WO2011096482A1 - 多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法 - Google Patents

多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法 Download PDF

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WO2011096482A1
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cell
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ips
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啓光 中内
新 金子
聡修 西村
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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for reconstructing immune function using pluripotent stem cells. More specifically, the present invention relates to a method for producing human T cells, a pharmaceutical composition containing T cells produced by the method, and immunity utilizing the method. It relates to a method of cell therapy.
  • Non-Patent Documents 1-2 CD34 positive cells, which are bone marrow progenitor cells, naive T lymphocytes, and the like are used as gene transfer cells, but these have low self-regenerative ability in Ex-vivo and low gene transfer efficiency. It has many problems such as difficulty in controlling differentiation by gene transfer.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells inducible pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells inducible pluripotent stem cells
  • IPS cells can be established by reprogramming somatic cells in various ways.
  • Reprogrammed iPS cells carry over the genetic information used for reprogramming as they are, so even those cells of the immune system, especially B lymphocytes and T lymphocytes, which have been rearranged and terminally differentiated are also reprogrammed. Whether it is possible was a subject of great interest. Under such circumstances, the establishment of iPS cells from mouse B lymphocytes was reported in 2008 by Jaenisch et al. (Non-patent Document 3), and the establishment of iPS cells from mouse T lymphocytes was reported in 2009 by Yamanaka et al. (Non-Patent Document 4). However, there is no report that iPS cells were established from human T lymphocytes.
  • T lymphocytes In order to realize immunotherapy using T lymphocytes, in addition to establishing iPS cells from human T lymphocytes, the TCR that the original human T lymphocytes had had established iPS cells. Although it is necessary to induce differentiation into functional T lymphocytes while maintaining the recombination structure of the gene, such a technique has not yet been established.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and its purpose is to establish iPS cells from human T lymphocytes, and to further establish the established iPS cells from the original human T lymphocytes.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of inducing differentiation into functional T lymphocytes while maintaining the recombination structure of the TCR gene.
  • a further object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing the T cells thus produced, and a method of immune cell therapy using the T cells thus produced.
  • the present inventors have succeeded in establishing iPS cells from human T cells while maintaining the same TCR reconstitution state as the original human T lymphocytes. did. Furthermore, the present inventors have functions of producing cytokines and the like from the thus established human T cell-derived iPS cells (TiPS cells) while maintaining the same TCR reconstitution state as the original human T lymphocytes. Succeeded in inducing differentiation of typical T cells. And it discovered that an ideal immune cell therapy could be performed by transplanting the human T cell obtained in this way into a patient's body, and came to complete this invention.
  • the present invention provides the following inventions.
  • a method for producing a human T cell comprising a step of inducing iPS cells from human T cells, and a step of differentiating the iPS cells into T cells.
  • the human T cell is a T cell expressing at least one molecule selected from the group consisting of CD4 and CD8.
  • the method according to (1) or (2), wherein the T cells induced into iPS cells have antigen specificity.
  • the method according to (3), wherein the antigen specificity of T cells induced into iPS cells and T cells differentiated from iPS cells are the same.
  • a pharmaceutical composition comprising the human T cell according to (5). (7) isolating T cells having a desired antigen specificity from humans; Inducing iPS cells from T cells having the desired antigen specificity; Differentiating the iPS cells into T cells; Administering the obtained iPS cell-derived T cells into a human body.
  • Lymphocytes that acquire structural changes in the TCR and BCR gene base sequences during development are extremely unique cells as the source of iPS cell establishment.
  • iPS cells with TCR reconstituted from mouse T cells and B cells can be established, suggesting that the TCR reconstitution mode is not lost by nuclear transfer or reprogramming. It had been.
  • mice these are all examples in mice.
  • the present invention shows for the first time that iPS cells can be obtained from human peripheral blood T lymphocytes, and further, when T lineage cells are derived from iPS cells having at least one in-frame TCR reconstruction, the TCR It has been revealed for the first time that human T-lineage cells having the above appear in a monoclonal (monoclonal) manner.
  • TCR T lineage cells from iPSCs (iPS cells) that have only one in-frame rearrangement with both the TCR ⁇ chain and ⁇ chain
  • the appeared TCR is identical to the base sequence conserved in iPS cells ( identity) and completely monoclonal.
  • identity base sequence conserved in iPS cells
  • CD34 positive hematopoietic stem cells that must always take into account the inhibitory effect (interfere) due to the expression of endogenous TCR ⁇ chain ⁇ chain (especially ⁇ chain incompletely controlled by allelic exclusion)
  • T cells having monoclonal TCR ⁇ against the target antigen can be induced as efficiently as compared with the method of introducing the TCR gene into naive T cells.
  • the present invention it is possible to efficiently produce human T lymphocytes specific to the target antigen.
  • human T lymphocytes thus produced, it is possible to provide an immune cell therapy method with few problems of rejection, which is the biggest barrier for regenerative medicine and transplantation medicine.
  • FIG. 1 shows the outline of preparation of the human iPS cell from a peripheral blood T lymphocyte.
  • “Tapering” indicates a period during which the tape was gradually replaced with human iPS cell medium (hiPS medium, etc.).
  • the upper part shows colonies obtained by introducing the 3/4 factor in the mountains into CD3 T cells, and the lower part shows, from the left
  • Day 6 cells reseeded on MEF cells
  • Day 15 ES cell-like colonies.
  • Formed cells Day 24: each cell that has completed colony formation (see FIG. 1 for Day).
  • the scale bar indicates 200 ⁇ m.
  • TkT3V1-7 human T-iPS cells
  • PB CD4 T-cell active CD4T lymphocytes
  • FIG. 7 is a scatter diagram showing a comparison result (right side) between TkT3V1-7 and human ES cells (KhES3) in FIG.
  • KhES3 human ES cells
  • two parallel lines in the figure indicate that there was a 5-fold difference between the corresponding samples.
  • 2 is a photomicrograph showing the karyotype of two typical examples of T-iPS cells (TkT3V1-7 and TkT4V1-3). The passage number of the examined T-iPS cells was 10, and no chromosomal abnormality was observed in any of them.
  • FIG. 6 is a photomicrograph showing a representative HE-stained section of teratoma formed in NOD-Scid mice 8 weeks after injection of T-iPS cells.
  • Tissues derived from the three germ layers (neural tissue and neural plate as ectoderm, retinocytes), cartilage and myocytes as mesoderm, and stomach as endoderm It shows the presence of gut-like mucosa and secretory glands / ducts.
  • the reconstituted TCRG was identified by a PCR band in the effective size range (about 200 bp). It is an electrophoresis photograph which shows the typical result of PCR analysis for detecting TCRB reconstruction.
  • FIG. 13 is a diagram showing a sequence result of a PCR product derived from TkT3V1-7 shown in FIGS. 11 and 12.
  • the functional (Productive) rearrangement in one allele of the TCRA gene is shown in the upper part.
  • the functional rearrangement (V (D) J ⁇ rearrangement) in one allele of the TCRB gene is shown in the middle.
  • Unproductive rearrangement (DJ ⁇ rearrangement) in the other allele of the TCRB gene is shown at the bottom.
  • CD3 + CD56 ⁇ peripheral blood T cells are first divided into a CD4 expression subset and a CD8 expression subset, and then na ⁇ ve T cells (Naive, CD45RA + CD62L + ), central memory T cells (Cemtral Memory, CD45RA ⁇ CD62L + ), effector memory T FIG.
  • FIG. 6 is a scatter diagram showing the results of classification into cells (Effect Memory, CD45RA ⁇ CD62L ⁇ ) or terminal effector T cells (Effector, CD45RA + CD62L ⁇ ). It is a graph which shows the result of having evaluated the reprogramming efficiency in each T cell subset based on the number of ALP + colonies obtained from the 1 * 10 ⁇ 5 > T cell subset replated on MEF. In the figure, the vertical axis represents the average number ⁇ S. Of ALP + colonies in three independent experiments. D. Indicates.
  • (A) is a figure which shows the outline of T lineage cell preparation from a pluripotent cell by culture
  • “Cytokine cocktail” indicates that hIL-7, hFlt-3L, and hSCF were added.
  • (B) is a scatter diagram showing the results of examining the expression of CD45, CD3, CD4, CD8, and TCR ⁇ using flow cytometry for T lineage cells prepared from each pluripotent cell.
  • ES indicates a T lineage cell derived from ES cells
  • skin iPS indicates a T lineage cell derived from skin iPS cells
  • T-iPS indicates a T lineage cell derived from T-iPS cells
  • PB peripheral blood (control data).
  • A is a diagram showing an outline of preparation of T lineage cells from pluripotent cells such as T-iPS cells by culturing on OP9 and OP9-DL1 stromal cell layers.
  • pluripotent cells were cultured on an irradiated OP9 cell layer for 10 to 14 days in an essential medium containing no cytokine and containing ⁇ -MEM, and then the induced hematopoietic cells were treated with OP9-DL1 cells.
  • FIG. 4 shows that the cells were cultured in an essential medium based on ⁇ MEM supplemented with hIL-7, hFlt-3L, hSCF and the like for 3 or 4 weeks.
  • B collects floating cells in the medium at each culture time point and examines the expression of T lineage markers CD45, CD34, CD3, CD4, CD8, TCR ⁇ using flow cytometry, and at least 3 independent It is a scatter diagram which shows the typical result in 1 experiment.
  • FIG. 3 is a scatter plot showing representative results in at least three independent experiments, in which the expression of T lineage cell markers was analyzed by flow cytometry.
  • the numerical values shown in each scatter diagram indicate the percentage (%) of cells in each category, “Human ESC” indicates the result in human ES cells (KhES3), and “CB-iPS” indicates umbilical cord blood CD34 positive.
  • FIG. 5 is a graph showing CD4 and CD8 expression in CD3 + T lineage cells as assessed by flow cytometry. In the figure, the vertical axis represents the relative distribution ⁇ S. D. Indicates.
  • “Human ESC” shows the result in human ES cells
  • “CB-iPSC” shows the result in cord blood CD34 positive cell-derived iPS cells
  • “HDF-iPSC” shows the results in human skin fibroblast-derived iPS cells
  • “T-iPSC” indicates the result in T-iPS cells.
  • the column of each cell indicates “DN”, “CD8”, “CD4”, “DP” in order from the left. Further, “DN” indicates CD4 ⁇ CD8 ⁇ , “CD4” indicates CD4 + CD8 ⁇ , “CD8” indicates CD4 ⁇ CD8 + , and “DP” indicates CD4 + CD8 ⁇ . It shows that it is + .
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph showing the results of analyzing the PCR product obtained by amplifying the TCR of TkT3V1-7 by PCR through construction of a cDNA library by SMART.
  • FIG. 25 is a diagram showing the results of sequencing analysis for PCR products in the effective size range (about 750 bp) shown in FIG.
  • FIG. 4 is a diagram showing that no progeny from the DJ ⁇ reconstructed allele was confirmed. Details and results of other samples are shown in Tables 8 and 9. It is a graph which shows the result of having evaluated the expression of CD3 by flow cytometry. In the figure, the vertical axis represents the ratio of CD3 + T lineage cells in CD45 + blood cells (Averages ⁇ SD of independent experiments of 3 or more in each group).
  • “Human ESC” indicates the result in human ES cells
  • “CB-iPSC” indicates the result in cord blood CD34 positive cell-derived iPS cells
  • “HDF-iPSC” indicates the results in human skin fibroblast-derived iPS cells
  • “T-iPSC” indicates the result in T-iPS cells.
  • ** indicates p ⁇ 0.01 for all other samples. It is a graph which shows the average fluorescence intensity (MFI, Mean fluorescence intensity) of CD3 evaluated by flow cytometry. The vertical axis represents CDs / iPS and HDF-iPS for each group 2, and others are averages ⁇ S.
  • “Human ESC” indicates the result in human ES cells
  • “CB-iPSC” indicates the result in cord blood CD34 positive cell-derived iPS cells
  • “HDF-iPSC” indicates human skin fibroblast-derived iPS cells.
  • T-iPSC shows the result in T-iPS cells
  • PB shows the result in peripheral blood mononuclear cells. It is the schematic which shows the arrangement
  • the human TCRG locus spans 135 kb on chromosome 7q14.
  • the forward primer and the reverse primer are each designed in a region having high homology in the V ⁇ segment or the J ⁇ segment, and the reconfiguration of the TCRG gene can be detected by detecting a PCR band of about 200 bp.
  • the human TCRB locus extends over 685 kb on chromosome 7q34.
  • 23 V ⁇ primers, 2 D ⁇ primers, and 13 J ⁇ primers can be annealed to the same conserved region. Designed.
  • the primer was divided into three tubes, each mixed and used for analysis.
  • the present invention provides a method for producing human T cells, comprising the steps of inducing iPS cells from human T cells and differentiating the iPS cells into T cells.
  • the “human” from which T cells are isolated is not particularly limited. Even a healthy person may be a person who has a reduced immune function or a person suffering from a malignant tumor, an infectious disease, an autoimmune disease or the like.
  • the human from whom T cells obtained by the present invention are administered is compared with the human to which the T cells obtained by the present invention are administered.
  • T cell means a cell expressing an antigen receptor called T cell receptor (TCR) on the surface.
  • TCR T cell receptor
  • human T cells induced into iPS cells and “human T cells differentiated from iPS cells” are not particularly limited, but preferably express CD3 and are selected from the group consisting of CD4 and CD8. T cells expressing at least one selected molecule.
  • human T cells include helper / regulatory T cells that are CD4 positive cells, cytotoxic T cells that are CD8 positive cells, naive T cells (CD45RA + CD62L + cells), central memory T cells ( CD45RA ⁇ CD62L + cells), effector memory T cells (CD45RA ⁇ CD62L ⁇ cells), and terminal effector T cells (CD45RA + CD62L ⁇ cells).
  • human T cells differentiated from iPS cells have the same antigen specificity as human T cells induced into iPS cells.
  • antigen specificity in T cells is provided by antigen-specific, rearranged TCR genes.
  • human T cells induced into iPS cells can be isolated from human tissues by a known technique.
  • the human tissue is not particularly limited as long as it is a tissue containing the T cell, and examples thereof include peripheral blood, lymph nodes, bone marrow, thymus, spleen, umbilical cord blood, and lesioned tissue.
  • peripheral blood and umbilical cord blood are preferable from the viewpoint of low invasiveness to humans and easy preparation.
  • a known technique for isolating human T cells includes, for example, flow cytometry using an antibody against a cell surface marker such as CD4 and a cell sorter as shown in the Examples described later.
  • desired T cells can be isolated using cytokine secretion or functional molecule expression as an index.
  • T cells have different cytokines secreted depending on Th1 type or Th2 type. Therefore, T cells having a desired Th type can be isolated by selecting such cytokines as indicators. .
  • cytotoxic (killer) T cells can be isolated using secretion or production of granzyme or perforin as an index.
  • a desired tissue is obtained from a human tissue containing “T cells having desired antigen specificity”. A method of purification using an affinity column or the like on which an antigen is immobilized can be employed.
  • MHC tetramer major histocompatibility gene complex
  • T a desired antigen specificity from a human tissue.
  • a method of purifying “cells” can also be employed.
  • the “iPS cell” in the present invention is a cell also called an induced pluripotent stem cell or an inducible pluripotent stem cell, and is induced by introducing a cell reprogramming factor into the T cell. can do.
  • the “cell reprogramming factor” is a factor that can impart differentiation pluripotency to a somatic cell by being introduced into the T cell alone or in cooperation with other differentiation pluripotency factors.
  • Oct3 / 4 c-Myc, Sox2, Klf4, Klf5, LIN28, Nanog, ECAT1, ESG1, Fbx15, Eras, ECAT7, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, ECAT15-2, It is preferably at least one protein selected from the group consisting of Fthl17, Sal14, Rex1, Utf1, Tcl1, Stella, ⁇ -catenin, Stat3 and Grb2. Furthermore, among these proteins, it is more preferable to introduce Oct3 / 4, c-Myc, Sox2 and Klf4 (4 factors) into the somatic cells from the viewpoint that iPS cells can be established efficiently with few factors. Further, from the viewpoint of reducing the risk of canceration of the resulting pluripotent stem cells, it is more preferable to introduce Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 (3 factors) excluding c-Myc into the somatic cells.
  • OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC, and NANOG are introduced into human CD8 positive T cells from the viewpoint of further increasing the efficiency of induction into iPS cells.
  • OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC, NANOG, and LIN28 are more preferably introduced into human CD8-positive T cells.
  • the method of “introducing a cell reprogramming factor into T cells” is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used.
  • the nucleic acid (eg, cDNA) encoding the cell reprogramming factor contains a promoter that functions in the T cell. And can be introduced into cells by infection, lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, electroporation method .
  • Examples of the “expression vector” according to the present invention include viral vectors such as lentivirus, retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, and animal cell expression plasmid.
  • the promoter used in such an expression vector examples include SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, RSV promoter, HSV-TK promoter and the like.
  • a promoter may be one that can control the expression of a gene inserted downstream of the promoter depending on the presence or absence of a drug (eg, tetracycline).
  • the expression vector may further contain an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene (for example, neomycin resistance gene), an SV40 replication origin, and the like.
  • the T cells are treated with interleukin-2 (IL-2) before the introduction of the cell reprogramming factor.
  • IL-2 interleukin-2
  • Such stimulation can be performed, for example, by adding IL-2, anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody to the medium and culturing the T cells for a certain period of time, as shown in Examples described later.
  • the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody may be ones to which magnetic beads or the like are bound, and instead of adding these antibodies to the medium, the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody are bound to the surface.
  • Stimulation may be given by culturing the T cells for a certain period on a cultured dish.
  • stimulation may be given by adding an antigen peptide recognized by human T cells to a medium together with feeder cells.
  • the concentration of IL-2 added to the medium is not particularly limited, but is preferably 1 to 200 ng / ml.
  • the concentration of the anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody added to the medium for such stimulation is not particularly limited, but it is preferably 1 to 10 times the culture amount of the T cells.
  • the concentration of anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody bound on the surface of the culture dish in such stimulation is not particularly limited, but the concentration at the time of coating is 1 to 100 ⁇ g / ml for anti-CD3 antibody, and anti-CD28 antibody. In this case, it is preferably 0.1 to 10 ⁇ g / ml.
  • the culture period for performing such stimulation is a period sufficient to give such stimulation to the T cells, and the T cells can be expanded to the number of cells necessary for introduction of the cell reprogramming factor.
  • the period is not particularly limited, but is usually 2 to 14 days, and preferably 2 to 7 days from the viewpoint of gene transfer efficiency. Furthermore, from the viewpoint of increasing gene transfer efficiency, it is preferable to culture on a culture dish coated with retronectin.
  • Examples of a medium for culturing the T cell and adding IL-2, anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, etc. include, for example, a known medium suitable for culturing the T cell (more specifically, IL-2 etc. Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, minimal essential medium ( ⁇ -MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), F12 medium, etc.) containing the above-mentioned cytokines, fetal calf serum (FCS) .
  • the medium may contain amino acids necessary for culture (eg, L-glutamine) and antibiotics (eg, streptomycin, penicillin). .
  • IL-7 or IL-15 When CD8 positive T cells are induced into iPS cells, it is preferable to add IL-7 or IL-15 to the medium from the viewpoint of suppressing apoptosis. There are no particular restrictions on the concentration of IL-7 or IL-15 added, but it is preferably 1 to 100 ng / ml.
  • the T cell into which the cell reprogramming factor has been introduced is cultured on a feeder cell layer. It is preferable to do this.
  • a feeder cell For example, a mouse embryo fibroblast (MEF), STO cell, and SNL cell which stopped cell division by irradiation of radiation or antibiotic treatment are mentioned.
  • the cell reprogramming factor when introducing the cell reprogramming factor into the T cells with basic fibroblast growth factor (bFGF), or Thereafter, it is preferably added to the medium.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproic acid
  • trichostatin A sodium butyrate
  • MC 1293, M344 and other small molecule inhibitors siRNA against HDAC
  • G9a histone methyltransferase inhibitors small molecule inhibitors such as BIX-01294, siRNA against G9a, etc.
  • p53 inhibitors small molecule inhibitors such as Pifithrin- ⁇ (PFT- ⁇ ), siRNA against p53, etc. Is preferably added to the medium at the time of introducing the cell reprogramming factor into the T cells or thereafter.
  • protamine sulfate should be added to the medium in order to facilitate the binding of the vector to the T cells. Is preferred.
  • a known medium suitable for culturing the T cells is gradually replaced with a medium suitable for culturing iPS cells. It is preferable to culture while continuing.
  • a medium suitable for culturing such iPS cells a known medium can be appropriately selected and used.
  • knockout serum substitute, L-glutamine, non-essential amino acid, 2-mercaptoethanol, b-FGF and the like can be used. Examples thereof include Dulbecco's modified Eagle medium / F12 medium (human iPS cell medium).
  • 1-1000 ⁇ M Cultivation is preferably performed under low oxygen concentration conditions (oxygen concentration: for example, 5%) in a medium further supplemented with ROCK inhibitor, and 1 to 1000 ⁇ M MEK inhibitor (for example, PD0325901) and 1 to 1000 ⁇ M GSK3 inhibitor (for example, , CHIR99021) is preferably added to the medium until colony formation described below.
  • TiPS cells selection of iPS cells derived from the T cells (hereinafter also referred to as “TiPS cells”) can be performed by appropriately selecting a known technique.
  • known methods include, for example, a method of observing and selecting the morphology of ES cells / iPS cell-like colonies as shown in the examples described later under a microscope, or knowing that they are specifically expressed in iPS cells.
  • Recombinant T cells targeting drug resistance gene or reporter gene (GFP gene, etc.) at the gene locus of the gene are selected using drug resistance or reporter activity as an index.
  • GFP gene drug resistance gene, etc.
  • iPS cells can be confirmed by, for example, undifferentiated cell-specific markers (ALP, SSEA-4, Tra- 1-60, Tra-1-81, etc.) can be detected by immunostaining, RT-PCR, or the like, or selected cells can be transplanted into mice and their teratoma formation observed. .
  • ALP undifferentiated cell-specific markers
  • SSEA-4 Tra- 1-60, Tra-1-81, etc.
  • RT-PCR or the like
  • the confirmation that the cells selected in this way are derived from the T cells can be performed, for example, by detecting the state of TCR gene rearrangement by genomic PCR, as shown in Examples below. it can.
  • the time for selecting and recovering these cells can be appropriately determined while observing the growth state of the colonies, and is generally 14 to 28 days after the introduction of the cell reprogramming factor into the T cells. .
  • the TiPS cells are allowed to contain cytokines on the stromal cells.
  • the stromal cells to be used are preferably OP9 cells and 10T1 / 2 cells subjected to treatment such as irradiation from the viewpoint of facilitating differentiation into hematopoietic system.
  • a medium containing at least one cytokine selected from the VEGF, SCF, TPO, SCF, and FLT3L groups it is preferable to culture in a medium containing at least one cytokine selected from the VEGF, SCF, TPO, SCF, and FLT3L groups. It is more preferable to culture in a medium containing VEGF, SCF and TPO, or in a medium containing VEGF, SCF and FLT3L.
  • the culture period is preferably a period until the formation of a bag-like structure (also referred to as ES-sac (sac)) containing blood cells and the like, and 10 to 14 after the start of cultivation of TiPS cells. Preferably it is days.
  • Cells contained in the sac obtained as described above should be cultured on stromal cells in ⁇ -MEM medium containing cytokines, FCS, etc. Is preferred.
  • the cell which exists in the inside of this sac-like structure can be isolate
  • the stromal cells used for this culture are OP9-DL1 cells, OP9-DL4 cells, 10T1 / 2/10 treated with radiation and the like from the viewpoint of inducing differentiation into T lymphocytes via a notch signal. DL4 cells are preferred.
  • cytokines added to the medium examples include IL-7, FLT3L, VEGF, SCF, TPO, IL-2, and IL-15.
  • IL-7 and FLT3L are preferable from the viewpoint of helping differentiation of early T cells.
  • SCF is preferably not contained in the medium.
  • the concentration of IL-7 added to the medium is 0 from the viewpoint that CD3-positive CD56-negative T lineage cells can be easily obtained and differentiation into CD4 single-positive (SP) T cells or CD8SPT cells is easily induced. It is preferably 1 to 4 ng / ml.
  • T cells thus obtained can be isolated by appropriately selecting a known technique.
  • a known technique for example, flow cytometry using an antibody against a cell surface marker such as CD4 and a cell sorter as shown in the Examples described later can be mentioned.
  • a method of purification using an affinity column or the like on which a desired antigen is immobilized can be employed.
  • a method of purifying “T cells having desired antigen specificity” using an MHC tetramer to which a desired antigen is bound may be employed.
  • Human T cell, pharmaceutical composition, immune cell therapy method Since human T cells produced by the method of the present invention have an antigen-specific immune function, they can be used, for example, for the treatment or prevention of diseases such as tumors, infectious diseases, and autoimmune disorders.
  • the present invention provides a human T cell produced by the method of the present invention, a pharmaceutical composition containing the human T cell, and a method of immune cell therapy using the human T cell.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by formulating human T cells produced by the method of the present invention by a known pharmaceutical method.
  • it can be used mainly parenterally as capsules, liquids, film coating agents, suspensions, emulsions, injections (intravenous injections, infusions, etc.).
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterilized water or physiological saline, vegetable oil, solvent, base, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, vehicle, Combined with preservatives, binders, diluents, tonicity agents, soothing agents, extenders, disintegrating agents, buffering agents, coating agents, lubricants, colorants, solubilizers or other additives as appropriate.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterilized water or physiological saline, vegetable oil, solvent, base, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, vehicle, Combined with preservatives, binders, diluents, tonicity agents, soothing agents, extenders, disintegrating agents, buffering agents, coating agents, lubricants, colorants, solubilizers or other additives as appropriate.
  • the dosage is appropriately selected according to the age, weight, symptom, health condition of the subject, the type of composition (pharmaceutical, food and drink, etc.) and the like.
  • the product (pharmaceutical product) of the composition of the present invention or the instructions thereof may have a label indicating that it is used for treating or preventing a decrease in immune function.
  • label indicating that it is used for treating or preventing a decrease in immune function means that the product body, container, packaging, etc. are marked, or instructions, package inserts, promotional materials, or other printed materials that disclose product information. It means that the display is attached to.
  • the method of immune cell therapy of the present invention comprises a step of isolating T cells having a desired antigen specificity from a human, a step of inducing iPS cells from T cells having the desired antigen specificity, and the iPS cells.
  • the method comprises the step of differentiating T cells into T cells and the step of administering the obtained iPS cell-derived T cells into the human body.
  • the human from whom the T cells obtained by the present invention are administered has the same type of HLA as the human from whom the T cells are isolated. It is preferable that the T cell obtained by the present invention is the same person as the human being administered.
  • human T cells to be administered human T cells produced by the method of the present invention may be administered as they are, or may be administered in the form of a pharmaceutical composition formulated as described above.
  • Flow cytometry> The flow cytometry analysis was performed using MoFlo (manufactured by Dako Cytomation), FACSAria (registered trademark, manufactured by BD Bioscience), or FACSCanto II (registered trademark, manufactured by BD Bioscience). Analysis of the obtained data was performed using FlowJo software (manufactured by Treestar). Moreover, the antibody used for the flow cytometry analysis is as follows.
  • Anti-human CD3-APC antibody (manufactured by BD Bioscience), anti-human CD4-FITC antibody (manufactured by BD Bioscience), anti-human CD8-PerCP / Cy5.5 antibody (manufactured by BD Bioscience), anti-human CD56-PE antibody ( BD Bioscience), anti-human CD45RA-Pacific Blue antibody (Caltag Laboratories), anti-human CD62L-PE-Cy7 antibody (Biolegend), anti-human CD45-Alexa 405 antibody (Molecular Probes-Invitrogen-Invitrogen-Invitrogen) USA), anti-human CD34-PE antibody (BD Bioscience), anti-human CD38-PerCP / Cy5.5 antibody (Biolegend), Human CD1a-APC antibody (manufactured by Biolegend), anti-human CD5-PE / Cy7, -CD7-FITC antibody (manufactured by Biolegend), anti-human CD5-PE / Cy7 antibody (manufactured by Biolegend), anti
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • Ficoll density gradient centrifugation Ficoll-Paque PLUS (registered trademark), 17-1440-02, manufactured by GE Healthcare
  • MoFlo The product was purified by DAKO Cytomation.
  • T cells were isolated using the CD3 + CD56 ⁇ cell population as a gate to avoid natural killer T (NKT) cell contamination.
  • a subset of T cells set an additional gate and segregated into the CD4 (CD4 + CD8 ⁇ ) and CD8 (CD4 ⁇ CD8 + ) cohorts.
  • CD4 and / or CD8 cells were further classified as naive (CD45RA + CD62L + ), central memory (CD45RA ⁇ CD62L + ), effector memory (CD45RA ⁇ CD62L ⁇ ), or terminal effector (CD45RA + CD62L ⁇ ).
  • the cells thus sorted were 10% fetal bovine serum (GIBCO-Invitrogen), 100 U / ml penicillin, 100 ng / ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, and 20 ng / ml human interleukin 2 (hIL-2,
  • the cells were first cultured in Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640 medium (GIBCO-Invitrogen) supplemented with Novartis Vaccines & Diagnostics. Then, these cells were activated by adding anti-CD3 / CD28-bound magnetic beads (Dynabeads (registered trademark), ClinExVivo (registered trademark) CD3 / CD28, manufactured by Invitrogen) three times the amount of such T cells.
  • T-iPS cells iPS cells derived from T cells
  • this activated day is defined as day 0 (hereinafter, see FIG. 1).
  • CD3 + cells magnetically captured from PBMCs were isolated and stimulated with anti-CD3 / CD28 coupled magnetic beads.
  • day 2 and day 3 cells were retrovirused by spinoculation on a retronectin (registered trademark) coating plate (manufactured by Takara) supplemented with 10 ⁇ g / ml protamine sulfate (manufactured by Sigma-Aldrich).
  • Kaneko S. et al., Blood, 2009, 113, 1006-1015
  • the complete synthetic medium for T cell culture was changed daily.
  • infected cells were harvested and transferred onto 3 ⁇ 10 5 irradiated MEF cell layers on 6 cm dishes. Thereafter, for 4 days (day 6 to day 10), half of the medium was replaced with human iPS cell medium every day.
  • the composition of the human iPS cell culture medium is as follows (see Takayama, N. et al., Blood, 2008, 111, 5298-5306).
  • VPA HDAC inhibitor valproic acid
  • Chromosome G band analysis was outsourced to the Japan Institute of Genetics and performed according to a predetermined method.
  • ALP staining human ES / iPS cell-like colonies were fixed with ice-cold fixative (90% methanol, 10% formaldehyde), and ALP staining kit (Vector Laboratories) was used, following the manufacturer's instructions. Stained.
  • immunocytochemical staining human ES / iPS cell-like colonies were fixed with 5% paraformaldehyde and permeabilized with 0.1% Triton X-100.
  • the colonies pretreated in this way were incubated with the primary antibody.
  • the primary antibodies used and the dilution ratios are as follows. PE-conjugated anti-SSEA-4 (FAB1435P, manufactured by R & D Systems, dilution ratio: 1/50), anti-Tra-1-60 (MAB4360, manufactured by Millipore, dilution ratio: 1/100), anti-Tra- 1-81 (MAB4381, manufactured by Millipore, dilution ratio: 1/100). Further, for the detection of Tra-1-60 and Tra-1-81, Alexa Fluor 488-conjugate goat anti-mouse antibody (dilution ratio: 1/500, A11029, manufactured by Molecular Probes-Invitrogen) is used as a secondary antibody. Using.
  • PCR was performed using ExTaq HS (manufactured by Takara) at 30 cycles for housekeeping genes (GAPDH or ACTB) and 35 cycles for all pluripotency genes or T cell-related genes.
  • GPDH or ACTB housekeeping genes
  • T cell-related genes The target genes and the sequences of the PCR primers used for the analysis are shown in Tables 1 and 2.
  • RNA Human genome cells (KhES3), T cell-derived iPS cells (TkT3V1-7), and CD3 / CD28-stimulated CD3 + CD4 + CD8 ⁇ cells were subjected to expression analysis of whole genome genes.
  • total RNA (2 ⁇ g) was extracted from each cell and subjected to probe preparation.
  • the fluorescence-labeled complementary RNA and Whole Human Genome Microarray 4 ⁇ 44K (G4112F, manufactured by Agilent Technologies) were hybridized by a one-color method (contractor: Takara Bio Inc).
  • the array was scanned, and the spot image was detected with an Agilent Feature Extraction apparatus (manufactured by Agilent Technologies).
  • the obtained signal data was analyzed using GeneSpring software (manufactured by Agilent Technologies). Two normalization procedures were applied to normalize the obtained data. That is, the signal intensity less than 0.01 was set to 0.01. In addition, each chip was normalized to the 50th percentile of the measured value obtained from the chip. Then, in all three samples, analysis was performed on the gene (36275 gene) with the present flag.
  • Genomic DNA was extracted from about 5 ⁇ 10 6 T-iPS cells using a QIAamp DNA kit (Qiagen). The extracted DNA (40 ng) was used to detect each of TCRG, TCRB, and TCRA gene rearrangement by PCR.
  • PCR (Benhattar, J. et al., Diamol Mol Pathol, 1995, vol. 4, pages 108-112) for detecting TCRG reconstitution was performed using ExTaq HS (Takara).
  • the PCR reaction conditions were 95 ° C for 5 minutes, followed by 5 cycles of reactions with relatively high annealing temperatures, ie, 95 ° C for 45 seconds, 65 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 45 seconds, and A reaction having a relatively low annealing temperature, that is, a reaction at 95 ° C. for 45 seconds, 55 ° C. for 45 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds was defined as 30 cycles.
  • PCR and heteroduplex analysis are in accordance with the BIOMED-2 protocol (van Dongen, J. Leukemia, 2003, Vol. 17, pp. 2257-2317) with minor modifications. I went.
  • Primer constructs for detecting TCRA reconstitution are Han et al. (See Han, M. et al., J Immunol, 1999, 163, pages 301-311).
  • PCR reaction conditions were 95 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 6 minutes, 3 cycles of amplification reaction, 95 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 45 seconds, and 72 ° C.
  • the amplification reaction of 6 minutes was 15 cycles, 95 ° C for 15 seconds, 62 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 6 minutes for 12 cycles.
  • PCR was performed by LATaq HS (manufactured by Takara).
  • the obtained PCR product was fractionated by gel based on size. Next, main bands within the expected size range were cut out, purified using a QIAquick gel extraction kit (manufactured by Qiagen), and sequenced.
  • sequence reaction PCR amplification and fluorescent dye addition were performed in a multifaceted approach using BigDye terminator kit v3.1 (Applied Biosystems) with V ⁇ , J ⁇ , V ⁇ , D ⁇ , or J ⁇ primer set. .
  • the obtained reaction product was analyzed with an ABI PRISM 3100 automatic sequencer (Applied Biosystems).
  • the results obtained are related to the construction of TCRA or TCRB.
  • the V, D, and J segments are the published sequences and the ImMunoGeneTics (IMGT) database (http://www.cines.fr/). Compared and identified by using a web tool such as v-quest (Lefranc, MP “IMGT databases, web resources and tools for immunoglobulin and T cell receptor sequence./ref. Leukemia, 2003, Vol. 17, pages 260-266). Moreover, the naming of gene fragments (segments) was in accordance with the IMGT nomenclature. The primer sequences used for detection of TCR reconstruction are shown in Tables 3-4.
  • T-iPS cells ⁇ Induction from T-iPS cells to T-lineage cells> Takayama, N., which has been subjected to slight modifications so that T-iPS cells or other pluripotent stem cells have an embryonic stem cell-derived sac (ES-sac) -like structure.
  • ES-sac embryonic stem cell-derived sac
  • Pluripotent cells are on an irradiated OP9 cell layer and contain no ⁇ -MEM based medium (20% fetal bovine serum, 100 U / ml penicillin, 100 ng / ml streptomycin, and 2 mM L-glutamine). ⁇ MEM) was co-cultured for 10 to 14 days (about Day 12).
  • Suspension cells packed in the sac were transferred onto the OP9-DL1 cell layer, and co-cultured to Day 40 in a medium based on ⁇ MEM and supplemented with 10 ng / ml hIL-7 and hFlt-3L.
  • the day when the pluripotent cells are transferred onto the OP9 cell layer is referred to as Day0.
  • the culture medium was changed every 3 days.
  • T lineage cells floating on the OP9-DL1 cell layer and expressing CD45, CD3, and TCR ⁇ were sorted weekly by flow cytometry and analyzed for gene expression.
  • OP9 cells and OP9-DL1 cells were obtained from the RIKEN BioResource Center through the National Bioresource Project (Japan).
  • cytokine production (expression) profile of T lineage cells was modified by Uckert, W. et al. Et al., Cancer Immunol Immunother, 2008, 58, pages 809-822. That is, 1 ⁇ 10 5 floating cells were converted into 10 ng / ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma-Aldrich), 0.4 ⁇ M A23187 calcium ionophore (ionomycin, Sigma-Aldrich) ) And 20 IU / ml hIL-1 ⁇ (Peprotech) for 12 hours. Furthermore, in the last 3 hours, the protein secretion inhibitor brefeldin A (1 mM, manufactured by Sigma-Aldrich) was added and cultured.
  • Such stimulated cells were labeled with anti-CD3 binding magnetic microbeads (Miltenyi Biotec) and held in a magnetic column.
  • an intracellular staining kit Inside stain kit, manufactured by Miltenyi Biotec
  • solid-cell intracellular staining solid-state intracellular cytostaining
  • SMART method a method based on a switching mechanism at the 5 ′ end of the reverse transcript (switch mechanism at the 5′-end of the reverse transcript)
  • switch mechanism at the 5′-end of the reverse transcript
  • SMART method a method based on a switching mechanism at the 5 ′ end of the reverse transcript (switch mechanism at the 5′-end of the reverse transcript)
  • SMART method Du, G. et al., J Immunol Methods, 2006, 308, 19-
  • cDNA was synthesized according to the manufacturer's instructions. That is, using 3 ′ SMART (registered trademark) CDS primer and SMART II A oligo (Super SMART (registered trademark) cDNA synthesis kit) and PrimeScript Reverse Transscriptase (produced by Takara Co., Ltd. at 90 ° C.
  • PCR reaction conditions were 20 cycles of 95 ° C. for 5 seconds, 65 ° C. for 5 seconds, and 68 ° C. for 3 minutes.
  • the amplified cDNA was used as a template in a TCRA-specific amplification reaction or a TCRB-specific amplification reaction. Specifically, amplification was performed by using 25 cycles of reaction of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 3 minutes using a forward primer (2nd 5′-SMART) and a reverse primer. As the reverse primer, 3'-TRAC was used for TCRA amplification and 3'-TRBC was used for TCRB amplification. The obtained PCR product was inserted into a pGEM-T-Easy vector (Promega, made by Madison) and sequenced.
  • iPS cells were established using T cells in human peripheral blood as shown in FIG. That is, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or CD3-positive cells are isolated from the peripheral blood of a healthy person (age (24 to 56 years old) and a plurality of healthy persons with different genders) and stimulated with CD3 / CD28 ClinExVivo beads. did.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CD3-positive cells are isolated from the peripheral blood of a healthy person (age (24 to 56 years old) and a plurality of healthy persons with different genders) and stimulated with CD3 / CD28 ClinExVivo beads. did.
  • iPS medium human iPS cell culture medium
  • the T cell medium was completely replaced with the iPS medium 4 days after seeding.
  • a cobblestone-like cell cluster was observed around 11 days after dissemination (5 days after seeding), and after several days (18-24 days after the start of culture), a human ES cell-like appearance was exhibited (FIG. 2). : See colony (photo of human ES cell-like colony).
  • CD3-derived pluripotent cells human ES cells (KhES3) and peripheral blood T cells were compared by microarray analysis.
  • the overall pattern of gene expression in CD3-derived iPS cells was similar to that in human ES cells, but different from that in T cells (see FIG. 6).
  • iPS cells established from human peripheral blood T cells have pluripotency.
  • Example 2 In order to confirm that the established iPS cells were derived from T cells, reconstitution of the TCR gene was confirmed. Three groups of TCR ⁇ , TCR ⁇ , and TCR ⁇ start reconstitution from an early stage (almost in this order). Reconstitution of the TCR ⁇ gene was observed in 2 out of 4 clones derived from 4 factors and 6 out of 9 clones derived from 3 factors (see FIG. 9: electrophoresis).
  • Example 3 Further, as in Example 2, in order to confirm that the established iPS cells were derived from T cells, reconstitution of the TCR gene was confirmed. That is, humans have four TCR genes (TCRA, TCRB, TCRG, and TCRD), and these DNA rearrangements are known to be involved in the development of normal T lymphocytes in the thymus. Yes. In addition, TCR gene rearrangement is an irreversible genetic phenomenon specific to T lineage cells, and this genetic phenomenon gives T cells a genetic signature and is characterized. Therefore, by examining these traces, it can be retrospectively confirmed whether the iPS cells obtained in Example 1 are derived from mature peripheral T lymphocytes of a healthy donor.
  • TCRA TCRA
  • TCRB TCRB
  • TCRG TCRG
  • TCRD TCRD
  • TCRG or TCRB rearrangement was detected by PCR analysis using a TCR primer set designed by Benhatter et al. And BIOMED-2 Consortium (see FIGS. 28 and 29, Benhattar, J. et al., Diamol Mol Pathol, 1995). 4, pp. 108-112, van Dongen, JJ, Leukemia, 2003, 17, pp. 2257-2317).
  • TCRG or TCRB reconstitution was identified in all examined iPS cell lines, and it was confirmed that all examined iPS cell lines were derived from peripheral blood T lymphocytes (FIGS. 10 and 11). .
  • the TCR ⁇ chain forms a heterodimer with the TCR ⁇ chain, and most peripheral blood T cells express TCR ⁇ (Davis, MM et al., Nature, 1998, 334, 395- (See page 402).
  • the TCRA locus is complex.
  • the TCRA locus is a region spanning over 1000 kb, not only containing the TCRD locus, but also including 103 V ⁇ segments, 61 J ⁇ segments, and C ⁇ segments. Therefore, in order to detect TCRA gene rearrangement in genomic DNA, a set of 34 forward primers for the V ⁇ segment and 12 reverse primers for the J ⁇ segment was designed.
  • TCR binding to the HLA-peptide complex is inevitably determined by the three-dimensional structure of the antigen recognition site consisting of three types of complementarity determining regions (CDR1, 2, and 3).
  • CDR3 is the most dispersible because it spans the V (D) J binding region into which various random nucleotides (N-nucleotides or P-nucleotides) are inserted.
  • D V
  • Peripheral T lymphocytes are mainly derived from two functional subsets: CD4 + helper / regulatory cells and CD8 + cytotoxic cells.
  • CD4 + helper / regulatory cells CD4 + helper / regulatory cells
  • CD8 + cytotoxic cells CD4 + helper / regulatory cells
  • peripheral T lymphocytes are divided into CD4 + T cells and CD8 + T cells and reprogrammed into iPS cells. Is there a difference in the efficiency of reprogramming into iPS cells depending on the difference in the derived T cells? I checked. The induction conditions for each cell are shown below.
  • CD4-positive T cells A CD3-positive CD56-negative CD4-positive T cell fraction (hereinafter referred to as CD4-positive T cells) of peripheral blood mononuclear cells obtained by blood collection is collected at a flow site, and anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody (bead binding, solidification). , Regardless of the addition to the medium). About 20 ng / ml of human IL-2 was added to the medium, and Yamanaka factor gene was introduced multiple times on a 24-well plate coated with retronectin 48 to 96 hours after stimulation. The Yamanaka factors used at that time are OCT4, SOX2, KLF4, and C-MYC, or OCT4, SOX2, and KLF4.
  • CD8-positive T cell A CD3-positive CD56-negative CD8-positive T cell fraction (hereinafter referred to as CD8-positive T cell) of peripheral blood mononuclear cells obtained by blood collection is collected at a flow site, and anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody (bead binding, solidification). , Regardless of the addition to the medium).
  • human IL-2 (20 ng / ml), IL-7 (10 ng / ml), and IL-15 (about 10 ng / ml) were added, and multiple times on a 24-well plate coated with retronectin 48 to 96 hours after stimulation. Introduced Yamanaka factor gene.
  • the Yamanaka factors used at that time are OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC, NANOG, and LIN28, or OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC, and NANOG.
  • Two to five days after the last gene transfer 1 to 5 ⁇ 10 5 gene-transferred T cells were placed on irradiated MEFs on a 6 cm dish.
  • the CD8 positive T cells were not sorted and used at the flow site on the first day, the CD8 positive T cells were sorted by the flow site at this timing and placed on the MEF.
  • T-iPS cells can be obtained from CD4 + T lymphocytes in 7 or 8 trials without introducing NANOG.
  • CD4 + T lymphocytes were further analyzed based on the expression of CD45RA and CD62L / CCR7, naive (CD45RA + CD62L +), central memory (CD45RA-CD62L +), effector memory (CD45RA-CD62L-), and terminal effector
  • the cells were divided into subsets of T cells (CD45RA + CD62L ⁇ ) and induced (reprogrammed) into iPS cells (see Sallusto, F. et al., Nature, 1999, 401, pages 708-712, see FIG. 14).
  • the average reprogramming efficiency in three healthy donors was 0.0041% for naive T cells, 0.017% for central memory T cells, 0.0036% for effector memory T cells, and terminal effector It was clarified that T-iPS cells were established relatively better than central memory T cells, which was 0.0008% in T cells (see FIG. 15). Note that the high reprogramming efficiency of CD4 + central memory T cells may reflect the sensitivity to anti-CD3 / CD28 stimulation.
  • Example 5 ⁇ Functional analysis of T lineage cells differentiated from TiPS cells> Transplantation of CD34 positive cells obtained from human ES cells into SCID-hu mice induces differentiation of the T cell lineage in the transplanted human fetal thymus (Galic, Z et al., PNAS, 2006, 103, 31). No., pages 11742-7). In vivo, ES cells are induced by OP9-DL1 cells into CD3 positive and TCR positive cells mainly CD4 / CD8 double positive (Timermans et al., JI, 2009, 182, 6879-6888). ).
  • T-iPS cells T cell-derived iPS cells
  • T-iPS cells T cell-derived iPS cells
  • T-iPS cells cultured on OP9 in the presence of IL-7, Flt3L (human FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) or SCF (human stem cell factor, hSCF) are ES-sac (Sac) (Takayama et al., Blood, 2008 The structure of No. 111, No.
  • CD45 positive blood cells were induced therein by day 14 (see (a) of FIG. 16).
  • Blood cells were transferred to OP9-DL1 on days 12 to 14 and the culture was repeated every 3 days to continue the culture.
  • CD3-positive cells were collected by FACS and T cell-related genes were collected. The expression of was evaluated.
  • the CD3 positive cells on the 40th day were mainly CD4 / 8 negative cells, but some CD8 single positive cells were observed in part (see FIG. 16 (b)).
  • CD3 + TCR ⁇ + cells were in the conegative (DN) stage, but in some cell groups, only CD4 positive cells (8. 5 ⁇ 8.2%) and cells positive only for CD8 (15.5 ⁇ 15.9%) were also detected (see FIGS. 18 and 19).
  • TCR-expressing T lineage cells can also respond to TCR stimulation and produce cytokines at the thymocyte stage (Fischer, M. et al., J Immunol, 1991, 146, (See pages 3452-3456). Therefore, the floating cells were stimulated with OKT-3 and IL-2, and the activation and number of CD3-expressing cells were examined. That is, as a result of stimulating floating cells with 30 ng / ml OKT-3 and 600 IU / ml hIL-2 for 5 days, the number of CD3 + cells increased, and CD3 expressing cells were activated by morphological criteria. It was observed (see FIG. 20). However, it was confirmed that the actual CD3 + cells were not changed.
  • the cytokine production ability was evaluated as follows. That is, as a result of stimulation with PMA and calcium ionophore (ionomycin), 12.5% of T lineage cells produce IFN- ⁇ , 1.0% of T lineage cells produce IL-2, 6.2% It was revealed that the T-lineage cells produced both of them (see FIG. 21). Therefore, it was revealed that CD3 + TCR ⁇ + cells derived from T-iPS cells contributed to induction into T lineage cells both morphologically and functionally.
  • TCR expression of the induced CD3 cells was analyzed, only one type of TCR ⁇ chain appeared in TkT3V1-3 and TkT3V1-7, and the sequence centered on the CDR3 region was the same as that of iPS cells before induction. (See FIG. 22). Most of the TCR ⁇ chains found diversity were derived from reconstituted ⁇ chains (see FIG. 23). It was revealed that reprogrammed T cells express clonal TCR when induced again into T cells.
  • CD3 high TCR ⁇ high T lineage cells redifferentiated from 4 T-iPS cells derived from two donors were analyzed. That is, the cDNA library of these cells was constructed by SMART-mediated reverse transcription reaction (see Du, G., et al., J Immunol Methods, 2006, 308, 19-35), and the TCR gene was amplified. The amplified TCR gene was inserted into a cloning vector, cloned and analyzed.
  • transcripts were derived from a functional chain, and there were also transcripts derived from a non-functional chain (see Table 8). However, transcripts different from sequences derived from functional or non-functional rearrangements were not confirmed (see Table 9).
  • iPS Clone indicates an established T cell-derived iPS cell line
  • Productivity indicates whether the reconstituted T cell receptor has a function, ie, a complex with ⁇ receptor.
  • ES cells human ES cells, Human ESC
  • skin-derived iPS cells human skin fibroblast-derived iPS cells, HDF-iPS
  • CD34-positive cell-derived iPS cells umbilical cord blood CD34-positive cell-derived iPS cells, CB
  • CD3-positive cells were induced in both iPSC) and T-iPS cells (T-iPSC), but T-iPS cells were compared to iPS and ES cells derived from skin cells and CD34-positive cells. It was clearly found that they were easily induced into T cells (see FIGS. 16, 17, 26, and 27).
  • Example 6 ⁇ Induction of iPS cells established from human T cells into functional T cells 2> Using T-iPSC clones (6 clones) derived from CD4 T cells or CD8 T cells of multiple donors, an attempt was made to induce a T cell population having a monoclonal TCR. Specifically, 3 ⁇ 10 5 T-iPS cells were seeded on irradiated OP9 cells or 10T1 / 2 cells spread in a 10 cm dish on the day of induction, and co-cultured for about 14 days using a differentiation medium. From 12 to 14 days, blood cells that entered the bag-like structure appeared during the co-culture.
  • CD34 cells CD34 positive hematopoietic stem cells
  • the seeds were co-cultured in ⁇ -MEM medium containing 20% FBS in the presence of IL-7 and Flt3L. SCF was not used because it strongly promotes differentiation into NK cells.
  • IL-7 5-10 ng / ml a CD3-positive CD56-positive NKT-like cell population appeared, and again most were DN.
  • CD3-positive CD56-negative T lineage cells accounted for the majority, and differentiation from DN to DP, CD4SP, and CD8SP was confirmed.
  • peripheral blood T cell differentiation markers about 80% of CD8SP was CD45RA + CD62L + naive T cells, and most of CD4SP was CD45RA ⁇ CD62L + central memory T cells. That is, it was suggested that T cells that have advanced to the effector memory stage can rejuvenate to naive T cells (in the case of CD8SP) and central memory T cells (in the case of CD4) via T-iPS cells.
  • the method for producing human T lymphocytes of the present invention is particularly suitable for producing human T lymphocytes that are specific to the target antigen, and thus specific to the target antigen, and desired human tissue compatibility. It is excellent in the production of sex antigen (HLA) -restricted CD4 single positive cells or CD8 single positive cells. Therefore, the present invention can greatly contribute to the treatment or prevention of various intractable diseases such as chronic intractable infections, malignant tumors, and autoimmune diseases.
  • HLA sex antigen

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Abstract

　ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程とを含む、ヒトＴ細胞を製造する方法、該方法によって製造されたＴ細胞を含有する医薬組成物、並びに該方法を利用する免疫細胞治療の方法。

Description

多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法
　本発明は、多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法に関し、より詳しくは、ヒトＴ細胞を製造する方法、該方法によって製造されたＴ細胞を含有する医薬組成物、該方法を利用する免疫細胞治療の方法に関する。
　様々な原因により生じる免疫機能低下において、免疫細胞等の補充や再生をすることができれば、疾患の病態改善や治療効果の向上などに極めて有効な手段となる。特に細胞性免疫を担うＴリンパ球の機能補充や再生が強く求められているが、現在有効な治療方法は確立されていない。免疫作用は特異性を特徴とするが、この特異性をうまく利用することが困難なところに大きな原因がある。
　近年の遺伝子操作技術の飛躍的な進歩により、抗原特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を各種リンパ球系細胞に遺伝子導入し、特異的免疫反応を補充や再生する試みがなされている（非特許文献１～２）。これらの試みでは遺伝子導入細胞として骨髄前駆細胞であるＣＤ３４陽性細胞や、ナイーブＴリンパ球などが用いられているが、これらは、Ｅｘ－ｖｉｖｏでの自己再生能が低い、遺伝子導入の効率が低い、遺伝子導入による分化の調節が困難である、など多くの課題を有している。
　また、近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（誘導性多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）が、ヒトを含む多くの動物種より樹立されている。これらの多能性幹細胞は、多能性を維持したまま旺盛な分裂能力を保持するとともに、適切に分化誘導することにより、ほぼ全ての臓器に分化し得ることから、再生医療に最も有用な細胞供給源であると考えられている。特にｉＰＳ細胞は自己由来の体細胞から樹立することが可能であることから、胚を破壊して作るＥＳ細胞に比べ、倫理的や社会的な問題が生じにくく、さらに自己由来であることから、再生医療や移植医療にとって最も大きな壁となる拒絶反応の回避も可能となる。
　ｉＰＳ細胞は体細胞を様々な方法で初期化することにより樹立できる。初期化されたｉＰＳ細胞は初期化に用いた遺伝子情報をそのまま引き継ぐことから、免疫系の細胞、特にＢリンパ球やＴリンパ球のように遺伝子を再構成し、終末分化したものにおいても初期化が可能であるかどうかは大きな興味の対象であった。そのような中、マウスＢリンパ球からのｉＰＳ細胞の樹立は、Ｊａｅｎｉｓｃｈ等により２００８年に報告され（非特許文献３）、マウスＴリンパ球からのｉＰＳ細胞の樹立はＹａｍａｎａｋａ等により２００９年に報告された（非特許文献４）。しかしながら、ヒトのＴリンパ球からｉＰＳ細胞を樹立したという報告はない。
　Ｔリンパ球を利用した免疫療法を実現するためには、ヒトのＴリンパ球からｉＰＳ細胞を樹立することに加え、さらに、樹立したｉＰＳ細胞を、元のヒトＴリンパ球が有していたＴＣＲ遺伝子の組み換え構造を保ったまま、機能的なＴリンパ球への分化を誘導することが必要であるが、このような技術は、いまだ確立されていない。
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ　Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００６年、６巻、３８３～３９３ページ Ｍｏｒｇａｎ　Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、３１４巻、１２６～１２９ページ Ｈａｎｎａ　Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ、２００８年、１３３巻、２号、２５０～２６４ページ Ｈｏｎｇ　Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年、４６０巻、１１３２～１１３５ページ
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒトＴリンパ球からｉＰＳ細胞を樹立し、さらに、樹立したｉＰＳ細胞を、元のヒトＴリンパ球が有していたＴＣＲ遺伝子の組み換え構造を保ったまま、機能的なＴリンパ球へ分化誘導しうる方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、こうして製造されたＴ細胞を含有する医薬組成物、並びにこうして製造されたＴ細胞を利用した免疫細胞治療の方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、元となったヒトＴリンパ球と同じＴＣＲ再構成状態を維持したまま、ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を樹立することに成功した。さらに、本発明者らは、こうして樹立したヒトＴ細胞由来のｉＰＳ細胞（ＴｉＰＳ細胞）から、元となったヒトＴリンパ球と同じＴＣＲ再構成状態を維持したまま、サイトカイン産生能等を有する機能的なＴ細胞を分化誘導することに成功した。そして、このようにして得られたヒトＴ細胞を患者体内に移植することにより、理想的な免疫細胞治療を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）ヒトＴ細胞を製造する方法であって、ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程とを含む、方法。
（２）前記ヒトＴ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である、（１）に記載の方法。
（３）ｉＰＳ細胞へ誘導されるＴ細胞が抗原特異性を有する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ｉＰＳ細胞へ誘導されるＴ細胞とｉＰＳ細胞から分化させるＴ細胞の抗原特異性が同一である、（３）に記載の方法。
（５）（１）から（４）のいずれかに記載の方法により製造されたヒトＴ細胞。
（６）（５）に記載のヒトＴ細胞を含有する、医薬組成物。
（７）ヒトより所望の抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程と、
該所望の抗原特異性を有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、
該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程と、
得られたｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞をヒトの体内に投与する工程と
を含む、免疫細胞治療の方法。
　発生過程でＴＣＲやＢＣＲ遺伝子塩基配列の構造的な変化を獲得するリンパ球は、ｉＰＳ細胞樹立のソースとしては極めて特異な細胞である。マウスＴ細胞やＢ細胞から再構成されたＴＣＲを持ったｉＰＳ細胞が樹立可能であることが近年相次いで報告され、ＴＣＲ再構成様式が核移植やリプログラミングによっても失われることが無いことが示唆されていた。しかしながら、これらは全てマウスでの事例である。本発明によって、ヒト末梢血Ｔリンパ球からｉＰＳ細胞が得られることが初めて示され、さらに、少なくとも一つのインフレーム（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）ＴＣＲ再構成を持つｉＰＳ細胞からＴ系譜細胞を誘導すると、そのＴＣＲを持つヒトＴ系譜細胞がモノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）に出現することが初めて明らかになった。特にＴＣＲα鎖β鎖とも一つのインフレーム（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）再構成しか持たないｉＰＳＣ（ｉＰＳ細胞）からのＴ系譜細胞への誘導においては、出現したＴＣＲはｉＰＳ細胞に保存された塩基配列と同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）であり、完全にモノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）であった。このことは、常に内在性ＴＣＲα鎖β鎖（特に対立形質排除（ａｌｌｅｌｉｃ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）による制御が不完全なα鎖）の発現による阻害効果（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ）を考慮しなければならないＥＳ細胞、ＣＤ３４陽性造血幹細胞、あるいはナイーブＴ細胞へのＴＣＲ遺伝子導入法とは比較にならないほど効率よく、目的の抗原に対するモノクローナルＴＣＲαβを持つＴ細胞を誘導できる事が示された。
　従って、本発明によれば、目的とする抗原に特異的なヒトＴリンパ球を効率的に製造することが可能となる。そして、こうして製造されたヒトＴリンパ球を利用することにより、再生医療や移植医療にとって最も大きな壁となる拒絶反応の問題の少ない、免疫細胞治療の方法を提供することが可能となる。
末梢血Ｔリンパ球からのヒトｉＰＳ細胞の作製の概略を示す図である。なお、図中「Ｔａｐｅｒｉｎｇ」はヒトｉＰＳ細胞培地（ｈｉＰＳ　ｍｅｄｉｕｍ　等）に徐々に置き換えていった期間を示す。 図１に示した方法によって形成されたＴ細胞由来のＥＳ細胞様コロニーを示す顕微鏡写真である。なお図中、上部はＣＤ３　Ｔ細胞に山中３／４因子を導入することによって得られたコロニーを示し、下部は、左側から、Ｄａｙ６：ＭＥＦ細胞に播き直した細胞、Ｄａｙ１５：ＥＳ細胞様コロニーを形成している細胞、Ｄａｙ２４：コロニー形成を完了した細胞を各々示す（Ｄａｙについては図１　参照）。また、スケールバーは２００μｍを示す。 ｉＰＳ細胞コロニーを免疫染色にて観察した結果を示す顕微鏡写真である。 Ｔ－ｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）、末梢血由来ＣＤ３＋細胞（ＰＢ　ＣＤ３＋）における多能性マーカーの発現をＲＴ－ＰＣＲによって分析した結果を示す電気泳動写真である。なお、ＡＣＴＢ（β－アクチン）及びＧＡＰＤＨはローディングコントロールとして用いた。 末梢血ＣＤ３＋Ｔ細胞における、３因子（３Ｆａｃｔｏｒｓ、ｃ－Ｍｙｃを除く）又は４因子（４Ｆａｃｔｏｒｓ、ｃ－Ｍｙｃを含む）による多能性状態への再プログラミング効率を示すグラフである。なお図中、縦軸は２２日目（ｄａｙ２２）の３×１０５個のＴリンパ球に由来するＡＬＰ陽性コロニー数を示す（３因子による結果は、ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ＝５．１±２．４［ｎ＝７］であり、４因子による結果は、ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ＝７７．０±２５．０［ｎ＝１２］であった）。 オリゴヌクレオチドＤＮＡマイクロアレイを用いた、網羅的遺伝子発現パターンにおけるヒトＴ－ｉＰＳ細胞（ＴｋＴ３Ｖ１－７）と活性ＣＤ４Ｔリンパ球（ＰＢ　ＣＤ４　Ｔ－ｃｅｌｌ）との比較結果（左側）、及び網羅的遺伝子発現パターンにおけるＴｋＴ３Ｖ１－７とヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）との比較結果（右側）を示す散布図である。なお、図中の平行な２本の線は対応のあるサンプル間で５倍の差があったことを示す。 Ｔ－ｉＰＳ細胞の代表的な２例（ＴｋＴ３Ｖ１－７及びＴｋＴ４Ｖ１－３）の核型（Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ）を示す顕微鏡写真である。なお、調べたＴ－ｉＰＳ細胞の継代数は１０であり、いずれにおいても染色体異常は認められなかった。 Ｔ－ｉＰＳ細胞を注入してから８週間後のＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウスにおいて形成されたテラトーマの代表的なＨＥ染色切片を示す顕微鏡写真である。三胚葉由来の組織（外胚葉としては神経組織（ｎｅｕｒａｌ　ｔｉｓｓｕｅ、神経板（ｎｅｕｒａｌ　ｐｌａｔｅ））及び網膜細胞（ｒｅｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）、中胚葉としては軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）及び筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅｓ）、内胚葉としては胃様粘膜（ｇｕｔ－ｌｉｋｅ　ｍｕｃｏｓａ）、及び分泌腺／管（ｇｌａｎｄｓ／ｄｕｃｔｓ））が存在していることを示す。 ＴＣＲγ鎖の遺伝子再構成を検出するためのＰＣＲ分析の結果を示す電気泳動写真である。 ＴＣＲＧ再構成を検出するためのＰＣＲ分析の代表的な結果を示す電気泳動写真である。なお、再構成したＴＣＲＧは有効なサイズ範囲（約２００ｂｐ）にあるＰＣＲバンドによって同定した。 ＴＣＲＢ再構成を検出するためのＰＣＲ分析の代表的な結果を示す電気泳動写真である。なお図中「Ｔｕｂｅ　Ａ」及び「Ｔｕｂｅ　Ｂ」のカラムにおけるＰＣＲ産物はＶ（Ｄ）Ｊ再構成していることを示す（有効なサイズ範囲：２４０～２８５ｂｐ）。一方、「Ｔｕｂｅ　Ｃ」のカラムにおけるＰＣＲ産物はＤＪ再構成していることを示す（有効なサイズ範囲：１７０～２１０ｂｐ、及び２８５～３２５ｂｐ）。 ＴｋＴ３Ｖ１－７における、ＴＣＲＡ再構成を検出するためのＰＣＲ分析の代表的な結果を示す電気泳動写真である。 図１１及び１２に示したＴｋＴ３Ｖ１－７由来のＰＣＲ産物のシークエンス結果を示す図である。なお図中、ＴＣＲＡ遺伝子の片方のアレルにおける機能的な（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）再構成を上部に示す。またＴＣＲＢ遺伝子の片方のアレルにおける機能的な再構成（Ｖ（Ｄ）Ｊβ再構成）を中部に示す。ＴＣＲＢ遺伝子のもう片方のアレルにおける非機能的な（Ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）再構成（ＤＪβ再構成）を下部に示す。 ＣＤ３＋ＣＤ５６－末梢血Ｔ細胞を先ずＣＤ４発現サブセット及びＣＤ８発現サブセットに分け、更にナイーブＴ細胞（Ｎａｉｖｅ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｃｅｍｔｒａｌ　Ｍｅｍｏｒｙ、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｍｅｍｏｒｙ、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－）、またはターミナルエフェクターＴ細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ－）に分類した結果を示す、散布図である。 ＭＥＦ上に播き直した１×１０５個のＴ細胞サブセットから得られたＡＬＰ＋コロニー数に基づき、各々のＴ細胞サブセットにおける再プログラミング効率を評価した結果を示す、グラフである。なお図中、縦軸は独立した３回の実験におけるＡＬＰ＋コロニーのＡｖｅｒａｇｅ　ｎｕｍｂｅｒ±Ｓ．Ｄ．を示す。 （ａ）は、ＯＰ９及びＯＰ９－ＤＬ１ストローマ細胞層上での培養による、多能性細胞からＴ系譜細胞作製の概略を示す図、並びに各時点における細胞の様子を示す顕微鏡写真である。なお図中「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（サイトカイン　カクテル）」は、ｈＩＬ－７、ｈＦｌｔ－３Ｌ、及びｈＳＣＦを添加したことを示す。（ｂ）は、各多能性細胞から作製されたＴ系譜細胞について、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβの発現を調べた結果を示す散布図である。なお図中「ＥＳ」はＥＳ細胞由来のＴ系譜細胞を示し、「ｓｋｉｎ　ｉＰＳ」は皮膚ｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞を示し、「Ｔ－ｉＰＳ」はＴ－ｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞を示し、「ＰＢ」は末梢血（対照データ）を示す。 （ａ）は、ＯＰ９及びＯＰ９－ＤＬ１ストローマ細胞層上での培養による、Ｔ－ｉＰＳ細胞等の多能性細胞からＴ系譜細胞作製の概略を示す図である。すなわち、サイトカインを含有せずα－ＭＥＭをベースとする必須培地にて、１０～１４日間、照射ＯＰ９細胞層上にて多能性細胞を培養し、次いで、誘導した造血細胞をＯＰ９－ＤＬ１細胞と共に３又は４週間、ｈＩＬ－７、ｈＦｌｔ－３Ｌ、及びｈＳＣＦ等を添加したαＭＥＭをベースとする必須培地にて培養したことを示す図である。（ｂ）は、各培養時点にて、培地中の浮遊細胞を回収し、フローサイトメトリーを用いて、Ｔ系譜マーカー　ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβの発現を調べ、独立した少なくとも３回の実験における代表的な結果を示す散布図である。なお、各散布図に示した数値は、各区分における細胞の割合（％）を示す。また、Ｂの最下部は、新鮮なＰＢＭＣを分析した結果（対照データ）を示す。 Ｔ系譜細胞マーカーの発現をフローサイトメトリーによって分析し、独立した少なくとも３回の実験における代表的な結果を示す散布図である。なお図中、各散布図に示した数値は各区分における細胞の割合（％）を示し、「Ｈｕｍａｎ　ＥＳＣ」はヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）における結果を示し、「ＣＢ－ｉＰＳ」は臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－４）における結果を示し、「ＨＤＦ－ｉＰＳ」はヒト皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞（ＴｋＤＡ４Ｍ）における結果を示し、「Ｔ－ｉＰＳＣ」はＴ－ｉＰＳ細胞（ＴｋＴ３Ｖ１‐７）における結果を示し、「ＰＢＭＮＣ」は末梢血単核球細胞における結果を示す。 フローサイトメトリーによって評価した、ＣＤ３＋Ｔ系譜細胞におけるＣＤ４及びＣＤ８の発現を示すグラフである。なお図中、縦軸は各多能性細胞由来のＴ系譜細胞におけるＲｅｌａｔｉｖｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ±Ｓ．Ｄ．を示す。また「Ｈｕｍａｎ　ＥＳＣ」はヒトＥＳ細胞における結果を示し、「ＣＢ－ｉＰＳＣ」は臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「ＨＤＦ－ｉＰＳＣ」はヒト皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「Ｔ－ｉＰＳＣ」はＴ－ｉＰＳ細胞における結果を示す。また、各細胞のカラムは左から順に「ＤＮ」、「ＣＤ８」、「ＣＤ４」、「ＤＰ」を示す。さらに「ＤＮ」はＣＤ４－ＣＤ８－であることを示し、「ＣＤ４」はＣＤ４＋ＣＤ８－であることを示し、「ＣＤ８」はＣＤ４－ＣＤ８＋であることを示し、「ＤＰ」はＣＤ４＋ＣＤ８＋であることを示す。 ＯＫＴ－３及びｈＩＬ－２によるＴＣＲ刺激後の再分化Ｔ系譜細胞、及び無刺激の再分化Ｔ系譜細胞における、比例変化（Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｎｇｅ）及び形態変化（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅ）を示す、グラフ及び顕微鏡写真である。 再分化Ｔ系譜細胞のサイトカイン産生プロファイルをフローサイトメトリーによって分析した結果を示す、散布図である。なお、分析した、再分化Ｔ系譜細胞（ＣＤ３＋ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ＴｋＴ３Ｖ１－７）又はＰＢＭＮＣ（ＰＢ　ＣＤ３、対照）は、ｈＩＬ－１αとともにＰＭＡ／イオノマイシンによって一晩刺激し、抗体を用いて染色した。プロット図に示した数値は、サイトカイン産生細胞の割合（％）を示す。 再分化Ｔ系譜細胞（ＴｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞）における、ＴＣＲβｍＲＮＡの配列とアミノ酸配列とを示す図である。 再分化Ｔ系譜細胞（ＴｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞）における、ＴＣＲαｍＲＮＡの配列とアミノ酸配列とを示す図である。 ＳＭＡＲＴによるｃＤＮＡライブラリー構築を介し、ＰＣＲによってＴｋＴ３Ｖ１－７のＴＣＲを増幅し、得られたＰＣＲ産物を分析した結果を示す電気泳動の写真である。 図２４に示した有効なサイズ範囲（約７５０ｂｐ）にあるＰＣＲ産物についてのシークエンシング解析の結果を示す図であり、全ての転写ｍＲＮＡの配列はＴ－ｉＰＳ細胞のゲノムの配列（図１３　参照）と完全に一致し、ＤＪβ再構成アレルからの子孫は確認されなかったことを示す図である。なお、他のサンプルの詳細及び結果は表８及び９に示す。 フローサイトメトリーによってＣＤ３の発現を評価した結果を示すグラフである。なお図中、縦軸はＣＤ４５＋血球中のＣＤ３＋Ｔ系譜細胞の割合（各群３以上の独立した実験のＡｖｅｒａｇｅｓ±Ｓ．Ｄ）を示す。また、「Ｈｕｍａｎ　ＥＳＣ」はヒトＥＳ細胞における結果を示し、「ＣＢ－ｉＰＳＣ」は臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「ＨＤＦ－ｉＰＳＣ」はヒト皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「Ｔ－ｉＰＳＣ」はＴ－ｉＰＳ細胞における結果を示す。さらに、＊＊は他の全てのサンプルに対して、ｐ＜０．０１であることを示す。 フローサイトメトリーによって評価したＣＤ３の平均蛍光強度（ＭＦＩ、Ｍｅａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示すグラフである。なお、縦軸は、ＣＤ－ｉＰＳ及びＨＤＦ－ｉＰＳは各群２の、その他は各群３以上の独立した実験のＡｖｅｒａｇｅｓ±Ｓ．Ｄを示し、「Ｈｕｍａｎ　ＥＳＣ」はヒトＥＳ細胞における結果を示し、「ＣＢ－ｉＰＳＣ」は臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「ＨＤＦ－ｉＰＳＣ」はヒト皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「Ｔ－ｉＰＳＣ」はＴ－ｉＰＳ細胞における結果を示し、「ＰＢ」は末梢血単核球細胞における結果を示す。 ＴＣＲＧ遺伝子の再構成、並びに該再構成状態を検出するためのプライマーの配列及び位置を示す概略図である。なお、ヒトＴＣＲＧ遺伝子座は染色体７ｑ１４上の１３５ｋｂにわたっている。また、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、Ｖγセグメント又はＪγセグメントにおいて高い相同性を有する領域に各々を設計され、約２００ｂｐのＰＣＲバンドを検出することによって、ＴＣＲＧ遺伝子の再構成を検出することができる。 ＴＣＲＢ遺伝子の再構成、並びに該再構成状態を検出するためのプライマーの配列及び位置を示す概略図である。なお、ヒトＴＣＲＢ遺伝子座は染色体７ｑ３４上の６８５ｋｂにわたっている。また、Ｖβ遺伝子セグメント及びＪβ遺伝子セグメントにおいて、同じ保存領域にアニールすることができる、全てのＶβプライマー及びＪβプライマーとして、２３個のＶβプライマー、２個のＤβプライマー、及び１３個のＪβプライマーが各々設計された。さらに、プライマーは３つのチューブ（ｔｕｂｅ）に分けられ、各々混合して分析に用いられた。すなわち、図中の「Ｔｕｂｅ　Ａ」、「Ｔｕｂｅ　Ｂ」、及び「Ｔｕｂｅ　Ｃ」はそのことを示している。また、Ｔｕｂｅ　Ａ及びＴｕｂｅ　Ｂに示したプライマーセットを用いて約２７０ｂｐのＰＣＲバンドを検出することによって、Ｖ（Ｄ）Ｊβ再構成を検出することができ、Ｔｕｂｅ　Ｃに示したプライマーセットを用いて１７０～２１０ｂｐ又は２８５～３２５ｂｐのＰＣＲバンドを検出することによって、ＤＪβ再構成を検出することができる。
＜ヒトＴ細胞を製造する方法＞
　本発明は、ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程とを含む、ヒトＴ細胞を製造する方法を提供する。
　－ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程－
　本発明においてＴ細胞を単離される「ヒト」としては、特に制限はない。健常人であっても、免疫機能が低下している人や、悪性腫瘍、感染症、自己免疫疾患などを患っている人であってもよい。本発明によって得られたＴ細胞を免疫細胞治療に用いる場合は、拒絶反応が起こらないという観点から、Ｔ細胞を単離されるヒトは、本発明によって得られたＴ細胞が投与されるヒトとＨＬＡの型が一致していることが好ましく、本発明によって得られたＴ細胞が投与されるヒトと同一人であることがより好ましい。
　本発明において「Ｔ細胞」とは、表面にＴ細胞受容体（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）と称される抗原受容体を発現している細胞を意味する。
　本発明において「ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞」及び「ｉＰＳ細胞から分化させるヒトＴ細胞」としては特に制限はないが、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である。このようなヒトＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパー／制御性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－細胞）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ－細胞）が挙げられる。後述する免疫療法を実施する場合、ｉＰＳ細胞から分化させるヒトＴ細胞は、ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞と抗原特異性が同一であることが好ましい。なお、Ｔ細胞における抗原特異性は、抗原特異的な、再構成されたＴＣＲ遺伝子によりもたらされる。
　本発明において「ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞」は、ヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織であれば特に制限はないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、後述の実施例に示すようなＣＤ４等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。かかる場合、例えば、Ｔ細胞は、Ｔｈ１タイプかＴｈ２タイプかで分泌されるサイトカインが異なるので、そのようなサイトカインを指標に選別して、所望のＴｈタイプを有するＴ細胞を単離することができる。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞を単離することが出来る。
　ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞として「抗原特異性を有するヒトＴ細胞」を用いる場合、その単離においては、「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を含むヒトの組織より、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を４量体化させたもの（いわゆる「ＭＨＣテトラマー」）を用いて、ヒトの組織より「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を精製する方法も採用することができる。
　本発明における「ｉＰＳ細胞」とは、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）又は誘導性多能性幹細胞とも称される細胞であり、前記Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入することにより誘導することができる。「細胞初期化因子」は、前記Ｔ細胞に導入されることにより、単独で、又は他の分化多能性因子と協働して該体細胞に分化多能性を付与できる因子であれば特に制限されることはないが、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｔａｔ３及びＧｒｂ２からなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質であるであることが好ましい。さらにこれらのタンパク質の中では、少ない因子で効率良くｉＰＳ細胞を樹立できるという観点から、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（４因子）を前記体細胞に導入することがより好ましい。また、得られる多能性幹細胞の癌化のリスクを低くするという観点から、ｃ－Ｍｙｃを除く、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（３因子）を前記体細胞に導入することがより好ましい。
　ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞をｉＰＳ細胞に誘導する場合においては、ｉＰＳ細胞への誘導効率をより高めるという観点から、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－ＭＹＣ、及びＮＡＮＯＧをヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入することが好ましく、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８をヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入することがより好ましい。
　また、本発明において「Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入する」方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。例えば、前記細胞初期化因子をタンパク質の形態にて前記Ｔ細胞に導入する場合においては、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法が挙げられる。また、前記細胞初期化因子をコードする核酸の形態にて前記Ｔ細胞に導入する場合においては、前記細胞初期化因子をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を、Ｔ細胞で機能するプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法にて細胞に導入することができる。
　本発明にかかる「発現ベクター」としては、例えば、レンチウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルスなどのウィルスベクター、動物細胞発現プラスミドが挙げられる。
　かかる発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターなどが挙げられる。また、かかるプロモータ－は薬剤（例えば、テトラサイクリン）の有無等によって、該プロモータ－の下流に挿入された遺伝子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、さらに、プロモーターの他に、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含有していてもよい。
　また、「ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程」においては、後述の実施例において示す通り、前記Ｔ細胞は、前記細胞初期化因子の導入前に、インターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下にて抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって刺激して活性化することが好ましい。かかる刺激は、例えば、後述の実施例において示すように、培地中に、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を添加して前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらにまた、ヒトＴ細胞が認識する抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。
　かかる刺激を行うために、培地中に添加するＩＬ－２の濃度としては特に制限はないが、１～２００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。さらに、かかる刺激において培地中に添加する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、前記Ｔ細胞の培養量の１～１０倍量であることがであることが好ましい。また、かかる刺激において培養ディッシュの表面上に結合させた抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、コーティングの際の濃度は抗ＣＤ３抗体では１～１００μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８抗体では０．１～１０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
　また、かかる刺激を行うための培養期間は、前記Ｔ細胞に対してかかる刺激を与えるのに十分な期間であって、前記細胞初期化因子の導入に必要な細胞数までＴ細胞を増殖しうる期間であれば特に制限はないが、通常２～１４日間であり、遺伝子導入効率の観点から、好ましくは２～７日間である。さらに、遺伝子導入効率を上げるという観点から、レトロネクチンがコートしてある培養ディッシュ上にて培養することが好ましい。
　前記Ｔ細胞を培養し、ＩＬ－２や抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体等を添加する培地としては、例えば、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地（より具体的には、ＩＬ－２等のサイトカイン類、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、最小必須培地（α－ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２培地等）を用いることができる。培地には、ＩＬ－２、及び抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞をｉＰＳ細胞に誘導する場合においては、アポトーシスを抑制するという　観点から、培地にＩＬ－７、ＩＬ－１５を添加することが好ましい。ＩＬ－７、ＩＬ－１５の添加濃度としては特に制限はないが、１～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
　また、本発明における「Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入する」際、又はその後の条件としては特に制限はないが、前記細胞初期化因子を導入した前記Ｔ細胞は、フィーダー細胞層上で培養するのが好ましい。かかるフィーダー細胞としては特に制限はないが、例えば、放射線の照射や抗生物質処理により細胞分裂を停止させたマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞が挙げられる。
　さらに、前記Ｔ細胞からｉＰＳ細胞に誘導する過程において、細胞の分化を抑制するという観点から、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を前記Ｔ細胞に前記細胞初期化因子を導入する際、又はその後において、培地に添加しておくことが好ましい。
　また、ｉＰＳ細胞の樹立効率をより高めるために、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ　１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡ等）、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＢＩＸ－０１２９４等の低分子阻害剤、Ｇ９ａに対するｓｉＲＮＡ等）、ｐ５３阻害剤（Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ－α（ＰＦＴ－α）等の低分子阻害剤、ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ等）を、前記Ｔ細胞に前記細胞初期化因子を導入する際、又はその後において、培地に添加しておくことが好ましい。
　さらに、「Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入する」際に、ウィルスベクターを用いる場合には、該ベクターが前記Ｔ細胞に結合し易くなるという観点から、硫酸プロタミンを培地に添加しておくことが好ましい。
　また、後述の実施例に示す通り、前記Ｔ細胞からｉＰＳ細胞への移行に合わせて、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地から、ｉＰＳ細胞の培養に適した培地に徐々に置換していきながら培養することが好ましい。かかるｉＰＳ細胞の培養に適した培地としては、公知の培地を適宜選択して用いることができ、例えば、ノックアウト血清代替物、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、ｂ－ＦＧＦ等を含有する、ダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２培地（ヒトｉＰＳ細胞培地）が挙げられる。
　ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞をｉＰＳ細胞に誘導する場合においては、後述の実施例に示すように、ｉＰＳ細胞への誘導効率をより高めるという観点から、前記フィーダー細胞上に移し換えた後に、１～１０００μＭ　ＲＯＣＫ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを更に添加した培地中、低酸素濃度条件（酸素濃度：例えば、５％）下にて培養することが好ましく、また１～１０００μＭ　ＭＥＫ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（例えば、ＰＤ０３２５９０１）及び１～１０００μＭ　ＧＳＫ３　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）を後述のコロニー形成まで培地に添加しておくことが好ましい。
　このようにして前記Ｔ細胞から誘導したｉＰＳ細胞（以下、「ＴｉＰＳ細胞」とも称する）の選択は、公知の手法を適宜選択することによって行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、後述の実施例において示すようなＥＳ細胞／ｉＰＳ細胞様コロニーの形態を顕微鏡下にて観察して選択する方法や、ｉＰＳ細胞において特異的に発現することの知られている遺伝子（例えば、前記細胞初期化因子）の遺伝子座に薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子（ＧＦＰ遺伝子等）をターゲッティングした組換え型のＴ細胞を用い、薬剤耐性やレポーター活性を指標として選択する方法が挙げられる。
　このようにして選択された細胞がｉＰＳ細胞であるということの確認は、例えば、後述の実施例において示すような、選択された細胞における未分化細胞特異的マーカー（ＡＬＰ、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、Ｔｒａ－１－８１等）の発現を免疫染色やＲＴ－ＰＣＲ等によって検出する方法や、選択された細胞をマウスに移植して、そのテラトーマ形成を観察する方法により行うことができる。
　また、このようにして選択された細胞が前記Ｔ細胞由来であることの確認は、例えば、後述の実施例に示すように、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。
　これらの細胞を選択して回収する時期は、コロニーの生育状態を観察しながら適宜決定することができ、概ね、前記細胞初期化因子を前記Ｔ細胞に導入してから１４日～２８日である。
　－ＴｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程－
　前記のようにして得られたＴｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させるためには、中胚葉系への分化を誘導し易くするという観点から、先ずはＴｉＰＳ細胞をストローマ細胞上にて、サイトカインを含有せず、ＦＣＳ等を含有するα－ＭＥＭ培地中にて培養することが好ましい。用いるストローマ細胞としては、造血系への分化を誘導し易くするという観点から、放射線照射等の処理を施したＯＰ９細胞、１０Ｔ１／２細胞であることが好ましい。但し、ＴｉＰＳ細胞を効率良くＣＤ３４陽性造血幹細胞に誘導させる場合には、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びＦＬＴ３Ｌ群から選択される少なくとも１のサイトカインを含有する培地中にて培養することが好ましく、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、及びＴＰＯを含有する培地中、又はＶＥＧＦ、ＳＣＦ、及びＦＬＴ３Ｌをを含有する培地中にて培養することがより好ましい。培養期間としては、血球細胞等を含有する袋状の構造物（ＥＳ－ｓａｃ（サック）とも称する）を形成するまでの期間であることが好ましく、ＴｉＰＳ細胞の培養を開始してから１０～１４日間であることが好ましい。
　前記のようにして得られたサックに含有されている細胞（造血前駆細胞、ＣＤ３４陽性細胞、血球細胞等）は、サイトカインやＦＣＳ等を含有するα－ＭＥＭ培地中におけるストローマ細胞上で培養することが好ましい。なお、かかるサック状構造物の内部に存在する細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。この培養に用いるストローマ細胞としては、ｎｏｔｃｈシグナルを介して、Ｔリンパ球への分化誘導を行うという観点から、放射線照射等の処理を施したＯＰ９－ＤＬ１細胞、ＯＰ９－ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ４細胞であることが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ－７、ＦＬＴ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－２、ＩＬ－１５，が挙げられる。これらの中では、初期Ｔ細胞の分化を助けるという観点から、ＩＬ－７及びＦＬＴ３Ｌが好ましい。ＴｉＰＳ細胞のＮＫＴ細胞への分化を抑制するという観点から、ＳＣＦは培地に含まれていないことが好ましい。ＩＬ－７の培地への添加濃度としては、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性のＴ系譜細胞が得られやすく、またＣＤ４シングルポジティブ（ＳＰ）Ｔ細胞、又はＣＤ８ＳＰＴ細胞への分化が誘導され易いという観点から、０．１～４ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
　このように分化誘導された細胞が、ＴｉＰＳ細胞由来であり、また該ＴｉＰＳ細胞の元となったＴ細胞由来であることの確認は、例えば、後述の実施例に示すように、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。
　このようにして得られたＴ細胞は、公知の手法を適宜選択して単離することができる。かかる公知の手法としては、例えば、後述の実施例に示すようなＣＤ４等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」をヒトより単離する場合においては、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣテトラマーを用いて、「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を精製する方法を採用することもできる。
　＜ヒトＴ細胞、医薬組成物、免疫細胞治療の方法＞
　本発明の方法によって製造したヒトＴ細胞は、抗原特異的な免疫機能を有するため、例えば、腫瘍、感染症、自己免疫不全等の疾患の治療または予防のために用いることができる。
　従って、本発明は、本発明の方法によって製造したヒトＴ細胞、該ヒトＴ細胞を含む医薬組成物、並びに該ヒトＴ細胞を用いた免疫細胞治療の方法を提供する。
　本発明の医薬組成物は、本発明の方法によって製造したヒトＴ細胞を、公知の製剤学的方法により製剤化することにより調製することができる。例えば、カプセル剤、液剤、フィルムコーティング剤、懸濁剤、乳剤、注射剤（静脈注射剤、点滴注射剤等）、などとして、主に非経口的に使用することができる。
　これら製剤化においては、薬理学上許容される担体または媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。また、前記疾患の治療または予防に用いられる公知の医薬組成物や免疫賦活剤等と併用してもよい。
　本発明の医薬組成物を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。
　本発明の組成物の製品（医薬品）またはその説明書は、免疫機能の低下を治療または予防するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。
　本発明の免疫細胞治療の方法は、ヒトより所望の抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程と、該所望の抗原特異性を有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程と、得られたｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞をヒトの体内に投与する工程とを含む方法である。本発明の免疫細胞治療の方法を実施する場合、拒絶反応が起こらないという観点から、Ｔ細胞を単離されるヒトは、本発明によって得られたＴ細胞が投与されるヒトとＨＬＡの型が一致していることが好ましく、本発明によって得られたＴ細胞が投与されるヒトと同一人であることがより好ましい。投与されるヒトＴ細胞は、本発明の方法により製造されたヒトＴ細胞をそのまま投与してもよく、また、上記の通り、製剤化された医薬組成物の形態で投与してもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本実施例においては、下記材料を用いて、下記方法等に沿って行った。
　＜フローサイトメトリー＞
　フローサイトリー分析は、ＭｏＦｌｏ（Ｄａｋｏ　Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）、ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、又はＦＡＣＳＣａｎｔｏII（登録商標、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製)を用いて行った。得られたデータの分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社製）を用いて行った。また、フローサイトリー分析に用いた抗体は下記の通りである。
抗ヒトＣＤ３－ＡＰＣ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ４－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ８－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ４５ＲＡ－Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ抗体（Ｃａｌｔａｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、抗ヒトＣＤ６２Ｌ－ＰＥ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＣＤ４５－Ａｌｅｘａ　４０５抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｃａｒｌｓｂａｄ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）、抗ヒトＣＤ３４－ＰＥ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ３８－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＣＤ１ａ－ＡＰＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＣＤ５－ＰＥ／Ｃｙ７，－ＣＤ７－ＦＩＴＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＣＤ５－ＰＥ／Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＣＤ７－ＦＩＴＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＴＣＲαβ－ＦＩＴＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）。さらに、フローサイトリー分析において、細胞は適切な濃度に調整した抗体カクテルと共に４℃にて３０分間インキュベーションした後、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した。また、死細胞を排除するため、ヨウ化プロピジウムを添加した。
　＜レトロウィルスの調製＞
　ヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、及びＮＡＮＯＧ（山中因子、ＹＦｓ）をコードするｐＭＸｓレトロウィルスベクターは、山中伸弥教授（京都大学ｉＰＳ細胞研究所　所属）より供与された。Ｇａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、及びＴｅｔ－ＯＦＦ制御のＶＳＶ－Ｇ偽型エンベロープ遺伝子を有する２９３ＧＰＧパッケージング細胞に、これらＹＦｓを導入した。テトラサイクリンを除いた培地にてウィルスを誘導してから３日後に、これら細胞の培養上清を毎日、全４回回収した。回収した培養上清は、０．４５μｍ酢酸セルロースフィルターに通し、６０００ｇにて１６時間かけ遠心分離を行った。そして、得られた上清の濃度が０．５％になるようにα－ＭＥＭ（α－最小必須培地）に懸濁し、使用するまで－８０℃にて保存した。
　＜Ｔ細胞の調製、レトロウィルス感染、及びｉＰＳ細胞の作製＞
　実験プロトコールは、東京大学医科学研究所　ヒト倫理審査委員会の承認を受けたものである（承認番号：２０－６－０８２６）。また、全ての研究はヘルシンキ宣言に従って行った。
　末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、健康な被験者由来の血液から、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ（登録商標）、１７－１４４０－０２、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて単離し、ＭｏＦｌｏ（ＤＡＫＯ　Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）にて精製した。Ｔ細胞はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞のコンタミを避けるため、ＣＤ３＋ＣＤ５６－細胞集団をゲートとし、単離した。Ｔ細胞のサブセットは、更なるゲートを設定し、ＣＤ４（ＣＤ４＋ＣＤ８－）、及びＣＤ８（ＣＤ４－ＣＤ８＋）コホートに分離した。ＣＤ４及び／又はＣＤ８細胞は更に、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－）、またはターミナルエフェクター（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ－）に分類した。
　このようにしてソートした細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、１００ｎｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、及び２０ｎｇ／ｍｌ　ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ－２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を添加した、ロズウェルパーク記念研究所培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＲＰＭＩ）１６４０培地（ＧＩＢＣＯ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて最初培養した。そして、かかるＴ細胞の３倍量の抗ＣＤ３／ＣＤ２８結合磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加することによって、これら細胞を活性化させた。なお、Ｔ細胞から誘導したｉＰＳ細胞（Ｔ－ｉＰＳ細胞）の作製において、この活性化した日をｄａｙ０と規定する（以下、図１　参照）。いくつかの実験において、抗ＣＤ３／ＣＤ２８結合磁性ビーズによって、ＰＢＭＣｓから磁気的に捕捉したＣＤ３＋細胞を単離すると同時に刺激した。ｄａｙ２及びｄａｙ３において、１０μｇ／ｍｌ硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加した、レトロネクチン（登録商標）コ―ティングプレート（Ｔａｋａｒａ社製）上にて、スピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）によってレトロウィルスを細胞に感染させた（Ｋａｎｅｋｏ，Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年、１１３巻、１００６～１０１５ページ　参照）。Ｔ細胞培養用の完全合成培地は毎日交換した。ｄａｙ６において、感染細胞を回収し、６ｃｍディッシュ上の３×１０５個の照射ＭＥＦ細胞層上に移した。その後４日間（ｄａｙ６～ｄａｙ１０）、培地の半分量を毎日ヒトｉＰＳ細胞培地に交換した。なお、ヒトｉＰＳ細胞培地の組成は下記の通りである（Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年、１１１巻、５２９８～５３０６ページ　参照）。
２０％　ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（登録商標）、ＧＩＢＣＯ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２００μＭ　Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１％　非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０μＭ　２－メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、及び５ｎｇ／ｍｌ　ｂ－ＦＧＦ（Ｗａｋｏ社製）を添加したダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）。
　またｉＰＳ細胞コロニーをピックアップする前に、前記ヒトｉＰＳ細胞培地に０．５ｍＭ　ＶＰＡ（ＨＤＡＣ阻害剤　バルプロ酸）を添加した。ｄａｙ１０において、ＶＰＡ含有ヒトｉＰＳ細胞培地に全培地を交換した。ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞様コロニーと同一視できるようになった際、およそｄａｙ２４において、それらコロニーを機械的に単離し、ピペッティングによって小塊に解離し、新鮮なＭＥＦ細胞層上に播いた。ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞様コロニーは、トリプシン溶液（０．２５％トリプシン、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、及び２０％　ノックアウト血清代替物添加リン酸緩衝生理食塩水）を用いて、新鮮なＭＥＦ細胞層上に３～４日毎に移した。
　＜染色体分析＞
　染色体Ｇバンド分析は、日本遺伝子研究所に外注し、所定の方法に従って行った。
　＜アルカリフォスファタ―ゼ（ＡＬＰ）染色、及び免疫細胞化学的染色＞
　ＡＬＰ染色のため、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞様コロニーを氷冷固定液（９０％メタノール、１０％ホルムアルデヒド）にて固定し、ＡＬＰ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用い、その製造会社の説明書に従って染色した。また、免疫細胞化学的染色のため、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞様コロニーを５％パラホルムアルデヒドにて固定し、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００にて透過処理を行った。
　そして、このように前処理したコロニーを一次抗体とともにインキュベートした。なお、用いた一次抗体、並びに希釈率は下記の通りである。
ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ＳＳＥＡ－４（ＦＡＢ１４３５Ｐ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、希釈率：１／５０）、ａｎｔｉ－Ｔｒａ－１－６０（ＭＡＢ４３６０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、希釈率：１／１００）、ａｎｔｉ－Ｔｒａ－１－８１（ＭＡＢ４３８１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、希釈率：１／１００）。また、Ｔｒａ－１－６０及びＴｒａ－１－８１の検出には、二次抗体としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　（希釈率：１／５００、Ａ１１０２９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。さらに、核の対比染色は４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ（希釈率：１／１０００、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて行った。また、顕微鏡写真は、蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ　Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ　Ｊａｐａｎ社製）を用いて撮影した。
　＜テラトーマ形成＞
　ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞様コロニーを凝集させ、ＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウスの左側の精巣の髄質にＭａｓａｋｉ，Ｈ．ら、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ、２００７年、１巻、１０５～１１５ページの記載に従って注入した。なお、注入細胞数はマウス１匹あたり、１．０×１０６個である。注入してから８週間後、精巣内に形成された腫瘍を切除し、５％パラホルムアルデヒドにて固定し、パラフィンに包埋した後、切片にした。そして、得られた切片をヘマトキシリン／エオシン法にて染色し、光学顕微鏡にて、前記ｉＰＳ細胞が三胚葉への分化能を有しているかどうかを調べた。
　＜多能性遺伝子、及びＴ細胞関連遺伝子についての発現分析＞
　ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞（クローニングしてから約５０日目の細胞）、これらの子孫細胞、及び新鮮分離した末梢血ＣＤ３＋Ｔ細胞から、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｃｒｏ　キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。そして、得られたトータルＲＮＡを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔII　１ｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　キット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、逆転写反応を行った。
　また、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ又はＡＣＴＢ）については３０サイクル、全ての多能性遺伝子又はＴ細胞関連遺伝子については３５サイクルにて、ＥｘＴａｑ　ＨＳ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。なお、標的遺伝子、及び分析に用いたＰＣＲプライマーの配列は表１及び表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜マイクロアレイ分析＞
　ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）、Ｔ細胞由来ｉＰＳ細胞（ＴｋＴ３Ｖ１－７）、及びＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－細胞について、全ゲノム遺伝子の発現解析を行った。先ず、各細胞からトータルＲＮＡ（２μｇ）を抽出し、プローブ調製に供した。そして、蛍光標識した相補的ＲＮＡとＷｈｏｌｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　４×４４Ｋ（Ｇ４１１２Ｆ、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）とを、一色法にてハイブリダイズした（委託先：Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ　Ｉｎｃ）。次いで、アレイをスキャンし、スポットイメージをＡｇｉｌｅｎｔ　Ｆｅａｔｕｒｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　装置（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて検出した。そして、得られたシグナルデータは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて分析した。また得られたデータの正規化には、Ｔｗｏ　ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓを適用した。すなわち、シグナル強度　０．０１未満は０．０１とした。また、チップから得られた測定値の５０ｔｈ　ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅに各チップを正規化した。そして、全３サンプルにおいて、ｐｒｅｓｅｎｔのフラグが付いた遺伝子（３６２７５遺伝子）について分析を行った。
　＜Ｔ－ｉＰＳ細胞のゲノムＤＮＡにおけるＴＣＲ再構成の検出＞
　約５×１０６個のＴ－ｉＰＳ細胞から、ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ（４０ｎｇ）は、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＢ、及びＴＣＲＡ遺伝子再構成の各々ＰＣＲにて検出するために用いた。
　ＴＣＲＧの再構成を検出するためのＰＣＲ（Ｂｅｎｈａｔｔａｒ，Ｊ．ら、Ｄｉａｇｎ　Ｍｏｌ　Ｐａｔｈｏｌ、１９９５年、４巻、１０８～１１２ページ　参照）はＥｘＴａｑ　ＨＳ　（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて５分間、次いでアニーリング温度の比較的高い反応、すなわち９５℃にて４５秒間、６５℃にて４５秒間、７２℃にて４５秒間という反応を５サイクル、そしてアニーリング温度の比較的低い反応、すなわち９５℃にて４５秒間、５５℃にて４５秒間、７２℃にて３０秒間の反応を３０サイクルとした。
　ＴＣＲＢの再構成を検出するため、ＰＣＲ及びヘテロ二本鎖分析は、若干の改変を加えたＢＩＯＭＥＤ－２プロトコール（ｖａｎ　Ｄｏｎｇｅｎ，Ｊ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００３年、１７巻、２２５７～２３１７ページ　参照）に沿って行った。
　ＴＣＲＡの再構成を検出するためのプライマーのコンストラクトはＨａｎ　ｅｔ　ａｌ．（Ｈａｎ，Ｍ．ら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９年、１６３巻、３０１～３１１ページ　参照）に基づく。ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて３０秒間、６８℃にて４５秒間、７２℃にて６分間という増幅反応を３サイクル、９５℃にて３０秒間、６２℃にて４５秒間、７２℃にて６分間という増幅反応を１５サイクル、９５℃にて１５秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて６分間という増幅反応を１２サイクルとした。
　また、ＰＣＲはＬＡＴａｑ　ＨＳ（Ｔａｋａｒａ社製）により行った。そして、得られたＰＣＲ産物は、サイズに基づきゲルによって分画した。次いで、予想されたサイズ範囲内の主なバンドは切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製し、シークエンスを行った。シークエンス反応においては、ＢｉｇＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　キットｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）をＶα、Ｊα、Ｖβ、Ｄβ、又はＪβ　プライマー一式と共に用いて、多面的アプローチにて、ＰＣＲの増幅及び蛍光色素付加を行った。そして、得られた反応生成物はＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて分析した。
　なお、得られた結果は、ＴＣＲＡ又はＴＣＲＢの構築に関与する、Ｖ、Ｄ、及びＪセグメントは、公開されている配列及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）と比較し、ｖ－ｑｕｅｓｔといったウェブツールを用いることによって同定した（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．「ＩＭＧＴ　ｄａｔａｂａｓｅｓ，　ｗｅｂ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　ｔｏｏｌｓ　ｆｏｒ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ａｎｄ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ，　ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ．」、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００３年、１７巻、２６０～２６６ページ　参照）。また、遺伝子断片（セグメント）の命名はＩＭＧＴ命名法に従った。またＴＣＲ再構成の検出に用いたプライマー配列は表３～４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　＜Ｔ－ｉＰＳ細胞からＴ系譜細胞（Ｔ－ｌｉｎｅａｇｅ　Ｃｅｌｌｓ）への誘導＞
　Ｔ－ｉＰＳ細胞又はその他の多能性幹細胞を、胚性幹細胞由来サック（ＥＳ－ｓａｃ）様の構造をとるように、若干の変更を施したＴａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年、１１１巻、５２９８～５３０６ページの記載に沿って、誘導した。
　多能性細胞は照射ＯＰ９細胞層上で、サイトカインは含有せずα－ＭＥＭをベースとする培地（２０％　ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、１００ｎｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミンを添加したαＭＥＭ）にて１０～１４日間（約Ｄａｙ１２）共培養した。
　サックに詰まっている浮遊細胞はＯＰ９－ＤＬ１細胞層上に移し、αＭＥＭをベースとし、１０ｎｇ／ｍｌ　ｈＩＬ－７及びｈＦｌｔ－３Ｌが添加された培地にて、Ｄａｙ４０まで共培養した。なお多能性細胞をＯＰ９細胞層上に移した日をＤａｙ０とする。培養培地は３日毎に交換した。ＯＰ９－ＤＬ１細胞層上に浮遊しており、ＣＤ４５、ＣＤ３、及びＴＣＲαβを発現しているＴ系譜細胞は、毎週フローサイトメトリーにてソーティングし、遺伝子発現解析を行った。なお、ＯＰ９細胞及びＯＰ９－ＤＬ１細胞は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（日本）を通して、理研バイオリソースセンターから入手した。
　＜ＴＣＲ刺激に対する反応性、及びＴ－ｉＰＳ細胞から再分化したＴ系譜細胞のサイトカイン発現プロファイル＞
　Ｔ細胞への誘導の終わり（ＯＰ９－ＤＬ１細胞層上にて約４週間培養した後、Ｄａｙ４０）に、浮遊細胞を回収し、３０ｎｇ／ｍｌ　ＯＫＴ－３（Ｊａｎｓｓｅｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ社製）及び６００ＩＵ／ｍｌ　ｈＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　＆　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）にて刺激した。その５日後に細胞数を数え、ＣＤ３の発現を評価した。そして、顕微鏡写真を撮り、形態学的画像を得た。
　また、Ｔ系譜細胞のサイトカイン産生（発現）プロファイルは若干の変更を施したＵｃｋｅｒｔ，Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２００８年、５８巻、８０９～８２２ページに記載の方法に沿って調べた。すなわち、１×１０５個の浮遊細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ　ホルボール　１２－ミリスタート　１３－アセテ―ト（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、０．４μＭ　Ａ２３１８７　カルシウムイオノホア（イオノマイシン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、及び２０ＩＵ／ｍｌ　ｈＩＬ－１α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）によって、１２時間刺激した。さらに最後の３時間においては、タンパク質分泌阻害剤　ブレフェルジンＡ（１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加して培養した。
　かかる刺激後の細胞を、抗ＣＤ３結合磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）にて標識し、そして磁気カラム中に保持した。一方、細胞内染色キット（Ｉｎｓｉｄｅ　ｓｔａｉｎ　ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用い、製造会社の説明書に従って、固相細胞内染色（ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）をこれら細胞に施した。ｈＩＦＮ－γ及びｈＩＬ－２の細胞内レベルを測定した。
　＜Ｔ－ｉＰＳ細胞から誘導したＴ系譜細胞のｍＲＮＡにおけるＴＣＲ再構成の検出＞
　ＯＰ９－ＤＬ１細胞層上での培養を開始してから、１４日目（ｄａｙ２６）、２１日目（ｄａｙ３３）、及び２８日目（ｄａｙ４０）に、Ｔ－ｉＰＳ細胞から誘導したＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋Ｔ系譜細胞から、トータルＲＮＡを抽出した。
　そして、逆転写産物５’末端における乗り換え機構（ｓｗｉｔｃｈ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ａｔ　ｔｈｅ　５’－ｅｎｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）に基づく方法（ＳＭＡＲＴ法、Ｄｕ，Ｇ．ら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００６年、３０８巻、１９～３５ページ　参照）にて、Ｓｕｐｅｒ　ＳＭＡＲＴ（登録商標）ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、製造会社の説明書に従って、ｃＤＮＡを合成した。すなわち、３’ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＣＤＳ　ｐｒｉｍｅｒ及びＳＭＡＲＴ　II　Ａ　ｏｌｉｇｏ（Ｓｕｐｅｒ　ＳＭＡＲＴ（登録商標）　ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ）、並びにＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、４２℃にて９０分間、逆転写反応を行った。また、二本鎖ｃＤＮＡの合成及び増幅は、５’ＰＣＲ　Ｐｒｉｍｅｒ　ＩＩ　Ａ（Ｓｕｐｅｒ　ＳＭＡＲＴ（登録商標）　ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ）及びＡｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＢＤ　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に含まれている試薬類を用いて行った。なお、ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて５秒間、６５℃にて５秒間、６８℃にて３分間を２０サイクルとした。
　そして、増幅したｃＤＮＡは、ＴＣＲＡ特異的増幅反応又はＴＣＲＢ特異的増幅反応における鋳型として用いた。すなわち、フォワードプライマー（２ｎｄ　５’－ＳＭＡＲＴ）及びリバースプライマーを用いて、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７２℃にて３分間という反応を２５サイクル行い増幅した。なお、リバースプライマーとしては、ＴＣＲＡ増幅においては３’－ＴＲＡＣを、ＴＣＲＢ増幅においては３’－ＴＲＢＣを用いた。そして得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＭ－Ｔ－Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ社製）に挿入し、シークエンシングを行った。
　＜統計解析＞
　本実施例における全ての統計解析は、エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）、及びＳｔａｔｃｅｌ２（ＯＭＳ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社製）を用い、ＡＮＯＶＡ又はスチューデントｔ検定にて行った。そして、Ｐ＜０．０５を有意とした。
　（実施例１）
　＜ヒト末梢血Ｔ細胞からのｉＰＳ細胞の樹立＞
　先ず、ヒト末梢血中のＴ細胞を用いて、図１に示すようにｉＰＳ細胞の樹立を行った。すなわち、健常人（年齢（２４～５６歳）及び性別の異なる複数の健常人）の末梢血より、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又はＣＤ３陽性細胞を単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８　ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ　ビーズにて刺激した。そして、ｈＩＬ－２　２０ｎｇ／ｍｌを含有するＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋ＰＳＧ（ペニシリン、ストレプトマイシン、及びＬ－グルタミン）で２日間培養し、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプのレトロウイルスウイルスベクター　ｐＭＸ　ＯＣＴ４、ｐＭＸ　ＳＯＸ２、ｐＭＸ　ＫＬＦ４、及びｐＭＸ　ｃ－ＭＹＣｍ、又はｐＭＸ　ＯＣＴ４、ｐＭＸ　ＳＯＸ２、ｐＭＸ　ＫＬＦ４を用いて遺伝子導入した。連続２日間の遺伝子導入操作後、分離日から６日目に６ｃｍ　ｄｉｓｈの照射ＭＥＦ（マウス胎児繊維芽細胞）上に１×１０５個を撒き、連日半量ずつｉＰＳメディウム（ヒトｉＰＳ細胞培地）に置換していき、播種後４日間にＴ細胞メディウムから完全にｉＰＳメディウムに置換した。分離１１日後（播種５日後）ころより敷石様の細胞集ゾクを認め、数日の後（培養開始してから１８～２４日後）にヒトＥＳ細胞様の外観を呈するようになった（図２：コロニー（ヒトＥＳ細胞様コロニー）の写真　参照、）。それらの細胞はＡＬＰ染色陽性、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１などの未分化マーカー陽性（図３：コロニーの染色写真　参照）であり、外来遺伝子のサイレンシングとＥＳ細胞様遺伝子発現パターンを認めた（図４：電気泳動の写真　参照）。なお、ｃ－ＭＹＣを導入した、及び導入しなかった３×１０５個の細胞から、各々アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）陽性ヒトＥＳ細胞様コロニーを、７７±２５（０．０３％）及び５．１±２．４（０．００１％）の割合にて得た(図５　参照)。
　また、マイクロアレイ解析によって、ＣＤ３由来多能性細胞と、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）及び末梢血Ｔ細胞との発現遺伝子プロファイルを比較した。ＣＤ３由来ｉＰＳ細胞における遺伝子発現の全体的なパターンは、ヒトＥＳ細胞におけるそれと類似しているが、Ｔ細胞におけるそれとは異なるものだった(図６　参照)。
　さらに、細胞のカリオタイプ（核型）は正常で（図７：カリオタイプ解析写真　参照）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス精巣への移植によって３胚葉への分化を示す奇形腫（テラトーマ）を形成した（図８：テラトーマ形成病理所見　参照）。
　従って、ヒト末梢血Ｔ細胞から樹立したｉＰＳ細胞は多能性を有していることが明らかになった。
　（実施例２）
　樹立されたｉＰＳ細胞がＴ細胞由来であることを確認するために、ＴＣＲ遺伝子の再構成を確認した。ＴＣＲ遺伝子はＴＣＲδ、ＴＣＲγ、ＴＣＲβの３群が（ほぼこの順番で）早期から再構成を始める。４因子由来の４クローン中２クローン、３因子由来の９クローン中６クローンでＴＣＲγ遺伝子の再構成を認めた（図９：電気泳動　参照）。それらのクローンのＴＣＲβ遺伝子とＴＣＲα遺伝子の再構成を解析したところ、全てのクローンでインフレーム（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）のＴＣＲβ遺伝子とＴＣＲα遺伝子の再構成を認めた（表５：ＴＣＲα鎖領域のインフレーム（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）遺伝子再構成、表６：ＴＣＲβ鎖領域のインフレーム（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）遺伝子再構成　参照）。それらの全ての再構成でＴＲＡＶ２４とＴＲＢＶ１１が特異的に用いられるＮＫＴ細胞タイプの組合わせは無く、末梢血Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞であることが確認された。なお、表５及び６において、「ｉＰＳ　Ｃｌｏｎｅ」は樹立したＴ細胞由来のｉＰＳ細胞株を示し、「Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ」は再構成に用いられるセグメントの組み合わせを示し、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｉｏｎ」は結合領域の塩基配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（実施例３）
　また、実施例２同様に、樹立されたｉＰＳ細胞がＴ細胞由来であることを確認するために、ＴＣＲ遺伝子の再構成を確認した。すなわち、ヒトは４つのＴＣＲ遺伝子（ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、及びＴＣＲＤ）を有しており、これらのＤＮＡ再構成は、胸腺における正常なＴリンパ球の発達に関与していることが知られている。また、ＴＣＲ遺伝子の再構成は、Ｔ系譜細胞に特異的な、不可逆的な遺伝的現象であり、この遺伝的現象によってＴ細胞は遺伝的な痕跡を与えられ、特徴付けられる。従って、これらの痕跡を調べることにより、実施例１において得られたｉＰＳ細胞は、健常人ドナーの成熟末梢Ｔリンパ球由来であるかどうか遡及的に確認することができる。
　先ず、Ｂｅｎｈａｔｔｅｒ達やＢＩＯＭＥＤ－２コンソーシアムによって設計されたＴＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ解析によって、ＴＣＲＧ又はＴＣＲＢ再構成を検出した（図２８及び２９　参照、Ｂｅｎｈａｔｔａｒ，Ｊ．ら、Ｄｉａｇｎ　Ｍｏｌ　Ｐａｔｈｏｌ、１９９５年、４巻、１０８～１１２ページ、ｖａｎ　Ｄｏｎｇｅｎ，　Ｊ．Ｊ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００３年、１７巻、２２５７～２３１７ページ　参照）。その結果、調べた全てのｉＰＳ細胞株において、ＴＣＲＧ又はＴＣＲＢ再構成は同定され、調べた全てのｉＰＳ細胞株は末梢血Ｔリンパ球由来のものであることが確認された（図１０及び１１）。
　また、ＴＣＲβ鎖はＴＣＲα鎖と共にヘテロ二量体を形成しており、殆どの末梢血Ｔ細胞はＴＣＲαβを発現している（Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、３３４巻、３９５～４０２ページ　参照）。ＴＣＲＧ及びＴＣＲＢに対して、ＴＣＲＡ遺伝子座は複雑である。ＴＣＲＡ遺伝子座はＴＣＲＤ遺伝子座を含んでいるだけでなく、１０３のＶαセグメント、６１のＪαセグメント、及びＣαセグメントを含む、１０００ｋｂ以上にわたる領域である。そこで、ゲノムＤＮＡにおけるＴＣＲＡ遺伝子再構成を検出するために、Ｖαセグメントに対する３４のフォワードプライマーと、Ｊαセグメントに対する１２のリバースプライマーとのセットを設計した。なお、多重構造の解析にこれらを用いる際に、膨大なプライマーの組み合わせを実用できる程度にその数を絞った。そして、全てのＪαプライマーは一つのチューブにて混合し、このＪαプライマーミックスと、各Ｖαプライマーとを用いて、１つのサンプルに対して３４のＰＣＲ反応を行った。その結果、この方法によって、ＴＣＲＢ再構成ｉＰＳ細胞において、ＴＣＲＡ再構成を同定することができた（図１２　参照）。
　さらに、ＨＬＡ－ペプチド複合体に対するＴＣＲの結合性は、３タイプの相補性決定領域（ＣＤＲ１、２、及び３）からなる抗原認識部位の三次元構造によって必然的に決定される。これら３領域においては、様々なランダムヌクレオチド（Ｎ－ヌクレオチド又はＰ－ヌクレオチド）が挿入されているＶ（Ｄ）Ｊ結合領域に渡っているため、ＣＤＲ３は最も分散可能（ｄｉｖｅｒｓｉｆｉａｂｌｅ）なものである。そこで、樹立したｉＰＳ細胞のゲノムのＣＤＲ３領域における、個々のＴＣＲ鎖をコードする配列を同定した。その結果、元のＴ細胞における機能的な再構成（Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）、インフレームで結合しておりストップコドンがない構成）が保存されていることが明らかになり、全てのＴ－ｉＰＳ細胞において、１アレル上に機能的なＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ再構成を一つのみ有していることが明らかになった。もう片方のアレルにおいては、ＤＪβ再構成を含む、完全な又は非機能的な再構成（ｉｎｔａｃｔ又はＲｅａｒｒａｎｇｅｄ（Ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ)）を有していることが明らかになった(表７、及び図１３参照）。なお、表７において、「ｉＰＳ　Ｃｌｏｎｅ」は樹立したＴ細胞由来のｉＰＳ細胞株を示し、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ」は、再構成したＴ細胞受容体が機能を有するか否か、すなわちβ受容体と複合体を作り抗原を認識するか（機能的：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）、否か（非機能的：Ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）を示し、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｉｏｎ」は結合領域の塩基配列を示す。また、ＴＲＡＶ２４及びＴＲＢＶ１１セグメントが特異的に確認されるヒトＮＫＴリンパ球はなかった（Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｄ．Ｉ．ら、Ｓｅｍｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２巻、６１～６７ページ　参照）。したがって、ＣＤＲ３配列に刻まれていたＴＣＲ産生能は変化することなく、一つの末梢血Ｔ細胞からｉＰＳ細胞が作製されたことが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（実施例４）
　＜ＣＤ４＋リンパ球又はＣＤ８＋リンパ球からｉＰＳ細胞への再プログラミング＞
　末梢Ｔリンパ球は主に２つの機能的なサブセット、すなわちＣＤ４＋ヘルパー／制御性細胞、及びＣＤ８＋細胞傷害性細胞に由来する。また、ウィルスによる遺伝子導入効率において、ＣＤ４＋リンパ球とＣＤ８＋リンパ球との間に有意な差はないことが知られている（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、１０１巻、４７６～４８４ページ、Ｋａｎｅｋｏ，Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年、１１３巻、１００６～１０１５ページ　参照）。そこで、末梢Ｔリンパ球をＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞とに分け、ｉＰＳ細胞への再プログラミングを行い、由来するＴ細胞の違いによって、ｉＰＳ細胞への再プログラミングの効率に差異があるのかどうかを調べた。なお、各細胞における誘導条件を下記に示す。
　＜ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する誘導条件＞
　採血により得た末梢血単核球のＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性ＣＤ４陽性Ｔ細胞分画（以下、ＣＤ４陽性Ｔ細胞）をフローサイトで分取し、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体（ビーズ結合、固層化、培地への添加の別を問わない）で活性化させた。培地にはヒトＩＬ－２を２０ｎｇ／ｍｌ程度添加し、刺激から４８～９６時間後にかけてレトロネクチンをコートした２４穴プレート上で複数回の山中因子遺伝子導入を行った。その際に用いた山中因子はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣ、又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４である。最後の遺伝子導入から２日後以降を目安に、６ｃｍディッシュ上の照射ＭＥＦ上に１～５ｘ１０５の遺伝子導入Ｔ細胞を乗せた。なお、初日にフローサイトでＣＤ４陽性Ｔ細胞を分取して用いなかった場合は、このタイミングでフローサイトによりＣＤ４陽性Ｔ細胞を分取してＭＥＦに乗せた。乗せ換え翌日より４日間、半量ずつの培地を０．５μＭバルプロ酸入りＥＳ細胞用培地に置換し、その後は連日又は一日おきに０．５μＭバルプロ酸入りＥＳ細胞用培地を交換して培養を続けた。乗せ換え後１０日前後より敷石様の細胞集簇を認め、数日のうちに完成したｉＰＳ細胞コロニーが観察された。
　＜ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する誘導条件＞
　採血により得た末梢血単核球のＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞分画（以下、ＣＤ８陽性Ｔ細胞）をフローサイトで分取し、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体（ビーズ結合、固層化、培地への添加の別を問わない）で活性化させた。培地にはヒトＩＬ－２を２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－７を１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５を１０ｎｇ／ｍｌ程度添加し、刺激から４８～９６時間後にかけてレトロネクチンをコートした２４穴プレート上で複数回の山中因子遺伝子導入を行う。その際に用いた山中因子はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８、又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－ＭＹＣ、及びＮＡＮＯＧである。最後の遺伝子導入から２日後以降を目安に、６ｃｍディッシュ上の照射ＭＥＦ上に１～５ｘ１０５の遺伝子導入Ｔ細胞を乗せた。なお、初日にフローサイトでＣＤ８陽性Ｔ細胞を分取して用いなかった場合は、このタイミングでフローサイトによりＣＤ８陽性Ｔ細胞を分取してＭＥＦに乗せた。乗せ換え翌日より４日間、半量ずつの培地を０．５μＭバルプロ酸入りＥＳ細胞用培地に置換し、その後は連日又は一日おきに０．５μＭバルプロ酸入りＥＳ細胞用培地を交換して培養を続けた。乗せ換え後２週前後より敷石様の細胞集簇を認め、１～２週のうちに完成したｉＰＳ細胞コロニーが観察された。
　上記誘導条件にて調べた結果、本実施例においては、ＮＡＮＯＧを導入しない条件下におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球からＴ－ｉＰＳ細胞への誘導の成功率は、リプログラミング因子　ＮＡＮＯＧを更に導入する条件下におけるＣＤ８＋Ｔリンパ球からＴ－ｉＰＳ細胞への誘導の成功率の２倍であった。なお、本実施例において、ＣＤ４＋Ｔリンパ球からはＮＡＮＯＧを導入せずに、７、８回の試行によってＴ－ｉＰＳ細胞が得られる。
　また、図には示さないが、ＣＤ８＋Ｔリンパ球からＴ－ｉＰＳ細胞への誘導の際に、ＭＥＦ上への乗せ換え後に１０μＭのＲＯＣＫ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ存在下に５％Ｏ２下の低酸素培養、又は１μＭ　ＭＥＫ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＰＤ０３２５９０１）及び３μＭ　ＧＳＫ３　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　（ＣＨＩＲ９９０２１）をコロニー形成まで培地に添加することによって、Ｔ－ｉＰＳ細胞への誘導効率が若干上昇する傾向にあることが確認された。
　前記結果を受け、さらに、ＣＤ４＋Ｔリンパ球を更に、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌ／ＣＣＲ７の発現に基づき、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ－）のサブセットに分け、ｉＰＳ細胞への誘導（再プログラミング）を行った（Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９９年、４０１巻、７０８～７１２ページ　参照、図１４　参照）。その結果、健常人ドナー３人における平均　再プログラミングの効率は、ナイーブＴ細胞においては０．００４１％、セントラルメモリーＴ細胞においては０．０１７％、エフェクターメモリーＴ細胞においては０．００３６％、ターミナルエフェクターＴ細胞においては０．０００８％であり、特にセントラルメモリーＴ細胞より比較的良好にＴ－ｉＰＳ細胞は樹立されることが明らかになった（図１５　参照）。なお、ＣＤ４＋セントラルメモリーＴ細胞の再プログラミング効率の高さは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に対する感受性を反映しているのかもしれない。
　（実施例５）
　＜ＴｉＰＳ細胞から分化したＴ系譜細胞の機能解析＞
　ヒトＥＳ細胞から得たＣＤ３４陽性細胞をＳＣＩＤ－ｈｕマウスに移植することで移植されたヒト胎児胸腺内にＴ細胞系譜が分化誘導される（Ｇａｌｉｃ，Ｚら、ＰＮＡＳ、２００６年、１０３巻、３１号、１１７４２～７ページ　参照）。またｉｎ　ｖｉｖｏではＥＳ細胞はＯＰ９－ＤＬ１細胞によって、ＣＤ４／ＣＤ８　ｄｏｕｂｌｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅを主としたＣＤ３陽性、ＴＣＲ陽性細胞へと誘導される（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓら、ＪＩ、２００９年、１８２巻、６８７９～６８８８ページ　参照）。
　そこで、得られたＴ細胞由来ｉＰＳ細胞（Ｔ－ｉＰＳ細胞）を用いて、Ｔ細胞への分化誘導を試みた。Ｔ細胞は発生過程でＴＣＲ遺伝子の組み換えを経た後には高頻度体細胞突然変異をおこさないので、Ｔ－ｉＰＳ細胞から誘導したＴ細胞系譜は元のＴ－ｉＰＳ細胞のＴＣＲ情報を保持し、対立アレル排除状態によってはモノクローナルなＴＣＲをもつと予想した。しかしながら、Ｔ－ｉＰＳ細胞からＴ細胞が誘導できるかどうか、また誘導したＴ細胞は機能的であるかどうか、ＴＣＲの再構成状態は、Ｔ－ｉＰＳ細胞の元になったＴ細胞と同一であるかどうかについては不明であるため、これらの点について以下の通り調べた。
　先ず、樹立したＴ－ｉＰＳ細胞よりＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖とも片方のアレルがインフレーム（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）再構成を起こし、対側のアレルがα鎖においてはアウトフレーム（ｏｕｔ　ｆｒａｍｅ）再構成、β鎖においてはＤＪ再構成で停止したクローンを選択し（ＴｋＴ３Ｖ１－７）、Ｔ細胞系譜をｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導した。ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ（ヒトＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド）またはＳＣＦ（ヒト幹細胞因子、ｈＳＣＦ）存在下にＯＰ９上で培養されたＴ－ｉＰＳ細胞はＥＳ－ｓａｃ（サック）（Ｔａｋａｙａｍａら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年、１１１巻、１１号、５２９８～５３０６ページ　参照）様の構造物を形成して１４日目までに内部にＣＤ４５陽性血液細胞を誘導した（図１６の（ａ）　参照）。１２～１４日目に血液細胞をＯＰ９－ＤＬ１に乗せ換えて培地交換を３日おきに繰り返して培養を継続し、２１日目および４０日目にＦＡＣＳでＣＤ３陽性細胞を採取しＴ細胞関連遺伝子の発現を評価した。４０日目のＣＤ３陽性細胞はＣＤ４／８陰性細胞が中心であるものの、一部にＣＤ８の単独陽性細胞を認めた（図１６の（ｂ）　参照）。
　また、サックをＯＰ９－ＤＬ１細胞層上に移した後、サックから出てきた浮遊細胞を回収し、フローサイトメトリーを用いて毎週分析した（図１７の（ａ）　参照）。その結果、第１週において、大抵の浮遊細胞はＣＤ４５を弱く発現しおり、いくらかの細胞において、ＣＤ３４、ＣＤ７、及びＣＤ１ａは発現しており、一方ＣＤ３－ＴＣＲαβ複合体及びＣＤ５を発現している細胞はなかった。第２週において、大抵の細胞においてＣＤ４５の発現は亢進しており、いくらかの細胞において、ＣＤ３－ＴＣＲαβ複合体も発現し始めていた。第３週までに、ＣＤ３４細胞は完全に消失しており、ＣＤ３－ＴＣＲαβ強陽性細胞は浮遊細胞の最も多い細胞群となっていた。なお、ＣＤ３＋細胞においてＴＣＲαβ－細胞はなかった（図１７の（ｂ）　参照）。また、第３週の後でさえ、大抵の再分化ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋細胞は、共陰性（ＤＮ）ステージのものであったが、いくつかの細胞群においては、ＣＤ４のみ陽性な細胞（８．５±８．２％）及びＣＤ８のみ陽性な細胞（１５．５±１５．９％）も検出された（図１８及び図１９　参照）。
　一般に、胸腺細胞ステージでも、ＴＣＲ発現Ｔ系譜細胞はＴＣＲ刺激に応答することができ、サイトカインを産生することもできることが知られている（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｍ．ら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１年、１４６巻、３４５２～３４５６ページ　参照）。そこで、ＯＫＴ－３及びＩＬ－２にて前記浮遊細胞を刺激して、ＣＤ３発現細胞の活性化並びに数を調べた。すなわち、３０ｎｇ／ｍｌ　ＯＫＴ－３及び６００ＩＵ／ｍｌ　ｈＩＬ－２にて５日間、浮遊細胞を刺激した結果、ＣＤ３＋細胞群は増加し、形態学的基準によってＣＤ３発現細胞は活性化しているように見受けられた（図２０　参照）。しかし、実際のＣＤ３＋細胞は変わっていないことが確認された。
　また、誘導ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋細胞はＴ系譜細胞への分化誘導に機能的に寄与していることを明らかにするため、サイトカイン産生能を下記の通り評価した。すなわち、ＰＭＡ及びカルシウムイオノフォア（イオノマイシン）によって刺激した結果、１２．５％のＴ系譜細胞はＩＦＮ－γを産生し、１．０％のＴ系譜細胞はＩＬ－２を産生し、６．２％のＴ系譜細胞はその両方を産生していることが明らかになった（図２１　参照）。従って、Ｔ－ｉＰＳ細胞から誘導したＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋細胞は、形態学的にも機能的にもＴ系譜細胞への誘導に寄与していることが明らかになった。
　また、前述の通り、一般にＴＣＲ遺伝子は高頻度体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｐｅｒ－ｖａｒｉａｂｌｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を受けないため、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来の再分化Ｔ系譜細胞は高頻度にＴ－ｉＰＳ細胞の元となった細胞のゲノムにコードされているＴＣＲαβが発現していることが予想される。しかしながら、ＴＣＲの再構成状態は、Ｔ－ｉＰＳ細胞の元になったＴ細胞と同一であるかどうかについては不明であるため、この点について以下の通り調べた。
　その結果、誘導されたＣＤ３細胞のＴＣＲ発現を解析するとＴｋＴ３Ｖ１－３、ＴｋＴ３Ｖ１－７においては１種類のＴＣＲβ鎖のみが出現しており、ＣＤＲ３領域を中心とした配列は誘導前のｉＰＳ細胞と同一であった（図２２　参照）。ＴＣＲα鎖は多様性を認めるものの大半は再構成済みのα鎖由来であった（図２３　参照）。リプログラミングを受けたＴ細胞は再度Ｔ細胞へと誘導される際に、クローナルにＴＣＲを発現することが明らかになった。
　また、ドナー２人由来の４　Ｔ－ｉＰＳ細胞から再分化したＣＤ３ｈｉｇｈＴＣＲαβｈｉｇｈＴ系譜細胞を分析した。すなわち、これらの細胞のｃＤＮＡライブラリーをＳＭＡＲＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎによって構築し（Ｄｕ，Ｇ．，ら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００６年、３０８巻、１９～３５ページ　参照）、ＴＣＲ遺伝子を増幅した。そして、増幅したＴＣＲ遺伝子をクローニングベクターに挿入し、クローニングして分析した。
　その結果、分析したクローンの配列は、Ｔ－ｉＰＳ細胞の分化前の細胞のゲノムにコードされていたＴＣＲ配列と一致した（図１３、２３、及び２５　参照）。一方、殆どの転写産物は機能的な鎖（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ｃｈａｉｎ）由来であり、非機能的な鎖（ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ｃｈａｉｎ）由来の転写産物も存在していた（表８　参照）。しかし、機能的又は非機能的再構成由来の配列とは異なる転写産物は確認されなかった（表９　参照）。なお、表８において、「ｉＰＳ　Ｃｌｏｎｅ」は樹立したＴ細胞由来のｉＰＳ細胞株を示し、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ」は、再構成したＴ細胞受容体が機能を有するか否か、すなわちβ受容体と複合体を作り抗原を認識するか（機能的：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）、否か（非機能的：Ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）を示し、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｉｏｎ」は結合領域の塩基配列を示す。また、表９において、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ」は、再構成したＴ細胞受容体が機能を有するか否か、すなわちβ受容体と複合体を作り抗原を認識するか（機能的：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）、否か（非機能的：Ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）を示し、「Ｎｏ．ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ　Ｓａｍｐｌｅｓ」は各ＴＣＲ遺伝子において解析したサンプル数を示し、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｔ－ｉＰＳＣ’ｓ　ｇｅｎｏｍｅ」は、解析したサンプルにおいて、再分化前のＴ－ｉＰＳ細胞のゲノムと一致した数及び割合（Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）、又は該ゲノムと異なった数及び割合（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
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　さらに、他の多能性細胞からＣＤ３４陽性細胞への誘導と、本発明の方法とを比較した。その結果、ＥＳ細胞（ヒトＥＳ細胞、Ｈｕｍａｎ　ＥＳＣ）、皮膚由来ｉＰＳ細胞（ヒト皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、ＨＤＦ－ｉＰＳ）、ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞（臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞、ＣＢ－ｉＰＳＣ）、Ｔ－ｉＰＳ細胞（Ｔ－ｉＰＳＣ）のいずれにおいてもＣＤ３陽性細胞が誘導されたが、Ｔ－ｉＰＳ細胞は、皮膚細胞やＣＤ３４陽性細胞に由来するｉＰＳ、およびＥＳ細胞に比して明らかにＴ細胞へと誘導されやすいことが判明した（図１６、１７、２６、及び２７　参照）。
　（実施例６）
　＜ヒトＴ細胞より樹立したｉＰＳ細胞から機能的Ｔ細胞への誘導２＞
　複数ドナーのＣＤ４Ｔ細胞又はＣＤ８Ｔ細胞に由来するＴ－ｉＰＳＣクローン（６クローン）を用いて、モノクローナルＴＣＲを持つＴ細胞集団の誘導を試みた。すなわち、誘導開始日に３×１０５個のＴ－ｉＰＳ細胞を１０ｃｍディッシュに敷き詰めた照射ＯＰ９細胞又は１０Ｔ１／２細胞に撒き、分化培地を用いて１４日間程度共培養した。１２～１４日目にかけて共培養中に袋状の構造物に入った血球細胞が出現した。なお、その際にサイトカインを併用しなくても血球細胞は出現したが、ＶＥＧＦを添加するとＣＤ３４陽性造血幹細胞（以下ＣＤ３４細胞）の回収が改善することが明らかになった。またＶＥＧＦ、ＳＣＦ、及びＴＰＯ、又はＶＥＧＦ、ＳＣＦ、及びＦＬＴ３Ｌを加えると、さらにＣＤ３４細胞の回収が改善するも明らかになった。なお、後述の通り、これらの傾向は最終産物であるＴ系譜細胞の回収にも反映された。
　また、１２日～１４日目のいずれかに、それらのＣＤ３４細胞を含む血球細胞を１０ｃｍディッシュに敷き詰めた照射ＯＰ９／ＤＬ１細胞、ＯＰ９／ＤＬ４細胞、又は１０Ｔ１／２／ＤＬ４細胞に３×１０５個まき、ＩＬ－７及びＦｌｔ３Ｌの存在下に２０％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培地にて共培養した。なお、ＳＣＦはＮＫ細胞への分化を強く促すため、使用しなかった。前述の通り、共培養２週目には一部、３週目には大部分の浮遊細胞がＣＤ３陽性ＴＣＲαβ陽性のＴ系譜細胞になるが、それらの細胞はＣＤ４とＣＤ８の発現においてダブルネガティブ（ＤＮ）、ダブルポジティブ（ＤＰ）、シングルポジティブ（ＳＰ）を含み、一様の集団ではなかった（図１７　参照）。そこで、さらに詳細に検討した結果、ＤＮ、ＤＰ、ＣＤ４ＳＰ、ＣＤ８ＳＰの構成はＩＬ－７の濃度に依存することを見出した。具体的には、図には示さないが、ＩＬ－７非添加ではＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性Ｔ細胞そのものが少なくて大部分はＤＮであった。ＩＬ－７　５～１０ｎｇ／ｍｌではＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性ＮＫＴ様の細胞集団が出現し、やはり大部分はＤＮであった。一方、ＩＬ－７　１ｎｇ／ｍｌではＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性のＴ系譜細胞が大部分を占め、ＤＮからＤＰ、そしてＣＤ４ＳＰ、ＣＤ８ＳＰへの分化が確認された。また、これらのＳＰ細胞を末梢血Ｔ細胞の分化マーカーで解析すると、ＣＤ８ＳＰの８０％程度はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞であり、ＣＤ４ＳＰの大部分はＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞であったすなわち、エフェクターメモリー段階に進んでいたＴ細胞が、Ｔ－ｉＰＳ細胞を介してナイーブＴ細胞（ＣＤ８ＳＰの場合）やセントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４の場合）に若返りし得ることが示唆された。
　上記の通り、本発明のヒトＴリンパ球の製造方法は、特に目的とする抗原に特異的であるヒトＴリンパ球の製造、ひいては目的とする抗原に特異的であり、且つ所望のヒト組織適合性抗原（ＨＬＡ）拘束性のＣＤ４単独陽性細胞、またはＣＤ８単独陽性細胞の製造に優れている。従って、本発明は、慢性難治性感染症や悪性腫瘍、又は自己免疫疾患等、種々の難病の治療又は予防等に大きく貢献しうるものである。
　配列番号１～１０９
＜２２３＞　人工的に合成されたプライマーの塩基配列

Claims (7)

  1. 　ヒトＴ細胞を製造する方法であって、
    ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、
    該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程と
    を含む、方法。
  2. 　前記ヒトＴ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　ｉＰＳ細胞へ誘導されるＴ細胞が抗原特異性を有する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　ｉＰＳ細胞へ誘導されるＴ細胞とｉＰＳ細胞から分化させるＴ細胞の抗原特異性が同一である、請求項３に記載の方法。
  5. 　請求項１から４のいずれかに記載の方法により製造されたヒトＴ細胞。
  6. 　請求項５に記載のヒトＴ細胞を含有する、医薬組成物。
  7. 　ヒトより所望の抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程と、
    該所望の抗原特異性を有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、
    該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程と、
    得られたｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞をヒトの体内に投与する工程と
    を含む、免疫細胞治療の方法。
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