WO2010030111A2 - 스피루리나로부터 클로로필 ａ 및 클로린을 제조하는 방법 - Google Patents

스피루리나로부터 클로로필 ａ 및 클로린을 제조하는 방법 Download PDF

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WO2010030111A2
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박계신
이은희
김효준
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다이아텍코리아 주식회사
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    • B01D11/02—Solvent extraction of solids
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
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    • A61K36/05—Chlorophycota or chlorophyta (green algae), e.g. Chlorella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing chlorophyll a and chlorine from spirulina, and more particularly, to efficiently extract chlorophyll a from spirulina through a precipitation method using water and ethanol, or a precipitation method using water and acetone.
  • Treatment of chlorophyll-a with acid to remove magnesium ions from chlorophyll-a yields pheophytin a followed by treatment of base with pheophytin-a to form the photosensitizer chlorine and treatment of acetonitrile and acid Acid chlorine to separate the salt It relates to a method for obtaining chlorine.
  • Spirulina is a microorganism belonging to a very small algae that grows actively in the surface of tropical alkaline lakes such as Chad Lake in Africa and Texcoco Lake in Mexico.
  • the cells contain a large amount of chlorophyll and phycocyanin, which are absorbed by the sun's rays, and are actively growing by carbon assimilation. Since these pigments have a blue-green color, they have been classified as blue-green algae since ancient times.
  • Spirulina was given because it was shaped like a spiral, and the form is primitive given the fact that DNA is a double helix.
  • Chlorophyll (chlorophyll, ⁇ , chlorophyll) is a kind of assimilation pigments of photosynthetic organisms.
  • Four pyrroles are derivatives of forbin in which a cyclopentane ring is linked to a cyclic tetrapyrrole bound by a methine group —CH ⁇ , with one Mg atom coordinated in the center of the tetrapytol ring and a pyrrole or a propionyl group of the pyrrole ring IV.
  • Farnesol is an ester bond.
  • Chlorophyll has been found to closely match the molecular structure of hemoglobin, also called “blue blood,” and is known to perform surprisingly similar functions to the blood of animals.
  • chlorophyll is anti-cancer, anti-inflammatory action, regenerate damaged cells, detoxification, anti-cholesterol action and a wide variety of functions.
  • Patents related to the conventional method for producing chlorophyll and chlorine include a method of preparing chlorophyll a comprising treating ethanol and optionally dioxane in an intact chlorella that is not crushed in Korean Patent No. 10-0841959. And a method of producing chlorine by treating acid with chlorophyll-a.
  • the method described in the registered patent is a method of extracting chlorophyll from chlorella and preparing chlorine therefrom, which has a big disadvantage in that not only chlorophyll a but also chlorophyll b is extracted. And the reaction proceeds in the form of precipitates, the final degree of purification of the photosensitizer chlorine is a purification degree of the material derived from chlorophyll a and chlorophyll b has the disadvantage that the actual purification is low.
  • live chlorella has the disadvantage that it is very difficult to filter and extract. Particularly, when the organic solvent (ethanol) is added to the live chlorella and filtered, the filter is hardly filtered. Therefore, the centrifugation method should be used. This takes a lot of time in the filtration process for mass production.
  • Dioxane component used as a co-solvent is known to be harmful to the human body.
  • Dioxane is a carcinogen and rarely used in the industry.
  • the present inventors have extracted chlorophyll a in high yield from spirulina belonging to the algae, and using it to produce a photosensitive chlorine, while using a relatively safe and simple process, chlorophyll a in a manner suitable for mass production.
  • chlorophyll a in a manner suitable for mass production.
  • the photosensitizer chlorine which has been extracted and precipitated and substituted various cations, it has been studied to complete the efficient manufacturing process.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing various cation-substitutable photosensitive chlorine using chlorophyll a extracted from spirulina.
  • the present invention provides a method for efficiently extracting chlorophyll a from spirulina.
  • the present invention is a method of efficiently extracting chlorophyll a from spirulina by (1) precipitation method using water and ethanol, (2) precipitation method using water and acetone.
  • the present invention may provide a method for extracting chlorophyll a from spirulina comprising the following steps:
  • Precipitating chlorophyll a from spirulina by adding 1/4 to 1/2 of the total volume of water to the extract and concentrating until it is 40-50% ethanol and removing other components than chlorophyll a.
  • the present invention may provide a method for extracting chlorophyll a from spirulina comprising the following steps:
  • Chlorophyll a-process A was removed by stirring spirulina with 60% acetone, filtering, adding water to the chlorophyll a extract extracted with ethanol solvent, and then concentrating to remove other components other than chlorophyll a and precipitating chlorophyll a.
  • the process consists of:
  • the main feature of the chlorophyll-a preparation was the extraction of chlorophyll-a from spirulina, which was stirred with 60% acetone and filtered, the addition of water to the chlorophyll-a extract and the concentration of ethanol to precipitate chlorophyll-a and other components other than chlorophyll-a.
  • the removal process is to be carried out. This process allows for the precipitation of chlorophyll-a with high yield and purification.
  • Impurity removal is performed by treating spirulina with 10-60%, most preferably 60% acetone, and 90-100% ethanol.
  • the reason for using acetone and ethanol is that acetone and ethanol show excellent efficiency in removing impurities. It is preferable to use acetone and ethanol, which are organic solvents that can be used in food processing, if the prepared chlorophyll-a is used as food. Because.
  • Ethanol used in the chlorophyll a extraction process has a concentration of 90-100%. If ethanol of less than 50% chlorophyll a is not extracted from spirulina, using less than 80% chlorophyll a extraction efficiency is greatly reduced.
  • the pretreatment process using acetone is performed 1 to 3 times, most preferably 2 times, and the extraction step using ethanol 1 to 3 times, most preferably 2 times.
  • Ethanol was added to spirulina, stirred to extract chlorophyll-a, filtered, and filled with water 1/3 of the total volume of chlorophyll-a extract. Chlorophyll a precipitated by ethanol concentration is obtained by filtration. In the concentration process, chlorophyll-a precipitates and impurities other than chlorophyll-a are removed.
  • the yield for chlorophyll a in process A is 8-12%.
  • the yield is calculated as a percentage of the weight ratio of chlorophyll a obtained to 1 g of spirulina weight used.
  • Chlorophyll a purity of process A is 80-90% (average 80-82%).
  • Chlorophyll a-process B is a method using ethanol, acetone, and water to prepare a highly purified chlorophyll a through a simple process.
  • the first step of chlorophyll a-process B is to wash spirulina with 60% acetone and then extract chlorophyll a from spirulina using 90-100% ethanol. In this process, if the concentration of ethanol is less than 80%, there is a problem that the extraction efficiency is greatly reduced. Extraction step using ethanol is carried out once to three times, most preferably twice.
  • the second step of chlorophyll-a process B is to precipitate chlorophyll-a by inducing freezing precipitation to chlorophyll-a extract using acetone and water.
  • chlorophyll-a can be precipitated to obtain chlorophyll-a as well as to increase the purity of chlorophyll-a.
  • 3 L of acetone is added to 5 L of chlorophyll a extract.
  • Acetone used here is 10-60%% acetone, most preferably 60% acetone.
  • Acetone is added and stirred well before additional water is added.
  • the amount of water to be used is added 1 L of water to 5 L of chlorophyll a extract and stirred sufficiently.
  • reaction solution is frozen at -20 ° C or lower to allow for better precipitation of chlorophyll-a.
  • the yield for chlorophyll a in process B is 7-8%.
  • the yield is calculated as a percentage of the weight ratio of chlorophyll a obtained to 1 g of spirulina weight used.
  • the chlorophyll a purity of process A is 83-95%.
  • the present invention provides a method for preparing various cation-substitutable photosensitive chlorine using chlorophyll a extracted from spirulina.
  • the method of preparing the photosensitive chlorine is a process of synthesizing or preparing chlorine using the chlorophyll a obtained by the two chlorophyll a production methods.
  • the final material made in spirulina is the reaction proceeds only in chlorophyll a so that the degree of purification of the final material is the degree of purification of the photosensitizer chlorine, the final material derived from chlorophyll a.
  • the present invention may provide a method for preparing chlorine from spirulina comprising the following steps:
  • the present invention may provide a method for preparing chlorine from spirulina comprising the following steps:
  • NaOH or KOH may be used as the base for treating the pheophytin a.
  • Photosensitizer Chlorine-Process A is characterized in that the preparation of the photosensitizer chlorine from pheophytin a is carried out in an acetone solvent.
  • pheophytin a is obtained by treating acid with chlorophyll-a extract to remove magnesium ions from chlorophyll-a.
  • the chemical formulas of chlorophyll a and pheophytin a are as follows:
  • Treatment of chlorophyll-a with acid removes magnesium ions from Formula 1 to produce pheophytin a.
  • Treat the chlorophyll-a extract with acid to bring the pH of the chlorophyll-a extract to 1-2.
  • the pH exceeds 3
  • Sulfuric acid and hydrochloric acid were used as the acid used in this step.
  • Pheophytin a is usually obtained in the form of a precipitate.
  • the precipitate of pheophytin a is dissolved in acetone, and the solution of pheophytin a is treated with basic reagent to pH 13-14.
  • various bases can be used, in which NaOH or KOH is used.
  • Obtaining the photosensitizer chlorine is carried out in acetone solvent. Na + salt chlorine is formed when NaOH is added in acetone solvent and K + salt chlorine is formed when KOH is added.
  • Chlorine was treated with Acetonitrile (50): 1% TFA (50) or Acetonitrile (50): 1% Formic acid (50) or Acetonitrile (50): 1% Acetic acid (50) and stirred for acid chlorine formation. After putting in a -20 °C freezer and separated from the water layer and the organic solvent to form the acid chlorine. The organic solvent (acetonitrile) layer was filtered + OH - , K + OH - , NH 4 + OH - By processing Na + , K + , NH 4 + salt Obtain chlorine.
  • Photosensitizer Chlorine-Na of Process A + Salt chlorine or K + Purity for salt chlorine is 90-95%, Acetonitrile (50): 1% TFA (50) or Acetonitrile (50): 1% Formic acid (50) or Acetonitrile (50): 1% Acetic acid (50) Acid chlorine to separate Na + OH - , K + OH - , NH 4 + OH - Handle and Na + , K + , NH 4 + salt The degree of purification for the salt chlorine obtained chlorine is 99.9%.
  • the yield for chlorine is 3-7% with spirulina as starting material.
  • the yield is calculated as a percentage of the weight ratio of chlorine obtained to 1 g dry weight of spirulina used.
  • Extraction method of chlorophyll a using spirulina of the present invention has the advantage of a simple and fast filtration process. As a result, the cost and yield are much better.
  • spirulina contains only chlorophyll-a, so the purity of pure chlorophyll-a is very high.
  • the pheupinin synthesized in spirulina consists only of pheupintine a and the final substance is also a substance formed in pheupinin a.
  • the degree of purification of various cation-substituted chlorine is 95% to 99%, which indicates the degree of purification that can be used as a medicine in a very easy way.
  • the water layer and the organic solvent layer were separated to form acid chlorine, and then the organic solvent (acetonitrile) layer was filtered and + OH - , K + OH - , NH 4 + OH -
  • Purity of chlorine which is various cation-substituted by the method of obtaining chlorine is 95% to 99%, which shows the degree of purification that can be used as a medicine in a very easy way. Synthesis and preparation of sensitizing chlorine using spirulina is more suitable for mass production process with more streamlined process, higher yield and higher purification rate than conventional methods.
  • the present invention efficiently extracts chlorophyll a from spirulina using a precipitation method using water and ethanol, or a precipitation method using water and acetone, and then removes magnesium ions from chlorophyll a by treating acid with chlorophyll a obtained above.
  • Pheophytin a is obtained, followed by treatment of base with peophytin a to form a photosensitizer chlorine, and treatment with acetonitrile and acid to separate acid chlorine, followed by base treatment with salt
  • By obtaining chlorine it has a very good effect that only chlorophyll-a can be extracted purely and pure sensitizer chlorine, which is formed only from pheophytin a, can be produced.
  • the present invention has the advantage of synthesizing and preparing a photosensitive chlorine substituted with chlorophyll a extraction and precipitation and various cations in a manner suitable for mass production in a relatively simple process using spirulina.
  • FIG. 2 is an HPLC chromatogram showing the result of extracting chlorophyll-a through the precipitation method using water and ethanol using the spirulina in the present invention, that is, process A.
  • the arrow is the peak corresponding to chlorophyll a.
  • FIG. 3 is an HPLC chromatogram showing the result of extracting chlorophyll-a through the precipitation method using water and acetone using the spirulina in the present invention, that is, process B.
  • the arrow is the peak corresponding to chlorophyll a.
  • Figure 4 is an HPLC chromatogram for chlorine prepared through chlorophyll a process A or B using spirulina in the present invention.
  • the arrow is the peak corresponding to chlorine.
  • FIG. 5 is an HPLC chromatogram for final synthesized chlorine prepared via Process A or B using spirulina in the present invention.
  • the arrow is the peak corresponding to chlorine.
  • 6 to 11 is a pretreatment process using water and acetone using spirulina in the present invention 10% (Fig. 6), 20% (Fig. 7), 30% (Fig. 8), 40% (Fig. 9), HPLC chromatogram of the extract obtained after extraction with 50% (FIG. 10) and 60% (FIG. 11) acetone to remove components other than chlorophyll.
  • Example 2 Obtaining Chlorophyll a from Spirulina
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • Acetone was added to chlorophyll-a obtained in Process A of Example 2, and the mixture was sufficiently stirred. Thereafter, the chlorophyll-a extract was treated with 5N HCl or 5N H 2 SO 4, and the pH of the extract was added to 1-2, and the reaction of removing magnesium ions from chlorophyll-a was stirred for 3 hours. After stirring, the pH was adjusted to 6 ⁇ 7 (neutralized) with NaOH, and the black phephytin a solution was stored at -20 ° C. in the freezer for 6 hours to form a precipitate. A precipitate was obtained.
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • Na + Salt chlorine or K + Salt chlorine was prepared and then treated with Acetonitrile (50): 1% TFA (50) or Acetonitrile (50): 1% Formic acid (50) or Acetonitrile (50): 1% Acetic acid (50) to separate acid chlorine.
  • Na + OH - , K + OH - , NH 4 + OH - Handle and Na + , K + , NH 4 + salt Chlorine was obtained. Chlorine was obtained. The yield of chlorine in salt form yielded 5.8 g with spirulina 100 g treatment and yield 5.8%.
  • HPLC high pressure liquid chromatography

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Abstract

본 발명은 스피루리나로부터 클로로필 a 및 클로린을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 스피루리나로부터 물과 에탄올을 이용한 침전방법, 또는 물과 아세톤을 이용한 침전방법을 통해 효율적으로 클로로필 a를 추출하고, 상기에서 수득한 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득하고 이어서 페오피틴 a에 염기를 처리하여 광민감제 클로린을 형성시키고 아세토니트릴과 산을 처리하여 산 클로린을 분리한 다음 염기를 처리하여 염<sup/>클로린을 수득하는 방법에 관한 것이다.

Description

스피루리나로부터 클로로필 ａ 및 클로린을 제조하는 방법
본 발명은 스피루리나로부터 클로로필 a 및 클로린을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 스피루리나로부터 물과 에탄올을 이용한 침전방법, 또는 물과 아세톤을 이용한 침전방법을 통해 효율적으로 클로로필 a를 추출하고, 상기에서 수득한 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득하고 이어서 페오피틴 a에 염기를 처리하여 광민감제 클로린을 형성시키고 아세토니트릴과 산을 처리하여 산 클로린을 분리한 다음 염기를 처리하여 염 클로린을 수득하는 방법에 관한 것이다.
스피루리나는 아프리카의 챠드 호수 및 멕시코의 텍스코코 호수와 같은 열대지역 알칼리성 호수의 수면에서 왕성하게 자생하는 극히 작은 조류(藻類 algae)에 속하는 미생물이다. 그 세포 속에는 다량의 클로로필과 피코시아닌이 들어있어서 태양광선을 흡수하여 탄소동화작용을 활발하게 수행하여 자라고 있다. 이러한 색소들이 들어있어서 청남색을 띠고 있으므로 옛날부터 남조류(blue-green algae)로 분류했었다.
스피루리나(Spirulina)라는 이름은 그 모양이 나선형(Spiral)이어서 붙여졌으며, DNA가 2중 나선형인 점을 고려할 때 그 형태가 원시적인 것이다.
전자현미경의 발달로 미생물의 세포구조가 자세히 밝혀지면서 녹조류나 갈조류의 구조는 고등 식물의 구조와 다른 점을 발견하였다. 즉 녹조류의 구조는 고등식물의 구조와 동일하게 진핵 세포(eukaryote)구조를 가지고 있는 반면에, 남조류는 세균의 구조와 비슷한 원핵세포(prokaryote)구조를 가진 것이 밝혀짐에 따라, 1960년대 초부터 일부 미생물학자들이 남조류는 조류보다는 세균에 가까우므로, 세균류에 포함시켜야 한다는 주장이 나오게 되었다. 현재는 이 주장을 받아들여 청 남세 균류(blue-green bacteria)로 분류하고 있다. 그러나 산업계에서는 옛날 관행대로 미세조류(微細藻類 micro-algae)라 부르고 있다.
클로로필(엽록소, 葉綠素, chlorophyll)은 광합성을 하는 생물이 가지는 동화색소의 일종이다. 4개의 피롤이 메틴기 －CH＝에 의해 결합된 고리모양테트라피롤에 시클로펜탄고리가 연결된 포르빈의 유도체인데, 테트라피톨고리의 중앙에 Mg원자가 1개 배위하고 피롤고리 Ⅳ의 프로피오닐기에 피롤 또는 파르네솔이 에스테르결합한 것이다.
클로로필은 헤모글로빈의 분자구조와 거의 일치하는 것으로 확인되어,“푸른혈액”이라고도 불리며, 실제로 동물의 혈액과 놀랍도록 비슷한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 특히, 클로로필은 항암, 항염작용을 하며, 손상된 세포를 재생시키고, 해독작용, 항콜레스테롤 작용에 이르기까지 매우 다양한 작용을 한다.
종래 클로로필 및 클로린을 제조하는 방법에 관한 특허문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-0841959호에 파쇄 되지 않은 인택트(intact) 클로렐라에 에탄올 및 선택적으로 다이옥산을 처리하는 단계를 포함하는 클로로필 a의 제조방법과, 상기 클로로필 a에 산을 처리하여 클로린을 제조하는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 상기 등록특허에 기재된 방법은 클로렐라에서 클로로필을 추출하고 이로부터 클로린을 제조하는 방법으로, 클로로필 a 뿐만 아니라 클로로필 b도 추출되는 큰 단점이 있으며, 이와 같이 클로로필 a와 클로로필 b가 혼합되어 있는 추출액 및 침전물 형태로 반응이 진행되어 최종 물질인 광민감제 클로린의 정제도는 클로로필 a와 클로로필 b에서 파생된 물질의 정제도가 되어 결과적으로 실질적인 정제도가 낮은 단점이 있다.
또한, live chlorella를 이용할 경우 여과 및 추출이 매우 힘들다는 단점이 있다. 특히 live chlorella에 유기용매(에탄올)을 넣고 여과할 경우 여과가 거의 되지 않으며, 따라서 원심분리를 이용한 방법을 사용해야한다. 이는 대량생산을 위한 여과공정에 많은 시간이 들게 된다.
아울러, 보조용매로서 사용되는 Dioxane 성분의 경우 인체에 유해한것으로 알려져 있다. Dioxane은 발암 물질로 업계에서는 거의 사용하지 않는 시약이다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 남조류에 속하는 스피루리나로부터 높은 수율로 클로로필 a를 추출하고 이를 이용하여 광민감제 클로린(chlorin)을 제조하면서 비교적 안전하고 간단한 공정으로 대량생산에 적합한 방식으로 클로로필 a 추출 및 침전과 다양한 양이온을 치환시킨 광민감제 클로린을 합성 및 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 연구하였고 그 결과 효율적인 제조과정을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 스피루리나로부터 효율적으로 클로로필 a를 추출하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 스피루리나로부터 추출된 클로로필 a를 이용하여 다양한 양이온 치환 가능한 광민감제 클로린을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 스피루리나로부터 효율적으로 클로로필 a를 추출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (1) 물과 에탄올을 이용한 침전방법, (2) 물과 아세톤을 이용한 침전방법을 통해 스피루리나로부터 효율적으로 클로로필 a를 추출하는 방법이다.
바람직한 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 스피루리나로부터 클로로필 a를 추출하는 방법을 제공할 수 있다:
스피루리나를 10~60% 아세톤으로 교반시키고 여과하는 단계;
상기 여과된 스피루리나에 90-100% 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 추출하는 단계; 및
상기 추출액에 물을 전체 볼륨의 1/4 내지 1/2을 첨가하고 40~50% 농도의 에탄올이 될 때까지 농축함으로써 스피루리나로부터 클로로필 a를 침전시키고 클로로필 a 이외의 다른 성분은 제거하는 단계.
또 다른 바람직한 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 스피루리나로부터 클로로필 a를 추출하는 방법을 제공할 수 있다:
스피루리나를 10~60% 아세톤으로 교반하고 여과하는 단계;
상기 여과된 스피루리나에 90-100% 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 추출하는 단계; 및
상기 추출액에 아세톤과 물을 첨가하여 냉동침전으로 클로로필 a를 침전 수득하는 단계.
클로로필 a - 과정 A
클로로필 a-과정 A는 스피루리나를 60% 아세톤으로 교반하고 여과한 후 에탄올 용매로 추출한 클로로필 a 추출액에 물을 첨가한 후 농축하는 방법을 이용하여 클로로필 a 이외의 다른 성분을 제거하고, 클로로필 a를 침전하는 과정으로 이루어져 있다.
클로로필 a를 수득하는데 이용되는 스피루리나는 파쇄된 스피루리나이다.
클로로필 a 제조법에 있어 가장 큰 특징은 60% 아세톤으로 교반하고 여과한 스피루리나로부터 클로로필 a를 추출하고 클로로필 a 추출액에 물을 첨가하고 에탄올을 농축하는 과정에서 클로로필 a를 침전시키고 클로로필 a 이외의 다른 성분들을 제거하는 과정을 실시하는 것이다. 이 과정은 높은 수율과 정제도로 클로로필 a를 침전할 수 있도록 한다.
불순물 제거 과정은 스피루리나에 10~60%, 가장 바람직하기로는 60%의 아세톤과, 90~100 % 에탄올을 처리하여 실시된다. 아세톤과 에탄올을 사용한 이유는 아세톤과 에탄올이 불순물을 제거하는 데 우수한 효율을 나타내기 때문이며 제조되는 클로로필 a가 식품으로 이용될 것을 예상하면 식품가공에 사용될 수 있는 유기용매인 아세톤과 에탄올을 이용하는 것이 바람직하기 때문이다.
60% 이상의 농도를 가지는 아세톤을 이용하여 전처리 과정을 실시하면 클로로필 a가 추출되어지기 때문에 불순물의 제거를 위해 실시할 수 없다. 또한 10%, 20%, 30%, 40% 및 50% 농도의 아세톤을 이용하여 전처리 과정을 실시하면 불순물의 제거가 60% 아세톤 보다는 잘되지 않는다. 따라서 60% 아세톤이 클로로필 a의 불순물 제거를 위해 가장 적당한 전처리 과정의 용액이라는 것을 알 수 있다.
클로로필 a 추출과정에서 이용되는 에탄올은 90~100%의 농도를 갖는다. 50% 미만의 에탄올을 이용하면 스피루리나에서 클로로필 a가 추출되지 않으며 80% 미만의 에탄올을 이용하면 클로로필 a 추출 효율이 크게 감소되는 문제점이 있다. 아세톤을 이용한 전처리 과정은 1~3회, 가장 바람직하기로는 2회, 에탄올을 이용한 추출단계는 1회~3회, 가장 바람직하기로는 2회 실시한다.
스피루리나에 에탄올을 첨가시키고 교반하여 클로로필 a를 추출하고 여과한 후 물을 클로로필 a 추출액 전체 볼륨의 1/3 채워준다. 에탄올 농축과정으로 침전되는 클로로필 a를 여과하여 수득한다. 농축과정에서 클로로필 a는 침전이 되고 클로로필 a 이외의 불순물은 제거가 된다.
과정 A에서 클로로필 a에 대한 수율은 8~12% 이다. 수율은 사용된 스피루리나 중량 1 g에 대한 수득한 클로로필 a의 중량비의 백분율로 계산된다. 과정 A의 클로로필 a 정제도는 80-90%(평균 정제도 80~82%)이다.
클로로필 a - 과정 B
클로로필 a-과정 B는 에탄올, 아세톤 및 물을 이용하는 방법으로써 간단한 공정을 통하여 정제도가 높은 클로로필 a를 제조할 수 있다.
클로로필 a-과정 B에 이용되는 스피루리나에 대한 내용은 과정 A와 동일하다.
클로로필 a-과정 B의 첫 번째 단계는 스피루리나를 60% 아세톤으로 세척한 후 90-100% 에탄올을 이용하여 스피루리나부터 클로로필 a를 추출하는 단계이다. 이 과정에서 에탄올의 농도가 80% 미만이면 추출효율이 크게 감소되는 문제점이 있다. 에탄올을 이용한 추출단계는 1회~3회, 가장 바람직하기로는 2회 실시한다.
클로로필 a-과정 B의 두 번째 단계는 클로로필 a 추출액에 아세톤과 물을 이용하여 냉동침전을 유도하여 클로로필 a를 침전시키는 단계이다. 이 단계를 통하여 클로로필 a를 침전시켜 클로로필 a를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 클로로필 a의 정제도를 높일 수 있다. 사용되는 아세톤과 물의 양은 클로로필 a 추출액 5L에 대하여 아세톤 3L가 첨가된다. 여기에 사용되는 아세톤은 10~60%%의 아세톤이며, 가장 바람직하기로는 60%의 아세톤이다. 아세톤을 첨가하고 충분히 교반한 다음 추가적으로 물을 첨가한다. 물의 사용량은 클로로필 a 추출액 5 L에 대하여 물 1L 첨가하고 충분히 교반시킨다.
아세톤과 물 첨가 단계 이후에 반응액을 -20℃ 이하에서 냉동 처리하여 클로로필 a의 침전이 더 잘 되도록 한다.
과정 B에서 클로로필 a에 대한 수율은 7~8% 이다. 수율은 사용된 스피루리나 중량 1 g에 대한 수득한 클로로필 a의 중량비의 백분율로 계산된다. 과정 A의 클로로필 a 정제도는 83-95% 이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 스피루리나로부터 추출된 클로로필 a를 이용하여 다양한 양이온 치환 가능한 광민감제 클로린을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 광민감제 클로린의 제조방법은 상기 두 가지 클로로필 a 제조 방법에 의해 수득한 클로로필 a를 이용하여 클로린을 합성 또는 제조하는 과정이다.
본 발명에서, 스피루리나에서 만들어지는 최종 물질은 클로로필 a에서만 반응이 진행되어 최종 물질의 정제도는 클로로필 a에서의 파생된 최종 물질인 광민감제 클로린의 정제도이다.
바람직한 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 스피루리나로부터 클로린을 제조하는 방법을 제공할 수 있다:
스피루리나를 10~60% 아세톤으로 교반시키고 여과하는 단계;
상기 여과된 스피루리나에 90-100% 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 추출하는 단계;
상기 추출액에 물을 전체 볼륨의 1/4 내지 1/2을 첨가하고 40~50% 농도의 에탄올이 될 때까지 농축함으로써 스피루리나로부터 클로로필 a를 침전시키고 클로로필 a 이외의 다른 성분은 제거하는 단계;
상기에서 수득한 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득하는 단계;
페오피틴 a에 염기를 처리하여 광민감제 클로린을 형성시키는 단계;
Acetonitrile(50) : 1% TFA(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Formic acid(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Acetic acid(50)을 처리하여 산 클로린을 분리하는 단계; 및
Na+OH-, K+OH- 또는 NH4 +OH-을 처리하여 Na+, K+ 또는 NH4 + 염 클로린을 수득하는 단계.
또 다른 바람직한 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 스피루리나로부터 클로린을 제조하는 방법을 제공할 수 있다:
스피루리나를 10~60% 아세톤으로 교반하고 여과하는 단계;
상기 여과된 스피루리나에 90-100% 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 추출하는 단계;
상기 추출액에 아세톤과 물을 첨가하여 냉동침전으로 클로로필 a를 침전 수득하는 단계;
상기에서 수득한 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득하는 단계;
페오피틴 a에 염기를 처리하여 클로린을 형성시키는 단계;
Acetonitrile(50) : 1% TFA(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Formic acid(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Acetic acid(50)을 처리하여 산 클로린을 분리하는 단계; 및
Na+OH-, K+OH- 또는 NH4 +OH-을 처리하여 Na+, K+ 또는 NH4 + 염 클로린을 수득하는 단계.
본 발명에서, 상기 페오피틴 a에 처리하는 염기로는 NaOH 또는 KOH가 사용될 수 있다.
광민감제 클로린 - 과정 A
광민감제 클로린 -과정 A는 페오피틴 a로부터 광민감제 클로린을 제조함에 있어서 아세톤 용매 하에서 실시하는 것을 특징으로 한다.
클로린-과정 A에 따르면 클로로필 a 추출액에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득한다. 클로로필 a 및 페오피틴 a의 화학식은 하기 화학식 1 및 2와 같다.
화학식 1
Figure PCTKR2009005099-appb-C000001
화학식 2
Figure PCTKR2009005099-appb-C000002
클로로필 a에 산을 처리하면 화학식 1로부터 마그네슘 이온이 제거되어 페오피틴(pheophytin) a가 제조된다. 클로로필 a 추출물에 산을 처리하여 클로로필 a 추출액의 pH를 1-2가 되도록 한다. 이 경우, pH 3을 초과하면 마그네슘 이온 제거율이 크게 감소되는 문제점이 있다. 이 단계에서 이용되는 산으로는 황산 및 염산이 사용되었다. 페오피틴 a는 통상적으로 침전물 형태로 수득하게 된다.
광민감제 클로린 형성 단계로 페오피틴 a 침전물을 아세톤으로 용해한 후 페오피틴 a 용액에 염기성 시약을 처리하여 pH 13-14가 되도록 한다. 이 단계에서 이용되는 염기로는 다양한 염기를 이용할 수 있으며 여기에서는 NaOH 또는 KOH가 사용되었다. 광민감제 클로린을 수득하는 단계는 아세톤 용매 하에서 실시된다. 아세톤 용매 하에 NaOH가 첨가되었을 경우 Na+ 염 클로린이 형성되며 KOH가 첨가되었을 경우에는 K+ 염 클로린이 형성된다.
염 클로린에 Acetonitrile(50) : 1% TFA(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Formic acid(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Acetic acid(50)을 처리하여 산 클로린 형성을 위해 교반해 준 뒤 -20℃ 냉동고에 넣어둔 후 물층과 유기용매층을 분리하여 산클로린을 형성한다. 유기용매(acetonitrile)층을 여과하여 Na+OH-, K+OH-, NH4 +OH-을 처리하여 Na+, K+, NH4 + 염 클로린을 수득한다.
광민감제 클로린-과정 A의 Na+ 염 클로린 또는 K+ 염 클로린에 대한 정제도는 90-95%, Acetonitrile(50) : 1% TFA(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Formic acid(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Acetic acid(50)을 처리하여 산 클로린을 분리하여 Na+OH-, K+OH-, NH4 +OH-을 처리하고 Na+, K+, NH4 + 염 클로린을 수득한 염 클로린에 대한 정제도는 99.9%이다.
클로린에 대한 수율은 스피루리나를 출발물질로 하는 경우 3-7% 이다. 수율은 사용된 스피루리나의 건조 중량 1 g에 대한 수득한 클로린의 중량비의 백분율로 계산된다.
클로린의 화학식은 하기 화학식 3과 같다.
화학식 3
Figure PCTKR2009005099-appb-C000003
본 발명의 스피루리나를 이용한 클로로필 a의 추출방법은 여과공정이 단순하고 빠른 장점이 있다. 이에 따라 비용 대비 수율 및 정제도는 훨씬 우수하다. 또한 스피루리나는 클로로필 a만을 포함하고 있어 순수 클로로필 a의 정제도가 매우 높다.
또한, 스피루리나에서 합성되는 페오피틴은 페오피틴 a로만 되어 있으며 최종물질 또한 페오피틴 a에서 형성되어진 물질이다. 다양한 양이온 치환되는 클로린의 정제도는 95%~99%로 매우 쉬운 방법으로 의약품으로 사용 가능한 정제도를 나타낸다.
즉, 스피루리나에서는 클로로필 a만 추출 및 침전되고, 합성되는 페오피틴은 페오피틴 a로만 되어 있고 최종물질 또한 페오피틴 a에서 형성되어진 순수한 광민감제 클로린이다. Acetonitrile(50) : 1% TFA(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Formic acid(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Acetic acid(50)을 처리하여 산 클로린 형성을 위해 -20℃ 냉동고에 넣어둔 후 물층과 유기용매층을 분리하여 산 클로린을 형성한 후 유기용매(acetonitrile)층을 여과하여 Na+OH-, K+OH-, NH4 +OH-을 처리하여 Na+, K+, NH4 + 염 클로린을 수득하는 방법으로 다양한 양이온 치환되는 클로린의 정제도는 95%~99%로 매우 쉬운 방법으로 의약품으로 사용 가능한 정제도를 나타낸다. 스피루리나를 이용한 광민감제 클로린의 합성 및 제조 방법은 기존의 방법보다 간결해진 공정과정과 비용대비 높은 수율과 높은 정제도로 대량생산 공정에 적합한 방식이다.
본 발명은 스피루리나로부터 물과 에탄올을 이용한 침전방법, 또는 물과 아세톤을 이용한 침전방법을 통해 효율적으로 클로로필 a를 추출하고, 상기에서 수득한 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득하고 이어서 페오피틴 a에 염기를 처리하여 광민감제 클로린을 형성시키고 아세토니트릴과 산을 처리하여 산 클로린을 분리한 다음 염기를 처리하여 염 클로린을 수득함으로써, 클로로필 a만 순수하게 추출하고 이로부터 페오피틴 a에서만 형성되어진 순수한 광민감제 클로린을 제조할 수 있는 매우 뛰어난 효과를 가진다.
또한, 본 발명은 스피루리나를 이용하여 비교적 간단한 공정으로 대량생산에 적합한 방식으로 클로로필 a 추출 및 침전과 다양한 양이온을 치환시킨 광민감제 클로린을 합성 및 제조할 수 있는 장점을 가진다.
도 1은 본 발명에서 사용하는 추출 전 스피루리나의 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 본 발명에서 스피루리나를 이용하여 물과 에탄올을 이용한 침전방법을 통해 즉, 과정 A를 이용하여 클로로필 a를 추출한 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 3은 본 발명에서 스피루리나를 이용하여 물과 아세톤을 이용한 침전방법을 통해 즉, 과정 B를 이용하여 클로로필 a를 추출한 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 4는 본 발명에서 스피루리나를 이용하여 클로로필 a 과정 A 또는 B를 통해 제조된 클로린에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 클로린에 해당하는 피크이다.
도 5는 본 발명에서 스피루리나를 이용하여 과정 A또는 B를 통해 제조된 최종 합성 완료된 클로린에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 클로린에 해당하는 피크이다.
도 6 내지 도 11은 본 발명에서 스피루리나를 이용하여 물과 아세톤을 이용한 전처리 과정으로 각각 10%(도 6), 20%(도 7), 30%(도 8), 40%(도 9), 50%(도 10) 및 60%(도 11) 아세톤으로 전처리하여 클로로필 이외의 성분이 제거되도록 추출한 후 얻은 추출액에 대한 HPLC 크로마토그램이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 출발물질로서 적합한 스피루리나를 선택
클로로필 a와 광민감제 클로린을 얻기 위한 출발물질로서 초음파 분쇄 스피루리나 시료를 준비하였다. 이어 초음파 분쇄 스피루리나에 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다.
초음파 분쇄 스피루리나 20 g을 취하여 에탄올을 100 ml를 첨가하여 30분, 1시간 30분, 3시간, 6시간, 12시간 동안 교반시킨 후 여과하여 추출용액을 얻었다. 추출용액에 대하여 HPLC(high pressure liquid chromatography) 분석과 분자량 분석(mass spectrometry)을 하였고, agilent 1200, agilent 6320 ion trap LC/MS 시스템을 이용하여 실시하였다. 샘플 주입 볼륨은 10 ㎕, 용매 유속은 1 ml/min로 하였다. 전개액으로는 메탄올(methanol)과 아세토나이트릴(acetonitrile)이 1:1로 혼합된 것을 이용하였다. 레퍼런스(reference)로는, Sigma-aldrich 회사의 클로로필 a를 사용하였다. 도 1에서, 머무름시간 약 20.883 분에 해당하는 피크가 클로로필 a에 해당하는 것이다.
도 1에서 볼 수 있듯이, 스피루리나를 이용할 경우 클로로필 b를 포함하지 않고 순수하게 클로로필 a만 포함되어 있어 클로로필 a에 대한 수율을 높일 수 있을 것으로 확인되었다. 이로써 클로로필 b의 제거 과정이 전혀 필요치 않음을 알 수 있었다.
실시예 2: 스피루리나로부터 클로로필 a의 수득
과정 A
A-1: 스피루리나로부터 클로로필 a의 침전 및 불순물 제거
(주)Shandong Binzhou Tianjian Biotechnology Co. Ltd 에서 구입한 스피루리나(spirulina)에서 클로로필 a 이외의 성분들을 제거하기 위하여 스피루리나를 60% 아세톤으로 교반하고 여과한 후 스피루리나에 에탄올을 첨가시키고 교반하여 클로로필 a를 추출하고 물을 클로로필 a 추출액 전체 볼륨의 1/3 채워주었다. 에탄올 농축과정으로 침전되는 클로로필 a를 여과하여 수득하였다. 에탄올과 물에 의한 추출 침전 과정을 총 1회 실시하였다.
침전물을 소량 취한 후 HPLC(high pressure liquid chromatography)로 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. HPLC는 agilent 1200 시스템을 이용하여 실시하였고, 샘플 주입 볼륨은 10 ㎕, 용매 유속은 1 ml/min로 하였다. 전개액으로는 메탄올(methanol)과 아세토나이트릴(acetonitrile)이 1:1로 혼합된 것을 이용하였다.
그 결과, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름시간(retention time) 약 19.076 min에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰되었고, 머무름시간 00-13 min의 불순물들이 상당량 제거되었음을 알 수 있었다. 또한, HPLC 크로마토그램에서 클로로필 a의 정제도가 82.19%임을 확인할 수 있었다. 과정 A의 클로로필 a에 대한 수율은 9.32% 이었다. 레퍼런스(reference)로는, Sigma-aldrich 회사의 클로로필 a를 사용하였다.
과정 B
B-1: 스피루리나로부터 클로로필 a의 침전 및 불순물 제거
(주)Shandong Binzhou Tianjian Biotechnology Co. Ltd에서 구입한 스피루리나(spirulina)에서 클로로필 a 이외의 성분들을 제거하기 위하여 스피루리나를 60% 아세톤으로 세척한 후 여과하고 스피루리나에 에탄올을 첨가시키고 교반하여 클로로필 a를 추출하였다. 에탄올에 의한 추출 과정을 총 2회 실시하였다. 이어 클로로필 a 추출액 전체 볼륨의 1/2 아세톤과 1/5 증류수를 첨가한 후 충분히 교반한 후 24시간 이상 -20℃ 냉동실에 보관하여 침전을 유도하였다. 이어 침전물을 여과하고 클로로필 a를 수득하였다.
상기 클로로필 a 침전물을 소량 취한 후, HPLC(high pressure liquid chromatography)로 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간(retention time) 약 19.206 분에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰이 되었다. 또한, HPLC 크로마토그램에서 클로로필 a의 정제도가 84.617%임을 확인할 수 있었다. 과정 B의 클로로필 a에 대한 수율은 7.52% 이었다. 실험 결과, 아세톤과 물을 이용하여 클로로필 a 침전물을 형성하는 경우에는 보다 높은 정제도로 클로로필 a를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 클로로필 a로부터 광민감제 클로린의 제조
3-1: 페오피틴(pheophytin) a의 생성
상기 실시예 2의 과정 A에서 얻은 클로로필 a에 아세톤을 첨가하고 충분히 교반하였다. 이후 여과과정을 통해 깨끗한 클로로필 a 추출액에 5N HCl 또는 5N H2SO4을 처리하여 추출액의 pH를 1-2이 되도록 첨가하고 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거하는 반응을 3시간 동안 교반하였다. 교반 후 NaOH로 pH 6~7(중화)로 맞춘 후 검은색의 페오피틴 a 용액을 -20℃ 냉동실에 6시간 보관하여 침전이 형성되게 하고 페오피틴 a 용액을 여과한 후 페오피틴 a 침전물을 수득하였다.
3-2: 광민감제 클로린의 생성
과정 A
상기 3-1의 페오피틴 a 침전물을 아세톤으로 녹여낸 후 여기에 5N NaOH 또는 5N KOH를 첨가하여 페오피틴 a 용액의 pH를 13-14로 조정하고 6시간 동안 교반시켜 페오피틴 a로부터 광민감제 클로린 침전물을 형성시켰다. 여과를 한 후 아세톤을 완전히 제거하였다.
상기에서 얻은 클로린 침전물을 소량 취한 후, HPLC(high pressure liquid chromatography)로 클로린 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간 약 6.729 분에서 클로린에 해당하는 피크가 관찰되었고 클로린의 정제도는 98.822% 이었다.
Na+ 염 클로린 또는 K+ 염 클로린을 제조한 다음 Acetonitrile(50) : 1% TFA(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Formic acid(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Acetic acid(50)을 처리하여 산 클로린을 분리하여 Na+OH-, K+OH-, NH4 +OH-을 처리하고 Na+, K+, NH4 + 염 클로린을 수득한 염 클로린을 수득하였다. 염 형태의 클로린의 수율은 스피루리나 100g 처리 시 5.8 g을 수득할 수 있었고 수율은 5.8% 이었다. 또한, 염 형태의 클로린에 대해 HPLC(high pressure liquid chromatography)를 수행하였다. 그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 염 형태 클로린의 정제도는 99.99% 이었다.
실시예 4: 아세톤 농도에 따른 스피루리나 전처리 효율 조사
아세톤 농도에 따른, 불순물 제거를 위한 전처리 과정의 효율을 조사하기 위하여 스피루리나를 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 및 60% 농도의 아세톤으로 교반하고 여과한 후 얻은 추출액에 대하여 HPLC(high pressure liquid chromatography)를 수행하였다. 그 결과, 도 6 내지 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이 아세톤의 농도가 증가함에 따라 스피루리나로부터 추출되어 제거되는 성분들이 더욱 다양하고 더욱 많아짐을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통해, 60% 아세톤이 클로로필 a의 불순물 제거를 위해 가장 적당한 전처리 과정의 용액이라는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

  1. 스피루리나를 10~60% 아세톤으로 교반시키고 여과하는 단계;
    상기 여과된 스피루리나에 90-100% 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 추출하는 단계; 및
    상기 추출액에 물을 전체 볼륨의 1/4 내지 1/2을 첨가하고 40~50% 농도의 에탄올이 될 때까지 농축함으로써 스피루리나로부터 클로로필 a를 침전시키고 클로로필 a 이외의 다른 성분은 제거하는 단계를 포함하는 스피루리나로부터 클로로필 a를 추출하는 방법.
  2. 스피루리나를 10~60% 아세톤으로 교반하고 여과하는 단계;
    상기 여과된 스피루리나에 90-100% 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 추출하는 단계; 및
    상기 추출액에 아세톤과 물을 첨가하여 냉동침전으로 클로로필 a를 침전 수득하는 단계를 포함하는 스피루리나로부터 클로로필 a를 추출하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에서 수득한 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득하는 단계;
    페오피틴 a에 염기를 처리하여 광민감제 클로린을 형성시키는 단계;
    Acetonitrile(50) : 1% TFA(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Formic acid(50) 또는 Acetonitrile(50) : 1% Acetic acid(50)을 처리하여 산 클로린을 분리하는 단계; 및
    Na+OH-, K+OH- 또는 NH4 +OH-을 처리하여 Na+, K+ 또는 NH4 + 염 클로린을 수득하는 단계를 포함하는 스피루리나로부터 클로린을 제조하는 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 아세톤은 60% 아세톤임을 특징으로 하는 스피루리나로부터 클로로필 a를 추출하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 아세톤을 이용한 전처리 과정은 1~3회, 에탄올을 이용한 추출단계는 1회~3회 실시하는 것을 특징으로 하는 스피루리나로부터 클로로필 a를 추출하는 방법.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 에탄올을 이용한 추출은 1회~3회 실시하는 것을 특징으로 하는 스피루리나로부터 클로로필 a를 추출하는 방법.
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