WO2011081037A1 - ゾル－ゲル法によって作製した半導体ナノ粒子分散蛍光性微粒子 - Google Patents

ゾル－ゲル法によって作製した半導体ナノ粒子分散蛍光性微粒子 Download PDF

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村瀬　至生
萍 楊
昌儀 安藤
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing highly durable silica glass-based fine particles in which a large number of semiconductor nanoparticles having high luminous efficiency are dispersed and its application.
  • Phosphors in which rare earth ions, transition metal ions, and the like are dispersed in an inorganic material have superior durability compared to organic dyes, and thus have been conventionally used in lighting, displays, and the like.
  • the luminance and color rendering properties are not always sufficient, there has been a demand for a phosphor having high luminance exceeding those.
  • semiconductor nanoparticles particles diameter of several nm, those not doped with rare earth ions and transition metal ions; hereinafter, they may be simply referred to as “nanoparticles”. In recent years, much attention has been paid to “quantum dots”.
  • semiconductor nanoparticles emit bright fluorescent light of various wavelengths according to the particle size even when irradiated with ultraviolet rays of the same wavelength, so that the color rendering properties are excellent and the luminance can be increased because the emission decay time is short. . If semiconductor nanoparticles are prepared carefully, the brightness is high enough to detect and separate the light emitted from each particle separately. The application fields used for elucidating the mechanism and diagnosing diseases are about to develop greatly.
  • Such phosphor semiconductors are mainly II-VI group semiconductors (cadmium sulfide (CdS), zinc selenide (ZnSe), cadmium selenide (CdSe), zinc telluride (ZnTe), cadmium telluride (CdTe ) And mixed crystals thereof) and III-V group semiconductors (such as indium phosphide (InP)).
  • CdS cadmium sulfide
  • ZnSe zinc selenide
  • CdSe cadmium selenide
  • ZnTe zinc telluride
  • CdTe cadmium telluride
  • CdTe cadmium telluride
  • III-V group semiconductors such as indium phosphide (InP)
  • the semiconductor nanoparticles In order to solve this, it is necessary to confine the semiconductor nanoparticles in a form of being dispersed and fixed in a transparent matrix, and to form a solid material that maintains the initial characteristics over a long period of time in various environments.
  • the solid matrix there are two types of glass and organic polymer material. Among these, glass, particularly silica glass, has higher transparency than organic polymers and is resistant to ultraviolet irradiation. Further, by providing a network structure, it becomes difficult for moisture and oxygen to pass through, and deterioration of dispersed nanoparticles can be prevented over a long period of time.
  • the sol-gel method is advantageous.
  • the sol-gel method proceeds to vitrification under mild conditions around room temperature and normal pressure, so if the fabrication method is devised, the semiconductor nanoparticles retain high luminous efficiency immediately after being synthesized by the solution method. This is because they are dispersed and fixed in transparent glass. Since water is used in the sol-gel method, it is more convenient to use hydrophilic nanoparticles to prevent aggregation and quenching.
  • silica glass Glass produced by the sol-gel method is called glass, silica, silica glass, silica-based glass, amorphous silica, SiO 2 and the like in related academic conferences even though it contains organic matter and water. This is because the prepared solid matrix does not have other metal ions that modify the network structure formed by silicon. Therefore, also in the present specification, a matrix containing silicon produced by a sol-gel method is referred to as glass, silica, or silica glass.
  • Patent Document 1 glass fine particles
  • Patent Documents 2, 3 and 4 glass fine particles
  • Patent Document 5 glass thin film
  • particle diameter particle diameter
  • the average of the lengths of the three principal axes of inertia is defined as the particle diameter (in the case of a perfect sphere, the diameter is the particle diameter).
  • description will be limited to the fluorescent silica glass fine particles.
  • a sol-gel method in which an alkoxide is hydrolyzed and dehydrated and condensed is used.
  • the reverse micelle method a method in which the sol-gel method is advanced in minute polka dots dispersed in an oil phase, water-dispersible nanoparticles are dispersed in polka dots in advance
  • the Stover method hydrolyzed.
  • a technology has been developed in which a plurality of semiconductor nanoparticles are dispersed in silica glass fine particles with high luminous efficiency (25% or more) by using an alkoxide to be deposited on the surface of the nanoparticles.
  • silica glass fine particles have little scattering if the particle size is about 100 nm or less, they are introduced into a quartz cell having an optical path length of 1 cm while being dispersed in a solution, and they are introduced into a general-purpose absorption spectrophotometer and fluorescence spectrophotometer. Measure with a meter. Thus, the absorbance and fluorescence intensity for each wavelength are obtained. An integrating sphere is used when the influence of scattering is a concern. At this time, both the absorbance and the fluorescence intensity have a larger error than when there is no scattering. Also in this case, recently, a general-purpose measuring device is commercially available (for example, C9920-02 of Hamamatsu Photonics Co., Ltd.).
  • the concentration of the semiconductor nanoparticles at the time of synthesis is usually about 1 to 10 ⁇ M (micromol / liter, the number of semiconductor nanoparticles, not the number of atoms constituting them), and this is stored in a cool and dark place as it is.
  • concentration usually about 1 to 10 ⁇ M (micromol / liter, the number of semiconductor nanoparticles, not the number of atoms constituting them), and this is stored in a cool and dark place as it is.
  • the concentration of the semiconductor nanoparticles at the time of synthesis is usually about 1 to 10 ⁇ M (micromol / liter, the number of semiconductor nanoparticles, not the number of atoms constituting them), and this is stored in a cool and dark place as it is.
  • the concentration which is the easiest to measure with a general-purpose absorption spectrophotometer or fluorescence spectrophotometer can be obtained.
  • the solvent is often pure water.
  • the fluorescence from one or several nanoparticles is often detected separately, in which case the concentration of nanoparticles is at most about 10 nM, and physiological Dispersed in high concentration salt such as saline. Further, the irradiation light intensity is usually 10 W / cm 2 or more, which is much higher than that of the spectroscope.
  • the dispersion concentration of nanoparticles is extremely low and a large amount of salts is contained in the solution, the nanoparticles may deteriorate even if they are coated on glass. I know that there is. In order to suppress such deterioration, it is one effective means to develop a glass network structure. Furthermore, it is more preferable to confine a plurality of nanoparticles to form one glass fluorescent fine particle than to coat one nanoparticle with glass in order to increase luminance.
  • CdSe nanoparticles containing Cd and Se for example, CdSe nanoparticles, among those described in Patent Documents 2 to 4, is effective in preventing deterioration.
  • CdSe nanoparticles with high luminous efficiency are produced by an organic solution method excluding water at a high level, and are quenched when dispersed in an aqueous solution. For this reason, it is desirable to disperse CdSe nanoparticles in glass fine particles while maintaining luminous efficiency, and in particular, to disperse as many nanoparticles as possible in order to increase luminance.
  • the fluorescent fine particles have a particle size of 100 nm or less.
  • the typical size of the cell is 10 to 30 ⁇ m, and when the particle size exceeds 100 nm, the probability that the cell takes up by phagocytosis decreases. Even when the inside of a cell is dyed separately, it becomes an area where the shape starts to be seen with an optical microscope when it exceeds 100 nm and approaches 200 nm, and is not suitable for clean staining.
  • the particle size of the semiconductor nanoparticles is several nanometers, and in order to increase the luminance by orders of magnitude, fine particles in which 10 or more nanoparticles are dispersed are necessary. For this purpose, the particle size is approximately 20 nm or more. Is required.
  • Fluorescent silica glass fine particles in which CdSe / ZnS nanoparticles are dispersed and fixed in glass by a sol-gel method and a production method thereof have been reported by Bavendy et al. (Non-patent Document 1).
  • this production method the surfaces of nanoparticles synthesized in advance in an organic solvent are covered with an alkoxide having an amino group (3-aminopropyltrimethoxysilane) and an alcohol having an amino group (5-amino-1-pentanol).
  • a separately prepared silica glass fine particle having a diameter of several hundreds of nanometers is adhered as a layer having a thickness of about 50 nm.
  • fluorescent glass fine particles having a structure in which the surfaces of silica glass fine particles not containing nanoparticles are coated with a sol-gel glass layer containing nanoparticles are obtained.
  • the nanoparticles exist only in the vicinity of the surface layer of the glass fine particles and the nanoparticles of the glass fine particles do not contain the nanoparticles, the dispersion concentration of the nanoparticles in the glass fine particles cannot be increased.
  • the luminous efficiency was about 13%.
  • Non-patent Document 2 a method has been reported in which alkoxides having a thiol group are grown on the surface of CdSe / ZnS nanoparticles to produce silica glass fine particles containing one nanoparticle in one silica glass fine particle.
  • the luminous efficiency in this case is reported to be 5-18%.
  • Silica glass fine particles having a particle size of 30 nm to 1 ⁇ m containing one CdSe / ZnS nanoparticle produced by a similar method have been reported, but the luminous efficiency is not described (Non-patent Document 3).
  • the luminous efficiency rapidly decreases immediately after the production, and further gradually decreases to 2% of the state before entering the silica glass after one week ( The absolute value decreased from 60% at the beginning to 1.2%).
  • the use of nanoparticles with a particularly thick shell increased the luminous efficiency to a maximum of 35% (Non-patent Document 4).
  • the nanoparticles having such a particularly thick shell have a large particle size and are not suitable for biotechnology applications, and it is difficult to produce such nanoparticles.
  • Non-patent Document 5 water-dispersible CdSe nanoparticles (citric acid coat) are produced and introduced into silica glass fine particles.
  • Non-patent Document 5 water-dispersible CdSe nanoparticles have an extremely low luminous efficiency of 0.1 to 0.15%.
  • the luminous efficiency is usually further reduced, so this cannot be called a phosphor.
  • Non-patent Document 6 in which water-dispersible CdSe nanoparticles are introduced into silica particles by the reverse micelle method, the luminous efficiency is at most 1.48%, which is called a phosphor. I can't.
  • a rough guide that can be called a phosphor is a luminous efficiency of 20% or more.
  • Non-Patent Document 7 a method for producing an aggregate of a plurality of nanoparticles using a linear polymer has recently been reported (Non-Patent Document 7).
  • the polymer particles produced by this method have been reported to have an average particle size measured by dynamic light scattering of 112 nm, but it is difficult to produce particles having a particle size of 100 nm or less.
  • the surface of the aggregate can be further coated with glass, but the particle size further increases.
  • glass materials that do not contain polymers are more durable and have less Cd elution, so it is necessary to produce glass materials in which a large number of semiconductor nanoparticles are dispersed without using polymers. Has been.
  • Japanese Patent No. 4366502 Japanese Patent No. 3767538 Japanese Patent No. 3755033 No. 2007/034877 JP 2006-282777 A Japanese Patent No. 4555966
  • An object of the present invention is to provide silica glass-based fluorescent fine particles having an average particle size of 20 to 100 nm in which a large number of nanoparticles having high durability and high luminous efficiency are dispersed. Furthermore, it is also an object of the present invention to show a technique for applying it to the bio field.
  • Step 1 (claimed process (A)) An appropriate amount of metal alkoxide (1) is added to the lipophilic semiconductor nanoparticles containing Cd and Se, and the surface of the nanoparticles is replaced with a hydrolyzate of metal alkoxide (1). Let the resulting solution be organic solution A. In this step, the metal alkoxide (1) covers the surface of the nanoparticles like a surfactant, so that a decrease in luminous efficiency can be suppressed.
  • Step 2 (claimed process (B)) An aqueous solution B is obtained by dispersing the metal alkoxide (2) in the aqueous solution and partially hydrolyzing it.
  • the metal alkoxide (2) one having a slower hydrolysis rate than the metal alkoxide (1) is selected.
  • a layer of the metal alkoxide (2) is further formed on the surface of the semiconductor nanoparticles covered with the metal alkoxide (1).
  • the semiconductor nanoparticles that have come into contact with water become hydrophilic because the metal alkoxide on the surface thereof is hydrolyzed, so that they become hydrophilic and move to the water phase. At this time, nanoparticles form an aggregate.
  • the metal alkoxyside (2) in the vicinity of the surface is slower in hydrolysis than the metal alkoxide (1) used in Step 1, so that the alkoxide on the surface of the semiconductor nanoparticles undergoes dehydration condensation all at once when transferred to the aqueous phase. It plays a role in preventing it from gathering and becoming a large lump. For this reason, when the amount of the metal alkoxide (2) is large, a small aggregate is formed, and when the amount is small, a large aggregate tends to be formed.
  • alcohol is added to the aqueous solution B used here, the contact area with the organic solution A increases and the reaction time is shortened. Examples of the alcohol include methanol, ethanol, isopropanol and the like.
  • Step 3 Process (C) of Claim)
  • semiconductor nanoparticle-dispersed silica fine particles are produced. This can be done by hydrolyzing a small amount of metal alkoxide (3) in the alkaline region with a large amount of water and alcohol and depositing it on the core nanoparticle aggregate by the ordinary Stover method. The fine particles thus obtained are separated and washed as necessary.
  • the metal alkoxide (3) may be the same as the metal alkoxide (1) or (2).
  • step 2 it is also possible to obtain the organic solution A by modifying the above production method and adding the metal alkoxide (1) and the metal alkoxide (2) having a slower hydrolysis rate at the same time in Step 1 described above.
  • a metal alkoxide (3) and an alkaline aqueous solution are added to make the surface of the nanoparticles of the organic solution A hydrophilic and convert it into an aqueous phase, and at the same time, an aggregate is formed (process (B1) of claim). ).
  • the two types of metal alkoxides (1) and (2) cover the surface of the nanoparticles, and as a result, an aggregate in which the nanoparticles are regularly arranged may be obtained. It is also possible to further protect the surface of the nanoparticle aggregate with a layer of silica glass by applying step 3 above.
  • an organic solution X is obtained by adding and stirring metal alkoxides A and B in a nonpolar solvent in which lipophilic semiconductor nanoparticles are dispersed.
  • the metal alkoxide B which has a slower hydrolysis rate than that, is added at the same time, so that the mutual distance and the light emission efficiency at the next stage of the assembly formation can be controlled.
  • the nonpolar solvent include hexane, benzene, diethyl ether, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride and the like in addition to toluene (process (A2) in claims).
  • the surfaces of the lipophilic semiconductor nanoparticles are replaced with partially hydrolyzed metal alkoxides A and B.
  • the organic solution X is brought into contact with the solution Y containing the metal alkoxide A or B and water, and the semiconductor nanoparticles in the organic solution X are moved to the solution Y (claim (B2)).
  • the alkoxides A and B attached to the surface of the semiconductor nanoparticles in the organic solution X cause phase transition by utilizing the fact that the hydrolysis proceeds and becomes hydrophilic when exposed to water. .
  • hydrolysis or dehydration condensation of the alkoxide further proceeds, so that an aggregate of semiconductor nanoparticles is formed.
  • the surface may be coated with silica glass, and the surface may be modified with a functional group.
  • the semiconductor nanoparticle-dispersed fluorescent silica glass fine particles containing Cd and Se prepared by the sol-gel method thus devised have an average particle diameter of 20 to 100 nm and are contained in an organic solution.
  • the luminous efficiency of the cadmium ions is reduced, a densely packed aggregate of nanoparticles is formed, and even if the concentration is reduced to a concentration of about 10 nM in a bio-buffer solution due to the influence of the silica network structure. It was confirmed that deterioration such as elution did not easily occur, and the present invention was completed.
  • the present invention provides the following highly durable and high-brightness semiconductor nanoparticle-dispersed fine particles and a method for producing the same by a sol-gel method.
  • the present invention if nanoparticles having a luminous efficiency of 30% in an organic solution are used, the luminous efficiency of the produced fluorescent fine particles is close to 30%. If nanoparticles with a luminous efficiency of 70% in the organic solution are used, fluorescent fine particles with a luminous efficiency close to 70% can be obtained. Item 1.
  • Fluorescent fine particles in which semiconductor nanoparticles containing Cd and Se are dispersed in fine particles containing silicon The silicon-containing fine particles have an average particle size of 20 to 100 nm, and Fluorescent fine particles, wherein the number of semiconductor nanoparticles dispersed in the fine particles containing silicon is 10 or more.
  • Item 2. The fluorescent fine particles according to Item 1, wherein the silicon-containing fine particles have an average particle size of 40 to 100 nm and the number of semiconductor nanoparticles dispersed in the silicon-containing fine particles is 20 or more.
  • the fluorescent fine particles according to Item 1 or 2 wherein the semiconductor nanoparticles dispersed in the fine particles containing silicon are regularly arranged.
  • Item 5 In a pH 7.4 solution (Hepes concentration 10 mmol / liter) of Hepes (2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid), which is a good buffer reagent, the concentration of semiconductor nanoparticles is 10 Item 5.
  • the fluorescent fine particles according to any one of Items 1 to 4 wherein the luminous efficiency is 20% or more when dispersed at nanomoles / liter. Item 6.
  • Item 12. Item 12.
  • Item 13. (A) A step of adding a metal alkoxide (1) to an organic solvent in which lipophilic semiconductor nanoparticles containing Cd and Se are dispersed and stirring to obtain an organic solution A, (B) A step of mixing and stirring the aqueous solution B containing the metal alkoxide (2) having a slower hydrolysis rate than the metal alkoxide (1) and the organic solution A to obtain a semiconductor nanoparticle aggregate, (C) The method according to any one of Items 1 to 12, comprising a step of adding a solution containing the metal alkoxide (3) to an alkaline aqueous solution containing the semiconductor nanoparticle aggregate and forming a coating layer on the surface of the semiconductor nanoparticle aggregate.
  • the metal alkoxide (2) has the formula (II): X n —Si (OR 2 ) 4-n (II) Wherein X is a group represented by CH 2 ⁇ CH—, a group containing oxirane, a group represented by H 2 NC m H 2m —, a group represented by CH 2 ⁇ C (CH 3 ) COOC p H 2p — , A group represented by HSC q H 2q —, a phenyl group, R 2 is a lower alkyl group, n is 1, 2 or 3, m is an integer of 1 to 6, p is an integer of 1 to 5, q is an integer of 1 to (Indicates an integer of 10) Item 14.
  • Item 15. The method for producing fluorescent fine particles according to Item 13 or 14, wherein heating is performed in the step (C).
  • Item 16. (A1) Metal alkoxide (1) and metal alkoxide (2) having a slower hydrolysis rate than metal alkoxide (1) are added to an organic solvent in which lipophilic semiconductor nanoparticles containing Cd and Se are dispersed and stirred. Obtaining an organic solution A, (B1) The method for producing fluorescent fine particles according to any one of Items 1 to 12, comprising a step of adding a metal alkoxide (3) and an alkaline aqueous solution to the organic solution A to form a semiconductor nanoparticle aggregate.
  • the fluorescent fine particles of the present invention a considerable number of semiconductor nanoparticles having durability and high light emission efficiency are dispersed, and the surface thereof is covered with an appropriately hydrolyzed alkoxide, which forms an appropriately sized aggregate. Furthermore, since the periphery thereof is covered with silica glass, the effect of having two characteristics of high durability and high luminance was obtained. In addition, since the average particle diameter is 20 to 100 nm, it is suitable for application to the bio field as a fluorescent probe. In addition, it can confirm that the semiconductor nanoparticle aggregate
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing Step 1 in the manufacturing process of the fluorescent fine particles produced in Example 1.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing Step 2 in the manufacturing process of the fluorescent fine particles produced in Example 1.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing Step 3 in the manufacturing process of the fluorescent fine particles produced in Example 1.
  • 2 is a graph showing the water concentration and the luminous efficiency of semiconductor nanoparticles in Step 1 of Example 1.
  • FIG. FIG. 3 is a projection view (two-dimensional photograph) in one direction of a three-dimensional tomographic image of the fluorescent fine particles produced in Example 1. It can be seen that the silica glass component is a pale white color, and the semiconductor nanoparticles are shown in a dark white color.
  • the average particle diameter (diameter) of one semiconductor nanoparticle is 5.5 nm.
  • 7 is a transmission electron microscope image of silica glass fine particles (1) to (4) produced in Example 7.
  • FIG. The right side (1L) to (4L) are enlarged images of (1) to (4), respectively.
  • It is a transmission electron microscope image of the aggregate
  • Semiconductor nanoparticles used in the present invention include those containing Cd and Se, specifically CdSe, CdSe / ZnS (CdSe nanoparticles coated with ZnS), CdSe / CdS / Cd 0.5 Zn Examples include 0.5 S / ZnS (CdS, CdS, and nanoparticles coated with Cd 0.5 Zn 0.5 S and ZnS sequentially), alloy composition CdSe x Te 1-x (0 ⁇ x ⁇ 1)), It is produced by the following 10 typical known methods.
  • the ligand on the nanoparticle surface prepared in the first step is replaced with the metal alkoxide (1) hydrolyzed in the following second step (step 1), the ligand in this step has a low binding energy. Is desirable.
  • the ligand include phosphoric acid compounds having an alkyl group (such as trioctylphosphine and trioctylphosphine oxide), alkylamines, and oleic acid.
  • step 1 (claimed process (A))
  • step 2 the hydrolyzed metal alkoxide (1) is coated on the surface of the semiconductor nanoparticles prepared in the first step by a sol-gel method using the metal alkoxide (1).
  • the ligand portion is made of hydrolyzed alkoxide ((Et-O) 3 -Si -O -) in quenching It has been reported that the luminous efficiency decreases rapidly due to its action. On the other hand, it was not known why the hydrolyzed alkoxide has a quenching effect.
  • the surface substitution to the alkoxide hydrolyzate was completed if the hydrolysis rate of the alkoxide was slow, the concentration of the semiconductor nanoparticles was thin, and the reaction time was long. Later, it was found that the luminous efficiency of the nanoparticles hardly decreased. That is, it has been found that the hydrolyzed alkoxide itself does not have a quenching action, and that the alkoxide is randomly concentrated on the surface of the nanoparticle and that the number of adhesion to the surface is not sufficient leads to quenching. By elucidating such a process, the present inventors have found a method of covering the surface with an alkoxide hydrolysis product without quenching the nanoparticles.
  • a phosphoric acid compound having an alkyl group prepared in the first step; an alkylamine; a hydrophobic nanoparticle covered with oleic acid or the like is prepared.
  • At least three types of metal alkoxides (1) used in the second step, metal alkoxides (2) used in the next third step, and metal alkoxides (3) used in the fourth step are prepared. These metal alkoxides are advantageous in that at least one metal is silicon to facilitate control of hydrolysis.
  • the metal alkoxides (1) and (2) are selected so that the hydrolysis rate of the metal alkoxide (1) in the alkaline solution is faster than that of the metal alkoxide (2). If necessary, another metal alkoxide may be further added to improve the controllability of hydrolysis rate, fine particle size, shape, and the like.
  • the metal alkoxide (1) used in this step is not particularly limited, it is preferable that the hydrolysis rate be higher than that of the metal alkoxide (2), as described above.
  • the synthesis can be performed by the following procedure.
  • organic solution A Add 2 to 400 ⁇ L (more preferably 5 to 80 ⁇ L, most preferably 10 to 30 ⁇ L) of metal alkoxide (1) to a nonpolar solvent (about 2.5 mL) such as toluene in which nanoparticles are dispersed to obtain organic solution A.
  • a nonpolar solvent about 2.5 mL
  • TEOS tetraethoxysilane
  • the solution is stirred for 1 to 8 hours (more preferably 2 to 5 hours, most preferably 2.5 to 3.5 hours).
  • the organic solution A can be obtained.
  • the amount of hydrolyzed metal alkoxide (1) attached to the surface of the nanoparticles is small, so that it tends to be difficult to convert to the aqueous phase in the next third step.
  • the length is longer than this range, too much hydrolyzed metal alkoxide (1) is attached to the surface of the nanoparticles, and the light emission efficiency tends to be lowered and aggregated.
  • the rate of hydrolysis increases, so the stirring time can be shortened if other hydrolysis conditions are the same.
  • the stirring time (hydrolysis time) is preferably about 30 minutes to 4 hours, for example.
  • silicon alkoxide When silicon alkoxide is used, a silica glass layer containing transparent silicon is formed. In the case of TEOS, it is better to reduce the hydrolysis rate. Therefore, it is effective to perform hydrolysis only with moisture entering from the air. In order to perform further controlled hydrolysis, it is possible to use a glove box with an adjusted atmosphere. Thus, what is necessary is just to adjust stirring time etc. with the hydrolysis rate of the metal alkoxide (1) to be used.
  • Step 2 (claimed process (B))
  • an appropriate amount of an appropriate type of metal alkoxide (2) is added to the aqueous phase to cause hydrolysis to obtain an aqueous solution B.
  • the reaction at this time is preferably in the alkaline region.
  • ammonia, sodium hydroxide or the like is added, and ammonia is particularly preferred.
  • the aqueous solution B and the organic solution A are mixed, and the aggregate is formed while transferring the nanoparticles to the aqueous phase.
  • the metal alkoxide (2) in this step is preferably one having a slower hydrolysis rate than the metal alkoxide (1) in the second step, and specifically, the formula (II): X n —Si (OR 2 ) 4-n (II) Wherein X is a group represented by CH 2 ⁇ CH—, a group containing oxirane, a group represented by H 2 NC m H 2m —, a group represented by CH 2 ⁇ C (CH 3 ) COOC p H 2p — , A group represented by HSC q H 2q —, a phenyl group, R 2 is a lower alkyl group, n is 1, 2 or 3, m is an integer of 1 to 6, p is an integer of 1 to 5, q is an integer of 1 to (Indicates an integer of 10) The thing represented by is mentioned.
  • the synthesis can be performed by the following procedure.
  • Metal alkoxide (2) (0.2-5 ⁇ L, more preferably 0.5-2 ⁇ L, most preferably 0.7-1.5 ⁇ L) in an organic solvent such as ethanol (10-50 mL, more preferably 15-30 mL, Most preferably, it is mixed with 20 to 27 mL) and an alkaline aqueous solution such as ammonia water (1 to 8 mL, more preferably 2 to 6 mL, most preferably 3 to 5 mL, with a concentration of about 3 wt%).
  • the aqueous solution B can be obtained using 3-mercaprotopropyltrimethoxysilane (MPS) or the like as the metal alkoxide (2).
  • MPS 3-mercaprotopropyltrimethoxysilane
  • the hydrolysis rate of metal alkoxide (2) represented by MPS etc.
  • the molar concentration of the metal alkoxide (2) is preferably 1.9 ⁇ 10 ⁇ 5 to 4.7 ⁇ 10 ⁇ 4 mol / liter, more preferably 4.7 ⁇ 10 ⁇ 5 to 1.9 ⁇ 10 ⁇ 4 mol / liter, and 6.6 ⁇ 10 ⁇ 5 to 1.4 ⁇ 10 ⁇ 4 mol / liter is most preferable.
  • the size of the aggregate becomes large at a stretch in the aqueous phase and becomes cloudy. This indicates that the metal alkoxide (2) has an effect of adjusting the size of the aggregate.
  • the hydrophobic nanoparticles prepared in the first step and the second step are gradually rendered hydrophilic by proceeding with hydrolysis of the alkoxide on the surface and converted into an aqueous phase.
  • the hydrolysis reaction When converted to the aqueous phase, the hydrolysis reaction further proceeds rapidly and proceeds randomly, and as it is, it becomes a large aggregate and the solution becomes cloudy.
  • a metal alkoxide having a high hydrolysis rate such as TEOS is used as the metal alkoxide (2).
  • an alkoxide having a slow hydrolysis rate is added to the aqueous phase, it adheres to the surface of the nanoparticles that have moved to the aqueous phase, and the nanoparticles gradually gather together.
  • step 3 Production of fluorescent fine particles by glass coating of aggregate
  • the metal alkoxide (3) is hydrolyzed in an alkaline aqueous solution containing alcohol by a so-called Stover method, and the silica glass component is deposited on the surface using the nanoparticle aggregate prepared in the third step as a seed.
  • a silica glass coating To form a silica glass coating.
  • ammonia, sodium hydroxide or the like is used, and ammonia is particularly preferable.
  • the alcohol a primary alcohol of a lower alcohol (having 5 or less carbon atoms), particularly ethanol, methanol or the like is preferable.
  • the metal alkoxide (3) is preferably tetrafunctional, among which TEOS is preferable.
  • the solution obtained in the third step is centrifuged to remove large particles, and further, water is removed and concentrated, so that the concentration of the semiconductor nanoparticles is about 0.1 to 5 ⁇ M (more (Preferably 0.3 to 3 ⁇ M, most preferably 0.5 to 2 ⁇ M).
  • This aqueous solution (about 0.5 mL) is taken out, lower alcohol (2-20 mL, more preferably 4-10 mL, most preferably 7-9 mL) and alkaline aqueous solution (0.01-0.2 mL, more preferably 0.05).
  • the thickness of the silica glass layer (shell) produced in this step is preferably 2 nm or more, and more preferably 4 nm or more. Most preferred.
  • the thickness of the silica glass layer can be 10 nm or more.
  • the thickness of the silica glass layer can be 20 nm or more.
  • the thickness of the layer made of silica glass can be easily measured as an outer portion not containing semiconductor nanoparticles by transmission electron microscope observation. When the thickness varies depending on the position of the periphery, the average of the entire periphery of the silica glass particles is defined as the thickness of the silica glass layer.
  • the silica glass network structure can be developed and Cd elution can be suppressed more effectively.
  • the heating temperature is about 30 to 85 ° C, more preferably about 35 to 60 ° C, and most preferably about 37 to 50 ° C.
  • the water-dispersible fluorescent fine particles produced in the fourth step have hydroxyl groups on their surfaces as they are. Furthermore, the surface can be modified with a carboxyl group by adding an alkoxide having a carboxyl group (for example, a sodium salt of carboxyethylsilanetriol). Moreover, the surface can be modified with a thiol group by adding an alkoxide having a thiol group (for example, MPS). In the fourth step, the alkoxide used in this step can be mixed with the metal alkoxide (3) to simultaneously perform surface silica coating and surface modification.
  • an alkoxide having a carboxyl group for example, a sodium salt of carboxyethylsilanetriol
  • a thiol group for example, MPS
  • the alkoxide used in this step can be mixed with the metal alkoxide (3) to simultaneously perform surface silica coating and surface modification.
  • modification with an amino group for example, using 3-aminopropyltrimethoxysilane
  • a group derived from polyethylene glycol for example, using 2- [methoxy (polyethyleneoxy) propyl] -trimethoxysilane or the like
  • the fluorescent fine particles of the present invention can be used as a fluorescent probe that specifically binds to a specific molecule in a living body and observes the distribution, amount, movement, etc. of the molecule by utilizing its surface modification. it can.
  • it since it has high luminance, luminous efficiency, and durability, it is also used for energy efficient phosphors for electronic materials.
  • electroluminescence emits light by applying an AC or DC voltage
  • cathodoluminescence emits light by irradiating a high-speed electron beam.
  • phosphors for example, electroluminescence (emits light by applying an AC or DC voltage), cathodoluminescence (emits light by irradiating a high-speed electron beam).
  • concentration of the semiconductor nanoparticle containing Cd and Se is based on literature (for example, Chemistry of Materials, 15 pages, 2854 pages, 2003). It is calculated by comparing. When the composition is changed, it can be determined by utilizing the additivity. Even when ZnS is coated on the CdSe nucleus as a shell, the concentration can be obtained by using literature (Journal of Physical Chemistry, B, Vol. 101, page 9463 (1997)).
  • Luminous efficiency of nanoparticles is internal quantum efficiency, and is defined as the probability of emitting fluorescent photons after the nanoparticles are excited with light. This value can be obtained by comparing the absorbance and the luminescence intensity of a standard substance (quinine 0.1 N sulfuric acid solution) with known luminous efficiency.
  • a standard substance quinine 0.1 N sulfuric acid solution
  • the method described in the literature by the present inventors may be used.
  • the fluorescence of quinine is in the blue region, but if the sensitivity for each wavelength of the fluorescence spectrophotometer is corrected, the emission efficiency of the fluorescence in the red region can be obtained as it is.
  • the emission efficiency value may be confirmed using a standard substance (for example, rhodamine 6G) in the red region.
  • the luminance of the silica glass fine particles is proportional to (luminous efficiency x number of nanoparticles dispersed in one silica glass fine particle).
  • the number of semiconductor nanoparticles dispersed in the silica glass fine particle can be counted almost accurately by observation with a transmission electron microscope at an acceleration voltage of 200 KeV or higher. However, when the size of the silica glass fine particles approaches 100 nm, the acceleration voltage is preferably about 300 KeV. Since the shape and size of the nanoparticles are almost constant, even if there is particle overlap along the electron traveling direction of the transmission electron microscope, if the particles do not overlap completely, the overlap is caused by discontinuous changes in the particle outline. Can be determined. For further accuracy, an electron tomography technique can be used by sequentially changing the angle of the sample to capture an image and displaying it three-dimensionally with dedicated software.
  • At least about 30 silica glass particles in the field of view selected at random from the observation sample are selected, and a histogram is created by counting the number of nanoparticle dispersions in the particles. , Average after confirming that the distribution is not biased.
  • the number of dispersed nanoparticles it is also possible to derive the number of dispersed nanoparticles by dissolving silica glass fine particles with an acid and determining the molar ratio of each component by chemical analysis. At this time, if the nanoparticle is also chemically analyzed to determine its composition, an accurate value can be obtained, but otherwise the approximate composition can be determined from the particle size of the nanoparticle, so the dispersed nanoparticle It is possible to estimate the number.
  • Quantification of eluted cadmium Semiconductor nanoparticles have a large specific surface area, and as described in the background art, surface defects have a great influence on the light emission characteristics. In order to avoid cell death, it is preferable that the amount of eluted cadmium under conditions close to use in bio-application (in the buffer solution, the concentration of nanoparticles is as low as about 10 nM or less). However, in addition, since elution always occurs from the surface of the semiconductor nanoparticles, a small amount of elution leads to less surface defects and also prevents a decrease in luminous efficiency. For this reason, quantification of the amount of elution is important for examining the degree of practicality.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the prepared silica glass fine particles or commercially available polymer-coated nanoparticles are dispersed, and a solution which is left for a predetermined time is filtered through a filter, and the Cd concentration in the filtrate is measured by ICP mass spectrometry.
  • the eluted Cd is quantified using this, the amount decreases with time. This is because the amount of Cd decreases because the eluted Cd forms an aggregate with the components in the DMEM with time, thereby growing to the same size as the semiconductor nanoparticles and being stopped by the filter. This is also suggested by the fact that there is no correlation with the amount of Se eluting at the same time.
  • the Hepes solution is also a frequently used buffer solution, which is ideal because it has been reported that the binding to metal is below the measurement sensitivity. For this reason, a Hepes buffer is used for the evaluation of eluted cadmium. Moreover, the amount of elution is converted and compared when the dispersion concentration of the semiconductor nanoparticles is 10 nM.
  • Example 1 CdSe / ZnS nanoparticles (CdSe core, ZnS shell) with a synthetic surface of silica glass fine particles covered with dodecylamine are known methods (Nano Letters, Volume 1, Page 207 (2001)) and Colloids and Surface IS, Volume 202, 145 pages (2002)).
  • the nanoparticles were dispersed in a toluene solution at a concentration of 20 ⁇ M, and the luminous efficiency was measured to be 35%.
  • the emission wavelength was about 620 nm, and the half width (full width at half maximum) of the emission spectrum was about 33 nm.
  • fluorescent nanoparticle-dispersed silica glass fine particles were produced through the three steps 1 to 3 shown in FIGS. 1A to 1C. Unless otherwise stated, the synthesis was carried out at room temperature and in the atmosphere.
  • Step 1 tetraethoxysilane (TEOS, 10 ⁇ L) was added to a toluene solution (0.4 mL, 1.5 ⁇ mol / liter) in which nanoparticles were dispersed, and the mixture was stirred for 3 hours to obtain an organic solution A.
  • Nanoparticles in the solution, 4 of the tetrafunctional TEOS only one ethoxy group by hydrolysis (Et-O) 3 -Si- O - distribution what becomes (where Et represents an ethyl group) and It is thought that it acts as a surfactant and acts as a surfactant, covering the surface in an orderly manner. In this state, almost no decrease in luminous efficiency was observed.
  • Step 2 3-mercaptopropyltrimethoxysilane (MPS, 1 ⁇ L) was mixed with ethanol (25 mL) and aqueous ammonia (4 mL, ammonia concentration 10 wt%) to obtain an aqueous solution B.
  • MPS 3-mercaptopropyltrimethoxysilane
  • ethanol 25 mL
  • aqueous ammonia 4 mL, ammonia concentration 10 wt%)
  • Step 3 0.5 mL of the aqueous solution in which the aggregate was dispersed was taken out, ethanol (8 mL) and ammonia water (0.1 mL, 25 wt%) were added, and TEOS (14 ⁇ L) was further added.
  • a silica glass layer was formed on the surface of the semiconductor nanoparticle aggregate to form fluorescent silica glass fine particles.
  • the nanoparticle was dispersed at a concentration of about 1 ⁇ M.
  • the luminous efficiency at this time was measured to be 31%. Luminous efficiency did not change even when this solution was re-dispersed in a Hepes pH 7.4 solution (Hepes concentration 10 mM) at a nanoparticle concentration of 10 nM. Further, even when the solvent was removed and measurement was performed with an integrating sphere as a dry powder, the same luminous efficiency was exhibited.
  • the step 3 described above was performed at 40 ° C. to produce silica glass fine particles.
  • the weight of eluted cadmium was measured and shown in Table 1.
  • Hepes Buffer Solution 4.766 g of commercially available Hepes (DOJINDO 348-01372 manufactured by Dojindo Laboratories Co., Ltd.) is dissolved in 160 mL of ultrapure water. Next, 1N aqueous sodium hydroxide solution is gradually added to adjust the pH to 7.4. Furthermore, ultrapure water is added to make 200 mL, and it is stored in a refrigerator at about 4 ° C. as a stock solution. Remove 10 mL from this stock solution and dilute to 100 mL with ultrapure water. As a result, a 10 mM Hepes buffer is prepared.
  • Quantification of the cadmium ion concentration in the filtered solution was performed according to the following procedure.
  • nitric acid has the effect of stabilizing elements in the sample and preventing the sample from adhering to the walls of the analyzer.
  • An ICP mass spectrometer (ThermoFisher SCIENTIFIC, Finningan ELEMENT 2) was used for the measurement. A standard curve was drawn in advance using a standard sample.
  • Example 2 The silica glass fine particles produced in Example 1 have hydroxyl groups on the surface. In order to apply it to the bio field as a fluorescent probe, this surface was modified with various functional groups, and an antibody was attached.
  • Fine particles after forming the silica glass layer were dispersed in pure water, 0.5 mL of fine particles (nanoparticle concentration of 1 ⁇ M) were taken out, and added to a mixture of 2 ⁇ L of MPS and 30 ⁇ L of ethanol. After stirring, the mixture was precipitated by centrifugation, washed with pure water, and dispersed in a PBS (concentration 10 ⁇ M) solution to make 0.5 mL. Of this, 0.1 mL was taken out and at 4 ° C., 10 ⁇ L of PBS buffer solution in which the concentration of maleimide with streptavidin was 200 mM was mixed with the silica glass fine particle dispersion.
  • PBS concentration 10 ⁇ M
  • rat fetal hippocampus-derived neurons E18
  • an anti-microtubule-related protein anti-microtubule-associated protein
  • bovine serum albumin was attached to the surface of streptavidinized silica glass fine particles to remove non-specific adsorption, and then bound with biotinylated anti-influenza A virus antigen antibody.
  • this was used as a fluorescent probe (fluorescent reagent) at the time of immunochromatography, it was possible to determine from the fluorescence intensity of the test line whether or not the sample contained influenza A virus antigen.
  • silica glass fine particles had an average particle size of about 47 nm. With such a particle size, electrons pass through the fine particles in transmission electron microscope observation, so it was relatively easy to count the number of semiconductor nanoparticles contained therein. However, if particles overlap when viewed from the direction in which the electron beam travels, they may be counted off. In order to avoid this, it is effective to look at the particle shape and determine that there is an overlap when there are discontinuous boundaries. By randomly selecting and photographing 30 silica glass fine particles and counting the number of semiconductor nanoparticles distributed therein, an almost accurate average distribution number N 2 was obtained as 22.
  • a dry powder sample (about 4 mg for silica glass fine particles, about 2 mg for CdSe / ZnS nanoparticles only) wrapped in medicine paper is weighed and placed in a Teflon (registered trademark) container, and hydrofluoric acid and nitric acid are added simultaneously. After sealing, the sample was dissolved by heating to about 200 ° C. with a microwave sample pretreatment device (Milestone General).
  • the average particle diameter of one silica glass fine particle is 47 nm
  • the average particle diameter of semiconductor nanoparticles is 5.8 nm
  • the density of the silica glass fine particles is known in the literature (Advanced Material). 21, 4016, 2009, and New Journal of Chemistry, 33, 561, 2009), 1.5 g / cm 3 .
  • 30% or more of the atoms are located on the surface, which causes a deviation from the stoichiometric composition ratio. Nevertheless, in order to accurately estimate the number of semiconductor nanoparticles dispersed in the silica glass fine particles, it is necessary to devise the calculation as follows.
  • the atomic weights of cadmium selenide and zinc sulfide constituting the nanoparticles are determined to be 131.8 and 158.9, assuming that the respective compositions are Cd 1 Se 0.25 and Zn 1.46 S 1.97 .
  • Si all as in the form of SiO 2, obtained as 1737.
  • This volume ratio between the silica glass particles one volume, the volume of CdSe / ZnS nanoparticles of the silica glass in the fine particles, 2660Nm 3, and the volume of one nanoparticle is 102 nm 3. From this, the number N of semiconductor nanoparticles contained in one silica glass fine particle was derived as 26.
  • Example 3 When the amount of MPS used in “Synthesis of silica glass fine particles” in Example 1 was reduced to 0.5 ⁇ L, the aggregate of formed nanoparticles became large. The aggregate surface was coated with silica glass in the same manner as in Example 1 to obtain fluorescent fine particles. At this time, when the semiconductor nanoparticles were dispersed in a Hepes solution at a concentration of 10 nanomol / liter, the luminous efficiency was about 25%. Electron microscope observation revealed that the fluorescent fine particles had an average particle size of 95 nm. It was also confirmed that at least 160 nanoparticles were dispersed.
  • Example 4 When the amount of MPS used in “Synthesis of silica glass fine particles” in Example 1 was increased to 2 ⁇ L, the aggregate of nanoparticles formed was reduced. The aggregate surface was coated with silica glass in the same manner as in Example 1 to obtain fluorescent fine particles. At this time, when the semiconductor nanoparticles were dispersed in a Hepes solution at a concentration of 10 nanomol / liter, the luminous efficiency was about 25%. Electron microscope observation revealed that the fluorescent fine particles had an average particle size of 21 nm. In addition, it was confirmed that an average of 11 nanoparticles were dispersed.
  • Example 5 By using a sodium salt of carboxyethylsilanetriol (Carboxyethylsilanetriol, sodium salt, abbreviated as CES), the surface could be modified with a carboxyl group or a salt thereof.
  • Carboxyethylsilanetriol sodium salt, abbreviated as CES
  • Step 3 of Example 1 instead of pure TEOS, TEOS with 5% molar ratio of CES was added after stirring for 48 hours to modify the surface with a sodium salt of a carboxyl group.
  • the obtained fluorescent fine particles could be obtained.
  • the surface could be modified with an amino group by using aminopropyltrimethoxysilane.
  • water-soluble carbodiimide By allowing water-soluble carbodiimide to act on this, it was possible to bind to a carboxyl group on the cell surface.
  • Example 6 The fluorescent fine particles produced in Example 1 were vacuum-dried, adhered to a glass substrate, and irradiated with a commercially available light-emitting diode (emission wavelength: 385 nm), which showed red light emission. By reducing the average particle size of the nanoparticles inside, blue and green fluorescent fine particles were obtained in the same manner. Specifically, when the average particle size of CdSe / ZnS nanoparticles is about 3.3 nm (of which the ZnS shell thickness is about 0.5 nm and the CdSe core size is about 2.3 nm), blue-emitting fluorescent fine particles are produced.
  • the thickness was about 5.1 nm (the ZnS shell thickness was about 0.5 nm and the CdSe core size was about 4.1 nm), green-emitting fluorescent fine particles were obtained. Further, the average particle diameter of the red light-emitting (peak wavelength of about 620 nm) nanoparticles used in Example 1 was about 5.5 nm. Since the emission color is determined by both the core size and the shell thickness, the emission color may not be the same even if the average particle diameter is the same.
  • the average particle size of the nanoparticles can be adjusted by the reaction time during synthesis by a known solution method. It has been found that these fluorescent fine particles can also be used as phosphors for electronic materials such as lighting and displays.
  • Example 7 The difference of the product according to the synthesis conditions was systematically investigated. The experiment was performed in the same procedure as in Example 1. Table 3 shows the synthesis conditions of Steps 2 to 3, the luminous efficiency of the synthesized product, and the particle size of the silica glass fine particles. The reaction time in the table indicates the reaction time of Step 3.
  • FIG. 4 shows transmission electron microscope images of the synthesized silica glass fine particles (1) to (4).
  • Numbers (1L), (2L), (3L), and (4L) in the figure indicate enlarged images of silica glass fine particles (1), (2), (3), and (4), respectively.
  • the silica glass layer thickness is approximately 20 nm, 10 nm, 7 nm, and 13 nm, respectively.
  • the silica glass fine particle luminous efficiency is 25% and the particle size is 90 ⁇ 9 nanometers. It became.
  • Example 8 The modified manufacturing method described in [Means for Solving the Problems] was used.
  • Step 2 4 mL of ethanol and 0.1 mL of water were added to this solution, and 10 ⁇ L of TEOS and aqueous ammonia (6.3% by weight, 0.3 mL) were gradually added.
  • the alkoxide attached to the surface of the nanoparticles prepared in Step 1 was hydrolyzed to become hydrophilic, and touched TEOS while moving into the aqueous solution to form an aggregate.
  • the particles were removed by centrifugation and observed with a transmission electron microscope, as shown in FIG.
  • FIG. 4 it can be seen that the nanoparticles in the aggregate are regularly arranged. In this case, about 30 nanoparticles are observed in the aggregate.
  • the luminous efficiency was approximately 25%. With such an ordered arrangement, the concentration of nanoparticles dispersed in the glass beads can be increased, and high-brightness glass beads were obtained.
  • the emission wavelength was 652 nm. At this time, the particle size of the glass beads was approximately 70 nm.
  • step 3 the surface could be covered with a silica glass layer.
  • the final glass bead particle size was approximately 90 nm.
  • Example 9 Take out a toluene dispersion of CdSe / ZnS nanoparticles with an emission wavelength of 610 nm (concentration 1.5 micromol / liter, capacity 0.4 mL), add TEOS 10 microliter and MPS 0.05 microliter, and stir for 3 hours to organic Solution A was obtained. Separately, MPS 0.15 microliter, ethanol 25 mL, ammonia water (6.25 wt%) 1.5 mL, and water 2 mL were mixed to obtain an aqueous solution B. When the organic solution A and the aqueous solution B were mixed, the nanoparticles moved from the organic solution to the aqueous solution. This was further stirred for 3 hours to obtain an aggregate of nanoparticles.
  • the aggregate size of the nanoparticles was 25 nm, and the number of nanoparticles contained therein was approximately 15. Further, a silica glass layer was formed using TEOS by the Stover method according to the method of Step 3 of Example 1. The final glass bead size was approximately 30 nm. The luminous efficiency was 25%.

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Abstract

半導体ナノ粒子が集合した、高耐久性で高輝度の微粒子を作製することを目的とする。 CdおよびSeを含む半導体ナノ粒子がケイ素を含む微粒子中に分散している蛍光性微粒子であって、 前記ケイ素を含む微粒子の平均粒径が２０～１００nmであり、且つ、 前記ケイ素を含む微粒子中に分散している半導体ナノ粒子の数が１０個以上である、蛍光性微粒子。

Description

ゾル－ゲル法によって作製した半導体ナノ粒子分散蛍光性微粒子
　本発明は、高発光効率の半導体ナノ粒子を多数、分散した高耐久性のシリカガラス系微粒子の作製法と、その応用に関するものである。
　希土類イオン、遷移金属イオン等を無機材料に分散させた蛍光体は、有機色素に比べると耐久性に優れているため、従来より照明、ディスプレイ等に使用されてきた。しかし、その輝度および演色性は必ずしも十分ではなかったため、それらを凌ぐ高輝度の蛍光体が要望されていた。これを実現する可能性が高い新しい高性能蛍光体として、半導体ナノ粒子（粒径数ｎｍ、希土類イオンおよび遷移金属イオンをドープしていないもの；以下、単に「ナノ粒子」と言うこともある。「量子ドット」と呼ばれることもある）が近年、大変、注目されている。これは、半導体ナノ粒子は、同一波長の紫外線を照射した場合でも粒径に応じて様々な波長の明るい蛍光を発するため演色性に優れ、発光の減衰時間が短いので輝度を高くできるためである。半導体ナノ粒子を注意して作製すれば、粒子１個１個の発光を別々に検出および分光できるほどに輝度が高いために、ディスプレイおよび照明以外に、生体分子に結合させて蛍光プローブとして生命の仕組みの解明、病気の診断等に用いる応用分野が大きく発展しようとしている。
　このような蛍光体となる半導体は、主にII-VI族半導体（硫化カドミウム(CdS)、セレン化亜鉛(ZnSe)、セレン化カドミウム(CdSe)、テルル化亜鉛(ZnTe)、テルル化カドミウム(CdTe)とこれらの混晶等）およびIII-V族半導体(リン化インジウム(InP)等)である。これらの半導体は直接遷移を示し、発光寿命が約１０ナノ秒と、従来の禁制遷移の性格をもつ希土類イオンまたは遷移金属イオンを用いた蛍光体よりも約５桁短く、このためにはるかに高輝度の蛍光が得られる。
　このような高輝度発光する半導体ナノ粒子については、水溶液中で合成する方法（親水性のナノ粒子が合成される）と水を高度に排除した有機溶液（無極性溶媒）中で合成する方法（疎水性のナノ粒子が合成される）の２つがある。ナノ粒子は比表面積が大きいために、表面エネルギーを下げようとして溶液中では徐々に凝集して発光効率が低下する。このため、どちらの方法によって合成されたナノ粒子でも、溶液のままでは応用しにくいという問題があった。これを解決するには、半導体ナノ粒子を透明なマトリックス中に分散固定する形で閉じ込め、種々の環境下で長期にわたって初期の特性を維持する固体材料とする必要がある。そのための固体マトリックスとしては、ガラスと有機高分子材料の２つが挙げられる。このなかでもガラス、とくにシリカガラスは、有機高分子と比較して透明性が高く、紫外線照射に強い。また網目構造を持たせることで、水分および酸素を通しにくくなり、分散したナノ粒子の劣化を長期にわたって防ぐことができる。このためのガラスの作製には、ゾル－ゲル法が有利である。なぜならば、ゾル－ゲル法では、常温常圧付近の穏やかな条件下でガラス化が進むので、作製法を工夫すれば半導体ナノ粒子は、溶液法で合成された直後の高い発光効率を保持したまま、透明なガラス中に分散固定されるからである。ゾル－ゲル法では水を使用するので、親水性のナノ粒子を使うほうが、凝集および消光を防ぐために好都合である。
　ここで、「シリカガラス」という言葉について説明を加える。ゾル－ゲル法で作製したガラスは、有機物と水を含むにも拘わらず、関連する学会では、ガラス、シリカ、シリカガラス、シリカ系ガラス、アモルファスシリカ、SiO2等と呼ばれている。これは、作製した固体マトリックス中に、ケイ素が作る網目構造を修飾する他の金属イオンを持たないためである。そこで、本願明細書においても、ゾル－ゲル法で作製したケイ素を含むマトリックスをガラス、シリカまたはシリカガラスと呼ぶ。
　この蛍光性ガラスとして我々は、バルク状のガラス（特許文献１）、ガラス微粒子（特許文献２、３および４）ならびにガラス薄膜（特許文献５）を開発した。このうちガラス微粒子（粒径１０ｎｍ～２マイクロメートル、粒子が完全な球形でない場合、たとえばラグビーボール型（対称軸方向に長い回転楕円体）、パンケーキ型（偏平な回転楕円体）等の場合は、本願明細書では３つの慣性主軸の長さの平均を粒径と定義する。完全な球の場合は直径が粒径となる）は、ディスプレイ、照明等の発光デバイス用の粉体状の蛍光体として用いることができるほかに、生体分子に結合して蛍光プローブとして用いる用途が重要である。以下では、この蛍光性のシリカガラス微粒子に限定して記述する。
　本発明者らによる上記の特許文献２、３および４では、アルコキシドを加水分解および脱水縮合させるというゾル－ゲル法が用いられる。その中でも、逆ミセル法（油相中に分散した微小水玉中でゾル－ゲル法を進行させる方法で、水分散性のナノ粒子を予め水玉中に分散させておく）またはストーバー法（加水分解したアルコキシドをナノ粒子表面に降り積もらせる）を用いて、複数の半導体ナノ粒子を、シリカガラス微粒子中に高い発光効率（２５％以上）で分散させる技術を開発した。
　ところが、作製したシリカガラス微粒子を蛍光プローブとしてバイオの分野で応用する場合には、蛍光特性の評価の条件が、材料作製の場合とは通常、大きく異なる。
　シリカガラス微粒子は粒径が１００ｎｍ程度またはそれ以下であれば散乱が少ないので、溶液に分散させたまま、光路長１センチの石英セルに導入し、それを汎用の吸光分光光度計および蛍光分光光度計で測定する。これによって、波長ごとの吸光度および蛍光強度を得る。散乱の影響が懸念される場合には積分球を用いるが、この時は吸光度、蛍光強度ともに散乱がない場合に比べて誤差が大きくなる。この場合も最近は汎用の測定装置が市販されている（例えば、浜松ホトニクス（株）のC9920-02）。
　合成時の半導体ナノ粒子の濃度は通常１～１０μＭ（マイクロモル／リットル、半導体ナノ粒子の数であり、それを構成する原子の数ではない）の程度であり、これをそのまま冷暗所に保管する。発光効率の測定時には、この濃度では濃すぎるので２００～３００ｎＭ程度に薄める。そうすると、汎用の吸光分光光度計または蛍光分光光度計で最も測定しやすい信号量が得られる。溶媒は純水であることが多い。一方で、蛍光プローブとして応用する際には、１個または数個程度のナノ粒子からの蛍光を別々に検出することが多く、その場合にはナノ粒子の濃度として高々１０ｎＭの程度となり、しかも生理食塩水のような高濃度の塩中に分散される。また、照射光強度も通常、１０Ｗ／ｃｍ２以上の値となり、分光器の場合より桁違いに強い。このように、材料合成の観点から見ると極端にナノ粒子の分散濃度が低く、溶液中に多量の塩類が含まれる場合には、たとえガラスにコートされていても、ナノ粒子が劣化する場合があることがわかってきた。このような劣化を抑えるためには、ガラス網目構造を発達させることが一つの有力な手段である。さらに、１つのナノ粒子をガラスコートするよりも、ナノ粒子を複数個閉じ込めて１つのガラス蛍光微粒子とするほうが、輝度を上げるためにはより好ましい。
　後述するように、上記特許文献２～４に記された中でもCdとSeを含むナノ粒子、例えばCdSeナノ粒子を用いることが劣化を防ぐために有効であることを我々は見出した。ところが、発光効率の高いCdSeナノ粒子は高度に水を排除した有機溶液法によって作製され、そのまま水溶液に分散させると消光する。このため、発光効率を保ちつつCdSeナノ粒子をガラス微粒子に分散させること、特に、輝度を上げるためにできるだけ多数のナノ粒子を分散させることが望ましい。
　さらに、バイオ分野での応用可能性を探ると、蛍光微粒子は１００ｎｍ以下の粒径が有用であることがわかってきた。細胞は１０～３０μｍが典型的な大きさであり、粒子サイズが１００ｎｍを超えると細胞が食作用で取り込む確率が減少する。また、細胞内部を染め分ける場合でも、１００ｎｍを超えて２００ｎｍに近づくと光学顕微鏡で形が見え始める領域となるので、きれいな染色には不向きである。一方で、半導体ナノ粒子の粒径は、数ナノメートルであり、桁違いに輝度を上げるためには、ナノ粒子１０個以上を分散した微粒子が必要となり、このためにはおよそ２０ｎｍ以上の粒径が必要となる。
　次に、CdとSeを含むナノ粒子が分散されたシリカガラス微粒子として知られているものと、その発光特性について調べた。
　CdSe/ZnSナノ粒子をゾル－ゲル法でガラス中に分散固定した蛍光性のシリカガラス微粒子、及びその作製方法が、バベンディらによって報告されている（非特許文献１）。この作製方法は、予め有機溶媒中で合成したナノ粒子の表面を、アミノ基を有するアルコキシド（３－アミノプロピルトリメトキシシラン）およびアミノ基を有するアルコール（５－アミノ－１－ペンタノール）で覆い、別途用意した直径数百ｎｍのシリカガラス微粒子の表面に厚さ５０ｎｍ程度の層として接着させるという方法である。この方法によれば、ナノ粒子を含まないシリカガラス微粒子の表面に、ナノ粒子を含有するゾル－ゲルガラス層がコートされた構造の蛍光性ガラス微粒子が得られる。しかし、ガラス微粒子の表層付近にのみナノ粒子が存在し、ガラス微粒子の核にはナノ粒子が含まれていないため、ガラス微粒子中のナノ粒子の分散濃度を高めることができなかった。また、発光効率は１３％程度であった。
　別の作製方法として、CdSe/ZnSナノ粒子の表面にチオール基を有するアルコキシド等を成長させ、１個のシリカガラス微粒子中に１個のナノ粒子を含むシリカガラス微粒子を作る方法が報告されている（非特許文献２）。この場合の発光効率は、５～１８％と報告されている。類似の方法で作製したCdSe/ZnSナノ粒子１個を含む粒径３０ｎｍ～１μｍのシリカガラス微粒子が報告されているが発光効率については記載がない（非特許文献３）。
　マイヤーリンクらは、１個のナノ粒子を１個のシリカガラス微粒子に導入することを目的として、CdSe/CdS/Cd0.5Zn0.5S/ZnS（CdSeを核としてCdS、Cd0.5Zn0.5SおよびZnSが順次コートされている）ナノ粒子を、逆ミセル法によってシリカガラス微粒子中に導入した。しかしながらそのメカニズムの検討から、加水分解されたアルコキシドは、ナノ粒子に対する親和性が高いために作製時にナノ粒子表面に配置されていた配位子を置き換え、これによって発光が消光されるとしている。このため、ナノ粒子が１個だけ入っているシリカガラス微粒子においてその発光効率は作製直後に急激に低下し、さらには徐々に低下して１週間後にはシリカガラスに入れる前の状態の２％（絶対値としては始めの６０％から１．２％へ低下）の程度となった。このようなシリカガラスによる消光効果をなくすために、特別に厚いシェルを作ったナノ粒子を用いると、発光効率が最高で３５％まで上昇した（非特許文献４）。しかし、このように特別に厚いシェルを作ったナノ粒子は、粒径が大きくなり、バイオ分野への応用には適さない上に、そのようなナノ粒子を作製するのは困難となる。
　水分散性のCdSeナノ粒子（クエン酸コート）を作製し、それを複数個、シリカガラス微粒子中に導入した研究も知られている。しかし水分散性のCdSeナノ粒子は発光効率が０．１～０．１５％と極端に低い（非特許文献５）。ナノ粒子をシリカマトリックス中へ導入したときの発光効率については記述がないが、普通は発光効率がさらに減少するので、これを蛍光体と呼ぶことはできない。また、同じく水分散性のCdSeナノ粒子を逆ミセル法によってシリカ粒子中に導入した比較的最近の文献（非特許文献６）の場合も、発光効率は高々1.48％であり、蛍光体と呼ぶことはできない。特許文献６に例示されるように、蛍光体と呼ぶことができる凡その目安は発光効率２０％以上である。
　このように、CdおよびSeを含むナノ粒子を１０個以上分散する、粒径２０～１００ｎｍの蛍光性シリカ微粒子を作製する方法は、開発されていなかった。
　一方で、線状の高分子を用いて複数のナノ粒子の集合体を作る方法が最近、報告されている（非特許文献７）。この方法で作製するポリマー粒子は、動的光散乱によって測定した平均粒径が112 nmと報告されているが、粒径100 nm以下のものを作るのは現状では困難である。この集合体の表面をさらにガラス被覆することも可能であるが粒径がさらに増加する。また、一般に、ポリマーを含まないガラス材料のほうが耐久性に優れており、またＣｄの溶出量も少ないことから、ポリマーを用いずに、多数の半導体ナノ粒子が分散したガラス材料を作ることが要求されている。
特許第４３６６５０２号 特許第３６７７５３８号 特許第３７５５０３３号 再表２００７／０３４８７７号公報 特開２００６－２８２９７７号公報 特許第４５５５９６６号
チャン、ツィンマー、ストロー、ステッケル、ジャイン、バベンディ、アドバンスド　マテリアルズ、16巻、2092頁(2004) ゲリオン、ピノー、ウィリアムス、パラック、ザンチェト、ワイス、アリビサトス、ジャーナル　オブ　フィジカルケミストリー　ビー、105巻、8861頁(2001) ナン、ムルバニー、アンゲバンテ　ヒェミー　インターナショナル　エディション、43巻、5393頁(2004) クール、シューネベルト、ヒルホスト、ドネガ、ハート、ブラーデレン、バンマエケルベルク、マイヤーリンク、ケミストリー　オブ　マテリアルズ、20巻、2503頁(2008) ロガッシュ、ナゲーシャ、オストランダー、ギールジッヒ、コトフ、　ケミストリー　オブ　マテリアルズ、12巻、2676頁(2000) チュー、ソン、シュ、ジャーナル　オブ　ナノパーティクル　リサーチ、10巻、613頁（2008） ヤング、デイブ、ガオ、ジャーナル　オブ　アメリカン　ケミカル　ソサエティー、130巻、5286頁(2008)
　本発明の目的は、耐久性が高く、多数の高発光効率のナノ粒子を分散した平均粒径２０～１００ｎｍのシリカガラス系蛍光微粒子を提供することである。さらに、それをバイオ分野に応用するための手法を示すことも本発明の目的とする。
　上記の課題を解決するために、まずバッファー溶液中に希薄な濃度で分散させたナノ粒子の安定性について調べた。そうしたところ、CdとSeを含むナノ粒子が最も優れていることがわかったので、これを用いることとした。このナノ粒子の表面にZnS, ZnSe, CdS等のシェルを有しているとさらに優れている。但しこのシェルは、Cd, Zn, Se, S等の組成がシェルの厚み方向で変化する傾斜組成であっても良い。また、ナノ粒子を分散させるシリカガラス系微粒子について、目的とする粒径領域（２０～１００ｎｍ）では、逆ミセル法よりもストーバー法が粒径を揃えるために適していることを見出し、以下の３つのステップからなる合成法を開発した。以下の工程（Ａ）、工程（Ｂ）、工程（Ｃ）は、それぞれ、請求項での呼び名に対応している。なお、以下の金属アルコキシド（１）および金属アルコキシド（２）に含まれる金属としてケイ素を含むものを用いるのが、加水分解の速度を制御するという観点から好ましい。
　ステップ１（請求項の工程（Ａ））
　CdとSeを含む親油性の半導体ナノ粒子に、適量の金属アルコキシド（１）を添加して適度に加水分解させることで、ナノ粒子表面を金属アルコキシド（１）の加水分解物で置換する。得られる溶液を有機溶液Ａとする。この工程では、ナノ粒子の表面を金属アルコキシド（１）が界面活性剤のように覆うことで、発光効率の低下が抑えられる。
　ステップ２（請求項の工程（Ｂ））
　水溶液中に金属アルコキシド（２）を分散させ、部分的に加水分解することで水溶液Ｂを得る。金属アルコキシド（２）は金属アルコキシド（１）よりも加水分解速度が遅いものを選択する。水溶液Ｂを有機溶液Ａと混合することで、金属アルコキシド（１）が覆われた半導体ナノ粒子の表面にさらに金属アルコキシド（２）の層が形成される。水に触れた半導体ナノ粒子は、その表面の金属アルコキシドの加水分解が進むので親水性となり水相に移動する。このとき、ナノ粒子同士が集合体を作る。表面付近にある金属アルコキシシド（２）は、ステップ１で用いた金属アルコキシド（１）よりも加水分解のスピードが遅いので、水相に移動したときに半導体ナノ粒子表面のアルコキシドが一気に脱水縮合を起こして集合し、大きな塊となることを防ぐ役目を果たす。このため、金属アルコキシド（２）の量が多いと小さな集合体ができ、少ないと大きな集合体ができる傾向にある。ここで用いる水溶液Ｂにアルコールを添加すると、有機溶液Ａとの接触面積が増えて反応時間が短縮される。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等が例示される。
　ステップ３（請求項の工程（Ｃ））
　水相中の集合体にさらにシリカガラス層を堆積させることで、半導体ナノ粒子分散シリカ微粒子を作製する。これは、通常のストーバー法により、アルカリ性領域でわずかな量の金属アルコキシド（３）を、大量の水とアルコールで加水分解、核となるナノ粒子集合体に堆積させることで行える。このようにして得られた微粒子は、必要に応じて分離、洗浄する。金属アルコキシド（３）は、金属アルコキシド（１）または（２）と同じであっても良い。
　なお、上記の作製方法を変形して、上記のステップ１で、金属アルコキシド（１）とそれよりも加水分解速度の遅い金属アルコキシド（２）を同時に加えて有機溶液Ａを得ることも可能である（請求項の工程（Ａ１））。このとき、ステップ２では、金属アルコキシド（３）およびアルカリ性水溶液を加え、有機溶液Ａのナノ粒子表面を親水性にして水相に転換させると同時に集合体を形成させる（請求項の工程（Ｂ１））。この場合、２種の金属アルコキシド（１）および（２）がナノ粒子表面を覆うことになり、その影響でナノ粒子が規則的に配列した集合体が得られる場合があった。この後に上記のステップ３を適用して、ナノ粒子集合体の表面をさらにシリカガラスの層で保護することも可能である。
　この作製法をより一般的に記述すると次のようになる。
　まず親油性の半導体ナノ粒子を分散した無極性溶媒中に金属アルコキシドＡ及びＢを添加して攪拌することで有機溶液Ｘを得る。ここで、金属アルコキシドＡのほかにそれよりも加水分解速度の遅い金属アルコキシドＢも同時に加えることで、次の段階の集合体形成時の相互の距離や発光効率を制御できる。無極性溶媒としては、トルエンのほかに、ヘキサン、ベンゼン、ジエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル、塩化メチレンなどが例示される（請求項の工程（Ａ２））。この工程では、親油性の半導体ナノ粒子の表面が部分的に加水分解した金属アルコキシドＡ及びＢで置換される。次にこの有機溶液Ｘを、金属アルコキシドＡ又はＢ並びに水を含む溶液Ｙに接触させて、有機溶液Ｘ中の半導体ナノ粒子を溶液Ｙに移動させる（請求項の工程（Ｂ２））。この工程では、有機溶液Ｘ中の半導体ナノ粒子の表面に付着したアルコキシドＡ及びＢが、水に触れることで加水分解が進行して親水性になることを利用して相移動を起こさせている。水に移ると、さらにアルコキシドの加水分解または脱水縮合が進行するので、半導体ナノ粒子の集合体が形成される。このあと、必要に応じてその表面をシリカガラスコートし、また、表面を官能基で修飾すればよい。
　本発明者らは、このように工夫されたゾル－ゲル法によって作製されたCdとSeを含む半導体ナノ粒子分散蛍光性シリカガラス微粒子は、２０～１００ｎｍの平均粒径を実現し、有機溶液中の発光効率をほぼ維持したままナノ粒子が密に詰まった集合体を形成し、シリカ網目構造の影響でバイオ用の緩衝液中で１０ｎＭ程度の濃度まで薄めても発光効率の低下、カドミウムイオンの溶出等の劣化を起こしにくいことを確認し、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は下記記載の高耐久性で高輝度の半導体ナノ粒子分散微粒子と、そのゾル－ゲル法による作製法とを提供するものである。本発明では、有機溶液中の発光効率が30％のナノ粒子を用いれば、作製される蛍光性微粒子の発光効率も30％に近い値となる。有機溶液中の発光効率が70％のナノ粒子を用いれば、発光効率が70％に近い蛍光性微粒子が得られる。
項１．CdおよびSeを含む半導体ナノ粒子がケイ素を含む微粒子中に分散している蛍光性微粒子であって、
前記ケイ素を含む微粒子の平均粒径が２０～１００nmであり、且つ、
前記ケイ素を含む微粒子中に分散している半導体ナノ粒子の数が１０個以上である、蛍光性微粒子。
項２．前記ケイ素を含む微粒子の平均粒径が４０～１００nmであり、且つ、前記ケイ素を含む微粒子中に分散している半導体ナノ粒子の数が２０個以上である、項１に記載の蛍光性微粒子。
項３．前記ケイ素を含む微粒子中に分散した半導体ナノ粒子が規則的に配列している、項１又は２に記載の蛍光性微粒子。
項４．発光効率が２０％以上である、項１～３のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
項５．グッド緩衝液試薬であるヘペス（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）のpH7.4溶液（ヘペス濃度10ミリモル／リットル）に、半導体ナノ粒子の濃度として10ナノモル／リットルで分散させたときに、発光効率が20％以上である、項１～４のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
項６．グッド緩衝液試薬であるヘペス（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）のpH7.4溶液（ヘペス濃度10ミリモル／リットル）に、前記半導体ナノ粒子の濃度としてXナノモル/リットルで分散させて室温で15時間経過後のヘペス溶液中へのCdの溶出量Yナノグラム（溶液1ミリリットル中の溶出Cdの重量）が、
10×Y/X< 1
を満たす項１～５のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
項７．半導体ナノ粒子がCdSeおよび／またはCdSeをZnSでコートしたCdSe/ZnSである項１～６のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
項８．ケイ素を含む厚さ２ｎｍ以上の層で覆われている項１～７のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
項９．表面にＣＯＯＨ基、ＮＨ２基、ＳＨ基及びこれらの塩、並びにポリエチレングリコール由来の基よりなる群から選ばれる少なくとも１種類を有する項１～８のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
項１０．蛍光プローブ用である項１～９のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
項１１．電子材料用である請求項１～９のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
項１２．エレクトロルミネッセンスおよび／またはカソードルミネッセンスを示す、項１～１１のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
項１３．（Ａ）CdおよびSeを含む親油性の半導体ナノ粒子を分散した有機溶媒に、金属アルコキシド（１）を添加して攪拌し、有機溶液Ａを得る工程、
（Ｂ）金属アルコキシド（１）よりも加水分解速度が遅い金属アルコキシド（２）を含む水溶液Ｂと、前記有機溶液Ａとを混合して攪拌し、半導体ナノ粒子集合体を得る工程、
（Ｃ）前記半導体ナノ粒子集合体を含むアルカリ性水溶液中に金属アルコキシド（３）を含む溶液を添加し、前記半導体ナノ粒子集合体の表面に被覆層を形成する工程
を含む項１～１２のいずれかに記載の蛍光性微粒子の製造方法。
項１４．金属アルコキシド（２）が、式（ＩＩ）：
　Ｘｎ－Ｓｉ（ＯＲ２）４－ｎ　　　　　（ＩＩ）
（式中、ＸはＣＨ２＝ＣＨ－で示される基、オキシランを含む基、Ｈ２ＮＣｍＨ２ｍ－で示される基、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣｐＨ２ｐ－で示される基、ＨＳＣｑＨ２ｑ－で示される基、又はフェニル基、Ｒ２は低級アルキル基、ｎは１、２又は３、ｍは１～６の整数、ｐは１～５の整数、ｑは１～１０の整数を示す）
で表される化合物である項１３に記載の蛍光性微粒子の製造方法。
項１５．工程（Ｃ）において、加熱する項１３又は１４に記載の蛍光性微粒子の製造方法。
項１６．（Ａ１）CdおよびSeを含む親油性の半導体ナノ粒子を分散した有機溶媒に、金属アルコキシド（１）および金属アルコキシド（１）よりも加水分解速度の遅い金属アルコキシド（２）を添加して攪拌し、有機溶液Ａを得る工程、
（Ｂ１）前記有機溶液Ａに金属アルコキシド（３）およびアルカリ性水溶液を添加し、半導体ナノ粒子集合体を形成する工程
を含む項１～１２のいずれかに記載の蛍光性微粒子の製造方法。
項１７．（Ａ２）CdおよびSeを含む親油性の半導体ナノ粒子を分散した無極性溶媒中に、２種類の金属アルコキシドを添加して攪拌し、有機溶液Ｘを得る工程、
（Ｂ２）前記有機溶液Ｘを金属アルコキシドおよび水を含む溶液Ｙに接触させ、有機溶液Ｘ中の半導体ナノ粒子を溶液Ｙに移動させる工程
を含む項１～１２のいずれかに記載の蛍光性微粒子の製造方法。
　本発明の蛍光性微粒子は、耐久性があり大きな発光効率を持つ半導体ナノ粒子が相当数分散し、その表面が適切に加水分解したアルコキシドで覆われ、それが適切な大きさの集合体をつくり、さらにその周囲がシリカガラスで覆われているので、高耐久性と高輝度という２つの特徴を持つという効果が得られた。また、２０～１００ｎｍという平均粒径であるため蛍光プローブとしてのバイオ分野への応用に適している。なお、半導体ナノ粒子集合体がシリカガラスで覆われていることは、分析電子顕微鏡による該当部分の解析によってケイ素と酸素が含まれることから確認することができる。また、試料を真空乾燥して粉体にした後に、粉末Ｘ線回折（CuのＫα線、1.5406オングストロームを照射）によって角度（２θ）が２３度の付近に半値全幅５度もしくはそれ以上の広い回折ピークが現れることからも確認できる。
実施例１で作製した蛍光性微粒子の製造工程におけるステップ１を示す模式図である。 実施例１で作製した蛍光性微粒子の製造工程におけるステップ２を示す模式図である。 実施例１で作製した蛍光性微粒子の製造工程におけるステップ３を示す模式図である。 実施例１のステップ１における水の濃度と半導体ナノ粒子の発光効率を示すグラフである。 実施例１で作製した蛍光性微粒子の３次元トモグラフィー像の一方向への投影図（２次元写真）である。シリカガラス成分は薄い白色であり、その中に半導体ナノ粒子が濃い白色となって写っているのがわかる。図のスケールについては、半導体ナノ粒子１個の平均粒径（直径）が５．５ｎｍである。 実施例７で作製したシリカガラス微粒子（１）から（４）の透過電子顕微鏡像である。右側の（１Ｌ）から（４Ｌ）は、それぞれ（１）から（４）の拡大像である。 実施例８で作製したナノ粒子が規則的に配列した集合体の透過電子顕微鏡像である。なお、この表面をさらにシリカガラスの層で覆うことも可能である。
　以下、本発明について蛍光性微粒子の作製、用途、評価の順に説明する。
　Ｉ．蛍光性微粒子の作製
　本発明によって作製されるものは、CdおよびSeを含有する蛍光性半導体ナノ粒子１０個以上を、平均粒径２０～１００ｎｍのケイ素を含むマトリックスに分散させた蛍光性微粒子である。作製工程は、１．半導体ナノ粒子の作製、２．ナノ粒子の被覆、３．ナノ粒子集合体の形成および４．集合体のガラス被覆による蛍光性微粒子の作製の４つからなる。また、必要に応じて５．蛍光性微粒子の表面修飾の工程を行ってもよい。電子材料とする場合には、第２工程、第３工程または第４工程で止めればよい。電子材料においてナノ粒子に電子を流す用途では、表面のガラス層、さらにその表面の官能基は不要である場合がある。これらについて、順次説明する。
　第１工程．半導体ナノ粒子の作製
　本発明で使用する半導体ナノ粒子としては、CdとSeを含むもの、具体的にはCdSe、CdSe/ZnS（ZnSでコートされたCdSeナノ粒子）、CdSe/CdS/Cd0.5Zn0.5S/ZnS（CdSeを核としてCdS、Cd0.5Zn0.5SおよびZnSが順次コートされたナノ粒子）、合金組成のCdSexTe1-x(0<x<1))が例として挙げられ、以下の代表的な１０個の公知の方法によって作製される。
・　Dmitri V. Talapin, Andrey L. Rogach, Ivo Mekis, Stephan Haubold, Andreas Kornowski, Markus Haase, Horst Weller, Colloids and Surfaces A, 202, 145(2002). 
・　Dmitri V. Talapin, Andrey L. Rogach, Andreas Kornowski, Markus Haase, and Horst Weller, NANO LETTERS, 1, 207(2001)
・　Z. Adam Peng and Xiaogang Peng, J. Am. Chem. Soc., 123, 1389(2001).
・　C. B. Murray, D. J. Norris, M. G. Bawendi, J. Am. Chem. Soc., 115, 8706(1993).
・　B. O. Dabbousi, J. Rodriguez-Viejo, F. V. Mikulec, J. R. Heine, H. Mattoussi, R. Ober, K. F. Jensen, and M. G. Bawendi, J. Phys. Chem. B,  101 (46), 9463(1997).
・　Lianhua Qu and Xiaogang Peng, J. Am. Chem. Soc., 124, 2049(2002).
・　Xinhua Zhong, Yaoyu Feng, and Yuliang Zhang, J. Phys. Chem. C, 111, 526(2007).
・　Renguo Xie, Ute Kolb, Jixue Li, Thomas Basche, and Alf Mews, J. Am. Chem. Soc., 127,7480(2005). 
・　Robert E. Bailey and Shuming Nie, J. Am.Chem. Soc., 125, 7100(2003). 
・　.S. Jun, E. Jang, J. E. Lim, Nanotechnology, 17, 3892(2006). 
　これらの方法で作製される半導体ナノ粒子の平均粒径はおよそ２～９ｎｍである。
　いずれの場合も、水を排除した有機溶液中での高温の反応を用いる。この第１工程で作製したナノ粒子表面の配位子を、以下の第２工程（ステップ１）で加水分解した金属アルコキシド（１）に置き換えるので、この工程の配位子は結合エネルギーが小さいものが望ましい。具体的な配位子として、アルキル基を持つリン酸化合物（トリオクチルフォスフィン、トリオクチルフォスフィンオキサイド等）、アルキルアミン、オレイン酸等が挙げられる。
　第２工程．ナノ粒子の被覆（ステップ１（請求項の工程（Ａ）））
　この第２工程では、金属アルコキシド（１）を用いたゾル－ゲル法により、第１工程で作製した半導体ナノ粒子の表面に加水分解した金属アルコキシド（１）をコートする。
　半導体ナノ粒子の発光効率を保ったままシリカガラスコートすることは、この数年の学会の関心事であったから、疎水性ナノ粒子がシリカガラスでコートされるとき、もとの表面配位子が取れるのか否かについての論争が続いていた。そして公知の非特許文献（ケミストリー　オブ　マテリアルズ、20巻、2503頁(2008)）により、加水分解されたアルコキシドはナノ粒子に対する親和性が高く、作製時に表面に接着していたアルキルアミンなどの配位子を置換してコートすることが示された。ところが、アルキルアミン配位子が表面欠陥をなくして発光効率を向上させるのに対して、一部分が加水分解したアルコキシドから成る配位子（(Et-O)3-Si-O- ）には消光作用があるために、発光効率が急激に低下すると報告されている。その一方で、なぜ加水分解したアルコキシドに消光作用があるのかは不明とされていた。
　一方で、発光効率を保つためには、ナノ粒子の表面を配位子が密に覆うことが必要とされている。このためには、非特許文献（コロイズ　アンド　サーフェスイズ　エー、202巻、145頁（2002））に説明があるように枝分かれのない１級のアルキルアミンが有用である。
　これらの文献をもとに被覆の条件を探ると、アルコキシドの加水分解速度を遅く、半導体ナノ粒子の濃度を薄く、また、反応時間を長く取れば、アルコキシド加水分解物への表面置換が終わった後もナノ粒子の発光効率がほとんど低下しないことを見出した。つまり、加水分解されたアルコキシドそのものに消光作用があるわけではなく、ナノ粒子の表面にアルコキシドが乱雑に密集すること、表面への接着数が十分でないこと等が、消光に繋がることが判明した。このような過程を解明し、ナノ粒子を消光させずにその表面をアルコキシドの加水分解生成物で覆う方法を見出した。
　具体的には、まず、先の第１工程で作製したアルキル基を持つリン酸化合物；アルキルアミン；オレイン酸等で覆った疎水性ナノ粒子を用意する。この第２工程で用いる金属アルコキシド（１）、次の第３工程で用いる金属アルコキシド（２）、さらに、第４工程で用いる金属アルコキシド（３）の少なくとも３種類のアルコキシドを用意する。これらの金属アルコキシドは、少なくとも１種類の金属をケイ素にしておき、加水分解の制御を行いやすくするのが好都合である。また、金属アルコキシド（１）のアルカリ性溶液中での加水分解の速度が、金属アルコキシド（２）よりも速くなるように、金属アルコキシド（１）および（２）を選択する。必要に応じて、他の金属アルコキシドをさらに添加して、加水分解速度、微粒子のサイズ、形状の制御性等を向上させても良い。
　この工程で使用される金属アルコキシド（１）は、特に限定されないが、上述のように、金属アルコキシド（２）より加水分解速度が速い必要があることから、加水分解速度が速いものが好ましい。
　具体的には、式（Ｉ）：
　Ｓｉ（ＯＲ１）４　　　　　（Ｉ）
（式中、Ｒ１は低級アルキル基を示す）
で表されるものが挙げられる。
　この工程では、例えば、以下の手順で合成を進めることができる。
　ナノ粒子を分散したトルエン等の無極性溶媒（２．５ｍＬ程度）に金属アルコキシド（１）を２～４００μＬ（より好ましくは５～８０μＬ、最も好ましくは１０～３０μＬ）添加して有機溶液Ａを得る。金属アルコキシド（１）としてテトラエトキシシラン（TEOS）を選択した場合には、この溶液を１～８時間（より好ましくは２～５時間、最も好ましくは２．５～３．５時間）攪拌することで、有機溶液Ａを得ることができる。
　上記の範囲より短いと、ナノ粒子の表面に付く加水分解した金属アルコキシド（１）の量が少ないため、次の第３工程で水相への転換が行われ難くなる傾向にある。また、この範囲より長いと、ナノ粒子の表面に多くの加水分解した金属アルコキシド（１）が付き過ぎて、発光効率の低下と凝集が起きる傾向にある。
　TEOSの替りに例えばテトラメトキシシラン（TMOS）を選択した場合には、加水分解の速度が増加するので、他の加水分解条件を同一とした場合には攪拌時間を短くすることができる。具体的には、攪拌時間（加水分解時間）を例えば３０分～４時間程度にするのが良い。ケイ素アルコキシドを用いると、透明なケイ素を含むシリカガラス層が形成される。TEOSの場合は、加水分解速度を落としたほうが良いので、空気中から入る水分のみで加水分解を行わせるのが有効である。さらに制御した加水分解を行うためには、雰囲気を調整したグローブボックスを用いることも可能である。このように、使用する金属アルコキシド（１）の加水分解速度によって、攪拌時間等を調整すればよい。
　第３工程．ナノ粒子集合体の形成（ステップ２（請求項の工程（Ｂ）））
　この工程では、まず水相に適切な種類の金属アルコキシド（２）を適量、添加して加水分解を行わせて、水溶液Ｂを得る。このときの反応はアルカリ性領域が好ましく、このためにはアンモニア、水酸化ナトリウム等を添加するが、特にアンモニアが好ましい。さらに、水溶液Ｂと有機溶液Ａを混合し、ナノ粒子を水相に移しつつ、その集合体を形成させる。
　この工程における金属アルコキシド（２）は、上述のように、第２工程における金属アルコキシド（１）よりも加水分解速度が遅いものが好ましく、具体的には、式（ＩＩ）：
　Ｘｎ－Ｓｉ（ＯＲ２）４－ｎ　　　　　（ＩＩ）
（式中、ＸはＣＨ２＝ＣＨ－で示される基、オキシランを含む基、Ｈ２ＮＣｍＨ２ｍ－で示される基、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣｐＨ２ｐ－で示される基、ＨＳＣｑＨ２ｑ－で示される基、又はフェニル基、Ｒ２は低級アルキル基、ｎは１、２又は３、ｍは１～６の整数、ｐは１～５の整数、ｑは１～１０の整数を示す）
で表されるものが挙げられる。
　この工程では、例えば、以下の手順で合成を進めることができる。
　金属アルコキシド（２）（０．２～５μＬ、より好ましくは０．５～２μＬ、最も好ましくは０．７～１．５μＬ）をエタノール等の有機溶媒（１０～５０ｍＬ、より好ましくは１５～３０ｍＬ、最も好ましくは２０～２７ｍＬ）とアンモニア水等のアルカリ性水溶液（１～８ｍＬ、より好ましくは２～６ｍＬ、最も好ましくは３～５ｍＬ、但し濃度３ｗｔ％程度）に混合する。金属アルコキシド（２）として３－メルカプロトプロピルトリメトキシシラン（MPS）等を使用して、水溶液Ｂを得ることができる。なお、MPS等に代表される金属アルコキシド（２）の加水分解速度は、金属アルコキシド（１）として使用されるTEOS等よりも遅い。ここで金属アルコキシド（２）のモル濃度としては、1.9×10-5～4.7×10-4モル/リットルが良く、4.7×10-5～1.9×10-4モル/リットルがより好ましく、6.6×10-5～1.4×10-4モル/リットルが最も好ましい。
　有機溶液Ａと水溶液Ｂを混合し、１～８時間（より好ましくは２～６時間、最も好ましくは２．５～３．５時間）攪拌すると、表面のアルコキシドの加水分解が進むために、半導体ナノ粒子は水相に移動し、さらに水相でナノ粒子の集合体が形成される。
　これらの第２工程および第３工程において、第２工程の始めに記した有機溶媒（トルエン）の量が１ｍＬから変わった場合には、それに比例してそれぞれの溶液の量を変えれば良い。
　ここで、金属アルコキシド（２）として、TEOS等の金属アルコキシド（１）に使用されるものを用いると、水相で一気に集合体の大きさが大きくなり、白濁する。このことから、金属アルコキシド（２）は集合体の大きさを調整する効果があることがわかる。
　この工程では、第１工程および第２工程で作製した疎水性のナノ粒子を、その表面のアルコキシドの加水分解を進めることで徐々に親水性にし、水相へ転換させる。水相に転換するとさらに加水分解反応が速く、無秩序に進行し、そのままでは大きな集合体となって溶液が白濁する。金属アルコキシド（２）としてTEOSのような加水分解速度の速い金属アルコキシドを使用すると、このような現象が見られる。ところが、水相に加水分解速度の遅いアルコキシドを添加しておくと、これが水相に移ってきたナノ粒子の表面に接着し、徐々にナノ粒子同士が集合する。これにより、集合体の粒径分布と中に入るナノ粒子の数の分布が減少する。このため、水相に入れる金属アルコキシド（２）の量を減らすと、集合体のサイズが大きくなり、中に取り込まれるナノ粒子の数が増加する。このような過程を解明し、分散させるナノ粒子の数と全体の粒径を制御し、シリカガラスに糊のような役目を持たせた集合体を水相で形成する方法を見出した。
　第４工程．集合体のガラス被覆による蛍光性微粒子の作製（ステップ３（請求項の工程（Ｃ）））
　この工程では、いわゆるストーバー法により、アルコールを含むアルカリ性水溶液中で、金属アルコキシド（３）を加水分解し、第３工程で作成したナノ粒子集合体を種として、その表面にシリカガラス成分を降り積もらせることで、シリカガラスの被覆を形成する。アルカリ性にするには、アンモニア、水酸化ナトリウム等を用いるが、特にアンモニアが好ましい。アルコールとしては、低級アルコール（炭素数が５以下）の第一級アルコール、特にエタノール、メタノール等が好ましい。金属アルコキシド（３）は、４官能が好ましく、その中でもTEOSが好ましい。
　この工程においては、必要に応じて第３工程で得た溶液を遠心分離して、大きな粒子を取り除き、さらに水を除去して濃縮し、半導体ナノ粒子の濃度を０．１～５μＭ程度（より好ましくは０．３～３μＭ、最も好ましくは０．５～２μＭ）にしておく。この水溶液（０．５ｍＬ程度）を取り出し、低級アルコール（２～２０ｍＬ、より好ましくは４～１０ｍＬ、最も好ましくは７～９ｍＬ）とアルカリ性水溶液（０．０１～０．２ｍＬ、より好ましくは０．０５～０．１５ｍＬ、最も好ましくは０．０７～０．１２ｍＬ、但し濃度２５ｗｔ％程度）を加え、さらに金属アルコキシド（３）（５～４０μＬ、より好ましくは７～２０μＬ、最も好ましくは１０～１６μＬ）を滴下する。これにより、半導体ナノ粒子集合体の表面にシリカガラス層を形成し、シリカガラス微粒子が得られる。さらに０．５～５時間、より好ましくは１～４時間、最も好ましくは１．５～３時間の攪拌後、遠心分離することで前記蛍光性微粒子を取り出すことができる。その後、純水中にナノ粒子の濃度として約１μＭで分散させればよい。この工程においては、始めに用いた水溶液の量が０．５ｍＬから変わった場合には、それに比例してそれぞれの溶液の量を変えれば良い。
　前記蛍光性微粒子からのナノ粒子の構成成分とくにCdの溶出を防ぐためには、この工程で作製されるシリカガラス層（シェル）の厚みを２ｎｍ以上にすることが好ましく、さらに４ｎｍ以上にすることが最も好ましい。蛍光性微粒子の平均粒径が２０ｎｍよりも大きくなって、５０ｎｍ程度になったときには、シリカガラス層の厚みを１０ｎｍ以上にすることもできる。さらに蛍光性微粒子の平均粒径が１００ｎｍに近い場合には、シリカガラス層の厚みを２０ｎｍ以上にすることができる。シリカガラスからなる層の厚みは、透過電子顕微鏡観察によって半導体ナノ粒子を含まない外側の部分として容易に測定できる。周縁の位置によって厚みが異なる場合には、シリカガラス粒子周縁全体の平均をもってシリカガラス層の厚みと定義する。
　また、この工程において加熱することで、シリカガラスの網目構造を発達させてCdの溶出をより効果的に抑えることができる。加熱温度は、３０～８５℃程度であり、より好ましくは３５～６０℃程度、最も好ましくは３７～５０℃程度である。
　第５工程．蛍光性微粒子の表面修飾
　前記の第４工程で作製された水分散性の蛍光性微粒子は、そのままでは表面に水酸基が存在している。これにさらに、カルボキシル基を持つアルコキシド（例えばカルボキシエチルシラントリオールのナトリウム塩等）を添加することで、表面をカルボキシル基で修飾できる。またチオール基を持つアルコキシド（例えばMPS等）を添加することで、表面をチオール基で修飾できる。第４工程で、この工程に使うアルコキシドを金属アルコキシド（３）に混ぜて表面シリカ被覆と表面修飾を同時に行うことも可能である。さらに、アミノ基（例えば３－アミノプロピルトリメトキシシラン等を使用）、ポリエチレングリコール由来の基（例えば２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］－トリメトキシシラン等を使用）での修飾も可能である。
　ＩＩ．蛍光性微粒子の用途
　本発明の蛍光性微粒子は、その表面修飾を利用して、生体内の特定分子に特異的に結合してその分子の分布、量、動き等を見る蛍光プローブとして用いることができる。また、輝度、発光効率および耐久性が高いことから、電子材料用のエネルギー効率の良い蛍光体にも用いられる。このような短波長光を照射して励起、発光させる用途のほかに、エレクトロルミネッセンス（交流または直流の電圧を引加することで発光させる）、カソードルミネッセンス（高速の電子線を照射することによって発光させる）等用の蛍光体としての用途もある。
　ＩＩＩ．蛍光性微粒子の評価
　１．溶液中のナノ粒子の分散濃度
　本明細書においてCdおよびSeを含む半導体ナノ粒子の分散濃度は、ナノ粒子の吸収スペクトルを文献（例えば、ケミストリー　オブ　マテリアルズ、１５巻、２８５４頁、２００３年）と比較することで求められる。組成が変わった場合には、加成性があることを利用して求めることができる。また、ZnSがシェルとしてCdSe核にコートされた場合においても、文献（ジャーナル　オブ　フィジカルケミストリー、ビー、101巻、9463頁（1997））を利用すればその濃度を求めることができる。
　２．ナノ粒子の発光効率
　本明細書における発光効率とは、内部量子効率のことであり、ナノ粒子が光で励起された後に、蛍光光子を放出する確率として定義される。この値は、溶液においては、発光効率が既知の標準物質（キニーネの０．１規定硫酸溶液）の吸光度と発光強度を比較することで求められる。ナノ粒子の濃度が１０ｎＭ程度という希薄溶液の場合の発光効率を求めるためには、吸収および蛍光分光光度計の波長ごとの感度の校正、ベースラインの安定性の確認作業を行うことが好ましく、また測定装置が置かれている実験室の温度変動を±２℃程度に制御することが好ましい。詳しくは、本発明者らによる文献（ジャーナル　オブ　ルミネッセンス、128巻、1896頁（2008））の方法を用いると良い。なお、キニーネの蛍光は青色領域であるが、蛍光分光光度計の波長ごとの感度を補正しておけば、赤色領域の蛍光の発光効率もそのまま求めることができる。さらに正確を期すためには、赤色領域の発光における標準物質（例えばローダミン６Ｇ）を用いて発光効率の値を確かめれば良い。
　なお、シリカガラス微粒子の輝度は、（発光効率×１個のシリカガラス微粒子中に分散するナノ粒子数）に比例する。
　３．１個のシリカガラス微粒子中に分散する半導体ナノ粒子の数
　シリカガラス微粒子中の半導体ナノ粒子の分散数は、加速電圧２００ＫｅＶ以上の透過電子顕微鏡観察によって、ほぼ正確に数えることができる。但しシリカガラス微粒子の大きさが１００ｎｍに近づくと、加速電圧は３００ＫｅＶ程度が望ましい。ナノ粒子の形とサイズはほぼ一定なので、透過電子顕微鏡の電子の進行方向に沿った粒子の重なりがある場合でも、完全に重なっていなければ、粒子の輪郭線の不連続な変化により、重なりを判別することができる。さらに正確を期するためには、電子線トモグラフィーの手法により、試料の角度を順に変えて画像を取り込み、それを専用のソフトウエアによって３次元表示させることで行える。
　いずれの場合も、分散数を求めるためには、観察試料中で無作為に選んだ視野中のシリカガラス微粒子を最低３０個程度選んで、その中のナノ粒子分散数を数えてヒストグラムを作製し、その分布が偏っていないことを確かめてから平均する。
　別の方法として、シリカガラス微粒子を酸で溶解させて、化学分析によりそれぞれの成分のモル比を求めることでナノ粒子の分散数を導くことも可能である。このとき、ナノ粒子も化学分析してその組成を求めておけば正確な値が得られるが、そうでなくても、ナノ粒子の粒径からおよその組成はわかるので、分散しているナノ粒子数の見積もりを行うことは可能である。
　４．溶出カドミウムの定量
　半導体ナノ粒子はその比表面積が大きいため背景技術で説明したように、表面の欠陥が発光特性に大きな影響を与える。バイオ用途での使用に近い条件（緩衝液中で、ナノ粒子の濃度が１０ｎＭ程度またはそれ以下の低濃度）での溶出カドミウム量が少ないことは、細胞死を避けるために好ましい。しかしそれだけでなく、溶出は必ず半導体ナノ粒子の表面から起きるので、溶出量が少ないことは表面欠陥が生じにくいことに繋がり、発光効率低下を防ぐことにもなる。このため、溶出量の定量は実用性の程度を調べるために重要である。
　この評価のために、どのような緩衝液または培養液を用いるかについては、まず、最も使われている培地としてDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）が挙げられる。測定においては、作製したシリカガラス微粒子または市販のポリマーコートナノ粒子を分散させて一定時間おいた溶液をフィルターで濾過し、その濾液中のＣｄ濃度を、ＩＣＰ質量分析法にて測定する。しかし、これを用いて溶出Ｃｄを定量すると、時間と共にその量が減少する。これは、溶出したＣｄが時間と共にDMEM中の成分と会合体を形成し、それによって半導体ナノ粒子と同等のサイズに成長してフィルターで止められてしまうせいでＣｄ量が減少するためである。これは、同時に溶出するＳｅの量と相関がないことからも示唆される。
　その一方で、ヘペス溶液も良く使われる緩衝液であり、金属との結合が測定感度以下と報告されているので理想的である。このため、溶出カドミウムの評価には、ヘペス緩衝液を用いる。また、溶出量は半導体ナノ粒子の分散濃度が１０ｎＭの場合に換算して比較する。
　以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
　実施例１
　シリカガラス微粒子の合成
　表面をドデシルアミンで覆ったCdSe/ZnSナノ粒子（CdSeコア、ZnSシェル）を公知の方法（ナノレターズ、1巻、207ページ（2001年）およびコロイズ　アンド　サーフェスイズ　エー、202巻、145ページ(2002年)）で作製した。このナノ粒子をトルエン溶液に濃度２０μＭで分散し、発光効率を測定すると３５％であった。発光波長は約６２０ｎｍ、発光スペクトルの半値幅（半値全幅）は約３３ｎｍであった。
　次に図１Ａ～図１Ｃに示したステップ１から３の３段階を経て、蛍光性ナノ粒子分散シリカガラス微粒子を作製した。特に記述がない限りは、合成は室温、大気中にて行った。
　ステップ１において、ナノ粒子を分散したトルエン溶液（０．４ｍＬ、１．５マイクロモル／リットル）にテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ、１０μＬ）を添加し、３時間攪拌することで有機溶液Ａを得た。この溶液中のナノ粒子は、４官能のTEOSのうち、一つのエトキシ基だけが加水分解して(Et-O)3-Si-O-（ここでEtはエチル基）となったものが配位子となって界面活性剤の役目を果たし、表面を整然と覆っていると考えられる。この状態では、発光効率の低下はほとんど見られなかった。
　このように発光効率の低下が見られない条件を探るために、上記の実験の条件を少し変えて、TEOS中にわずかに水を分散させ、３時間攪拌した後の発光効率の相対値をプロットしたのが、図２である。上記の実験では水の濃度は０Ｍ（Ｍはモル／リットル）であるが、濃度０．００５Ｍを越えるあたりから発光効率の低下が始まることがわかる。水が多いと、加水分解速度が増加する。TEOSは４官能のアルコキシドであるから、ナノ粒子表面を覆うTEOS加水分解物も、２箇所以上で加水分解が起き、お互いが繋がろうとする。また、次々に加水分解生成物が表面に接着する。これによって表面の配位子の配置が乱雑になることが、発光効率の低下に繋がったと考えられる。なお、水を添加しなくても、TEOSは空気中の水分を取り込んで徐々に加水分解が進むことが知られている。
　ステップ２では、３－メルカプトプロピルトリメトキシシラン（MPS、１μＬ）をエタノール（２５ｍＬ）とアンモニア水（４ｍＬ、アンモニア濃度１０ｗｔ％）に混合して水溶液Ｂを得た。これを有機溶液Ａと混合し、３時間攪拌したところ、半導体ナノ粒子は水相に移動し、さらに水相でナノ粒子の集合体が形成された。この集合体を遠心分離によって取り出した。ここで、MPSの替りにTEOSを用いると、水相で一気に集合体の大きさが大きくなり、白濁した。このことから、MPSは、集合体の大きさを調整する効果があることがわかった。
　ステップ３においては、上記の集合体が分散した水溶液０．５ｍＬを取り出し、エタノール（８ｍＬ）とアンモニア水（０．１ｍＬ、２５ｗｔ％）を加え、さらにTEOS（１４μＬ）を添加した。これにより、半導体ナノ粒子集合体の表面にシリカガラス層を形成し、蛍光性シリカガラス微粒子とした。さらにナノ粒子の濃度として約１μＭで分散させた。このときの発光効率を測定すると、３１％であった。この溶液をヘペスのｐＨ７．４溶液（ヘペス濃度１０ｍＭ）にナノ粒子の濃度として１０ｎＭで再分散させても発光効率は変わらなかった。また、溶媒を飛ばして乾燥粉体として積分球で測定しても、同等の発光効率を示した。
　さらにシリカガラス層の網目構造を発達させることを狙って、上記のステップ３の工程を４０℃で行い、シリカガラス微粒子を作製した。以下で同様に溶出カドミウム重量を測定し、表１に示した。
　＜溶出カドミウムの定量＞
　ヘペス緩衝液の作製
　市販のヘペス（（株）同仁化学研究所製のDOJINDO 348-01372）の粉末４．７６６ｇを超純水１６０ｍＬに溶解する。次に１規定の水酸化ナトリウム水溶液を徐々に加えてｐＨを７．４に調整する。さらに、超純水を加えて２００ｍＬとし、ストック溶液として、４℃程度の冷蔵庫に保管する。このストック溶液から１０ｍＬを取り出し、超純水で希釈して１００ｍＬとする。これにより、１０ｍＭのヘペス緩衝液が作製される。
　溶出カドミウムの測定
　上記のヘペス溶液３ｍＬをポリプロピレン製の容器に入れ、作製したシリカガラス微粒子を加え、半導体ナノ粒子の濃度Xとして５０ｎＭに調整したところ、発光効率は３１％の程度で分散前と変わらなかった。これを室温で１５時間放置した。この段階で再び発光効率を測定しても、ほぼ同じ値であった。これを３ｍＬ取り出して、遠心濃縮フィルター（ザルトリウス社製のビバスピン6、3000-MWCO）に導入し、１００００ｒｐｍで５分間遠心し、シリカガラス微粒子を含まない溶液成分のみ１．５ｍＬをろ別し、ポリプロピレン製のミニチューブに入れて密栓して検体とした。その後、腐敗を防ぐために４℃の冷蔵庫に保管した。
　ここで、溶出カドミウム量は数ｐｐｂ（溶液１ミリリットル中に数ｎｇ）という少ない値となるので、他の要因による汚染を極力、排除する必要があった。今回は、溶出試験容器としてポリプロピレン製容器を用い、別途、半導体ナノ粒子を入れずに対照実験を行い、溶出カドミウムが検出限界（０．２ｐｐｂ）以下であることを確かめた後に、実験に用いた。溶液にモリブデンが共存すると分析精度が落ちるので、注意が必要である。
　ろ別溶液中のカドミウムイオン濃度の定量は、以下の手順で行った。
　まず、検体溶液０．１ｍＬに超純水０．８ｍＬおよび高純度硝酸０．１ｍＬ（TAMAPURE AA-100（多摩化学工業（株）））を加えて前処理を行い、定量した。硝酸は、試料中の元素を安定させ、また分析装置の器壁に試料が付着するのを防ぐ効果がある。測定には、ICP質量分析装置（ThermoFisher SCIENTIFIC製 Finningan ELEMENT2）を用いた。予め標準試料を用いて検量線を引いた。溶出カドミウムが低濃度になるにつれて、測定誤差がより大きくなることが危惧されたため、半導体ナノ粒子の分散濃度が高い溶液から得た検体を用いることとし、必要に応じて濃縮してから定量する方法が有効であった。なお、濃度既知の標準試料を用いた測定の精度確認では、定量下限（試料１ｍＬ中の重量が０．５ｎｇ、０．５ｐｐｂ）付近でも誤差が１０％以内であることを確認した。また、今回は、半導体ナノ粒子の濃度５０ｎＭから得られた溶液を検体としたが、この半導体ナノ粒子濃度と検体中の溶出Cdイオンの濃度とは少なくとも半導体ナノ粒子濃度１００ｎＭまでの範囲であれば、比例関係にあることを確かめた。
　次に、市販のポリマーコートCdSe/ZnSナノ粒子について同様の試験を試みた。インビトロジェン社のQ21321MP（表面がCOOH）、Q10021MP（表面がストレプトアビジン）、Q25021MP（通称Qtracker、表面がペプチド）の３種類を用意し、それぞれを濃度Xが２０ｎＭの条件で上記の手順で作製したヘペス緩衝液に分散させ、１５時間後の溶液中の溶液１ｍＬ中の溶出カドミウム重量Y （単位をｎｇで表したときの値、ｐｐｂで表した値と一致）を測定した。
　それぞれの場合の溶出量Yを、半導体ナノ粒子の分散濃度が１０ｎＭの場合の溶出量Zに変換するためには、Z = 10×Y /Xとすれば良い。このZは表１のＣｄ重量濃度で示したようになった。つまり表中で、ｐｐｂで表したCd重量濃度が、Zである。この表から、蛍光シリカガラス微粒子の場合のみ、10×Y /X< 1を満たすことがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例２
　実施例１で作製したシリカガラス微粒子は、表面に水酸基が存在している。蛍光プローブとしてバイオ分野へ応用するために、この表面を各種官能基で修飾し、さらに抗体を取り付けた。
　実施例１でのシリカガラス層形成後に、MPSを用いると、チオール基でコートされた微粒子が作製された。
　シリカガラス層形成後の微粒子を純水に分散させ、０．５ｍＬの微粒子（ナノ粒子の濃度にして１μＭ）を取り出し、MPS２μＬとエタノール３０μＬの混合物に加えた。攪拌後、遠心分離により沈殿させ、純水で洗浄し、PBS（濃度１０μＭ）溶液に分散させて０．５ｍＬとした。このうち０．１ｍＬを取り出し、４℃にてストレプトアビジン付マレイミドの濃度を２００ｍＭとしたPBSバッファー溶液１０μＬを上記のシリカガラス微粒子分散溶液に混ぜた。その後、遠心分離により沈殿させ、PBSバッファー溶液にて洗浄し、再びPBSバッファー溶液に再分散させた。これを、ビオチン化二次抗体と接着させることで、各種一次抗体への結合が可能であった。表面修飾および抗体接着が実際に行われたことは、電気泳動速度の違いとして確認できた。生体応用の一例として、抗微小管関連タンパク質（アンチ－マイクロチューブル－アソシエイティッド　プロテインズ）を一次抗体として、ラット胎児海馬由来神経細胞（Ｅ１８）を染色することができた。
　別の例として、ストレプトアビジン化したシリカガラス微粒子の表面にウシ血清アルブミンを付着させて非特異吸着を除いた後、抗Ａ型インフルエンザウイルス抗原抗体をビオチン化したものと結合させた。これをイムノクロマグラフィーの際の蛍光プローブ（蛍光試薬）として用いると、検体中にＡ型インフルエンザウイルス抗原を含むかどうかをテストラインの蛍光強度から判定することができた。
　＜電子顕微鏡観察によるシリカガラス微粒子径と分散ナノ粒子数Nの決定＞
　応研商事（株）製のハイレゾルーションカーボン支持膜付グリッド（Cu製、グリッドピッチ１００μｍ）を放電処理後、実施例１で作製したシリカガラス微粒子分散水溶液を１滴落とし、表面にわずかな量の微粒子を吸着させることで観察グリッドを作製した。
　透過型電子顕微鏡（（株）トプコン社製、EM-002B、加速電圧２００ＫＶ）で観察すると、シリカガラス微粒子の平均粒径が約４７ｎｍであることがわかった。このくらいの粒径であれば、透過電顕観察において電子が微粒子を通り抜けるので、中に入っている半導体ナノ粒子の数を数えることは、比較的容易であった。ただし、電子線の進む方向から見て粒子が重なっている場合には、数え落とすことがある。これを避けるためには、粒子の形を見て、不連続な境界線があるときには、重なりがあると判断するのが有効である。無作為に３０個のシリカガラス微粒子を選択して撮影し、その中に分布する半導体ナノ粒子数を数えることで、ほぼ正確な平均分布数N2が２２と得られた。
　さらに正確を期するためには、３次元画像をとるのが有効である。FEI社のTecnaiG2F20（加速電圧２００ＫＶ）を用い、１度刻みで試料を±６４度の範囲で回転させながら倍率７９０００倍にて暗視野画像シリーズをとり、それをＦＥＩ社製のソフトウエアInspect3Dを用いて三次元画像再構築を行い、ＭＣＳ社製のソフトウエアAvizo5を用いて可視化処理した。このようにして作製した３次元画像を回転させながら、無作為に選んだ６０個のシリカガラス微粒子中に分布する半導体ナノ粒子の数を数え、正確な平均分布数N3が２３と得られた。２次元で観察したN2が３次元で観察したN3よりわずかに小さいのは、ナノ粒子同士の重なりのためにわずかな数え落としがあったためと推定される。
　＜化学分析による分散ナノ粒子数の決定＞
　実施例１で作製したシリカガラス微粒子と半導体ナノ粒子（CdSe/ZnS）の両方の化学組成を分析することで、シリカガラス微粒子中に分散している半導体ナノ粒子の数を計算することができた。
　薬包紙に包んだ乾燥粉末試料（シリカガラス微粒子の場合４ｍｇ程度、CdSe/ZnSナノ粒子のみの場合２ｍｇ程度）を秤量の後、テフロン（登録商標）容器に入れ、さらにフッ酸と硝酸を同時に加えて密閉後、マイクロ波試料前処理装置（マイルストーンゼネラル社）にて２００℃程度に加熱することで溶解した。これを十分に冷却した後、取り出して超純水にて希釈した後、高周波誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ＩＣＰ－ＡＥＳ、日本ジャーレル・アッシュ社、現在の社名はサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、IRIS Advantage）にて溶液中のCd, Se, Zn, S,および Siを定量した。それぞれの元素について、予め濃度がわかっている試料を用いて検量線を引くことで、分析誤差が１０％以内に納まるように工夫した。
　その結果、表２の分析結果が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　これから、シリカガラス微粒子１個に分散する半導体ナノ粒子数Nを計算するには、以下の手順を経る。
　始めに、透過電子顕微量写真による観察から、シリカガラス微粒子１個の平均の粒径が４７ｎｍ、半導体ナノ粒子の平均粒径は５．８ｎｍ、またシリカガラス微粒子の密度は、公知文献（アドバンストマテリアルズ、21巻、4016ページ、2009年およびニュージャーナル　オブ　ケミストリー、33巻、561ページ、2009年）の考察から１．５ｇ／ｃｍ３であった。今回の半導体ナノ粒子の大きさでは３０％以上の原子が表面に位置することになり、化学量論的組成比からのずれが生じる。それにも拘わらず、シリカガラス微粒子中に分散する半導体ナノ粒子の数を正確に見積もるためには、以下のように計算に工夫が必要になる。
　表２の試料２の分析結果から、ナノ粒子を構成するセレン化カドミウムおよび硫化亜鉛の原子量は、それぞれの組成がCd1Se0.25およびZn1.46S1.97であるとして、131.8および158.9と求められる。また、Siは全てSiO2の形をとるとして、1737と求められる。ここでそれぞれの物質の比重を利用すると、シリカガラス微粒子中での体積比は、CdSe : ZnS : SiO2 = 32.1 : 27.4 : 1157.8と求められる。従って、シリカガラス微粒子中の半導体ナノ粒子の体積割合は0.049（=(32.1+27.4)/(32.1+27.4+1157.8)）となる。シリカガラス微粒子１個の体積とこの体積割合から、シリカガラス微粒子中のCdSe/ZnSナノ粒子の体積は、２６６０ｎｍ３となり、ナノ粒子１個の体積は、１０２ｎｍ３である。これから、シリカガラス微粒子１個に含まれる半導体ナノ粒子の数Nは、２６と導かれた。
　実施例３
　実施例１の「シリカガラス微粒子の合成」で使用したＭＰＳの量を０．５μＬに減少させると、形成されるナノ粒子の集合体が大きくなった。この集合体表面を、実施例１と同様の方法でシリカガラス被覆することで蛍光微粒子を得た。このとき、半導体ナノ粒子の濃度として１０ナノモル／リットルでヘペス溶液中に分散させた場合の、発光効率は２５％程度であった。電子顕微鏡観察によって、蛍光微粒子は、平均粒径９５ｎｍであることがわかった。また、少なくとも１６０個のナノ粒子が分散していることが確認された。
　実施例４
　実施例１の「シリカガラス微粒子の合成」で使用したＭＰＳの量を２μＬに増加させると、形成されるナノ粒子の集合体が小さくなった。この集合体表面を、実施例１と同様の方法でシリカガラス被覆することで蛍光微粒子を得た。このとき、半導体ナノ粒子の濃度として１０ナノモル／リットルでヘペス溶液中に分散させた場合の、発光効率は２５％程度であった。電子顕微鏡観察によって、蛍光微粒子は、平均粒径２１ｎｍであることがわかった。また、平均１１個のナノ粒子が分散していることが確認された。
　実施例５
　カルボキシエチルシラントリオールのナトリウム塩（Carboxyethylsilanetriol, sodium salt、ＣＥＳと略記）を用いることで、表面をカルボキシル基またはその塩で修飾することも可能であった。
　すなわち、実施例１のステップ３において、純粋なＴＥＯＳの替りに、ＴＥＯＳにその５％のモル比のＣＥＳを加えたものを４８時間攪拌後に添加することで、表面にカルボキシル基のナトリウム塩で修飾された蛍光微粒子を得ることができた。
　同様にアミノプロピルトリメトキシシランを用いることで、表面をアミノ基で修飾することができた。これに、水溶性カルボジイミドを作用させることで、細胞表面のカルボキシル基に結合させることが出来た。
　実施例６
　実施例１で作製した蛍光微粒子を真空乾燥させた後、ガラス基板上に接着させ、市販の発光ダイオード（発光波長３８５ｎｍ）で照射すると赤色発光を示した。中に入るナノ粒子の平均粒径を小さくすることで、同様に青色発光、緑色発光の蛍光微粒子も得られた。具体的には、CdSe/ZnSナノ粒子の平均粒径を３．３ｎｍ程度（このうちZnSシェルの厚みは０．５ｎｍ程度、CdSeコアのサイズは２．３ｎｍ程度）にすると青色発光の蛍光微粒子が得られ、５．１ｎｍ程度（このうちZnSシェルの厚みは０．５ｎｍ程度、CdSeコアのサイズは４．１ｎｍ程度）にすると緑色発光の蛍光微粒子が得られた。また、実施例１で用いた赤色発光（ピーク波長６２０ｎｍ程度）のナノ粒子の平均粒径は５．５ｎｍ程度であった。発光色は、コアのサイズとシェルの厚みの両方で決まるので、平均粒径が同じでも発光色が同じでないことがある。なお、ナノ粒子の平均粒径は、公知の溶液法での合成時の反応時間により調整できる。これらの蛍光微粒子は、照明およびディスプレイなどの電子材料用の蛍光体としても使用可能であることがわかった。
　実施例７
　合成条件による作製物の違いを系統的に調べた。実施例１と同じ手順で実験を行った。ステップ２から３の合成条件および合成物の発光効率とシリカガラス微粒子の粒径を表３に示す。表中の反応時間は、ステップ３の反応時間を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　合成されたシリカガラス微粒子（１）から（４）の透過電子顕微鏡像を図４に示す。図の番号の（１Ｌ）、（２Ｌ）、（３Ｌ）、（４Ｌ）は、それぞれシリカガラス微粒子（１）、（２）、（３）、（４）の拡大像を示す。
　この図から、シリカガラス層厚はそれぞれおよそ２０ｎｍ、１０ｎｍ、７ｎｍ、１３ｎｍであることがわかる。表３のシリカガラス微粒子（１）の合成条件のうち、ＭＰＳのモル濃度を5.0×10-5モル/リットルに上昇させると、シリカガラス微粒子発光効率は25％、粒径は90±9ナノメートルとなった。
　実施例８
　［課題を解決するための手段］で説明した変形した作製法を用いた。
　CdSe/ZnSナノ粒子のトルエン溶液0.5ｍL（濃度1.5μＭ）にMPS 0.5μL、エタノール25μL、およびTEOS２μLを加え、２日間、攪拌した。このステップ１において、TEOSおよびMPSに覆われたナノ粒子が作製された。
　次のステップ２では、この溶液にエタノール４ｍＬおよび水0.1ｍＬを添加し、さらにＴＥＯＳ10μＬおよびアンモニア水（6.3重量％、0.3ｍＬ）を徐々に加えた。これにより、ステップ１で作製したナノ粒子の表面に付いたアルコキシドが加水分解されて親水性になり、水溶液中に移動しつつＴＥＯＳに触れて集合体を形成した。３時間半の攪拌後に遠心して粒子を取り出して透過電子顕微鏡で観察すると、図５のようになった。これを例えば図４と比較すると、集合体中のナノ粒子が規則的に配列していることがわかる。この場合、集合体中には約３０個のナノ粒子が認められる。発光効率はおよそ２５％であった。このような規則配列により、ガラスビーズ中に分散するナノ粒子の濃度を上げることができ、高い輝度のガラスビーズが得られた。発光波長は652 nmであった。このときのガラスビーズの粒径はおよそ70 nmであった。
　さらにステップ３で、この表面をシリカガラスの層で覆うことができた。最終的なガラスビーズの粒径は、およそ90 nmであった。
　実施例９
　発光波長610 nmのCdSe/ZnSナノ粒子のトルエン分散液（濃度1.5マイクロモル/リットル、容量0.4ｍＬ）を取り出して、さらにTEOS 10マイクロリットル、MPS 0.05マイクロリットルを加えて、3時間攪拌して有機溶液Ａを得た。別途、MPS 0.15マイクロリットル、エタノール25ｍＬ、アンモニア水（6.25重量％）1.5ｍＬ、水2ｍＬを混合して、水溶液Ｂを得た。有機溶液Ａと水溶液Ｂを混合すると、ナノ粒子は有機溶液から水溶液に移動した。これをさらに3時間攪拌することで、ナノ粒子の集合体を得た。この段階で、ナノ粒子の集合体の大きさは25 nm、中に含まれるナノ粒子の数は、およそ15個であった。さらに、実施例１のステップ３の方法でストーバー法によってTEOSを用いてシリカガラスの層を形成した。最終的なガラスビーズの大きさは、およそ30 nmであった。また、発光効率は25％であった。
 

Claims (17)

  1. CdおよびSeを含む半導体ナノ粒子がケイ素を含む微粒子中に分散している蛍光性微粒子であって、
    前記ケイ素を含む微粒子の平均粒径が２０～１００nmであり、且つ、
    前記ケイ素を含む微粒子中に分散している半導体ナノ粒子の数が１０個以上である、蛍光性微粒子。
  2. 前記ケイ素を含む微粒子の平均粒径が４０～１００nmであり、且つ、前記ケイ素を含む微粒子中に分散している半導体ナノ粒子の数が２０個以上である、請求項１に記載の蛍光性微粒子。
  3. 前記ケイ素を含む微粒子中に分散した半導体ナノ粒子が規則的に配列している、請求項１又は２に記載の蛍光性微粒子。
  4. 発光効率が２０％以上である、請求項１～３のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
  5. グッド緩衝液試薬であるヘペス（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）のpH7.4溶液（ヘペス濃度10ミリモル／リットル）に、前記半導体ナノ粒子の濃度として10ナノモル／リットルで分散させたときに、発光効率が20％以上である、請求項１～４のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
  6. グッド緩衝液試薬であるヘペス（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）のpH7.4溶液（ヘペス濃度10ミリモル／リットル）に、前記半導体ナノ粒子の濃度としてXナノモル/リットルで分散させて室温で15時間経過後のヘペス溶液中へのCdの溶出量Yナノグラム（溶液1ミリリットル中の溶出Cdの重量）が、
    10×Y/X< 1
    を満たす請求項１～５のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
  7. 半導体ナノ粒子がCdSeおよび／またはCdSeをZnSでコートしたCdSe/ZnSである請求項１～６のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
  8. ケイ素を含む厚さ２ｎｍ以上の層で覆われている請求項１～７のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
  9. 表面にＣＯＯＨ基、ＮＨ２基、ＳＨ基及びこれらの塩、並びにポリエチレングリコール由来の基よりなる群から選ばれる少なくとも１種類を有する請求項１～８のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
  10. 蛍光プローブ用である請求項１～９のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
  11. 電子材料用である請求項１～９のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
  12. エレクトロルミネッセンスおよび／またはカソードルミネッセンスを示す、請求項１～１１のいずれかに記載の蛍光性微粒子。
  13. （Ａ）CdおよびSeを含む親油性の半導体ナノ粒子を分散した有機溶媒に、金属アルコキシド（１）を添加して攪拌し、有機溶液Ａを得る工程、
    （Ｂ）金属アルコキシド（１）よりも加水分解速度が遅い金属アルコキシド（２）を含む水溶液Ｂと、前記有機溶液Ａとを混合して攪拌し、半導体ナノ粒子集合体を得る工程、
    （Ｃ）前記半導体ナノ粒子集合体を含むアルカリ性水溶液中に金属アルコキシド（３）を含む溶液を添加し、前記半導体ナノ粒子集合体の表面に被覆層を形成する工程
    を含む請求項１～１２のいずれかに記載の蛍光性微粒子の製造方法。
  14. 金属アルコキシド（２）が、式（ＩＩ）：
    　Ｘｎ－Ｓｉ（ＯＲ２）４－ｎ　　　　　（ＩＩ）
    （式中、ＸはＣＨ２＝ＣＨ－で示される基、オキシランを含む基、Ｈ２ＮＣｍＨ２ｍ－で示される基、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣｐＨ２ｐ－で示される基、ＨＳＣｑＨ２ｑ－で示される基、又はフェニル基、Ｒ２は低級アルキル基、ｎは１、２又は３、ｍは１～６の整数、ｐは１～５の整数、ｑは１～１０の整数を示す）
    で表される化合物である請求項１３に記載の蛍光性微粒子の製造方法。
  15. 工程（Ｃ）において、加熱する請求項１３又は１４に記載の蛍光性微粒子の製造方法。
  16. （Ａ１）CdおよびSeを含む親油性の半導体ナノ粒子を分散した有機溶媒に、金属アルコキシド（１）および金属アルコキシド（１）よりも加水分解速度の遅い金属アルコキシド（２）を添加して攪拌し、有機溶液Ａを得る工程、
    （Ｂ１）前記有機溶液Ａに金属アルコキシド（３）およびアルカリ性水溶液を添加し、半導体ナノ粒子集合体を形成する工程
    を含む請求項１～１２のいずれかに記載の蛍光性微粒子の製造方法。
  17. （Ａ２）CdおよびSeを含む親油性の半導体ナノ粒子を分散した無極性溶媒中に、２種類の金属アルコキシドを添加して攪拌し、有機溶液Ｘを得る工程、
    （Ｂ２）前記有機溶液Ｘを金属アルコキシドおよび水を含む溶液Ｙに接触させ、有機溶液Ｘ中の半導体ナノ粒子を溶液Ｙに移動させる工程
    を含む請求項１～１２のいずれかに記載の蛍光性微粒子の製造方法。
     
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