (15.6) 26.15 (3.78) 13.54 (8.65) 11.61 (9.21)
1 propanol, 3-[methythio] sucré 1675 1708 5.90 (1.71) 4.54 (1.88) 3.58 (2.11) 4.14 (2.48) 4.63 (3.52) 4.01 (2.68) 5.29 (0.85) 4.08 (1.27) 2.75 (0.27) fleur, fruité, sucré,
benzyle alcool rôti 1838 1822 1,1 1.66 (0.39) 1.29 (0.37) 1.07 (0.52) 1.24 (0.48) 1.29 (0.83) 1.22 (0.62) 1.48 (0.14) 1.35 (0.28) 1.06 (0.21) phényle éthyle alcool 1873 1859 1,36 0.81 (0.20) 0.91 (0.14) 0.65 (0.22) 0.71 (0.09) 0.79 (0.29) 0.62 (0.18) 0.72 (0.07) 1.02 (0.24) 0.48 (0.15)
1,5 hexanediol (2,6
dihydroxyhexane) 1965 0,69 0.29 (0.01) 0.51 (0.36) 0.46 (0.04) 0.40 (0.21) 0.36 (0.01) 0.49 (0.13) 0.27 (0.02) 0.66 (0.34) 0.42 (0.23)
Acides
vinaigre, fruit
fermenté,
Acide acétique désagréable
2-méthyle propanoïque
acide beurre rance
rance, beurre,
Acide butanoïque fromage
2-méthyle butenoïque puant, sucré,
acide séché, rance
3 methyl-3-butenoic acid
Sucré,
désagréable,
rance, fromage,
acide hexanoïque huileuse
acide heptanoique
Sucré,
désagréable,
rance, fromage,
acide octanoïque huileuse
acide decanoïque rance, huile
3-méthyle
thiopropanoïque acide
2[3H] furanone, 5 buthyl
dihydro
hexanamide
IR : indice de Kovats DB-WAX, Kl* : Indices de Kovats de la littérature, n,d,: non déterminé, Log P: coefficient de partition de l'octanol-eau de la littérature
Les descripteurs de l'odeur ont été pris de la littérature

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de jus de noni comprenant les étapes de : a) broyage de fruits de noni lorsqu'ils sont au stade de maturité blanc translucide pour produire une purée de fruits de noni ;
b) traitement enzymatique de ladite purée de fruits de noni avec une préparation enzymatique présentant au moins une activité pectinase, correspondant à une activité polygalacturonase (EC 3.2.1.15) supérieure à 4 Ul.ml"1 et/ou une activité pectine- lyase (EC 4.2.2.10) supérieure à 3 Ul.ml"1, et au moins une activité cellulase correspondant à une activité endo-cellulase (EC 3.2.1.4) supérieure à 20 Ul.ml"1 et/ou activité exo cellulases (EC 3.2.1.91) supérieure à 4 Ul.ml"1, à une teneur comprise entre 50 à 200 ml ou g/tonne de purée de fruits de noni à une température comprise entre 20 et 55°C pendant au moins 30 minutes ;
c) élimination de la pulpe et des graines présentes dans les fruits de noni par pressage de ladite purée conduisant à un premier jus ;
d) tamisage ou filtration grossière dudit premier jus obtenu à l'issue de l'étape c) conduisant à un second jus ;
e) microfiltration ou ultrafiltration tangentielle sur membrane céramique tabulaire de seuil de coupure inférieur ou égal à 0,5 μιη dudit second jus obtenu à l'issu de l'étape d).
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les fruits du noni sont lavés et désinfectés avant l'étape a) de broyage.
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape b) de traitement enzymatique est réalisée sous agitation.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite préparation enzymatique est utilisée à une concentration comprise entre 150 et 300 ml/tonne de fruits.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape e) de microfiltration est mise en œuvre en appliquant une pression transmembranaire comprise entre 0,5 et 3 bars.
6. Jus de fruit de noni susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par une teneur en acide octanoïque inférieure à 200 μg/g de jus de noni et une teneur en acide hexanoïque inférieure à 200 μg/g de jus de noni.
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