WO2011048238A2 - Método de cultivo de viñedos y obtención de sus levadura para fermentación en altos contenidos de azúcar y alcohol - Google Patents

Método de cultivo de viñedos y obtención de sus levadura para fermentación en altos contenidos de azúcar y alcohol Download PDF

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WO2011048238A2
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Juan Pedro NAVARRO AVIÑO
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    • A01G17/00—Cultivation of hops, vines, fruit trees, or like trees
    • A01G17/02—Cultivation of hops or vines
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
    • C12H6/00—Methods for increasing the alcohol content of fermented solutions or alcoholic beverages
    • C12H6/02—Methods for increasing the alcohol content of fermented solutions or alcoholic beverages by distillation

Definitions

  • a first object is to develop a method of cultivation of a vineyard resistant to weather and / or climatic incidences with the development of deep and strong roots.
  • a second object is to develop a method of deep fermentation with wild yeasts of grapes that remind the land and possess its organoleptic properties, and methods of obtaining wines with high alcohol content.
  • a third object is to develop a method of obtaining and using wild grape yeasts, capable of fermenting sugars at low to high concentrations, from the solutions of sucrose, commercial sugar, molasses from cane sugar, from beet molasses, fermentation of sugars from starch hydrolysis, and fermentation of sugars from plant materials
  • yeasts complete the fermentation of all the sugar present in grape juice, thus a high degree of alcohol, usually up to about 14% vol. or not very superior, it gives the wine its final and aromatic structure.
  • the fermentation of grape must in practice can be done with wild yeasts, inoculated yeasts or using both procedures.
  • the wild yeasts responsible for winemaking are found naturally in the skins of the grapes (usually in a powder-shaped layer fine white that covers the skin of the grapes, (vitis vinifera /.), and that is called "pru ⁇ na").
  • Specific cultured yeast strains can provide specific fruity aromas, high alcohol content, pleasant nose texture and other characteristics such as fermenting at low temperatures or with relatively low pH etc.
  • yeasts are usually used to convert sugar into alcohol.
  • the species of yeast that is considered best for the total fermentation of alcohol is saccharomyces cerevisiae. Fermentation with wild or indigenous yeasts, although it is very minor, is practiced by some European processors, who have always fermented with Wild yeasts and with very good results. Likewise, California winemakers are starting to start this spontaneous fermentation, with also very favorable results. At harvest, the grapes carry thousands of organisms, including yeasts, with the consequent risk of infection.
  • One of the most common characteristics of wild yeasts is their low resistance to alcohol and their low resistance to infections.
  • wild yeasts An advantage of the use of wild yeasts is the fact that it takes longer to start fermentation, allows more skin contact time with the grapes, which translates into more body, depth of character, color and more flavors fruity (that is, many more variables than with industrial wines). It has been found that many of the unpredictable aromas and esters communicated by wild yeasts give an interesting sophisticated nature to the wine, resulting in a wine with complex flavors, good bouquet and very good alcohol.
  • the document FR 2844275 aims at a natural winemaking process with wild yeasts that is characterized by comprising the following steps: -transfer grapes by gravity to wooden barrels, - vibrated to ensure complete filling of the barrels, - control of the Grape fermentation in these barrels with periodic oscillation, etc. as well as the subsequent malolactic fermentation of the wine and the conservation of this wine in the same fermentation barrel. It does not use pumps for the transfer or tanks, only tanks.
  • WO2004029 93 proposes a method of producing a fermentation product, the method comprising a fermentation step that includes contact with a fermentation microorganism or fermentation media used with at least one esterase enzyme, such as lipase , phytases, phospholipase and cutinase.
  • esterase enzyme such as lipase , phytases, phospholipase and cutinase.
  • the present invention relates to a method of cultivation of a vineyard resistant to weather and / or climatic inclemencies with the development of deep and strong roots, cultivation method thanks to which wild yeasts that will carry out the wine fermentation process are developed ; and a deep fermentation method by which the total transformation of sugar into alcohol is carried out, these wild yeasts are developed and multiplied in broths that reach such a high degree of alcohol, totally superior to those obtained by the conventional fermentation practiced to date.
  • Natural method of cultivation consists in obtaining a totally natural wine, starting with the selection of the vine, so that it is the vine itself that develops and produces its fruits and by its own yeasts.
  • the method starts from the moment of the selection of vines and reaches the achievement of the yeast of these strains, which will then be treated, where appropriate, genetically to achieve a faster multiplication and to be the predominant in the process of fermentation, that is, that they develop in quantity and strength so that they prevail against other yeasts that may appear and that they also get the total fermentation of sugars, to obtain a wine with character and very good alcohol that will give it longevity, aromas and flavors, that not only remind us of the fruit but also the earth and the environment where the vines have been cultivated, solving a problem that currently exists and that is that, with wild or indigenous yeasts, fermentation with a high degree of alcohol
  • the method of deep fermentation with wild grape yeasts reminiscent of the soil and possess its organoleptic properties; and very important they ferment all the sugars contained in the grapes.
  • the deep fermentation method does not use any type of additional yeast, it is done only with the wild yeasts of the grapes, that is, the fermentation is carried out with the yeasts obtained from the grapes grown by the natural method of cultivation.
  • These wild yeasts typical of grapes whose properties are largely pronounced of the soil are capable of fermentation even with high percentages of alcohol.
  • an evolution of the wild yeasts contributed by the grapes has been seen, the flavors, aromas and the bouquet have been improving and standardizing and the alcohol was getting better, until in the year 2004 its properties have been stabilized, giving thereafter more regular wines for their properties.
  • the deep fermentation method with wild grape yeasts allows to obtain broths with even higher alcohol content, which allows the direct obtaining of alcoholic beverages such as cognacs, etc.
  • the present method creates the conditions for the industrial production of bioethanol with indices more efficient energy compared to those currently obtained in industrial production of bioethanol by fermentation of raw materials such as sugarcane juice, or beets.
  • the essential characteristic stages of the deep fermentation method are:
  • Figure 1 corresponds to the ground of a barrel containing 17.7% ethanol, and the ground of a second barrel whose alcohol content was 18.2%, both planted in YPD medium plates.
  • Figure 2 shows in a planting in the YPD medium the White Yeast 1, Slow Growth Yeast 2 and the Yellow Yeast 3.
  • Figure 3 shows a sample of the bottom of the tank and another of the grounds of the grape fermentation tank of the 2008 harvest, in the YPD medium, filamentous fungi can be seen that could be the slow-growing yeast.
  • Figure 4 which also corresponds to the 2008 harvest, shows a sample from the bottom of the tank and another from the ground of the fermentation tank, in the YPD medium, filamentous fungi, abundant presence of white yeast and a small of yellow yeast
  • Figure 5.1 and Figure 5.2 represent: the right column is a YPD glucose-free medium that has been increasing the level of ethanol.
  • the left column shows plates of YPD medium containing 1% glucose. To the left of the photos, the text indicates the percentage of ethanol on each plate. All plates are divided into three zones and in each respective zone each of the strains White Yeast 1, Slow Growth Yeast 2 and Yellow Yeast 3 are planted.
  • Figure 6 shows the behavior of the three strains of White Yeast 1, Slow Growth Yeast 2 and Yellow Yeast 3. in YPD medium with 1% glucose at elevated ethanol levels. Likewise, all the plates are divided into three zones and in each zone each of the strains is sown.
  • Figure 7 shows the microscopic morphology of the seeding separately from the white yeast.
  • Figure 8 shows the microscopic view of the seeding separately from the white yeast after more advanced growth.
  • Figure 9 corresponds to the slow growing yeast under the microscope separately.
  • Figure 10 corresponds to the same plate of Figure 4 from which hyphae obtained in a must in fermentation will be analyzed.
  • Figure 1 1 shows one of the entire hyphae, including its head.
  • Figure 12 shows an enlargement of the head of the hypha of Figure 11, and in which it can be seen that it is composed of its small cells.
  • Figure 13 is an enlargement in which small cells Figure 12.
  • Figure 14 is seen a photograph of a flask with foam due to the release of C0 2 shown in fermentation medium with 60% commercial sugar (saccharose).
  • Figure 15 is a photograph of a flask with foam due to the release of C0 2 shown in fermentation medium with 70% commercial sugar (sucrose).
  • Figure 16 is a photograph of a flask with foam due to the release of C0 2 from the sample in the fermentation of beet molasses with a 12.2% sucrose content.
  • Figure 17 is a photograph of a flask with foam due to the release of C0 2 shows the fermentation of molasses sugar cane pure a sucrose content of 40%.
  • Figure 18 is a photograph of a foam flask due to the release of C0 2 from the sample in the fermentation of beet molasses with a content of 12.2% sucrose.
  • Figure 19 is a photograph of a flask with foam due to the release of C0 2 of the sample in the fermentation of beet molasses containing sucrose 18.4%.
  • Figure 20 is a photograph of a flask with foam due to the release of C0 2 of the sample in the fermentation of beet molasses containing sucrose 42.7%.
  • Figure 21 is a photograph of a foam flask due to the release of C0 2 from the sample in the fermentation of sugars from starch with a starch concentration of 20%.
  • Figure 22 is a photograph of a foam flask due to the release of C0 2 from the sample in the fermentation of sugars from starch with a starch concentration of 40%.
  • Figure 23 is a photograph of a tube with foam due to the release of C0 2 shows the fermentation of sugars from plant matter.
  • Figure 24 is a photograph of a tube with foam due to the release of C0 2 shows the fermentation of sugars from plant matter.
  • Embodiment No. 1 CULTURE METHOD OF A RESISTANT VINEYARD a). Cultivation conditions:
  • the first commercial harvest is collected making the late harvest, in the foggy season and especially after the autumn rains. It has been established according to the Invention that although usually when it rains in September, the grapes gain weight, however, with the rains of autumn it thickens the skin of the grapes, the grapes do not get fat, and that is when the yeasts of the Second Object of the Invention appear, Deep fermentation method with wild yeasts, which will subsequently intervene in the innovative sugar fermentation process.
  • the fermentation yeasts corresponding to the Second Object of the Invention have been studied in the laboratory, for which representative samples of the wine produced were extracted.
  • - White yeast grows properly in all concentrations of ethanol and in large quantities both in the medium with glucose (1%), and in the medium without glucose, as it can use both ethanol carbon as a source of food, as also peptone and yeast extract, which are components of the YPD medium.
  • 2. -Yellow yeast has a different morphology depending on whether the medium contains glucose, or not. In glucose media it grows in the form of large colonies, while in glucose-free media it grows in the form of smaller colonies, but in much larger numbers. In both cases there is a reduction in the amount of yeast produced by increasing the percentage of ethanol.
  • the . White yeast grew significantly in all concentrations of ethanol. The difference between some concentrations and others was the speed of yeast growth. For higher concentrations, the growth rate is lower, the yeast took more days to grow, but as you can see the amount of yeast grown is very similar in all plates.
  • the yellow yeast grew in all the plates, but its growth was small, in some plates it is even hard to see if it has grown or not.
  • the plates with the highest growth are those of 25 and 40% vol. of ethanol
  • the slow growing yeast grew in a large number of colonies for a concentration of 25% vol. and for higher concentrations of ethanol did not experience any growth.
  • Figures 7 and 8 show the images corresponding to white yeast 1. A large number of cells in reproduction can be seen in Figure 8.
  • Figure 13 shows the images corresponding to the small cells that form the hyphae head of Figure 12. These cells look very similar to those observed in slow growing yeast 2, see Figure 9. Although, the size of the cells of the head of hypha is larger and its cell membrane thicker than those of the cells observed in slow-growing yeast 2.
  • Embodiment No. 3 CAPACITY OF MIXED VINETS IN THE FERMENTATION OF
  • a culture medium is prepared in flasks with different concentrations weight / volume of commercial sugar.
  • the components of the medium are:
  • the sugar concentrations are: 1, 2, 10, 15, 20, 25, 30, 40 and 50% all of them in weight / volume percentage.
  • the colonies of the different strains grown on YPD medium plates, each strain separately, are planted in the YPD liquid medium (5 ml), and stirred 24 hours at 240 rpm and 28 ° C. Once this time has elapsed and all the strains have grown, 20 ⁇ of each one is placed in a test tube with 5 ml of the corresponding medium in each tube and they are stirred at 240 rpm 24 hours.
  • each medium shows the following growth
  • absorbance is measured to assess cell growth in the culture medium.
  • the measure of absorbance is directly related to the amount of yeast cells in a given volume of culture medium.
  • the difference measured by the spectrophotometer between the intensity of the light emitted by the lamp and that which reaches the detector once the sample is crossed, that is, the amount of light absorbed by the cells will be greater than the greater number of cells in the sample.
  • the contents of the test tube were transferred to a flask with the culture medium at its corresponding concentration, leaving a total volume of 40ml. Stirring at 240 rpm for 4 hours for the inoculated cells to multiply. After this time the agitation was stopped leaving the cultures at 31 ° C under anaerobic conditions. A small agitation (22 rpm) was placed to try to ensure that the cells were well distributed throughout the culture. At this time the fermentation was started. The following week the concentration of carbohydrates was determined by the Dubois Phenol-Sulfuric Colorimetric Method obtaining the following percentages:
  • reaction that describes the alcoholic fermentation is as follows: C 6 H 12 0 6 + 2 P ⁇ + 2 ADP ⁇ 2 CH 3 -CH 2 OH + 2 C0 2 + 2 ATP
  • Embodiment No. 4 CAPACITY OF MIXED VINETS IN THE FERMENTATION OF MELAZA (FROM SUGAR CANE) WITH DIFFERENT DILUTIONS.
  • Molasses from sugarcane was used as the basis for the culture medium. From this molasses, different dilutions were made to check the behavior of the strains before the different sugar levels.
  • the starting molasses had 78.9 ° Brix and a sucrose content of 49.9%.
  • the prepared media are shown in the following table:
  • a colony of each strain, White Yeast 1, Slow Growth Yeast 2 f ⁇ a Yellow Yeast 3 sown in the YPD medium is taken, and all are resuspended together in 1 ml of water.
  • a 5 ml aliquot of each prepared culture medium is taken and placed in test tubes, 50 ⁇ of the strain mixture is inoculated into each tube. Stirring at 240 rpm and 28 ° C. At 66 hours they show the following growth:
  • the OD 6 oo values of each sample are independent of the others, being a measure of how the yeasts have adapted to that medium.
  • the next step is to transfer an aliquot with a 1/1000 dilution of the contents of these tubes to their corresponding flask. Once the yeasts are inoculated into the flask, agitation is applied at 240 rpm and 28 ° C. At 16 hours it showed the following growth:
  • Figures 16 and 17 forming foams produced by the presence of C0 2 released, fermentation product is observed.
  • Figure 16 corresponds to a flask in which the concentration of sucrose is 23%.
  • the figure 17 corresponds to a flask in which the concentration of sucrose is 40%.
  • molasses is a very viscous fluid, so cells find a lot of resistance to diffuse through it, that is why when molasses is not diluted with some water, cell growth is practically impossible, as can be seen. in case No. 6, which is pure molasses.
  • the strains grow in a percentage of 40% sucrose without difficulty, at the end of the fermentation of this broth the theoretical alcoholic grade that would be obtained would be 25.93 °, giving the calculation, equivalent to 20.7% vol .
  • Figure 18 shows a molasses flask in which the sucrose concentration is 42.7%
  • Figure 19 shows a molasses flask in which the sucrose concentration is 18.4%
  • Figure 20 shows a flask with molasses in which the concentration of sucrose is 12.2%.
  • the results obtained, see Figure 18, demonstrate that a broth with a content up to 42.7% of sugar can be fermented, which is 27.68 °, 28% volume / volume of ethanol (see theoretical calculation method above exposed), something really extraordinary.
  • a separate material is molasses that, being a very viscous fluid, the cells find a lot of resistance to diffuse through it, so when the molasses is not diluted with some water, cell growth is practically impossible.
  • Embodiment No. 5 CAPACITY OF MIXED VINETS IN THE FERMENTATION OF SUGARS
  • starch is the origin of treatments for the production of both bread or beer.
  • Different solutions of starch in water were prepared, the starch is not soluble in water, so it is resuspended.
  • the acid hydrolysis method was used, which consists of lowering the pH to 0.8 with sulfuric acid and stirring it at 84 ° C for 6 hours.
  • the starch concentrations used are: 10%, 20%, 40% and 50%, all of them referred to in weight / volume percentage.
  • OD 60 or lower corresponds to flasks prepared with a higher concentration of starch, which is where the yeast is most resistant to survive, and therefore the number of these is lower. After 48 hours of stirring it stops so that there is no oxygen supply and the fermentation is allowed to end.
  • Figure 21 corresponds to a flask prepared with 20% starch.
  • Figure 22 corresponds to a flask prepared with 40% starch. Since the flour contains starch, and the yeasts are capable of fermenting starch, the use of these three strains of yeast in the fermentation process, at the same time, can confer higher quality, whatever the fermentation product of the flour that it is desired to obtain, since the coordinated action of the three yeasts will in itself improve the fermentation process.
  • the yeast that works best in glucose ⁇ Yellow Yeast 3) can give coverage to the other two in high-content media (they must somehow survive on 70% sucrose), Slow Growth Yeast 2 can create a veil that favors the absence of oxygen, and provide all the advantages for a better fermentation, and finally White Yeast 1 can grow in the middle of very high concentrations of ethanol, and perhaps protect the other species of yeasts present in the process. Consequently in any process in which fermentation from fermentable sugars is present, these yeasts can presumably provide a higher quality to the product obtained.
  • the species Nicotiana glauca was taken. They were taken samples of different parts of the plants, root, green stem, woody stem and leaves. In order to obtain the sugars from the plants, they were crushed and the crushed was mixed with water so that the plant's soluble sugars dissolved in the water. At this point the amount (in percentage weight / volume) of sugar present in the media was:
  • the samples were inoculated with the strains from a saturated culture in YPD medium. 35 ⁇ of culture of each strain, of the mixture of White Yeast 1, Slow Growth Yeast 2 and Yellow Yeast 3 were inoculated. These media were stirred at 240 rpm and 28 ° C for 48 hours. The cell growth and the amount of sugar in the samples were then measured to determine what was consumed.
  • Root 0.77 0.865 The data shows how yeasts have consumed the initial sugar.
  • the yeast that works best in glucose (Yellow Yeast 3) can provide coverage to the other two in high-content media (they must somehow survive on 70% sucrose, as evidenced by the results obtained), Slow Growth Yeast 2 can create a veil that favors the absence of oxygen, and provide all the necessary advantages for that a better fermentation takes place, and finally White Yeast 1 can grow in a medium with very high concentrations of ethanol, and perhaps thus protect the other yeast species present in the process, thus stopping (protecting the whole of yeasts) there is a subsequent improvement of the obtained broths, or of whatever the product obtained. Consequently, in any process in which fermentation is present, from fermentable sugars, these yeasts can presumably provide a higher quality to the product obtained. Therefore, this would explain why a higher quality of the product obtained with various fermentable sources (sucrose, molasses, starch, must, etc.) should be obtained.
  • Yellow Yeast 3 could be used in those processes in which a yeast with great resistance to osmotic stress is necessary, and which is also capable of growing, developing, reproducing and fermenting.
  • Osmotic stress is a problem of fighting for water in an aqueous environment.
  • a very high concentration of glucose implies a remarkably effective defensive system to avoid damage caused by strong pressure.
  • the more glucose in the medium the more external pressure in the cell to the outside. Therefore it is a phenomenon that has many physical, chemical and biological implications. This phenomenon is of such importance that numerous research groups have been studying it in the world for tens of years, to know the damage and responses in the cells. Especially S. cerevisiae yeast has been used for this purpose.
  • White Yeast 1 has a very high ethanol tolerance. To speak of an ethanol concentration of 60% in plaque and 70% v / v in liquid, means talking about numbers not reported in the art to date in any scientific journal or patent document, for S. cerevisiae strains. As in the case of glucose resistance, the values described multiply those observed to date by several orders of magnitude. This means that the strains of the present application White Yeast 1, Slow Growth Yeast 2 and Yellow Yeast 3, have a potential to solve scientific and technical problems, of orders of magnitude greater than the strains known to date. In the case of White Yeast 1 it is important to note the role that could potentially develop. Ethanol is a toxic to most living organisms. Its toxicity depends on the species and concentration.
  • White Yeast 1 may have applications in this area. It can be used to study how microorganisms survive (and especially a model organism such as S. cerevisiae yeast) at high concentrations of ethanol, and thus be able to determine the keys to the process. They could also be used to transport microorganisms that are not resistant to high concentrations of ethanol by such solutions. A high concentration of White Yeast 1 can create a microenvironment that allows certain microorganisms to survive for a short period of time. The same could be said of Yellow Yeast 3 for high concentrations of sugar.
  • This type of strategy is used when, for example, DNA electroporation techniques in protoplasts are performed, the action of exo- and endonuclease is avoided (DNA is protected) by using high concentrations of a DNA other than the object of electroporation , such as salmon sperm.
  • Yeasts are oxidative, fermentative, or their metabolic activity is both types. On the surface of a liquid, oxidative yeasts can grow in the form of a film, a veil, or a foam, and are therefore called film-forming yeasts. Slow Growth Yeast 2 is especially sensitive in its morphological plasticity, to the changes produced by key aspects of fermentation. For example, when its development in YPD plate is observed (see Figures 3 and 4), rapid blackening can be seen over time. If a rapid change in these yeasts is observed (it quickly changes from an intense white color to a strong black; yeasts in a normal state have a white color), it must be because some factor is in contact with which it is usually not. This factor is probably oxygen.
  • sugars are the most appropriate energy source for yeasts, although in oxidative ones, for example, film formers oxidize organic acids and alcohol, and also contribute to the production of flavors or "bouquet" of wines. Therefore, a commercial use of this yeast would be to provide the vine strains with a bouquet, or any other fermentation process such as the production of spirits, low-alcoholic beverages, bread, etc. It could also be used in any industrial process of those mentioned above or where the absence of oxygen is especially necessary and important, and that allows the use of a film-forming yeast, such as for example the production of an oxygen sensitive drug or substance . Within this group, all substances considered as antioxidants would be framed, that is, those that are especially sensitive to an electronic imbalance in the environment in which they are found. Electronic imbalance characterized by an excess or defect of electronic load with respect to a baseline state.
  • This same yeast could be used to protect certain solutions from the phenomenon of oxidation, as a method of preventing the loss of natural properties of food, or industrial solutions, sensitive to oxygen or, which is the same (produced by oxygen or not) to the presence of an agent that creates an electronic imbalance, either by capturing electrons (for example, oxygen), or by releasing electrons (for example, Fe2 +).
  • an agent that creates an electronic imbalance either by capturing electrons (for example, oxygen), or by releasing electrons (for example, Fe2 +).
  • antioxidants a large number of substances of biomedical interest are grouped, and beneficial, in general for a large majority of living organisms, since their main function is to act as buffers of an electronic imbalance.
  • antioxidants those substances that are of interest in aging and cancer processes, such as antioxidants: citric acid, ascorbic acid (vitamin C), glutathione, resveratrol, etc.
  • they are substances that act as the pH indicators act, that is, they change their electronic conformation easily by gaining or losing electrons in the face of relatively small changes in the electronic balance of the environment in which they are found.
  • the manufacture, or transport, or storage of these substances creating a veil of this type would be clearly improved. Later this veil could be collected, in a simple centrifugation process. This could be, for example, of great interest in biomedicine or in all those food sectors where the use of antioxidant substances added to food has been booming in recent years. Also in industrial sectors where substances very sensitive to oxidation are manufactured.
  • this place of the technique may be occupied with other techniques such as manufacturing or vacuum packing, but in this case, the use of this type of yeast could mean a great cost reduction and in some cases an improvement in the quality of the product, since the implementation of the vacuum could have some impact on the product - at the time of producing it.

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Abstract

Método de cultivo de viñedos resistentes que selecciona viñas autóctonas teniendo pie natural, abona con las hierbas del terreno, sin otros nutrientes, recolecta en otoño. Método de fermentación que forma pie con uva estrujada, ocupa 20-25% de los depósitos, reproduce sus propias levaduras salvajes y alcanza inicialmente 3,5-6% vol. de alcohol, realiza rellenos posteriores cada 7-15 días; fermenta en escalera el azúcar total añadido. Obtiene tres levaduras distintas Levadura Blanca (1), Levadura de Crecimiento Lento (2) y Levadura amarilla (3), que permiten obtener directamente bebidas de alta calidad, sidra, cervezas, coñacs, roñes, vodkas, etc.; y productos hasta con 60% vol. /vol. de alcohol. Realizan la fermentación incluso a altas concentraciones de soluciones de sacarosa, melazas, azúcares de la hidrólisis de almidón y diversas materias vegetales. Ayuda a la producción de pan, bollería y derivados de calidad.

Description

MÉTODO DE CULTIVO DE VIÑEDOS Y OBTENCIÓN DE SUS LEVADURAS PARA FERMENTACIÓN EN ALTOS CONTENIDOS DE AZÚCAR Y ALCOHOL.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
Un primer objeto es desarrollar un método de cultivo de un viñedo resistente a las inclemencias meteorológicas y/o climáticas con el desarrollo de raíces profundas y fuertes Un segundo objeto es desarrollar un método de fermentación profunda con levaduras salvajes de uvas que recuerden al terreno y posean sus propiedades organolépticas, y métodos de obtención de vinos con alta graduación alcohólica.
Un tercer objeto es desarrollar un método de obtención y de uso de levaduras salvajes de uvas, capaces de realizar la fermentación de azúcares en bajas hasta altas concentraciones, provenientes de las soluciones de la sacarosa, del azúcar comercial, de la melaza procedente de caña de azúcar, de la melaza procedente de remolacha, la fermentación de azucares procedentes de la hidrólisis del almidón, y la fermentación de azucares procedentes de materias vegetales
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En la elaboración del vino es deseable que las levaduras completen la fermentación de todo el azúcar presente en el zumo de uva, así un alto grado de alcohol, normalmente hasta unos 14% vol. o no muy superior, da al vino su estructura final y aromática.
La fermentación de los mostos de uvas en la práctica se puede realizar con levaduras salvajes, levaduras inoculadas o empleando ambos procedimientos Las levaduras salvajes responsables de la vinificación se encuentran de forma natural en los hollejos de las uvas (generalmente en una capa en forma de polvo blanco fino que recubre la piel de las uvas, (vitis vinifera /.), y que se denomina "pruína"). Las cepas de levaduras cultivadas específicas, pueden proporcionar aromas afrutados específicos, alto grado de alcohol, textura agradable en nariz y otras características como fermentar a bajas temperaturas o con relativamente bajo pH etc.
En gran mayoría de las bodegas se utilizan habitualmente levaduras seleccionadas específicas para convertir el azúcar en alcohol. La especie de levadura que se considera mejor para la total fermentación del alcohol es la saccharomyces cerevisiae. La fermentación con levaduras salvajes o indígenas, aunque es muy minoritaria, la practican algunos elaboradores europeos, que han fermentado desde siempre con levaduras salvajes y con muy buenos resultados. Asimismo, elaboradores de vino californianos están empezando a poner en marcha esta fermentación espontánea, con resultados también muy favorables. En la cosecha, las uvas portan millares de organismos, incluidas las levaduras, con el consiguiente riesgo de infección. Una de las características más comunes de las levaduras salvajes es su baja resistencia al alcohol y su poca resistencia a las infecciones.
Sin embargo, muchos tipos de levaduras salvajes son incapaces de actuar una vez se alcance niveles de alcohol del 9% vol., resultando un atasco en la fermentación, un vino sin consistencia, con un sistema de baja inmunidad y gran cantidad de azúcar residual no deseada, entre otros problemas. Una dificultad adicional al utilizar levaduras salvajes en la fermentación, es el tiempo necesario para que la levadura salvaje establezca colonias, quedando el mosto abierto a una infección por otros organismos que tienen un desarrollo más rápido o a la oxidación, además, una vez comienza la fermentación, ésta es larga, lenta y sin garantías de que finalice correctamente. Otro problema añadido es la impredecibilidad de los aromas y ésteres que las levaduras salvajes pueden introducir en el vino. Sin embargo, con las levaduras seleccionadas o de laboratorio comerciales es posible conseguir los sabores y aromas deseados al gusto de cada elaborador.
Una ventaja del empleo de las levaduras salvajes es el hecho de que se tarde más tiempo en iniciar la fermentación, permite más tiempo de contacto de la piel con las uvas, lo que se traduce en más cuerpo, profundidad de carácter, color y sabores más afrutados (es decir, muchas más variables que con los vinos industriales). Se ha constatado que muchos de los impredecibles aromas y ésteres comunicados por las levaduras salvajes dan una interesante naturaleza sofisticada al vino, resultando un vino con sabores complejos, buen bouquet y muy buen alcohol.
Un modo de influir en la cosecha es el riego. Sin embargo, el efecto del riego respecto al grado alcohólico de los vinos es la disminución de la concentración de los azúcares, debido al efecto de la dilución. La producción aumenta al comparar vides irrigadas y no irrigadas, se observa que los compuestos fenólicos y la intensidad de los colorantes disminuyen en los vinos procedentes de vides irrigadas. En el mosto se constata un aumento del ácido málico en uvas de vides irrigadas. El efecto de aportaciones de agua al final de la maduración repercute negativamente en la composición del vino final y la calidad por la disminución de la concentración de elementos debido a la dilución producida en la baya por el agua.
En el estado de la técnica son escasos los trabajos que profundicen en los factores que influyen sobre las calidades de los vinos, pues los factores, que influyen sobre la glicólisis fermentativa de los azúcares por las levaduras salvajes, son complejos debido a la interrelación existente entre éstos, y a la naturaleza de los parámetros que intervienen durante el proceso de fermentación
El documento FR 2844275 tiene por objeto un procedimiento de vinificación natural con levaduras salvajes que se caracteriza por comprender los siguientes pasos: -transferir mediante gravedad las uvas a barricas de madera, - vibrado para asegurar el llenado completo de las barricas, - control de la fermentación de la uva en estos barriles con una oscilación periódica, etc. así como la posterior fermentación malo-láctica del vino y la conservación de este vino en el mismo barril de fermentación. No emplea bombas para el trasiego ni tanques, sólo cubas.
El documento WO2004029 93 propone un método de producción de un producto de fermentación, comprendiendo el método una etapa de fermentación que incluye el contacto con un microorganismo en fermentación o medios de fermentación utilizados con al menos una enzima de esterasa, como p.ej. lipasa, fitasas, fosfolipasa y cutinasa.
En el estado de la técnica, sin embargo, no aparecen referencias del cultivo de las viñas con objeto de conseguir cepas de levaduras salvajes para realizar la fermentación total del azúcar. Representaría un indudable interés práctico un método de obtener levaduras salvajes que realicen la fermentación total del azúcar y con garantías de superar infecciones vínicas.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a un método de cultivo de un viñedo resistente a las inclemencias meteorológicas y/o climáticas con el desarrollo de raíces profundas y fuertes, método de cultivo gracias al cual se desarrollan las levaduras salvajes que realizarán el proceso de fermentación del vino; y a un método de fermentación profunda por el que se realiza la total transformación del azúcar en alcohol, se desarrollan y multiplican estas levaduras salvajes en caldos que alcanzan tan alto grado de alcohol, totalmente superiores a los obtenidos por la fermentación convencional practicada hasta la fecha. E! método natural de cultivo consiste en la obtención de un vino totalmente natural, empezando por la selección de la vid, de forma que sea la propia vid la que se desarrolle y produzca sus frutos y por sus propias levaduras. La intervención del hombre se centrará en la preparación del suelo, cultivando las hierbas para posteriormente enterrarlas para su aportación orgánica al suelo "in situ" sin adición alguna de abono, haciéndose la planta fuerte de una manera natural y adaptándose al terreno por sí sola. Siguiendo este procedimiento, se ha comprobado a través de los años, que la cosecha se podía retrasar con lo que se conseguían unas uvas con más proporción de azúcar; se ha llegado a recoger incluso en los meses de enero y febrero, aunque en los últimos años ha sido posible adelantarla algo permaneciendo el resultado, en cuanto a calidad el mismo, y su producción ha aumentado. El método empieza desde en el mismo momento de la selección de viñas y llega hasta la consecución de la levadura de estas cepas, que posteriormente serán tratadas, en su caso, genéticamente para conseguir una multiplicación más rápida y para que sean las predominantes en el proceso de fermentación, es decir, que se desarrollen en cantidad y fuerza para que prevalezcan frente a otras levaduras que puedan aparecer y que además consigan la total fermentación de los azúcares, para obtener un vino con carácter y muy buen alcohol que le dará longevidad, aromas y sabores, que no sólo nos recuerden el fruto sino también la tierra y el ambiente donde se han cultivado las viñas, resolviendo un problema existente actualmente y que es que con levaduras salvajes o indígenas no se había conseguido, hasta ahora, la fermentación con un alto grado de alcohol.
Las etapas características esenciales del método natural de cultivo son:
- se seleccionan unas variedades de viñas naturales autóctonas, teniendo un pie natural, sin injerto alguno,
- se abonan dichas viñas con el compost obtenido de las propias materias orgánicas del terreno,
- se recolectan las uvas de forma tardía,
no se adicionan otros nutrientes que los del propio terreno
El método de fermentación profunda con levaduras salvajes de uvas, que recuerdan al terreno y poseen sus propiedades organolépticas; y muy importante fermentan la totalidad de los azúcares contenidos en las uvas. El método de fermentación profunda no emplea ningún tipo de levadura adicional, la realiza sólo con las levaduras salvajes propias de las uvas, es decir, se realiza la fermentación con las levaduras obtenidas de las uvas crecidas por el método natural de cultivo. Estas levaduras salvajes propias de las uvas cuyas propiedades en gran medida recuerdan al terreno son capaces de realizar la fermentación incluso con altos porcentajes de alcohol. En bodega durante largos años se ha ido viendo una evolución de las levaduras salvajes aportadas por las uvas, los sabores, aromas y el bouquet han ido mejorando y estandarizándose y el alcohol era cada vez mejor, hasta que en el año 2.004 sus propiedades se han estabilizado, dando a partir de entonces unos vinos más regulares por sus propiedades.
Más aún, el método de fermentación profunda con levaduras salvajes de uvas permite la obtención de caldos con contenidos aún superiores de alcohol, lo que permite la obtención directa de bebidas alcohólicas como coñacs, etc. Finalmente, el presente método crea las condiciones para la producción industrial de bioetanol con índices energéticos más eficaces en comparación con los obtenidos actualmente en producción industrial de bioetanol por la fermentación de materias primas como el jugo de la caña de azúcar, o la remolacha. Las etapas características esenciales del método de fermentación profunda son:
- formación de un pie de cuba con uva estrujada,
- realización de la fermentación en depósitos de capacidad inferior a 5.000 litros sobre el 20-25% de dicho volumen,
- reproducción de las levaduras salvajes autóctonas obtenidas, alcanzando del 3,5 a 6% vol. de alcohol,
- rellenos posteriores cada 7 a 15 días,
- fermentación con las mismas levaduras en escalera, realizando en etapas sucesivas la fermentación obteniendo en cada etapa un aumento del tanto por ciento de alcohol, hasta la fermentación de todo el azúcar y obtención de un vino de grado alcohólico final entre 14 a 21 % vol.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 corresponde al poso de una barrica que contenía un 17.7% de etanol, y del poso de una segunda barrica cuyo contenido en alcohol era 18.2%, sembradas ambas en placas del medio YPD. La Figura 2 muestra en una siembra en el medio YPD las Levadura Blanca 1 , Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3.
La Figura 3 presenta una muestra de la parte inferior del tanque y otra del poso del tanque de fermentación de uvas de la cosecha de 2008, en el medio YPD, se aprecian unos hongos filamentosos que podrían tratarse de la levadura de crecimiento lento.
La Figura 4 que corresponde igualmente a la cosecha de 2008, presenta una muestra de la parte inferior del tanque y otra del poso del tanque de fermentación, en el medio YPD, se aprecian unos hongos filamentosos, abundante presencia de levadura blanca y una pequeña de levadura amarilla.
La Figura 5.1 y la Figura 5.2 representan: la columna de la derecha es un medio YPD sin glucosa al que se le ha ido aumentando el nivel de etanol. La columna de la izquierda muestra placas de medio YPD que contiene un 1 % de glucosa. A la izquierda de las fotos, el texto indica el porcentaje de etanol en cada placa. Todas las placas están divididas en tres zonas y en cada zona respectiva está sembrada cada una de las cepas Levadura Blanca 1 , Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3. , La Figura 6 presenta el comportamiento de las tres cepas de levadura Levadura Blanca 1 , Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3. en medio YPD con un 1% de glucosa a niveles elevados de etanol. Igualmente, todas las placas están divididas en tres zonas y en cada zona está sembrada cada una de las cepas.
La Figura 7 presenta la morfología al microscopio de la siembra por separado de la levadura blanca. La Figura 8 presenta la morfología vista al microscopio de la siembra por separado de la levadura blanca luego de un crecimiento más avanzado.
La Figura 9 corresponde a la levadura de crecimiento lento al microscopio por separado. La Figura 10 corresponde a la misma placa de la Figura 4 a partir de la cual se van a analizar unas hifas obtenidas en un mosto en fermentación.
La Figura 1 1 presenta una de las hifas entera, incluyendo su cabeza. La Figura 12 presenta una ampliación de la cabeza de la hifa de la Figura 11 , y en la que se puede ver que está compuesta por sus pequeñas células.
La Figura 13 es una ampliación donde se observan las pequeñas células de la Figura 12. La Figura 14 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C02 de la muestra en la fermentación de un medio con un 60% de azúcar comercial (sacarosa).
La Figura 15 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C02 de la muestra en la fermentación de un medio con un 70% de azúcar comercial (sacarosa).
La Figura 16 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C02 de la muestra en la fermentación de la melaza de remolacha con un contenido del 12,2% en sacarosa.
La Figura 17 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C02 de la muestra en la fermentación de la melaza caña de azúcar pura con un contenido en sacarosa del 40%.
La Figura 18 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C02 de la muestra en la fermentación de la melaza de remolacha con un contenido en sacarosa del 12,2%.
La Figura 19 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C02 de la muestra en la fermentación de la melaza de remolacha con un contenido en sacarosa del 18,4%.
La Figura 20 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C02 de la muestra en la fermentación de la melaza de remolacha con un contenido en sacarosa del 42,7%.
La Figura 21 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C02 de la muestra en la fermentación de azúcares procedentes de almidón con una concentración de almidón del 20%. La Figura 22 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C02 de la muestra en la fermentación de azúcares procedentes de almidón con una concentración de almidón del 40%.
La Figura 23 es una fotografía de un tubo con espuma debida al desprendimiento de C02 de la muestra en la fermentación de azúcares procedentes de materia vegetal.
La Figura 24 es una fotografía de un tubo con espuma debida al desprendimiento de C02 de la muestra en la fermentación de azúcares procedentes de materia vegetal.
REALIZACIONES PREFERENTES
Realización N°1. MÉTODO DE CULTIVO DE UN VIÑEDO RESISTENTE a). Condiciones de cultivo:
Los trabajos se iniciaron en 1.989. Se seleccionaron las viñas autóctonas, Bobal, CRUJIDERA, Royal y Tardana. Desde el primer momento se realiza una agricultura enteramente natural. En el cultivo no se emplea ningún abono químico ni orgánico, a excepción del compost elaborado con las hierbas del terreno donde están plantadas las vides. Esto corresponde al Primer Objeto de la Invención, Método de cultivo de un viñedo resistente, que consiste en conseguir unas viñas resistentes por sí mismas y que sean capaces de bastarse con los nutrientes propios del terreno, por lo que desarrollarán unas raíces profundas y fuertes. Así, se consigue que la uva adquiera los sabores y aromas que recuerden al terreno donde se cultivan. No se realiza ningún riego, a pesar de que la pluviosidad en la zona es inferior a 500 l/m2, ya que se trata de un clima continental y seco, (entre 300 a 500 mm de pluviosidad). Esto corresponde asimismo al Primer Objeto de la Invención para el tipo de cultivo, que logrará que también las levaduras presentes en la piel de las uvas se adapten a esta climatología. b) Cronología de recolección y características de las uvas:
- Año 1.990: se recoge la uva más tarde, pues las uvas aguantaban perfectamente debido principalmente a la forma de cultivo. Estas viñas se han ido extendiendo por el terreno, terreno que tiene orientación sur y que se encuentra en un microclima, ya que a ambos lados del mismo existen dos pequeños bosques.
Años 1.996 a 1.998: Las viñas empezaron a producir uvas de diferentes sabores y aromas a partir de los 6, 7 años y van mejorando cada año la calidad de su producción. Se hace vino con las uvas recolectadas tardíamente, en correspondencia con el Segundo Objeto de la Invención. Para este tipo de cultivo tardío se logra un alto grado alcohólico entre 14° a 16° alcohol, de una forma totalmente natural con las levaduras salvajes que aparecen en el mosto, es decir, superando en mucho la opinión generalizada que las levaduras salvajes difícilmente sobreviven y se desarrollan en medios con tales altos grados de alcohol. Aunque no se aclimatan a más graduación de alcohol ya en el año 1.998 cambian los aromas. Se sabe que las levaduras son seres vivos muy sensibles y parece que se están aclimatando gradualmente a estas altas graduaciones de alcohol.
- Año 2.002: Según el Primer Objeto de la Invención, se recoge la primera cosecha comercial realizando la vendimia tardía, en época de nieblas y especialmente después de las lluvias del otoño. Se ha establecido según la Invención que aunque normalmente cuando llueve en septiembre las uvas engordan, no obstante, con las lluvias del otoño engrosa la piel de las uvas, las uvas no engordan, y es cuando aparecen las levaduras del Segundo Objeto de la Invención, método de fermentación profunda con levaduras salvajes, las que intervendrán posteriormente en el proceso innovador de fermentación del azúcar.
Realización N°2. MÉTODO DE FERMENTACIÓN PROFUNDA CON LEVADURAS SALVAJES Según el Segundo Objeto de la Invención, la obtención del vino se realiza:
elaborando un pie de cuba con uva estrujada, en depósitos de capacidad inferior a 5.000 litros, sobre el 20-25% de dicho volumen, o una relación proporcional equivalente, para que se reproduzca la levadura, siendo ésta la levadura salvaje o natural de la viña.
- Duración de la fermentación: entre 15 a 20 días alcanzando del 3,5 a 6% vol. de alcohol. - A partir de este pie de cuba, se va añadiendo del 15 al 20% del volumen del contenedor cada 7 a 15 días, realizando una fermentación en escalera y aportando de esta manera oxígeno y nutriente a las levaduras que aumentarán la graduación alcohólica, hasta conseguir fermentar todo el azúcar y
- Grado alcohólico final entre el 16 al 19% vol. de alcohol.
2.1- Producción a partir de 2002: En el año 2.002 se produjeron caldos con 15,5° de alcohol, en el 2.003 igual grado alcohólico, y en el año 2.004 se obtiene ya una cantidad de alcohol entre 15,5 a 18,98% vol..
De esta forma se consigue obtener un vino con cuerpo, muy buen alcohol, con lo que se asegura su calidad a lo largo del tiempo, y con muy buenos sabores que nos recuerdan al ambiente y al terreno, aromas que recuerdan el fruto donde proceden, consiguiéndose un bouquet y personalidad característicos y debido a la longevidad de las viñas, (viñedos viejos con más de 70 años), una mayor calidad en los caldos fermentados.
2.2.- CARACTERIZACIÓN DE LAS LEVADURAS SALVAJES AUTÓCTONAS.
Según el Tercer Objeto de la Invención, Método de obtención de levaduras salvajes autóctonas, se ha estudiado en laboratorio las levaduras causantes de la fermentación correspondiente al Segundo Objeto de la Invención, para lo que se extrajeron muestras representativas del vino producido.
Muestras: Las muestras recogidas pertenecían a la cosecha de 2004 y fueron:
- Muestra del poso de una barrica que contenía un porcentaje de etanol de 17.7% vol. de alcohol, en adelante 17.7%.
- Muestra del poso de otra barrica cuyo contenido en alcohol era 18.2% vol. de alcohol, en adelante 18.2%. Estudio de las muestras en placas:
1- Las muestras se sembraron en placas conteniendo el medio YPD (Yeast extract- Peptone-Dextrose). En la Figura 1 se puede ver un ejemplo de los resultados obtenidos, en el que se observan tres tipos distintos de colonias.
2- Se tomó una muestra de los tres tipos de levadura y se sembró en una nueva placa del medio YPD para que crecieran en mayor cantidad y poder diferenciarlas mejor, véase la Figura 2. Se ha señalado con una flecha cada una de las levaduras en esta Figura 2, así se distinguen la Levadura Blanca 1 , la Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3. 3- Con las levaduras perfectamente definidas y diferenciadas, se determinó su capacidad de crecimiento. Se tomó la misma cantidad de cada tipo de levadura y se sembró en una nueva placa YPD y se comprobó que la levadura denominada de crecimiento lento, efectivamente crecía más lentamente que las otras dos.
4- Se tomaron nuevas muestras, pero no de barricas, sino ahora del tanque de fermentación y de la cosecha de 2008.
- Se tomó una muestra del líquido de la parte inferior del tanque.
- Se tomó otra muestra del poso del tanque de fermentación.
Las dos muestras fueron sembradas en dos placas del medio YPD y se observó la aparición de unos hongos filamentosos, indicados en la Figura 3 y véase mejor en la Figura 4, con una flecha, que suponíamos podría tratarse de la levadura de crecimiento lento 2 que en el proceso de fermentación se encuentra en forma de hongos filamentosos, para posteriormente evolucionar a la forma de levadura que hemos obtenido en barricas. En las placas también se observan abundante levadura blanca 1 y en menor medida la levadura amarilla 3.
- ENSAYOS DE LAS LEVADURAS AISLADAS A DISTINTAS CONCENTRACIONES DE ETANOL a- Siembra de los glicerinados de las tres levaduras - Crecimiento de las levaduras a distintas concentraciones de etanol y glucosa
Se realizaron los glicerinados de cada una de las tres levaduras y se sembraron en medios con distintos niveles de etanol para ver su capacidad para desarrollarse. Se prepararon dos tipos de medios, uno con glucosa (1%) y otro sin glucosa. Después de algunos intentos fallidos de preparación en el medio de YPD con etanol, debido a que las concentraciones elevadas de etanol fluidifican en exceso el medio YPD, se elaboró un procedimiento adecuado. Se consigue que el medio solidifique al aumentar la cantidad de agar en dependencia de la cantidad de etanol que se fuera a añadir a continuación. En estas placas se sembraron las levaduras, cuidando de sembrar la misma cantidad de las levaduras en todas las placas, obteniendo los siguientes resultados, véanse las Figuras 5.1 y 5.2:
1.- La levadura blanca crece adecuadamente en todas las concentraciones de etanol y en grandes cantidades tanto en el medio con glucosa (1%), como en el medio sin glucosa, pues puede utilizar como fuente de alimentación tanto el carbono del etanol, como también la peptona y el extracto de levadura, que son componentes del medio YPD. 2. -La levadura amarilla presenta una morfología distinta dependiendo de si el medio contiene glucosa, o no. En medios con glucosa crece en forma de grandes colonias, mientras que en los medios sin glucosa crece en forma de colonias más pequeñas, pero en mucho mayor número. En ambos casos se produce una reducción de la cantidad producida de levadura al aumentar el porcentaje de etanol.
3. - La levadura de crecimiento lento al igual que la levadura amarilla crece de forma distinta dependiendo de si el medio lleva glucosa, o no. En este caso, el comportamiento es el opuesto a la levadura amarilla, así las colonias en el medio sin glucosa presentan un mayor tamaño, que las colonias en el medio con glucosa aunque estén en menor número. En cuanto al crecimiento en los distintos niveles de etanol vemos como a niveles altos de etanol crecen con más dificultad. b.- Crecimiento de las levaduras a concentraciones superiores de etanol
En ensayos posteriores se aumentó la concentración de etanol para determinar la concentración límite de etanol que resiste cada tipo de levadura. Este ensayo entrañaba un problema y era que la cantidad de etanol a añadir era bastante alta y el medio podía tener problemas para solidificar, por lo que se decidió aumentar la concentración de agar en el medio del 2% al 3%. La cantidad de glucosa que se empleó en el medio fue del 1%
Se obtuvieron los siguientes resultados:
La. levadura blanca creció significativamente en todas las concentraciones de etanol. La diferencia entre unas concentraciones y otras era la velocidad de crecimiento de la levadura. Para las concentraciones mayores, la velocidad de crecimiento es menor, la levadura empleó más días en crecer, pero como se puede ver la cantidad de levadura crecida es muy similar en todas las placas.
La levadura amarilla creció en todas las placas, pero su crecimiento fue pequeño, en algunas placas incluso cuesta observar si ha crecido o no. Así, en las placas que se observa un mayor crecimiento son las de 25 y 40% vol. de etanol.
La levadura de crecimiento lento creció en un gran número de colonias para una concentración del 25% vol. y para mayores concentraciones de etanol no experimentó crecimiento alguno.
Así, preliminarmente se concluye que la levadura de crecimiento lento no resiste condiciones en las que la concentración de etanol sea superior al 25% vol., mientras que la levadura blanca resiste concentraciones de etanol muy elevadas, y a la levadura amarilla le cuesta mucho crecer en todas las concentraciones de etanol, y crece en cantidades muy pequeñas. c- Ensayos de levaduras a niveles aún mayores de etanol.
Los niveles de etanol ensayados en estas placas fueron: 40%, 45%, 50%, 60% vol. Los resultados obtenidos, véase la Figura 6, fueron:
- La levadura blanca crece significativamente en todas las placas aunque a 60% vol. de etanol se aprecia una marcada disminución de la cantidad de levadura, posiblemente, porque a este nivel se ve afectada por la toxicidad del etanol. - La levadura de crecimiento lento no crece en ninguna de estas placas.
- La levadura amarilla sí presenta indicios de crecimiento en algunas de estas placas pero parece ser que es un crecimiento residual por la gran cantidad de levadura sembrada con el asa y que permanece en la estría de siembra. d.- Morfología de los distintos tipos de levaduras
Se observaron los distintos tipos de levaduras al microscopio.
En las Figuras 7 y 8 se pueden observar las imágenes correspondientes a la levadura blanca 1. En la Figura 8 se aprecia un gran número de células en reproducción.
En la Figura 9 se pueden observar las imágenes correspondientes a la levadura de crecimiento lento 2.
En la Figura 10 se pueden observar las imágenes correspondientes al mosto en fermentación recogido del tanque de fermentación de la cosecha de 2008, en el que se aprecian unas hifas, elementos filamentosos cilindricos característicos de la mayoría de los hongos.
En la Figura 1 1 se pueden observar las imágenes correspondientes a una hifa entera de la Figura 10, observándose perfectamente la cabeza de dicha hifa.
En la Figura 2 se pueden observar las imágenes correspondientes a una ampliación de la cabeza" de hifa de la Figura 11 , en la que se observa que está formada por pequeñas células.
En la Figura 13 se pueden observar las imágenes correspondientes a las pequeñas células que forman la cabeza de hifa de la Figura 12. Estas células tienen un aspecto muy parecido a las observadas en la levadura de crecimiento lento 2, véase la Figura 9. Aunque, el tamaño de las células de la cabeza de hifa resulta mayor y su membrana celular más gruesa que las de las células observadas en la levadura de crecimiento lento 2.
Realización N°3. CAPACIDAD DE LAS CEPAS MEZCLADAS EN LA FERMENTACIÓN DE LA
SACAROSA (AZÚCAR COMERCIAL).
Se prepara un medio de cultivo en matraces con diferentes concentraciones peso/volumen de azúcar comercial. Los componentes del medio son:
Fosfato monopotásico 0,5%
- Sulfato de amonio 0,2%
- Sulfato magnésico heptahidratado 0,004%
- Extracto de levadura 0,1%
- Agua.
Las concentraciones de azúcar son: 1 , 2, 10, 15, 20, 25, 30, 40 y 50 % todas ellas en porcentaje peso/volumen.
Preparación de las cepas de la levadura blanca 1 , amarilla 3, levadura de crecimiento lento 2 para inocularlas en los distintos medios:
Se siembran en el medio líquido YPD (5 mi), las colonias de las distintas cepas crecidas en placas de medio YPD, cada cepa por separado, y se ponen en agitación 24 horas a 240 r.p.m y 28°C. Una vez transcurrido este tiempo y habiendo crecido todas las cepas se pone 20 μΙ de cada una de ellas en un tubo de ensayo con 5 mi del correspondiente medio en cada tubo y se ponen en agitación a 240 r.p.m 24 horas.
Una vez trascurrido este tiempo cada medio presenta el siguiente crecimiento
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En los ensayos se mide la absorbancia para evaluar el crecimiento celular en el medio de cultivo. La medida de la absorbancia está directamente relacionada con la cantidad de células de levadura que hay en un determinado volumen de medio de cultivo. La diferencia medida por el espectrofotómetro entre la intensidad de la luz emitida por la lámpara y la que llega al detector una vez atravesada la muestra, es decir, la cantidad de luz absorbida por las células será mayor a mayor número de células en la muestra.
Estos valores de crecimiento ya nos dan una idea de que estas levaduras tienen una gran resistencia a altas concentraciones de azúcar.
Se traspasó el contenido del tubo de ensayo a un matraz con el medio de cultivo a su correspondiente concentración, quedando un volumen total de 40ml. Se puso en agitación a 240 r.p.m. durante 4 horas para que las células inoculadas se multiplicaran. Una vez transcurrido este tiempo se paró la agitación dejando los cultivos a 31 °C en condiciones anaerobias. Se puso una pequeña agitación (22 r.p.m) para intentar que las células estuvieran bien repartidas por todo el cultivo. En estos momentos se dio por comenzada la fermentación. A la semana siguiente se determinó la concentración de carbohidratos por el Método Colorimétrico Fenol-Sulfúrico de Dubois obteniendo los siguientes porcentajes:
Porcentaje azúcar inicial (%) Porcentaje azúcar final (%)
0,052
0,049
10 0,947 15 4,988 20 9,506 25 13,024 30 21 ,988 40 31 ,137 50 40,333
Así se puede observar como se ha reducido el contenido en azúcares en todos los matraces, lo que indica que se ha producido la fermentación a todas las concentraciones ensayadas.
A continuación se describe teóricamente, la cantidad de etanol que se puede encontrar en estos casos; por ejemplo para la concentración inicial 20% azúcar se ha obtenido una concentración final de 9,5% de azúcar esto quiere decir que en 100 mi de caldo inicial se han consumido 10,5gr de azúcar:
La reacción que describe la fermentación alcohólica es la siguiente:
C6H12°6 + 2 P¡ + 2 AJDP→ 2 CH3-CH2OH + 2 C02 + 2 ATP
De la relación estequiométrica obtenemos que por cada mol de glucosa obtenemos dos moles de etanol.
10Ornl de caldo → 10,5 gramos glucosa
10,5 gramos glucosa→ 0,058 moles glucosa (PM glucosa= 180,16gr/mol)
0,058 moles glucosa → 0,116 moles etanol (estequiometria 1 :2) 0,116moles etanol → 5,370 gramos etanol (PM etanol= 46,07 gr/mol)
5,370 gramos etanol → 6,806 mi etanol (densidad etanol= 0,789 gr/ml)
Resumen: 100 mi caldo→ 6,806 mi etanol. Si consideramos que el rendimiento real es el 80% del teórico: 6,806x0,8 = 5,445 mi de etanol. Es decir que en el ejemplo de una concentración inicial 20% de azúcar se ha obtenido una concentración final de alcohol aproximada de 5,4% vol.
Como parece que estas cepas de levadura resisten sin problemas concentraciones de hasta el 50% de azúcar el siguiente paso fue aumentar la concentración de azúcar. Se hicieron pruebas con concentraciones del 60 y 70% (peso/volumen) de azúcar, véanse la Figura 14 y 15. Se observa la formación de espuma producida por las burbujas de C02 producto de la fermentación. Estos medios estuvieron en agitación 72 horas a 28°C y 240 r.p.m. Para comprobar que las cepas crecen sin problemas en estos medios tan concentrados en azúcar se midió la densidad óptica de estos dos cultivos y los resultados que se obtuvieron fueron:
Figure imgf000017_0001
Se constata que las cepas crecen incluso en el medio con una concentración de azúcar del 70%; al final de la fermentación de este caldo el grado alcohólico teórico que se obtendría sería 45,37°. A continuación se expone el algoritmo de cálculo de este dato.
La reacción que describe la fermentación alcohólica es la siguiente: C6H1206 + 2 P¡ + 2 ADP→ 2 CH3-CH2OH + 2 C02 + 2 ATP
De la relación estequiométrica obtenemos que por cada mol de glucosa obtenemos dos moles de etanol.
100ml de -caldo 70 gramos glucosa
70 gramos glucosa 0,338 moles glucosa (PM glucosa= 180,16gr/mol)
0,338 moles glucosa 0,777 moles etanol (estequiometria 1 :2)
0,777 moles etanol 35,8 gramos etanol (PM etanol= 46,07 gr/mol)
35,8 gramos etanol * 45,37 mi etanol (densidad etanol= 0,789 gr/ml)
Resumen: 100ml caldo→ 45,37 mi etanol. Si consideramos que el rendimiento real es el 80% del teórico: 45,37x0,8=36,30 mi etanol, o una concentración de 36,35 vol.
Realización N°4. CAPACIDAD DE LAS CEPAS MEZCLADAS EN LA FERMENTACIÓN DE LA MELAZA (PROCEDENTE DE CAÑA DE AZÚCAR) CON DIFERENTES DILUCIONES.
Se utilizó la melaza procedente de la caña de azúcar como base para el medio de cultivo. A partir de esta melaza se hicieron distintas diluciones para comprobar el comportamiento de las cepas ante los distintos niveles de azúcar. La melaza de partida tenía 78,9° Brix y un contenido en sacarosa del 49,9%.
Los medios preparados se muestran en la siguiente tabla:
Figure imgf000018_0001
El procedimiento para la inoculación de las cepas es el siguiente:
Se toma una colonia de cada cepa, Levadura Blanca 1 , la Levadura de Crecimiento Lento 2 f \a Levadura amarilla 3 sembrada en el medio YPD, y se resuspenden todas juntas en 1 ml de agua. Se toma una alícuota de 5 mi de cada medio de cultivo preparado y se pone en tubos de ensayo, se inoculan 50 μΙ de la mezcla de cepas a cada tubo. Se pone en agitación a 240 r.p.m y 28°C. A las 66 horas muestran el siguiente crecimiento:
Figure imgf000018_0002
Los valores de OD6oo de cada muestra son independientes de las otras, siendo una medida de cómo se hayan adaptado las levaduras a ese medio.
El siguiente paso es transferir una alícuota con una dilución 1/1000 del contenido de estos tubos a su correspondiente matraz. Una vez inoculadas las levaduras al matraz se aplica una agitación a 240 r.p.m y 28°C. A las 16 horas presentaba el siguiente crecimiento:
Figure imgf000018_0003
A partir de las 16 horas, se reduce la agitación para disminuir el aporte de oxígeno y dar comienzo a la fermentación. En las Figuras 16 y 17 se observa la formación de espumas producidas por la presencia de C02 liberado, producto de la fermentación. La Figura 16 corresponde a un matraz en el que la concentración de sacarosa es del 23%. La Figura 17 corresponde a un matraz en el que la concentración de sacarosa es del 40%. Es de señalar que la melaza es un fluido muy viscoso por lo que las células encuentran mucha resistencia para difundir a través de esta, es por eso que cuando la melaza no está diluida con algo de agua el crecimiento celular resulta prácticamente imposible, como se aprecia en el caso N° 6, que es melaza pura. Así, vemos que las cepas crecen en un porcentaje del 40% de sacarosa sin dificultad, al final de la fermentación de este caldo el grado alcohólico teórico que se obtendría sería 25,93°, dando el cálculo, equivalente al 20,7% vol.
Se realizó otro experimento con melaza procedente de remolacha, esta melaza tenía una concentración de 76,8° Brix. El contenido en sacarosa de esta melaza era del 47%. Se prepararon las siguientes diluciones de la melaza para la preparación de los medios:
Figure imgf000019_0001
En estos medios se inocularon las cepas estudiadas de Levadura Blanca 1 , la Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3 y se pusieron en agitación a 240 r.p.m y 28°C. El crecimiento observado después de una semana de agitación fue:
% sacarosa OD600
6,1 12,88
12,2 11 ,22
18,4 14,3
24,4 13,32
27,5 12,36
30,5 9,4
36,6 2,54
42,7 2,34
47
De esta tabla se puede comprobar cómo a partir de 30,5% de sacarosa, las levaduras ya van encontrando más resistencia para su reproducción, esto se manifiesta con una disminución de la absorbancia, aunque todavía a 42,7% persiste la formación de espuma y tienen suficiente capacidad para realizar la fermentación alcohólica.
Esto se puede observar en las Figuras 8, 19 y 20. La Figura 18 muestra un matraz con melaza en el que la concentración de sacarosa es del 42,7%, la Figura 19 muestra un matraz con melaza en el que la concentración de sacarosa es del 18,4%, la Figura 20 muestra un matraz con melaza en el que la concentración de sacarosa es del 12,2%. Los resultados obtenidos, véase la Figura 18, demuestran que se puede fermentar un caldo con un contenido hasta 42,7% de azúcar, lo que supone un 27,68°, 28% volumen/volumen de etanol (véase método de cálculo teórico anteriormente expuesto), algo realmente extraordinario. Como hemos señalado un material aparte es la melaza que al ser un fluido muy viscoso las células encuentran mucha resistencia para difundir a través de esta, por eso cuando la melaza no está diluida con algo de agua el crecimiento celular es prácticamente imposible.
Realización N°5. CAPACIDAD DE LAS CEPAS MEZCLADAS EN LA FERMENTACIÓN DE AZUCARES
PROCEDENTES DE LA HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN. Representa indudable interés práctico la presente realización ya que el almidón es el origen de tratamientos para la producción de ambas, pan o de cerveza. Se prepararon diferentes disoluciones de almidón en agua, el almidón no es soluble en agua por lo que queda resuspendido. Para hidrolizarlo se utilizó el método de hidrólisis ácida que consiste en bajar el pH a 0,8 con ácido sulfúrico y ponerlo en agitación a 84°C durante 6 horas.
Las concentraciones de almidón utilizadas son: 10%, 20%, 40% y 50% todas ellas referidas en porcentaje peso/volumen. Una vez hidrolizado el almidón se neutralizó el pH con NaOH y se inocularon las cepas procedentes de un cultivo saturado en el medio YPD, un cultivo saturado es aquél en el que el número de células permanece constante, es decir, mueren las mismas que nacen. Se inocularon 170 μΙ de cultivo de cada cepa, la mezcla de la Levadura Blanca 1 , la Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3. A las 48 horas de agitación a 240 r.p.m y 28°C los medios presentan el siguiente crecimiento:
Porcentaje inicial de almidón en el matraz
Í%1 OD600
10 0,749
20 0,556
40 0,471
50 0,351
Como se aprecia en la tabla anterior, las OD60o más bajas corresponden a los matraces preparados con una mayor concentración de almidón que es donde mayor resistencia encuentran las levaduras para sobrevivir, y por lo tanto el número de éstas es menor. A las 48 horas de agitación se detiene la misma para que no haya aporte de oxigeno y se deja terminar la fermentación. La Figura 21 corresponde a un matraz preparado con un 20% de almidón. La Figura 22 corresponde a un matraz preparado con un 40% de almidón. Puesto que la harina contiene almidón, y las levaduras son capaces de fermentar almidón, la utilización de estas tres cepas de levadura en el proceso de fermentación, a la vez, puede conferir mayor calidad, cualquiera que sea el producto de fermentación de la harina que se desee obtener, puesto que la acción coordinada de las tres levaduras mejorará en sí mismo el proceso de fermentación. La levadura que funciona mejor en glucosa {Levadura Amarilla 3) puede dar una cobertura a las otras dos en medios de alto contenido de la misma (de alguna manera deben sobrevivir en un 70% de sacarosa), la Levadura de Crecimiento Lento 2 puede crear un velo que favorezca la ausencia de oxígeno, y proporcionar todas las ventajas para que se produzca una mejor fermentación, y por último la Levadura Blanca 1 puede crecer en medio de concentraciones muy elevadas de etanol, y tal vez proteger a las otras especies de levaduras presentes en el proceso. En consecuencia en cualquier proceso en que esté presente la fermentación desde azúcares fermentables, estas levaduras pueden proporcionar presumiblemente una mayor calidad al producto obtenido.
Experimento 6: CAPACIDAD DE LAS CEPAS MEZCLADAS EN LA FERMENTACIÓN DE AZUCARES
PROCEDENTES DE MATERIA VEGETAL.
Para la realización de este experimento se tomó, en calidad de ejemplo de materia vegetal procedente de plantas silvestres, la especie Nicotiana glauca. Se tomaron muestras de distintas partes de las plantas, raíz, tallo verde, tallo leñoso y hojas. Para poder obtener los azucares de las plantas, éstas de trituraron y se mezcló el triturado con agua para que los azucares solubles de la planta se disolvieran en el agua. En este punto la cantidad (en porcentaje peso/volumen) de azúcar presente en los medios era:
Muestra Porcentaje inicial de
azúcar (%)
Tallo verde 1 ,98
Tallo leñoso 1 ,53
Hoja 2,19
Raíz 1 ,61
A las muestras se les inocularon las cepas procedentes de un cultivo saturado en medio YPD. Se inocularon 35 μΙ de cultivo de cada cepa, de la mezcla de la Levadura Blanca 1 , la Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3. Se pusieron estos medios en agitación a 240 rpm y 28°C durante 48 horas. A continuación se midió el crecimiento celular y la cantidad de azúcar en las muestras para determinar la que se había consumido.
Muestra Porcentaje de azúcar (%) OD600
Tallo verde 1 ,710 1 ,221
Tallo leñoso 0,93 1 ,411
Hoja 1 ,98 1 ,363
Raíz 0,77 0,865 En los datos se aprecia como las levaduras han consumido el azúcar inicial.
Se detuvo la agitación de los medios para que se dejaran de oxigenar y comenzara la fermentación. A igual que en las Figuras anteriores, en las Figuras 23 y 24 se pueden ver las burbujas producto de la fermentación. Se repitió el experimento en medios en los que las concentraciones de azúcar fueran mayores. Para aumentar el contenido en azucares del medio se hizo una hidrólisis ácida del material vegetal obteniendo así las siguientes concentraciones de azúcar:
muestra Porcentaje inicial de azúcar (%)
Tallo verde 3,850
Tallo leñoso 16,59
Hoja 8,63
Raíz 18,50
En este momento se inocularon las cepas procedentes de un cultivo saturado de medio YPD. Se inocularon 35 μΙ de cultivo de cada cepa. Se mantuvieron estos medios en agitación a 240 rpm y 28°C durante 48 horas. Transcurrido este tiempo se midió el crecimiento celular. muestra OD600
Tallo verde 1 ,670
Tallo leñoso 1 ,183
Hoja 2,078
Raíz 1 ,881
Se puede comprobar cómo al aumentar el contenido en azúcares las levaduras no se ven afectadas.
DISCUSIÓN
De los resultados observados y expuestos anteriormente se pueden inferir varios hechos. La utilización a la vez de las tres cepas de levadura de la presente solicitud, en el proceso de fermentación, es decir de forma coordinada, puede conferir mayor calidad, cualquiera que sea el producto de fermentación que se desee obtener, puesto que la acción coordinada de las tres levaduras mejorará en sí mismo el proceso de fermentación. Puesto que estas tres levaduras fueron obtenidas de barrica, las tres deben de estar al final del proceso de fermentación donde las concentraciones de etanol rondan los 16-19 grados. La levadura que funciona mejor en glucosa (Levadura Amarilla 3) puede dar una cobertura a las otras dos en medios de alto contenido de la misma (de alguna manera deben sobrevivir en un 70% de sacarosa, pues así lo atestiguan los resultados obtenidos), la Levadura de Crecimiento Lento 2 puede crear un velo que favorezca la ausencia de oxígeno, y proporcionar todas las ventajas necesarias para que se produzca una mejor fermentación, y por último la Levadura Blanca 1 puede crecer en un medio con concentraciones muy elevadas de etanol, y tal vez proteger así a las otras especies de levaduras presentes en el proceso, para de esta forma (protegiendo el conjunto de levaduras) se produzca una posterior mejora de los caldos obtenidos, o de cualquiera que sea el producto obtenido. En consecuencia, en cualquier proceso en que esté presente la fermentación, desde azúcares fermentables, estas levaduras pueden proporcionar presumiblemente una mayor calidad al producto obtenido. Por tanto esto explicaría porqué se debe obtener una mayor calidad del producto que se obtenga con diversas fuentes fermentables (sacarosa, melaza, almidón, mosto, etc).
Por otra parte, esta acción coordinada junto con las características propias de cada cepa (analizadas en la presente Descripción) permiten explicar porqué se pueden fermentar soluciones con una altísima concentración de sacarosa (o sucedáneos) y por tanto obtener productos con una elevadísima concentración de etanol (recuérdese que la mayoría de las cepas de levadura no soportan concentraciones de etanol superiores al 13%).
La actuación coordinada de estas tres levaduras junto con la presencia inicial de mayores cantidades de azúcares, puede hacer que la fermentación sea más rica en productos secundarios. Se han analizado diversas materias (origen de fermentación) que cubren un amplio espectro de productos representativos de la industria de fermentación, como el azúcar, el almidón, la melaza, los restos vegetales, etc. Los microorganismos necesitan unas condiciones adecuadas para poder crecer, reproducirse, y desarrollarse. Esto no siempre se consigue. Puesto que las 3 levaduras estudiadas en la presente solicitud, son capaces de fermentar en un medio simple conteniendo almidón, se puede inferir que pueden ser útiles en aquellos procesos que utilicen el almidón como origen previo a la fuente de carbono para la fermentación. Se sabe que las levaduras son capaces de fermentar almidón hidrolizado, y que las levaduras son necesarias, no obstante para producción de cerveza.
Se puede inferir por tanto de lo analizado hasta aquí, que con la mezcla de estas levaduras se obtendrán:
1.- mayores concentraciones de etanol
2.- productos de mayor calidad
3.- fermentaciones de materias infermentables hasta la fecha por su elevado contenido de azúcar, y por su elevada producción consiguiente de etanol.
Destacando resultados positivos.
•Se pueden obtener bebidas con mayor graduación de alcohol •Se puede obtener alcohol con una mayor eficiencia energética, puesto que mayor concentración de etanol significa menor cantidad de energía invertida para destilar.
•Se pueden obtener vino, pan y cerveza de mayor calidad. Todos estos alimentos necesitan las levaduras para ser obtenidos. Su obtención con las levaduras descritas en la presente solicitud producirán un producto de mayor calidad.
•Se puede producir una elaboración más eficaz de bioetanol partiendo de biomasa, tanto no vegetal, como vegetal. En consecuencia, los costes de producción pueden ser mucho menores que los actuales. Esto significa una mejora sustancial de los procesos convencionales de obtención de bioetanol, partiendo de cualquiera de sus orígenes, en cuanto a fuente de carbono, puesto que sea cual sea dicha fuente, el sustrato de la fermentación es la glucosa que luego sería convertida a etanol por levaduras del género Saccharomyces cerevisiae (fundamentalmente). Las industrias que probablemente moverán mas volumen económico y más beneficiadas serán, entre otras: la de producción de bioetanol como combustible, y la de las alcoholeras industriales, que producen alcohol de fuentes poco elevadas en concentración de sacarosa o glucosa, y por tanto son muy poco eficientes en costes..
•Los resultados obtenidos permiten inferir que las levaduras estudiadas en la presente solicitud son capaces de mejorar energética y económicamente, en general, todo proceso basado en la fermentación de azúcares. Por tanto no debe descartarse la utilización de las levaduras aquí descritas en cualquier proceso de fermentación de azúcares, lo que puede incluir prácticamente la producción de cualquier bebida alcohólica obtenida desde plantas o derivados, como frutas, partiendo de sus azúcares ya extraídos o extrayéndolos.
Trabajo de las levaduras encontradas en la presente solicitud:
•Las levaduras trabajan coordinadamente, no hay otra manera de explicar que cada una de ellas tenga un papel preponderante, es decir, nos encontramos ante un fenómeno de sinergismo.
«La Levadura Amarilla 3 podría utilizarse en aquellos procesos en los que sea necesaria una levadura con gran resistencia a estrés osmótico, y que además sea capaz de crecer, desarrollarse, reproducirse y fermentar. El estrés osmótico es un problema de lucha por el agua existente en un medio acuoso. Una concentración muy elevada de glucosa implica un sistema defensivo notablemente eficaz para evitar los daños producidos por una fuerte presión. Cuanta más glucosa en el medio más presión extema en la célula hacia el exterior. Por tanto es un fenómeno que tiene muchas implicaciones físicas, químicas y biológicas. Este fenómeno es de tal importancia que numerosos grupos de investigación vienen estudiándolo en el mundo desde hace decenas de años, para conocer los daños y respuestas en las células. Especialmente se ha utilizado la levadura S. cerevisiae para este propósito. Actualmente existen muchos grupos de investigación empeñados en mejorar alguno/s de los paso/s cruciale/s, tanto del daño como de la resistencia, para al final obtener levaduras como la Levadura Amarilla 3, con el agravante, de que aquellas serían modificadas genéticamente y esta levadura de la presente solicitud es una levadura obtenida por selección natural.
»La Levadura blanca 1 posee una tolerancia al etanol muy elevada. Hablar de una concentración de etanol de un 60% en placa y un 70% v/v en líquido, significa hablar de números no reportados en la técnica hasta la fecha en ninguna revista científica o documento de patente, para cepas de S. cerevisiae. Al igual que en el caso de la resistencia a glucosa, los valores descritos multiplican los observados hasta la fecha en varios órdenes de magnitud. Esto significa que las cepas de la presente solicitud Levadura blanca 1 , Levadura de Crecimiento Lento 2 y Levadura Amarilla 3, poseen un potencial para resolver problemas científicos y técnicos, de órdenes de magnitud superiores a las cepas conocidas hasta la fecha. En el caso de la Levadura blanca 1 es importante notar el papel que potencialmente podría desarrollar. El etanol es un tóxico para la mayoría de los organismos vivos. Su toxicidad depende de las especies y de la concentración. El etanol es utilizado desde muy antiguo para desinfectar, todo tipo de material, en ámbitos relacionados con la medicina. Normalmente la gran mayoría de las especies de bacterias patógenas se ven afectadas por el etanol, causándoles la muerte. La Levadura Blanca 1 puede tener aplicaciones en este ámbito. Se puede utilizar para estudiar como sobreviven los microorganismos (y en especial un organismo modelo como es la levadura S. cerevisiae) a concentraciones elevadas de etanol, y así poder determinar las claves del proceso. También podrían servir para transportar microorganismos no resistentes a elevadas concentraciones de etanol por ese tipo de soluciones. Una elevada concentración de la Levadura blanca 1 puede crear un microentorno que permita sobrevivir durante un corto período de tiempo a ciertos microorganismos. Lo mismo se podría decir de la Levadura Amarilla 3 para elevadas concentraciones de azúcar. Este tipo de estrategia se utiliza cuando se realizan, por ejemplo técnicas de electroporación de DNA en protoplastos, la acción de las exo- y endonucleasa se evita (se protege el DNA) mediante la utilización de elevadas concentraciones de un DNA distinto al objeto de electroporación, como por ejemplo esperma de salmón.
•Las levaduras son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos. En la superficie de un líquido, las levaduras oxidativas pueden crecer en forma de película, de velo, o de espuma, y por ello se denominan levaduras formadoras de película. La Levadura de Crecimiento Lento 2 es especialmente sensible en su plasticidad morfológica, a los cambios producidos por aspectos claves de la fermentación. Por ejemplo, cuando se observa su desarrollo en placa de YPD (véanse las Figuras 3 y 4), se aprecia un ennegrecimiento rápido con el paso del tiempo. Si se observa un cambio rápido en dichas levaduras (pasa rápidamente de un color blanco intenso a un negro fuerte; las levaduras en un estado normal tienen color blanco), debe ser porque está en contacto algún factor con el que habitualmente no lo está. Este factor probablemente es el oxígeno. Apoya esta hipótesis, el hecho dé que el ennegrecimiento se observa primero y de forma más intensa en la parte de la levadura que está en contacto con el oxígeno en mayor concentración (superficie del medio YPD). Refuerza esta hipótesis, la observación de que este fenómeno se produce cuando la Levadura de Crecimiento Lento 2 se encuentra en forma de micelio y no cuando se encuentra en forma esférica. Esta argumentación es coherente con el hecho de que la fermentación es un proceso de combustión parcial de la glucosa que se produce en ausencia de oxígeno. Por tanto ésta será más efectiva cuanto menos oxígeno esté presente. De esta forma se puede suponer que la Levadura de Crecimiento Lento 2 puede estar contribuyendo a que la fermentación se produzca en mejores condiciones garantizando un velo que proteja de la presencia de oxígeno. En consecuencia un uso inmediato comercial, sería su integración en procesos de fermentación, cualesquiera que sea su tipología, para producir un mejor proceso, más eficaz y de mayor calidad. En general, los azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras, aunque en las oxidativas, por ejemplo, las formadoras de película oxidan los ácidos orgánicos y el alcohol, y también contribuyen en la producción de los sabores o "bouquet" de los vinos. Por tanto un uso comercial de esta levadura sería para dotar de bouquet a las cepas vínicas, o de cualquier otro proceso fermentativo como producción de licores, bebidas alcohólicas de baja graduación, pan, etc. También podría utilizarse en cualquier proceso industrial de los mencionados anteriormente o donde sea especialmente necesaria e importante la ausencia de oxígeno, y que permita la utilización de una levadura formadora de película, como por ejemplo podría ser la producción de un medicamento o sustancia sensible al oxígeno. Dentro de este grupo se enmarcarían todas las sustancias consideradas como antioxidantes, es decir, aquellas que son especialmente sensibles a un desbalance electrónico en el entorno en que se encuentran. Desbalance electrónico caracterizado por un exceso o defecto de carga electrónica respecto a un estado basal.
Esta misma levadura podría utilizarse para proteger determinadas soluciones del fenómeno de la oxidación, como método de evitar la pérdida de propiedades naturales de alimentos, o soluciones industriales, sensibles al oxígeno o, lo que es lo mismo (producido por oxígeno o no) a la presencia de un agente creador de un desbalance electrónico, bien capturando electrones (caso por ejemplo del oxígeno), bien cediendo electrones (caso por ejemplo del Fe2+). Dentro de este tipo de sustancias conocidas como antioxidantes, se agrupan un gran número de sustancias de interés biomédico, y beneficiosas, en general para una gran mayoría de organismos vivos, pues su principal función es actuar como tamponadores de un desequilibrio electrónico. Por ejemplo, aquellas sustancias que son de interés en procesos de envejecimiento y cáncer, como antioxidantes: ácido cítrico, ascórbico (vitamina C), glutatión, resveratrol, etc. En general son sustancias que actúan como actúan los indicadores de pH, es decir, cambian su conformación electrónica con facilidad ganando o perdiendo electrones ante cambios relativamente pequeños en el balance electrónico del entorno en el que se encuentran. La fabricación, o el transporte, o el almacenado de este tipo de sustancias creando un velo de este tipo, se verían, claramente mejorados. Posteriormente se podría recoger este velo, en un simple proceso de centrifugación. Esto podría ser por ejemplo, de gran interés en biomedicina o en todos aquellos sectores alimenticios donde el uso de sustancias antioxidantes añadidas a los alimentos está cobrando un gran auge en los últimos años. También en los sectores industriales donde se fabriquen sustancias muy sensibles a las oxidación. Actualmente este lugar de la técnica puede estar ocupado con otras técnicas como la de fabricación o embasado al vacio, pero en este caso, la utilización de este tipo de levaduras podría significar una gran reducción de costes y en algunos casos un mejora de la calidad del producto, puesto que la implementación del vacío podría suponer algún impacto en el producto-en el momento de producirlo.
Una vez descrita suficientemente la invención, así como varias realizaciones preferentes de la misma, sólo debe añadirse que es posible realizar modificaciones en su constitución y materiales empleados sin apartarse del alcance de la misma, definido en las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Un método de cultivo de un viñedo resistente a las inclemencias meteorológicas y/o climáticas con el desarrollo de raíces profundas y fuertes caracterizado porque
- se seleccionan unas variedades de viñas naturales autóctonas, teniendo un pie natural, sin injerto alguno,
- se abonan dichas viñas con el compost obtenido de las propias hierbas del terreno,
no se adicionan otros nutrientes que los del propio terreno,
- se recolectan las uvas después de las lluvias del otoño,
2. - Un método de fermentación profunda con levaduras salvajes de uvas que recuerden al terreno y posean sus propiedades organolépticas caracterizado porque se fermentan la totalidad de los azúcares contenidos en las uvas mediante:
- la formación de un pie de cuba con uva estrujada,
- realizar la fermentación en depósitos de capacidad inferior a 5.000 litros sobre el 20-25% de dicho volumen,
- reproducción de las levaduras salvajes autóctonas obtenidas, alcanzando del 3,5 a 6% vol. de alcohol,
- rellenos posteriores cada 7 a 15 días,
- fermentación con las mismas levaduras en escalera hasta la fermentación de todo el azúcar y obtención de un vino de grado alcohólico final entre 14 a 20% vol.
3.- Un método de obtención de levaduras salvajes de uvas según la reivindicación N°2 caracterizado porque se obtienen tres levaduras distintas: Levadura Blanca (1), Levadura de Crecimiento Lento (2) y Levadura amarilla (3), en donde el extracto de la mezcla obtenida de dichas tres levaduras se obtiene en medio YPD, y porque la separación de dichas levaduras se efectúa mediante cultivo en medio YPD con diferentes concentraciones de alcohol y azúcar:
- Levadura Blanca (1) por crecimiento en medios YPD conteniendo concentraciones de etanol hasta 60%
- Levadura de Crecimiento Lento (2) por crecimiento en medios YPD conteniendo concentraciones de etanol hasta 25%.
- Levadura amarilla (3) por crecimiento en medios YPD conteniendo azúcar, de tal forma que, en dicho medio, produce colonias de mayor tamaño que el resto de las levaduras detectadas.
4.- Un método de uso de levaduras salvajes individuales según la reivindicación N°3 caracterizado porque el extracto individual de dichas tres levaduras encuentra aplicación en:
- Levadura Blanca (1) en supervivencia en altas concentraciones de etanol. - Levadura de Crecimiento Lento (2) en formar una capa de micelio beneficiosa para el proceso de fermentación.
- Levadura amarilla (3) en facilitar el crecimiento de levadura en concentraciones de glucosa.
5.- Un método de uso en la producción industrial de alcoholes de levaduras salvajes según la reivindicación N°3 caracterizado porque la mezcla obtenida de dichas tres levaduras^ Levadura Blanca (1), Levadura de Crecimiento Lento (2) y Levadura amarilla (3), realiza la fermentación de bajas hasta altas concentraciones de azúcares provenientes de las soluciones de sacarosa, del azúcar comercial, de la melaza proveniente de caña de azúcar, de la melaza proveniente de remolacha, la fermentación de azucares provenientes de la hidrólisis del almidón, la fermentación de azucares provenientes de materias vegetales y otras.
6.- Un método de uso, en la industria de producción de bebidas alcohólicas de baja graduación, de levaduras salvajes según la reivindicación N°3 caracterizado porque la mezcla obtenida de dichas tres levaduras, Levadura Blanca (1), Levadura de Crecimiento Lento (2) y Levadura amarilla (3), permite por fermentación de azúcares provenientes de distintas fuentes obtener bebidas de baja graduación alcohólica tipo vino, cerveza, sidra, etc.
7. - Un método de uso, en la industria de producción de bebidas alcohólicas de alta graduación, de levaduras salvajes según la reivindicación N°3 caracterizado porque la mezcla obtenida de dichas tres levaduras, Levadura Blanca (1), Levadura de Crecimiento Lento (2) y Levadura amarilla (3), permite por fermentación de azúcares provenientes de distintas fuentes obtener bebidas de alta graduación alcohólica tipo coñacs, roñes, vodkas, etc.
8. - Un método de uso de levaduras salvajes, en la industria de producción de pan, bollería y derivados de calidad, según la reivindicación N°3 caracterizado porque el proceso de fermentación del almidón utiliza dicha mezcla obtenida de dichas tres levaduras, Levadura Blanca (1), Levadura de Crecimiento Lento (2) y Levadura amarilla (3).
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