WO2015034288A1 - 인간 유래 역분화 줄기세포 및 이를 이용한 인간의 면역계가 발현된 동물 제조 방법 - Google Patents

인간 유래 역분화 줄기세포 및 이를 이용한 인간의 면역계가 발현된 동물 제조 방법 Download PDF

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임예리
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an animal in which the human immune system is expressed using human-derived induced pluripotent stem cel l iPS cel l, and to an animal produced by the method.
  • Induced pluripotent stem cells refer to cells having pluripotent capacity obtained by dedifferentiation from differentiated cells such as somatic cells, and differentiate into various organ cells. Is possible. iPS cells can be obtained by re-differentiating cells differentiated by dedifferentiation inducers, thus enabling the generation of patient immunocompetent pluripotent cell lines without somat i cel l transfer.
  • All retrodifferentiated stem cells have a plur ipotency that is capable of producing all the cells of our body, and the cells that resemble themselves indefinitely. It has the ability to produce sel f-renewal. Human embryonic stem cells also exhibit pluripotent differentiation ability, but ethical issues limit the range of research and gestation, whereas dedifferentiated stem cells are free from ethical issues because human somatic cells are available.
  • pluripotent stem cells are expected to be able to fundamentally solve intractable diseases that are difficult to treat with drugs or surgery by replacing damaged cells, tissues, or organs, and to new drug development, disease mechanisms, and developmental studies. It is expected to be used in various fields of life sciences.
  • the dedifferentiated stem cell technology is still in its infancy and is focused on developing a technique for producing and establishing dedifferentiated stem cells mainly by inducing dedifferentiation.
  • no technology has been reported for preparing animal models in which the human immune system is implemented using human dedifferentiated stem cells or for selecting a treatment or drug suitable for an individual using such animals.
  • the present inventors have completed the technology of making humanized animals more easily and efficiently by making dedifferentiated stem cells and injecting them into embryos of animals to develop animals expressing an immune system that is almost the same as or the same as the human immune system.
  • the dedifferentiated stem cells were prepared, and an animal expressing the human immune system was prepared using the same, and the animals thus prepared can predict human reaction to disease-causing agents or therapeutic substances more accurately. There is a characteristic that can increase the therapeutic effect.
  • one object of the present invention is to introduce a 0ct4, Sox2, Kl f4 and c-myc genes into human-derived cells to prepare a retrodifferentiated cells; Injecting said dedifferentiated stem cells into an embryo of an immunodeficient animal; And implanting the embryo into the uterus, wherein the animal's immune system is expressed. It is to provide a manufacturing method.
  • Still another object of the present invention is to provide an animal produced by the above-described method, wherein the human immune system is expressed.
  • the present invention provides a method for producing an animal in which the human immune system is expressed using dedifferentiated stem cells derived from rheumatoid arthritis (RA) patients and osteoarthritis (OA) patients, and an animal prepared by the method.
  • RA rheumatoid arthritis
  • OA osteoarthritis
  • OA osteoarthritis
  • RA rheumatoid arthritis
  • Figure 2 shows the production of dedifferentiated stem cells from synovial cells of rheumatoid arthritis (RA) patients.
  • FIG. 3 shows the production of dedifferentiated stem cells from synovial cells of osteoarthritis (OA) patients.
  • Figure 4 shows the stem cell characteristics of dedifferentiated stem cells prepared from the synovial cells of rheumatoid arthritis (RA) patients and osteoarthritis (OA) patients via qRT-PCR (real-t ime PCR).
  • FIG. 5 shows the stem cell characteristics of dedifferentiated stem cells prepared from synovial cells of rheumatoid arthritis (RA) patients in comparison with H7, a positive control group through cell staining.
  • Figure 6 shows the stem cell characteristics of dedifferentiated stem cells prepared from synovial cells of osteoarthritis (OA) patients compared to H7, a positive control through cell staining.
  • Figure 7 shows the analysis of the chromosome state of dedifferentiated stem cells prepared from synovial cells of rheumatoid arthritis (RA) patients, showing that both shape and number are normal.
  • Figure 8 shows the formation of teratoma using dedifferentiated stem cells prepared from synovial cells of rheumatoid arthritis (RA) patients.
  • Figure 9 shows through cell staining that generated mice expressing human immune cells.
  • the present invention As one aspect for achieving the above object, the present invention
  • the human-derived cells can be used for all cells derived from humans, include somatic cells and germ cells, and include cells derived from various tissues or blood.
  • synovial cells examples include synovial cells, skin cells, peripheral blood mononucleated cells, fibroblasts, fibroblasts, nerve cells, epithelial cells, keratinocytes, hematopoietic cells, melanin cells, chondrocytes, Macrophage, Muscle Cell Blood Cell, Bone Marrow Cell, Lymphocyte Cell (B Lymphocyte, T Lymphocyte), Macrophage, Monocyte, Lung Cell, Pancreatic Cell, Liver Cell, Stomach Cell, Intestinal Cell, Heart Cell, Bladder Cell, Kidney Cell Cells, embryonic germ cells, cumulus cells and the like can be exemplified, but is not limited thereto.
  • synovial cells, skin cells, peripheral blood mononuclear cells or fibroblasts can be used.
  • synovial cells were used as the human-derived cells.
  • skeletal cell is a synovial cell covering the inner surface of the joint cavity, and is a connective tissue cell and is divided into two types, A type and B type.
  • Type A cells are macrophage-like and phagocytic, with large Golgi apparatus and many lysosomes in the cytoplasm, with few rough endoplasmic reticulum.
  • Type B cells are fibroblasts with relatively smooth cell surface and many rough endoplasmic reticulum in the cytoplasm.
  • the synovial membrane is a tissue surrounding the joint that produces joint fluid and is a symptom of arthritis. Cell infiltration, edema, proliferation of binding fibers, etc.
  • the dedifferentiated stem cells were prepared using a method of introducing 0ct4, Sox2, Kl f4 and c-myc genes into synovial cells.
  • the term "reprograzing” refers to restoring finally to a new type of differentiation potential from differentiated cells existing in different aspects, such as non-differentiating cells or cells with partial differentiation ability. Or a process that can be converted.
  • the differentiation mechanism may be included as long as the process of returning differentiated cells having differentiation capacity of 0% to less than 100% to an undifferentiated state, preferably differentiated cells having 0% differentiation capacity or more than 0% to 100%. By means of restoring or converting a partially differentiated cell having a differentiation capacity of less than% to a cell having 100% differentiation capacity.
  • the reverse differentiation was induced by introducing the 0ct4, Sox2, Kl f4, and c-myc genes as the reverse differentiation inducers.
  • the "de-differentiation induction factor '' is finally or partly differentiated cells sleep, which can be differentiated to a new type, a material inducing such that the de-differentiation the stem cells with green power, inducing the de-differentiation of a differentiated cell
  • Any material to be used may be included without limitation, and may be selected and used depending on the type of cells to be finally differentiated, and is not limited to the 0ct4, Sox2, KH4 and c-myc.
  • the term "de-differentiated stem cells or induced pluripotent stem cells (iPS cel l)” refers to cells induced by artificially dedifferentiating the already differentiated adult cells, pluripotency (p) lur ipotency).
  • iPS cel l induced pluripotent stem cells
  • a patient-derived dedifferentiated stem cell prepared by the above method is injected into an embryo of an immunodeficiency animal, the embryo is implanted in the uterus of the animal, and a baby is born, thereby producing an animal expressing a human immune system. How to to provide.
  • immunodeficiency animal is a decrease or deficiency in immune response due to various causes such as reduction of T cells, B cells, macrophages, antibodies, complement, etc. involved in immune response, deficiency or dysfunction. Means animal.
  • the immunodeficiency animal may be an animal deficient in at least one selected from the group consisting of T cells, B cells, and NK (natural killer) cells.
  • the immunodeficiency animals of the present invention include Severe Combined I ⁇ unodef icient syndrome (SCID) mice, SC ID-beige mice, NOG (N0D / Shi-scid / IL-2RYnull, NOG) mice, and NSG (N0D scid gaV a) mice.
  • SCID Severe Combined I ⁇ unodef icient syndrome
  • NOG N0D / Shi-scid / IL-2RYnull
  • NSG N0D scid gaV a mice.
  • Severe Combined Immunodef icient Syndrome Mice have a severe dysfunction of lymphoid stem cells, resulting in a lack of both cellular and humoral immunity due to birth defects in both T- and B-cells. Means a mutant mouse having the expression trait.
  • Recombinase assay which shows an autosomal recessive genotype and is involved in the reorganization of immunoglobulins or T cell receptor genes, is deficient in functional T cells and B cells.
  • SCID-beige mice showed autosomal recessive mutations in both SCID and Beige.
  • T cells and B cells are deficient as described above, and in Beige mutations, there is a deficiency of NK (natural killer) cells.
  • SCID-beige rats have the same characteristics as above.
  • B cells and NK (natural killer) cells are deficient.
  • NSG N0D scid gamma murine Severe Combined It is made by crossing Immunodef icient syndrome (SCID) and NOD (non-obese diabetic) rats. It has no mature T cells and B cells, shows very low natural killer (NK) cell activity. high.
  • SCID Immunodef icient syndrome
  • NOD non-obese diabetic
  • the present invention is to express the human immune system by injecting dedifferentiated stem cells into an immunodeficiency animal, Severe Combined Immunodef icient syndrome (SCID) rat, SC ID-beige rat, Nog (N0D / Shi)
  • SCID Severe Combined Immunodef icient syndrome
  • SC ID-beige rat Nog
  • N0D / Shi Nog
  • immunodeficient animals can be used without limitation.
  • embryo refers to the early stages of development from the time when fertilization takes place and the conjugate where the sperm and the ovum are combined starts to divide more than once and becomes a complete individual.
  • the embryo may be blastocyst stage.
  • Example 3 of the present invention the present invention is applied to SCID beige mice lacking immune cells.
  • Example 4 Injecting the patient-derived dedifferentiated stem cells prepared in step 1 into the embryo to prepare a mouse in which the human immune system is expressed, Example 4
  • ICC ICC unocytochemistry
  • the method may further comprise the step of treating the gonadotropin (Human Menopausal Gonadotropins (HMG) and gonadotropin (HCG) in the mouse.
  • Human Menopausal Gonadotroins (HMG) contain two active ingredients: follicle stimulating hormone (FSH) and leutinizing hormone (LH). These are glycoprotein hormones produced by the pituitary gland, which are used to promote follicle production and promote ovarian development.
  • the gonadotropin (HMG) may include a series of hormones such as the follicle stimulating hormone and luteinizing hormone or a variant thereof.
  • Gonadal gonadotropin includes chorionic gonadotropin and thyroid stimulating hormone and is synthesized and secreted by the pituitary gland. It is used to stimulate the growth of the ovary, which is secreted from the anterior pituitary gland in natural situations and can be obtained by extraction or by recombinant techniques.
  • the gonadotropin (HMG) and gonadotropin (HCG) are intended to more safely implant the embryo into the uterus, and promote the secretion of the hormone as well as the hormone. If the substance, a drug that exhibits the effect of the hormone, such as an agent that can induce an embryo to implant well in the uterus can be used without limitation.
  • the present invention relates to an animal, the expression of a human 'immune systems produced by the above production method. More preferably, the animal may be a mouse.
  • the present invention by injecting dedifferentiated stem cells into the immunodeficient mouse (mouse) to prepare a 'humani zed mouse' expressing the same or very similar to the human immune system (humani zed mouse) to respond to a specific substance or stimulation Mice were prepared that could be interpreted as representative of this human reaction. More specifically, the present invention is to obtain a rat that implements the immune system of arthritis patients by injecting dedifferentiated stem cells derived from rheumatoid arthritis patients and osteoarthritis patients to express a human immune system, the development of a customized therapeutic agent for patients It is possible.
  • RA rheumatoid arthritis
  • OA osteoarthritis
  • Synovial cells from rheumatoid arthritis (RA) patients and osteoarthritis (OA) patients were stored in the sample bank of the Rheumatoid Research Center. After homogenizing the synovial tissue, it was dissolved in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco by Invitrogen, Carlsbad, California, USA) containing 0.01% collagenase and mixed at 37 ° C for 4 hours. After washing the cells, 20% fetal bovine serum (FBS) (Gibco by Invitrogen, Carlsbad, California, USA) and 1% penicillin / streptomycin solution (Gibco by Invitrogen) , Carlsbad, California, USA) was released incubated in DMEM containing.
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin / streptomycin solution Gibsbad, California, USA
  • 1 shows synovial cells obtained from the synovial membrane derived from rheumatoid arthritis (RA) patients and from osteoarthritis (0A) patients.
  • RA rheumatoid arthritis
  • 1-3 Production of lenti virus and transduction into synovial cells
  • Lipofectamine 2000 (12 mg 4-in-l reprogramming plasmid (0ct4, Sox2, Klf4, and c-Myc) and 9 mg packaging pPAX2 plasmid and 3 mg pMD2G plasmid 2000) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) were transfected into 293T cells (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and 80% of 100-dish dish (dish) was repopulated.
  • the virus was obtained and mixed with Lentivirus Concentrator (Clontech Laboratories, Mountain View, California, USA). After overnight incubation at 4 ° C, the virus was collected by 1,500 ⁇ centrifugation and re-released in Phosphate buffer saline (PBS). Prior to infecting the cells with virus, RA and 0A synovial cells were first plated in a 6-well plate, and then the cells were incubated overnight in media with lentiviral. The resulting retrodifferentiated stem cell colonies were then isolated and harvested 18-20 days after infection (FIGS. 2 and 3).
  • RA and 0A synovial cells infected with the lentiviral in Example 3 were 37 ° C and 5% in DMEM containing 20% fetal bovine serum (FBS) (Gibco by Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Cultured in a C0 2 environment and all cells with passage 8 were used. The resulting patient-derived dedifferentiated stem cells were then cultured with a Matrigel-coated culture dish (BD Biosciences, San Jose, California, USA), E8 human embryonic stem cell (hESC). Incubation in media.
  • Example 2 Identification of dedifferentiated stem cells
  • the retrodifferentiated stem cell clones were fixed in 4% paraformaldehyde, followed by SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-80 (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA), 0ct3 as primary antibodies for immunostaining. / 4, Nanog (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA) and Sox2 (BioLegend, San Diego, California, USA). Then, the secondary antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) bound to Alexa Fluor 594 or 488 was attached to the samples to which the primary antibody was attached, and observed using indirect immunofluorescence.
  • de-differentiated stem cells derived from the rheumatoid arthritis patient and osteoarthritis patient prepared in Example 2 exhibited the characteristics of stem cells through cell staining and indirect immunofluorescence, in particular, the same or more stem cells as the positive control H7. It confirmed that the characteristic is shown (FIGS. 5 and 6).
  • SCID biege mice lacking immune cells were injected with patient-derived dedifferentiated stem cells to prepare mice expressing the human immune system, which were confirmed using ICC (Immunocytochemistry) method.
  • ICC Immunocytochemistry
  • blood was collected from the manufactured mouse, and the collected blood was smeared on a slide and dried at room temperature for 1 hour. After soaking in acetone for 10 minutes and dried at room temperature. After washing with PBST buffer (washing buffer), it was blocked for 1 hour at room temperature with 10% normal goat serum.
  • monoclonal rabbit anti-CD3E ant i body (abeam), a monoclonal antibody, was diluted 1: 100 as a primary antibody and added to the slide and reacted overnight at 4 ° C. After reaction, the slide was immersed in PBST buffer (washing buffer) and washed again. After diluting the biotinylated secondary goat ant i -rabbit IgG 1: 200 as a secondary antibody to the slide, the reaction mixture was reacted at room temperature for 1 hour.

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Abstract

본 발명은 인간 유래 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 이용하여 인간의 면역계가 발현된 동물을 제조하는 방법, 및 상기 방법으로 만들어진 동물에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
인간 유래 역분화 즐기세포 및 이를 이용한 인간의 면역계가 발현된 동물 제조 방법
【기술분야】
본 발명은 인간 유래 역분화 줄기세포 ( induced plur ipotent stem cel l iPS cel l )를 이용하여 인간의 면역계가 발현된 동물을 제조하는 방법， 및 상기 방법으로 제조된 동물에 관한 것이다.
【배경기술】
역분화 줄기세포 (유도만능 줄기세포， induced plur ipotent stem cel l , iPS 세포)는 체세포와 같이 분화된 세포로부터 역분화되어 얻어진 만능분화능 (plur ipotency)을 갖는 세포를 지칭하며， 각종 장기 세포로 분화가 가능하다. iPS세포는 역분화 유도인자들에 의해 분화된 세포를 역분화 (reprogra醒 ing)하여 얻어질 수 있으므로， 체세포 핵치환 (somat i c cel l transfer )없이 환자 면역 적합성 만능 세포주의 생성이 가능하다.
역분화 줄기세포는 모두 우리 몸의 모든 세포를 생성할 수 있는 능력이 있는 만능분화능 (plur ipotency)을 가지며， 자기와 닮은 세포들을 무한정. 만들어낼 수 있는 자기재생 (sel f-renewal ) 능력이 있다. 인간 배아줄기세포 역시 만능분화능을 나타내지만 윤리적 문제로 인해 연구 및 웅용의 범 가 제한적임에 반하여， 역분화 줄기세포는 인간의 체세포를 이용할 수 있기 때문에 윤리적 문제에서 자유롭다는 장점이 있다.
역분화 줄기세포는 그 만능분화능으로 인해 향후 손상된 세포, 조직 또는 장기를 대체함으로써 약물이나 수술로 치료가 어려운 난치병을 근원적으로 해결할 수 있을 것으로 기대되고， 나아가 신약 개발， 질병 메커니즘 및 발생학 연구에 이르기까지 생명과학의 다양한 분야에 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있다. 그러나 아직까지 역분화 줄기세포 기술은 초보적인 단계에 머물러 있으며， 주로 역분화를 유도함으로써 역분화 줄기세포를 제조 및 확립하는 기술 개발에 차중하고 있는 실정이다. 또한， 지금까지 인간 역분화 줄기세포를 이용하여 인간의 면역계가 구현된 동물 모델을 제조하거나， 이러한 동물을 활용하여 개인에게 맞는 치료법이나 약물을 선정하는 기술은 보고된 바가 없다.
종래 인간의 면역 체계와 유사한 면역 체계를 갖는 인간화된 동물 모델을 구축하기 위한 방법으로， 면역 기능이 결핍된 쥐에 조혈모세포를 이식하는 방법이 주로 이용되었다 (Greiner DL , Hessel ton RA and Shul tz LD, Stem Cel l s 1998； 16： 166-177) . 그러나， 이식한 쥐에 형성된 소량의 인간세포의 대부분은 B 세포이고， T 세포는 나타나지 않는 문제가 있었다. 특히 기존의 면역기능이 결핍된 쥐에 인간의 조혈모 세포를 이식하여 구축된 인간화 쥐의 경우， 정상적인 인체와 차이가 있고， 특히 면역계의 자극에 의한 발병이나 치료 효과를 연구하기에는 그 한계가 명확하였다.
【발명의 상세한 설명]
【기술적 과제】
이에， 본 발명자들은 역분화 줄기세포를 제작하여 이를 동물의 배아쎄 주입함으로써 인간의 면역계와 거의 동일하거나 동일한 면역계를 발현하는 동물을 개발해냄으로써 보다 용이하고 효율적으로 인간화 동물를 제작하는 기술을 완성하였다. 보다 상세하게， 본 발명에서는 역분화 줄기세포를 제조하고, 이를 이용하여 인간의 면역계를 발현하는 동물을 제조하였으며， 이와 같이 제조된 동물은 질병 유발 물질이나 치료물질에 대한 인간의 반웅을 보다 정확히 예측할 수 있도록 하며 치료 효과 역시 증가시킬 수 있는 특징이 있다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 목적은 역분화 줄기세포를 이용한 인간화 면역 동물의 체조방법및 이에 의해 제조된 인간화 면역 동물을 제공하는 것이다.
보다 상세하게, 본 발명의 하나의 목적은， 인간 유래 세포에 0ct4 , Sox2 , Kl f4 및 c-myc 유전자를 도입하여 역분화 즐기세포를 제조하는 단계; 상기 역분화 줄기세포를 면역결핍 동물의 배아에 주입하는 단계; 및 상기 배아를 자궁에 착상시키는 단계를 포함하는， 인간의 면역계가 발현되는 동물 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된， 인간의 면역계가 발현되는 동물을 제공하는 것이다. 【유리한 효과】
본 발명은 류마티스 관절염 (RA) 환자 및 골관절염 (OA) 환자 유래의 역분화 줄기세포를 이용하여 인간의 면역계가 발현되는 동물 제조 방법 및 상기 제조방법으로 제조된 동물을 제공하여， 관절염 환자의 면역계를 구현한 동물을 이용하여 보다 환자에 맞추어진 치료제의 제공이 가능하도록 하며 관절염 치료에 크게 기여할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 골관절염 (OA)환자 및 류마티스 관절염 (RA)환자로부터 얻어낸 활막 세포를 나타낸 것이다.
도 2는 류마티스 관절염 (RA) 환자의 활막 세포로부터 역분화 줄기세포를 제작한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 골관절염 (OA) 환자의 활막 세포로부터 역분화 줄기세포를 제작한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 류마티스 관절염 (RA) 환자와 골관절염 (OA)환자의 활막 세포로부터 제작한 역분화 줄기세포의 줄기세포적 특성을 qRT-PCR( real -t ime PCR)을 통해 나타낸 것이다.
도 5는 류마티스 관절염 (RA) 환자의 활막 세포로부터 제작한 역분화 줄기세포의 줄기세포적 특성을 세포 염색을 통하여 양성 대조군인 H7과 비교하여 나타낸 것이다.
도 6은 골관절염 (OA) 환자의 활막 세포로부터 제작한 역분화 줄기세포의 줄기세포적 특성을 세포 염색을 통하여 양성 대조군인 H7과 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 류마티스 관절염 (RA) 환자의 활막 세포로부터 제작한 역분화 줄기세포의 염색체의 상태를 분석한 것으로， 모양 및 개수 모두 정상임을 나타낸 것이다. 도 8은 류마티스 관절염 (RA) 환자의 활막 세포로부터 제작한 역분화 줄기세포를 이용하여 테라토마 형성되는 것을 나타낸 것이다.
도 9는 사람의 면역세포가 발현되는 마우스를 생성하였음을 세포 염색을 통해 나타낸 것이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서， 본 발명은
(a) 인간 유래 세포에 0ct4 , Sox2 , Kl f4 및 c-myc 유전자를 도입하여 역분화 줄기세포를 제조하는 단계 ;
(b) 상기 역분화 줄기세포를 면역결핍 동물의 배아에 주입하는 단계;
(c) 상기 배아를 자궁에 착상시키는 단계를 포함하는， 인간의 면역계가 발현된 동물의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 바람직하게 상기 인간 유래 세포는 인간에서 유래한 모든 세포에 사용이 가능하며， 체세포와 생식세포를 포함하며， 각종 조직이나 혈액에서 유래한 세포를 포함한다. 이러한 세포의 예로는, 활막세포， 피부세포， 말초혈액단핵구 세포 (per ipheral blood mononuc lear cel l ) , 섬유아세포， 섬유세포， 신경세포, 상피세포， 각질세포， 조혈세포， 멜라닌 세포， 연골세포， 마크로파지， 근육세포 혈액 세포,골수 세포， 림프구 세포 (B림프구 , T림프구)， 대식세포，단핵세포， 폐 세포， 췌장 세포, 간 세포， 위 세포， 장 세포, 심장 세포， 방광 세포， 신장 세포 요도 세포， 배아 생식세포, 난구세포 등을 예시할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는， 활막세포, 피부세포， 말초혈액단핵구 세포 또는 섬유아세포 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는， 상기 인간 유래 세포로서 활막세포를 사용하였다.
본 발명에서 용어， "활막세포" 는 관절강의 내면을 덮고 있는 활막의 세포로서， 결합조직성의 세포이며 A형과 B형의 2형으로 구분한다. A형 세포는 대식세포모양이며 식작용이 있고, 세포질 내에는 큰 골지 장치와 많은 리소좀이 있으며， 조면소포체는 적다. B형 세포는 섬유아세포로 세포 표면은 비교적 평활하고 세포질 내에는 조면소포체가 많다. 활막은 관절을 감싸는 조직으로 관절액을 생산하며， 관절염의 증상으로, 활막에 대한 세포침윤， 부종， 결합직의 증식 등이 나타난다.
본 발명에서는 활막세포에 0ct4 , Sox2 , Kl f4 및 c-myc 유전자를 도입하는 방법을 이용하여 역분화 줄기세포를 제조하였다.
본 발명에서 용어， "역분화 (또는 reprogra醒 ing) " 란 분화능이 없는 세포 또는 일정부분 분화능이 있는 세포 등 서로 다른 양태로 존재하는 분화된 세포로부터 최종적으로 새로운 유형의 분화잠재력을 갖는 상태로 복원 또는 전환될 수 있는 프로세스를 의미한다. 본 발명에서 역분화 기작은 0% 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이면 모두 포함될 수 있으며， 바람직하게는 0% 분화능을 가지는 분화된 세포 또는 0% 초과 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 일정 부분 분화된 세포를 100% 분화능을 가지는 세포로 복원 또는 전환시키는 것을 의미한다.
본 발명에서는 역분화 유도인자로서 0ct4, Sox2 , Kl f4 및 c-myc 유전자를 도입하여 역분화를 유도하였다. 상기 "역분화 유도인자'' 란， 최종적으로 또는 일정부분 분화된 세포가 새로운 유형으로 분화될 수 있는 잠'재력을 갖는 역분화 줄기세포로 되도록 유도하는 물질로서， 분화된 세포의 역분화를 유도하는 물질이면 제한 없이 포함될 수 있으며， 최종적으로 분화시키려는 세포의 종류에 따라 선택하여 사용할 수 있으며， 상기 0ct4 , Sox2 , KH4 및 c-myc에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어， "역분화 줄기세포 또는 유도만능줄기세포 ( iPS cel l ) " 는 이미 분화가 완성된 성체세포들에 대하여 인위적으로 역분화과정을 수행하여 유도된 세포들로， 만능분화능 (p lur ipotency)을 가진다. 본 발명에서는 역분화 유도인자로 0ct4 , Sox2 , Kl f4 및 c-myc 유전자를 도입하여 역분화 줄기세포를 제조하였으며， 제조된 환자 유래 역분화 줄기세포가 줄기세포적 특성을 나타내는 것을 실시예 2를 통하여 확인하여， 여러 부분으로 분화가 가능한 역분화 줄기세포가 형성되었음을 확ᄋ J하였다.
본 발명에서는 상기의 방법으로 제조된 환자 유래 역분화 줄기세포를 면역결핍 동물의 배아에 주입하고， 상기 배아를 동물의 자궁에 착상시킨 후 출산된 새끼를 얻어， 인간의 면역계를 발현되는 동물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어， "면역결핍 동물"이란， 면역웅답에 관여하는 T세포， B세포， 대식세포， 항체， 보체 등의 감소， 결손 혹은 기능이상 등의 다양한 원인에 의해 면역응답능이 저하 또는 결핍된 동물을 의미한다.
바람직하게， 상기 면역결핍 동물은 T 세포， B 세포 및 NK (natural killer)세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 결핍된 동물일 수 있다.
보다 바람직하게， 본 발명의 면역결핍동물은 증증 복합 면역 결핍 (Severe Combined I醒 unodef icient syndrome , SCID) 쥐， SC ID-beige 쥐， 노그 (N0D/Shi-scid/IL-2RYnull, NOG) 쥐 및 NSG(N0D scid ga瞧 a) 쥐일 수 있다.
중증 복합 면역 결핍 (Severe Combined Immunodef icient syndrome, SCID) 쥐는 림프구계 줄기세포의 발생장애로 T세포， B세포 두 계통에 선천적인 결손 등에 의하여 세포성 면역과 액성 면역 모두가 결손된， 증증 복합 면역 결핍증을 표현 형질로 하는 돌연변이 쥐를 의미한다. 상염색체 열성의 유전형을 나타내며， 면역글로불린이나 T 세포수용체유전자의 재편성에 관여하는 재조합 효소 (recombinase) 흑은 그 관련 인자의 이상으로 기능적 T세포 및 B세포가 결손되어 있다.
특히, SCID-beige 쥐는 SCID 및 Beige에서 모두 상염색체 열성 돌연변이가 나타난 것이다. SCID 돌연변이의 경우 상기와 같이 T세포 및 B세포가 결손되어 있는 특성이 나타나며， Beige돌연변이의 경우 NK(natural killer)세포의 결핍이 나타난다, SCID-beige 쥐는 상기와 같은 특성이 동시에 나타나는 것으로， T세포， B세포 및 NK(natural killer)세포가 결핍되어 있다.
노그 (N0D/Shi-scid/IL-2RYnull, NOG) 쥐란， ' 이종이식을 위한 수용체로 개발된， 중증 복합 면역 결핍 (Severe Combined Immunodef icient syndrome, SCID)돌연변이와 인터루킨ᅳ 2R(IL-2RY )대립형질 돌연변이에 대한 이중 동형접합이며, 이에 따라 T세포와 B세포 외에 NK(natural killer)세포까지 결핍된 면역결핍 쥐를 의미한다.
NSG(N0D scid gamma) 쥐란， 중증 복합 면역 결핍 (Severe Combined Immunodef icient syndrome , SCID)와 NOD (non-obese diabetic) 쥐와의 교배로 만들어진 것으로， 성숙한 T 세포 및 B 세포가 전혀 없고， 매우 낮은 NK(natural killer)세포 활성을 보여， 인간세포의 이식 효율이 높다.
본 발명은 면역결핍 동물에 역분화 줄기세포를 주입하여 인간의 면역계를 발현시키기 위한 것으로서, 상기 중증 복합 면역 결핍 (Severe Combined Immunodef icient syndrome, SCID) 쥐， SC ID-beige 쥐， 노그 (N0D/Shi-scid/IL-2RYnull, NOG) 쥐 및 NSG(N0D scid ga画 a) 쥐 외에도 면역결핍된 동물이면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 "배아 "란 수정이 일어나 정자와 난자가 합쳐진 접합체가 한 번 이상 세포분열을 하기 시작한 시기부터 하나의 완전한 개체가 되기 전까지의 발생 초기 단계를 의미한다. 바람직하게， 상기 배아는 배반포 단계일 수 있다.
본 발명 실시예 3에서는 면역세포가 결핍된 SCID beige 쥐에 실시예
1에서 제조한 환자 유래 역분화 줄기세포를 배아에 주입하여 인간이 면역계가 발현되는 쥐를 제조하였으며， 실시예 4의
ICC(I隱 unocytochemistry) 방법을 이용하여 사람의 면역 세포와 동일한 수준의 염색상태를 보아는 세포를 검출하여, 인간의 면역계가 발현되는 쥐가 제조된 것을 확인하였다.
보다 바람직하게， 역분화 줄기세포를 주입하기 전에， 성선 자극 호르몬 (Human Menopausal Gonadotropins, HMG) 및 생식선 자극 호르몬 (human chorionic gonadotropin, HCG)을 쥐에 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 성선 자극 호르몬 (Human Menopausal Gonadotro ins, HMG)은 난포 자극 호르몬 (follicle stimulating hormone , FSH) 및 황체 형성 호르몬 (leuteinizing hormone , LH)의 두 가지 활성 성분을 포함한다. 이들은 뇌하수체에서 생성되는 당단백질 호르몬으로서, 난포 생성을 촉진하는데 사용되고, 난소발육을 촉진시킨다. 본 발명에서 성선 자극 호르몬 (Human Menopausal Gonadotropins, HMG)이란 상기 난포 자극 호르몬 및 황체 형성 호르몬 등의 일련의 호르몬 또는 그 변이체를 포함할 수 있다. 이는 자연적인 상황에서 뇌하수체 전엽으로부터 분비되며， 이를 추출하거나 또는 재조합 기술을 통해 제조하여 얻을 수 있다. 생식선 자극 호르몬 (human chor ioni c gonadotropin, HCG)은 융모성 생식선 자극 호르몬 및 갑상선 자극 호르몬 등을 포함하며， 뇌하수체에 의하여 합성되고 분비된다. 난소의 성장을 자극시키는데 사용되며， 이는 자연적인 상황에서 뇌하수체 전엽으로부터 분비되며， 이를 추출하거나 또는 재조합 기술을 통해 제조하여 얻을 수 있다. 상기 성선 자극 호르몬 (Human Menopausal Gonadotropins , HMG) 및 생식선 자극 호르몬 (human chor ioni c gonadotropin, HCG)은 배아를 자궁에 보다 안전하게 착상시키도록 하기 위한 것으로서， 상기 호르몬 뿐만 아니라， 상기 호르몬의 분비를 촉진하는 물질， 상기 호르몬의 효과를 나타내는 약제, 제재 등 배아가 자궁에 잘 착상할 수 있도록 유도할 수 있는 물질이면 제한 없이 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서 , 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된， 인간의 '면역계가 발현되는 동물에 관한 것이다. 보다 바람직하게， 상기 동물은 쥐 (mouse)일 수 있다.
본 발명은， 상기 면역결핍 쥐 (mouse)에 역분화 줄기세포를 주입하여 인간의 면역계와 동일하거나 매우 유사한 면역계를 발현하는 '인간화 쥐 (humani zed mouse) ' 를 제조하여 특정한 물질이나 자극에 대한 반웅이 인간의 반웅을 대표하는 것으로 해석될 수 있는 쥐를 제조하였다. 보다 구체적으로， 본 발명은 류마티스 관절염 환자 및 골관절염 환자 유래의 역분화 줄기세포를 주입하여 인간의 면역계를 발현하는 쥐를 제조함으로써 관절염 환자의 면역계를 구현한 쥐를 얻어， 환자에게 맞춤형 치료제의 개발이 가능하도록 한 것이다. 또한， 환자의 세포를 공여세포 (donor )로 사용하였을 경우 특정 질환에 대한 반응성이나， 특정 장기의 기능에 대한 '연구를 가능하게 하며， 약에 대한 예후 흑은 화학물질에 대한 반웅성을 관찰하는 도구로 사용될 수 있으며, 더 나아가 이러한 모델을 통해 각 개인에 맞는 치료법과 치료 약물을 선정할 수도 있다. 특히 본 발명을 통해서 면역체계를 각 개인의 것으로 치환하는 작업이 성공할 경우 활용분야가 제약은 물론 의료， 임상， 기초연구에까지 확대될 것으로 기대된다는 점에서 매우 큰 유용가치를 가지고 있다. 【발명의 실시를 위한 형태】 이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 역분화줄기세포의 제조
1-1. 환자모집과 활액의 준비
1987년 the American College of Rheumatology (ACR; formerly the American Rheumatism Assoc i at ion)가 개정한 판단 기준에 의해 류마티스 관절염 (RA)을 진단 받은 환자 (n = 2)와 골관절염 (OA)을 진단받은 환자 (n = 2)들을 서울 성모병원 류마티스 내과 외래 병동에서 모집하여， 총 4명 (각 2명씩)의 환자로부터 활액을 추출하였다. 관절경적 활막 절제술이나 무릎 전체 이식 수술을 받은 환자들로부터 수술 중 활액 샘플을 얻어내었다. 골관절염 (OA)에 포함되는 환자의 적격성은 상기 ACR 판단 기준에 의하여 초기 무릎 OA 진단을 받은 사람만 포함되었으며， 전체 실험 프로토콜은 한국 가를릭 대학교 인간 연구 윤리 위원회에 의해 승인받은 후 진행하였다.
1-2. RA및 OA활막 세포의 분리 및 유지
류마티스 관절염 (RA) 환자 유래 및 골관절염 (OA) 환자 유래 활막은 류마티스 연구 센터의 샘플 은행에 보관된 것을 사용하였다. 활막 조직을 균질화 시킨 후, 0.01% 아교질가수분해효소 (collagenase)가 포함된 Dulbecco' s modified Eagle's medium (DMEM, Gibco by Invitrogen, Carlsbad, California, USA)에 풀어 4시간 동안 37°C에서 섞어주었다. 세포들을 세척한 후， 20%의 소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS) (Gibco by Invitrogen, Carlsbad, California, USA)와 1% 페니실린 /스트렙토마이신 용액 (penici 11 in/streptomycin solution) (Gibco by Invitrogen, Carlsbad, California, USA)이 포함된 DMEM에 풀어서 배양하였다. 도 1은 류마티스 관절염 (RA) 환자 유래 및 골관절염 (0A) 환자 유래 활막으로부터 얻어낸 활막 세포를 나타낸 것이다. 1-3. 렌티바이러스 (Lent i virus)의 생성 및 활막세포에의 형질 도입 12mg의 4-in-l 리프로그래밍 플라스미드 (reprogramming plasmid) (0ct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc)와 9mg의 packaging pPAX2플라스미드 (plasmid) 및 3mg의 pMD2G 플라스미드 (plasmid)를 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 293T세포 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 형질 도입한 후， 100-醒 디쉬 (dish)의 80%가 되도톡 세포를 깔아주었다. 약 48-72시간 배양한 후， 바이러스를 얻어 렌티바이러스 농죽키트 (Lent i_X Concentrator) (Clontech Laboratories, Mountain View, California, USA)와 섞었다. 4°C에서 밤새 배양한 후， 바이러스들을 1,500^ 원심 분리로 모아 인산완층식염수 (Phosphate buffer saline, PBS)에 다시 풀어주었다. 세포에 바이러스를 감염시키기에 앞서 먼저 RA와 0A 활막 세포를 6-웰 (well) 플레이트 (plate)에 깔았으며, 그 다음 렌티바이러스가 첨가된 미디아 (media)에 세포들을 밤새 배양하였다. 그 후 생성된 역분화 줄기세포 콜로니 (colony)들을 감염 18-20일 후에 분리해서 얻어내었다 (도 2 및 도 3).
1- 4. 환자유래 역분화줄기세포의 배양 및 유지
상기 실시예 3에서 렌티바이러스에 감염시킨 RA와 0A 활막 세포는 20%소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS) (Gibco by Invitrogen, Carlsbad, California, USA)이 함유된 DMEM에 37 °C, 5% C02인 환경에서 배양하였으며ᅳ 모두 패시지 (passage) 8인 세포들을 사용하였다. 이후 생성된 환자 유래 역분화 줄기세포들을 마트리겔 (matrigel)이 코팅된 세포배양접시 (culture dish)(BD Biosciences , San Jose, California, USA) , E8 인간배아줄기세포 (human embryonic stem cell , hESC)용 미디아 (media)에서 배양하였다. 실시예 2. 역분화줄기세포의 확인
2- 1. qPCR (quantitative PCR) 수행
R easy Plus Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)을 사용하여 RNA를 분리하고， 역전사 중합효소 연쇄반웅 (Reverse transcriptase PCR, RT—PCR)은 i Script™ cDNA Synthesis Kit (BI0RAD, Marnes-La-Coquette, France)을 사용하여 수행하였다. 유전자 발현은 ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Appl ied Biosystems, Foster City, California, USA)으로 SYBR Green 실시간 연쇄중합반웅 (rea卜 time PCR)을 사용하여 측정하였다. 상대적인 mRNA 양 (level)은 GAPDH의 mRNA 값으로 표준화하였다. 이를 통해 실시예 1에서 제조된 역분화 줄기세포가 줄기세포적 특성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).
2-2. 세포면역염색 수행
역분화 줄기 세포 클론들을 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)에 고정한 후， 면역 염색에 일차 항체로서 SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-80 (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) , 0ct3/4, Nanog (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , California, USA) 및 Sox2 (BioLegend, San Diego, California, USA)를 사용하여 반응시켰다. 이후 일차 항체가 부착된 샘플들에 Alexa Fluor 594또는 488이 결합된 이차 항체 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 부착하고， 간접 면역형광법을 이용하여 관찰하였다. 세포 염색 및 간접 면역형광법을 통하여 실시예 2에서 제조된 류마티스 관절염 환자 유래 및 골관절염 환자 유래 역분화 줄기세포가 각각 줄기세포의 특성을 나타내는 것을 확인하였으며， 특히 양성 대조군인 H7과 동일 혹은 그 이상의 줄기세포 특성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 5 및 도 6).
2-3. 테라토마 형성 관찰
상기 실시예 1을 통해 생성 및 유지된 역분화 줄기세포를 ΐχΐο6씩
10mL MatrigeKBD Biosciences, San Jose, California, USA)에 풀어주었다. 28.5 게이지 시린지 (syringe)를 이용하여 세포들을 8주령 SCID Beige mouse(severe combined immunodeficiency Beige mouse)의 신장 내 캡술에 주입하고， 8주 후 생성된 종양들을 추출하여 헤마록실린 (hematoxylin)과 에오신 (eosin) 염색을 수행하였다. 상기 실험을 통해 각 부분으로 분화가 가능한 줄기세포능을 가진 역분화 줄기치ᅵ포가 생성된 것을 확인하였다 (도 7). 2-4. 핵형 분석
류마티스 관절염 환자 유래의 역분화 줄기세포의 특성을 확인하기 위하여， 각 6-웰 (well) 플레이트 (plate)에 30iiL의 CRA( Chromosome Resolution Additive) (Genial Genetic Solutions Limited, The Heath Business & Technical Park, Runcorn, U.K.)를 넣고 1시간 동안 배양한 후， 30분 동안 콜세미드 (colcemid)를 처리하여 세포 분열을 중지시켰다. 세포들은 트립신을 이용하여 분리한 후， 미리 데워 놓은 KC1 저장액 (hypotonic solution)을 처리하였다. 아세트산 (Acetic acid)과 메탄올 (Methanol )이 1:3으로 섞인 용액으로 세포를 고정하여 슬라이드에 부착하고， G-분염법 (Trypsin-Giemsa banding)을 이용하여 핵형 분석을 수행하였다. 이를 통해 류마티스 관절염 환자 유래의 역분화 줄기세포의 염색체의 모양 및 개수는 모두 정상으로 나타났으며， 돌연변이가 발생하지 않았음을 확인하ᅳ였다 (도 8). 실시예 3. 인간의 면역계가 발현되는 쥐 제조
관절염 환자의 면역계를 구현한 쥐를 얻기 위하여， 환자 유래 줄기세포를 주입한 배아를 쥐의 자궁에 착상시켰다. 실험에는 10주령인 수컷과 6주령인 암컷인 CD-I strain을 사용하였으며, 실험에 앞서 시술에 들어갈 쥐들에게 성선 자극 호르몬 (PMS) 과 생식선 자극 호르몬 (HCG)를 각각 0.1 ml/mouse이 되도록 50IU/ml씩 처리하였다. 환자 유래 역분화 줄기 세포들을 1 mg/ml 아큐테이즈 (accutase)로 떼어낸 후， 배아 당 5ᅳ 8개씩 주입하였다. 세포가 주입된 배아들은 37개씩 가임신 상태인 두 마리의 암컷에 이식하였으며， 약 3주 후， 9마리의 새끼를 출산하였다. 실시예 4. 인간의 면역계 발현 확인
면역세포가 결핍된 SCID biege 쥐 (mouse)에 환자 유래 역분화 줄기세포를 주입하여 인간의 면역계가 발현되는 쥐 (mouse)를 제조하고, 이를 ICC(Immunocytochemistry) 방법을 이용하여 확인하였다. 상기 ICC(I隱 unocytochemistry) 방법으로， 제조한 쥐 (mouse)로부터 혈액을 채취하고， 채취한 혈액을 슬라이드에 도말하여 상온에서 1시간 동안 말린 뒤 아세톤에 담궈서 10분간 고정시킨 후 상온에서 말렸다. 이후 PBST buffer (washing buffer)를 이용하여 세척한 후， 10% normal goat serum으로 실온에서 1시간동안 블럭킹 (blocking)하였다. 그 후 일차 항체로서 단일클론항체인 monoclonal rabbit anti-CD3E ant i body (abeam)를 1:100으로 희석하여 슬라이드에 가한 후 4°C에서 밤새 반웅시켰다. 반웅 후， 다시 PBST buffer (washing buffer)에 슬라이드를 담가 세척하고， 이차 항체로서 biotinylated secondary goat ant i -rabbit IgG 를 1:200으로 희석하여 슬라이드에 가한 후 상온에서 1시간동안 반웅시켰다. 반응 후 다시 PBST buffer (washing buffer)에 슬라이드를 담가 세척하고， 0.6% H202 (SAMCHUN Catalog#7722-84-l) 에 슬라이드를 담가 10분간 배양한 후 다시 PBST buffer에서 5분간 세척하였다. streptavidin-HRP, R.T.U. (Ready-to-Use) reagents, (Vector Lab. Catalog# SA-5704) 를 슬라이드에 2방울 떨어뜨리고 상은에서 1시간 반웅시킨 후， PBST buffer로 5분간 세척하였다. DAB Peroxidase Substrate Kit (Vector Lab Catalog SK-4100) 를 사용하여 상온에서 발색정도를 확인하고 원하는 발색정도에서 수듯물을 이용하여 반웅을 정지시켰다. 그 후 물기를 말린 슬라이드를 자알렌 (xylene)에 담구어 세척한 후 마운팅 미디아 (Mounting Medium) (Vector Lab Catalog H-5000)를 이용하여 봉입하였다.
상기 염색을 통해， 음성 대조군에서는 염색에 양성을 띠는 세포를 발견할 수없었으며， 양성 대조군인 사람이 면역세포와 동일한 형태 및 수준의 염색 상태를 보이는 세포가 인간의. 면역계가 발현되는 쥐 (mouse)에서 나타나는 것을 확인하였다 (도 9). 이를 통해 인간의 면역세포가 발현되는 인간화 쥐 (mouse)가 정상적으로 제조된 것을 확인하였다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
(a) 인간 유래 세포에 OcU, Sox2, Klf4 및 c-myc 유전자를 도입하여 역분화 줄기세포를 제조하는 단계■;
(b) 상기 역분화 줄기세포를 면역결핍 동물의 배아에 주입하는 단계;
(c) 상기 배아를 자궁에 착상시키는 단계를 포함하는，
인간의 면역계가 발현된 동물의 제조 방법 .
【청구항 2】
거 U항에 있어서, 상기 인간 유래 세포는 체세포 또는 생식세포인， 방법.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 (a)단계 후 (b)단계 전에 성선 자극 호르몬 (Human Menopausal Gonadotro ins, HMG) 및 생식선 자극 호르몬 (human chorionic gonadotropin, HCG)을 쥐에 처리하는 단계를 더 포함하는， 방법.
【청구항 4】
게 1항에 있어서，상기 면역결핍 동물은 T세포， B세포 및 NK (natural killer)세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 결핍되어 있는 것인， 방법 · 청구항 5】
제 4항에 있어서， 상기 면역결핍 동물은 SCID (Severe Combined
Immiinodeficient syndrome) 쥐， SCID-베이지 (SCID— beige) 쥐， 노그 (N0D/Shi-scid/IL-2RYnull, NOG) 쥐 또는 NSG(N0D scid ga隱 a) 쥐인， 방법 .
【청구항 6】 게 1항 내지 게 5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된， 인간의 면역계가 발현된 동물.
【청구항 7]
제 6항에 있어서， 상기 동물은 설치류인， 동물. 【청구항 8】
제 6항에 있어서， 상기 동물은 T 세포， B 세포 및 K (natural iller)세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 인간 유래 세포로 이루어진 것인， 동물.
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