JPH1183860A - 尿による化学診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＧＣ／ＭＳにより代謝物質の全項目の一斉分
析を行うことができ、その結果に基づいて化学診断する
ことができ化学診断を自動化して迅速かつ正確に化学診
断を行うことが可能な尿による化学診断方法を得る。 【解決手段】 尿をしみ込ませて乾燥させた濾紙を検体
２として回収し、この検体２から抽出した尿成分を試料
として用い、試料をウレアーゼ処理して内部標準物質を
加え、トリメチルシリル誘導体化してＧＣ／ＭＳ分析に
より、クレアチニンを含む代謝物質の内部標準物質に対
する分析値を求め、得られたクレアチニンの分析値にク
レアチニンの補正係数を乗じてクレアチニン補正分析値
を求めるとともに、他の代謝物質の量をクレアチニン補
正分析値に対する量として表示し、この値を演算装置に
入力して健常値と比較し、異常値を表示するとともに、
予め記憶させた所見リストから代謝物質の異常値に対応
する所見を選択して表示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は尿を試料として分析
し、その分析値に基づいて化学診断を行う方法、特に糖
尿病、痛風その他の代謝異常の診断に適した化学診断方
法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】糖尿病、痛風その他の代謝異常疾患は成
人病として社会問題になっている。糖尿病の代謝異常疾
患の前段階として耐糖能異常がある。耐糖能異常者は専
門医の指導の下に栄養、運動などの生活スタイルの適切
な管理を行えば、糖尿病や動脈硬化症のような血管合併
症にならずに済むか、少なくとも病気になるのを大幅に
遅らせることができる。ところが、一旦糖尿病になって
しまうと、元の耐糖能異常に戻すことはできない。

【０００３】このような代謝異常疾患や耐糖能異常は尿
の分析とそれに基づく化学診断により早期に発見するこ
とができる。もちろん医学的な診断は医師の専門的な立
場から行われるものであるが、化学診断は尿の分析結果
から医師の診断が必要かどうかをスクリーニングすると
ともに、医師の診断の資料を提供するためにも行われ
る。

【０００４】糖尿病や耐糖能異常の化学分析のために
は、グルコース（ブドウ糖）とフルクトース（果糖）等
の糖類、ソルビトール、ミオイノシトール、１，５−ア
ンヒドログルシトール（１，５−ＡＧ）等の糖アルコー
ルおよび尿酸その他有機酸などの代謝物質の分析が必要
である。これらの代謝物質は従来、オートアナライザを
用いる化学分析が主流であったが、ＧＣ／ＭＳ（ガスク
ロマトグラフィー質量分析・・・Gas Chromatography-Mass
Spectrometry）による分析が試みられている。

【０００５】ところで尿は採取時期に応じてその濃度が
変化するため代謝物質の含量は一般に尿中のクレアチニ
ンに対する含量として表示されている。これはクレアチ
ニンが個人差なくほぼ一定量代謝されるため、この代謝
クレアチニンを基準として人の代謝物質の含量を表示す
れば試料としての尿の濃度を考慮する必要がないからで
ある。

【０００６】ところがＧＣ／ＭＳによるクレアチニンの
分析値はクレアチニンが含まれているため通常の化学分
析（Jaff'e法）とは大きく異なる値が得られるため、基
準値となるクレアチニンは化学分析により分析されてお
り、ＧＣ／ＭＳによる分析と化学分析による分析とを並
行して行う必要があり、工程が複雑であった。また両者
の結果を別々に入力して演算する必要があり、化学診断
もその結果を見て人が評価するようになっており、自動
化を大きく妨げていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題はＧＣ／
ＭＳにより代謝物質の全項目の一斉分析を行うことがで
き、その結果に基づいて化学診断することができるとと
もに、化学診断を自動化して迅速かつ正確に化学診断を
行うことが可能な尿による化学診断方法を提案すること
である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は次の尿による化
学診断方法である。 （１） 尿試料をウレアーゼ処理するとともに内部標準
物質を加え、さらにトリメチルシリル誘導体化してＧＣ
／ＭＳ分析により、クレアチニンを含む代謝物質含量を
内部標準物質に対する分析値として求め、得られたクレ
アチニンの分析値に、予め他の分析法により求めたクレ
アチニンの補正係数を乗じてクレアチニンの補正値を求
めるとともに、他の代謝物質の含量を補正されたクレア
チニンに対する測定値として表示し、得られた測定値を
演算装置に入力して測定値と健常値とを比較し、異常値
を表示するとともに、予め記憶させた所見リストから代
謝物質の異常値に対応する所見を選択して表示すること
を特徴とする尿による化学診断方法。 （２） 尿をしみ込ませて乾燥させた濾紙を検体として
回収し、この検体から抽出した尿成分を試料として用い
る上記（１）記載の方法。

【０００９】本発明の化学診断方法は試料としての尿を
ＧＣ／ＭＳにより分析し、その分析値に基づいて化学診
断を行うものである。試料としての尿は任意の形態のも
のを検体として用いることができるが、尿をしみ込みせ
た濾紙を検体として回収し、この検体から尿成分を抽出
して試料とするのが好ましい。

【００１０】この場合予め濾紙と、この濾紙を収納する
非透水性のプラスチック袋と、氏名、採尿日等のデータ
を記入する検査票とをセットにして配布し、被検者が尿
をしみ込ませて乾燥した濾紙をプラスチック袋に入れて
検査票とともに郵便等で回収し、回収した濾紙から尿成
分を抽出して試料とし、検査票のデータは演算装置に入
力することができる。抽出は水（純水）で抽出し、遠心
分離により分離して試料を得ることができる。

【００１１】こうして得た試料はウレアーゼ処理により
尿素を分解する。ウレアーゼ処理は試料にウレアーゼ
（尿素分解酵素）を加えて加温処理することにより、尿
素は分解される。ウレアーゼ処理とともに内部標準物質
を加える。内部標準物質としてはヘプタデカン酸が好ま
しいが、他の物質でもよい。内部標準物質を加えた試料
は通常除蛋白および濃縮脱水したのちトリメチルシリル
誘導体化する。

【００１２】除蛋白はエタノール、アセトン等の変性剤
を加えて蛋白質を凝固させ、これを遠心分離、濾過等に
より分離して除去することができる。濃縮脱水は減圧等
によりアルコール等の変性剤および水を除去する。トリ
メチルシリル誘導体化は分析対象である糖類、糖アルコ
ール、有機酸、アミノ酸等のＧＣ／ＭＳの過程における
揮発性を高めるために、これらをトリメチルシリル誘導
体に転換するものであり、Ｎ，Ｏ−ビストリメチルシリ
ルトリフロロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）、トリメチル
クロロシラン（ＴＭＣＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチ
ルシリルトリフロロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）等のト
リメチルシリル化剤を用い、加熱下に反応させる。

【００１３】こうしてトリメチルシリル誘導体化した試
料をＧＣ／ＭＳ分析により分析する。分析の対象となる
のはクレアチニンを含む代謝物質であり、診断目的によ
り異なるが、例えば糖尿病、痛風、耐糖能異常の場合
は、グルコース、フルクトース等の糖類；ソルビトー
ル、ミオイノシトール、１，５−アンヒドログルシトー
ル、キロイノシトール等の糖アルコール；尿酸などがあ
げられる。このほかにも診断目的により他の有機酸、ア
ミノ酸などの他の代謝物質を分析する。

【００１４】ＧＣ／ＭＳではガスクロマトグラフィ（Ｇ
Ｃ）で各成分を分離して結果をクロマトグラムで表示す
る。そしてここで分離された各成分を質量分析計（Ｍ
Ｓ）で分析してクロマトグラムの各ピークの各成分のマ
ススペクトルを得、このマススペクトルから各ピークの
成分の定性および定量を行う。ＭＳにより得られる各成
分の分析値は強度の比として得られるため、予め一定量
を添加した内部標準物質（例えばヘプタデカン酸）に対
する量として表示することにより、絶対量としての分析
値が得られる。

【００１５】ところで尿は採取時期によって濃度が異な
り、特に濾紙に尿をしみ込ませて乾燥させるときは、乾
燥のしかたによっても濾紙中に保持される尿成分が異な
ることになるので、ほぼ一定量代謝されるクレアチニン
を基準としてクレアチニンに対する量として各代謝物質
の量が表示される。

【００１６】ところが尿中のクレアチニンはJaff'e法な
どの化学分析では分析値がそのままクレアチニンの量と
して採用できるが、ＧＣ／ＭＳではクレアチンが熱分解
によりクレアチニンとして表示されるため、ＧＣ／ＭＳ
の分析値をそのままクレアチニンの分析値として採用す
ることができない。

【００１７】このため本発明では、予めJaff'e法等の他
の分析法により求めたクレアチニンの補正係数をＧＣ／
ＭＳの測定値に乗じて補正することにより、クレアチニ
ンの分析値を算出して表示する。この補正係数は０．２
９９３であるが、±０．０２００の範囲の近似値は許容
される。このようなクレアチニンの補正値の算出ととも
に、補正されたクレアチニンに対する他の代謝物質量を
算出してこれを測定値として表示装置あるいは出力装置
から出力される報告書（以下表示装置等という）に表示
する。

【００１８】次に得られた測定値を演算装置に入力して
測定値と健常値（標準値）との差を演算し、その演算結
果を健常値とともに表示装置等に表示し、同時に異常の
有無および異常値を表示する。異常値は、健常値に対す
る倍率、差など任意の値とすることができる。そして代
謝物質の異常値に対応する所見リストを予め演算装置に
記憶させておき、このリストから前記算出された異常値
に対応する所見を選択して表示装置等に表示する。この
とき必要に応じ分析結果を見て所見の補正を行うことが
できる。

【００１９】

【発明の効果】本発明によれば、尿試料をＧＣ／ＭＳに
より分析し、クレアチニンを含む代謝物質の分析値を得
るとともに、クレアチニンの分析値を補正して、補正し
たクレアチニンに対する含量として表示し、この値を健
常値と比較して異常値を表示するとともに、記憶された
所見リストから異常値に対応する所見を選択して表示す
るようにしたので、ＧＣ／ＭＳにより代謝物質の全項目
の一斉分析を行うことができ、その結果に基づいて化学
診断することができるとともに、化学診断を自動化して
迅速かつ正確に化学診断を行うことが可能になる。

【００２０】また尿をしみ込ませて乾燥させた濾紙を検
体として用いることにより、検体の採取と回収が容易で
あり、広範囲の検診が可能になるという効果がある。

【００２１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。図１は実施形態の化学診断方法を示すフロ
ーチャート、図２は試料調製工程のフローチャート、図
３はＧＣ／ＭＳおよび演算装置におけるデータ処理のフ
ローチャートである。

【００２２】この実施形態の化学診断方法は、図１に示
すように、予め濾紙と、この濾紙を収納する非透水性の
プラスチック袋と、氏名、採尿日等のデータを記入する
検査票とをセットにして病院／患者１に配布しておき、
被検者が尿をしみ込ませて乾燥した濾紙を検体２として
プラスチック袋に入れ、検査票３とともに封筒に入れて
郵便等により回収する。

【００２３】回収した検体２は試料調製工程４におい
て、濾紙から尿成分を抽出して試料を調製し、ＧＣ／Ｍ
Ｓ５で分析する。検査票３のデータは演算装置６に入力
する。ＧＣ／ＭＳ５の分析結果は検査結果入力工程７に
おいて演算装置６に入力され、その結果により化学診断
工程８において化学診断が行われ、報告書作成工程９に
おいて報告書１０を作成する。

【００２４】試料調整工程４では図２に示すように、検
体２から抽出工程１１において試料を抽出する。この場
合検体２となる濾紙は約１ｍｌの尿を保持する大きさと
しておき、これを乾燥した検体２に１ｍｌの水（純水）
を加えて尿成分を抽出し、遠心分離により試料液を得
る。

【００２５】次に試料採取工程１２において０．１ｍｌ
の試料液をバイアル瓶に採取する。ウレアーゼ処理工程
１３において試料に３０ｕのウレアーゼを加えて３７℃
で３０分間インキュベートし、大過剰の尿素を分解す
る。そして内部標準物質添加工程１４としてｎ−ヘプタ
デカン酸２０μｇを添加し、除蛋白工程１５として１ｍ
ｌの無水エタノールを加えて遠心分離により除蛋白す
る。

【００２６】上層を濃縮工程１６で減圧濃縮してエタノ
ールと水を除去し、乾涸工程１７でＮ₂気流下に乾涸す
る。次にトリメチルシリル誘導体化工程１８において１
００μｌのＢＳＴＦＡと１０μｌのＴＭＣＳを加え、８
０℃で３０分間加熱し、試料中の代謝物質をトリメチル
シリル誘導体に変換する。

【００２７】こうして調製した試料をＧＣ／ＭＳ５によ
り分析する。ＧＣ／ＭＳ５は限定されないが、例えばＧ
ＣはUltra Alloy plus-5⁺金属キャピラリーカラム（３
０ｍ×０．２５ｍｍ）を用い、６０℃から３５０℃まで
毎分１７℃で昇温して分析する。ＭＳは電子衝撃法によ
り、ｍ／ｚ５０からｍ／ｚ６５０まで０．４秒スキャン
で測定する。

【００２８】ＧＣ／ＭＳ５では図３に示すように、クロ
マトグラム２１とマススペクトル２２が得られる。この
マススペクトル２２から分析目的とするピークの特定の
フラグメントイオンのピーク面積と、内部標準物質であ
るｎ−ヘプタデカン酸のフラグメントイオンのピーク面
積との比を求め、予め作成した検量線と対比して、各代
謝物質の対内部標準物質分析値２３を算出する。

【００２９】一方、この対内部標準物質分析値２３中の
クレアチニン分析値はクレアチンの分解物の値を含むた
め、補正係数０．２９９３を乗じてクレアチニン補正分
析値２４を算出する。次に前記各代謝物質の対内部標準
物質分析値２３をクレアチニン補正分析値２４の１ｍｇ
当たりの量として算出して、各代謝物質の対クレアチニ
ン分析値２５を得、これを演算装置６に入力する。

【００３０】演算装置６では検査結果入力工程７におい
て、このＧＣ／ＭＳ５から各代謝物質の対クレアチニン
分析値２５を入力して表示し、一方予め記憶されている
各成分の健常値２６を表示する。そして化学診断工程８
において、これらを比較して異常値２７を演算して表示
するとともに、予め記憶されている各代謝物質の異常値
２７に対応する所見リストから、演算により得られた異
常値２７に対応する特定の所見２８を選択して表示す
る。

【００３１】ここで所見リストは異常成分と異常の大小
の組み合わせに対応して、複数の所見２８をリスト化し
ておき、異常に対応してリストから特定の所見２８を選
択するようにするが、自動診断により適切な所見２８が
出ない場合もあるので、担当の検査医師が分析値、異常
値および予め入力された病歴等のデータを見て所見２８
を訂正し、補正所見２９として表示する。

【００３２】こうして化学診断を行った後、報告書作成
工程９において対クレアチニン分析値２５、健常値２
６、異常値２７、補正所見２９を出力装置３０に出力
し、報告書１０を作成する。異常値２７としては健常値
２６に対する倍率、差、比、偏差値など任意の値を表示
することができ、その表示方法も数値のほかグラフ表示
も可能である。

【００３３】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明する。 実施例１ 健常人５０人の尿を試料として、図２に示した方法で試
料調製し、クレアチニンをＧＣ／ＭＳで分析した結果を
横軸（ｘ）とし、Jaff'e法によりピクリン酸を反応させ
て比色法で分析した結果を縦軸（ｙ）としたグラフを図
４に示す。図４からｙ＝０．２９９３ｘの関係が得ら
れ、ＧＣ／ＭＳで得られたクレアチニンの補正係数は、
０．２９９３であり、バラツキは０．２９９３±０．０
２００に収まることがわかる。

【００３４】実施例２ 濾紙に尿をしみ込ませて乾燥した４検体について、図２
に示した方法で試料調製し、ＧＣ／ＭＳで分析を行っ
た。各代謝物質の最初に得られた対内部標準物質分析値
を表１に、表１の実測値のクレアチニンを基準として算
出した補正前の対クレアチニン分析値を表２に、また補
正係数（０．２９９３）を乗じて補正したクレアチニン
補正分析値およびこのクレアチニン補正分析値を基準と
した補正後の対クレアチニン分析値を表３に示す。

【００３５】

【表１】

【００３６】

【表２】

【００３７】

【表３】

【００３８】表２、表３の結果より、クレアチニン実測
値を基準とする補正前の対クレアチニン分析値と、補正
されたクレアチニン分析値を基準とする補正後の対クレ
アチニン分析値とでは大きな差があることがわかる。

【００３９】各代謝物質の健常値、およびこの健常値に
対する表３の補正後の対クレアチニン分析値の倍率を表
４に示す。またこの結果に対して所見し、所見リストか
ら選択された所見を表５に示す。

【００４０】

【表４】

【００４１】

【表５】

【００４２】実施例３ 糖尿病（ＤＭ）、糖尿病妊娠（ＤＭＰ）、妊娠糖尿病
（ＧＤＭ）の患者の検体について実施例２と同様に分析
した補正後の対クレアチニン分析値と健常値を表６に示
す。

【００４３】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施形態の化学診断方法を示すフローチャート
である。

【図２】試料調製工程のフローチャートである。

【図３】ＧＣ／ＭＳおよび演算装置におけるデータ処理
のフローチャートである。

【図４】ＧＣ／ＭＳ法とJaff'e法のクレアチニン分析値
の関係を示すグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 尿試料をウレアーゼ処理するとともに内
   部標準物質を加え、さらにトリメチルシリル誘導体化し
   てＧＣ／ＭＳ分析により、クレアチニンを含む代謝物質
   含量を内部標準物質に対する分析値として求め、 得られたクレアチニンの分析値に、予め他の分析法によ
   り求めたクレアチニンの補正係数を乗じてクレアチニン
   の補正値を求めるとともに、他の代謝物質の含量を補正
   されたクレアチニンに対する測定値として表示し、 得られた測定値を演算装置に入力して測定値と健常値と
   を比較し、異常値を表示するとともに、 予め記憶させた所見リストから代謝物質の異常値に対応
   する所見を選択して表示することを特徴とする尿による
   化学診断方法。
2. 【請求項２】 尿をしみ込ませて乾燥させた濾紙を検体
   として回収し、この検体から抽出した尿成分を試料とし
   て用いる請求項１記載の方法。