ES2350431B1 - Levadura vinica osmotolerante cect 13015 y su aplicacion en la produccion y mejora de vinos dulces y la obtencion de bioetanol. - Google Patents

Abstract

Levadura vínica osmotolerante CECT 13015 y su aplicación en la producción y mejora de vinos dulces y la obtención de bioetanol, en donde se aplica una cepa de Saccharomyces cerevisiae CECT 13015 para la producción de vinos, especialmente vinos dulces, así como para la producción de bioetanol a partir de sustratos azucarados. Esta cepa ha sido aislada de un mosto fermentado de uva pasa Pedro Ximénez de la D.O. Montilla-Moriles, y ha sido seleccionada por su rápida cinética de fermentación, por sus excelentes cualidades organolépticas, así como por su elevada producción de etanol.

Description

Levadura vínica osmotolerante CECT 13015 y su aplicación en la producción y mejora de vinos dulces y la obtención de bioetanol.

Lapresente invención tiene por objeto la aplicación de una cepa de Saccharomyces cerevisiae CECT 13015 para la producciónde vinos, especialmente vinos dulces, así como parala producciónde bioetanol a partirde sustratos azucarados. Esta cepa ha sido aislada de un mosto fermentado de uva pasa Pedro Ximénez de la D.O. MontillaMoriles,yhasido seleccionadaporsurápida cinéticade fermentación,porsusexcelentes cualidadesorganolépticas, así como por su elevada producción de etanol.

Estado de la técnica anterior

En algunas regiones cálidas, con especiales características climáticas, se obtienen vinos dulces especiales mejorandola calidaddelasuvas recolectadasensu madurez, medianteun procesode secado naturalporexposición directa de las uvas al sol durante unos días. Esto sucede en regiones vitivinícolas con un índice heliotérmico de 2597ºC o superior, situadas envarios países mediterráneos como España, Grecia, Chipre, ItaliayTurquía, donde se producen vinosde postre especialespor estemétodoa partirde distintasvariedadesdeuva, aunque principalmentese usanlas variedades Muscat.EnAndalucía(España)yparticularmenteenlas zonasde Montilla-Moriles,JerezyMálaga,seusa además de la uva Muscat, la uva Pedro Ximénez.

El mosto obtenido de las uvas Pedro Ximénez en su madurez media posee un contenido en azúcares en torno a 25ºBxydespuésdel procesode pasificación presentaun contenidoque alcanzahasta 45ºBx,equivalentea500g/L, (FrancoM, PeinadoRA, MedinaM, MorenoJ. 2004.Off-vine grape dryingeffectonvolatile compoundsand aromatic seriesin must from PedroXiménez grapevariety. J Agrie Food Chem 52:3905-3910).

Saccharomyces cerevisiae es un hongo sacarofílicoy en su hábitat se encuentra con elevadas concentraciones de azúcares. Sin embargo, cuando se usa para fermentar mostos con alta concentración en azúcares se presentan una serie de problemas como son paradas de fermentaciónyfermentaciones lentas, que puedefavorecer el desarrollo de microorganismos indeseables, que aumentan la acidez volátily originan vinos de baja calidad (Caridi A., Crucitti P., RamondinoD. 1999.Winemakingof mustathigh osmotic strengthby thermotolerant yeast.Biotechnol Lett, 21: 617-620). En Salmón JM, Mauricio JC. 1994. Relationship between sugar uptakekinetics and total sugar consumption indifferent industrial Saccharomyces cerevisiae strains during alcoholic fermentation. Biotechnol Lett 16: 8994 se describe una menor actividad en el transporte de glucosa en levaduras que fermentan medios con una elevada concentración de azúcares. Con objeto de evitar estos problemas, algunos vinos dulces especiales se han elaborado tradicionalmente en determinadas zonas mezclando los mostosde uva pasificada con alcohol vínico. Este hecho origina problemas enla catalogación del producto enel mercadoyparael consumidor final,yaque noha sido elaborado medianteun procesode fermentación.Unaposible soluciónpodríaserla realizaciónde fermentacionesparciales dirigidas conlevaduras aisladasyseleccionadasa partirde mostosde uva pasa.

La crisis energética causadaporla dependenciadelos combustibles fósiles,así comoelefecto contaminanteque éstos tienen sobreel ambiente, unidoasu contribuciónal efectoinvernadero, hace necesarialabúsquedade fuentes energéticas alternativas o complementarias renovables, cuyo balance neto en la emisión de CO2 sea inferior (Cot M, LoretM-O, FrançoisJ, BenbadisL. 2007.Physiological behaviourof Saccharomyces cerevisiae in aerated fed-batch fermentation for high level production of bioethanol. FEMS Yeast Res 7:22-32). Una de estas fuentes energéticas es el bioetanol obtenidoa partirde carbohidratosde plantas (LiangL, ZhangY, ZhangL, ZhuM. LiangS, HuangY.2008. Study of sugarcane pieces as yeast supports for ethanol production from sugarcane juice and molasses. J Ind Microbiol Biotechnol 35:1605-1613), que es particularmente interesante como combustible paravehículos automóviles bien sólo

o mezclado con otros combustibles.El etanol se obtiene mediante un proceso en tresfases:

i) obtención de una solución de azúcares fermentables,

ii) fermentación alcohólicade dicha solución,y

iii) destilaciónydeshidratación del etanol. La eficiencia del proceso total está fuertemente relacionada con la energíainvertida, particularmente enlafasede destilación.

Se han usado distintas fuentes de carbohidratos fermentables, en función de su abundancia o disponibilidad en el entorno próximooenlos subproductoso residuosdela agriculturae industria local.De una forma inconsciente,sehan usado sustratos comoel maízyel trigo,sinevaluarelimpactonegativoque sobrela alimentación humanaha tenido la desviación de estos granos hacia la producción de bioetanol. Estos sustratos, ricos en almidón o carbohidratos, no asimilables directamente por los microorganismos fermentativos, requieren costosos pre-tratamientos ácidos o enzimáticoso calentamientos para convertir los carbohidratos no asimilables en azúcares fermentables (LeipperKA, SchleeC,TebbleI,StewartGG. 2006.The fermentationof beetsugar syrupto produce bioethanol. J Inst Brew 112: 122-133.) que aumentan los costes de producciónyla energía necesaria para obtener el etanol. El uso de sustratos quepresenten altos contenidosen azúcares fermentables (melazasojugos procedentesdel procesodeextraccióndel azúcarde cañaodela remolacha)no requiere tratamientos especiales,porloqueel coste (económicoy energético) del proceso será menor.

Por otro lado, se sabe que cuanto mayor es el contenido en etanol de una mezcla, menor es el consumo energético necesario para su separación (Bertolini MC, Ernandes JR, Laluce C. 1991. Newyeast strains for alcoholicfermentation at higher sugar concentration. Biotechnol Lett 13: 197-202). De este modo, cuanto mayor sea la concentración en etanol obtenida en la fase de fermentación, menor será la energía invertida en la destilación. En consecuencia, la optimización de lafase fermentativa con respecto al uso de microorganismos osmotolerantes que producen elevadas concentraciones de etanol a partir de sustratos con elevado contenido en azúcares se revela como una interesante alternativa para incrementar la eficiencia del proceso de obtención de bioetanol.

La levadura Saccharomyces cerevisiae esel microorganismomás usadoenlafermentación alcohólica, aunqueenla actualidad la bacteria Zymomonas mobilis seestá también usando debidoaque tiene una seriedeventajas con respecto a S. cerevisiae (Zaldivar J, Nielsen J, Olsson L. 2001. Fuel ethanol production from lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and process integration. Appl Microbiol Biotechnol 56:17-34).

Como ha sido previamente comentado S. cerevisiae es un hongo sacarofílicoy en su hábitat se encuentra con elevadas concentraciones de azúcares. Sin embargo, cuando se usa para fermentar mostos con alta concentración en azúcares se presentan una serie de problemas como son paradas de fermentaciónyfermentaciones lentas (Caridi et al.,1999). SalmónyMauricio(1994)han descritouna menoractividadeneltransportedeglucosaenlevadurasque fermentan medios con una elevada concentración de azúcares.

Para evitar estos problemas, una posible solución podría ser la realización de fermentaciones dirigidas con levaduras aisladasyseleccionadasa partirdemediosmuy azucarados como sonlos mostosdeuva pasa,quealcanzanmás de 400 g/L de azúcares fermentables. Normalmente,las cepas de levaduras implicadas en los procesos industriales tienen una osmotolerancialimitada, porlo que las fermentaciones se realizana partirde concentracionesde azúcares inferiores al 20% (p/v). Por tanto, el uso de levaduras osmotolerantesysuperproductoras de etanol es muy deseable en la producción de etanol.

La fermentacióndel mostoesun proceso microbiológico complejoque implica interacciones entrelevaduras, bacteriasyhongos filamentosos (ArandaA, MatallanaE, del OlmoM. 2005.Levaduras. Saccharomyces I. Levaduras de primera fermentación.En Microbiologíadelvino, CoordinadoresA.V. Carrascosa,R. MuñozyR. González,pp19

56. AMV Ediciones, Madrid).Tradicionalmente,la fermentación del mostoha sido un fenómeno espontáneo, realizado por la microbiota que se encuentra en la superficie del grano de uvay en la bodega. Sin embargo, esta microbiota puede afectarse por un gran número defactores, como condiciones sanitarias, condiciones climáticas, grado de madurez de la cosecha, variedad de uva, uso de productos fitosanitarios, etc. Por tanto, las levaduras presentes en los frutos no son constantes a través de los años, ni tampoco sus características metabólicas que son, en gran medida, responsables de las características organolépticas del vino obtenido. Esta circunstancia da lugar a una variación, no deseada,dela producciónde año en año.Para resolver este problemaytambién en un intentode obtener un producto parecidoal producido en regiones tradicionalmente productoras, los paísesde nueva tradición vitivinícola iniciaronla fermentación con inóculosdelevaduras seleccionadase importadasde países con tradiciónmuy arraigada.Seha comprobado que el uso de levaduras seleccionadas tiene importantes ventajas con respecto a la fermentación espontánea tradicional.Sinembargo,es imposible obtenerunacepabuenapara cualquiertipode vinificación,así,sehan obtenido levaduras de distintas regiones productoras con el fin de obtener levaduras seleccionadas mejor aclimatadas a cada zona en cuestión. Hoydía, cada vez más se está imponiendo el uso de levaduras secas activas (LSA) seleccionadas para resolver distintos problemas. En general, las levaduras vínicas seleccionadas deben ser capaces de producir vinos de calidad.Y esta calidad debe mantenerse para un mismo tipode mostoyprocedimientode elaboración,evitando lavariabilidadylos problemasquepueden ocasionarlos microorganismossilvestresnodeseados.La utilizaciónde levaduras seleccionadas en procesos de vinificación presenta básicamente cinco ventajas frente a la fermentación espontánea tradicional (MeleroR. 1992. Fermentación controladay selección de levaduras vínicas. Rev. Esp. Cienc. Tecnol. Aliment. 32, 371-379), que son: mayor velocidad de fermentación, máximo consumo de los azúcares reductores, mayor reproducibilidad enla calidadde los vinos, reducciónde los problemas causados porlevadurasextrañas silvestres, mayor control de la calidad sensorial del vino.

Los criteriosde seleccióndelevadurasparasuusoenenologíason:baja producciónde acidezvolátil, consumototalde azucares fermentables, alto vigor fermentativoymáxima reduccióndefasede latencia, capacidad fermentativaa altasybajas temperaturas, resistenciaal anhídrido sulfuroso,baja producciónde anhídrido sulfuroso,baja producción de sulfhídrico,altavelocidadde sedimentaciónycapacidadde flocular,baja producciónde espuma, fenotipo killer,baja producciónde acetaldehído, producciónde glicerol adecuada, producciónde acetatode etiloyalcoholes superiores, asimilaciónde sustanciasnitrogenadas, síntesisy excreciónde aminoácidosyderivados amínicos, producciónde βglucosidasa, baja producción de precursores de carbamato de etilo. En la actualidad, existen más de 200 cepas comercialesdelevadurasbien caracterizadasdisponiblesenel mercado (SchullerD,CasalM.2005.Theuseof genetically modified Saccharomyces cerevisiae strains in the wine industry, Applied Microbiology and Biotechnology 68(3), 292304).Actualmente,lasinvestigacionesse dirigen fundamentalmenteentres sentidos:a) aislamientode nuevascepas locales, mejor aclimatadas a cada región productora, que permitan satisfacer las necesidades de cada bodeguero, b) obtención de cepas con propiedades específicas interesantes como: cepas floculantes, que se separen mejor de los vinosfacilitandola clarificación, cepas con actividad β-glucosidasa, capaces de liberar terpenos responsables de aromas primariosvarietalesque mejoranlascaracterísticas organolépticasde ciertos vinosyc) introducciónde marcadores genéticos específicos en las cepas seleccionadas para determinarycontrolar el crecimiento de las mismas en mostos no estériles(DegréR. 1993. Selectionand comercial cultivationof wine yeastand bacteria,inWine Microbiologyand Biotechnology, editedby G.H. Fleet, pp. 421-447, Harwood Academia Publishers).

Asípues, aunqueexisten bastantes LSA comerciales, teóricamente apropiadas para realizar vinificaciones, resulta mucho más adecuado utilizar cepas autóctonas (locales) seleccionadas, ya que aseguran su implantación como agente biológico más importante responsable de la fermentación alcohólica, además de mantener las características propias típicas de los vinos de la zona (SuarezJA, Iñigo B. 2003. Microbiología Enológica. Fundamentos deVinificación. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid). Esto se acentúa en aquellas zonas de climas cálidos donde las levaduras están adaptadasala elevada concentraciónde azúcares, etanoly a altas temperaturas.

En la patente “Procedimiento de fermentación dirigida secuencial, nueva cepa de levadura que interviene en el mismo,y su aplicación industrial”(ES2222786A1)sehace referenciaaun procedimientode fermentacióndirigida secuencial,porel cualel mostoessembradoen tiempos diferentesporlacepa CECT 11773de Pichia fermentans y por otra del género Saccharomyces. La primera da lugar a la síntesis de una gran cantidad de sustancias aromáticas ysaborizantescon baja producción de etanol, que determinarán el aroma del producto final; la segunda levadura se encargade terminar la fermentación aumentando la cantidad de alcohol acumulado hasta un 12-13% v/v. La aplicación en Enología de levaduras vínicas seleccionadas simplifica, desde el punto de vista microbiológico, el proceso de fermentación vínicaymejora su control.

El bioetanolesel alcohol etílicoproducidoapartirdela fermentacióndelos azúcaresquese encuentranenlosproductos vegetales (cereales, caña de azúcar, remolacha, etc) combinados en forma de sacarosa, almidón, hemicelulosa ycelulosa. Principalmente, el microorganismo usado para llevar a cabo dicho proceso esS. cerevisiae. Actualmente, son numerosos los estudios enfocados a la producción de etanol como combustible a partir de fuentes renovables como alternativa económicamente viablealagasolina.La mayoríadelosestudiosse centranenbuscarla mejoradela eficienciadel proceso incrementandolavelocidaddela producciónde etanol, esto último está limitadoporel microorganismo productor de etanol, debido al efecto tóxico de éste (Allain EJ. 2007. Cell-free ethanol production: The future of fuel ethanol. J Chem Technol Biotechnol 82:117-124). En este sentido, son numerosos los trabajos de investigación encaminadosa aislaryseleccionar distintas cepas silvestresdelevaduras obtenidasdediversossustratos como suelo, frutas maduras, melazas, alimentos fermentados,etc. (Kiran SreeN, SridharM, SureshK, BanatIM,VenkateswarRao

L. 2000. High alcohol production by repeated batch fermentation using an immobilized osmotolerant Saccharomyces cerevisiae. 2000. J Ind Microbiol Biotechnol 24: 222-226; Brooks AA. 2008. Ethanol production potential of local yeast strains isolated from ripe banana peels. Afr J Biotechnol 7: 3749-3752; Gomes FCO, Silva CLC, Marini MM, Oliveira ES, Rosa CA. 2007. Use of selected indigenous Saccharomyces cerevisiae strains for the production of the traditional cachaca in Brazil. J Appl Microbiol 103: 2438-2447),existiendo en losúltimosaños un gran númerode patentesen aspectos relacionados conorganismos productoresde etanol.Tambiénsehan obtenido nuevas cepasmejoradas genéticamente (KnaufM, KrausK. 2006.Specific yeastdeveloped for modern ethanol production. 2006. Sugar Industry 131: 753-758; SekiT, MyogaS, LimtongS, UedonoS,KumnuantaJ,TaguchiH. 1983. Genetic construction of yeast strains for high etanol production. Biotechnol Lett 5: 351-356). Un microorganismo ideal para producir etanol debe tener unbuenyrápido potencial fermentativo, capacidad de flocular, osmotolerancia apreciable, elevada toleranciaal etanolybuena termotolerancia (Knaufand Kraus, 2006, ChandelAK, Narasu M.L., ChandrasekharG, ManikyamA.,RaoLV. 2009.Useof Saccharum spontaneum (wild sugarcane) as biomaterial for cell immobilization and modulated ethanolproductionbythermotolerant Saccharomyces cerevisiae VS3. Biores Technol 100:2404-2410).

Explicación de la invención

Como ha sido indicado anteriormente, la fermentación de mostos de uva con elevados contenidos en azúcares para la elaboración de vinos dulces presenta una serie de problemas técnicos. Una posible solución podría ser la realización de fermentaciones dirigidas con levaduras osmotolerantes aisladasy seleccionadas de esos tipos de mostos. En la presenteinvención,sehaaisladoyseleccionadounalevadura naturaldeunmostodeuvapasaPedro Ximénezconuna concentración inicial de azúcares reductores de450 g/L. Es una cepa de Saccharomyces cerevisiae, CECT 13015,y se caracteriza porque es osmotoleranteybuena productorade etanol. Experimentosde microvinificación dirigidacon esta levadura demuestra una cinética de fermentación más rápiday una mejora de las características organolépticas de estos vinos, con respectoa los obtenidos mediante fermentación espontánea.El usode estalevadura vínica enla industria enológica podría ser útil para mejorar el aroma de los vinos, especialmente de los vinos dulces.

Por otrolado,enunsegundo aspectodela presenteinvenciónydebidoala creciente demandade etanolporla crisis energética de los combustibles fósiles, se hace necesaria la búsqueda de cepas de levadura osmotolerantesy deelevada producciónde etanol.La cepa CECT 13015 presenta un mayor crecimientoy cinéticade fermentación en todas las fermentaciones ensayadas. Experimentos de microfermentaciónindican que esta levadura es de útil uso en la producción de bioetanol a partir de distintos sustratos azucarados como melazas o jugos obtenidos a partir de remolacha u otros.

Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otras características técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos, ventajasy característicasdelainvenciónse desprenderánenpartedela descripciónyenpartedelaprácticadelainvención.Los siguientes ejemplosydibujosse proporcionanamododeilustración,y nose pretendeque sean limitativosdelapresente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinacionesde realizaciones particulares ypreferidas aquí indicadas.

Breve descripción de los dibujos

Fig.1muestralaevolucióndela masavolúmica (g/L) durantela fermentación conlevadura osmo-etanol tolerante.

Fig.2muestralas característicasdelosvinosdeuvaspasasPedroXiménezendonde(A) muestralasvariablesenológicas comunes, (característicasde los vinos), siendo1: Etanol(% v/v),2:A.volátil(g/l),3:A. total (g/l).4:pHv5: d(q/ml) (B) los alcoholes superiores mayoritarios, (C) los compuestos carbonílicosy(D) polialcoholes mayoritarios, donde6: vino tradicional,7: controly8:levadura CECT 13015.

Exposición detallada de modos de realización y ejemplos

La presenteinvenciónse refiereal aislamientoyseleccióndeunacepade Saccharomyces cerevisiae,CECT 13015, para su aplicación en fermentaciones dirigidas para la producción de vinos dulces así como para la obtención de bioetanol a partir de sustratos azucarados.

Aislamiento y selección de cepas osmotolerantes

Distintas cepas osmotolerantes de Saccharomyces cerevisiae se aislaron a partir de un mosto fermentado de uva secada al sol (450 g/L de azúcares fermentables iniciales) mediante el procedimiento de siembra por agotamiento encajasdePetriconagarYPD(1%deextractodelevadura,2%de peptonay5%de glucosa,pH5.5).Lascajasse incubarona28ºC durante48h. Posteriormente,cada coloniasepasóauntuboconagarYPD inclinadopara obtenerun cultivo puro. Los cultivos puros se guardaron en neveraa 4ºCóa -80ºC hasta suuso.Seha seleccionado una cepapor sus características de osmo-etanol-tolerancia,buenas características organolépticas en mostos con elevado contenido en azúcaresasí comoporla produccióndeetanol.La identificaciónydepósitodelacepadelevadurasellevóacabo porla Colección Españolade CultivosTipo (CECT), identificándose conel número CECT13015.

Mosto, correcciones prefermentativas, condiciones de fermentación e inoculación para la obtención de vinos dulces

El mosto inicial de uva Pedro Ximénez pasa presentaba un valor de masa volúmica de 1,1543±0,0015 g/mL, equivalente a un contenido en azúcares reductores de 373±4g/Lyaproximadamentea 22% (v/v)de etanol potencial. El contenido en acidez titulable fue de 3,31±0.07 g/L, la acidez volátil 0,07±0.02yelpH presentaba unvalorde 4,30±0.02.

El mostose corrigió hastaunvalordepHde3,8 mediantela adiciónde ácido tartáricoyse añadió50mg/LdeS02 como metabisulfito potásicoy sedividió en6fraccionesde 750mL que se colocaron en sendas probetasde1L.Tres probetas se destinarona un control sin fermentar,y3parala cepa CECT 13015. Las probetas se taparon con algodón hidrófoboy se sumergieron en un baño termostatizado con aguaa 24ºC.

Previamentealainoculación,la cepade S. cerevisiae CECT 13015 se puso a crecer por separado en medio YPD durante24 horasa 28ºCyposteriormentese recogiópor centrifugacióny selavó conagua destilada estérilyfría.El inoculode cadalevadura para cada probeta con mosto fuede6±1x106 células/mL.

Producción de etanol

La céluladelevadurase cultivóen medioYPD(1%extractodelevadura,2% peptonay 5% glucosa,pH5.5) esterilizado en autoclave. Las células se incubaron a 24ºC en agitación continua a 200 rpm en un incubador Shaker (New Brunswick Scientific,UK) durante24hy se recogieronpor centrifugacióna3500x g.

Las microfermentacionessellevaronacaboa24ºCentubosFalconde50mLcon20mldela solución1%extracto delevadura,2% peptonay concentraciones crecientesde glucosade25a45% (p/v).Los mediosde fermentaciónse esterilizaron a vapor fluente durante 30 minutos. Los medios de fermentación se inocularon con 4x106 cells/ml. Los taponesde los tubosFalcon se atravesaron con una aguja hipodérmicay se agitarona 150 rpm.

El númerode células totalesse determinópor recuentoenun contador electrónicode partículas (Beckman Coulter Z2ParticleCountandSize Analyzer).El desarrollodel procesode fermentaciónse monitorizóporla cantidaddeCO2 liberada como medida de pérdida de peso (Sablayrolles et al., 1987; Bely et al., 1990).

El etanol se cuantificó por el Kit enzimático de Boehringer-Mannheim, Alemania.

Ejemplo1

Obtención de vino dulce

LaFig.1muestrala cinéticadefermentación.Elmosto inoculadoconlacepaCECT13015mostróunvalordela masa volúmica de 1078 g/L a las 140 horas.

El contenido final en etanol fue de un 12% (v/v)de etanol. En este momento se detuvo la fermentación mediante la adiciónde alcoholvínicohastaun contenidoenetanoldel15%(v/v)y unamasavolúmicade1062g/LparaCECT 13015. Por otro lado,el control correspondeala adiciónde alcohol vínicoal mostoinicial hasta unvalor del10% (v/v)y se obtuvounvalorde1153g/L,quenose alteró durantetodoel ensayo.

Enla Fig.2 se representan losvalores mediosde los compuestosyfracciones cuantificadas en cada unode los experimentos realizadosy en una muestrade vinoPX elaboradodela forma tradicional.Enla Fig.2A se destacaque losmostos parcialmente fermentados con CECT 13015 presentaronvaloresdela acidezvolátil superioresa losque poseen los dos restantes mostos no fermentados.

La Fig.2B muestrala concentraciónde alcoholes superiores mayoritariosymetanol, destacóla mayor producción de los mismos en relación con los otros mostos. Entre los compuestos carbonílicos cuantificados (Fig. 2C), destacó el contenido en acetoína del mosto control (no fermentado)yel contenido en acetato de etilo del vino elaborado de la forma tradicional.En cuantoala producciónde 2,3-butanodiolyde glicerina (Fig.2D) ambos compuestos presentaron un mayor contenido en los mostos fermentados con CECT 13015.

Ejemplo2

Obtención de Bioetanol

El medio usado para estudiar la producción de etanol contenía de 25 a 45% (p/v) de glucosa. Los resultados expuestos en la tabla anterior ponen de manifiesto que la cepa CECT 13015 podría utilizarse para la obtención de etanol debido a su elevada eficiencia.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Levadura vínica perteneciente a la especie Saccharomyces cerevisiae depositada en la colección española de cultivos tipo, con número de identificación CECT 13015.

2. 2.

   Levadura vínica de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque presenta una tolerancia osmótica comprendida entre 25-45%(p/v)de glucosay una toleranciaal etanolde entre 12-15%(v/v).

3. 3.

   Levadura vínica de acuerdo a las reivindicaciones anteriores caracterizada porque produce un máximo de 20% (v/v) de etanol a 28ºC.

4. 4.

   Usodelalevadura vínicadelas reivindicaciones1a3parala producciónde bebidasalcohólicas.

5. 5.

   Usodelalevadura vínicadelas reivindicaciones1a3parala producciónde vinos dulces naturales.

6. 6.Usodelalevadura vínicadelasreivindicaciones1a3enla producciónde etanola partirde sustratos azucarados mediante la inoculación al medio de 4x106 células/mL de dichas levaduras.

   OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

   N.º solicitud:200930240

   ESPAÑA

   Fecha de presentación de la solicitud: 01.06.2009

   Fecha de prioridad:

   INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

   51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

   DOCUMENTOS RELEVANTES

   Categoría

   Documentos citados Reivindicaciones afectadas

   X

   BENÍTEZ, T. et al. Selection of wine yeasts for growth and fermentation in the presence of ethanol and sucrose. Applied and environmental microbiology, 1983, vol. 45 (5), páginas 1429-1436, tabla 3. 1-6

   X

   BUESHER, W. A. et al. High alcohol wine production from grape juice concentrates. AJEV, 2001, vol. 52 (4), páginas 345-351, tablas 2 y 3. 1-6

   X

   MALACRINO P. et al. The vinification of partially dried grapes: a comparative fermentation study of Saccharomyces cerevisiae strains under high sugar stress. Letters in Applied microbiology, 2005, vol. 40, páginas 466-472, tabla 1 1-6

   X

   EZEOGU, L. I. and OKOLO, B. N. Sedimentation characteristics and effect of molasses concentration and medium supplementation on the ethanol productivity of an ethanol tolerant palm wine Saccharomyces. Biotechnology Letters, 1994, vol. 16 (1), página 101-106, table 5. 1-6

   Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

   El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:

   Fecha de realización del informe 03.12.2010

   Examinador A. Polo Diez Página 1/6

   OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

   N.º solicitud:200930240

   ESPAÑA

   Fecha de presentación de la solicitud: 01.06.2009

   Fecha de prioridad:

   INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

   51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

   DOCUMENTOS RELEVANTES

   Categoría

   Documentos citados Reivindicaciones afectadas

   X

   GUIJO, S. et al. Fermentative features of vinification and maturation yeasts isolated in the Montilla-Moriles region of Southern Spain. Food Microbiology, 1986, vol. 3, páginas 133-142, table 8. 1-6

   X

   BERTOLONI, M.C. et al. New strains for alcoholic fermentation at higher sugar concentration. Biotechnology Letters, 1991, vol. 13 (3), páginas 197-702, table 1. 1-6

   Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

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   Fecha de realización del informe 03.12.2010

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   INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

   CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

   C12N1/18(01.01.2006) C12P7/06(01.01.2006) C12G1/022(01.01.2006) C12R1/865(01.01.2006)

   Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

   C12N, C12P, C12G, C12R

   Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

   INVENES, EPODOC, WPI, FSTA, HCAPLUS, BIOSIS, INTERNET

   OPINIÓN ESCRITA

   Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 03.12.2010

   Declaración

   Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

   Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO

   Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

   Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO

   Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

   Base de la Opinión.-

   La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

   OPINIÓN ESCRITA

   1. Documentos considerados.-

   A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

   Documento

   Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

   D01

   BENÍTEZ, T. et al. Selection of wine yeasts for growth and fermentation in the presence of ethanol and sucrose. Applied and environmental microbiology,1983, vol. 45 (5), páginas 1429-1436 1983

   D02

   BUESHER, W. A. et al. High alcohol wine production from grape juice concentrates. AJEV, 2001, vol.52 (4), páginas 345-351. 2001

   D03

   MALACRINO P. et al. The vinification of partially dried grapes: a comparative fermentation study of Saccharomyces cerevisiae strains under high sugarstress. Letters in Applied microbiology, 2005, vol.40, páginas 466-472. 2005

   D04

   EZEOGU, L. I. and OKOLO, B. N. Sedimentation characteristics and effect of molasses concentration and medium supplementation on the ethanol productivity of an ethanol tolerant palm wine Saccharomyces. BiotechnologyLetters, 1994, vol. 16 (1), página 101-106. 1994

   D05

   GUIJO, S. et al. Fermentative features of vinification and maturation yeasts isolated in the Montilla-Moriles region of Southern Spain. Food Microbiology, 1986,vol. 3, páginas 133142. 1996

   D06

   BERTOLONI, M.C. et al. New strains for alcoholic fermentation at higher sugar concentration. BiotechnologyLetters, 1991, vol. 13 (3), páginas 197-702. 1991

7. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

   La invención se refiere a una cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae (depositada con el nº CECT 13015) que se caracteriza por presentar una alta tolerancia a la glucosa (25-45% p/v) y al etanol (12 a 15% v/v) y por producir elevadas cantidades de etanol (hasta un máximo de 20% v/v). La invención también se refiere a la utilización de esta cepa para la producción de bebidas alcohólicas en general y vinos dulces en particular y para la producción de bioetanol a partir de sustratos azucarados.

   La cepa ha sido aislada de mosto fermentado de uvas pasas Pedro Ximenez de la D.O. Montilla Moriles y seleccionada en base sus cualidades organolépticas y a su elevada producción de etanol. Al tolerar altas concentraciones de azúcar evita las paradas en las fermentaciones vínicas, y, hace más eficiente el proceso de obtención de bioetanol.

   Novedad (art 6 de la LP)

   Ninguno de los documentos citados en el informe sobre el estado de la técnica menciona el mismo número de acceso que el que aparece en la primera reivindicación de la solicitud. Dado que no se puede afirmar que la cepa de la solicitud sea la misma que ninguna de las ya conocidas, se considera que las reivindicaciones que se refieren a dicha cepa (1 a 3) y a su utilización (reivindicaciones 4-6) cumplen el requisito de novedad.

   Actividad inventiva (art. 8 de la LP)

   En el documento D01 se seleccionan una serie de cepas de levadura del género Saccharomyces de diversas procedencias por su capacidad para crecer en altas concentraciones de glucosa y etanol. Algunas de las cepas de S. cerevisiae son capaces de crecer en un 50% p/v de glucosa. La producción de etanol en estas condiciones varía dependiendo de la temperatura empleada durante la fermentación alcanzándose un máximo de 14,5% (v/v) (cepa FJF206 a 22ºC, tabla 3).

   El documento D02 realiza fermentaciones de zumos de uva concentrados (35ºBrix, 40%v/v) para obtener vinos de alta concentración alcohólica. La levadura utilizada es la cepa comercial S. cerevisiae L2226: Los niveles de alcohol obtenidos varían según las condiciones de la fermentación (variedades de uva, condiciones de aireación, tipo de nutriente y concentración inicial de levadura) pudiéndose alcanzar un 21% v/v de etanol (tablas 2 y 3).

   En el documento D03 se utilizan cuatro cepas comerciales de S. cerevisiae (Zinfandel, S6U, EC1118, BM45) para realizar microvinificaciones a partir de mosto de uvas secas, es decir con alto contenido en glucosa (35º Brix, 40% p/v). Según la tabla 1, el etanol producido varía según la cepa utilizada entre 143,5 y 158 g/l (es decir de un 18 y 20%v/v).

   OPINIÓN ESCRITA

   El documento D04 describe una cepa de S. cerevisiae (J) aislada de vino de palma capaz de tolerar concentraciones de 30ºBrix (34% p/v) y de producir un porcentaje de etanol de 13 a 17% v/v dependiendo del producto con que se enriquezcan las melazas (ver tabla 5)

   En el documento D05 se aíslan una serie de levaduras durante la fermentación y la maduración de vinos dulces obtenidos a partir de uvas Pedro Ximénez. Las cepas de S. cerevisiae encontradas toleran aproximadamente 30% p/v de azúcar y algunas producen hasta un 17% v/v de alcohol (tabla 8).

   Por último, el documento D06 se refiere a cepas de S. cerevisiae aisladas en destilerías de Brasil (osmo-1 a osmo-8) tolerantes a la presión osmótica y al etanol. La tabla 1 muestra la producción de etanol de estas levaduras a concentraciones de 30% p/v de azúcares que supone aproximadamente un 19% v/v.

   Como demuestran los documentos del estado de la técnica, se conocen cepas de S. cerevisiae con alta tolerancia a la presión osmótica y a la concentración de etanol. Además, algunas de ellas tienen capacidad para producir altas concentraciones de alcohol. Estas características las hacen muy útiles tanto para las vinificaciones de vinos dulces como para la obtención de bioetanol. Por otro lado, los estudios realizados demuestran que la producción de etanol puede variar en una misma cepa dependiendo de muchos factores (temperatura a la que se lleva a cabo la fermentación, cantidad inicial de levaduras, aireación, o nutrientes añadidos)

   La solicitud en estudio, aporta una nueva cepa, aislada por métodos rutinarios y en base a criterios enológicos normalmente utilizados que tiene las mismas características y soluciona los mismos problemas que las ya conocidas en el estado de la técnica (es decir ,es tolerante a la presión osmótica y al etanol y productora de elevadas cantidades de etanol). Para que dicha cepa tenga actividad inventiva debe señalarse algún efecto técnico inesperado que se haya detectado en fermentaciones realizadas (en las mismas condiciones) con la cepa en estudio comparándola con las cepas del estado del estado de la técnica con las mismas características. En ausencia de este efecto técnico, se considera que las reivindicaciones 1 a 6 carecen de actividad inventiva.