WO2011158738A1 - 生体試料前処理方法及び装置 - Google Patents

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WO2011158738A1
WO2011158738A1 PCT/JP2011/063309 JP2011063309W WO2011158738A1 WO 2011158738 A1 WO2011158738 A1 WO 2011158738A1 JP 2011063309 W JP2011063309 W JP 2011063309W WO 2011158738 A1 WO2011158738 A1 WO 2011158738A1
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WO
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phase extraction
solid phase
biological sample
solid
sample pretreatment
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PCT/JP2011/063309
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勝弘 神田
真 野上
伊藤　伸也
泉 和氣
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction

Definitions

  • the present invention relates to a biological sample pretreatment method and apparatus for performing pretreatment for performing hemolysis treatment, deproteinization treatment, and solid phase extraction treatment of a specimen.
  • the extraction of target components from multi-component blood samples can be performed using various physical properties such as the size, weight and shape of target components and biochemical properties such as solubility and affinity as indices.
  • chromatographic separation techniques have been developed, and the development of fillers suitable for the target components and the optimization of methods have been made.
  • fillers suitable for the target components and the optimization of methods have been made.
  • Even in the case of using such advanced separation technology in order to efficiently extract a target trace component from multi-component blood having various cells and different properties, it is necessary to make it extractable. Sample preparation and crude purification are essential.
  • TDM Therapeutic Drug Monitoring
  • TDM target drugs examples include antiepileptic agents, antibacterial agents, immunosuppressive agents, antiarrhythmic agents, and antipsychotic agents. Although many drugs are distributed in the serum, for example, immunosuppressants administered to organ transplant patients have high fat solubility and blood cell migration. After the blood cell contents are taken out, a pretreatment for extracting the drug adsorbed on the protein or the like is required.
  • hemolysis may be caused by dissolving or damaging lipids constituting the cell membrane with various solvents or surfactants.
  • physical methods include pressure, centrifugal force, stirring, freezing and thawing, hypotonicity, and the like.
  • Biological techniques include formation of a transmembrane protein complex resulting from antibody binding to blood cells and complement binding, and formation of pores in the blood cell membrane by hemolysin (hemolysin) produced by pathogenic bacteria.
  • hemolysin hemolysin
  • protein removal treatment or liquid / liquid extraction may be mentioned as a method for recovering the target component adsorbed on the protein in the blood.
  • the target component is extracted to the organic solvent side, the protein is denatured, and generally the aggregated protein and the supernatant are separated by centrifugation. Fractions are collected.
  • Deproteinization is a process that removes a large amount of proteins contained in a large amount of blood by agglutinating them. Only after such treatment, a sample derived from whole blood is equivalent to serum or plasma specimens. Ready to handle.
  • the organic solvent also has a hemolytic effect as described above, there is a method in which hemolysis, liquid / liquid extraction, and deproteinization are performed by directly adding to the blood. There is also a method of adding the above-described zinc sulfate to supplement the protein removal effect at that time.
  • the blood cell migratory drug can be recovered in a solution state.
  • it can be used for purification operations such as solid phase extraction and liquid chromatography separation. It becomes possible to do.
  • the recovered supernatant after liquid / liquid extraction is dried up and then redissolved with an appropriate volume of lysing solution to reduce the liquid volume and concentrate the target component.
  • a liquid chromatography mass spectrometer Liquid Chromatograph Mass Spectrometer, LCMS
  • separation and purification of the target component after concentration and detection are performed, and identification and quantitative analysis of the target component To implement.
  • Patent Document 1 As a known technique of solid phase extraction, there is a technique described in Patent Document 1.
  • the technique described in Patent Document 1 is a solid phase having a structure in which, for example, a syringe-like container is filled with a solid-phase extraction agent, and the upstream and downstream of the filler are sandwiched by a filter (frit) to hold the filler. Extraction column.
  • a sample obtained by filtering a reaction product is temporarily collected from a biological sample and stored in a container or the like, and a solid phase extraction process is performed using a separate container or the like.
  • reaction of the sample requires complicated processing as described above, which requires time and effort.
  • An object of the present invention is to realize a biological sample pretreatment method and apparatus that can be supplied to a solid phase extraction process without first collecting the filtrate after the reaction process.
  • the present invention is configured as follows.
  • the biological sample pretreatment method and apparatus of the present invention supplies a biological sample and a deproteinizing reagent to a filter member accommodated in a filter device, and uses the solid phase extraction agent that contains the filtrate of the filter member as a filtrate.
  • the solid phase of the biological sample is extracted from the filtrate contained in the solid phase extractant.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining a pretreatment flow of a sample pretreatment method in Embodiment 1 of the present invention.
  • a pretreatment flow 103 in FIG. 1 is a pretreatment flow in the first embodiment of the present invention, and the whole blood treatment and the solid phase extraction treatment are collectively performed.
  • FIG. 1 shows a flow for individually performing whole blood processing (processing flow 101) and solid phase extraction processing (processing flow 102) for comparison with the pretreatment of the present invention.
  • a whole blood sample is dispensed onto a filter device, and a hemolytic treatment solution (such as a zinc sulfate aqueous solution) is further dispensed and stirred. Thereafter, a slow protein solution (methanol or the like) is dispensed, stirred, and then filtered (or centrifuged).
  • a hemolytic treatment solution such as a zinc sulfate aqueous solution
  • hemolysis is performed, for example, by adding H 2 O to a whole blood sample to make it hypotonic and bursting blood cells.
  • an organic solvent is added to the solid phase extractant, pressure is added, water is added, and the pressure is applied to condition the solid phase extractant.
  • pressure addition ⁇ washing liquid addition ⁇ pressure addition ⁇ eluate (methanol etc.) addition ⁇ pressure addition the target component is adsorbed, the non-specifically adsorbed component is removed by washing, and the target component is eluted and recovered This completes sample preparation.
  • Example 1 of the present invention by subjecting the filtrate after hemolysis and deproteinization treatment directly to the solid phase extraction agent without temporary collection, the target component is adsorbed to the solid phase extraction agent.
  • the pretreatment apparatus used in the sample pretreatment method of Example 1 of the present invention, a filter device and a column that is a solid phase extractor are integrated.
  • the pretreatment apparatus solid phase extraction cartridge
  • the pretreatment apparatus is first conditioned in the same manner as the conditioning in the processing flow 102, and then filtered from the whole blood sample dispensing as in the processing flow 101 (however, by applying pressure) Filtration) is performed, and the internal phase is added to the eluate and pressure is added as in the processing flow 102 without temporarily collecting the filtrate, and the solid phase is extracted.
  • composition of the filtrate is compatible with the adsorption conditions for the target component to the solid phase extractant.
  • immunosuppressive agents such as tacrolimus, sirolimus (rapamycin), everolimus, and cyclosporine have high hydrophobicity and are difficult to dissolve in aqueous solutions.
  • solubility of these drugs in methanol was examined, there was a tendency for them to not dissolve stably unless in the presence of 50% or more of methanol.
  • FIG. 2 shows data of everolimus (201) and cyclosporine (202). This means that when these drugs are to be extracted, it is necessary to pay attention to the final concentration of the organic solvent at the time of deproteinization and at the time of sample preparation to the solid phase extraction agent, and at least 50% when methanol is used. This indicates that the above is desirable.
  • the method of adsorbing a target component by directly using a solid phase extractant without temporarily collecting the filtrate at the time of deproteinization described above can be applied to any equipment configuration. .
  • a pseudo patient whole blood sample can be prepared and used.
  • an immunosuppressant preparation dissolved in 50% methanol is added to a whole blood sample collected from a healthy person so that the final concentration is about the therapeutic range of each immunosuppressant.
  • it is also possible to reproduce the blood cell migration of each immunosuppressive agent by incubating the prepared pseudo-patient whole blood specimen for 30 minutes while gently inverting at 37 ° C.
  • Example 1 of the present invention the whole blood treatment and the solid phase extraction treatment are collectively performed without primary collection of the filtrate after the reaction treatment. Loss of biological samples and contamination with other biological samples and the like can be suppressed.
  • Example 2 has a suspension-type equipment configuration.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of a suspension-type sample pretreatment apparatus that is Embodiment 2 of the present invention.
  • the sample pretreatment equipment 301 is characterized by being integrated by inserting a filter equipment 302 into a solid phase extraction equipment 303.
  • This sample pretreatment equipment 301 is provided with a filter equipment 302 on the upstream side and a solid phase extraction equipment 303 on the downstream side, and is directly applied to the solid phase extraction equipment 303 without temporarily collecting the filtrate from the filter equipment 302. It is characterized by that.
  • the filter device 302 includes a filter reservoir 304 and a filter unit 305.
  • the solid phase extraction device 303 is cup-shaped, and is used with the solid phase extraction agent 308 added.
  • the material of the filter reservoir 304 in the filter device 302 is not limited, and a resin, a metal, or the like that is generally used for pretreatment of a biological sample may be used. However, in order to satisfy the capacity of the reagent to be added, it is desirable to have an allowable amount of at least 8 times the sample amount to be tested.
  • the volume of zinc sulfate solution used for hemolysis is 150 ⁇ l
  • the volume of methanol used for deproteinization is 200 ⁇ l.
  • the total amount of the reaction solution is 400 ⁇ l, which corresponds to 8 times the sample amount.
  • the material of the filter unit 305 in the filter device 302 is not limited as long as it has a filtering function, and a material generally used for pretreatment of a biological sample or the like may be applied.
  • the amount of aggregate produced by the reaction in the filter device 302 largely depends on the type, origin, amount, etc. of the specimen, but in order to avoid clogging of the filter unit 305, it is desirable that the bottom area 311 on the upstream side of the filter unit is large.
  • the pore size of the filter unit 305 is desirably ⁇ 2.0 ⁇ m or less in order to capture contaminant fine components in the biological sample.
  • the material of the solid-phase extraction device 303 is not limited, and a resin, a metal, or the like that is generally used for pretreatment of a biological sample may be used. However, in order to satisfy the capacity of the reagent to be added, it is desirable to have an allowable amount that is at least equal to or larger than the amount of the deproteinized sample to be tested.
  • solid phase extraction agent 308 filled in the solid phase extraction device 303 a material having performance suitable for extraction of the target component is applied.
  • a material having performance suitable for extraction of the target component is applied.
  • silica gel, polymer, resin beads or the like can be applied.
  • Each reagent used for conditioning the solid phase extraction agent 308, adsorption of the target component, removal of the contaminating component, and elution recovery of the target component is selected according to the characteristics of the solid phase extraction agent 308. For the sake of convenience, in this embodiment, a case where the solid phase extraction agent 308 in the reverse phase mode is used is shown.
  • a necessary amount of the solid phase extraction agent 308 is added to the cup-shaped solid phase extraction device 303, and the conditioning is performed first.
  • an organic solvent such as methanol is added, and after sufficient stirring, the supernatant is discarded by centrifugation (FIG. 3A).
  • an aqueous solution such as a buffer is added, and after sufficient stirring, centrifuged and the supernatant is discarded ((B) in FIG. 3).
  • the filter device 302 is attached to the opening of the solid-phase extraction device 303, and the sample is added into the filter reservoir 304.
  • an internal standard substance is also added and it fully stirs.
  • the sample pretreatment equipment 303 is centrifuged to leave aggregates on the filter equipment 302 side, without collecting the filtrate, glass filters, resin filters, etc.
  • the filtrate is directly used as a solid phase extraction agent via the filter part 305.
  • the target component is adsorbed on the solid phase extraction agent 308.
  • the filter device 302 is discarded, the solid phase extraction agent 308 in the solid phase extraction device 303 is sufficiently stirred, and after centrifugation, the supernatant is discarded. By this operation, contaminant components that have not been adsorbed on the solid-phase extraction agent 308 are removed.
  • the solid-phase extraction agent 308 is a magnetic substance
  • the solid-phase extraction agent 308 and the supernatant can be separated by bringing a magnet or the like closer to the surface of the solid-phase extraction device 303 instead of centrifugation as described above. I do not care.
  • the whole blood treatment and the solid phase extraction treatment are collectively performed without primary recovery of the filtrate after the reaction treatment. While being able to perform a reaction process, the loss of the sample which generate
  • Example 2 has a syringe-type (non-detachable) equipment configuration.
  • FIG. 4 is a view showing the structure of a syringe type (non-detachable) sample pretreatment apparatus (sample pretreatment equipment) 401 that is Embodiment 3 of the present invention.
  • the sample pretreatment equipment 401 has a structure in which the filter equipment 402 and the solid phase extraction equipment 403 cannot be detached so that they cannot be separated from each other.
  • the sample pretreatment equipment 401 is provided with a filter equipment 402 on the upstream side and a solid-phase extraction equipment 403 on the downstream side, and is directly applied to the solid-phase extraction equipment 403 without temporarily collecting the filtrate from the filter equipment 402.
  • the filter device 402 includes a filter reservoir 404 and a filter unit 405.
  • the solid-phase extraction device 403 includes a solid-phase extraction reservoir 406, a solid-phase extraction agent 408, and an upstream frit 407 and a downstream frit 409 that hold the solid-phase extraction agent 408 in the solid-phase extraction device 403.
  • the material of the filter reservoir 404 in the filter device 402 is not limited, and a resin, a metal, or the like generally used for pretreatment of a biological sample may be used. However, in order to satisfy the capacity of the reagent to be added, it is desirable to have an allowable amount of at least 8 times the sample amount to be tested.
  • the volume of zinc sulfate solution used for hemolysis is 150 ⁇ l
  • the volume of methanol used for deproteinization is 200 ⁇ l.
  • the total amount of the reaction solution is 400 ⁇ l, which corresponds to 8 times the sample amount.
  • the material of the filter unit 405 in the filter device 402 is not limited as long as it has a filtering function, and a material generally used for pretreatment of a biological sample or the like may be applied.
  • the amount of aggregate produced by the reaction in the filter device 402 largely depends on the type, origin, amount, etc. of the specimen, but in order to avoid clogging of the filter unit 405, the upstream frit bottom area 413 in the solid phase extraction device 403. It is desirable that the bottom area 411 on the upstream side of the filter part is larger.
  • the pore size of the filter unit 405 is desirably ⁇ 2.0 ⁇ m or less in order to capture the contaminating fine components in the biological sample.
  • the material of the solid phase extraction reservoir 406 in the solid phase extraction device 403 is not limited, and a resin, metal, or the like that is generally used for pretreatment of a biological sample may be used. However, in order to satisfy the capacity of the reagent to be added, it is desirable to have an allowable amount that is at least equal to or larger than the amount of the deproteinized sample to be tested.
  • the structure of the filling portion of the solid phase extraction agent 408 in the solid phase extraction device 403 largely depends on the performance and specifications of the solid phase extraction agent 408 to be filled, but in order to maintain the extraction efficiency of the trace component in the minute volume sample. Furthermore, it is desirable that the filling height 414 be equal to or larger than the diameter of the upstream frit bottom surface 413. However, the sizes of the upstream frit bottom area 413 and the downstream frit bottom area 415 are not necessarily the same, and the filling shape of the solid-phase extraction agent 408 is, for example, a narrow tube (cylindrical shape). It may be in the shape. In addition, as the solid phase extraction agent 408 to be filled, one having performance suitable for extraction of the target component is applied.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of an operation method when a sample is prepared using the sample pretreatment equipment 401.
  • Example 3 shows a case where the solid phase extraction agent 508 in the reverse phase mode is used.
  • FIG. 5A first, an organic solvent such as methanol is added to the filter device 502, pressure is applied, and pressure is applied to the upper end opening of the sample pretreatment device 501 or suction from the lower end opening.
  • the solution is passed through the solid phase extraction agent 508 via the filter unit 505, and the liquid discharged from the lower end of the solid phase extraction device 503 is discarded.
  • the functional group of the solid phase extraction agent 508 is activated.
  • an aqueous solution such as a buffer is added to the filter device 502, pressure is applied, and pressure is applied to the upper end opening of the sample pretreatment device 501 or suction from the lower end opening. Then, the solution is passed through the solid phase extraction agent 508 via the filter unit 505, and the liquid discharged from the lower end of the solid phase extraction device 503 is discarded. By this operation, the activated solid-phase extraction agent 508 is equilibrated to complete the conditioning of the solid-phase extraction agent 508.
  • a sample is added to the filter device 502.
  • an internal standard substance is also added and it fully stirs.
  • a required amount of cleaning liquid is added to the filter device 502, pressure is applied to the sample pretreatment device 501, and pressure is applied to the upper end opening of the sample pretreatment device 501.
  • the liquid is extracted from the lower end of the solid phase extraction device 503 by passing through the solid phase extraction agent 508 via the filter unit 505 by suction from the lower end opening.
  • a required amount of eluate is added to the filter device 502, and pressure is applied to the sample pretreatment device 501 ⁇ application to the upper end opening of the sample pretreatment device 501.
  • the liquid discharged from the lower end of the solid-phase extraction device 503 is collected by allowing the solid-phase extraction agent 508 to pass through the filter portion 505 by pressure or suction from the lower end opening. By this operation, the target component specifically adsorbed on the solid phase extraction agent 508 is eluted and recovered.
  • This Example 4 has a syringe-type (detachable) equipment configuration.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram of a sample pretreatment apparatus (equipment) 601 that is Embodiment 4 of the present invention.
  • 6A shows a schematic configuration
  • FIG. 6B shows a schematic cross section of the sample pretreatment device 601.
  • the structure of the sample pretreatment device 601 in which the filter device 602 and the solid phase extraction device 603 are connected while having a structure that can be detached by a connection mechanism 616 such as a luer lock method will be described.
  • the sample pretreatment device 601 of the present invention is provided with a filter device 602 on the upstream side and a solid phase extraction device 603 on the downstream side, so that the solid phase extraction device can be directly recovered without temporarily collecting the filtrate from the filter device 602. Test at 603.
  • the filter device 602 includes a filter reservoir 604 and a filter unit 605.
  • the solid phase extraction device 603 includes a solid phase extraction reservoir 606, a solid phase extraction agent 608, and an upstream frit 607 and a downstream frit 609 that hold the solid phase extraction agent 608 in the solid phase extraction device 603.
  • the material of the filter reservoir 604 in the filter device 602 is not limited, and a resin, a metal, or the like generally used for pretreatment of a biological sample may be used. However, in order to satisfy the capacity of the reagent to be added, it is desirable to have an allowable amount of at least 8 times the sample amount to be tested.
  • the volume of zinc sulfate solution used for hemolysis is 150 ⁇ l
  • the volume of methanol used for protein removal is 200 ⁇ l.
  • the total amount of the reaction solution is 400 ⁇ l, which corresponds to 8 times the sample amount.
  • the material of the filter unit 605 in the filter device 602 is not limited as long as it has a filtering function, and a material generally used for pretreatment of a biological sample or the like may be applied.
  • the amount of aggregate produced by the reaction in the filter device 602 largely depends on the type, origin, amount, etc. of the specimen, but in order to avoid clogging of the filter unit 605, the upstream frit bottom area 613 in the solid phase extraction device 603 It is desirable that the bottom area 611 on the upstream side of the filter part is larger.
  • the pore size of the filter unit 605 is desirably ⁇ 2.0 ⁇ m or less in order to capture contaminant fine components in the biological sample.
  • the material of the solid-phase extraction reservoir 606 in the solid-phase extraction device 603 is not limited, and a resin, a metal, or the like that is generally used for biological sample pretreatment may be used. However, in order to satisfy the capacity of the reagent to be added, it is desirable to have an allowable amount that is at least equal to or larger than the amount of the deproteinized sample to be tested.
  • the structure of the filling portion of the solid-phase extraction agent 608 in the solid-phase extraction device 603 largely depends on the performance and specifications of the solid-phase extraction agent 608 to be filled, but in order to maintain the extraction efficiency of the trace components in the minute volume sample. Further, it is desirable that the filling height 614 is equal to or larger than the diameter of the upstream frit bottom surface 613. However, the sizes of the upstream frit bottom area 613 and the downstream frit bottom area 615 are not necessarily the same, and the filling shape of the solid phase extraction agent 608 is, for example, a narrow tube (cylindrical shape). It may be in the shape. In addition, as the solid phase extraction agent 608 to be filled, one having performance suitable for extraction of the target component is applied.
  • the lower end region of the filter device 602 and the upper end region of the solid-phase extraction device 603 have, for example, a screw-like structure 616 such as a luer lock for detaching both devices.
  • a structure in which the filter device 602 is inserted into the upper part of the solid phase extraction reservoir 606 or connected to the lower part of the filter device 602 by a structure in which the solid phase extraction device 603 can be inserted is also possible.
  • reagents used for conditioning the solid phase extraction agent 708, adsorption of the target component, removal of the contaminating component, and elution recovery of the target component an appropriate one is selected according to the characteristics of the solid phase extraction agent 708. For the sake of convenience, in this embodiment, a case where a solid phase extraction agent 708 in the reverse phase mode is used is shown.
  • an organic solvent such as methanol is added to the filter device 702, and pressure is applied to the upper end opening of the sample pretreatment device 701 or suction from the lower end opening.
  • liquid is passed through the solid-phase extraction agent 708 via the filter unit 705, and the liquid discharged from the lower end of the solid-phase extraction device 703 is discarded.
  • the functional group of the solid phase extraction agent 708 is activated.
  • an aqueous solution such as a buffer is added to the filter device 702, and pressure is applied to the upper end opening of the sample pretreatment device 701 or from the lower end opening.
  • aqueous solution such as a buffer
  • pressure is applied to the upper end opening of the sample pretreatment device 701 or from the lower end opening.
  • liquid is passed through the solid phase extraction agent 708 via the filter unit 705, and the liquid discharged from the lower end of the solid phase extraction device 703 is discarded.
  • the activated solid-phase extraction agent 708 is equilibrated to complete the conditioning of the solid-phase extraction agent 708.
  • a sample is added to the filter device 702.
  • an internal standard substance is also added and it fully stirs.
  • a necessary amount of the protein denaturing solution is added to the filter device 702 and sufficiently stirred.
  • proteins in the sample are denatured and aggregates are formed.
  • the agglomerates are filtered by applying pressure to the sample pretreatment device 701, applying pressure to the upper end opening of the sample pretreatment device 701, or suctioning from the lower end opening.
  • the filtrate is left on the equipment 702 side, and the filtrate is directly used as a solid phase extraction agent 708 via the filter unit 705 without collecting the filtrate.
  • the liquid discharged from the lower end of the solid-phase extraction device 703 is discarded.
  • the target component is adsorbed on the solid phase extractant 708 and the contaminating components that are not adsorbed on the solid phase extractant 708 are removed.
  • the filter device (702) is removed from the solid phase extraction device (703), and the filter device (702) is discarded.
  • a necessary amount of cleaning liquid is added into the solid-phase extraction device 703, and pressure is applied to the sample pretreatment device 701 to the upper end opening of the sample pretreatment device 701.
  • Liquid is passed through the solid-phase extraction agent 708 by pressurization or suction from the lower end opening, and the liquid discharged from the lower end of the solid-phase extraction device 703 is discarded.
  • contaminant components non-specifically adsorbed on the solid phase extraction agent 708 are removed.
  • a required amount of eluate is added into the solid-phase extraction device 703, and pressure is applied to the sample pretreatment device 701 to the upper end opening of the sample pretreatment device 701.
  • the solid phase extraction agent 708 is passed through by pressurization or suction from the lower end opening, and the liquid discharged from the lower end of the solid phase extraction device 703 is recovered. By this operation, the target component specifically adsorbed on the solid phase extraction agent 708 is eluted and collected.
  • This Example 4 has a syringe type (also used as a frit) device configuration.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram of a sample pretreatment apparatus (equipment) 801 that is Embodiment 5 of the present invention.
  • a sample pretreatment device 801 having a structure in which the filter device 802 and the solid phase extraction device 803 are connected and the filter unit 805 also serves as an upstream frit holding the solid phase extraction agent 808 will be described.
  • the filter device 802 and the solid-phase extraction device 803 are joined so as not to be separated from each other, and therefore do not have a function of detaching both devices.
  • the sample pretreatment equipment 801 is provided with a filter equipment 802 on the upstream side and a solid phase extraction equipment 803 on the downstream side, so that the solid phase extraction equipment 803 can be directly recovered without temporarily collecting the filtrate from the filter equipment 802. Can be tested.
  • the filter device 802 includes a filter reservoir 804 and a filter unit 805.
  • the solid-phase extraction device 803 does not have a solid-phase extraction reservoir, and is composed of a solid-phase extraction agent 808 and a downstream frit 809 that holds the solid-phase extraction agent 808 in the solid-phase extraction device 803.
  • the filter unit 805 has a substitute structure.
  • the material of the filter reservoir 804 in the filter device 802 is not limited, and a resin, a metal, or the like generally used for pretreatment of a biological sample may be used. However, in order to satisfy the capacity of the reagent to be added, it is desirable to have an allowable amount of at least 8 times the sample amount to be tested.
  • the volume of zinc sulfate solution used for hemolysis is 150 ⁇ l
  • the volume of methanol used for deproteinization is 200 ⁇ l.
  • the total amount of the reaction solution is 400 ⁇ l, which corresponds to 8 times the sample amount.
  • the material of the filter unit 805 in the filter device 802 is not limited as long as it has a filtering function, and a material generally used for pretreatment of a biological sample or the like may be applied.
  • the amount of aggregate produced by the reaction in the filter device 802 largely depends on the type, origin, amount, etc. of the specimen, but in order to avoid clogging of the filter unit 805, the solid phase extraction packed in the solid phase extraction device 803 It is desirable that the filter unit upstream side bottom area 811 is larger than the upstream side bottom surface 813 of the agent 808.
  • the size of the filter unit upstream side bottom surface 811 and the filter unit downstream side bottom surface 812 of the filter unit 805 are different, and the filter unit downstream side bottom surface 812 covers the upstream side bottom surface 813 of the solid phase extraction agent 808.
  • the pore size of the filter unit 805 is desirably ⁇ 2.0 ⁇ m or less in order to capture contaminant fine components in the biological sample.
  • the material of the solid-phase extraction device 803 is not limited, and a resin, a metal, or the like generally used for pretreatment of a biological sample may be used.
  • the structure of the solid-phase extraction agent 808 filling portion in the solid-phase extraction device 803 largely depends on the performance and specifications of the solid-phase extraction agent 808 to be filled, but in order to maintain the extraction efficiency of the trace components in the minute volume sample. It is desirable that the filling height 814 is equal to or larger than the diameter of the upstream bottom 813 of the solid phase extractant 808. However, the sizes of the upstream bottom area 813 and the downstream frit bottom area 815 of the solid phase extraction agent 808 are not necessarily the same, and the filling shape of the solid phase extraction agent 808 is, for example, a thin tube (columnar). It may be conical. In addition, as the solid phase extraction agent 808 to be filled, one having a performance suitable for extraction of the target component is applied.
  • the operating method for preparing a sample using the sample pretreatment equipment 801 is the same as in Example 3.
  • This Example 6 has a syringe type (prepack) equipment configuration.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram of a sample pretreatment apparatus (equipment) 901 that is Embodiment 6 of the present invention.
  • the sample pretreatment equipment 901 dedicated to target component measurement is obtained by adding an internal standard substance for target component measurement to a conditioned solid-phase extraction agent 908 filled in the sample pretreatment equipment 901.
  • the structure and characteristics of the sample pretreatment equipment 901 are the same as those shown in Examples 1 to 3 above, but since the solid phase extraction agent 908 has been conditioned, the surroundings of the solid phase extraction agent 908 are in equilibrium.
  • the sample pretreatment device 901 is filled with a solution used for the conversion, and the upper and lower openings of the sample pretreatment device 901 are sealed with caps 911 and 912.
  • sample pretreatment equipment 901 dedicated to target component measurement
  • a necessary amount of an internal standard substance for target component measurement is added to the slurry of the conditioned solid-phase extraction agent 908 filled in the sample pretreatment equipment 901.
  • the sample pretreatment equipment 901 is filled and the periphery thereof is filled with the equilibration solution, and the openings at the upper and lower ends of the sample pretreatment equipment 901 are sealed with caps 911 and 912. Yes.
  • a necessary amount of an internal standard substance for measuring the target component is added to the conditioned solid-phase extraction agent 908 filled in the sample pretreatment equipment 901 or the equilibration solution filling the surrounding area after filling. It does not matter as a configuration.
  • the upper end and lower end openings of the sample pretreatment equipment 901 are sealed with caps 911 and 912.
  • reagents used for conditioning the solid phase extractant 908, adsorption of the target component, removal of contaminating components, and elution recovery of the target component an appropriate one is selected according to the characteristics of the solid phase extractant 908. For the sake of convenience, in this embodiment, a case where a solid phase extraction agent 908 in the reverse phase mode is used is shown.
  • caps 911 and 912 sealing the upper and lower ends of the sample pretreatment equipment 901 are removed.
  • the equilibrated solution infiltrated with the solid phase extractant 908 is passed through the sample pretreatment equipment 901 by applying pressure or the like, and a necessary amount of the internal standard substance is adsorbed on the solid phase extractant 908.
  • a sample is added to the filter device 902.
  • a necessary amount of a hemolysis solution is added to the filter device 902, and the sample is sufficiently stirred.
  • the sample in the filter device 902 is filtered through the filter unit 905 by applying pressure to the sample pretreatment device 901, and the filtrate is directly passed through the filter unit 905 without recovery of the obtained filtrate.
  • the target component is adsorbed on the solid phase extractant 908 by passing it through the extractant 908 and passing it through.
  • contaminant components non-specifically adsorbed to the solid phase extraction agent 908 are removed by passing a cleaning liquid through the solid phase extraction agent 908 by applying pressure to the sample pretreatment equipment 901.
  • the target component specifically adsorbed to the solid phase extraction agent 908 is eluted and collected by passing the eluate through the solid phase extraction agent 908 by applying pressure to the sample pretreatment equipment 901.
  • a necessary amount of a preservative such as sodium azide may be added and provided.
  • the seventh embodiment has a chip-type equipment configuration.
  • 10A, 10B, and 10C are explanatory diagrams of a sample pretreatment apparatus (equipment) 1001 that is Embodiment 7 of the present invention.
  • 10A shows the configuration of the sample pretreatment device 1001
  • FIG. 10B shows the description of sample and reagent dispensing and stirring
  • FIG. 10C shows conditioning, adsorption, washing, and elution by suction and discharge.
  • the sample pretreatment device 1001 is connected to the filter device 1002 and the solid phase extraction device 1003 in a non-detachable manner so that they cannot be separated from each other. is there.
  • the sample pretreatment device 1001 is provided with a filter device 1002 on the upstream side and a solid phase extraction device 1003 on the downstream side, and the sample is directly applied to the solid phase extraction device 1003 without temporarily collecting the filtrate from the filter device 1002.
  • the filter device 1002 includes a filter reservoir 1004 and a filter unit 1005.
  • the solid-phase extraction device 1003 includes a solid-phase extraction reservoir 1006, a solid-phase extraction agent 1008, and an upstream frit 1007 and a downstream frit 1009 that hold the solid-phase extraction agent 1008 in the solid-phase extraction device 1003.
  • the material of the filter reservoir 1004 in the filter device 1002 is not limited, and a resin, a metal, or the like generally used for pretreatment of a biological sample may be used. However, in order to satisfy the capacity of the reagent to be added, it is desirable to have an allowable amount of at least 8 times the sample amount to be tested.
  • the volume of zinc sulfate solution used for hemolysis is 150 ⁇ l
  • the volume of methanol used for deproteinization is 200 ⁇ l.
  • the total amount of the reaction solution is 400 ⁇ l, which corresponds to 8 times the sample amount.
  • the material of the filter unit 1005 in the filter device 1002 is not limited as long as it has a filtering function, and a material generally used for pretreatment of a biological sample or the like may be applied.
  • the amount of aggregate produced by the reaction in the filter device 1002 largely depends on the type, origin, amount, etc. of the specimen, but in order to avoid clogging of the filter unit 1005, the upstream frit bottom area 1013 in the solid phase extraction device 1003. It is desirable that the bottom area 1011 on the upstream side of the filter part is larger.
  • the pore size of the filter unit 1005 is desirably ⁇ 2.0 ⁇ m or less in order to capture contaminant fine components in the biological sample.
  • the material of the solid-phase extraction reservoir 1006 in the solid-phase extraction device 1003 is not limited, and a resin, metal, or the like that is generally used for biological sample pretreatment or the like may be used. However, in order to satisfy the capacity of the reagent to be added, it is desirable to have an allowable amount that is at least equal to or larger than the amount of the deproteinized sample to be tested.
  • the structure of the filling portion of the solid phase extraction agent 1008 in the solid phase extraction device 1003 largely depends on the performance and specifications of the solid phase extraction agent 1008 to be filled, but in order to maintain the extraction efficiency of the trace components in the minute volume sample. Furthermore, it is desirable that the filling height 1014 is equal to or larger than the diameter of the upstream frit bottom 1013. However, the sizes of the upstream frit bottom area 1013 and the downstream frit bottom area 1015 do not necessarily have to be the same, and the filling shape of the solid phase extraction agent 1008 is, for example, a narrow tube (cylindrical shape). It may be in the shape. Further, as the solid phase extraction agent 1008 to be filled, one having a performance suitable for extraction of the target component is applied.
  • the filter reservoir 1104 has a swelled shape so that the sample and various reagents can be easily mixed with shaking. It doesn't matter.
  • the sample pretreatment device 1001 of Example 7 of the present invention is characterized in that a dispenser (pipetter) can be attached to the opening at the upper end of the filter device 1002, and the filtrate is filtered through the filter unit 1005 by a discharge operation.
  • the target component can be directly adsorbed to the solid-phase extraction agent 1008 without the temporary recovery.
  • a dispenser attached to the upper end opening of the filter device 1002 by immersing the lower end opening of the solid phase extraction device 1003 in the cleaning liquid stored in the container.
  • the washing liquid is sucked and discharged to the solid-phase extraction agent 1008 filled at the lower end of the solid-phase extraction device 1003, thereby washing and removing the non-specific adsorbed components on the solid-phase extraction agent 1008. It is characterized by that.
  • the above-described washing solution may be changed to a necessary amount of elution solution, and the target component specifically adsorbed on the solid phase extraction agent 1008 may be eluted and collected by the same suction and discharge operation.
  • the target component specifically adsorbed to the solid-phase extraction agent 1008 may be eluted and collected by sucking a required amount of the eluate and discharging it to a separate collection container.
  • Reagents used for conditioning the solid phase extractant 1208, adsorption of the target component, removal of contaminant components, and elution recovery of the target component are selected according to the characteristics of the solid phase extractant (1208. For convenience, In this embodiment, a case where a solid phase extraction agent 1208 in the reverse phase mode is used is shown.
  • the lower end opening of the solid-phase extraction device 1203 is immersed in an organic solvent such as methanol stored in the container, and attached to the upper end opening of the filter device 1202.
  • the organic solvent is sucked and discharged to the solid-phase extraction agent 1208 filled at the lower end of the solid-phase extraction device 1203 by pipetting operation of a pouring device (pipetter).
  • a pouring device pipetter
  • the lower end opening of the solid-phase extraction device 1203 is immersed in the aqueous solution stored in the container, and the filter device 1202 By pipetting operation of a dispenser (pipetter) attached to the upper end opening, the aqueous solution is sucked and discharged to the solid phase extraction agent 1208 filled at the lower end of the solid phase extraction device 1203. By this operation, the activated solid-phase extraction agent 1208 is equilibrated, whereby the conditioning of the solid-phase extraction agent 1208 is completed.
  • a dispenser pipetter
  • a sample is added to the filter device 1202 as shown in FIG.
  • an internal standard substance is also added and it fully stirs.
  • a dispenser (pipetter) is attached to the opening at the upper end of the filter device 1202, and the aggregate is left on the filter device 1202 side by the discharge operation, and the filtrate is not recovered.
  • the filtrate is directly used as a solid phase extraction agent 1208 via the filter unit 1205.
  • the liquid discharged from the lower end of the solid-phase extraction device 1203 is discarded.
  • the target component is adsorbed on the solid-phase extractant 1208 and the contaminating components that are not adsorbed on the solid-phase extractant 1208 are removed.
  • a dispenser attached to the upper end opening of the filter device 1202 by immersing the lower end opening of the solid phase extraction device 1203 in the cleaning liquid stored in the container.
  • the cleaning liquid is sucked and discharged with respect to the solid-phase extraction agent 1208 filled at the lower end of the solid-phase extraction device 1203.
  • contaminant components non-specifically adsorbed on the solid-phase extraction agent 1208 are removed.
  • the lower end opening of the solid-phase extraction device 1203 is immersed in the required amount of eluate stored in the container, and the upper end opening of the filter device 1202 is attached.
  • the eluate is sucked and discharged to the solid-phase extraction agent 1208 filled at the lower end of the solid-phase extraction device 1203 by pipetting operation of a pouring device (pipetter).
  • a pouring device pipetter
  • the solid phase extraction device is obtained by immersing the lower end opening of the solid phase extraction device 1203 in the eluate stored in the container and pipetting the dispenser (pipetter) attached to the upper end opening of the filter device 1202.
  • the required amount of eluate is sucked into the solid phase extractant 1208 filled at the lower end of 1203 and discharged to a separate collection container, so that the target component specifically adsorbed on the solid phase extractant 1208 is eluted and recovered. It doesn't matter.
  • Example 7 of the present invention the same effect as Example 2 can be obtained.
  • the eighth embodiment has a plate type configuration in which a plurality of sample pretreatment devices (equipment) are arranged.
  • FIG. 13 is an explanatory diagram of a plate-type sample pretreatment apparatus (equipment) 1301 that is Embodiment 8 of the present invention.
  • the plate-type sample pretreatment equipment 1301 has a structure in which each of the various sample pretreatment equipment shown in Examples 1 to 5 is arranged in a plurality of arrays.
  • the filter device 1302 has a plate shape, and a plurality of filter portions 1305 each having a filter reservoir 1304 are arranged and fixed on the filter device 1302.
  • the solid phase extraction device 1303 is also plate-shaped, and a plurality of members in which the downstream frit 1309, the solid phase extraction filler 1308, and the solid phase extraction reservoir 1306 are integrated are arranged in the solid phase extraction device 1303. It is fixed.
  • the filter device 1302 and the solid phase extraction device 1303 are connected to each other, and the filter reservoir 1304, the filter unit 1305, the downstream frit 1309, the solid phase extraction filler 1308, and the solid phase extraction reservoir 1306 are integrated.
  • Pre-processing equipment 1301 is formed.
  • the sample pretreatment device 1301 is operated in accordance with the processing steps described in Examples 1 to 5, but a plurality of devices corresponding to wells are processed in parallel.
  • the operation method in the case of preparing a sample using the sample pretreatment equipment 1301 is the same as in Examples 3 to 7, and a plurality of sample pretreatment equipments 1301 are collectively processed.
  • the same effect as in the second embodiment can be obtained, and a plurality of pre-processing equipment can be collectively processed.
  • the ninth embodiment has a valve switching type equipment configuration.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram of a sample pretreatment apparatus (equipment) 1401 that is Embodiment 9 of the present invention.
  • the sample pretreatment device 1401 that is Embodiment 9 of the present invention is configured to control the addition of the sample and the reagent to the solid phase extraction agent 1408 and the pressure application step by switching the flow path using a valve switching mechanism. .
  • the sample pretreatment equipment includes a filter equipment 1402, a solid phase extraction equipment 1403, a reagent test pump 1421, a recovery container 1424, or a detector 1424 connected to each other via valves 1422 and 1423.
  • a valve 1422 is provided on the upstream side of the solid-phase extraction device 1403, and the filter device 1402 and the reagent providing pump 1421 are connected to the valve 1422.
  • the downstream side of the solid-phase extraction device 1403 also has a structure capable of switching between waste liquid disposal and eluate recovery, and is indicated by a valve 1423 in the drawing for convenience.
  • Example 9 shows an example in which the solid phase extraction agent 1408 in the reverse phase mode is used.
  • an organic solvent such as methanol is passed through the solid phase extraction agent 1408 of the solid phase extraction device 1403 by the pump 1421 and the liquid discharged from the downstream pipe of the solid phase extraction device 1403 is discarded.
  • the upstream valve 1422 opens a flow path from the pump 1421 to the solid-phase extraction device 1403, and the downstream valve 1423 opens a flow path from the solid-phase extraction device 1403 to the waste liquid.
  • the functional group of the solid phase extraction agent 1408 is activated.
  • an aqueous solution such as a buffer is passed through the solid phase extraction agent 1408 of the solid phase extraction device 1403 by the pump 1421, and the liquid discharged from the downstream pipe of the solid phase extraction device 1403 is discarded.
  • the upstream valve 1422 opens a flow path from the pump 1421 to the solid-phase extraction device 1403, and the downstream valve 1423 opens a flow path from the solid-phase extraction device 1403 to the waste liquid.
  • the activated solid-phase extraction agent 1408 is equilibrated, whereby the conditioning of the solid-phase extraction agent 1408 is completed.
  • a sample is added to the filter device 1402.
  • an internal standard substance is also added and it fully stirs. At that time, there is no liquid flow through the upstream valve 1422 and the downstream valve 1423.
  • pressure is applied to the filter device 1402, and pressure is applied to the upper end opening of the filter device 1402 or suction from the lower end side to leave agglomerates on the filter device 1402 side, and without collecting the filtrate, the filter unit 1405.
  • the filtrate is used as a solid phase extractant 1408 as it is.
  • the liquid discharged from the lower end of the solid-phase extraction device 1403 is discarded.
  • the upstream valve 1422 opens a flow path from the filter device 1402 to the solid-phase extraction device 1403, and the downstream valve 1423 opens a flow channel from the solid-phase extraction device 1403 to the waste liquid.
  • the target component is adsorbed on the solid phase extractant 1408, and the contaminant components that are not adsorbed on the solid phase extractant 1408 are removed.
  • the cleaning liquid is passed through the solid phase extraction agent 1408 of the solid phase extraction device 1403 by the pump 1421, and the liquid discharged from the downstream pipe of the solid phase extraction device 1403 is discarded.
  • the upstream valve 1422 opens a flow path from the pump 1421 to the solid-phase extraction device 1403, and the downstream valve 1423 opens a flow path from the solid-phase extraction device 1403 to the waste liquid.
  • the eluate is passed through the solid phase extractant 1408 of the solid phase extraction device 1403 by the pump 1421, and the liquid discharged from the downstream pipe of the solid phase extraction device 1403 is recovered by the recovery container 1424 or sent to the detector 1424.
  • the upstream valve 1422 opens a flow path from the pump 1421 to the solid phase extraction device 1403, and the downstream valve 1423 opens a flow path from the solid phase extraction device 1403 to the recovery container 1424 or the detector 1424.
  • Example 10 is a method and apparatus using a solid-phase extraction agent to which an internal standard substance has been added.
  • the sample pretreatment equipment in Example 10 is characterized in that the solid-phase extraction agent is not filled in the solid-phase extraction equipment in advance as in the equipment configuration shown in each of the above-described Examples, and is provided separately. . That is, the downstream side frit is loaded in the vicinity of the lower end opening of the solid phase extraction device in advance, and the solid phase extraction agent is filled therein to be used for sample preparation. The upstream frit may be loaded as necessary after filling the solid-phase extraction agent into the solid-phase extraction device.
  • the solid phase extraction agent at that time may be in a dry state or a slurry.
  • the solid phase extractant When the solid phase extractant is provided in the form of a slurry, the solid phase extractant may be either not conditioned or conditioned.
  • the solid-phase extraction agent When the solid-phase extraction agent is provided in the form of a conditioned slurry, it may be in a state where an internal standard substance is not added to the slurry or in a state where it is added in advance.
  • the conditioning process can be omitted.
  • the internal standard substance for measuring the target component when a necessary amount of the internal standard substance for measuring the target component is added to the conditioned solid phase extraction agent in advance, it can be provided as a kit dedicated to the target component measurement. In this case, after filling the solid-phase extraction device with the same solid-phase extraction agent, the operation can be started from the sample addition step without the conditioning step, and the final eluate can be used for direct measurement without the internal standard addition step. It becomes possible to do.
  • a necessary amount of a preservative such as sodium azide may be added and provided.
  • a conditioned filler slurry obtained by adding a necessary amount of an internal standard material in advance under an adsorbable condition is provided as a solid-phase extraction agent for specific measurement purposes. Is. And, while performing hemolysis and deproteinization treatment in one sample pretreatment equipment, and filtering the reaction product, solid-phase extraction of the target component in the filtrate, without the temporary recovery of the product that occurs in the middle, It is characterized by batch processing.
  • a solid-phase extraction device having an internal standard substance added thereto as a prepack device that is sealed so that the solvent does not evaporate. At that time, a filter device for the purpose of deproteinization may be provided on the upstream side of the solid phase extraction agent.
  • a pretreatment method having a mechanism in which a reaction vessel (filter device) having a mechanism for filtering a reaction product and a solid phase extraction device are connected, and a solid phase extraction agent can be directly used without temporarily collecting the filtrate, and
  • the equipment (kit) can be provided.
  • the omission of the temporary collection process eliminates the need for a temporary collection container, thereby reducing the number of consumables and their costs, and avoiding sample loss and carryover that occur during the temporary collection process.
  • the required amount of the internal standard substance of the measurement target component is added in advance to the solid-phase extraction agent that has already been packed in the prepack device, thereby providing the prepack device as a sample pretreatment device dedicated to the measurement target component.
  • the user can perform sample pretreatment without preparing the internal standard substance, and can measure the extracted component by, for example, mass spectrometry even if the internal standard substance addition step is omitted.
  • This kind of conditioned solid-phase extractant with the necessary amount of internal standard added in advance is measured by providing not only prepack equipment but also unfilled solid-phase extraction equipment as a slurry before filling the solid-phase extraction equipment. It is also possible to provide a sample pretreatment kit dedicated to the target component, and the user can adjust the amount of slurry as appropriate according to the extraction amount of the target component to be measured, and can perform sample pretreatment without the preparation of an internal standard substance. Even if the step of adding the internal standard substance is omitted, for example, extraction components can be measured by mass spectrometry or the like.
  • the present invention can be widely applied not only in the clinical laboratory field but also in an analytical field that requires purification from a contaminated component in order to detect a target component.
  • it can be used for practical use in the fields of environment, food, medical use, public security (anti-terrorism / illegal drugs), and basic / applied research therefor.
  • Solid phase extraction reservoir Reference numeral 407: upstream frit, 408: solid phase extractant, 409: downstream frit, 411: filter unit upstream bottom surface, 413: upstream frit Surface, 414 ... fill height, 415 ... downstream frit bottom, 501 ... sample pretreatment equipment, 502 ... filter equipment, 503 ... solid phase extraction equipment, 505 ... filter section, 508 ... Solid phase extractant, 601 ... Sample pretreatment equipment, 602 ... Filter equipment, 603 ... Solid phase extraction equipment, 604 ... Filter reservoir, 605 ... Filter section, 606 ..Solid phase extraction reservoir, 607 ... upstream frit, 608 ... solid phase extractant, 609 ... downstream frit, 611 ...
  • upstream bottom surface of the filter section 613 ... upstream frit bottom surface , 614 ... filling height, 615 ... downstream frit bottom surface, 616 ... screw-like structure such as luer lock, 701 ... sample pretreatment equipment 702 ... Filter equipment, 703 ... Solid phase extraction equipment, 705 ... Filter part, 708 ... Solid phase extraction agent, 801 ... Sample pretreatment equipment, 802 ... Filter equipment, 803 ..Solid phase extraction equipment, 804... Filter reservoir, 805... Filter part, 808... Solid phase extractant, 809 .. Downstream frit, 811. ⁇ 813. -Filter equipment, 903 ... Solid phase extraction equipment, 905 ... Filter part, 908 ...
  • Solid phase extraction filler 911 ... Upstream cap, 912 ... Downstream cap, 1001 ...
  • Sample pretreatment equipment 1002 ... Filter equipment, 1003 ... Solid phase extraction equipment, 1004 ... Filter reservoir, 1005 ... Filter section, 1006 ... Solid phase extraction reservoir, 1007 ..Upstream frit, 1008... Solid phase extractant, 1009. Downstream frit, 1011... Filter unit upstream bottom, 1013. Upstream frit bottom, 1014. ... Bottom frit bottom surface, 1101 ... Sample pretreatment equipment, 1102 ... Filter equipment, 1103 ... Solid phase extraction equipment, 1104 ... Filter reservoir, 1105 ... Filter section, 1106 ... ⁇ Solid phase extraction reservoir, 1107... Upstream frit, 1108...
  • Solid phase extractant 1109. Lit, 1202 ... Filter equipment, 1203 ... Solid phase extraction equipment, 1205 ... Filter part, 1208 ... Solid phase extraction agent, 1301 ... Sample pretreatment equipment, 1302 ... Filter equipment, 1303 ... Solid phase extraction equipment, 1304 ... Filter reservoir, 1305 ... Filter unit, 1306 ... Solid phase extraction reservoir, 1308 ... Solid phase extraction agent, 1309 ... Downstream frit, 1401 ... Sample pretreatment equipment, 1402 ... Filter equipment, 1403 ... Solid phase extraction equipment, 1405 ... Filter section, 1408 ... Solid phase extraction agent, 1421 ... Pump, 1422 ... Upstream valve, 1423 ... downstream valve, 1424 ... recovery container or detector

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Abstract

　反応処理後の濾過液を一次回収することなく、固相抽出処理に供給することが可能な試料処理装置が実現される。固相抽出器材（３０３）に固相抽出剤（３０８）を必要量添加しコンディショニングを行う。固相抽出剤（３０８）に水系溶液を添加し上清を廃棄する。固相抽出器材（３０３）の開口部にフィルター器材（３０２）を装着しフィルターリザーバー（３０４）内に試料を添加する。溶血溶液を添加し十分に撹拌して血球を破壊する。タンパク質変性溶液を添加し十分に撹拌し、試料中のタンパク質を変性し凝集物を形成する。遠心分離して凝集物をフィルター器材（３０２）側に残し濾液の回収なしにフィルター部（３０５）経由で濾液を固相抽出剤に供試する。固相抽出器材（３０３）内に必要量の洗浄液を添加し、撹拌後遠心分離し上清を廃棄する。固相抽出器材（３０３）内に必要量の溶出液を添加し、十分に撹拌後遠心分離し、上清を廃棄する。

Description

生体試料前処理方法及び装置
　本発明は、検体の溶血処理、除タンパク質処理、固相抽出処理を実施するための前処理を行う生体試料前処理方法及び装置に関する。
　例えば、多成分からなる血液試料からの目的成分抽出には、目的成分のサイズ、重量、形状のような物理的性質や、溶解性、親和性のような生化学的な性質を指標とした様々な技術が存在する。特に、血液のような生体試料中の微量成分の抽出に関しては、クロマトグラフィーによる分離技術が発達しており、目的成分に適した充填剤の開発やメソッドの至適化がなされている。このような高度な分離技術を用いる場合であっても、様々な細胞や異なった諸性質を示す多成分からなる血液から目的微量成分を効率良く抽出するためには、抽出可能な状態にするための試料調製や粗精製が必須となる。
　血液中の微量成分を測定する臨床検査事例として、血中治療薬物モニタリング（Therapeutic Drug Monitoring, TDM）が挙げられる。ＴＤＭは、薬効を示す治療域が狭い薬剤等に適用され、投薬後の患者血液中の薬剤濃度を経時的に確認することにより、患者ごとに適正な投与設計を実践するために必要な検査である。
　ＴＤＭの対象薬剤として、抗てんかん剤、抗菌剤、免疫抑制剤、抗不整脈剤、抗精神剤等が挙げられる。多くの薬剤は血清中に分布するが、例えば臓器移植患者等に投与される免疫抑制剤は脂溶性が高く、血球移行性があるため、その血中濃度を測定する場合には、溶血させて血球内容物を取り出した後にタンパク質等に吸着している薬剤を抽出する前処理が必要となる。
　溶血手法としては、化学的、物理的、生物学的な原理を応用して実施することができる。
　例えば、化学的な溶血手法としては、各種溶媒や界面活性剤により細胞膜を構成する脂質を溶解あるいは損傷させることにより溶血を引き起こすことが挙げられる。
　また、物理学的な手法としては、圧力、遠心力、撹拌、凍結融解、低張化等が挙げられる。生物学的な手法としては、血球への抗体や補体結合に起因する膜貫通タンパク質複合体形成や病原性細菌が産生する溶血素（ヘモリジン）による血球細胞膜への孔形成等が挙げられる。
　一方、血液中のタンパク質に吸着している目的成分を回収する手法として除タンパク質処理あるいは液／液抽出が挙げられる。溶血処理したサンプルに有機溶媒を添加することにより、目的成分を有機溶媒側に抽出するとともに、タンパク質を変性させ、一般的には遠心分離することによって凝集タンパク質と上清を分離した後、上清画分を回収している。除タンパク質処理は、血中に多種多様かつ大量に含まれているタンパク質を凝集させることによって除去する工程であり、このような処理を施すことによってはじめて全血由来の試料を血清あるいは血漿検体と同等に扱える状態になる。
　有機溶媒は前述のように溶血効果もあるため、直接血液に添加して溶血、液／液抽出、除タンパク質を行う手法もある。また、そのときに除タンパク質効果を補足するため、前述の硫酸亜鉛を添加する手法もある。
　全血検体に前記のような処理を施すことによって、血球移行性の薬剤を溶液状態で回収することができるため、例えば、固相抽出処理や液体クロマトグラフィー分離等のような精製操作に供試することが可能となる。一般的には、液／液抽出後の回収上清はドライアップした後、適切な容量の溶解液で再溶解することにより、液量の低減と目的成分の濃縮を行う。その後、例えば、再溶解物を液体クロマトグラフィー質量分析計（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer, LCMS）等に供試することにより、濃縮後の目的成分の分離精製と検出を行い、目的成分の同定や定量解析を実施する。
　固相抽出の公知技術としては、特許文献１に記載された技術がある。この特許文献１に記載の技術は、例えばシリンジ状の容器に固相抽出剤を充填し、その充填剤を保持するために充填剤の上流と下流をフィルター（フリット）で挟んだ構造の固相抽出カラムである。
特許第４０６２６３７号公報
　血液等の生体試料に含まれる目的成分は微量であるため、前処理においては、極力その消費を避ける必要がある。しかしながら、従来の技術においては、生体試料について、反応産物の濾過処理後の試料を一時回収して容器等に収容し、別個の容器等を用いて固相抽出処理を行っていた。
　このため、上記一次回収の際に、試料のロス発生や、他の試料等とのコンタミネーションが発生する可能性があった。
　また、一次回収用の容器やチップ等が必要であり、そのためのコストや洗浄等が必要であった。
　さらに、試料の反応は上述したように複雑な処理が必要であり、手間や時間を要していた。
　本発明の目的は、反応処理後の濾過液を一次回収することなく、固相抽出処理に供給することが可能な生体試料前処理方法及び装置を実現することである。
　上記目的を達成するため、本発明は次のように構成される。
　本発明の生体試料前処理方法及び装置は、フィルター器材に収容されたフィルター部材に生体試料と除タンパク質試薬を供給し、上記フィルター部材の濾過液を、固相抽出剤を収容する固相抽出器材の上記固相抽出剤に供給し、上記固相抽出剤に含まれた上記濾過液から、生体試料の固相を抽出する。
　反応処理後の濾過液を一次回収することなく、固相抽出処理に供給することが可能な試料処理方法及び装置を実現することができる。
本発明の実施例１における試料前処理方法の前処理フローを説明する図である。 免疫抑制剤のメタノール溶解性を示すグラフである。 本発明の実施例２である懸濁方式の試料前処理装置の説明図である。 本発明の実施例３であるシリンジ方式の試料前処理装置を示す図である。 本発明の実施例３である試料前処理器材を用いて試料調製する場合の操作法についての説明図である。 本発明の実施例４である試料前処理装置の説明図である。 本発明の実施例４である試料前処理器材を用いて試料調製する場合の操作法についての説明図である。 本発明の実施例５である試料前処理装置の説明図である。 本発明の実施例６である試料前処理装置の説明図である。 本発明の実施例７である試料前処理装置の説明図である。 本発明の実施例７である試料前処理装置の説明図である。 本発明の実施例７である試料前処理装置の説明図である。 本発明の実施例７の変形例の説明図である。 本発明の実施例７の変形例の説明図である。 本発明の実施例７である試料前処理装置の動作説明図である。 本発明の実施例８であるプレート方式の試料前処理装置の説明図である。 本発明の実施例９である試料前処理装置の説明図である。
　本発明の実施例を、添付図面を参照称して説明する。
　図１は、本発明の実施例１における試料前処理方法の前処理フローを説明する図である。図１の前処理フロー１０３は、本発明の実施例１における前処理フローであり、全血処理と固相抽出処理とを一括して処理する。
　図１は、本発明の前処理と比較するため、個別に全血処理（処理フロー１０１）と固相抽出処理（処理フロー１０２）とを行うフローを示している。
　（サンプル調製工程および免疫抑制剤の溶解性）
　処理フロー１０１においては、全血検体をフィルター器材に分注し、さらに溶血処理液（硫酸亜鉛水溶液等）を分注した後に攪拌する。その後、徐タンパク質液（メタノール等）を分注して、攪拌した後、濾過（あるいは遠心分離）する。
　この場合、例えば、免疫抑制剤のように、疎水性が高く、血球移行性がある薬剤の場合、患者検体からの目的成分の抽出のためには、最初に溶血させる必要がある。溶血は、例えば、全血試料に対してＨ２Ｏを添加することで低張化し、血球をバーストさせることで行われる。
　また、全血中の夾雑成分であるタンパク質を除去するため、有機溶媒によりタンパク質変性を引き起こし、凝集させ、遠心分離あるいは濾過により上清を回収する。この除タンパク質処理は、検体が全血以外（例えば、血清、血漿、尿、体液等）であっても、クリーンアップ効果が期待できる。
　次に、処理フロー１０２において、固相抽出剤に有機溶媒を添加し、圧力を付加し、水を添加し、圧力を付加することにより、固相抽出剤をコンディショニングし、その固相抽出剤に前述の一時回収した濾液（上清）を添加し、内部標準物質を添加した後に攪拌する。そして、圧力付加→洗浄液添加→圧力付加→溶出液（メタノール等）添加→圧力付加を行い、目的成分を吸着させ、洗浄により非特異的に吸着した成分を除去した後、目的成分を溶出回収することで試料調製が完了する。
　本発明の実施例１では、溶血および除タンパク質処理後の濾液を、一時回収なしに、直接固相抽出剤に供試することにより、固相抽出剤への目的成分の吸着処理を行うことを特徴とする（処理フロー１０３）。
　本発明の実施例１の試料前処理方法に使用される前処理装置はフィルター器材と固相抽出器であるカラムとが一体となっている。このため、まず、前処理装置（固相抽出カートリッジ）は、処理フロー１０２におけるコンディショニングと同様なコンディショニングが行われ、その後、処理フロー１０１と同様な全血検体分注から濾過（ただし、圧力付加による濾過）が行われ、濾液の一時回収を行うことなく、処理フロー１０２と同様な内部標準物質添加から溶出液添加、圧力付加が行われ、固相が抽出される。
　この場合、濾液の組成が目的成分の固相抽出剤への吸着条件に適合していることが必要となる。
　このことを詳細に説明するために、一例として、免疫抑制剤のメタノール溶解性について説明する。
　例えば、タクロリムス、シロリムス（ラパマイシン）、エベロリムス、シクロスポリンのような免疫抑制剤は疎水性が高く、水系の溶液には溶解し難い性質を有する。これら薬剤のメタノールに対する溶解性を検討したところ、５０％以上のメタノール存在下でなければ安定して溶解しない傾向が認められた。
　事例として、図２にエベロリムス（２０１）およびシクロスポリン（２０２）のデータを示す。このことは、これら薬剤を抽出対象とする場合は、除タンパク質処理時および固相抽出剤への試料供試時の有機溶媒の終濃度に注意する必要があり、少なくともメタノールを用いる場合は５０％以上であることが望ましいことを示している。
　このような免疫抑制剤のように疎水性の高い薬剤の場合、除タンパク質時のメタノール終濃度を５０％に設定することにより、タンパク質変性による凝集物形成だけでなく、溶血処理により血球外に取り出された免疫抑制剤を上清側に溶解できるとともに、そのまま固相抽出剤へ吸着処理することも可能となる。このことにより、除タンパク質処理で得られる濾液を直接固相抽出剤に供試することが可能となる。
　一方、親水性の高い薬剤の場合は、除タンパク質時のメタノール終濃度が５０％になると、その濾液を直接固相抽出剤に供試しても目的成分を吸着させることができない。その場合は、タンパク質変性後の凝集物懸濁液にＨ２Ｏ等を必要量添加し、メタノール濃度を低下させてから濾過処理を行い、その濾液を直接固相抽出剤に供試することにより、目的成分を固相抽出剤に吸着させることも可能である。
　後述する各実施例について、前述した除タンパク質時の濾液の一時回収なしに直接固相抽出剤に供試することで目的成分を吸着させる手法は、いずれの器材構成であっても適用可能である。
　評価用の試料として患者全血検体がない場合、擬似的な患者全血検体を調製して用いることが可能である。擬似患者全血検体は、健常人から採血した全血検体に対して、例えば５０％メタノールで溶解した免疫抑制剤標品を終濃度が各免疫抑制剤の治療域濃度程度になるように添加することで調製できる。さらに、調製した擬似患者全血検体を３７°Ｃで緩やかに転倒混和しながら３０ｍｉｎインキュベートすることにより、各免疫抑制剤の血球移行を再現することも可能である。
　以上のように、本発明の実施例１によれば、反応処理後の濾過液を一次回収することなく全血処理と固相抽出処理を一括して行うように構成したので、一次回収の際に発生する、生体試料のロスや、他の生体試料等とのコンタミネーションを抑制することができる。
　また、一次回収用の容器やチップ等が不要であり、そのためのコストや洗浄等を省略することができる。
　次に、本発明の実施例２である生体試料前処理装置について説明する。この実施例２は、懸濁方式の器材構成となっている。
　図３は、本発明の実施例２である懸濁方式の試料前処理装置の説明図である。
　図３の（Ｃ）に示すように、試料前処理器材３０１は、フィルター器材３０２を固相抽出器材３０３に挿入することで一体化することを特徴とする。
　本試料前処理器材３０１は、上流側にフィルター器材３０２、下流側に固相抽出器材３０３が配置され、フィルター器材３０２からの濾液を一時回収することなしに直接固相抽出器材３０３に供試することを特徴とする。
　フィルター器材３０２は、フィルターリザーバー３０４とフィルター部３０５で構成される。また、固相抽出器材３０３は、カップ状であり、固相抽出剤３０８を添加して使用する。
　フィルター器材３０２におけるフィルターリザーバー３０４の素材は問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用される樹脂や金属等を用いて構わない。ただし、添加する試薬分の容量を満たすために、少なくとも供試するサンプル量の８倍以上の許容量を有することが望ましい。
　これは、例えば、免疫抑制剤抽出のためにサンプルとして全血５０μｌを用いた場合、溶血処理に用いる硫酸亜鉛溶液の容量は１５０μｌ、除タンパク質処理に用いるメタノールの容量は２００μｌであるため、そのときの反応溶液の全量は４００μｌとなり、サンプル量の８倍量に相当することに起因する。
　また、フィルター器材３０２におけるフィルター部３０５の素材は濾過機能を有するものであれば問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用されるものを適用して構わない。フィルター器材３０２内における反応で生成される凝集物量は検体の種類、由来、量等に大きく依存するが、フィルター部３０５の目詰まりを避けるために、フィルター部上流側底面積３１１は大きいことが望ましい。また、フィルター部３０５のポアサイズは生体試料中の夾雑微細成分を捕捉するために、φ２．０μｍ以下であることが望ましい。
　固相抽出器材３０３の素材は問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用される樹脂や金属等を用いて構わない。ただし、添加する試薬分の容量を満たすために、少なくとも供試する除タンパク質処理済みサンプル量と同等以上の許容量を有することが望ましい。
　また、固相抽出器材３０３に充填する固相抽出剤３０８は対象成分の抽出に適した性能を有するものを適用する。例えば、シリカゲルやポリマー、樹脂製のビーズ等を適用することができる。
　同試料前処理器材３０１を用いて試料調製する場合の操作法について以下に示す。
　固相抽出剤３０８に対するコンディショニング、目的成分の吸着、夾雑成分の除去、目的成分の溶出回収に用いる各試薬は、固相抽出剤３０８の特性にしたがって適切なものを選択する。便宜的に、本実施例では逆相モードの固相抽出剤３０８を使用したときの事例で示す。
　図３の（Ａ）、（Ｂ）において、カップ状の固相抽出器材３０３に固相抽出剤３０８を必要量添加し、最初にそのコンディショニングを行う。まず、固相抽出剤３０８の官能基を活性化させるため、例えばメタノール等の有機溶媒を添加し、十分に撹拌後、遠心分離して上清を廃棄する（図３の（Ａ））。
　次に、固相抽出剤３０８を平衡化するため、例えばバッファー等の水系溶液を添加し、十分に撹拌後、遠心分離して上清を廃棄する（図３の（Ｂ））。
　以上により、固相抽出剤３０８のコンディショニングが完了する。
　次に、図３の（Ｃ）に示すように、固相抽出器材３０３の開口部にフィルター器材３０２を装着し、フィルターリザーバー３０４内に試料を添加する。その際、例えば、抽出成分を質量分析等で測定する場合には、内部標準物質も添加し、十分に撹拌する。
　次に、図３の（Ｄ）に示すように、試料が全血で血球内成分を取り出す必要がある場合は、必要量の溶血溶液を添加し、十分に撹拌することにより、血球を破壊する。
　次に、図３の（Ｅ）に示すように、必要量のタンパク質変性溶液を添加し、十分に撹拌する。これにより、試料中のタンパク質が変性し、凝集物を形成する。
　次に、図３の（Ｆ）に示すように、試料前処理器材３０３を遠心分離にかけることにより、凝集物をフィルター器材３０２側に残し、濾液の回収なしに、ガラスフィルター、樹脂製フィルター等のフィルター部３０５経由でそのまま濾液を固相抽出剤に供試する。この操作により、固相抽出剤３０８に目的成分が吸着する。
　次に、フィルター器材３０２を廃棄し、固相抽出器材３０３内の固相抽出剤３０８を十分に撹拌し、遠心分離後、上清を廃棄する。この操作により、固相抽出剤３０８に吸着しなかった夾雑成分が除去される。
　次に、図３の（Ｇ）に示すように、固相抽出器材３０３内に必要量の洗浄液を添加し、十分に撹拌後遠心分離し、上清を廃棄する。この操作により、固相抽出剤３０８に非特異的に吸着した夾雑成分が除去される。
　次に、図３の（Ｈ）に示すように、固相抽出器材３０３内に必要量の溶出液を添加し、十分に撹拌後遠心分離し、上清を廃棄する。この操作により、固相抽出剤３０８に特異的に吸着した目的成分を溶出回収する。
　例えば、固相抽出剤３０８が磁性体である場合、前述のような遠心分離ではなく、固相抽出器材３０３表面にマグネット等を近付けることにより、固相抽出剤３０８と上清を分離しても構わない。
　以上のように、本発明の実施例２によれば、反応処理後の濾過液を一次回収することなく全血処理と固相抽出処理を一括して行うように構成したので、簡単な構成で反応処理を行うことができると共に、一次回収の際に発生する、試料のロスや、他の試料等とのコンタミネーションを抑制することができる。
　また、一次回収用の容器やチップ等が不要であり、そのためのコストや洗浄等を省略することができる。
　次に本発明の実施例３である試料前処理装置について説明する。この実施例２は、シリンジ方式（脱着不可）の器材構成となっている。
　図４は、本発明の実施例３であるシリンジ方式（脱着不可）の試料前処理装置（試料前処理器材）４０１の構造を示す図である。
　図４において、試料前処理器材４０１は、フィルター器材４０２と固相抽出器材４０３が、互いに切り離せないように脱着不可の構造となっている。
　試料前処理器材４０１は、上流側にフィルター器材４０２、下流側に固相抽出器材４０３が配置され、フィルター器材４０２からの濾液を一時回収することなしに直接固相抽出器材４０３に供試する。
　フィルター器材４０２は、フィルターリザーバー４０４とフィルター部４０５で構成される。また、固相抽出器材４０３は、固相抽出リザーバー４０６、固相抽出剤４０８および固相抽出剤４０８を固相抽出器材４０３内に保持する上流側フリット４０７と下流側フリット４０９で構成される。
　フィルター器材４０２におけるフィルターリザーバー４０４の素材は問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用される樹脂や金属等を用いて構わない。ただし、添加する試薬分の容量を満たすために、少なくとも供試するサンプル量の８倍以上の許容量を有することが望ましい。
　これは、例えば、免疫抑制剤抽出のためにサンプルとして全血５０μｌを用いた場合、溶血処理に用いる硫酸亜鉛溶液の容量は１５０μｌ、除タンパク質処理に用いるメタノールの容量は２００μｌであるため、そのときの反応溶液の全量は４００μｌとなり、サンプル量の８倍量に相当することに起因する。
　また、フィルター器材４０２におけるフィルター部４０５の素材は濾過機能を有するものであれば問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用されるものを適用して構わない。フィルター器材４０２内における反応で生成される凝集物量は検体の種類、由来、量等に大きく依存するが、フィルター部４０５の目詰まりを避けるために、固相抽出器材４０３における上流側フリット底面積４１３よりもフィルター部上流側底面積４１１は大きいことが望ましい。
　また、フィルター部４０５のポアサイズは生体試料中の夾雑微細成分を捕捉するために、φ２．０μｍ以下であることが望ましい。
　固相抽出器材４０３における固相抽出リザーバー４０６の素材は問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用される樹脂や金属等を用いて構わない。ただし、添加する試薬分の容量を満たすために、少なくとも供試する除タンパク質処理済みサンプル量と同等以上の許容量を有することが望ましい。
　また、固相抽出器材４０３における固相抽出剤４０８の充填部の構造は、充填する固相抽出剤４０８の性能や仕様に大きく依存するが、微容量試料中の微量成分の抽出効率を保つために、上流側フリット底面４１３の直径と同等以上の充填高４１４であることが望ましい。ただし、上流側フリット底面積４１３と下流側フリット底面積４１５の大きさは必ずしも同一である必要はなく、固相抽出剤４０８の充填形状は、例えば細管状（円柱状）であっても、円錐状であっても構わない。また、充填する固相抽出剤４０８は対象成分の抽出に適した性能を有するものを適用する。
　図５は、試料前処理器材４０１を用いて試料調製する場合の操作法についての説明図である。
　固相抽出剤５０８に対するコンディショニング、目的成分の吸着、夾雑成分の除去、目的成分の溶出回収に用いる各試薬は、固相抽出剤５０８の特性にしたがって適切なものを選択する。便宜的に、本実施例３では逆相モードの固相抽出剤５０８を使用したときの事例で示す。
　図５の（Ａ）において、まず、フィルター器材５０２に例えばメタノール等の有機溶媒を添加し、圧力印加し、試料前処理器材５０１の上端開口部への加圧あるいは下端開口部からの吸引により、フィルター部５０５経由で固相抽出剤５０８に通液させ、固相抽出器材５０３の下端から排出される液を廃棄する。この操作により、固相抽出剤５０８の官能基を活性化させる。
　次に、図５の（Ｂ）において、フィルター器材５０２に例えばバッファー等の水系溶液を添加し、圧力印加して試料前処理器材５０１の上端開口部への加圧あるいは下端開口部からの吸引により、フィルター部５０５経由で固相抽出剤５０８に通液させ、固相抽出器材５０３の下端から排出される液を廃棄する。この操作により、活性化させた固相抽出剤５０８を平衡化させることで、固相抽出剤５０８のコンディショニングが完了する。
　次に、図５の（Ｃ）に示すように、フィルター器材５０２に試料を添加する。その際、例えば、抽出成分を質量分析等で測定する場合には、内部標準物質も添加し、十分に撹拌する。
　次に、図５の（Ｄ）に示すように、試料が全血で血球内成分を取り出す必要がある場合は、必要量の溶血溶液を添加し、十分に撹拌する。この操作により、血球を破壊する。
　次に、図５の（Ｅ）に示すように、フィルター器材５０２に必要量のタンパク質変性溶液を添加し、十分に撹拌する。この操作により、試料中のタンパク質が変性し、凝集物が形成される。
　次に、図５の（Ｆ）に示すように、試料前処理器材５０１へ圧力印加し、試料前処理器材５０１の上端開口部への加圧あるいは下端開口部からの吸引により、凝集物をフィルター器材５０２側に残し、濾液の回収なしに、フィルター部５０５経由でそのまま濾液を固相抽出剤５０８に供試する。固相抽出器材５０３の下端から排出される液は廃棄する。この操作により、固相抽出剤５０８に目的成分が吸着するとともに、固相抽出剤５０８に吸着しなかった夾雑成分が除去される。
　次に、図５の（Ｇ）に示すように、フィルター器材５０２内に必要量の洗浄液を添加し、試料前処理器材５０１へ圧力印加し、試料前処理器材５０１の上端開口部への加圧あるいは下端開口部からの吸引により、フィルター部５０５経由で固相抽出剤５０８に通液させ、固相抽出器材５０３の下端から排出される液を廃棄する。この操作により、固相抽出剤５０８に非特異的に吸着した夾雑成分が除去される。
　次に、図５の（Ｈ）に示すように、フィルター器材５０２内に必要量の溶出液を添加し、試料前処理器材５０１への圧力印加＜試料前処理器材５０１の上端開口部への加圧あるいは下端開口部からの吸引により、フィルター部５０５経由で固相抽出剤５０８に通液させ、固相抽出器材５０３の下端から排出される液を回収する。この操作により、固相抽出剤５０８に特異的に吸着した目的成分を溶出回収する。
　本発明の実施例３においても、実施例２と同様な効果を得ることができる。
　次に、本発明の実施例４である試料前処理装置について説明する。この実施例４は、シリンジ方式（脱着可）の器材構成となっている。
　図６は、本発明の実施例４である試料前処理装置（器材）６０１の説明図である。図６の（Ａ）は、概略構成を示し、図６の（Ｂ）は、試料前処理器材６０１の概略断面を示している。
　フィルター器材６０２と固相抽出器材６０３が、ルアーロック方式等の連結機構６１６により脱着可能な構造を有しながら連結された試料前処理器材６０１の構造について説明する。
　図６において、本発明の試料前処理器材６０１は上流側にフィルター器材６０２、下流側に固相抽出器材６０３が配置され、フィルター器材６０２からの濾液を一時回収することなしに直接固相抽出器材６０３に供試する。
　フィルター器材６０２は、フィルターリザーバー６０４とフィルター部６０５とを備える。また、固相抽出器材６０３は、固相抽出リザーバー６０６、固相抽出剤６０８および固相抽出剤６０８を固相抽出器材６０３内に保持する上流側フリット６０７と下流側フリット６０９とを備える。
　フィルター器材６０２におけるフィルターリザーバー６０４の素材は問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用される樹脂や金属等を用いて構わない。ただし、添加する試薬分の容量を満たすために、少なくとも供試するサンプル量の８倍以上の許容量を有することが望ましい。
　これは、例えば、免疫抑制剤抽出のためにサンプルとして全血５０μｌを用いた場合、溶血処理に用いる硫酸亜鉛溶液の容量は１５０μｌ、除タンパク質処理に用いるメタノールの容量は２００μｌであるため、そのときの反応溶液の全量は４００μｌとなり、サンプル量の８倍量に相当することに起因する。
　また、フィルター器材６０２におけるフィルター部６０５の素材は濾過機能を有するものであれば問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用されるものを適用して構わない。フィルター器材６０２内における反応で生成される凝集物量は検体の種類、由来、量等に大きく依存するが、フィルター部６０５の目詰まりを避けるために、固相抽出器材６０３における上流側フリット底面積６１３よりもフィルター部上流側底面積６１１は大きいことが望ましい。また、フィルター部６０５のポアサイズは生体試料中の夾雑微細成分を捕捉するために、φ２．０μｍ以下であることが望ましい。
　固相抽出器材６０３における固相抽出リザーバー６０６の素材は問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用される樹脂や金属等を用いて構わない。ただし、添加する試薬分の容量を満たすために、少なくとも供試する除タンパク質処理済みサンプル量と同等以上の許容量を有することが望ましい。
　また、固相抽出器材６０３における固相抽出剤６０８の充填部の構造は、充填する固相抽出剤６０８の性能や仕様に大きく依存するが、微容量試料中の微量成分の抽出効率を保つために、上流側フリット底面６１３の直径と同等以上の充填高６１４であることが望ましい。ただし、上流側フリット底面積６１３と下流側フリット底面積６１５の大きさは必ずしも同一である必要はなく、固相抽出剤６０８の充填形状は、例えば細管状（円柱状）であっても、円錐状であっても構わない。また、充填する固相抽出剤６０８は対象成分の抽出に適した性能を有するものを適用する。
　フィルター器材６０２の下端領域と、固相抽出器材６０３の上端領域には、両器材どうしの脱着のために、例えば、ルアーロック等のネジ状の構造６１６を有する。または、固相抽出リザーバー６０６上部にフィルター器材６０２が挿入、あるいはフィルター器材６０２下部に固相抽出器材６０３が挿入可能な構造により連結する構造とすることも可能である。
　試料前処理器材６０１を用いて試料調製する場合の操作法について、図７を参照して説明する。
　固相抽出剤７０８に対するコンディショニング、目的成分の吸着、夾雑成分の除去、目的成分の溶出回収に用いる各試薬は、固相抽出剤７０８の特性にしたがって適切なものを選択する。便宜的に、本実施例では逆相モードの固相抽出剤７０８を使用したときの事例で示す。
　図７の（Ａ）に示すように、まず、フィルター器材７０２に例えばメタノール等の有機溶媒を添加し、圧力印加により試料前処理器材７０１の上端開口部への加圧あるいは下端開口部からの吸引により、フィルター部７０５経由で固相抽出剤７０８に通液させ、固相抽出器材７０３の下端から排出される液を廃棄する。この操作により、固相抽出剤７０８の官能基を活性化させる。
　次に、図７の（Ｂ）に示すように、フィルター器材７０２に例えばバッファー等の水系溶液を添加し、圧力印加により試料前処理器材７０１の上端開口部への加圧あるいは下端開口部からの吸引により、フィルター部７０５経由で固相抽出剤７０８に通液させ、固相抽出器材７０３の下端から排出される液を廃棄する。この操作により、活性化させた固相抽出剤７０８を平衡化させることで、固相抽出剤７０８のコンディショニングが完了する。
　次に、図７の（Ｃ）に示すように、フィルター器材７０２に試料を添加する。その際、例えば、抽出成分を質量分析等で測定する場合には、内部標準物質も添加し、十分に撹拌する。
　次に、図７の（Ｄ）に示すように、試料が全血で血球内成分を取り出す必要がある場合は、必要量の溶血溶液を添加し、十分に撹拌する。この操作により、血球を破壊する。
　次に、図７の（Ｅ）に示すように、フィルター器材７０２に必要量のタンパク質変性溶液を添加し、十分に撹拌する。この操作により、試料中のタンパク質が変性し、凝集物が形成される。　
　次に、図７の（Ｆ）に示すように、試料前処理器材７０１への圧力印加により試料前処理器材７０１の上端開口部への加圧あるいは下端開口部からの吸引により、凝集物をフィルター器材７０２側に残し、濾液の回収なしに、フィルター部７０５経由でそのまま濾液を固相抽出剤７０８に供試する。固相抽出器材７０３の下端から排出される液は廃棄する。この操作により、固相抽出剤７０８に目的成分が吸着するとともに、固相抽出剤７０８に吸着しなかった夾雑成分が除去される。
　次に、固相抽出器材（７０３）からフィルター器材（７０２）を取り外し、フィルター器材（７０２）を廃棄する。
　次に、図７の（Ｇ）に示すように、固相抽出器材７０３内に必要量の洗浄液を添加し、試料前処理器材７０１への圧力印加により試料前処理器材７０１の上端開口部への加圧あるいは下端開口部からの吸引により、固相抽出剤７０８に通液させ、固相抽出器材７０３の下端から排出される液を廃棄する。この操作により、固相抽出剤７０８に非特異的に吸着した夾雑成分が除去される。
　次に、図７の（Ｈ）に示すように、固相抽出器材７０３内に必要量の溶出液を添加し、試料前処理器材７０１への圧力印加により試料前処理器材７０１の上端開口部への加圧あるいは下端開口部からの吸引により、固相抽出剤７０８に通液させ、固相抽出器材７０３の下端から排出される液を回収する。この操作により、固相抽出剤７０８に特異的に吸着した目的成分を溶出回収する。
　本発明の実施例４においても、実施例２と同様な効果を得ることができる。
　次に、本発明の実施例５である試料前処理装置について説明する。この実施例４は、シリンジ方式（フリット兼用）の器材構成となっている。
　図８は、本発明の実施例５である試料前処理装置（器材）８０１の説明図である。
　フィルター器材８０２と固相抽出器材８０３が連結され、フィルター部８０５が固相抽出剤８０８を保持する上流側フリットを兼用する構造を有する試料前処理器材８０１について説明する。本発明の実施例５の場合、フィルター器材８０２と固相抽出器材８０３は互いに切り離せないように接合された構造を取るため、両器材を脱着する機能は有さない。
　図８において、試料前処理器材８０１には、上流側にフィルター器材８０２、下流側に固相抽出器材８０３が配置され、フィルター器材８０２からの濾液を一時回収することなしに直接固相抽出器材８０３に供試することができる。
　詳細には、フィルター器材８０２は、フィルターリザーバー８０４とフィルター部８０５を備える。また、固相抽出器材８０３は、固相抽出リザーバーを有さず、固相抽出剤８０８および固相抽出剤８０８を固相抽出器材８０３内に保持する下流側フリット８０９で構成され、上流側フリットは前述の通りフィルター部８０５が代用する構造となる。
　フィルター器材８０２におけるフィルターリザーバー８０４の素材は問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用される樹脂や金属等を用いて構わない。ただし、添加する試薬分の容量を満たすために、少なくとも供試するサンプル量の８倍以上の許容量を有することが望ましい。
　これは、例えば、免疫抑制剤抽出のためにサンプルとして全血５０μｌを用いた場合、溶血処理に用いる硫酸亜鉛溶液の容量は１５０μｌ、除タンパク質処理に用いるメタノールの容量は２００μｌであるため、そのときの反応溶液の全量は４００μｌとなり、サンプル量の８倍量に相当することに起因する。
　また、フィルター器材８０２におけるフィルター部８０５の素材は濾過機能を有するものであれば問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用されるものを適用して構わない。フィルター器材８０２内における反応で生成される凝集物量は検体の種類、由来、量等に大きく依存するが、フィルター部８０５の目詰まりを避けるために、固相抽出器材８０３に充填された固相抽出剤８０８の上流側底面８１３よりもフィルター部上流側底面積８１１は大きいことが望ましい。したがって、フィルター部８０５のフィルター部上流側底面８１１とフィルター部下流側底面８１２の大きさは異なるとともに、フィルター部下流側底面８１２が固相抽出剤８０８の上流側底面８１３を覆うことが望ましい。また、フィルター部８０５のポアサイズは生体試料中の夾雑微細成分を捕捉するために、φ２．０μｍ以下であることが望ましい。
　また、固相抽出器材８０３の素材は問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用される樹脂や金属等を用いて構わない。
　また、固相抽出器材８０３における固相抽出剤８０８充填部の構造は、充填する固相抽出剤８０８の性能や仕様に大きく依存するが、微容量試料中の微量成分の抽出効率を保つために、固相抽出剤８０８の上流側底面８１３の直径と同等以上の充填高８１４であることが望ましい。ただし、固相抽出剤８０８の上流側底面積８１３と下流側フリット底面積８１５の大きさは必ずしも同一である必要はなく、固相抽出剤８０８の充填形状は、例えば細管状（円柱状）であっても、円錐状であっても構わない。また、充填する固相抽出剤８０８は対象成分の抽出に適した性能を有するものを適用する。
　同試料前処理器材８０１を用いて試料調製する場合の操作法については、実施例３と同様である。
　本発明の実施例５においても、実施例２と同様な効果を得ることができる。
　次に、本発明の実施例６である試料前処理装置について説明する。この実施例６は、シリンジ方式（プレパック）の器材構成となっている。
　図９は、本発明の実施例６である試料前処理装置（器材）９０１の説明図である。
　フィルター器材９０２と固相抽出器材９０３とが連結された試料前処理器材９０１であり、固相抽出剤９０８が予めコンディショニング済みの状態である。また、試料前処理器材９０１に充填されたコンディショニング済みの固相抽出剤９０８に、目的成分測定のための内部標準物質が添加された、目的成分測定専用の試料前処理器材９０１である。
　試料前処理器材９０１の構造および特徴は、前述の実施例１～３に示したものと同等であるが、固相抽出剤９０８がコンディショニング済みであるため、その固相抽出剤９０８の周囲は平衡化に用いる溶液で満たされているとともに、試料前処理器材９０１の上端と下端の開口部はキャップ９１１、９１２により密栓されている。
　また、目的成分測定専用の試料前処理器材９０１の場合は、試料前処理器材９０１に充填するコンディショニング済み固相抽出剤９０８のスラリーに、目的成分測定のための内部標準物質を必要量添加し、十分に懸濁後、試料前処理器材９０１に充填し、その周囲を平衡化用の溶液で満たしているとともに、試料前処理器材９０１の上端と下端の開口部はキャップ９１１、９１２により密栓されている。
　あるいは、試料前処理器材９０１に充填したコンディショニング済み固相抽出剤９０８、あるいは充填後にその周囲を満たしている平衡化用の溶液に対して、目的成分測定のための内部標準物質を必要量添加している構成としても構わない。そして、試料前処理器材９０１の上端と下端の開口部はキャップ９１１、９１２により密栓されている。
　同試料前処理器材９０１を用いて試料調製する場合の操作法について以下に示す。
　固相抽出剤９０８に対するコンディショニング、目的成分の吸着、夾雑成分の除去、目的成分の溶出回収に用いる各試薬は、固相抽出剤９０８の特性にしたがって適切なものを選択する。便宜的に、本実施例では逆相モードの固相抽出剤９０８を使用したときの事例で示す。
　最初に、試料前処理器材９０１の上端と下端を密栓しているキャップ９１１、９１２を取り除く。
　次に、試料前処理器材９０１に対して、圧力印加等により固相抽出剤９０８を浸潤させている平衡化溶液を通液させ、必要量の内部標準物質が固相抽出剤９０８に吸着した状態にする。次に、フィルター器材９０２に試料を添加する。　
　試料が全血である場合は、次に、フィルター器材９０２に溶血溶液を必要量添加して、十分に試料と撹拌する。
　次に、フィルター器材９０２にタンパク質変性溶液を必要量添加して、十分にサンプルと撹拌する。
　次に、試料前処理器材９０１に対して、圧力印加等によりフィルター器材９０２内のサンプルをフィルター部９０５で濾過するとともに、得られた濾液の回収なしに、フィルター部９０５経由で濾液を直接固相抽出剤９０８に供試し、通液させることにより目的成分を固相抽出剤９０８に吸着させる。
　次に、試料前処理器材９０１に対して、洗浄液を必要量添加する。
　次に、試料前処理器材９０１に対して、圧力印加等により洗浄液を固相抽出剤９０８に通液させることにより、固相抽出剤９０８に非特異的に吸着した夾雑成分を除去する。
　次に、試料前処理器材９０１に対して、溶出液を必要量添加する。
　次に、試料前処理器材９０１に対して、圧力印加等により溶出液を固相抽出剤９０８に通液させることにより、固相抽出剤９０８に特異的に吸着した目的成分を溶出回収する。
　前述のようなスラリーの場合、アジ化ナトリウム等の防腐剤を必要量添加して提供しても構わない。
　本発明の実施例６においても、実施例２と同様な効果を得ることができる。
　次に、本発明の実施例７である試料前処理装置について説明する。この実施例７は、チップ方式の器材構成となっている。
　図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃは、本発明の実施例７である試料前処理装置（器材）１００１の説明図である。図１０Ａは、試料前処置器材１００１の構成を示し、図１０Ｂは試料、試薬の分注、攪拌の説明、図１０Ｃは、吸引吐出によるコンディショニング、吸着、洗浄、溶出を示している。
　フィルター器材１００２と固相抽出器材１００３が、互いに切り離せないように脱着不可の様式で連結された試料前処理器材１００１であり、フィルター器材１００２上端の開口部に分注器（ピペッター）が装着可能である。
　試料前処理器材１００１は上流側にフィルター器材１００２、下流側に固相抽出器材１００３が配置され、フィルター器材１００２からの濾液を一時回収することなしに直接固相抽出器材１００３に供試する。
　フィルター器材１００２は、フィルターリザーバー１００４とフィルター部１００５を備える。また、固相抽出器材１００３は、固相抽出リザーバー１００６、固相抽出剤１００８および固相抽出剤１００８を固相抽出器材１００３内に保持する上流側フリット１００７と下流側フリット１００９を備える。
　フィルター器材１００２におけるフィルターリザーバー１００４の素材は問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用される樹脂や金属等を用いて構わない。ただし、添加する試薬分の容量を満たすために、少なくとも供試するサンプル量の８倍以上の許容量を有することが望ましい。
　これは、例えば、免疫抑制剤抽出のためにサンプルとして全血５０μｌを用いた場合、溶血処理に用いる硫酸亜鉛溶液の容量は１５０μｌ、除タンパク質処理に用いるメタノールの容量は２００μｌであるため、そのときの反応溶液の全量は４００μｌとなり、サンプル量の８倍量に相当することに起因する。
　また、フィルター器材１００２におけるフィルター部１００５の素材は濾過機能を有するものであれば問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用されるものを適用して構わない。フィルター器材１００２内における反応で生成される凝集物量は検体の種類、由来、量等に大きく依存するが、フィルター部１００５の目詰まりを避けるために、固相抽出器材１００３における上流側フリット底面積１０１３よりもフィルター部上流側底面積１０１１は大きいことが望ましい。また、フィルター部１００５のポアサイズは生体試料中の夾雑微細成分を捕捉するために、φ２．０μｍ以下であることが望ましい。
　固相抽出器材１００３における固相抽出リザーバー１００６の素材は問わず、一般的に生体試料の前処理等で使用される樹脂や金属等を用いて構わない。ただし、添加する試薬分の容量を満たすために、少なくとも供試する除タンパク質処理済みサンプル量と同等以上の許容量を有することが望ましい。
　また、固相抽出器材１００３における固相抽出剤１００８の充填部の構造は、充填する固相抽出剤１００８の性能や仕様に大きく依存するが、微容量試料中の微量成分の抽出効率を保つために、上流側フリット底面１０１３の直径と同等以上の充填高１０１４であることが望ましい。ただし、上流側フリット底面積１０１３と下流側フリット底面積１０１５の大きさは必ずしも同一である必要はなく、固相抽出剤１００８の充填形状は、例えば細管状（円柱状）であっても、円錐状であっても構わない。また、充填する固相抽出剤１００８は対象成分の抽出に適した性能を有するものを適用する。
　フィルター器材１００２の構造については、例えば、図１１Ａ、図１１Ｂに示すように、フィルターリザーバー１１０４が膨らんだ形状にすることにより、試料と各種試薬の混合を、振盪撹拌し易くした仕組みを有していても構わない。
　本発明の実施例７の試料前処理器材１００１は、フィルター器材１００２上端の開口部に分注器（ピペッター）を装着可能であることを特徴とし、吐出操作によりフィルター部１００５経由の濾過とともに、濾液の一時回収なしに、固相抽出剤１００８に直接目的成分を吸着させることができる。
　また、その後の固相抽出処理における洗浄工程は、容器に溜めた洗浄液に対して固相抽出器材１００３の下端開口部を浸漬させ、フィルター器材１００２の上端開口部に装着した分注器（ピペッター）のピペッティング操作により、固相抽出器材１００３の下端に充填した固相抽出剤１００８に対して洗浄液を吸引吐出することで、固相抽出剤１００８に非特異的に吸着した夾雑成分を洗浄除去することを特徴とする。
　さらに、溶出工程についても、前述の洗浄液を必要量の溶出液に変更して、同様の吸引吐出操作により、固相抽出剤１００８に特異的に吸着した目的成分を溶出回収しても構わない。あるいは、必要量の溶出液を吸引し、別に設けた回収容器に吐出することで、固相抽出剤１００８に特異的に吸着した目的成分を溶出回収しても構わない。
　同試料前処理器材１００１を用いて試料調製する場合の操作法について、図１２を参照して説明する。
　固相抽出剤１２０８に対するコンディショニング、目的成分の吸着、夾雑成分の除去、目的成分の溶出回収に用いる各試薬は、固相抽出剤（１２０８の特性にしたがって適切なものを選択する。便宜的に、本実施例では逆相モードの固相抽出剤１２０８を使用したときの事例で示す。
　図１２の（Ａ）に示すように、まず、容器に溜めた例えばメタノール等の有機溶媒に対して固相抽出器材１２０３の下端開口部を浸漬させ、フィルター器材１２０２の上端開口部に装着した分注器（ピペッター）のピペッティング操作により、固相抽出器材１２０３下端に充填した固相抽出剤１２０８に対して有機溶媒を吸引吐出する。この操作により、固相抽出剤１２０８の官能基を活性化させる。
　次に、図１２の（Ｂ）に示すように、図１２の（Ａ）と同様に、容器に溜めた水系溶液に対して固相抽出器材１２０３の下端開口部を浸漬させ、フィルター器材１２０２の上端開口部に装着した分注器（ピペッター）のピペッティング操作により、固相抽出器材１２０３下端に充填した固相抽出剤１２０８に対して水系溶液を吸引吐出する。この操作により、活性化させた固相抽出剤１２０８を平衡化させることで、固相抽出剤１２０８のコンディショニングが完了する。
　次に、図１２の（Ｃ）に示すように、フィルター器材１２０２に試料を添加する。その際、例えば、抽出成分を質量分析等で測定する場合には、内部標準物質も添加し、十分に撹拌する。
　次に、図１２の（Ｄ）に示すように、試料が全血で血球内成分を取り出す必要がある場合は、必要量の溶血溶液を添加し、十分に撹拌する。この操作により、血球を破壊する。
　次に、図１２の（Ｅ）に示すように、フィルター器材１２０２に必要量のタンパク質変性溶液を添加し、十分に撹拌する。この操作により、試料中のタンパク質が変性し、凝集物が形成される。
　次に、図１２の（Ｆ）に示すように、フィルター器材１２０２上端の開口部に分注器（ピペッター）を装着し、吐出操作により、凝集物をフィルター器材１２０２側に残し、濾液の回収なしに、フィルター部１２０５経由でそのまま濾液を固相抽出剤１２０８に供試する。固相抽出器材１２０３の下端から排出される液は廃棄する。この操作により、固相抽出剤１２０８に目的成分が吸着するとともに、固相抽出剤１２０８に吸着しなかった夾雑成分が除去される。
　次に、図１２の（Ｇ）に示すように、容器に溜めた洗浄液に対して固相抽出器材１２０３の下端開口部を浸漬させ、フィルター器材１２０２の上端開口部に装着した分注器（ピペッター）のピペッティング操作により、固相抽出器材１２０３の下端に充填した固相抽出剤１２０８に対して洗浄液を吸引吐出する。この操作により、固相抽出剤１２０８に非特異的に吸着した夾雑成分が除去される。
　次に、図１２の（Ｈ）に示すように、容器に溜めた必要量の溶出液に対して固相抽出器材１２０３の下端開口部を浸漬させ、フィルター器材１２０２の上端開口部に装着した分注器（ピペッター）のピペッティング操作により、固相抽出器材１２０３の下端に充填した固相抽出剤１２０８に対して溶出液を吸引吐出する。この操作により、固相抽出剤１２０８に特異的に吸着した目的成分を溶出回収する。
　あるいは、容器に溜めた溶出液に対して固相抽出器材１２０３の下端開口部を浸漬させ、フィルター器材１２０２の上端開口部に装着した分注器（ピペッター）のピペッティング操作により、固相抽出器材１２０３の下端に充填した固相抽出剤１２０８に対して溶出液を必要量吸引し、別に設けた回収容器に吐出することで、固相抽出剤１２０８に特異的に吸着した目的成分を溶出回収しても構わない。
　本発明の実施例７においても、実施例２と同様な効果を得ることができる。
　次に、本発明の実施例８である試料前処理装置について説明する。この実施例８は、複数の試料前処理装置（器材）が配列されたプレート方式の構成となっている。
　図１３は、本発明の実施例８であるプレート方式の試料前処理装置（器材）１３０１の説明図である。
　プレート方式の試料前処理器材１３０１は、実施例１～５に示した各種試料前処理器材について、各々複数アレイ状に配置された構造を有する。
　つまり、フィルター器材１３０２はプレート状となっており、フィルターリザーバー１３０４を有するフィルター部１３０５が複数個、フィルター器材１３０２に配列され固定されている。そして、固相抽出器材１３０３もプレート状となっており、下流側フリット１３０９と固相抽出充填剤１３０８と固相抽出リザーバー１３０６が一体となった部材が複数個、固相抽出器材１３０３に配列され固定されている。
　フィルター器材１３０２と固相抽出器材１３０３とは互いに連結され、フィルターリザーバー１３０４と、フィルター部１３０５と、下流側フリット１３０９と、固相抽出充填剤１３０８と、固相抽出リザーバー１３０６とが一体となり、試料前処理機材１３０１が形成される。
　その場合の試料前処理器材１３０１の操作法は、実施例１～５に各々記述した処理工程に準じて行われるが、ウェルに相当する複数の器材が並行処理される。
　試料前処理器材１３０１を用いて試料調製する場合の操作法については、実施例３～７と同一であり、複数の試料前処理器材１３０１を一括処理する。
　本発明の実施例８においても、実施例２と同様な効果を得ることができる他、複数の前処理器材について一括処理が可能となる。
　次に、本発明の実施例９である試料前処理装置について説明する。この実施例９は、バルブスイッチング方式の器材構成となっている。
　図１４は、本発明の実施例９である試料前処理装置（器材）１４０１の説明図である。
　本発明の実施例９である試料前処理器材１４０１は、バルブスイッチング機構を用いた流路切り換えにより、試料および試薬の固相抽出剤１４０８への添加と圧力印加工程を制御する構成となっている。
　図１４において、試料前処理器材の構成としては、フィルター器材１４０２、固相抽出器材１４０３、試薬供試用ポンプ１４２１、回収容器１４２４あるいは検出器１４２４がバルブ１４２２、１４２３を介して各々配管で連結されている。すなわち、固相抽出器材１４０３の上流側にバルブ１４２２を設け、そのバルブ１４２２にフィルター器材１４０２と試薬提供用ポンプ１４２１を連結した構造である。一方、固相抽出器材１４０３の下流側も廃液廃棄と溶出液回収の切り換えが可能な構造を有し、便宜上図面ではバルブ１４２３で表示する。
　試料前処理器材１４０１を用いて試料調製する場合の操作法について以下に示す。
　固相抽出剤１４０８に対するコンディショニング、目的成分の吸着、夾雑成分の除去、目的成分の溶出回収に用いる各試薬は、固相抽出剤１４０８の特性にしたがって適切なものを選択する。便宜的に、本実施例９では逆相モードの固相抽出剤１４０８を使用したときの事例で示す。
　まず、ポンプ１４２１により、例えばメタノール等の有機溶媒を固相抽出器材１４０３の固相抽出剤１４０８に通液させ、固相抽出器材１４０３の下流配管から排出される液を廃棄する。その際、上流側バルブ１４２２はポンプ１４２１から固相抽出器材１４０３に向かう流路を開放し、下流側バルブ１４２３は固相抽出器材１４０３から廃液に向かう流路を開放する。この操作により、固相抽出剤１４０８の官能基を活性化させる。
　次に、ポンプ１４２１により、例えばバッファー等の水系溶液を固相抽出器材１４０３の固相抽出剤１４０８に通液させ、固相抽出器材１４０３の下流配管から排出される液を廃棄する。その際、上流側バルブ１４２２はポンプ１４２１から固相抽出器材１４０３に向かう流路を開放し、下流側バルブ１４２３は固相抽出器材１４０３から廃液に向かう流路を開放する。この操作により、活性化させた固相抽出剤１４０８を平衡化させることで、固相抽出剤１４０８のコンディショニングが完了する。
　次に、フィルター器材１４０２に試料を添加する。その際、例えば、抽出成分を質量分析等で測定する場合には、内部標準物質も添加し、十分に撹拌する。その際、上流側バルブ１４２２および下流側バルブ１４２３の通液はない。
　次に、試料が全血で血球内成分を取り出す必要がある場合は、必要量の溶血溶液を添加し、十分に撹拌する。この操作により、血球を破壊する。その際、上流側バルブ１４２２および下流側バルブ１４２３の通液はない。
　次に、フィルター器材１４０２に必要量のタンパク質変性溶液を添加し、十分に撹拌する。この操作により、試料中のタンパク質が変性し、凝集物が形成される。その際、上流側バルブ１４２２および下流側バルブ１４２３の通液はない。
　次に、フィルター器材１４０２へ圧力を印加し、フィルター器材１４０２の上端開口部への加圧あるいは下端側からの吸引により、凝集物をフィルター器材１４０２側に残し、濾液の回収なしに、フィルター部１４０５経由でそのまま濾液を固相抽出剤１４０８に供試する。固相抽出器材１４０３の下端から排出される液は廃棄する。その際、上流側バルブ１４２２はフィルター器材１４０２から固相抽出器材１４０３に向かう流路を開放し、下流側バルブ１４２３は固相抽出器材１４０３から廃液に向かう流路を開放する。この操作により、固相抽出剤１４０８に目的成分が吸着するとともに、固相抽出剤１４０８に吸着しなかった夾雑成分が除去される。
　次に、ポンプ１４２１により、洗浄液を固相抽出器材１４０３の固相抽出剤１４０８に通液させ、固相抽出器材１４０３の下流配管から排出される液を廃棄する。その際、上流側バルブ１４２２はポンプ１４２１から固相抽出器材１４０３に向かう流路を開放し、下流側バルブ１４２３は固相抽出器材１４０３から廃液に向かう流路を開放する。この操作により、固相抽出剤１４０８に非特異的に吸着した夾雑成分が除去される。
　次に、ポンプ１４２１により、溶出液を固相抽出器材１４０３の固相抽出剤１４０８に通液させ、固相抽出器材１４０３の下流配管から排出される液を回収容器１４２４で回収あるいは検出器１４２４に供試する。その際、上流側バルブ１４２２はポンプ１４２１から固相抽出器材１４０３に向かう流路を開放し、下流側バルブ１４２３は固相抽出器材１４０３から回収容器１４２４あるいは検出器１４２４に向かう流路を開放する。この操作により、固相抽出剤１４０８に特異的に吸着した目的成分を溶出回収する。
　なお、図１４の抽出剤活性化処理を（ａ）、抽出剤平滑化処理を（ｂ）、試料及び内部標準物質添加処理を（ｃ）、溶血処理を（ｄ）、タンパク質変性処理を（ｅ）、フィルター分離及び固相抽出剤へのサンプルロード処理を（ｆ）、煩雑物洗浄処理を（ｇ）、目的成分溶出処理を（ｈ）とし、各処理に使用する試料、溶液、物質、機構について、該当する処理（ａ）～（ｈ）が付されている。
　また、図１４においては、バルブ１４２２、１４２３の動作について、矢印で示した部分への通液を行う処理を丸印の横に列挙し、矢印で示した部分への通液を行わない処理を×印の横に列挙している。
　次に、本発明の実施例１０である試料前処理方法及び装置について説明する。この実施例１０は、内部標準物質添加済み固相抽出剤を使用する方法及び装置である。
　実施例１０における試料前処理器材は、前述の各実施例で示した器材構成のように、固相抽出剤が予め固相抽出器材に充填されておらず、別々に提供することを特徴とする。すなわち、固相抽出器材の下端開口部近傍には予め下流側フリットが装填された状態であり、それに固相抽出剤を充填することで試料調製に用いる。上流側フリットは、固相抽出器材への固相抽出剤充填後に、必要に応じて装填することで構わない。
　そのときの固相抽出剤は、乾燥状態であっても、スラリー状であっても構わない。
　固相抽出剤がスラリー状で提供する場合、固相抽出剤は、コンディショニングされていなくても、コンディショニング済みであっても構わない。
　固相抽出剤がコンディショニング済みのスラリー状で提供する場合、そのスラリーに内部標準物質が無添加の状態であっても、予め添加された状態であっても構わない。
　以上のような、固相抽出器材と分けて提供される固相抽出剤の状態に応じて、コンディショニング工程を省略することが可能である。
　また、コンディショニング済みの固相抽出剤に、予め目的成分測定用の内部標準物質が必要量添加されている場合、その目的成分測定専用のキットとして提供することが可能となる。その場合、固相抽出器材に同固相抽出剤を充填後、コンディショニング工程なしで試料添加工程から操作を開始でき、内部標準物質の添加工程なしに、最終的な溶出物を直接測定に供試することが可能となる。
　前述のようなスラリーの場合、アジ化ナトリウム等の防腐剤を必要量添加して提供しても構わない。
　以上のように、本発明によれば、コンディショニング済の充填剤スラリーに、吸着可能な条件下で内部標準物質を予め必要量添加したものを、特定の測定目的用の固相抽出剤として提供するものである。そして、１つの試料前処理器材内で、溶血および除タンパク質処理を行うとともに、その反応産物を濾過後、濾液中の目的成分を固相抽出することを、途中で生じる産物の一時回収なしに、一括処理できることを特徴とする。あるいは、内部標準物質添加済の固相抽出剤を固相抽出器材に充填し、溶媒が蒸発しないように密閉したプレパック器材として提供することも考えられる。その際、固相抽出剤の上流側に除タンパク質目的のためのフィルター器材を設けても構わない。
　また、反応産物を濾過処理する機構を有する反応容器（フィルター器材）と固相抽出器材を連結し、濾液を一時回収することなしに直接固相抽出剤に供試できる仕組みを有する前処理手法およびその器材（キット）を提供することができる。
　血液のような夾雑成分の多い生体試料を前処理なしに直接同器材に供試することが可能であり、同器材で処理して得られた抽出物を直接ＭＳ等の分析装置に供試することができる。
　このことは、濾液の一時回収工程の省略により、工程およびＴＡＴの短縮化が図れる。
　また、濾液の一時回収および一時回収した濾液の固相抽出ユニットへの供試に関わる工程の省略を図ることが可能となり、同前処理用器材（キット）により操作の簡素化および低コスト化が実現できる。
　さらに、一時回収工程の省略により、一時回収用の容器が不要となるため、消耗品点数およびそのコストを削減することが可能となるとともに、一時回収工程で生じるサンプルロスおよびキャリーオーバーを回避できる。
　また、予めコンディショニング済みの固相抽出剤を固相抽出器材内に充填し、固相抽出剤を浸潤している溶液が蒸発しないように密栓したプレパック器材として提供することにより、試料前処理における工程数およびＴＡＴ（Turn-Around -Time）の短縮化を図ることが可能となる。
　さらに、同プレパック器材に充填済みの固相抽出剤に対して、予め測定対象成分の内部標準物質を必要量添加しておくことにより、同プレパック器材を測定対象成分専用の試料前処理器材として提供することが可能となり、使用者は内部標準物質の準備なしに試料前処理が行えるとともに、内部標準物質の添加工程を省略しても、例えば質量分析等による抽出成分の測定を行うことができる。
　このような、予め内部標準物質を必要量添加したコンディショニング済み固相抽出剤は、プレパック器材だけでなく、固相抽出器材充填前のスラリーとして未充填の固相抽出器材とともに提供することにより、測定対象成分専用の試料前処理キットとしても提供することが可能となり、使用者は測定対象成分の抽出量に合わせて適宜スラリー量を調節できるとともに、内部標準物質の準備なしに試料前処理が行え、内部標準物質の添加工程を省略しても、例えば質量分析等による抽出成分の測定を行うことができる。
　なお、本発明は、臨床検査分野だけでなく、目的成分検出に夾雑成分からの精製を要する分析分野に幅広く応用可能である。例えば、環境、食品、医用、公安（テロ対策／違法薬物）等の分野への実用およびそのための基礎／応用研究に利用可能である。
　１０１・・・全血処理工程（溶血処理および除タンパク質処理）、１０２・・・固相抽出処理工程、１０３・・・本発明による全血および固相抽出一括処理工程、３０１・・・試料前処理器材、３０２・・・フィルター器材、３０３・・・固相抽出器材、３０４・・・フィルターリザーバー、３０５・・・フィルター部、３０８・・・固相抽出剤、３１１・・・フィルター部上流側底面、４０１・・・試料前処理器材、４０２・・・フィルター器材、４０３・・・固相抽出器材、４０４・・・フィルターリザーバー、４０５・・・フィルター部、４０６・・・固相抽出リザーバー、４０７・・・上流側フリット、４０８・・・固相抽出剤、４０９・・・下流側フリット、４１１・・・フィルター部上流側底面、４１３・・・上流側フリット底面、４１４・・・充填高、４１５・・・下流側フリット底面、　　　　　　５０１・・・試料前処理器材、５０２・・・フィルター器材、５０３・・・固相抽出器材、５０５・・・フィルター部、５０８・・・固相抽出剤、６０１・・・　　　　　　試料前処理器材、６０２・・・フィルター器材、６０３・・・固相抽出器材、６０４・・・フィルターリザーバー、６０５・・・フィルター部、６０６・・・固相抽出リザーバー、６０７・・・上流側フリット、６０８・・・固相抽出剤、６０９・・・下流側フリット、６１１・・・フィルター部上流側底面、６１３・・・上流側フリット底面、６１４・・・充填高、６１５・・・下流側フリット底面、　　　　　　６１６・・・ルアーロック等のネジ状構造、７０１・・・試料前処理器材、７０２・・・フィルター器材、７０３・・・固相抽出器材、７０５・・・フィルター部、７０８・・・固相抽出剤、８０１・・・試料前処理器材、８０２・・・フィルター器材、８０３・・・固相抽出器材、８０４・・・フィルターリザーバー、８０５・・・フィルター部、８０８・・・固相抽出剤、８０９・・・下流側フリット、８１１・・・フィルター部上流側底面、８１２・・・フィルター部下流側底面、８１３・・・充填時の固相抽出剤上流側底面、８１４・・・充填高、８１５・・・下流側フリット底面、９０１・・・試料前処理器材、９０２・・・フィルター器材、９０３・・・固相抽出器材、９０５・・・フィルター部、９０８・・・固相抽出充填剤、９１１・・・上流側キャップ、９１２・・・下流側キャップ、　　　　　　　１００１・・・試料前処理器材、１００２・・・フィルター器材、１００３・・・固相抽出器材、１００４・・・フィルターリザーバー、１００５・・・フィルター部、１００６・・・固相抽出リザーバー、１００７・・・上流側フリット、１００８・・・固相抽出剤、１００９・・・下流側フリット、１０１１・・・フィルター部上流側底面、１０１３・・・上流側フリット底面、１０１４・・・充填高、１０１５・・・下流側フリット底面、１１０１・・・試料前処理器材、１１０２・・・フィルター器材、１１０３・・・固相抽出器材、１１０４・・・フィルターリザーバー、１１０５・・・フィルター部、１１０６・・・固相抽出リザーバー、１１０７・・・上流側フリット、１１０８・・・固相抽出剤、１１０９・・・下流側フリット、１２０２・・・フィルター器材、１２０３・・・固相抽出器材、１２０５・・・フィルター部、１２０８・・・固相抽出剤、１３０１・・・試料前処理器材、１３０２・・・フィルター器材、１３０３・・・固相抽出器材、１３０４・・・フィルターリザーバー、１３０５・・・フィルター部、１３０６・・・固相抽出リザーバー、１３０８・・・固相抽出剤、１３０９・・・下流側フリット、１４０１・・・試料前処理器材、１４０２・・・フィルター器材、１４０３・・・固相抽出器材、１４０５・・・フィルター部、１４０８・・・固相抽出剤、１４２１・・・ポンプ、１４２２・・・上流側バルブ、１４２３・・・下流側バルブ、１４２４・・・回収容器あるいは検出器

Claims (18)

  1. 　フィルター器材に収容されたフィルター部材に生体試料と除タンパク質試薬を供給し、上記フィルター部材の濾過液を、固相抽出剤を収容する固相抽出器材の上記固相抽出剤に供給し、
    　上記固相抽出剤に含まれた上記濾過液から、生体試料の固相を抽出することを特徴とする生体試料前処理方法。
  2. 　請求項１に記載の生体試料前処理方法において、
    　上記固相抽出器材は容器であり、上記フィルター器材は上記固相抽出器材内に挿入され、上記フィルター部材に生体試料と除タンパク質試薬を供給した後、遠心分離処理により濾液をフィルター部材から固相抽出剤に移行させ、固相抽出剤に移行された生体試料の固相抽出処理を懸濁方式で行うことを特徴とする生体試料前処理方法。
  3. 　請求項１に記載の生体試料前処理方法において、
    　上記フィルター器材及び固相抽出器材は筒状であり、これらフィルター器材及び固相抽出器材は互いに連結され、上記フィルター器材内への圧力制御によりフィルター部材から上記固相抽出剤に濾液を供給することを特徴とする生体試料前処理方法。
  4. 　請求項１に記載の生体試料前処理方法において、
    　上記フィルター器材及び固相抽出器材は筒状であり、これらフィルター器材及び固相抽出器材は互いに連結され、フィルター器材の開口部から分注器により生体試料と除タンパク質試薬を供給して、濾液をフィルター部材から固相抽出剤に移行させ、上記固相抽出器材に形成された排出口を経由して固相抽出試薬を分注器により、上記固相抽出剤に供給して、上記固相抽出剤に含まれた上記濾過液から、生体試料の固相を抽出することを特徴とする生体試料前処理方法。
  5. 　請求項１に記載の生体試料前処理方法において、
    　フィルター器材内で試料と除タンパク質試薬を反応させるときの溶媒組成を抽出対象成分の溶解度に応じて設定することを特徴とする生体試料前処理方法。
  6. 　請求項５に記載の生体試料前処理方法において、
    　抽出対象成分が疎水性の高い薬剤の場合、フィルター器材内で試料と除タンパク質試薬を反応させるときの溶媒組成が、メタノールの終濃度で５０％以上とすることを特徴とする生体試料前処理方法。
  7. 　請求項６に記載の生体試料前処理方法において、
    　抽出対象成分が血球移行性のある薬剤の場合、フィルター器材内で試料と溶血試薬を反応させた後にタンパク質変性試薬と反応させ、フィルター器材のフィルター部材を経由した濾液を上記固相抽出剤に供給することを特徴とする生体試料前処理方法。
  8. 　請求項１に記載した生体試料前処理方法において、
    　抽出対象成分の固相抽出剤への吸着性能を至適化するために、フィルター器材内で試料と除タンパク質試薬を反応させた後、その反応溶液を希釈し、フィルター器材のフィルター部材を経由した濾液を固相抽出剤に供給することを特徴とする生体試料前処理方法。
  9. 　生体試料前処理装置において、
    　生体試料が供給され、濾過するフィルター部材を有するフィルター器材と、
    　上記フィルター器材と連結し、上記フィルター部材により濾過された生体試料が供給される固相抽出剤を有する固相抽出器材と、
    　を備えることを特徴とする生体試料前処理装置。
  10. 　請求項９に記載の生体試料前処理装置において、
    　上記フィルター器材は固相抽出器材に脱着できない状態で連結されていることを特徴とする生体試料前処理装置。
  11. 　請求項９に記載の生体試料前処理装置において、
    　上記フィルター器材は固相抽出器材と脱着可能に連結されていることを特徴とする生体試料前処理装置。
  12. 　請求項９に記載の生体試料前処理装置において、
    　上記固相抽出器材は上流側フリットを有し、上記フィルター器材のフィルター部材は、上記固相抽出器材の上流側フリットを兼用することを特徴とする生体試料前処理装置。
  13. 　請求項９に記載の生体試料前処理装置において、
    　上記固相抽出器材は上流側フリットを有し、上記フィルター器材のフィルター部材の面積が固相抽出器材の上流側フリット以上の面積を有することを特徴とする生体試料前処理装置。
  14. 　請求項１３に記載の生体試料前処理装置において、
    　上記固相抽出器材の固相抽出剤の充填高が上流側フリットの直径以上であることを特徴とする生体試料前処理装置。
  15. 　請求項９に記載の生体試料前処理装置において、
    　上記フィルター器材の上流側開口部は、試料、除タンパク質試薬、定量試薬の注入口であるとともに、分注器が取り付けられることを特徴とする生体試料前処理装置。
  16. 　請求項９に記載の生体試料前処理装置において、
    　固相抽出剤はコンディショニング済みのスラリーであることを特徴とする生体試料前処理装置。
  17. 　請求項１６に記載の生体試料前処理装置において、
    　上記コンディショニング済みのスラリーに測定対象成分用の内部標準物質が添加されていることを特徴とする生体試料前処理装置。
  18. 　請求項１７に記載の生体試料前処理装置において、
    　測定対象成分用の内部標準物質が添加されたコンディショニング済み固相抽出剤が固相抽出器材内に充填され、固相抽出剤が浸かっている溶媒が蒸発しないように固相抽出器材が密閉された構造となっていることを特徴とする生体試料前処理装置。
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