WO2011040285A1 - Ｄｎａ構築物およびそれを用いた組み換えｃｈｏ細胞の製造方法 - Google Patents

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gene
cho
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hprt
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修司 曾根▲崎▼
大神　有美
良正 山名
純也 成田
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Toto株式会社
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Definitions

  • the present invention relates to a DNA construct useful for efficient production of recombinant CHO cells and a method for producing recombinant CHO cells using the same.
  • Recombinant protein production systems using mammalian cells as hosts are similar to those produced in vivo by post-translational modifications such as glycosylation, folding, and phosphorylation of proteins derived from higher animals such as humans. It is possible to apply.
  • This post-translational modification is necessary for reproducing the inherent physiological activity of a protein with a recombinant protein, and in the production system of a recombinant protein used for a pharmaceutical or the like that particularly requires such physiological activity, Protein production systems using mammalian cell hosts are often used.
  • the CHO-DHFR system a clone in which the copy number of the plasmid vector incorporated in the chromosome is amplified is selected by combining a selection marker contained in the plasmid vector and an appropriate drug selection process.
  • the CHO-DHFR system can select a cell clone having an expression level increased several tens of times by a two-step selection process using the selective drug methotrexate.
  • the protein production system does not necessarily increase the expression level of the target protein in proportion to the number of copies of the simply amplified plasmid vector, and it takes a long time to select a cell clone with an increased expression level. It is known that there are problems. Furthermore, it has been reported that, after selection of cell clones with increased expression levels, the culturing of the selected cell clones in a medium that does not contain a selection agent is continued to confirm the decrease or disappearance of the expression level in most clones. (Patent Document 1: Special Table 2002-541854, Non-Patent Document 1: Kim, NS (1998) Biotechnol. Bioeng., 60, 679-688.).
  • the target protein production system using mammalian cells as described above generally introduces a vector containing the target protein gene into a host cell, selects a cell clone in which the vector is integrated into the chromosome, and further selects the cell. It is produced by culturing clones under appropriate culture conditions.
  • This integration into the chromosome is an event that can occur at random positions, and the expression level of the target protein varies depending on the resulting cell clone.
  • Some cell clones also have problems such as not expressing the target protein.
  • the method of selecting many clones by the expression level of a recombinant protein, and selecting a preferable clone is taken.
  • this screening process is very laborious and labor intensive.
  • Various processes have been reported for avoiding such trouble and quickly selecting a preferred clone.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 9-510865.
  • Homologous recombinant cell clones are generated in a pool of recombinant cell clones by a vector carrying a sequence having a base sequence homologous to the immunoglobulin ⁇ 2A locus.
  • the target chromosome position is identified in advance as a position that can give a higher expression level when a foreign gene is integrated compared to random integration. Therefore, the presence of homologous recombinant cell clones having a high expression level in the pool of recombinant cell clones to be screened at a certain frequency makes it possible to reduce the labor for screening according to the expression level. .
  • Patent Document 3 Japanese Translation of PCT International Publication No. 2001-516221.
  • a clone having a high expression level of a marker gene present in the marking plasmid is selected from a cell clone population in which the marking plasmid is randomly recombined in advance.
  • a target protein-producing clone that inherits the expression level of the marker gene by selecting a cell clone in which site-specific recombination has occurred between a plasmid vector having the target protein gene and a randomly incorporated marking plasmid sequence Is obtained.
  • the above technique is advantageous in reducing labor required for selection of clones with high expression levels.
  • the selected drug not only increases the culture cost, but also increases the cost of the purification process that is performed to avoid the risk of contamination with pharmaceuticals. Therefore, development of a cell clone production technique that can stably maintain the expression level without adding a selective agent is strongly desired.
  • Non-patent Document 3 Barnes, L. M. et al. (2003) Biotechnology and Bioengineering, 81, 631. -639.).
  • the hprt gene is known as one of the housekeeping genes existing in the long arm of the X chromosome of humans, etc., and the cells after knockout of the hprt gene are the drug 6-Thioguanime Since it shows resistance to (6TG) and G418, negative selection is easily performed.
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-325571
  • Non-Patent Document 4 Koyama Y Et Al., (2006) Biotechnology And Bioengineering, 95, 1052-1060.
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-325571
  • Non-Patent Document 4 Koyama Y Et Al., (2006) Biotechnology And Bioengineering, 95, 1052-1060.
  • Non-patent Document 5 Porter C.I. G. Itzaki J. E, Eur. J. Biochem 218, 273-281 (Non-patent Document 5) and Hiroshima University Atomic Radiation Medical Research Institute Annual Report No. 44 (2003) (Non-patent Document 6) compare ES cells with HT1080 cells for gene targeting. It has been reported that the frequency of gene targeting is very low in somatic cell-derived cultured cells.
  • CHO cells are used as host cells for antibody pharmaceutical protein production systems, and it is required to produce high-level and stable protein production systems using CHO cells.
  • Non-Patent Document 11 PNAS, 88, 9488-9502 (1991)
  • Non-Patent Document 12 Somatic Cell. Mol. Genet., 19, 363-375
  • Non-Patent Document 13 PNAS, 86, 4574-4578 (1989)
  • a cell line in which the aprt gene is present only on one chromosome was used as a host, and a homologous DNA fragment of 2.6 kbp to 4 kbp was used as a homology arm.
  • a homologous DNA fragment of 2.6 kbp to 4 kbp was used as a homology arm.
  • several clones to about 15 clones per 10 7 cells were obtained. Has been obtained.
  • CHO cells Since CHO cells are female-derived cells, they have two X chromosomes and two hprt loci. Therefore, CHO cells become resistant to selective drugs such as 6TG by incorporating foreign genes into the hprt locus of both chromosomes. However, the probability of recombination occurring in two chromosomes is usually lower than in the case of male-derived cells. For example, Koyama Y Et Al.
  • Non-patent Document 4 (2006) Biotechnology And Bioengineering, 95, 1052-1060 (Non-patent Document 4), assuming that the probability of recombination on a single chromosome is 10 ⁇ 6 with reference to the recombination efficiency of the male-derived HT1080 cell line to the hprt locus Then, the theoretical probability that occurs simultaneously on two chromosomes is 10-12 .
  • Non-patent Document 7 Datt, A. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9757-9762
  • Non-Patent Document 8 Selva E. M. et al., (1995) Genetics.
  • Patent Document 9 Riele H. et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Non-Patent Document 10 Deng C, D, Capecchi M, R (1992) Mol.Cell.Biol. 12, 3365-337 1).
  • the frequency of obtaining recombinant cells may be lower than that of cultured cells derived from males due to the influence of polymorphism of the X chromosome. Therefore, there is still a need to create a technique for efficiently producing recombinant CHO cells that express a target protein gene.
  • an object of the present invention is to provide a DNA construct useful for efficient production of recombinant CHO cells and a method for producing recombinant CHO using the same.
  • the DNA construct according to the present invention is a DNA construct comprising a first homologous DNA fragment, a target protein gene, and a second homologous DNA fragment from the 5 ′ end to the 3 ′ end,
  • the first homologous DNA fragment and the second homologous DNA fragment have a homology capable of homologous recombination with a portion of the hypoxanthine-phosphoribosyltransferase enzyme ( hprt ) locus of the CHO cell genome, and have 1 kbp or more It has a chain length.
  • the method for producing recombinant CHO cells according to the present invention comprises introducing a vector comprising the above DNA construct into CHO cells.
  • recombinant CHO cells expressing the target protein gene can be obtained at a remarkably high frequency.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the hprt locus of the CHO-K1 cell line in Example 1.
  • FIG. Numbers 1 to 9 represent exons 1 to 9 of the hprt gene, and the sequence between each exon represents introns 1 to 8.
  • 3 is a schematic diagram of a vector for homologous recombination used in Example 2.
  • FIG. (A) is a vector having a homologous DNA fragment derived from the hprt gene of CHO cells.
  • (B) is a vector having a homologous DNA fragment derived from human HT1080 cells.
  • FIG. (A) is a schematic diagram showing the relationship between the hprt gene region of CHO cells, the vector for homologous recombination, and the DNA used as an index for genomic PCR of recombinant CHO cells in Example 4.
  • FIG. (B) and (C) show the PCR results of Example 4.
  • (A) is a schematic diagram showing the relationship between the hprt gene region of CHO cells, the vector for homologous recombination, and the DNA used as an indicator of Southern hybridization in Example 5.
  • FIG. (B) shows the result of Southern hybridization in Example 5. The antibody production amount by the recombinant CHO cell acquired in Example 6 is shown.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of a vector for homologous recombination having a 2.5 kbp homologous DNA fragment used in Example 7.
  • A is a schematic diagram showing the relationship between the hprt gene region of CHO cells, the vector for homologous recombination, and the DNA used as an indicator of genomic PCR of recombinant CHO cells in Example 7.
  • FIG. (B) and (C) show the PCR results of Example 7.
  • A) is a schematic diagram showing the relationship between the hprt gene region of CHO cells, the vector for homologous recombination, and the DNA used as an indicator of Southern hybridization in Example 7.
  • FIG. (B) shows the results obtained from Southern hybridization in Example 7.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of a vector for homologous recombination having a 2.5 kbp homologous DNA fragment and a CHO endogenous promoter used in Example 9. The antibody productivity when the recombinant CHO cells obtained in Example 9 are maintained for a long period of time is shown.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a vector for homologous recombination having a 2.5 kbp homologous DNA fragment used in Example 10.
  • FIG. It is the schematic diagram of the CHO recombinant vector which has MAR derived from the human hprt gene intron used in Example 11, and the chromosome in which the vector was integrated into the CHO hprt locus.
  • A shows a vector in which MAR is not transcribed and a chromosome structure after integration.
  • B shows a vector having a structure in which MAR is transcribed by transcription of the hprt locus, and a chromosome structure after integration.
  • FIG. 10 shows a vector in which MAR is transcribed by the CMV promoter and a chromosome structure after integration.
  • the stability in the antibody production of the CHO cell acquired by the CHO recombinant vector which has MAR used in Example 11 is shown.
  • the DNA construct according to the present invention comprises two homologous DNA fragments having homology capable of homologous recombination with a part of the hprt locus in the CHO cell genome, each having a chain length of 1 kbp or more. This is a feature.
  • a CHO cell has two X chromosomes
  • a recombinant CHO cell can be obtained at a remarkably high frequency.
  • 130 recombinant cells are obtained per 1 ⁇ 10 ⁇ 7 . This result can be said to be a surprising fact considering that the theoretical probability that recombination occurs simultaneously at the two hprt loci of two chromosomes was predicted to be 10 ⁇ 12 as described above.
  • the DNA construct according to the present invention uses a part of the hprt locus as a target region for homologous recombination.
  • a part of the hprt locus as a target region is advantageous for stably expressing the target protein gene at a high level.
  • the target region of the present invention may be appropriately determined in the hprt locus as long as expression of the target protein gene is not hindered.
  • the target region is preferably a region containing at least a part of the intron of the hprt gene.
  • the intron has been determined by the present inventors for its base sequence. Specifically, the intron has the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 15 to 22, which will be described later with reference to FIG. ⁇ 8.
  • target region of the present invention may include all or part of the exons adjacent to the intron.
  • specific examples of such exons include exons 1 to 9 in FIG. 1.
  • These base sequences access, for example, a known database such as the National Center for Biotechnology Information. Can be obtained.
  • the DNA construct according to the present invention having such a homologous DNA fragment can be incorporated into a desired target region in the hprt locus. Examples of this integration include (1) a type in which an exon is disrupted by incorporation of a DNA construct, (2) a type in which one or more exons are deleted by incorporation of a DNA construct, and (3) an exon by incorporation of a DNA construct.
  • the DNA fragment of the present invention is preferably homologous to a region containing at least a part of the intron of the hprt gene, as described above, considering the chain length necessary for homologous recombination. Therefore, according to one aspect of the present invention, the first homologous DNA fragment or the second homologous DNA fragment of the present invention comprises the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 15 to 22 or a partial sequence thereof. It is supposed to be.
  • the lower limit of the chain length of the partial sequence is 1 bp, and the upper limit thereof can be appropriately adjusted within the range of the chain length of the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 15 to 22.
  • the homology between the homologous DNA fragment and the hprt locus is appropriately determined in view of the efficiency of homologous recombination, but is preferably 99.0% or more, more preferably 99.9% or more, and still more preferably Is 100%. Such homology can be appropriately determined by, for example, analysis using a DNA sequencer or the like.
  • the homologous DNA fragment has a chain length of 1 kbp or more, and such a chain length is preferable for achieving homologous recombination at a remarkable high frequency of the DNA construct.
  • the lower limit of the chain length of the homologous DNA fragment is preferably 2.5 kbp or more.
  • the upper limit of the chain length of the homologous DNA fragment is 7.5 kbp or less, preferably 5 kbp or less.
  • the range of the chain length of the homologous DNA fragment can be appropriately combined with the above upper limit value and lower limit value.
  • it is preferably 1 kbp or more and 7.5 kbp or less, more preferably 1 kbp or more and 5 kbp or less, and most preferably 2.5 kbp or more and 5 kbp or less. If the chain length is within this range, it is possible to maintain a favorable frequency of obtaining recombinant cells while achieving homologous recombination at a significantly high frequency of the DNA construct.
  • the target protein gene preferably encodes a protein useful as a medicine.
  • the target protein gene can be suitably used, whether it is a sequence derived from cDNA or a structural gene containing a natural intron derived from genomic DNA.
  • the target protein includes antibodies, enzymes, cytokines, hormones, coagulation factors, regulatory proteins, receptors, etc., but preferably monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, erythropoietin, tissue-specific plasminogen activation Factor or granulocyte colony activating factor.
  • the target protein gene is preferably incorporated into the hprt locus as an expression unit containing elements necessary for expression such as a promoter sequence and a transcription termination signal sequence. Therefore, according to one embodiment of the present invention, the target protein gene is arranged in the DNA construct as an expression unit containing at least a promoter sequence and a transcription termination signal sequence.
  • the CHO cell endogenous element may be used as an element necessary for expression, and such an embodiment is also included in the present invention.
  • the promoter and transcription termination signal may be appropriately determined according to the type and nature of the target protein gene, and suitable examples of such promoter sequences include CMV promoter and SV40 promoter. Further, preferable examples of the transcription termination signal sequence include BGH poly A signal sequence and SV40 poly A signal sequence.
  • Examples of other elements necessary for the expression of the promoter sequence and the transcription termination signal sequence include, for example, regulatory elements for efficiently expressing the target gene (eg, enhancer, IRES (internal ribosome entry site) sequence, LoxP sequence) And a recombinant enzyme recognition sequence such as an FRT sequence) may be appropriately selected and used. Depending on the nature of the regulatory element, it can be placed in an appropriate position in the expression unit. These elements necessary for expression are appropriately selected in consideration of the productivity of the target protein.
  • the DNA construct preferably comprises a positive selection marker gene.
  • the positive selection marker gene can be appropriately placed in the DNA construct as long as homologous recombination is not prevented.
  • the positive selection marker gene include a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, a zeocin resistance gene, a dihydrofolate reductase gene, and a glutamine synthetase gene.
  • both positive selection and negative selection by inactivation of the hprt gene can be applied in the selection of recombinant CHO cells, which is advantageous for greatly reducing false positive clones.
  • the DNA construct according to the present invention can be incorporated into a vector and introduced into the CHO cell genome.
  • a vector system is not particularly limited as long as the DNA construct can be integrated into the CHO cell genome by homologous recombination reaction.
  • Preferred examples include a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, and an artificial chromosome vector.
  • the DNA construct according to the present invention and the vector containing the DNA construct are suitably constructed by combining a restriction enzyme cleavage reaction and a ligation reaction.
  • a recognition sequence of a restriction enzyme is contained at both ends of each constituent unit, a cleavage reaction is performed with the restriction enzyme for the recognition sequence, and unnecessary DNA sequences (such as an operation sequence in E. coli) are gel-cut out.
  • a DNA construct and a vector containing the same can be constructed by performing a ligation reaction of the obtained unit after removal by treatment.
  • the vector DNA constructed by the ligation reaction can be purified by phenol / chloroform extraction or the like, and can be propagated in host cells such as Escherichia coli and yeast selected in consideration of the type of vector.
  • the vector according to the present invention preferably carries the CHF1 ⁇ promoter operably linked to the target protein gene. Expression of a foreign gene integrated into the CHO hprt locus is caused by inactivation of the promoter.
  • stable expression at the CHO hprt gene locus becomes possible.
  • the vector according to the present invention transcribes the nuclear / matrix attachment region (MAR) derived from the first intron of the human hprt gene into the chromosomal site by transcription originally occurring at the integration site after the vector is integrated into the chromosome. It is preferable to hold the structure.
  • MAR nuclear / matrix attachment region
  • Patent Document 4 WO 2004/022741 and Non-Patent Document 5
  • MAR nucleus / matrix adhesion region
  • the hprt gene is a gene that exists universally in many mammals including CHO. Since the hprt locus of CHO is presumed to have a high degree of difficulty in selecting integration cells, no examples of its use as a vector integration site are known. A person skilled in the art normally considers that when a foreign gene is integrated into the hprt locus of CHO, it can be stably expressed as in human cells. However, the intron sequence at the hprt locus of CHO is completely different from the human hprt gene, and the surprising fact that MAR does not exist in the intron has been revealed by the present inventors for the first time. Actually, the foreign gene integrated into the hprt locus of CHO was unable to be stably expressed as shown in Example 11.
  • Non-Patent Document a prior example in which MAR is incorporated into a vector and randomly incorporated into a CHO chromosome or held as an extrachromosomal plasmid to achieve partial stabilization is known (Non-Patent Document). 14: Mol Gen.
  • Non-Patent Document 14 Molecular Biology Reports, 31, 85-90 (2004).
  • the MAR itself is transcribed into a vector at a position where it is not transcribed (Non-Patent Document 14), or the MAR itself is also transcribed by a promoter placed in expectation of transcription of the target protein gene (Non-Patent Document 14). Reference 15).
  • Example 11 which will be described later, the structure of hprt loci of CHO is less effective and the result is that it is insufficient for long-term stable expression.
  • the structure is such that the MAR mounted on the vector is transcribed only by transcription originally occurring at the vector integration site. It was revealed that it was necessary.
  • the recombinant CHO cell according to the present invention can be preferably produced by introducing the above vector into a CHO cell. Therefore, the recombinant CHO cell according to the present invention has a foreign target protein gene integrated at the hprt locus. According to a preferred embodiment of the present invention, the function of the hprt gene is inactivated in the recombinant CHO cell. Such recombinant CHO cells are advantageous in stably producing a target protein such as an antibody at a high level.
  • a generally used method can be preferably used. Examples include calcium phosphate method, electroporation method, microinjection method, DEAE-dextran method, method using liposome reagent, lipofection method using cationic lipid, and the like.
  • the vector when it is circular, it may be linearized by a known method and introduced into cells.
  • site-specific introduction systems using recombinant enzymes such as the Cre / LoxP system and the Flp / FRT system may be applied as appropriate, taking into account the efficiency of obtaining recombinant cells.
  • site-specific introduction systems using recombinant enzymes such as the Cre / LoxP system and the Flp / FRT system may be applied as appropriate, taking into account the efficiency of obtaining recombinant cells.
  • Cre / LoxP system and the Flp / FRT system
  • Such an embodiment is also included in the present invention.
  • the selection step can be performed by negative selection based on inactivation of the hprt gene.
  • cell selection can be performed with high accuracy by combining negative selection and positive selection.
  • a promoter trap method In addition to the above selection method, a promoter trap method, a poly A trap method, or the like may be used in appropriate combination.
  • serum-free culture is also possible by obtaining recombinant CHO cells and acclimatizing them to a Chemical Defined medium. Such acclimation conditions can be appropriately determined according to the state of the recombinant cells.
  • Method for producing a target protein prepared above recombinant CHO cells, comprising to produce the protein of interest by culturing the cells, the method for producing a target protein are provided.
  • the target protein can be obtained efficiently and stably.
  • a known medium may be appropriately selected according to the state of the recombinant CHO cells, but a serum-free medium is preferable.
  • the culture medium is preferably a medium to which a selective agent is not added in consideration of culture cost and purification cost.
  • Preferable examples of the medium include Chemical Defined medium.
  • the culture method known methods such as a batch culture method, a fed-batch culture method, and a reflux culture method can be applied.
  • the present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • the reaction conditions such as restriction enzyme reaction, PCR reaction, ligation reaction and the like are the reaction conditions recommended by the manufacturer, or Molecular Cloning 2nd Edition; Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • the DNA sequence was determined using the DNA sequencer (310 Genetic Analyzer Applied BioSystems, Inc.).
  • the homology arms 1 and 2 shown below correspond to the first and second homologous DNA fragments of the present invention, respectively.
  • Example 1 Acquisition of hprt locus DNA sequence information of CHO cells
  • a Chinese hamster oocyte cell line CHO-K1 cell line (Cell No; JCRB9018) obtained from the JCRB cell bank was prepared as an AMEM medium (composition: Advanced MEM (GIBCO), 5 % [V / v] FBS, 1 ⁇ GlutaMAX (GIBCO)), and cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). The obtained culture broth was centrifuged to obtain a CHO-K1 cell pellet. This pellet was treated with DNA Isolation Kit for Cells and Tissues (Roche Diagnostics KK) to obtain genomic DNA.
  • AMEM medium composition: Advanced MEM (GIBCO), 5 % [V / v] FBS, 1 ⁇ GlutaMAX (GIBCO)
  • the obtained culture broth was centrifuged to obtain a CHO-K1 cell pellet. This pellet was treated with DNA Isolation Kit for Cells and Tissues
  • Fragment 1 sense primer 5'-tctgcaggct tcctctcac accg-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • Fragment 1 antisense primer 5'-acatgtcaag gcaacgccat ttcca -3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Fragment 2 sense primer 5'-tggaaatggc gttgccttga catgt -3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Fragment 2 antisense primer 5'- caccttttcc aaatcctcga -3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Fragment 3 sense primer 5'- agcttatgct ctgatttgaa atcagctg -3 '(SEQ ID NO: 5)
  • Fragment 3 antisense primer 5'-cttcagtctg ataaaatcta cagtca
  • intron 1 located between exon 1 and exon 2 of the hprt locus of the CHO-K1 cell line
  • intron 2 located between exon 2 and exon 3
  • Intron 3 located between exon 3 and exon 4
  • Intron 4 located between exon 4 and exon 5
  • Intron 5 located between exon 5 and exon 6
  • Intron 6 located between exon 6 and exon 7 (SEQ ID NO: 20)
  • intron 7 located between exon 7 and exon 8 SEQ ID NO: 21
  • intron 8 located between exon 8 and exon 9 SEQ ID NO: 20
  • Example 2 Construction of targeting vector
  • a vector represented by FIG. 1kx2 antibody vector
  • FIG. 1kx2 antibody vector For comparison, the homologous DNA fragment derived from the human hprt gene sequence was replaced with the homologous DNA fragment derived from the hprt gene sequence of the CHO cell, and is represented by FIG. 2 (B) having the same structure as the CHO 1kx2 antibody vector.
  • Vector (HT1080 homology arm vector) was constructed.
  • HA1 and HA2 were set to sequences homologous to the region containing exon 3 of the hprt gene as shown in FIG. 3 described later.
  • the primer sequences used in the PCR reaction are as shown below.
  • HA1 sense primer 5'-CCTGCAGGTCGCGATTGGTACTTGTTCAGCTTTATTCAAG-3 '(SEQ ID NO: 23)
  • HA1 antisense primer 5'-GTCGACAAGGACGCGTTCTGATAAAATCTACAGTCATAGGA-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • HA2 sense primer 5'-GTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCTCCGGAGACTGAAGAGCTATTGTGTGAGTAT-3 '(SEQ ID NO: 25)
  • HA2 antisense primer 5'-ACATGTTCTCTTAAGTCGCGAAGTAGTGTTATGATGTATGGGCATA-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • restriction enzyme Sse 8387I and Nru I recognition sites were added to the 5 ′ end of the HA1 sense primer.
  • the recognition site of Sal I and Mlu I is at the 5 ′ end of the HA1 antisense primer
  • the recognition site of Sal I and Acc III is at the 5 ′ end of the HA2 sense primer
  • the 5 ′ end of the HA2 antisense primer is at the 5 ′ end.
  • Pci I and Nru I recognition sites were added, respectively.
  • Ecolisense primers 5'-ACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAAC-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • Ecoli antisense primers 5'-CCTGCAGGGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGC-3 '(SEQ ID NO: 28)
  • DNA sequences containing HA1, HA2, and ori sequences and ampicillin resistance gene were each cloned by PCR reaction. These three DNA sequences were cleaved with restriction enzymes Pci I, Sse 8387I and Sal I, and ligation reaction was performed to obtain a pHA12 plasmid vector. Next, the pHA12 plasmid vector was cleaved with restriction enzymes Mlu I and Acc III to obtain DNA sequence 1 in which HA2, a DNA sequence containing an ori sequence and an ampicillin resistance gene, and HA1 were linked in order from the 5 ′ end. .
  • the p23HA12 plasmid vector was cleaved with Mlu I and Bam] HI, and a DNA fragment obtained by annealing linker 2-s oligo and linker 2-a oligo was inserted to obtain basic vector II.
  • Linker 2-s oligo 5'-CGCGTatcTCTAGAataATCGATagaAAGCTTacaG-3 '(SEQ ID NO: 29)
  • Linker 2-a oligo 5'-GATCCtgtAAGCTTtctATCGATtatTCTAGAgatA-3 '(SEQ ID NO: 30)
  • a DNA sequence 3 (an expression cassette containing SV40, neoR, synthetic polyA) containing the SV40 promoter, polyA signal sequence and neomycin resistance gene is obtained by PCR reaction. Amplified.
  • the primer sequences used for the PCR reaction are as follows. In this PCR reaction, a restriction enzyme Xba I recognition site was added to the 5 'end of the sense primer, and a synthetic poly A and Cla I recognition site was added to the 3' end.
  • neoR sense primer 5'-ccttTCTAGActtctgaggcggaaagaacc-3 '(SEQ ID NO: 31)
  • neoR antisense primer 5'-cttATCGATtCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTgtgggcgaagaactccagca-3 '(SEQ ID NO: 32)
  • the basic vector II was cleaved with restriction enzymes Xba I and Cla I, and the DNA sequence 3 was ligated to obtain a basic vector + NeoR plasmid.
  • IGH-3A21s primer 5'-TAAAAGGTGTCCAGGATGTGCAGTTTCAGG -3 '(SEQ ID NO: 33)
  • IGH-3A21a1 primer 5′-GAGGCCGATGAAACAGTGACCAGAGTCCCT -3 ′ (SEQ ID NO: 34)
  • RT-PCR was performed using One-step RT-PCR kit (QIAGEN) using RNA extracted from RPMI8226 cultured cells with ISOGEN (Nippon Gene) as a template, and using the obtained mRNA as a template, the constant region was designated as IGH-Cs, PCR amplification was performed with the IGH-Ca primer set to obtain DNA sequence 5.
  • QIAGEN One-step RT-PCR kit
  • ISOGEN Natural Gene
  • IGH-Cs primer 5'-CATCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCT-3 '(SEQ ID NO: 35)
  • IGH-Ca primer 5′-TTAAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAG-3 ′ (SEQ ID NO: 36)
  • PCR amplification was performed with the IGH-LS and IGH-Va primer sets using the DNA sequence 4 as a template to obtain a DNA sequence 6 to which a secretion signal was added.
  • IGH-LS primer 5'-GGTCGCCACCATGGAGTTTGGACTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGGATGTG-3 '(SEQ ID NO: 37)
  • IGH-Va primer 5'-GCCCTTGGTGGAGGCCGATGAAACAGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 38)
  • DNA sequence 5 and DNA sequence 6 as a template, assembly PCR was performed with IGH-Vs and IGH-Ca primer sets to obtain DNA sequence 7 in which both sequences were linked.
  • IGH-Vs primer 5'-TTCCGGTACCGGTCGCCACCATGGAGTTTG -3 '(SEQ ID NO: 39)
  • a pmaxGFP plasmid (amaxa) was subjected to a mutagenesis PCR reaction using Prime STAR MAX (Takara Shuzo) with a NotI-site-s / NotI-site-a primer set, and a NotI site was introduced immediately before the CMV promoter.
  • NotI-site-s primer 5'-ATGCggccgcATGTCAATATTGGCCATT-3 '(SEQ ID NO: 40)
  • NotI-site-a primer 5'-GACATgcggccGCATGGGAGGAGACCGGG-3 '(SEQ ID NO: 41)
  • a 0.5 kbp fragment was amplified with the NotI-spacer-s / NotI-spacerA-a primer set using pcDNA3.1-hygro (+) (Invitrogen) as a template, inserted into the NorI site of pmaxGFP + NotI, and pmax A GFP + spacerA plasmid was obtained.
  • NotI-spacerA-s primer 5'-ttGCGGCCGCgaaaagcctgaactcaccg-3 '(SEQ ID NO: 42)
  • NotI-spacerA-a primer 5'-ttGCGGCCGCgacggtgtcgtccatcacag-3 '(SEQ ID NO: 43)
  • the heavy chain was amplified with the KpnI-IGH-s / BglII-IGH-a primer set. This was replaced with GFP of pmaxGFP + spacerA to obtain a pmax + spacerA + IgH plasmid.
  • KpnI-IGH-s primer 5'-ccttGGTACCGAAGCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCaTGGAGTTTGGACTGAGCTGGG-3 '(SEQ ID NO: 44)
  • BglII-IGH-a primer 5'-ccttAGATCTtcatttacccggagacaggg-3 '(SEQ ID NO: 45)
  • the plasmid retaining the light chain variable region was used as a template, and the variable region was PCR amplified with the IGL-3A21s1 and IGL-3A21a1 primer sets to obtain DNA sequence 9.
  • IGL-3A21s1 primer 5'-CCCAGGTGCCAGATGTGACATCAAGATGAC-3 '(SEQ ID NO: 48)
  • IGL-3A21a1 primer 5'-GCCACAGTTCGTTTTATTTCCAACTTTGTC-3 '(SEQ ID NO: 49)
  • IGL-Cs primer 5'-TGGAAATAAAACGAACTGTGGCTGCACCAT-3 '(SEQ ID NO: 50)
  • IGL-Ca primer 5'-TTAAGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGT-3 '(SEQ ID NO: 51)
  • PCR amplification was performed with the IGL-LS and IGL-3A21a primer sets using the DNA sequence 9 as a template to obtain a DNA sequence 11 to which a secretion signal was added.
  • IGL-LS primer 5'-GGTCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGACA-3 '(SEQ ID NO: 52)
  • IGL-3A21a primer 5'-GCCACAGTTCGTTTTATTTCCAACTTTGTC-3 '(SEQ ID NO: 53)
  • DNA sequence 10 and DNA sequence 11 as a template, assembly PCR was performed with IGL-Vs and IGL-Ca primer sets to obtain DNA sequence 12 in which both products were linked.
  • IGL-Vs primer 5'-CCTTGGTACCGGTCGCCACCATGGACATGA-3 '(SEQ ID NO: 54)
  • NotI-spacerB-s primer 5'-ttGCGGCCGCctgtgatggacgacaccgtc-3 '(SEQ ID NO: 55)
  • NotI-spacerBa primer 5'-ttGCGGCCGCctattcctttgccctcggac-3 '(SEQ ID NO: 56)
  • the light chain was amplified with the KpnI-IGH-s / BglII-IGH-a primer set. This was replaced with GFP of pmaxGFP + spacerB to obtain a pmax + spacerB + IgL plasmid.
  • KpnI-IGL-s primer 5'-ccttGGTACCGAAGCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCatggacatgagggtccccgc-3 '(SEQ ID NO: 57)
  • BglII-IGL-a primer 5'-ccttAGATCTctaacactctcccctgttga-3 '(SEQ ID NO: 58)
  • HindIII-spB (IgL) -s2 primer 5'-ccttAAGCTTctattcctttgccctcggac-3 '(SEQ ID NO: 59)
  • Hin3-CMV-IgHL-SVpA-a primer 5'-cttAAGCTTAACGTCTCGCCCTTTGGTCTC-3 '(SEQ ID NO: 60)
  • the basic vector + neoR plasmid was cleaved with the restriction enzyme Hind III, and the DNA sequence 13 (light chain cassette) was inserted to obtain the basic vector + neoR + IgL plasmid.
  • CHA1 and CHA2 were set to sequences homologous to the region containing exon 3 of the hprt gene as shown in FIG. 3 described later.
  • the primer sequences used in the PCR reaction are as shown below.
  • SseNru-CHA1-1k-s primer 5'-ttCCTGCAGGTCGCGAaggagtttattagaggaaatat-3 '(SEQ ID NO: 61)
  • MluI-CHA1-r primer 5'-ttACGCGTtgataaaatctacagtcatggg-3 '(SEQ ID NO: 62)
  • Bam-CHA2-s primer 5'-ttGGATCCgactgaagagctactgtgta-3 '(SEQ ID NO: 63)
  • PciNru-CHA2-1k-r primer 5'-ttACATGTTCGCGAatcagatcccctgggactgga-3 '(SEQ ID NO: 64)
  • CHA2 sequence amplified with the Bam-CHA2-s / PciNru-CHA2-1k-r primer set was cleaved with the restriction enzymes BamHI and PciI and replaced with the HA2 sequence of the basic vector + neoR + IgL plasmid.
  • the CHA1 sequence amplified with the SseNru-CHA1-1k-s / MluI-CHA1-r primer set was cleaved with restriction enzymes Sse8387I and MluI and replaced with the HA1 sequence.
  • DNA sequence 8 (heavy chain cassette) was inserted into the restriction enzyme Mlu I site to obtain a CHO 1kx2 antibody vector shown in FIG. 2 (A).
  • HT1080 homology arm vector DNA sequence 8 (heavy chain cassette) was inserted into the restriction enzyme MluI site of the basic vector + neoR + IgL plasmid to obtain the HT1080 homology arm vector shown in FIG. 2 (B).
  • Example 3 Introduction of vector into cells
  • the vector linearized CHO 1kx2 antibody vector and the HT1080 homology arm vector were purified using Endofree Plasmid Maxi kit (manufactured by QIAGEN) and cleaved with NruI. It was dissolved in sterile water to a concentration of 2 g / L and used for the following transfection experiments.
  • Transfection and screening CHO-K1 cells were prepared to 1 ⁇ 10 6 cells with Nucleofection T solution (amaxa) and mixed with 2 ⁇ g of linearized plasmid vector. Next, a voltage was applied with the program U-023 using the obtained mixed solution and using Nuefector II (amaxa). Transfection was performed 3 times for each vector.
  • the transfected cells are seeded in a 96-well plate at 350 cells / well, and cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 (medium: Advanced MEM (GIBCO), 5% FBS, 1 ⁇ Glutamax (GIBCO). ), G418 (Invitrogen) was added 2 days after transfection (final concentration: 500 ⁇ g / mL).
  • the G418 / 6TG resistant clones obtained with the CHO 1kx2 antibody vector were 6 clones per 3 ⁇ 10 6 cells.
  • the HT1080 homology arm vector a G418 / 6TG resistant clone was not obtained.
  • Example 4 Analysis by genomic PCR Using DNA Isolation kit (Roche), genomic DNA was extracted from clones resistant to G418 and 6TG obtained by transfection of the CHO 1kx2 antibody vector, and this genomic DNA was used as a template below. The PCR reaction shown confirmed the regiospecific recombination to the target hprt locus.
  • FIG. 3A is a schematic diagram illustrating details of analysis of homologous recombination reaction by genomic PCR.
  • the target region (2) for homologous recombination of the hprt gene (1) is set to include exon 3 (3), and this region contains CHA1 (4), CHA2 (5) and vector DNA (6).
  • the antibody heavy chain sequence (7), neomycin resistance gene (8) and antibody light chain sequence (9) sandwiched between them are integrated by homologous recombination.
  • DNA containing CHA1 (4) and part of antibody heavy chain sequence (7) (1688 bp DNA) and DNA containing CHA2 (5) and part of antibody light chain sequence (9) (1752 bp of DNA) DNA
  • 1688 bp DNA DNA containing CHA1 (4) and part of antibody heavy chain sequence (7)
  • DNA containing CHA2 (5) and part of antibody light chain sequence (9) (1752 bp of DNA) DNA
  • the 1688 bp DNA shown in FIG. 3 (A) was set as an index for homologous recombination between CHA1 and the target region, and this DNA was detected by PCR reaction using the primers CHPRTs / NotI-spacerAs shown below. .
  • FIGS. 3 (B) and (C) 1 to 6 represent clones obtained with the CHO 1kx2 antibody vector. Among the obtained 6 clones, PCR amplification products of both 1688 bp and 1752 bp were confirmed in 5 clones, and homologous recombination reaction was confirmed.
  • Example 5 Analysis by Southern hybridization In the 5 clones obtained in Example 4, it was confirmed by the following Southern hybridization that the CHO 1kx2 antibody vector was integrated into the target hprt locus by position-specific recombination. .
  • FIG. 4A is a schematic diagram illustrating details of Southern hybridization of Example 5.
  • the target region (2) for homologous recombination of the hprt gene (1) is set to a region containing exon 3 (3), and homology arm 1 (CHA1) (4) and homology arm 2 (CHA2) (5) is set to be homologous to two adjacent regions in the target region.
  • the Pci I restriction enzyme site is located so as to sandwich the target region (2) and does not exist inside thereof.
  • the Pci I restriction enzyme site does not exist in the CHO 1kx2 antibody vector.
  • the neomycin resistance gene sequence (6) of the CHO 1kx2 antibody vector is designed so that the NR probe can hybridize.
  • the CHO 1kx2 antibody vector is incorporated into the hprt locus of the clone. Can be determined.
  • NR probe having a sequence complementary to the neomycin resistance gene in the CHO 1kx2 antibody vector was synthesized by the following procedure. First, the full length of the neomycin resistance gene coding sequence in the CHO 1kx2 antibody vector was amplified by PCR and TA-cloned into the pGEM T plasmid vector (Promega). Next, using a PCR DIG probe synthesis kit (Roche, primer: M13 Forward / Reverse primer), a DIG (Dioxigein) -labeled probe was prepared.
  • Genomic DNA of each cell clone was extracted from 6TG resistant colonies and cleaved with Pci I restriction enzyme. 5 ⁇ g of the cut genomic DNA was electrophoresed using a 0.6% agarose gel, and transferred to a nylon membrane (Hybond N + membrane, Amaersham Biosciences). The obtained membrane was incubated at 80 ° C. for 2 hours to immobilize DNA on the membrane.
  • Hybridization The NR probe was hybridized to the membrane. At this time, prehybridization, hybridization, and probe detection were performed according to the DIG application manual (Roche).
  • Example 6 Protein production by recombinant cells Culture of recombinant clones and sampling of medium First, recombinant clones were seeded at 2 ⁇ 10 5 cells per dish, G418 (final concentration; 500 ⁇ g / mL) and 6-TG (final concentration; 50 ⁇ M), and FBS (Japan) The cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 in 10 mL of Advanced MEM (Invitrogen) containing 5% of Bio Serum. On the fifth day after the start of the culture, the medium was collected. The collected medium was used for the following ELISA analysis.
  • the amount of IgG in the medium collected quantitatively by ELISA was analyzed by measuring the absorbance at 450 nm using Human IgG EIA Kit (precoated) (Takara Shuzo).
  • Example 7 Homologous recombination with a vector having a homologous DNA fragment having a chain length of 2.5 kbp Obtaining a 2.5 kbp CHO cell hprt gene homologous DNA fragment
  • the genomic DNA of the CHO-K1 cell was used as a template.
  • the target hprt gene homologous DNA fragments (CHA1-2.5 and CHA2-2.5) were cloned by PCR reaction (KOD-Plus-Ver2, TOYOBO).
  • CHA1-2.5 and CHA2-2.5 were set to sequences homologous to the region containing exon 3 of the hprt gene, as also shown in FIG.
  • the primer sequences used in the PCR reaction were the MluI-CHA1-r primer and Bam-CHA2-s primer described in Example 2 and those shown below.
  • CHA2-2.5 sequence amplified with the Bam-CHA2-s / NcoNru-CHA2-2.5k-r primer set was cleaved with restriction enzymes BamHI and NcoI, and the basic vector + neoR + IgL Replaced with the HA2 sequence of the plasmid.
  • the CHA1-2.5 sequence amplified with the SseNru-CHA1-2.5 ks / MluI-CHA1-r primer set was cleaved with restriction enzymes Sse8387I and MluI and replaced with the HA1 sequence.
  • DNA sequence 8 (heavy chain cassette) was inserted into the restriction enzyme Mlu I site to obtain a CHO 2.5 kx2 antibody vector shown in FIG.
  • the CHO 2.5 kx2 antibody vector was purified and linearized in the same manner as in Example 3 and dissolved in sterile water to a concentration of 2 g / L. 6 cells were introduced.
  • Genomic DNA was extracted from clones resistant to G418 and 6TG obtained by transfection of the CHO 2.5 kx2 antibody vector, and the PCR reaction shown below was performed using this genomic DNA as a template to target hprt locus. Confirmation of position-specific recombination was performed.
  • FIG. 7A is a schematic diagram illustrating details of analysis of homologous recombination reaction by genomic PCR.
  • the target region (2) for homologous recombination of the hprt gene (1) is set to include exon 3 (3), and this region contains CHA1-2.5 (4), CHA2 in the vector DNA (6). -2.5 (5) and the antibody heavy chain sequence (7), neomycin resistance gene (8) and antibody light chain sequence (9) sandwiched between them are integrated by homologous recombination.
  • DNA containing CHA1-2.5 (4) and part of antibody heavy chain sequence (7) (3075 bp DNA), and CHA2-2.5 (5) and antibody light chain sequence (9) Can be obtained from the genome only by homologous recombination and serves as an index for homologous recombination. Therefore, as an index for homologous recombination between CHA1-2.5 and the target region, the 3075 bp DNA shown in FIG. 7 (A) is set, and this DNA is represented by the primer CHA1-seq-s11 / NotI Detection was by PCR reaction with spacerA-s.
  • the DNA of 3228 bp shown in FIG. 7 (A) was set, and this DNA was used as the primer IGL-Cs / CHA2- Detection was by PCR reaction with seq-a4.
  • CHA1-seq-s11 primer 5'-GACACATGCAGACAGAACAG-3 '(SEQ ID NO: 69)
  • CHA2-seq-a4 primer 5'-GTTTGCTAACACCCCTTCTC-3 '(SEQ ID NO: 70)
  • PCR amplification product was analyzed by 1.0% agarose gel electrophoresis.
  • the results were as shown in FIGS. 7 (B) and (C).
  • 7 (B) and (C) 1 to 5 represent clones obtained with the CHO 2.5kx2 antibody vector.
  • PCR amplification products of both 3075 bp and 3228 bp were confirmed in 4 clones, and homologous recombination reaction was confirmed.
  • FIG. 8A is a schematic diagram illustrating details of Southern hybridization in Example 7.
  • the target region (2) for homologous recombination of the hprt gene (1) is set to a region containing exon 3 (3), and homology arm 1 (CHA1-2.5) (4 ) And homology arm 2 (CHA2-2.5) (5) are set to be homologous to two adjacent regions in the target region. Only one Eco RV restriction enzyme site exists in the vicinity of the target region (2), and only one site exists in the target region. On the other hand, in the CHO 2.5 kx2 antibody vector, there is only one Eco RV restriction enzyme site in CHA2-2.5.
  • the neomycin resistance gene sequence (6) of the CHO 2.5 kx2 antibody vector is designed so that the NR probe can hybridize.
  • Example 8 Confirmation of homologous recombination in two chromosomes of CHO cells Genomic DNA extracted from wild-type hprt gene residual confirmation CHO 1k ⁇ 2 antibody vector and CHO 2.5 k ⁇ 2 homologous recombination cloning of antibody vectors by genomic PCR was used as template by PCR reactions described below wild-type hprt gene residual I confirmed that it was.
  • FIG. 9A is a schematic diagram illustrating details of genomic PCR for confirming the remaining wild-type hprt gene.
  • FIG. 9A (left) shows PCR in wild-type CHO cells having two X chromosomes.
  • the target region (2) for homologous recombination of the hprt gene (1) is set including exon 3 (3).
  • the target region DNA (2322 bp) can be amplified by a PCR reaction, and it can be confirmed that the wild type hprt gene remains using this as an index.
  • the center diagram of FIG. 9 (A) shows PCR in a heterozygous homologous recombination cell in which a vector is integrated into the hprt locus of one X chromosome.
  • the DNA (7) of the vector including CHA1 (4), CHA2 (5) and the antibody heavy chain, neomycin resistance gene and antibody light chain sequence sandwiched between them
  • the other chromosome holds the target region, and the DNA (2322 bp) of the target region can be amplified by the PCR reaction, and it can be confirmed that the wild-type hprt gene remains.
  • a 2322 bp DNA shown in FIG. 9A was set as the index, and a PCR reaction was performed using the primer CHPRTs / CHA2-seq-a1 in order to detect this DNA.
  • the obtained PCR amplification product was analyzed by 1.0% agarose gel electrophoresis. The result was as shown in FIG. 9 (B).
  • WT indicates wild type cells
  • 1 kx2 vector integration clones (1, 2, 3, 5 and 6) indicate integration clones of the CHO 1kx2 antibody vector obtained in Example 4.
  • .5 kx2 vector integration clone (1 to 4) indicates an integration clone of the CHO 2.5 kx2 antibody vector obtained in Example 7.
  • From the wild type cells a 2322 bp PCR amplification product was confirmed, and the presence of the wild type hprt gene was confirmed.
  • no 2322 bp PCR amplification product was confirmed in all the analyzed recombinant clones, the recombinant cells were homozygous with the vector integrated into both X chromosomes.
  • Example 9 Long-term stable expression of an antibody by a recombinant vector clone using a CHO endogenous promoter Preparation of CHO CHEF1P vector
  • the CHO-K1 genomic DNA was used as a template, and the CHEF1 ⁇ promoter was amplified with the EF1aP-MluI-F / EF1aP-XbaI-R primer set.
  • EF1aP-MluI-F primer 5'-AGAACGCGTCCACACAATCAGAACCACA-3 '(SEQ ID NO: 71)
  • EF1aP-XbaI-R primer 5'-GACGATCTAGAGGTGGTTTTCACAACA-3 '(SEQ ID NO: 72)
  • the IgH gene was amplified with the CMV-seq-s / MluI-CMV-IgHL-SVpA-a primer set using the CHO 2.5k ⁇ 2_H-neo-L plasmid as a template.
  • CMV-seq-s primer 5'-AGGGACTTTCCATTGACGTC-3 '(SEQ ID NO: 73)
  • MluI-CMV-IgHL-SVpA-a primer 5'-cttACGCGTAACGTCTCGCCCTTTGGTCTC-3 '(SEQ ID NO: 74)
  • the obtained CHEF1 ⁇ P and IgH genes were cleaved with XbaI and NheI, respectively, and ligation reaction was performed. Thereafter, the CHEF1 ⁇ P + IgH gene band was gel-extracted, cloned into a TOPO vector (Invitrogen), and then digested with MluI to obtain a CHEF1 ⁇ P + IgH gene cassette.
  • the CHEF1 ⁇ promoter was amplified with the EF1aP-HindIII-F / EF1aP-HindIII-R primer set.
  • EF1aP-HindIII-F primer 5'-AGAAAGCTTCCACACAATCAGAACCACA-3 '(SEQ ID NO: 75)
  • EF1aP-HindIII-R primer 5'-GACGAATTCGCGGTGGTTTTCACAACA-3 '(SEQ ID NO: 76)
  • the IgL gene was amplified with IgLser-EcoRI-F / IgLser-HindIII-R primer set using CHO 2.5k ⁇ 2_H-neo-L plasmid as a template.
  • IgLser-EcoRI-F primer 5'-TATGAATTCGTCGCCACCATGGACAT-3 '(SEQ ID NO: 77)
  • IgLser-HindIII-R primer 5'-TGTAAGCTTTACCACATTTGTAGAGGTTTT-3 '(SEQ ID NO: 78)
  • the obtained CHEF1 ⁇ P and IgL gene were cleaved with EcoRI, and a ligation reaction was performed. Thereafter, the band of the CHEF1 ⁇ P + IgL gene was gel-extracted, cloned into a TOPO vector, and digested with HindIII to obtain a CHEF1 ⁇ P + IgL gene cassette.
  • the CHO 2.5k ⁇ 2_H-neo vector was digested with HindIII and dephosphorylated, and then the CHEF1 ⁇ P + IgL gene cassette was inserted to obtain an H-neo-EF1L vector. Next, after MluI digestion and dephosphorylation, a CHEF1 ⁇ P + IgH gene cassette was inserted to obtain a CHO CHEF1P vector shown in FIG.
  • CHO CHEF1P Vector Recombinant CHO Cells The constructed CHO CHEF1P vector was linearized, introduced into CHO cells, and screened in the same manner as in Example 3 to obtain CHO CHEF1P vector recombinant CHO cells.
  • Cells maintained during passage are detached, seeded in a 100 mm dish at 2 ⁇ 10 6 cells, cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 , and detached to prepare 3 ⁇ 10 5 cells / ml. 1.5 ml each was seeded on a 12-well plate and cultured. After 24 hours, the medium was completely removed and 1.5 ml of fresh medium was dispensed. After culturing for 24 hours, the whole amount of the medium was recovered, and the amount of IgG was measured by ELISA assay. Moreover, the cells adhering to the bottom of the well were detached and the number of cells was counted.
  • Example 10 Obtaining a homologous recombinant by a vector having a homologous DNA fragment having a chain length of 2.5 kbp and expressing an antibody heavy chain Preparation of antibody heavy chain expression recombinant vector
  • the CHO 2.5 kx2 antibody vector prepared in Example 7 was cleaved with restriction enzyme Hind III and self-cyclized to prepare a CHO 2.5 kbx2 heavy chain vector shown in FIG.
  • Example 11 Obtaining stably expressing CHO cells with a vector having a human hprt locus intron-derived MAR and expressing an antibody heavy chain Preparation of MAR non-transcribed vector Using the genomic DNA of the human-derived cell line HT1080 cell line prepared in Example 2 as a template, using the XbaI-hprtMAR-s / XbaI-hprtMAR-a primer set, the MAR of the human hprt gene intron (hprtMAR1) Amplified.
  • XbaI-hprtMAR-s primer 5'-ttTCTAGAtagttatgagcccatgtccc-3 '(SEQ ID NO: 79)
  • XbaI-hprtMAR-a primer 5'-ttTCTAGAcggtgaaatcctgtctctac-3 '(SEQ ID NO: 80)
  • the CHO 2.5 kx2 antibody vector prepared in Example 7 was cleaved with the restriction enzyme XbaI, and hprtMAR1 was inserted to obtain a MAR non-transcribed vector shown in FIG. 13 (A).
  • MAR Transcription Vector Using human genome cell line HT1080 cell line as a template, the human hprt gene intron MAR (hprtMAR2) was amplified using AscI-hprtMAR-s / MluI-hprtMAR-a primer set.
  • AscI-hprtMAR-s primer 5'-ttGGCGCGCCtagttatgagcccatgtccc-3 '(SEQ ID NO: 81)
  • MluI-hprtMAR-a primer 5'-ttACGCGTcggtgaaatcctgtctctacac-3 '(SEQ ID NO: 82)
  • the CHO 2.5 kx2 antibody vector prepared in Example 7 was cleaved with the restriction enzyme MluI, and hprtMAR2 was inserted. Next, it was cleaved with the restriction enzyme MluI, and the antibody heavy chain expression cassette of Example 2 was inserted to obtain the MAR transcription vector shown in FIG. 13 (B).
  • MAR CMV Transcription Vector Human hprt gene intron MAR (hprtMAR3) was amplified with BglII-hprtMAR-s / BglII-hprtMAR-a primer set using the genomic DNA of human-derived cell line HT1080 cell line as a template.
  • BglII-hprtMAR-s primer 5'-ttAGATCTtagttatgagcccatgtccc-3 '(SEQ ID NO: 83)
  • BglII-hprtMAR-a primer 5'-ttAGATCTcggtgaaatcctgtctctacac-3 '(SEQ ID NO: 84)
  • the pCR-BluntII-TOPO + antibody heavy chain expression cassette prepared in Example 2 was cleaved with restriction enzyme BglII, hprtMAR3 was inserted, and then cut out with restriction enzyme MluI to obtain an antibody heavy chain + MAR expression cassette.
  • the pCR-BluntII-TOPO + antibody light chain expression cassette prepared in Example 2 was cleaved with the restriction enzyme BglII, hprtMAR3 was inserted, and then cut out with the restriction enzyme HindIII to obtain an antibody light chain + MAR expression cassette.
  • the CHO 2.5 kx2 antibody vector prepared in Example 7 was cleaved with the restriction enzyme MluI, and the antibody heavy chain + MAR expression cassette was inserted. Next, it was cleaved with restriction enzyme HindIII, and an antibody light chain + MAR expression cassette was inserted to obtain a MAR CMV transcription vector shown in FIG. 13 (C).
  • Example 12 Obtaining a homologous recombinant by a vector having a homologous DNA fragment having a chain length of 200b or 500b and expressing an antibody heavy chain CHO 200b ⁇ 2 vector, CHO 500b ⁇ 2 vector production
  • CHO-K1 cell genomic DNA as a template, SseNru-CHA1-200-s / MluI-CHA1-r primer set, Bam-CHA2-s / PciNru-CHA2-200
  • a homologous DNA fragment (CHA1-200 and CHA2-200) of the target hprt gene was cloned by PCR reaction with the -r primer set.
  • CHA1-200 and CHA2-200 were set to sequences homologous to the region containing exon 3 of the hprt gene.
  • the primer sequences used in the PCR reaction are as shown below.
  • DNA sequence 8 (heavy chain cassette) was inserted into the restriction enzyme Mlu I site to obtain a CHO 200b ⁇ 2 vector having a homology arm length of 200b shown in FIG. 15 (A).
  • a homologous DNA fragment of target hprt gene (CHA1-) by PCR reaction with SseNru-CHA1-500-s / MluI-CHA1-r primer set and Bam-CHA2-s / PciNru-CHA2-500-r primer set. 500 and CHA2-500 were cloned respectively.
  • DNA sequence 8 (heavy chain cassette) was inserted into the restriction enzyme Mlu I site to obtain a CHO 500b ⁇ 2 vector having a homology arm length of 500b shown in FIG. 15 (B).
  • Example 13 Obtaining a homologous recombinant by a vector having a homologous DNA fragment having a chain length of 5 kb and expressing an antibody heavy chain CHO 5 kb ⁇ 2 vector preparation PCR using genomic DNA of CHO-K1 cells as template and NsiNru-CHA1-5k-s / MluI-CHA1-r primer set, BclI-CHA2-s / BspNru-CHA2-5k-r primer set By the reaction, homologous DNA fragments (CHA1-5k and CHA2-5k) of the target hprt gene were cloned. CHA1-5k and CHA2-5k were set to sequences homologous to the region containing exon 3 of the hprt gene. The primer sequences used in the PCR reaction are as shown below.
  • NsiNru-CHA1-5ks primer 5'-ttATGCATTCGCGAAtctcaggtgataggagacataagac-3 '(SEQ ID NO: 89)
  • BclI-CHA2-s primer 5'-ttTGATCAgactgaagagctactgtgta-3 '(SEQ ID NO: 90)
  • BspNru-CHA2-5k-r primer 5'-ttTCATGAaTCGCGAAtcagcactcaggagtcagag-3 '(SEQ ID NO: 91)
  • DNA sequence 8 (heavy chain cassette) was inserted into the restriction enzyme Mlu I site to obtain a CHO 5 kb ⁇ 2 vector having a homology arm length of 5 kb shown in FIG.

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Abstract

　目的タンパク質の生産に有用な組み換えＣＨＯ細胞の効率的な製造に有用なＤＮＡ構築物が開示されている。このＤＮＡ構築物は、５'末端から３'末端に向かって、第一の相同ＤＮＡ断片、目的タンパク質遺伝子、および第二の相同DNA断片を含んでなる、ＤＮＡ構築物であって、第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が、ＣＨＯ細胞ゲノムのヒポキサンチン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（hprt）遺伝子座の一部と相同組み換え可能な相同性を有し、かつ１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものである。

Description

ＤＮＡ構築物およびそれを用いた組み換えＣＨＯ細胞の製造方法
　本発明は、組み換えＣＨＯ細胞の効率的な製造に有用なＤＮＡ構築物、およびそれを用いた組み換えＣＨＯ細胞の製造方法に関する。
　組み換えタンパク質生産システムにおいて、原核生物や真核生物を宿主とした種々の方法が知られている。哺乳類動物細胞を宿主とした組み換えタンパク質生産システムは、ヒトを始めとする高等動物由来のタンパク質に対し、糖鎖付加、フォールディング、リン酸化などの翻訳後修飾をより生体で作られるものと同じように施すことが可能である。
　この翻訳後修飾は、タンパク質の本来有する生理活性を組み換えタンパク質で再現するために必要なものであり、そのような生理活性が特に必要とされる医薬品などに用いられる組み換えタンパク質の生産系には、哺乳類動物細胞を宿主としたタンパク質生産システムがよく用いられている。
　現在、工業的生産に用いられている哺乳類動物細胞による主なタンパク質生産システムとしては、ＣＨＯ－ＤＨＦＲシステムとＧＳ－ＮＳ０システムの二つが挙げられる。これらの生産システムでは、プラスミドベクターに含まれる選択マーカーと適切な薬剤選択プロセスを組み合わせることで、染色体に組み込まれたプラスミドベクターのコピー数が増幅したクローンを選択する。特にＣＨＯ－ＤＨＦＲシステムは、選択薬剤メトトレキセートによる２段階の選抜工程により、発現レベルが数十倍に増大した細胞クローンを選択しうる。
　しかしながら、上記タンパク質生産システムには、単純に増幅されたプラスミドベクターのコピー数に比例して目的タンパク質の発現レベルが必ずしも増大しないこと、発現レベルが増大した細胞クローンを選択するまでにかかる時間が長いことなどの問題があることが知られている。さらに、発現レベルが増大した細胞クローンの選択後に、選択薬剤を含まない培地で選択細胞クローンの培養を継続することで、ほとんどのクローンにおいて発現レベルの減少または消失が確認されることが報告されている（特許文献１：特表２００２－５４１８５４公報、非特許文献１：Ｋｉｍ，　Ｎ．　Ｓ．　（１９９８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．，６０，　６７９－６８８．）。
　また、上記のような哺乳類動物細胞による目的タンパク質生産システムは、一般的に、目的タンパク質遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入し、該ベクターが染色体へ組み込まれた細胞クローンを選択し、さらに該細胞クローンを適切な培養条件で培養することにより製造されている。
　この染色体への組み込みはランダムな位置で起こりうる事象であり、得られる細胞クローンによって目的タンパク質の発現レベルが異なる。また細胞クローンによっては目的タンパク質を発現しないなどの問題がある。これについては、多数のクローンを組み換えタンパク質の発現レベルにより選抜して、好ましいクローンを選択するという方法が採られている。しかしながら、このスクリーニングプロセスは非常に手間と労力を要する。このような手間を回避して迅速に好ましいクローンを選択するための種々のプロセスが報告されている。
　例えば、マウス細胞の特定染色体位置にベクターを組み込む技術が開示されている（特許文献２：特表平９－５１０８６５公報）。免疫グロブリンγ２Ａ座と相同な塩基配列を有する配列を搭載したベクターにより、組み換え細胞クローンのプール中に相同的組み換え細胞クローンを生じさせる。標的となる染色体位置は、外来遺伝子が組み込まれた際にランダム組み込みと比較して高い発現レベルを与えうる位置としてあらかじめ同定されている。したがって、スクリーニング対象となる組み換え細胞クローンのプール中に、高い発現レベルを有する相同的組み換え細胞クローンが一定の頻度で存在することにより、発現レベルによるスクリーニングの際の労力を低減することが可能となる。
　また、マーキングプラスミドの利用技術についても開示されている（特許文献３：特表２００１－５１６２２１公報）。あらかじめマーキングプラスミドをランダム組み換えした細胞クローン集団の中からマーキングプラスミド内に存在するマーカー遺伝子の発現レベルが高いクローンを選択しておく。次に目的タンパク質遺伝子を有するプラスミドベクターとランダムに組み込まれたマーキングプラスミド配列との間で部位特異的組み換えが引き起こされた細胞クローンを選択することにより、マーカー遺伝子の発現レベルを継承した目的タンパク質産生クローンが得られる。
　上記技術は、発現レベルの高いクローンの選択に要する労力削減において有利である。しかしながら、例えば、組み換え細胞を選択薬剤非添加で継続的に培養した際、得られたクローンが長期的に発現レベルを安定に維持しうるかについては依然として予測できない。
　医薬タンパク質の工業的生産においては、タンパク質の発現が高いレベルでかつ安定に維持されることが重要である。特に発現レベルが安定に維持されることに関しては、コスト面のみならず、医薬タンパク質としての同一性および安全性を証明するためにも重要である。組み換えタンパク質生産細胞を工業的スケールでの生産に用いるためには生産細胞クローンの培養スケールの拡大を図る必要がある。これには通常少なくとも樹立直後のクローンから約６０回の細胞分裂を経なければならないと見積られており（非特許文献２：Ｂｒｏｗｎ，　Ｍ．　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　９，　２３１－２３６．）、この発現レベルが一定に保たれていなければならない。
　また、選択薬剤は培養コストを上昇させることのみならず、医薬品への異物混入リスク回避のために行われる精製プロセスのコストも上昇させる。したがって、選択薬剤を添加することなく発現レベルを安定に維持できる細胞クローンの作製技術の開発が強く望まれている。　
　上記のような事情があるにも関わらず、目的タンパク質発現レベルの安定性に関して充分な技術的検討が行なわれてきたとはいえない。これまでのところ、多くのタンパク質産生系の製造方法においては、長期培養時における成長速度ならびに生産性に関して蓄積されたデータを元に、経験的にクローン選択が行なわれている。しかしながら、この経験的な方法では発現レベルが安定な細胞クローンを実際に取得できるケースは稀である（非特許文献３：Ｂａｒｎｅｓ，　Ｌ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００３）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　８１，　６３１－６３９．）。
　近年、細胞ゲノム中の標的遺伝子座に目的タンパク質遺伝子を特異的な組み込み、長期間、安定にタンパク質を発現しうる組み換え細胞を効率的に取得する手法が検討されている。
　この標的遺伝子の一例としては、hprt遺伝子が挙げられる。hprt遺伝子は、ヒト等のＸ染色体長腕に存在するハウスキーピング遺伝子の一つとして知られており、hprt遺伝子のノックアウト後の細胞は、薬剤6-Thioguanime
(6TG)やG418に対して耐性を示すため、陰性選択が容易に行われる。
　そして、本発明者らの一部は、ヒトの雄由来のHT1080細胞株のhprt遺伝子座へ目的タンパク質遺伝子を組み換えベクターにより導入し、選択薬剤非存在下で長期間、安定にタンパク質を発現しうる組み換え細胞を取得したことを報告している（特許文献５：特開２００７－３２５５７１公報、非特許文献４：Ｋｏｙａｍａ　Ｙ　Ｅｔ　Ａｌ．，（２００６）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５，１０５２－１０６０）。この実施例においては、各々約１ｋｂｐの第一および第二の相同DNA断片をホモロジーアームとして用いたところ、107細胞あたり10クローン程度の組み換え細胞を取得したことが報告されている。
　また、hprt遺伝子座へのターゲッティングの別の例としては、マウスＥＳ細胞に対してターゲッティングが行われたことが報告されている（特許文献６：特表平５－５０７８５３公報）。
　しかしながら、同じ遺伝子座を標的としても、培養細胞の種類によっては、ジーンターゲッティング頻度が大きく異なる場合がある。例えば、Ｐｏｒｔｅｒ　Ｃ．　Ｇ．　Ｉｔｚｈａｋｉ　Ｊ．　Ｅ，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２１８，　２７３－２８１（非特許文献５）、および広島大学原爆放射線医科学研究所年報第44号 (2003)（非特許文献６）では、ＥＳ細胞と、ＨＴ１０８０細胞とを比較すると、ジーンターゲッティング頻度が異なり、体細胞由来の培養細胞では、ジーンターゲッティング頻度が極めて低いことが報告されている。
　一方、ＣＨＯ細胞は、抗体医薬タンパク質産生系の宿主細胞として利用されており、ＣＨＯ細胞を用いて高レベルで安定なタンパク質生産システムを製造することが求められている。
　しかしながら、ＣＨＯ細胞のhprt遺伝子座に対してジーンターゲッティングが行われたことは報告されていない。ＣＨＯ細胞の一方の染色体上のaprt遺伝子を欠損した特殊な細胞株を用いた研究例が存在するのみである（非特許文献１１:ＰＮＡＳ，８８, ９４８８－９５０２（１９９１）、非特許文献１２：Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １９，　３６３－３７５、非特許文献１３：ＰＮＡＳ，８６,４５７４－４５７８（１９８９））。これらの実施例では、一方の染色体上のみにaprt遺伝子が存在する細胞株を宿主とし、２.６ｋｂｐ～４ｋｂｐの相同ＤＮＡ断片をホモロジーアームとして用いた結果、107細胞あたり数クローン～１５クローン程度の相同組み換え体を取得している。
　また、ＣＨＯ細胞のhprt遺伝子座のゲノムの配列はエキソン以外は何ら報告されていない。したがって、ＣＨＯ細胞のhprt遺伝子座に対する特異的なジーンターゲッティングを行うためには、まずはエキソン以外の全塩基配列を解析し、同定しなければならないないという問題がある。
　また、ＣＨＯ細胞は、雌由来の細胞であることから、Ｘ染色体を２本有しており、そのhprt遺伝子座も２つ有している。そのため、両方の染色体のhprt遺伝子座に外来遺伝子が組み込まれることで、ＣＨＯ細胞は６TG等の選択薬剤耐性となる。しかしながら、このように、２本の染色体で組み換えが生じる確率は、雄由来細胞の場合と比べて低くなるのが通常である。例えば、Ｋｏｙａｍａ　Ｙ　Ｅｔ　Ａｌ．，　（２００６）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５，１０５２－１０６０（非特許文献４）における雄由来HT1080細胞株のhprt遺伝子座への組み換え効率を参考として染色体１本で組み換えが生じる確率を10-６と仮定すると、染色体２本で同時に生じる理論上の確率は10-1２となる。
　さらに、雌由来の細胞では、２本存在するＸ染色体のうち、片方は父方に由来し、もう片方は母方に由来するため、ポリモルフォリズムが存在する。ジーンターゲッティングの頻度は、ホモロジーアームのゲノムに対する相同性が重要であり、塩基配列の相違により、大幅にジーンターゲッティング頻度が大幅に低下する場合がある（非特許文献７：Ｄａｔｔ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　９４，　９７５７－９７６２、非特許文献８：Ｓｅｌｖａ　Ｅ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，（１９９５）　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．　１３９，　１１７５－１１８８、非特許文献９：Ｒｉｅｌｅ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９２）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８９，　５１２８－５１３２、非特許文献１０：Ｄｅｎｇ　Ｃ，　Ｄ，　Ｃａｐｅｃｃｈｉ　Ｍ，　Ｒ　（１９９２）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１２，　３３６５－３３７１）。よって、ＣＨＯ細胞のような雌由来の培養細胞の場合、Ｘ染色体のポリモルフォリズムの影響によっても、雄由来の培養細胞と比較して、組み換え細胞の取得頻度は低くなりうる。
　したがって、目的タンパク質遺伝子を発現する組み換えＣＨＯ細胞を効率的に製造する技術の創出が依然として必要とされている。
特表２００２－５４１８５４公報 特表平９－５１０８６５公報 特表２００１－５１６２２１公報 ＷＯ２００４／０２２７４１公報 特開２００７－３２５５７１公報 特表平５－５０７８５３公報
Ｋｉｍ，　Ｎ．　Ｓ．　（１９９８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．，　６０，　６７９－６８８． Ｂｒｏｗｎ，　Ｍ．　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　９，　２３１－２３６． Ｂａｒｎｅｓ，　Ｌ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００３）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　，　８１，　６３１－６３９． Ｋｏｙａｍａ　Ｙ　Ｅｔ　Ａｌ．，　（２００６）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　９５，　１０５２－１０６０ Ｐｏｒｔｅｒ　Ｃ．　Ｇ．　Ｉｔｚｈａｋｉ　Ｊ．　Ｅ，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２１８，　２７３－２８１ 広島大学原爆放射線医科学研究所 年報第44号 (2003) Ｄａｔｔ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９７）　ＰＮＡＳ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．　９４，　９７５７－９７６２ Ｓｅｌｖａ　Ｅ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９５）　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．　１３９，　１１７５－１１８８ Ｒｉｅｌｅ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９２）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８９，　５１２８－５１３２ Ｄｅｎｇ　Ｃ，　Ｄ，　Ｃａｐｅｃｃｈｉ　Ｍ，　Ｒ　（１９９２）　Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２，３３６５－３３７１ ＰＮＡＳ，８８, ９４８８－９５０２（１９９１） Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １９，　３６３－３７５ ＰＮＡＳ，８６,４５７４－４５７８（１９８９） Ｍｏｌ Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２１２，　３０１－３０９（１９８８） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　３１，　８５－９０（２００４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　９１，　１－１１（２００５）
　本発明者らは、今般、ＣＨＯ細胞におけるhprt遺伝子のイントロンを含む全ＤＮＡ配列を決定し、さらに、その相同ＤＮＡ断片を有する特定のＤＮＡ構築物により目的タンパク質遺伝子をＣＨＯ細胞に導入したところ、組み換えＣＨＯ細胞を顕著な高頻度で製造しうることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
　したがって、本発明は、組み換えＣＨＯ細胞の効率的な製造に有用なＤＮＡ構築物およびそれを用いた組み換えＣＨＯ細製造方法の提供をその目的とする。
　そして、本発明によるＤＮＡ構築物は、５’末端から３’末端に向かって、第一の相同ＤＮＡ断片、目的タンパク質遺伝子、および第二の相同ＤＮＡ断片を含んでなる、ＤＮＡ構築物であって、
　前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が、ＣＨＯ細胞ゲノムのヒポキサンチン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（hprt）遺伝子座の一部と相同組み換え可能な相同性を有し、かつ１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものである。
　また、本発明による組み換えＣＨＯ細胞の製造方法は、上記ＤＮＡ構築物を含んでなるベクターをＣＨＯ細胞に導入することを含んでなる。
　本発明によれば、目的タンパク質遺伝子を発現する組み換えＣＨＯ細胞を顕著な高頻度で取得することができる。
実施例１における、ＣＨＯ－Ｋ１細胞株のhprt遺伝子座の模式図である。番号１から９まではhprt遺伝子のエクソン１～９を示し、各エクソン間の配列は、イントロン１～８を示す。 実施例２で用いられた相同組み換え用ベクターの模式図である。（Ａ）はＣＨＯ細胞のhprt遺伝子に由来する相同ＤＮＡ断片を有するベクターである。（Ｂ）はヒトＨＴ１０８０細胞に由来する相同ＤＮＡ断片を有するベクターである。 （Ａ）は、ＣＨＯ細胞のhprt遺伝子領域、相同組み換え用ベクター、および実施例４において組み換えＣＨＯ細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式図である。（Ｂ）および（Ｃ）は、実施例４のＰＣＲの結果を示す。 （Ａ）は、ＣＨＯ細胞のhprt遺伝子領域、相同組み換え用ベクター、および実施例５におけるサザンハイブリダイゼーションの指標となったＤＮＡの関係を示す模式図である。（Ｂ）は、実施例５のサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。 実施例６で取得された組み換えＣＨＯ細胞による抗体生産量を示す。 実施例７で用いられた、２．５ｋｂｐの相同ＤＮＡ断片を有する相同組み換え用ベクターの模式図である。 （Ａ）は、ＣＨＯ細胞のhprt遺伝子領域、相同組み換え用ベクター、および実施例７において組み換えＣＨＯ細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式図である。（Ｂ）および（Ｃ）は、実施例７のＰＣＲの結果を示す。 （Ａ）は、ＣＨＯ細胞のhprt遺伝子領域、相同組み換え用ベクター、および実施例７におけるサザンハイブリダイゼーションの指標となったＤＮＡの関係を示す模式図である。（Ｂ）は、実施例７のサザンハイブリダイゼーションより得られた結果を示す。 （Ａ）は、実施例８における、ＣＨＯ細胞中の野生型hprt遺伝子の残存を確認するためのゲノムＰＣＲの詳細を説明する模式図である。左図は、野生型のＣＨＯ細胞におけるＰＣＲを示し、中央図は、ヘテロ接合型の組み換えＣＨＯ細胞におけるＰＣＲを示し、右図は、ホモ接合型の組み換えＣＨＯ細胞におけるＰＣＲを示す。　（Ｂ）は、実施例８のＰＣＲの結果を示す。 実施例９で用いられた、２．５ｋｂｐの相同ＤＮＡ断片を有し、ＣＨＯ内在性のプロモーターを有する相同組み換え用ベクターの模式図である。 実施例９で取得された組み換えＣＨＯ細胞を長期間継代維持した場合の、抗体生産性を示す。 実施例１０で用いられた、２．５ｋｂｐの相同ＤＮＡ断片を有する相同組み換え用ベクターの模式図である。 実施例１１で用いられた、ヒトｈｐｒｔ遺伝子イントロン由来のＭＡＲを有するＣＨＯ組換えベクターと、そのベクターがＣＨＯ　ｈｐｒｔ遺伝子座へ組込まれた染色体の模式図である。（Ａ）はＭＡＲが転写されない構造のベクターと、組込み後の染色体構造である。（Ｂ）はＭＡＲがｈｐｒｔ遺伝子座の転写によって転写される構造のベクターと、組込み後の染色体構造である。（Ｃ）はＭＡＲがＣＭＶプロモーターで転写される構造のベクターと、組込み後の染色体構造である。 実施例１１で用いられた、ＭＡＲを有するＣＨＯ組換えベクターによって取得されたＣＨＯ細胞の抗体生産における安定性を示す。 実施例１２で用いられた、ホモロジーアーム長２００ｂ×２のＣＨＯ組み換えベクター（Ａ）、および５００ｂ×２のＣＨＯ組み換えベクター（Ｂ）を示す模式図である。 実施例１３で用いられた、ホモロジーアーム長５ｋｂ×２のＣＨＯ組み換えベクターを示す模式図である。
ＤＮＡ構築物
　本発明によるＤＮＡ構築物は、ＣＨＯ細胞ゲノム中のhprt遺伝子座の一部と相同組み換え可能な相同性を有し、各々が１ｋｂｐ以上の鎖長を有する、二つの相同ＤＮＡ断片を含んでなることを一つの特徴とする。上記ＤＮＡ構築物によれば、ＣＨＯ細胞が２本のＸ染色体を有するにもかかわらず、顕著な高頻度で組み換えＣＨＯ細胞を取得しうるのは意外な事実である。本発明によるＤＮＡ構築物によれば、後述の実施例１０に示される通り、１ｘ１０-７あたり１３０個の組み換え細胞が得られている。この結果は、上記したように、染色体２本のhprt遺伝子座において同時に組み換えが生じる理論上の確率が１０-1２と予測されていたことを勘案すると、驚くべき事実といえる。
　本発明によるＤＮＡ構築物は、hprt遺伝子座の一部を相同組み換えの標的領域とするものである。hprt遺伝子座の一部を標的領域とすることは、目的タンパク質遺伝子を高レベルで安定に発現する上で有利である。また、かかる標的領域に、ＤＮＡ構築物を組み込むことは、hprt遺伝子の転写・発現を阻害してhprt遺伝子の機能を不活化し、6-TG等を用いる陰性選択によって効率的に組み換え細胞を取得する上でも好ましい。
　また、本発明の標的領域は、目的タンパク質遺伝子の発現を妨げない限り、hprt遺伝子座中において適宜決定してよい。しかしながら、相同組み換えに必要な相同ＤＮＡ断片の鎖長等を勘案すれば、上記標的領域は、hprt遺伝子のイントロンの少なくとも一部を含む領域が好ましい。上記イントロンは、本発明者らにより今般、塩基配列が決定されたものであり、具体的には、配列番号１５～２２のいずれかで表される塩基配列を有する、後述する図１のイントロン１～８が挙げられる。
　また、本発明の標的領域は、上記イントロンと隣接するエクソンの全部または一部を含んでいてもよい。かかるエクソンとしては、具体的には、図１のエクソン１～９が挙げられ、これらの塩基配列は、例えば、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等の公知のデータベースにアクセスすることにより取得することができる。
　本発明にあっては、図１に示されるhprt遺伝子座におけるイントロンおよびエクソンの配置・それらの塩基配列の情報に基づき、hprt遺伝子座中の所望の領域と相同性を有する相同ＤＮＡ断片が当業者により適宜構築される。
　かかる相同ＤＮＡ断片を有する本発明によるＤＮＡ構築物によれば、hprt遺伝子座中の所望の標的領域に組み込むことが可能である。この組み込みの態様としては、（１）ＤＮＡ構築物の組み込みによってエクソンが分断されるタイプ、（２）ＤＮＡ構築物の組み込みによってエクソンが１つ以上欠失するタイプ、（３）ＤＮＡ構築物の組み込みによってエクソンが２個に増幅し、その間にＤＮＡ構築物が挿入されるタイプ、（４）ＤＮＡ構築物の組み込みによってイントロンが分断されるタイプ、（５）ＤＮＡ構築物の組み込みによってイントロンが１つ以上欠失するタイプ、（６）ＤＮＡ構築物の組み込みによってイントロンが２個に増幅し、その間にＤＮＡ構築物が挿入されるタイプが挙げられる。
　また、本発明のＤＮＡ断片は、相同組み換えに必要な鎖長を勘案すると、上述の通り、hprt遺伝子のイントロンの少なくとも一部を含む領域と相同性を有するものが好ましい。したがって、本発明の一つの態様によれば、本発明の第一の相同ＤＮＡ断片または第二の相同ＤＮＡ断片は、配列番号１５～２２のいずれかに記載の塩基配列またはその部分配列を含んでなるものとされる。
　また、上記部分配列の鎖長の下限は１ｂｐであり、その上限は配列番号１５～２２のいずれかに記載の塩基配列の鎖長の範囲内において、適宜調節することができる。
　また、上記相同ＤＮＡ断片と、hprt遺伝子座との相同性は、相同組み換えの効率を勘案して適宜決定されるが、好ましくは９９．０％以上、より好ましくは９９．９％以上、さらに好ましくは１００％である。かかる相同性は、例えば、ＤＮＡシーケンサー等を用いて解析することにより適宜決定することができる。
　また、上記相同ＤＮＡ断片は１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものとされており、かかる鎖長は、ＤＮＡ構築物の顕著な高頻度での相同組み換えを達成する上で好ましい。上記相同ＤＮＡ断片の鎖長の下限値は、好ましくは２．５ｋｂｐ以上である。また、上記相同ＤＮＡ断片の鎖長の上限値は、７．５ｋｂｐ以下であり、好ましくは５ｋｂｐ以下である。相同ＤＮＡ断片の鎖長の範囲は上記の上限値、下限値を適宜組み合わせることができる。具体的には、好ましくは１ｋｂｐ以上７．５ｋｂｐ以下、より好ましくは１ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下、最も好ましくは２．５ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下である。鎖長がこの範囲であれば、ＤＮＡ構築物の顕著な高頻度での相同組み換えを達成しながら、組み換え細胞の取得頻度を良好に保つことが可能となる。
　また、本発明によるＤＮＡ構築物において、目的タンパク質遺伝子は、医薬として有用なタンパク質をコードしていることが好ましい。目的タンパク質遺伝子は、cDNAに由来する配列であっても、ゲノムDNAに由来する天然イントロンを含む構造遺伝子であっても、好適に利用可能である。具体的には、目的タンパク質としては、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、凝固因子、調節タンパク質、レセプター等が挙げられるが、好ましくは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、エリスロポエチン、組織特異的プラスミノーゲン活性化因子または顆粒球コロニー活性化因子等である。
　また、上記目的タンパク質遺伝子は、プロモーター配列や転写終結シグナル配列等の発現に必要な要素を含む発現ユニットとしてhprt遺伝子座に組み込まれることが好ましい。したがって、本発明の一つの態様によれば、目的タンパク質遺伝子は、少なくともプロモーター配列および転写終結シグナル配列を含んだ発現ユニットとしてＤＮＡ構築物中に配置される。
　もっとも、発現に必要な要素としてＣＨＯ細胞の内在性のものを用いるように構成してもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
　また、上記プロモーターや転写終結シグナルは、目的タンパク質遺伝子の種類、性質等に応じて適宜決定してよく、かかるプロモーター配列の好適な例としては、CMVプロモーター、SV40 プロモーター等が挙げられる。また、転写終結シグナル配列の好適な例としては、BGHポリAシグナル配列、SV40ポリAシグナル配列等が挙げられる。
　また、プロモーター配列、転写終結シグナル配列の他の発現に必要な要素としては、例えば、目的遺伝子を効率的に発現させるための調節エレメント（例えば、エンハンサー、ＩＲＥＳ（internal ribosome entry site）配列、ＬｏｘＰ配列およびＦＲＴ配列等の組み換え酵素認識配列）等を適宜選択して用いてよい。調節エレメントはその性質に応じて、発現ユニットにおける適切な位置に配置することが可能である。これら発現に必要な要素は、目的タンパク質の生産性等を勘案して適宜選択される。
　また、ＤＮＡ構築物は、上記の他、陽性選択マーカー遺伝子を含んでなることが好ましい。陽性選択マーカー遺伝子は、相同組み換えを妨げない限り、ＤＮＡ構築物中に適宜配置することができる。陽性選択マーカー遺伝子の好適な例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子およびグルタミン合成酵素遺伝子等が挙げられる。陽性選択マーカー遺伝子を用いる場合、組み換えＣＨＯ細胞の選択において、陽性選択と、hprt遺伝子の不活化による陰性選択の両者を適用でき、偽陽性クローンを大幅に低減する上で有利である。
ベクター
　本発明によるＤＮＡ構築物は、ベクターに組み込んでＣＨＯ細胞ゲノムに導入することができる。かかるベクターシステムとしては、相同組み換え反応によりＤＮＡ構築物をＣＨＯ細胞ゲノムに組み込みうる限り特に限定されないが、好ましくは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターまたは人工染色体ベクター等が挙げられる。
　本発明によるＤＮＡ構築物およびこれを含むベクターは、制限酵素切断反応およびライゲーション反応を組み合わせて好適に構築される。例えば、各構成ユニットの両末端に制限酵素の認識配列を含有させ、該認識配列用の制限酵素で切断反応を行い、不要なＤＮＡ配列（大腸菌内での操作用配列等）をゲル切り出し等の処理によって除去し、得られたユニットのライゲーション反応を行うことにより、ＤＮＡ構築物およびこれを含むベクターを構築しうる。
　ライゲーション反応により構築したベクターＤＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出等により精製し、ベクターの種類等を勘案して選択した大腸菌、酵母等の宿主細胞において増殖させることができる。
　本発明によるベクターは、ＣＨＦ１αプロモーターを、目的タンパク質遺伝子に作動可能に連結して搭載していることが好ましい。ＣＨＯ　ｈｐｒｔ遺伝子座に組込んだ外来遺伝子の発現はプロモーターの不活化によって生じる。目的タンパク質遺伝子をＣＨＯ内在性のＣＨＥＦ１αプロモーターで発現させるベクター構造にすることで、ＣＨＯ　ｈｐｒｔ遺伝子座での安定発現が可能となる。
　本発明によるベクターは、ヒトｈｐｒｔ遺伝子の第一イントロン由来の核／マトリックス付着領域（ＭＡＲ）を、当該ベクターが染色体に組込まれた後、組込み部位で元来生じている転写によって、ＭＡＲ自身が転写される構造で保持することが好ましい。このような構造でヒトｈｐｒｔ遺伝子イントロンのＭＡＲをベクターに搭載しておくことで、発現安定性を備えた組換えＣＨＯを効率的に製造できる。
　出願人らは、先に、ヒト由来細胞株ＨＴ１０８０細胞株において、ｈｐｒｔ遺伝子座に組込んだ外来遺伝子が安定発現することを報じている（特許文献４：ＷＯ２００４／０２２７４１公報、および非特許文献５：Ｐｏｒｔｅｒ　Ｃ．　Ｇ．　Ｉｔｚｈａｋｉ　Ｊ．　Ｅ，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２１８，　２７３－２８１）。また、ヒトｈｐｒｔ遺伝子の第一イントロンには、核／マトリックス付着領域（ＭＡＲ）と呼ばれる安定化因子が存在することが知られている（非特許文献１４）。これらの事実から、ヒトｈｐｒｔ遺伝子での発現安定化は、組込み部位近傍に存在するＭＡＲの寄与によるものと推察される。
　ところで、ｈｐｒｔ遺伝子はＣＨＯを含めた多くの哺乳動物において普遍的に存在する遺伝子である。ＣＨＯのｈｐｒｔ遺伝子座は、組込み細胞の選別難易度が高いと推定されるため、ベクター組込み部位として用いられた例は知られていない。当業者であれば、ＣＨＯのｈｐｒｔ遺伝子座に外来遺伝子を組込んだ場合は、ヒト細胞と同様に安定発現可能であると考えるのが普通である。しかしながら、ＣＨＯのｈｐｒｔ遺伝子座のイントロン配列は、ヒトのｈｐｒｔ遺伝子とは全くことなっており、イントロンにＭＡＲが存在しないという驚くべき事実が、本発明者らによって今般初めて明らかにされた。実際に、ＣＨＯのｈｐｒｔ遺伝子座に組込んだ外来遺伝子は、実施例１１に示すように、安定発現不能であった。
　以上の結果から、ＣＨＯのｈｐｒｔ遺伝子座に外来遺伝子を組込む場合に、当業者であれば、ヒトｈｐｒｔ遺伝子イントロンのＭＡＲを取得し、ＣＨＯ組換えベクターに搭載してＣＨＯのｈｐｒｔ遺伝子座に組込むことで、ＣＨＯでもヒト細胞と同様に安定発現可能ではないかと考えるであろう。この考え方に沿って、ＭＡＲをベクターに搭載し、ＣＨＯの染色体にランダムに組込む、あるいは染色体外プラスミドとして保持させることで、部分的に安定化を達成した先行例が知られている（非特許文献１４：Ｍｏｌ Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２１２，　３０１－３０９（１９８８）および非特許文献１５：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　３１，　８５－９０（２００４））。これらの先行例では、ＭＡＲ自身は転写されない位置でベクターに搭載した構造（非特許文献１４）、または目的タンパク質遺伝子の転写を期待して配置したプロモーターによって、ＭＡＲ自身も転写される構造（非特許文献１５）となっている。
　しかしながら、後述する実施例１１に示すように、ＣＨＯのｈｐｒｔ遺伝子座においてはそれらの構造は効果が薄く、長期間の安定発現には不十分であるという、意外な結果となった。そして、ＣＨＯのｈｐｒｔ遺伝子座で安定発現を達成するためには、実施例１１で示すように、ベクター組込み部位で元来生じている転写によってのみ、ベクターに搭載したＭＡＲが転写される構造であることが必要であることが明らかにされた。
組み換えＣＨＯ細胞／製造方法
　本発明による組み換えＣＨＯ細胞は、上記ベクターをＣＨＯ細胞に導入することにより好適に製造することができる。
　したがって、本発明による組み換えＣＨＯ細胞は、hprt座に外来性の目的タンパク質遺伝子が組み込まれてなる。また、本発明の好ましい態様によれば、組み換えＣＨＯ細胞はhprt遺伝子の機能が不活化している。かかる組み換えＣＨＯ細胞は、抗体等の目的タンパク質を高レベルで安定に産生する上で有利である。
　ベクターの導入
　上記ベクターの導入方法としては、一般的に用いられる方法が好適に利用できる。例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、リポソーム試薬を用いる方法、カチオン性脂質を用いたリポフェクション法などが挙げられる。ここで、ベクターが環状である場合、公知の方法により線状化して細胞に導入されてもよい。
　また、ベクターや目的タンパク質の性質によっては、組み換え細胞の取得効率等を勘案して、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムやＦｌｐ／ＦＲＴシステムなどのような、組み換え酵素を利用した部位特異的導入システムも適宜適用してよく、本発明にはかかる態様も包含される。
細胞株の選択
　また、本発明による製造方法にあっては、上記導入後、組み換えＣＨＯ細胞の選択を行うことが好ましい。選択工程は、hprt遺伝子の不活化に基づく陰性選択により行うことができる。また、陽性マーカー遺伝子を組み換えＣＨＯ細胞に導入している場合には、陰性選択と陽性選択とを組み合わせて高い精度で細胞選択を行うことが可能となる。
　また、上記選択方法の他、プロモータートラップ法やポリＡトラップ法なども適宜組み合わせて利用してよい。
　また、本発明による製造方法にあっては、組み換えＣＨＯ細胞を取得後、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　培地などに馴化させることにより無血清下での培養も可能である。かかる馴化条件は、組み換え細胞の状態に応じて適宜決定することができる。
目的タンパク質の製造方法
　また、本発明の別の態様によれば、上記組み換えＣＨＯ細胞を用意し、該細胞を培養して目的タンパク質を産生することを含んでなる、目的タンパク質の製造方法が提供される。上記方法によれば、目的タンパク質を効率的かつ安定に取得することができる。
　上記培養工程における培地としては、組み換えＣＨＯ細胞の状態に応じて公知の培地を適宜選択してよいが、無血清培地が好ましい。また、上記培地は、培養コストおよび精製コストを勘案すれば、選択薬剤を添加しないものが好ましい。上記培地の好適な例としては、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｅｆｉｎｅｄ培地等が挙げられる。
　上記培養方法としては、バッチカルチャー法、フェッド－バッチカルチャー法、還流培養法など公知の方法が適用可能である。
　なお、組み換えＣＨＯ細胞の製造に使用される種々の手法のさらなる詳細は、例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８９）に記載されており、上記文献の全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる。　
　以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　なお、以下の実験において、制限酵素による反応、ＰＣＲ反応、ライゲーション反応等の各反応条件は、メーカーの推奨する反応条件、あるいは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ；　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　に記載の方法に従って設定した。また、得られた種々のプラスミドベクターＤＮＡについては、ＤＮＡシーケンサー（３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｅｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｉｎｃ．）を用いてＤＮＡ配列を決定した。また、以下に示すホモロジーアーム１および２はそれぞれ、本発明の第一および第二の相同DNA断片に対応している。
実施例１：ＣＨＯ細胞のhprt遺伝子座ＤＮＡ配列情報の取得
　ＪＣＲＢセルバンクから入手したチャイニーズハムスター卵母細胞株ＣＨＯ－Ｋ１細胞株（Ｃｅｌｌ　Ｎｏ；　ＪＣＲＢ９０１８）をＡＭＥＭ培地（組成；Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、５％［ｖ／ｖ］ＦＢＳ、１×　ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ））を用いて、CO2インキュベーター（３７ ℃、５％ CO2）で培養した。得られた培養液を遠心分離し、ＣＨＯ－Ｋ１細胞ペレットを得た。このペレットをＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｔｉｓｓｕｅｓ　（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｋ．Ｋ．）により処理し、ゲノムＤＮＡを得た。次に、このゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ　ｖｅｒ．２、ＴＯＹＯＢＯ）によって、ＣＨＯ－Ｋ１細胞のhprt遺伝子座のＤＮＡ断片を７つ得た。得られた断片は図１に示される通りである。７断片の増幅のために用いたＰＣＲプライマーは、Ｚｕ　Ｚ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ．　１９９３．　２８８（２）：２３７－４８．）に記載のプライマー配列を参考に作製した。プライマー配列は以下に示す通りである。
　断片１　ｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- tctgcaggct tcctcctcac accg -3’（配列番号１）
　断片１　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- acatgtcaag gcaacgccat ttcca -3’（配列番号２）
　断片２　ｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- tggaaatggc gttgccttga catgt -3’（配列番号３）
　断片２　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- caccttttcc aaatcctcga -3’（配列番号４）
　断片３　ｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- agcttatgct ctgatttgaa atcagctg -3’（配列番号５）
　断片３　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- cttcagtctg ataaaatcta cagtca -3’（配列番号６）
　断片４　ｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- aagacttgcc cgagatgtca tgaa -3’（配列番号７）
　断片４　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- ccaagtgagt gattgaaagc acag -3’（配列番号８）
　断片５　ｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- tgtgtgtatt caagaatatg catg -3’（配列番号９）
　断片５　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- gctgagaaaa tttaacagta ttttag -3’（配列番号１０）
　断片６　ｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- caaatacaag caagaatttc ccagag -3’（配列番号１１）
　断片６　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- ggacttgaac atctagggag -3’（配列番号１２）
　断片７　ｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- acttaccact taccattaaa tacc -3’（配列番号１３）
　断片７　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’- gacaatctat cgaaggctca tagtgc -3’（配列番号１４）
　得られた７つの断片についてＤＮＡシーケンスを行った（ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）。
　図１に示すように、ＣＨＯ－Ｋ１細胞株のhprt遺伝子座のエクソン１とエクソン２間に位置するイントロン１（配列番号１５）、エクソン２とエクソン３間に位置するイントロン２（配列番号１６）、エクソン３とエクソン４間に位置するイントロン３（配列番号１７）、エクソン４とエクソン５間に位置するイントロン４（配列番号１８）、エクソン５とエクソン６間に位置するイントロン５（配列番号１９）、エクソン６とエクソン７間に位置するイントロン６（配列番号２０）、エクソン７とエクソン８間に位置するイントロン７（配列番号２１）、エクソン８とエクソン９間に位置するイントロン８（配列番号２２）のＤＮＡ配列を決定した。
実施例２：ターゲティングベクターの構築
　以下に記載の手法により、抗体遺伝子をhprt遺伝子座に対して組み込むため、抗体遺伝子を含む、図２（Ａ）で表されるベクター（ＣＨＯ
１ｋｘ２ 抗体ベクター）を構築した。
　また、比較対象として、ヒトhprt遺伝子配列由来の相同ＤＮＡ断片を、ＣＨＯ細胞のhprt遺伝子配列由来の相同ＤＮＡ断片と置換した以外、ＣＨＯ １ｋｘ２ 抗体ベクターと同様の構成を有する図２（Ｂ）で表されるベクター（ＨＴ１０８０ホモロジーアームベクター）を構築した。
ヒトhprt遺伝子相同ＤＮＡ断片の取得
　ＪＣＲＢセルバンクから入手したヒト由来細胞株ＨＴ１０８０細胞株（カタログ番号：ＩＦ０５０３５４）をＧＦＸ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｂｌｏｏｄ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により処理し、ゲノムＤＮＡを得た。次に、このゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ反応（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－、ＴＯＹＯＢＯ）によって、標的となるhprt遺伝子の相同ＤＮＡ断片（ＨＡ１およびＨＡ２）をクローニングした。ＨＡ１およびＨＡ２は、後述する図３でも示される通り、hprt遺伝子のエクソン３を含む領域と相同な配列に設定した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下に示す通りである。
ＨＡ１ sense プライマー：
5’-CCTGCAGGTCGCGATTGGTACTTGTTCAGCTTTATTCAAG-3’（配列番号２３）
ＨＡ１ antisense プライマー：
5’-GTCGACAAGGACGCGTTCTGATAAAATCTACAGTCATAGGA-3’（配列番号２４）
ＨＡ２ sense プライマー：
5’-GTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCTCCGGAGACTGAAGAGCTATTGTGTGAGTAT-3’（配列番号２５）
ＨＡ２ antisense プライマー：
5’-ACATGTTCTCTTAAGTCGCGAAGTAGTGTTATGATGTATGGGCATA-3’（配列番号２６）
　上記ＰＣＲ反応においては、ＨＡ１センスプライマーの５’末端には、制限酵素Ｓｓｅ　８３８７ＩおよびＮｒｕ　Ｉの認識サイトを付加した。同様に、ＨＡ１アンチセンスプライマーの５’末端にはＳａｌ　ＩおよびＭｌｕ　Ｉの認識サイト、ＨＡ２センスプライマーの５’末端にはＳａｌ　ＩおよびＡｃｃ　ＩＩＩの認識サイト、ＨＡ２アンチセンスプライマーの５’末端にはＰｃｉ　ＩおよびＮｒｕ　Ｉの認識サイトをそれぞれ付加した。
　ｐＱＢＩ２５プラスミドベクター（和光純薬株式会社）のＤＮＡから、大腸菌内での複製起点であるｏｒｉ配列およびアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ配列を、ＰＣＲ反応によりクローニングした。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下に示す通りである。このＰＣＲ反応において、センスプライマーの５’末端および３’末端に、制限酵素Ｐｃｉ　ＩおよびＳｓｅ　８３８７Ｉの認識サイトを付加した。
Ｅｃｏｌｉ　ｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’-ACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAAC-3’（配列番号２７）
Ｅｃｏｌｉ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　プライマー：
5’-CCTGCAGGGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGC-3’（配列番号２８）
　ＨＡ１、ＨＡ２、およびｏｒｉ配列およびアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ配列をそれぞれ、ＰＣＲ反応によりクローニングした。これら３つのＤＮＡ配列を制限酵素Ｐｃｉ　Ｉ、Ｓｓｅ　８３８７ＩおよびＳａｌ　Ｉにより切断し、ライゲーション反応を行うことによりｐＨＡ１２プラスミドベクターを得た。次に、ｐＨＡ１２プラスミドベクターを制限酵素Ｍｌｕ　ＩおよびＡｃｃ　ＩＩＩにより切断し、５’末端から順に、ＨＡ２と、ｏｒｉ配列およびアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ配列と、ＨＡ１とが連結したＤＮＡ配列１を得た。
　また、ｐｃＤＮＡ３，１－Ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から、制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ認識サイトを含むＤＮＡ断片を、末端に制限酵素Ｍｌｕ
ＩおよびＡｃｃＩＩＩサイトを付加してPCR増幅を行い、ＤＮＡ配列２を得た。この断片とDNA配列１を連結し、p23HA12プラスミドベクターを得た。
基礎ベクターの構築
　次に、ｐ２３ＨＡ１２プラスミドベクターをＭｌｕ　ＩおよびＢａｍ］　ＨＩで切断し、リンカー２－ｓオリゴとリンカー２－ａオリゴをアニールさせたＤＮＡ断片を挿入し、基礎ベクターIIを得た。
リンカー２－ｓオリゴ：
5’-CGCGTatcTCTAGAataATCGATagaAAGCTTacaG-3’（配列番号２９）
リンカー２－ａオリゴ：
5’- GATCCtgtAAGCTTtctATCGATtatTCTAGAgatA-3’（配列番号３０）
　また、ｐＱＢＩ１５プラスミドベクター（和光純薬株式会社）のＤＮＡから、ＳＶ４０プロモーター、ポリＡシグナル配列およびネオマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ配列３（ＳＶ４０，ｎｅｏＲ，合成ポリＡを含む発現カセット）を、ＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。このＰＣＲ反応において、センスプライマーの５’末端に制限酵素Ｘｂａ　Ｉの認識サイトを、３’末端に合成ポリＡおよびＣｌａ　Ｉの認識サイトを付加した。
ｎｅｏＲ　ｓｅｎｓｅプライマー：
5’- ccttTCTAGActtctgaggcggaaagaacc-3’（配列番号３１）
ｎｅｏＲ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅプライマー：
5’-cttATCGATtCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTgtgggcgaagaactccagca-3’（配列番号３２）
　次に、基礎ベクターＩＩを制限酵素Ｘｂａ　ＩおよびＣｌａ　Ｉで切断し、ＤＮＡ配列３を連結し、基礎ベクター＋ＮｅｏＲプラスミドを得た。
抗体重鎖発現カセットの構築
重鎖可変領域を保持したプラスミド（「Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉ－ＲＮａｓｅ　Ａ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　３Ａ２１」：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．　Ｖｏｌ．８２，　Ｎｏ．３，　ｐｐ．　３１２－３１４，１９９９）を鋳型とし、可変領域をIGH-3A21s、IGH-3A21a1プライマーセットでPCR増幅し、ＤＮＡ配列４を得た。
ＩＧＨ－３Ａ２１ｓプライマー：
5’- TAAAAGGTGTCCAGGATGTGCAGTTTCAGG -3’（配列番号３３）
ＩＧＨ－３Ａ２１ａ１プライマー：
5’- GAGGCCGATGAAACAGTGACCAGAGTCCCT -3’（配列番号３４）
　ＲＰＭＩ８２２６培養細胞からＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）で抽出したＲＮＡを鋳型とし、Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＴ－ＰＣＲを行い、得られたｍＲＮＡを鋳型として定常領域をＩＧＨ－Ｃｓ、ＩＧＨ－ＣａプライマーセットでＰＣＲ増幅し、ＤＮＡ配列５を得た。
ＩＧＨ－Ｃｓプライマー：
5’- CATCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCT -3’（配列番号３５）
ＩＧＨ－Ｃａプライマー：
5’- TTAAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAG -3’（配列番号３６）
　次に、ＩＧＨ－ＬＳ、ＩＧＨ－Ｖａプライマーセットで、ＤＮＡ配列４を鋳型としてＰＣＲ増幅を行い、分泌シグナルを付加したＤＮＡ配列６を得た。
ＩＧＨ－ＬＳプライマー：
5’-GGTCGCCACCATGGAGTTTGGACTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGGATGTG-3’（配列番号３７）
ＩＧＨ－Ｖａプライマー：
5’-GCCCTTGGTGGAGGCCGATGAAACAGTGAC -3’（配列番号３８）
ＤＮＡ配列５およびＤＮＡ配列６を鋳型とし、IGH-Vs、IGH-CaプライマーセットでアセンブルＰＣＲを行い、両配列を連結させたDNA配列７を得た。
ＩＧＨ－Ｖｓプライマー：
5’-TTCCGGTACCGGTCGCCACCATGGAGTTTG -3’（配列番号３９）
　ｐｍａｘＧＦＰプラスミド（ａｍａｘａ）に対し、ＮｏｔＩ－ｓｉｔｅ－ｓ／　ＮｏｔＩ－ｓｉｔｅ－ａプライマーセットで、Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＭＡＸ（宝酒造）を用いて変異導入ＰＣＲ反応を行い、ＣＭＶプロモータ直前にＮｏｔＩ部位を導入したｐｍａｘＧＦＰ＋ＮｏｔＩプラスミドを得た。
ＮｏｔＩ－ｓｉｔｅ－ｓプライマー：
5’-ATGCggccgcATGTCAATATTGGCCATT -3’（配列番号４０）
ＮｏｔＩ－ｓｉｔｅ－ａプライマー：
5’-GACATgcggccGCATGGGAGGAGACCGGG -3’（配列番号４１）
　次に、ｐｃＤＮＡ３．１－ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型としてＮｏｔＩ－ｓｐａｃｅｒＡ－ｓ／　ＮｏｔＩ－ｓｐａｃｅｒＡ－ａプライマーセットで０．５ｋｂｐの断片を増幅し、ｐｍａｘＧＦＰ＋ＮｏｔＩのＮｏｒＩ部位に挿入し、ｐｍａｘ
ＧＦＰ＋ｓｐａｃｅｒＡプラスミドを得た。
ＮｏｔＩ－ｓｐａｃｅｒＡ－ｓプライマー：
5’-ttGCGGCCGCgaaaaagcctgaactcaccg -3’（配列番号４２）
ＮｏｔＩ－ｓｐａｃｅｒＡ－ａプライマー：
5’-ttGCGGCCGCgacggtgtcgtccatcacag -3’（配列番号４３）
　次に、ＤＮＡ配列７を鋳型とし、ＫｐｎＩ－ＩＧＨ－ｓ／ＢｇｌＩＩ－ＩＧＨ－ａプライマーセットで重鎖を増幅した。これを、ｐｍａｘＧＦＰ＋ｓｐａｃｅｒＡのＧＦＰと置換し、ｐｍａｘ＋ｓｐａｃｅｒＡ＋ＩｇＨプラスミドを得た。
ＫｐｎＩ－ＩＧＨ－ｓプライマー：
5’-ccttGGTACCGAAGCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCaTGGAGTTTGGACTGAGCTGGG-3’（配列番号４４）
ＢｇｌＩＩ－ＩＧＨ－ａプライマー：
5’-ccttAGATCTtcatttacccggagacaggg-3’（配列番号４５）
　ｐｍａｘ＋ｓｐａｃｅｒＡ＋ＩｇＨ　を鋳型とし、ＭｌｕＩ－ｓｐＡ（ＩｇＨ）－ｓ２／ＭｌｕＩ－ＣＭＶ－ＩｇＨＬ－ＳＶｐＡ－ａプライマーセットでＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした後、制限酵素Ｍｌｕ　Ｉで切断し、ＤＮＡ配列８（重鎖カセット）を得た。
ＭｌｕＩ－ｓｐＡ（ＩｇＨ）－ｓ２プライマー：
5’-ccttACGCGTgacggtgtcgtccatcacag -3’（配列番号４６）
ＭｌｕＩ－ＣＭＶ－ＩｇＨＬ－ＳＶｐＡ－ａプライマー：
5’-cttACGCGTAACGTCTCGCCCTTTGGTCTC -3’（配列番号４７）
抗体軽鎖発現カセットの構築
　同様に、軽鎖可変領域を保持したプラスミドを鋳型とし、可変領域をＩＧＬ－３Ａ２１ｓ１、ＩＧＬ－３Ａ２１ａ１プライマーセットでＰＣＲ増幅し、ＤＮＡ配列９を得た。
ＩＧＬ－３Ａ２１ｓ１プライマー：
5’-CCCAGGTGCCAGATGTGACATCAAGATGAC-3’（配列番号４８）
ＩＧＬ－３Ａ２１ａ１プライマー：
5’-GCCACAGTTCGTTTTATTTCCAACTTTGTC-3’（配列番号４９）
　ＲＰＭＩ８２２６培養細胞からＩＳＯＧＥＮで抽出したＲＮＡを鋳型とし、Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｋｉｔを用いてＲＴ－ＰＣＲを行い、得られたｍＲＮＡを鋳型として定常領域をＩＧＬ－Ｃｓ、ＩＧＬ－ＣａプライマーセットでＰＣＲ増幅し、ＤＮＡ配列１０を得た。
ＩＧＬ－Ｃｓプライマー：
5’-TGGAAATAAAACGAACTGTGGCTGCACCAT-3’（配列番号５０）
ＩＧＬ－Ｃａプライマー：
5’-TTAAGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGT-3’（配列番号５１）
ＩＧＬ－ＬＳ、ＩＧＬ－３Ａ２１ａプライマーセットで、ＤＮＡ配列９を鋳型としてＰＣＲ増幅を行い、分泌シグナルを付加したＤＮＡ配列１１を得た。
ＩＧＬ－ＬＳプライマー：
5’-GGTCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGACA -3’（配列番号５２）
ＩＧＬ－３Ａ２１ａプライマー：
5’-GCCACAGTTCGTTTTATTTCCAACTTTGTC-3’（配列番号５３）
　ＤＮＡ配列１０およびＤＮＡ配列１１を鋳型とし、ＩＧＬ－Ｖｓ、ＩＧＬ－ＣａプライマーセットでアセンブルＰＣＲを行って両産物を連結させたＤＮＡ配列１２を得た。
ＩＧＬ－Ｖｓプライマー：
5’-CCTTGGTACCGGTCGCCACCATGGACATGA -3’（配列番号５４）
　次に、ｐｃＤＮＡ３．１－ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型としてＮｏｔＩ－ｓｐａｃｅｒＢ－ｓ／　ＮｏｔＩ－ｓｐａｃｅｒＢ－ａプライマーセットで０．５ｋｂｐの断片を増幅し、ｐｍａｘＧＦＰ＋ＮｏｔＩのＮｏｒＩ部位に挿入し、ｐｍａｘＧＦＰ＋ｓｐａｃｅｒＢプラスミドを得た。
ＮｏｔＩ－ｓｐａｃｅｒＢ－ｓプライマー：
5’-ttGCGGCCGCctgtgatggacgacaccgtc-3’（配列番号５５）
ＮｏｔＩ－ｓｐａｃｅｒＢ－ａプライマー：
5’-ttGCGGCCGCctattcctttgccctcggac-3’（配列番号５６）
　次に、ＤＮＡ配列１２を鋳型とし、ＫｐｎＩ－ＩＧＨ－ｓ／ＢｇｌＩＩ－ＩＧＨ－ａプライマーセットで軽鎖を増幅した。これを、ｐｍａｘＧＦＰ＋ｓｐａｃｅｒＢのＧＦＰと置換し、ｐｍａｘ＋ｓｐａｃｅｒＢ＋ＩｇＬプラスミドを得た。
ＫｐｎＩ－ＩＧＬ－ｓプライマー：
5’-ccttGGTACCGAAGCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCatggacatgagggtccccgc-3’（配列番号５７）
ＢｇｌＩＩ－ＩＧＬ－ａプライマー：
5’-ccttAGATCTctaacactctcccctgttga -3’（配列番号５８）
　ｐｍａｘ＋ｓｐａｃｅｒＢ＋ＩｇＬ　を鋳型とし、ＨｉｎｄＩＩＩ－ｓｐＢ（ＩｇＬ）－ｓ２／　Ｈｉｎ３－ＣＭＶ－ＩｇＨＬ－ＳＶｐＡ－ａプライマーセットでＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯベクターにクローニングした後、制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで切断し、ＤＮＡ配列１３（軽鎖カセット）を得た。
ＨｉｎｄＩＩＩ－ｓｐＢ（ＩｇＬ）－ｓ２プライマー：
5’-ccttAAGCTTctattcctttgccctcggac-3’（配列番号５９）
Ｈｉｎ３－ＣＭＶ－ＩｇＨＬ－ＳＶｐＡ－ａプライマー：
5’-cttAAGCTTAACGTCTCGCCCTTTGGTCTC-3’（配列番号６０）
　基礎ベクター＋ｎｅｏＲプラスミドを制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで切断し、ＤＮＡ配列１３（軽鎖カセット）を挿入し、基礎ベクター＋ｎｅｏＲ＋ＩｇＬプラスミドを得た。
ＣＨＯ細胞hprt遺伝子相同ＤＮＡ断片の取得
　ＣＨＯ－Ｋ１細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ反応（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｖｅｒ２、ＴＯＹＯＢＯ）によって、標的となるhprt遺伝子の相同ＤＮＡ断片（ＣＨＡ１およびＣＨＡ２）をクローニングした。ＣＨＡ１およびＣＨＡ２は、後述する図３でも示される通り、hprt遺伝子のエクソン３を含む領域と相同な配列に設定した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下に示す通りである。
ＳｓｅＮｒｕ－ＣＨＡ１－１ｋ－ｓプライマー：
5’-ttCCTGCAGGTCGCGAaggagtttattagaggaaatat-3’（配列番号６１）
ＭｌｕＩ－ＣＨＡ１－ｒプライマー：
5’-ttACGCGTtgataaaatctacagtcatggg-3’（配列番号６２）
Ｂａｍ－ＣＨＡ２－ｓプライマー：
5’-ttGGATCCgactgaagagctactgtgta-3’（配列番号６３）
ＰｃｉＮｒｕ－ＣＨＡ２－１ｋ－ｒプライマー：
5’- ttACATGTTCGCGAatcagatccctgggactgga-3’（配列番号６４）
ＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクターの取得
　Ｂａｍ－ＣＨＡ２－ｓ／　ＰｃｉＮｒｕ－ＣＨＡ２－１ｋ－ｒプライマーセットで増幅したＣＨＡ２配列を、制限酵素Ｂａｍ　ＨＩおよびＰｃｉ　Ｉで切断し、基礎ベクター＋ｎｅｏＲ＋ＩｇＬプラスミドのＨＡ２配列と置換した。さらに、ＳｓｅＮｒｕ－ＣＨＡ１－１ｋ－ｓ／　ＭｌｕＩ－ＣＨＡ１－ｒプライマーセットで増幅したＣＨＡ１配列を、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＭｌｕ　Ｉで切断し、ＨＡ１配列と置換した。次いで、制限酵素Ｍｌｕ　Ｉ部位に、ＤＮＡ配列８（重鎖カセット）を挿入し、図２（Ａ）で示されるＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクターを得た。
ＨＴ１０８０ホモロジーアームベクターの取得
　基礎ベクター＋ｎｅｏＲ＋ＩｇＬプラスミドの制限酵素Ｍｌｕ　Ｉ部位に、ＤＮＡ配列８（重鎖カセット）を挿入し、図２（Ｂ）に示されるＨＴ１０８０ホモロジーアームベクターを得た。
実施例３：細胞へのベクターの導入
ベクター線状化
　ＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクター、ＨＴ１０８０ホモロジーアームベクターは、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、Ｎｒｕ　Ｉにて切断した。２ｇ／Ｌの濃度になるように滅菌水に溶解し、以下のトランスフェクション実験に用いた。
トランスフェクションおよびスクリーニング
　ＣＨＯ－Ｋ１細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ　Ｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ａｍａｘａ）で１×１０６細胞に調製し、線状化したプラスミドベクター２μｇと混合した。次に、得られた混合液を用いて、ＮｕｃｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩ（ａｍａｘａ）を用い、プログラムＵ－０２３で電圧印加した。トランスフェクションは各ベクターにつき、３回施行した。トランスフェクトした細胞は、３５０細胞／ウェルにて９６ウェルプレートに播種し、インキュベーター中３７℃、５％ＣＯ２にて培養し（培地：Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）に５％ＦＢＳ、１ｘ　Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ社）を添加したもの）、トランスフェクションから２日後にＧ４１８（インビトロジェン社）を加えた（最終濃度；５００μｇ／ｍＬ）。
　トランスフェクションから４日後にＧ４１８（最終濃度；５００μｇ／ｍＬ）および６－ＴＧ（最終濃度；５０μＭ）（和光純薬工業）を加え、さらに６日間培養した。培養後、全ウェルを確認し、Ｇ４１８／６ＴＧ耐性コロニーを単離した。結果は、表１に示される通りであった。
　結果は、表１に示される通りであった。ＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクターによって得られたＧ４１８／６ＴＧ耐性クローンは、３×１０６細胞あたり６クローンであった。一方、ＨＴ１０８０ホモロジーアームベクターにおいては、Ｇ４１８／６ＴＧ耐性クローンは得られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例４：ゲノムＰＣＲによる解析
　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ロシュ）を用い、ＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクターのトランスフェクションにより得たＧ４１８および６ＴＧに耐性のクローンからゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型とした以下に示すＰＣＲ反応により、標的hprt遺伝子座への位置特異的な組み換えの確認を行った。
　図３（Ａ）は、ゲノムＰＣＲによる相同組み換え反応の解析の詳細を説明する模式図である。
　hprt遺伝子（１）の相同組換えの標的領域（２）は、エクソン３（３）を含んで設定されており、この領域にベクターＤＮＡ（６）中のＣＨＡ１（４）、ＣＨＡ２（５）およびこれに挟まれた抗体重鎖配列（７）、ネオマイシン耐性遺伝子（８）および抗体軽鎖配列（９）は相同組み換えにより組込まれる。
　ＣＨＡ１（４）と、抗体重鎖配列（７）の一部とを含むＤＮＡ（１６８８ｂｐのＤＮＡ）および、ＣＨＡ２（５）と、抗体軽鎖配列（９）の一部とを含むＤＮＡ（１７５２ｂｐのＤＮＡ）は、相同組み換えによってのみゲノムから取得することができ、相同組み換えの指標となる。
　よって、ＣＨＡ１と標的領域との相同組換えの指標として、図３（Ａ）に示す１６８８ｂｐのＤＮＡを設定し、このＤＮＡは、以下に示すプライマーＣＨＰＲＴｓ／ＮｏｔＩ－ｓｐａｃｅｒＡ－ｓによるＰＣＲ反応により検出した。一方、ＣＨＡ２と標的hprt遺伝子座との相同組換えの指標として、図３（Ａ）に示す１７５２ｂｐのＤＮＡを設定し、このＤＮＡは、以下に示すプライマーＩＧＬ－Ｃｓ／　ＣＨＡ２－ｓｅｑ－ａ１によるＰＣＲ反応により検出した。
　ＣＨＰＲＴｓプライマー：
　5’-TGTTCCTGTGCATACTAGGC-3’ （配列番号６５）
　ＣＨＡ２－ｓｅｑ－ａ１プライマー：
　5’-CCAGAGAAATTATTTGCCACCAGC-3’ （配列番号６６）
　次に、得られたＰＣＲ増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動により解析した。結果は、図３（Ｂ）および（Ｃ）に示される通りであった。
　図３（Ｂ）および（Ｃ）において、１から６はＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクターにより得られたクローンを示す。取得した６クローンのうち、５クローンにおいて１６８８ｂｐおよび１７５２ｂｐの両方のＰＣＲ増幅産物が確認され、相同組換え反応が確認された。
実施例５：サザンハイブリダイゼーションによる解析
　実施例４で取得された５クローンにおいて、ＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクターが標的hprt遺伝子座へ位置特異的な組み換えで組み込まれたことを、以下のサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
　図４（Ａ）は、実施例５のサザンハイブリダイゼーションの詳細を説明する模式図である。
　図４（Ａ）で示される通り、hprt遺伝子（１）の相同組み換えの標的領域（２）は、エクソン３（３）を含む領域に設定され、ホモロジーアーム１（ＣＨＡ１）（４）およびホモロジーアーム２（ＣＨＡ２）（５）は、標的領域における二つの隣接した領域に相同であるように設定されている。そして、Ｐｃｉ　Ｉ制限酵素サイトは、標的領域（２）を挟むように位置し、その内側には存在しない。一方、ＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクターにはＰｃｉ　Ｉ制限酵素サイトは存在しない。そして、ＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクターのネオマイシン耐性遺伝子配列（６）には、ＮＲプローブがハイブリダイズしうるように設計されている。
　図４（Ａ）に示される通り、Ｐｃｉ　Ｉ制限酵素サイトの位置、およびＤＮＡ配列の鎖長を勘案すると、１０４８８　ｂｐのＤＮＡが検出される場合、ＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクターがクローンのhprt遺伝子座に組み込まれているものと判定できる。
ＮＲプローブの調製
　ＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクター中のネオマイシン耐性遺伝子に相補的な配列を有するＮＲプローブを、以下の手順で合成した。まず、ＣＨＯ　１ｋｘ２　抗体ベクター中のネオマイシン耐性遺伝子コード配列の全長をＰＣＲにより増幅し、ｐＧＥＭ　Ｔ　プラスミドベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にＴＡクローニングした。次に、ＰＣＲ　ＤＩＧプローブ合成キット（ロシュ社、プライマー：Ｍ１３　Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー）を用いて、ＤＩＧ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｉｎ）標識されたプローブを作製した。
メンブレンの調製
　６ＴＧ耐性コロニーから各細胞クローンのゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｃｉ　Ｉ制限酵素により切断した。切断したゲノムＤＮＡ５μｇを、０．６％アガロースゲルを用いて電気泳動し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｎ＋　ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＡｍａｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）へ転写した。得られたメンブレンは８０℃で２時間インキュベートし、ＤＮＡをメンブレン上に固定した。
ハイブリダイゼーション
　上記メンブレンに対し、上記ＮＲプローブをハイブリダイズさせた。この際、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよびプローブの検出は、ＤＩＧアプリケーション　マニュアル（ロシュ社）に従って行った。
　図４（Ｂ）に示される通り、解析した５クローン全てにおいて、ＮＲプローブにより１０４８８ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。
実施例６：組み換え細胞によるタンパク質の生産
組み換えクローンの培養および培地のサンプリング
　まず、組み換えクローンを１シャーレあたり２　Ｘ　１０５ 細胞播種し、Ｇ４１８（最終濃度； ５００ μｇ／ｍＬ）および６－ＴＧ（最終濃度； ５０ μM）、およびFBS（Japan Bio Serum社製）を５％含んだAdvanced MEM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０ｍＬ中、５ % CO２存在下３７℃で培養した。培養を開始してから５日目に、培地を回収した。回収した培地は、以下のＥＬＩＳＡ解析に用いた。
ＥＬＩＳＡによる定量
　回収した培地中のＩｇＧ量は、Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ＥＩＡ　Ｋｉｔ　（ｐｒｅｃｏａｔｅｄ）（宝酒造製）により、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより解析した。
　結果は、図５に示される通りであった。測定した３クローンにおいて、シャーレ１枚あたりのＩｇＧ量の平均値は１．２９±０．１８μｇ／ｄｉｓｈであり、ＣＶ値は１４．２％であった。
実施例７：鎖長２．５ｋｂｐの相同ＤＮＡ断片を有するベクターによる相同組み換え
２．５ｋｂｐのＣＨＯ細胞hprt遺伝子相同ＤＮＡ断片の取得
　鎖長２．５ｋｂｐの相同ＤＮＡ断片を有する、図６に示すＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターベクターを製造するため、ＣＨＯ－Ｋ１細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ反応（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｖｅｒ２、ＴＯＹＯＢＯ）によって、標的となるhprt遺伝子の相同ＤＮＡ断片（ＣＨＡ１－２．５およびＣＨＡ２－２．５）をクローニングした。ＣＨＡ１－２．５およびＣＨＡ２－２．５は、後述する図７（Ａ）でも示される通り、hprt遺伝子のエクソン３を含む領域と相同な配列に設定した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は実施例２に記載したＭｌｕＩ－ＣＨＡ１－ｒプライマーおよびＢａｍ－ＣＨＡ２－ｓプライマーと、以下に示すものを用いた。
ＳｓｅＮｒｕ－ＣＨＡ１－２．５ｋ－ｓプライマー：
5’-ttCCTGCAGGTCGCGAgtctgtgtgtatgtttgtgataggc-3’（配列番号６７）
ＮｃｏＮｒｕ－ＣＨＡ２－２．５ｋ－ｒプライマー：
5’-ttCCATGGTCGCGAtgaaggttatagagcataggggacc-3’（配列番号６８）
ＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターの取得
　Ｂａｍ－ＣＨＡ２－ｓ／　ＮｃｏＮｒｕ－ＣＨＡ２－２．５ｋ－ｒプライマーセットで増幅したＣＨＡ２－２．５配列を、制限酵素Ｂａｍ　ＨＩおよびＮｃｏ　Ｉで切断し、基礎ベクター＋ｎｅｏＲ＋ＩｇＬプラスミドのＨＡ２配列と置換した。さらに、ＳｓｅＮｒｕ－ＣＨＡ１－２．５ｋ－ｓ／　ＭｌｕＩ－ＣＨＡ１－ｒプライマーセットで増幅したＣＨＡ１－２．５配列を、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＭｌｕ　Ｉで切断し、ＨＡ１配列と置換した。次いで、制限酵素Ｍｌｕ　Ｉ部位に、ＤＮＡ配列８（重鎖カセット）を挿入し、図６で示されるＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターを得た。
ＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクター組込みクローンの取得
　ＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターは、実施例３と同様、精製および線状化を行い、２ｇ／Ｌの濃度になるように滅菌水に溶解し、１×１０６細胞に対しして導入した。
　次に、実施例３と同様に選択薬剤によるスクリーニングを行った結果、５クローンのＧ４１８／６ＴＧ耐性コロニーを単離した。
ゲノムＰＣＲによる解析
　ＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターのトランスフェクションにより得たＧ４１８および６ＴＧに耐性のクローンからゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型とした以下に示すＰＣＲ反応により、標的hprt遺伝子座への位置特異的な組み換えの確認を行った。
　図７（Ａ）は、ゲノムＰＣＲによる相同組み換え反応の解析の詳細を説明する模式図である。
　hprt遺伝子（１）の相同組換えの標的領域（２）は、エクソン３（３）を含んで設定されており、この領域にベクターＤＮＡ（６）中のＣＨＡ１－２．５（４）、ＣＨＡ２－２．５（５）およびこれに挟まれた抗体重鎖配列（７）、ネオマイシン耐性遺伝子（８）および抗体軽鎖配列（９）は相同組み換えにより組込まれる。
　ＣＨＡ１－２．５（４）と、抗体重鎖配列（７）の一部とを含むＤＮＡ（３０７５　ｂｐのＤＮＡ）、および、ＣＨＡ２－２．５（５）と、抗体軽鎖配列（９）の一部とを含むＤＮＡ（３２２８　ｂｐのＤＮＡ）は、相同組み換えによってのみゲノムから取得することができ、相同組み換えの指標となる。
　よって、ＣＨＡ１－２．５と標的領域との相同組換えの指標として、図７（Ａ）に示す３０７５　ｂｐのＤＮＡを設定し、このＤＮＡは、以下に示すプライマーＣＨＡ１－ｓeｑ－ｓ１１／ＮｏｔＩ－ｓｐａｃｅｒＡ－ｓによるＰＣＲ反応により検出した。一方、ＣＨＡ２－２．５と標的hprt遺伝子座との相同組換えの指標として、図７（Ａ）に示す３２２８　ｂｐのＤＮＡを設定し、このＤＮＡは、以下に示すプライマーＩＧＬ－Ｃｓ／　ＣＨＡ２－ｓｅｑ－ａ４によるＰＣＲ反応により検出した。
　ＣＨＡ１－ｓeｑ－ｓ１１プライマー：
　5’-GACACATGCAGACAGAACAG-3’（配列番号６９）
　ＣＨＡ２－ｓｅｑ－ａ４プライマー：
　5’-GTTTGCTAACACCCCTTCTC-3’（配列番号７０）
　次に、得られたＰＣＲ増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動により解析した。結果は、図７（Ｂ）および（Ｃ）に示される通りであった。
　図７（Ｂ）および（Ｃ）において、１から５はＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターにより得られたクローンを示す。取得した５クローンのうち、４クローンにおいて３０７５　ｂｐおよび３２２８　ｂｐの両方のＰＣＲ増幅産物が確認され、相同組み換え反応が確認された。
サザンハイブリダイゼーションによる解析
　実施例７で取得された４クローンにおいて、ＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターが標的hprt遺伝子座へ位置特異的に組み込まれたことを、以下のサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
　図８（Ａ）は、実施例７のサザンハイブリダイゼーションの詳細を説明する模式図である。
　図８（Ａ）で示される通り、hprt遺伝子（１）の相同組み換えの標的領域（２）は、エクソン３（３）を含む領域に設定され、ホモロジーアーム１（ＣＨＡ１－２．５）（４）およびホモロジーアーム２（ＣＨＡ２－２．５）（５）は、標的領域における二つの隣接した領域に相同であるように設定されている。そして、Ｅｃｏ　ＲＶ制限酵素サイトは、標的領域（２）近傍には一か所のみ存在し、標的領域内には一か所しか存在しない。一方、ＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターには、Ｅｃｏ　ＲＶ制限酵素サイトはＣＨＡ２－２．５に一か所しか存在しない。そして、ＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターのネオマイシン耐性遺伝子配列（６）には、ＮＲプローブがハイブリダイズしうるように設計されている。
　図８（Ａ）に示される通り、Ｅｃｏ　ＲＶ制限酵素サイトの位置、およびＤＮＡ配列の鎖長を勘案すると、１２３０２　ｂｐのＤＮＡが検出される場合、クローンのhprt遺伝子座にＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターが組み込まれているものと判定できる。
プローブの調製
ＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクター中のネオマイシン耐性遺伝子に相補的な配列を有するＮＲプローブは、実施例５と同様にして準備した。
メンブレンの調製
　６ＴＧ耐性コロニーから各細胞クローンのゲノムＤＮＡを抽出し、Ｅｃｏ　ＲＶ制限酵素により切断した。切断したゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を、実施例５と同様に行った。
　図８（Ｂ）に示される通り、解析した４クローン全てにおいて、ＮＲプローブにより１２３０２　ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。
実施例８：ＣＨＯ細胞の２本の染色体における相同組み換えの確認
ゲノムＰＣＲによる野生型hprt遺伝子残存の確認
　ＣＨＯ　１ｋｘ２抗体ベクターおよびＣＨＯ　２．５ｋｘ２抗体ベクターの相同組換えクローンから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用いた、以下に示すＰＣＲ反応により、野生型hprt遺伝子が残存しているのかを確認した。
　図９（Ａ）は、野生型hprt遺伝子の残存を確認するためのゲノムＰＣＲの詳細を説明する模式である。
　　まず、図９（Ａ）左図は２本のＸ染色体を有する野生型ＣＨＯ細胞におけるＰＣＲを示す。hprt遺伝子（１）の相同組換えの標的領域（２）は、エクソン３（３）を含んで設定されている。ベクター非導入の野生型細胞の場合、標的領域のＤＮＡ（２３２２ｂｐ）は、ＰＣＲ反応によって増幅することができ、これを指標として野生型hprt遺伝子が残存していることを確認することができる。
　図９（Ａ）の中央図は、１本のＸ染色体のhprt遺伝子座にベクターが組込まれたヘテロ接合型の相同組換え細胞におけるＰＣＲを示す。一方の染色体では、標的領域（２）中にベクターのＤＮＡ（７）（ＣＨＡ１（４）、ＣＨＡ２（５）およびこれに挟まれた抗体重鎖、ネオマイシン耐性遺伝子および抗体軽鎖配列を含む）は相同組み換えによりに組込まれている。一方、もう１本の染色体は、標的領域を保持しており、標的領域のＤＮＡ（２３２２ｂｐ）は、ＰＣＲ反応によって増幅することができ、野生型hprt遺伝子が残存していることを確認できる。
　一方、図９（Ａ）の右図に示されるとおり、両方のＸ染色体にベクターが組込まれたホモ接合型の相同組換え細胞においては、組み換えＤＮＡのみが発現し、ＰＣＲ反応によって標的領域のＤＮＡ（２３２２ｂｐ）の増幅は生じない。
　以上の理解から、図９（Ａ）に示す２３２２ｂｐのＤＮＡを上記指標として設定し、このＤＮＡを検出するため、プライマーＣＨＰＲＴｓ／ＣＨＡ２－ｓｅｑ－ａ１を用いてＰＣＲ反応を行った。
　次に、得られたＰＣＲ増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動により解析した。結果は、図９（Ｂ）に示される通りであった。
　図９（Ｂ）において、ＷＴは野生型細胞を示し、１ｋｘ２ベクター組込みクローン（１、２、３、５および６）は、実施例４で取得されたＣＨＯ　１ｋｘ２抗体ベクターの組込みクローンを示し、２．５ｋｘ２ベクター組込みクローン（１～４）は、実施例７で取得されたＣＨＯ　２．５ｋｘ２抗体ベクターの組込みクローンを示す。野生型細胞からは２３２２ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認され、野生型hprt遺伝子の存在が確認された。一方、解析した全ての組み換えクローンにおいては２３２２ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認されなかったことから、組み換え細胞は両方のＸ染色体にベクターが組込まれたホモ接合型であった。
　この結果から、本発明によるベクターを用いると、２本のＸ染色体の両hprt遺伝子座に目的タンパク質遺伝子が組込まれた組換え細胞クローンが高頻度で取得されていることが確認された。
実施例９：ＣＨＯ内在性プロモーターを使用した組み換えベクタークローンによる、抗体の長期安定発現
ＣＨＯ　ＣＨＥＦ１Ｐベクターの作製
　ＣＨＯ－Ｋ１ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＥＦ１ａＰ－ＭｌｕＩ－Ｆ／ＥＦ１ａＰ－ＸｂａＩ－ＲプライマーセットでＣＨＥＦ１αプロモーターを増幅した。
ＥＦ１ａＰ－ＭｌｕＩ－Ｆプライマー：
5’-AGAACGCGTCCACACAATCAGAACCACA-3’（配列番号７１）
ＥＦ１ａＰ－ＸｂａＩ－Ｒプライマー：
5’-GACGATCTAGAGGTGGTTTTCACAACA-3’（配列番号７２）
　また、ＣＨＯ　２．５ｋ×２＿Ｈ－ｎｅｏ－Ｌプラスミドを鋳型とし、ＣＭＶ－ｓｅｑ－ｓ／ＭｌｕＩ－ＣＭＶ－ＩｇＨＬ－ＳＶｐＡ－ａプライマーセットでＩｇＨ遺伝子を増幅した。
ＣＭＶ－ｓｅｑ－ｓプライマー：
5’-AGGGACTTTCCATTGACGTC-3’（配列番号７３）
ＭｌｕＩ－ＣＭＶ－ＩｇＨＬ－ＳＶｐＡ－ａプライマー：
5’-cttACGCGTAACGTCTCGCCCTTTGGTCTC-3’（配列番号７４）
　次に、得られたＣＨＥＦ１αＰとＩｇＨ遺伝子をＸｂａＩ、ＮｈｅＩでそれぞれ切断し、ライゲーション反応を行った。その後、ＣＨＥＦ１αＰ＋ＩｇＨ遺伝子のバンドをゲル抽出し、ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社）へクローニング後、ＭｌｕＩ切断により、ＣＨＥＦ１αＰ＋ＩｇＨ遺伝子カセットを得た。
　一方、ＣＨＯ－Ｋ１ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＥＦ１ａＰ－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｆ／ＥＦ１ａＰ－ＨｉｎｄＩＩＩ－ＲプライマーセットでＣＨＥＦ１αプロモーターを増幅した。
ＥＦ１ａＰ－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｆプライマー：
5’-AGAAAGCTTCCACACAATCAGAACCACA-3’（配列番号７５）
ＥＦ１ａＰ－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｒプライマー：
5’-GACGAATTCGCGGTGGTTTTCACAACA-3’（配列番号７６）
　また、ＣＨＯ　２．５ｋ×２＿Ｈ－ｎｅｏ－Ｌプラスミドを鋳型とし、ＩｇＬｓｅｒ－ＥｃｏＲＩ－Ｆ／ＩｇＬｓｅｒ－ＨｉｎｄＩＩＩ－ＲプライマーセットでＩｇＬ遺伝子を増幅した。
ＩｇＬｓｅｒ－ＥｃｏＲＩ－Ｆプライマー：
5’-TATGAATTCGTCGCCACCATGGACAT-3’（配列番号７７）
ＩｇＬｓｅｒ－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｒプライマー：
5’-TGTAAGCTTTACCACATTTGTAGAGGTTTT-3’（配列番号７８）
　次に、得られたＣＨＥＦ１αＰとＩｇＬ遺伝子をＥｃｏＲＩで切断し、ライゲーション反応を行った。その後、ＣＨＥＦ１αＰ＋ＩｇＬ遺伝子のバンドをゲル抽出し、ＴＯＰＯベクターへクローニングして、ＨｉｎｄＩＩＩ切断により、ＣＨＥＦ１αＰ＋ＩｇＬ遺伝子カセットを得た。
　ＣＨＯ　２．５ｋ×２＿Ｈ－ｎｅｏベクターをＨｉｎｄＩＩＩ切断および脱リン酸処理後、ＣＨＥＦ１αＰ＋ＩｇＬ遺伝子カセットを挿入してＨ－ｎｅｏ－ＥＦ１Ｌベクターを得た。次に、ＭｌｕＩ切断および脱リン酸処理後、ＣＨＥＦ１αＰ＋ＩｇＨ遺伝子カセットを挿入し、図１０で示されるＣＨＯ　ＣＨＥＦ１Ｐベクターを得た。
ＣＨＯ　ＣＨＥＦ１Ｐベクター組み換えＣＨＯ細胞の取得
　構築したＣＨＯ　ＣＨＥＦ１Ｐベクターの線状化、ＣＨＯ細胞への導入およびスクリーニングを実施例３と同様に実施し、ＣＨＯ　ＣＨＥＦ１Ｐベクター組換えＣＨＯ細胞を取得した。
ＣＨＯ　ＣＨＥＦ１Ｐベクタークローンの抗体生産における長期安定性の確認
　取得したＣＨＯ　ＣＨＥＦ１Ｐベクター組換えＣＨＯ細胞を、７℃、５％ＣＯ２にて継代維持し（選択薬剤非添加培地：　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）に５％　ＦＢＳ、１ｘＧｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ社）を添加したもの）、適時抗体生産量の測定に供した。
　継代維持中の細胞を剥離し、２×１０６ｃｅｌｌｓで１００ｍｍディッシュに播き込み、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養後、細胞を剥離して３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、１．５ｍｌずつ１２ウェルプレートに播き込んで培養した。２４時間後、培地を完全除去し、新しい培地を１．５ｍｌ分注し、２４時間培養後、培地を全量回収し、ＥＬＩＳＡアッセイによってＩｇＧ量を測定した。また、ウェル底面に付着した細胞を剥離し、細胞数を計測した。
　結果は図１１に示される通りであった。ｈｐｒｔ遺伝子座にＣＨＯ　ＣＨＥＦ１Ｐベクターを組込んだＣＨＯ細胞の抗体生産性は、選択薬剤非添加で１６週間の継代培養を経ても一定に保たれ、生産性低下は認められなかった。
実施例１０：鎖長２．５ｋｂｐの相同ＤＮＡ断片を有し、抗体重鎖を発現するベクターによる相同組み換え体の取得
抗体重鎖発現組み換えベクターの作製
　実施例７で作製したＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターを制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで切断し、自己閉環化させ、図１３で示されるＣＨＯ　２．５ｋｂｘ２　重鎖ベクターを作製した。
　ＣＨＯ　２．５ｋｂｘ２　重鎖ベクター組換えＣＨＯ細胞の取得
　構築したＣＨＯ　２．５ｋｂｘ２　重鎖ベクターの線状化、ＣＨＯ細胞への導入およびスクリーニングを実施例３と同様に実施し、ＣＨＯ　２．５ｋｂｘ２　重鎖ベクター組換えＣＨＯ細胞を取得した。その結果、１０７細胞あたり１３０個の組換えＣＨＯ細胞が取得された。
実施例１１：ヒトｈｐｒｔ遺伝子座イントロン由来ＭＡＲを有し、抗体重鎖を発現するベクターによる安定発現ＣＨＯ細胞の取得
ＭＡＲ非転写ベクターの作製
　実施例２で準備したヒト由来細胞株ＨＴ１０８０細胞株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＸｂａＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ｓ／ＸｂａＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ａプライマーセットでヒトｈｐｒｔ遺伝子イントロンのＭＡＲ（ｈｐｒｔＭＡＲ１）を増幅した。
ＸｂａＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ｓプライマー：
5’-ttTCTAGAtagttatgagcccatgtccc-3’（配列番号７９）
ＸｂａＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ａプライマー：
5’-ttTCTAGAcggtgaaatcctgtctctac-3’（配列番号８０）
　実施例７で作製したＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターを制限酵素ＸｂａＩで切断し、ｈｐｒｔＭＡＲ１を挿入し、図１３（Ａ）で示されるＭＡＲ非転写ベクターを得た。
ＭＡＲ転写ベクターの作製
　ヒト由来細胞株ＨＴ１０８０細胞株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＡｓｃＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ｓ／ＭｌｕＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ａプライマーセットでヒトｈｐｒｔ遺伝子イントロンのＭＡＲ（ｈｐｒｔＭＡＲ２）を増幅した。
ＡｓｃＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ｓプライマー：
5’-ttGGCGCGCCtagttatgagcccatgtccc-3’（配列番号８１）
ＭｌｕＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ａプライマー：
5’-ttACGCGTcggtgaaatcctgtctctac-3’（配列番号８２）
　実施例７で作製したＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターを制限酵素ＭｌｕＩで切断し、ｈｐｒｔＭＡＲ２を挿入した。次に、制限酵素ＭｌｕＩで切断し、実施例２の抗体重鎖発現カセットを挿入し、図１３（Ｂ）で示されるＭＡＲ転写ベクターを得た。
ＭＡＲ　ＣＭＶ転写ベクターの作製
　ヒト由来細胞株ＨＴ１０８０細胞株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＢｇｌＩＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ｓ／ＢｇｌＩＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ａプライマーセットでヒトｈｐｒｔ遺伝子イントロンのＭＡＲ（ｈｐｒｔＭＡＲ３）を増幅した。
ＢｇｌＩＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ｓプライマー：
5’-ttAGATCTtagttatgagcccatgtccc-3’（配列番号８３）
ＢｇｌＩＩ－ｈｐｒｔＭＡＲ－ａプライマー：
5’-ttAGATCTcggtgaaatcctgtctctac-3’（配列番号８４）
　実施例２で作製したｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯ＋抗体重鎖発現カセットを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、ｈｐｒｔＭＡＲ３を挿入した後、制限酵素ＭｌｕＩで切り出し、抗体重鎖＋ＭＡＲ発現カセットを得た。
　次に、実施例２で作製したｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯ＋抗体軽鎖発現カセットを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、ｈｐｒｔＭＡＲ３を挿入した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、抗体軽鎖＋ＭＡＲ発現カセットを得た。
　実施例７で作製したＣＨＯ　２．５ｋｘ２　抗体ベクターを制限酵素ＭｌｕＩで切断し、抗体重鎖＋ＭＡＲ発現カセットを挿入した。次に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、抗体軽鎖＋ＭＡＲ発現カセットを挿入し、図１３（Ｃ）で示されるＭＡＲ　ＣＭＶ転写ベクターを得た。
ＭＡＲベクター組み換えＣＨＯ細胞の取得
　構築したＭＡＲ非転写ベクター、ＭＡＲ転写ベクターおよびＭＡＲ　ＣＭＶ転写ベクターの線状化、ＣＨＯ細胞への導入およびスクリーニングを実施例３と同様に実施し、組換えＣＨＯ細胞を取得した。
ヒトｈｐｒｔ遺伝子座イントロン由来ＭＡＲを有し、抗体重鎖を発現するベクタークローンの抗体生産における安定性の確認
　図１３（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示されるＭＡＲベクターによって取得した組換えＣＨＯクローンの抗体生産性解析を、実施例９と同様に実施した。
　その結果は図１４に示されるとおりであった。この結果が示すように、抗体生産性が維持されたものは、ベクター組込み部位のｈｐｒｔ遺伝子の転写によってのみ、ヒトｈｐｒｔのＭＡＲが転写されるベクターを組込んだクローンだけであった。ヒトｈｐｒｔＭＡＲが転写されない構造のベクター、およびＣＭＶプロモーターで目的タンパク質遺伝子とＭＡＲが同時に転写される構造のベクターで取得したクローンでは、７日間の培養中に抗体生産性が低下していた。
実施例１２：鎖長２００ｂ、５００ｂの相同ＤＮＡ断片を有し、抗体重鎖を発現するベクターによる相同組み換え体の取得
ＣＨＯ　２００ｂ×２ベクター、ＣＨＯ　５００ｂ×２ベクター作製
　ＣＨＯ－Ｋ１細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＳｓｅＮｒｕ－ＣＨＡ１－２００－ｓ／ＭｌｕＩ－ＣＨＡ１－ｒプライマーセット、Ｂａｍ－ＣＨＡ２－ｓ／ＰｃｉＮｒｕ－ＣＨＡ２－２００－ｒプライマーセットによるＰＣＲ反応によって、標的となるｈｐｒｔ遺伝子の相同ＤＮＡ断片（ＣＨＡ１－２００およびＣＨＡ２－２００）をそれぞれクローニングした。ＣＨＡ１－２００およびＣＨＡ２－２００はｈｐｒｔ遺伝子のエクソン３を含む領域と相同な配列に設定した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下に示す通りである。
ＳｓｅＮｒｕ－ＣＨＡ１－２００－ｓプライマー：
5’-ttCCTGCAGGTCGCGAtggaatcttctattcctgattt-3’（配列番号８５）
ＰｃｉＮｒｕ－ＣＨＡ２－２００－ｒプライマー：
5’-ttACATGTTCGCGAtcagcactcaggagtcagag-3’（配列番号８６）
　次に、実施例２の基礎ベクター＋ｎｅｏＲ＋ＩｇＬプラスミドを制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ、Ｐｃｉ　Ｉで切断し、ＣＨＡ２－２００断片と置換した。次に、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ、Ｍｌｕ　Ｉで切断し、ＣＨＡ１－２００断片と置換した。最後に、制限酵素Ｍｌｕ　Ｉ部位にＤＮＡ配列８（重鎖カセット）を挿入し、図１５（Ａ）で示すホモロジーアーム長２００ｂのＣＨＯ　２００ｂ×２ベクターを得た。
　一方、ＳｓｅＮｒｕ－ＣＨＡ１－５００－ｓ／ＭｌｕＩ－ＣＨＡ１－ｒプライマーセット、Ｂａｍ－ＣＨＡ２－ｓ／ＰｃｉＮｒｕ－ＣＨＡ２－５００－ｒプライマーセットによるＰＣＲ反応によって、標的となるｈｐｒｔ遺伝子の相同ＤＮＡ断片（ＣＨＡ１－５００およびＣＨＡ２－５００）をそれぞれクローニングした。
ＳｓｅＮｒｕ－ＣＨＡ１－５００－ｓプライマー：
5’-ttCCTGCAGGTCGCGAgatgcctagcatgtacctgg-3’（配列番号８７）
ＰｃｉＮｒｕ－ＣＨＡ２－５００－ｒプライマー：
5’-ttACATGTTCGCGAtaagtacaaatccatcttgggtgac-3’（配列番号８８）
　次に、実施例２の基礎ベクター＋ｎｅｏＲ＋ＩｇＬプラスミドを制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ、Ｐｃｉ　Ｉで切断し、ＣＨＡ２－５００断片と置換した。次に、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ、Ｍｌｕ　Ｉで切断し、ＣＨＡ１－５００断片と置換した。最後に、制限酵素Ｍｌｕ　Ｉ部位にＤＮＡ配列８（重鎖カセット）を挿入し、図１５（Ｂ）で示すホモロジーアーム長５００ｂのＣＨＯ　５００ｂ×２ベクターを得た。
ＣＨＯ　２００ｂ×２ベクター、ＣＨＯ　５００ｂ×２ベクター組み換えＣＨＯ細胞の取得
　構築したＣＨＯ　２００ｂ×２ベクター、ＣＨＯ　５００ｂ×２ベクターの線状化、ＣＨＯ細胞への導入およびスクリーニングを実施例３と同様に実施した。
　ところが、２回の導入操作を実施したにもかかわらず、ＣＨＯ　２００ｂ×２ベクター、ＣＨＯ　５００ｂ×２ベクターのいずれにおいても組み換えＣＨＯ細胞は全く取得されなかった。
実施例１３：鎖長５ｋｂの相同ＤＮＡ断片を有し、抗体重鎖を発現するベクターによる相同組み換え体の取得
ＣＨＯ　５ｋｂ×２ベクター作製
　ＣＨＯ－Ｋ１細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＮｓｉＮｒｕ－ＣＨＡ１－５ｋ－ｓ／ＭｌｕＩ－ＣＨＡ１－ｒプライマーセット、ＢｃｌＩ－ＣＨＡ２－ｓ／ＢｓｐＮｒｕ－ＣＨＡ２－５ｋ－ｒプライマーセットによるＰＣＲ反応によって、標的となるｈｐｒｔ遺伝子の相同ＤＮＡ断片（ＣＨＡ１－５ｋおよびＣＨＡ２－５ｋ）をそれぞれクローニングした。ＣＨＡ１－５ｋおよびＣＨＡ２－５ｋはｈｐｒｔ遺伝子のエクソン３を含む領域と相同な配列に設定した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下に示す通りである。
ＮｓｉＮｒｕ－ＣＨＡ１－５ｋ－ｓプライマー：
5’-ttATGCATTCGCGAAtctcaggtgataggagacataagac-3’（配列番号８９）
ＢｃｌＩ－ＣＨＡ２－ｓプライマー：
5’-ttTGATCAgactgaagagctactgtgta-3’（配列番号９０）
ＢｓｐＮｒｕ－ＣＨＡ２－５ｋ－ｒプライマー：
5’-ttTCATGAaTCGCGAAtcagcactcaggagtcagag-3’（配列番号９１）
　次に、実施例２の基礎ベクター＋ｎｅｏＲ＋ＩｇＬプラスミドを制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ、Ｐｃｉ　Ｉで切断し、ＣＨＡ２－５ｋ断片と置換した。次に、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ、Ｍｌｕ　Ｉで切断し、ＣＨＡ１－５ｋ断片と置換した。最後に、制限酵素Ｍｌｕ　Ｉ部位にＤＮＡ配列８（重鎖カセット）を挿入し、図１６で示すホモロジーアーム長５ｋｂのＣＨＯ　５ｋｂ×２ベクターを得た。
ＣＨＯ　５ｋｂ×２ベクター組み換えＣＨＯ細胞の取得
　構築したＣＨＯ　５ｋｂ×２ベクターの線状化、ＣＨＯ細胞への導入およびスクリーニングを実施例３と同様に実施した。
　その結果、１×１０６細胞あたり、７クローンの組み換えＣＨＯ細胞が取得された。実施例７のホモロジーアーム２．５ｋｂのベクターでの取得頻度は１×１０６細胞あたり４クローンであったことから、ホモロジーアーム長５ｋｂはより好ましい結果となった。
 

Claims (16)

  1. 　５’末端から３’末端に向かって、第一の相同ＤＮＡ断片、目的タンパク質遺伝子、および第二の相同ＤＮＡ断片を含んでなる、ＤＮＡ構築物であって、
    　前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が、ＣＨＯ細胞ゲノムのヒポキサンチン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（hprt）遺伝子座の一部と相同組み換え可能な相同性を有し、かつ１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものである、ＤＮＡ構築物。
  2. 　前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が１ｋｂｐ以上７．５ｋｂｐ以下の鎖長を有するものである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  3. 　前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が１ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下の鎖長を有するものである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  4. 　前記hprt遺伝子座の一部が、hprt遺伝子のイントロンの少なくとも一部を含んでなる領域である、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  5. 　前記第一の相同ＤＮＡ断片または第二の相同ＤＮＡ断片が、配列番号１５～２２のいずれかに記載の塩基配列またはその部分配列を含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  6. 　前記目的タンパク質が、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、凝固因子、調節タンパク質またはレセプターである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  7. 　陽性選択マーカー遺伝子をさらに含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  8. 　請求項１に記載のＤＮＡ構築物を含んでなる、ベクター。
  9. 　ヒトｈｐｒｔ遺伝子の第一イントロン由来の核／マトリックス付着領域（ＭＡＲ）を、当該ベクターが染色体に組込まれた後、組込み部位で生じる転写によって、当該ＭＡＲ自身が転写される構造で保持する、請求項８に記載のベクター。
  10. 　前記目的タンパク質遺伝子に作動可能に連結されたＣＨＥＦ－１α遺伝子プロモーターを含んでなる、請求項８または９に記載のベクター。
  11. 　前記ベクターが、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターまたは人工染色体ベクターである、請求項８～１０のいずれか一項に記載のベクター。
  12. 　請求項８～１０のいずれか一項に記載に記載のベクターをＣＨＯ細胞に導入することを含んでなる、組み換えＣＨＯ細胞の製造方法。
  13. 　hprt座に外来性の目的タンパク質遺伝子が組み込まれてなる、組み換えＣＨＯ細胞。
  14. 　hprt遺伝子の機能が不活化している、請求項１３に記載の組み換えＣＨＯ細胞。
  15. 　請求項１２に記載の製造方法により得られる、組み換えＣＨＯ細胞。
  16. 　請求項１３または１５に記載の組み換えＣＨＯ細胞を用意し、該細胞を培養して目的タンパク質を産生することを含んでなる、目的タンパク質の製造方法。
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