KR101288461B1 - 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체, 이를 함유하는 광감작제 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체, 이를 함유하는 광감작제 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것으로, 세포 증식 억제 활성을 갖는 항암 화학요법제와 광역학적 활성을 갖는 클로린 유도체를 접합시킴으로써 종양세포의 증식을 억제하면서 동시에 광역학적 치료를 할 수 있으며, 항암 화학요법제의 독성을 감소시키고 내성을 피할 수 있으므로 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체, 이를 함유하는 광감작제 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물{Anticancer chemotherapeutic agent-chlorin derivative conjugate, a photosensitizer comprising the same, and a composition for treatment of cancer comprising the same}
본 발명은 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체, 이를 함유하는 광감작제 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
광역학적 치료(PDT)는 빛과 광감작제(PS)의 조합을 이용한 의학적 치료로서, 작용기전은 크게 광감각제의 종양 선택적 축적에 대한 분자적 기전과 광감각제와 빛의 상호작용에 따른 종양 파괴기전으로 나눌 수 있다. 각 인자는 그 자체로 해롭지 않으나, 산소와 결합되었을 때, 이들은 종양 세포를 비활성화하는 치사의 세포독성 작용제를 생산할 수 있다[Sternberg ED et al., Tetrahedron, 1998, 54: 4151-4202; Kadish KM et al., The Porphyrin Handbook. 2000, Vol 6: 158-161].
PDT는 이중 선택성을 나타내는데, 병든 조직에 의해서 PS가 우선적으로 흡수되고, 특정 영역의 빛을 조사함으로써 PS가 활성화된다. PDT는, 세포 내 수많은 항산화 방어 메커니즘을 압도하고 세포의 거대분자에 산화적 손상을 야기하는, 일중항산소 및 다른 반응산소종(ROS)의 생산을 통해 세포를 사멸시킨다[Weishaupt KR et al., Cancer Res, 1976, 36: 2326-2329].
PDT 도중 형성되는 세포독성 작용제인 일중항산소와 ROS를 발생시키는 광화학적 반응은 변형된 야블론스키 다이아그램(도 1)에 의해 나타내어진다. 요컨대, 빛의 흡수 이후에 PS는 반감기가 짧은 여기된 일중항 상태[S1, (~10-6s)]를 통해 바닥 일중항 상태(S0)로부터 전기적으로 여기된 삼중항 상태[T1, (~10-2s)]로 변형된다. PDT에 관한 특별히 중요한 것은 반감기가 짧은 여기된 일중항 상태 PS가 계간 교차(ISC)의 비-방사성 과정을 수행할 수 있다는 점이다. 이는 스핀 반전을 필요로 하여 이에 의하여 PS를 전자 스핀 평행을 가지는 상대적으로 반감기가 긴 여기된 삼중항 상태(T1)으로 전환하기 때문에 스핀-금지(spin-forbidden) 과정이다. 어떠한 '금지' 경로도 '허용' 과정보다 가능성이 더 낮으나, 우수한 PS는 매우 높은 효율로 '금지' ISC 경로를 수행한다. 여기된 삼중항 상태 PS는 두 가지 종류의 반응을 수행할 수 있다[Macdonald JI et al., J Porphyrins Phthalocyanines, 2001, 5: 105-129.]. 첫째, 이는 산소와 상호작용 이후에 슈퍼옥사이드 이온, O2 -과 같은 과산화 생성물을 생산할 수 있는 라디칼 및 라디칼 이온을 형성하기 위하여 생물학적 기질과 함께 전자-전달 과정에 참여할 수 있다[타입 I 반응]. 양자택일적으로, 이는 안정한 삼중항 산소(3O2)가 반감기는 짧으나 큰 반응성을 가지는 일중항 산소(1O2)로 전환하게 되는 타입 II 반응으로서 알려진 광화학적 과정을 수행할 수 있다.
더 나아가, PDT의 종양세포치사 효과는 암 덩어리 내의 빛 침투 깊이와 관련된다. 조직 내 빛의 영향은 거리에 대해 기하급수적으로 감소한다[Moser JG. In Photodynamic Tumor Therapy-2 nd & 3 rd Generation Photosensitizers. Harwood Academic Publishers, London, 1997: 3-8]. 조직의 약화는 최적의 흡수, 내인성 분자 및 약물 발색단 자체에 의한 산란에 의해 영향을 받는다. 피부 조직의 최대 투과율은 700-800 nm 영역에 있고, 이 영역 내에서 최대 흡수를 나타내는 광감작제의 개발이 요구된다. 630 nm에서의 유효한 침투는 1 내지 3 mm 사이인데 반하여, 700-850 nm에서는 최소한 6 mm의 빛 침투가 관찰되었다. 따라서, 이상적인 PS는 근적외선 영역에서 강한 흡수를 나타내야만 한다.
PS는 빛의 흡수 하에서 다른 화학종의 화학적 또는 물리적 변형을 유도하는 화학종으로서 정의된다. 임상의와 화학자는 이상적인 PS에 대해 다른 견해를 가진다[Kirchner C et al., Nano Lett, 2005, 5, 331.]. 예를 들어, 화학자는 높은 절멸 정도와 일중항 산소의 높은 양자 수율을 보다 더 강조할 수 있음에 반하여 임상의는 낮은 독성과 높은 선택성을 더욱 강조할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 양쪽 모두 임상적 PDT와 이상적 PS가 임상적으로 적절하고 Allison 등[Zheng H. Technology in Cancer Research & Treatment, 2005, 4: 283-293]과 Castano 등[Anna C et al., Photochem Photobiol, 2006, 82: 617-625]에 의해 보고된 하기 기준의 몇몇을 최소한 충족해야만 한다는 점에 동의한다.
1. 가시광선 스펙트럼의 적색 부분에서의 강한 흡수(>650 nm),
2. 94 kJ/mol-1보다 큰 삼중항 에너지를 가진 삼중항 형성의 높은 양자 수율,
3. 일중항 산소 생성의 높은 양자 수율(반감기가 긴 여기 상태),
4. 낮은 암흑(dark) 독성,
5. 종양 조직 대 건강한 조직, 특별히 피부에서의 농축 선택성을 나타내야만 함; 일반적인 피부 감작은 피해야만 함; 특정 치료 모달리티는 피부 감작을 필요로 하며, 이때 피부의 급속한 감작 및 탈감작이 바람직함,
6. 약물의 단순한 제형화; 제형화된 약물은 긴 저장 기간을 가져야만 함,
7. 체내로부터 급속하게 제거되는 약물 동력학적 프로파일,
8. 상기 특성들의 향상을 가능하게 하는 용이한 유도체화(측쇄)의 선택권,
9. 쉽게 입수가능한 출발 물질로부터의 용이한 합성, 다수-킬로그램 스케일로의 쉬운 변형,
10. 1O2 양자 수율을 감소시키는 것으로 인한 체내에서의 자기-응집이 없음.
PDT 분야에서, 테트라피롤 거대 고리가 PS로서 종종 사용된다. 가시광선 스펙트럼의 적색 영역에서의 강한 흡수는 이것이 더 두꺼운 종양의 치료를 가능하게 하기 때문에 효과적인 광감작제를 위한 매우 바람직한 특징이다[Johnson CK et al., Tetrahedron Lett, 1998, 39: 4619-4622]. 이러한 이유 때문에, 포르피린, 클로린, 박테리오클로린, 포피신, 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌, 그리고 확장된 포르피린과 같은 테트라피롤이 합성되어지고 PDT 효능이 평가되어 왔다. PS는 이들의 화학적 구조와 유래에 의하여 분류될 수 있다. 일반적으로 이들은 3 개의 넓은 부류로 나뉠 수 있다: (i) 포르피린-기초(예를 들어 포토프린, ALA/PpIX 및 BPD-MA), (ii) 클로린-기초(예를 들어 퍼푸린 및 박테리오클로린), 및 (iii) 염료(예를 들어 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌).
한편, 플래티늄(II) 복합체의 생물학적 활성은 Rosenberg et al에 의해 1969년에 발견되었다. cis-디아민디클로로플래티늄(II)(또는 시스플라틴)은 광범위한 고형 암의 치료를 위한 가장 중요한 화학요법제 중 하나가 되어왔다. 이러한 화합물에 관련된 유독한 부작용으로 인하여 2세대의 약 개발이 뒤따랐다. 이들 중에, cis-디아민(1,1시클로부탄 디카르복실아토) 플래티늄(II)(또는 카보플라틴)이 임상시험에 들어갔다[Horst, K. et al., J. Phot. chem and Phot. bio A: Chem. 1998, 114, 193-195].
파클리탁셀은 암 화학요법에 사용되는 유사분열 억제제이다. 이는 Monroe E. Wall과 Mansukh C. Wani가 탁수스 브레이폴리아(Taxus breyifolia)로서 '탁솔(taxol)'로 명명된 태평양 주목 나무의 껍질로부터 분리해낸 1967년에 발견되었다. 파클리탁셀은 현재 폐, 난소, 유방암, 두경부암, 및 카포시육종의 진행된 형태를 가진 환자들을 치료하는데 사용된다. 1988년까지는 특별히 Potier의 간행물을 통해, Holton에게 있어 실제적 반-합성의 생산 루트가 중요할 것이라는 점이 명백하였다. 1992년에, Holton은 80% 수율을 가진 향상된 공정을 특허받았다. 최근 몇 년간, 광범위한 연구가 그것의 투약을 바꿈으로써 파클리탁셀의 부작용을 완화하는 방법을 찾기 위해 수행되어 왔다. DHA-파클리탁셀, PG-파클리탁셀, 및 종양-활성화 파클리탁셀 전구약물이 계속되는 테스트를 수행하였으며, 실제적으로 광범위한 임상적 사용으로 도입되는 중에 있다.
화학요법제는 급속하게 분열하는 세포를 죽이는데 가장 효과적이다. 불행하게도, 화학요법제는 암 세포와 정상 세포 간의 차이를 알지 못한다. 이의 임상적 유용성은 신독성, 이독성 및 신경독성과 같은 심한 부작용과 약물 내성의 발생으로 인해 자주 제한되어 왔다[Mauro, V. de .A et al., J. Braz. Chem. Soc. 2006, 17, 1266-1273]. 시스-플래티늄 및 파클리탁셀의 독성을 감소시키고 내성을 피하기 위하여 새로운 세대의 약물을 개발할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 세포 증식 억제 활성을 갖는 항암 화학요법제와 광역학적 활성을 갖는 클로린 유도체를 접합시킴으로써 항암 화학요법제의 독성을 감소시키고 내성을 피할 수 있는 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포 증식 억제 활성을 갖는 항암 화학요법제와 광역학적 활성을 갖는 클로린 유도체를 접합시킴으로써 항암 화학요법제의 독성을 감소시키고 내성을 피할 수 있는 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 제공한다.
본 발명에서, 상기 항암 화학요법제는 시스플라틴, 파클리탁셀 등의 세포 증식 억제 활성을 가진 항암 화학요법제인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 클로린 유도체는 메틸페오포르비드-a, 피로페오포르비드-a 또는 메틸피로페오포르비드-a인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체는 세포 증식 억제 활성을 갖는 항암 화학요법제와 광역학적 활성을 갖는 클로린 유도체를 접합시킴으로써 항암 화학요법제의 독성과 내성을 감소시키고 광감작제로서의 독성을 감소시킬 뿐만 아니라 선택성이 증진되어 정상 세포에 대한 부작용을 최소화하면서 암세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있다.
바람직한 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 제공한다.
Figure 112010040924341-pat00001
바람직한 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 2의 구조를 가지는 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 제공한다.
Figure 112010040924341-pat00002
바람직한 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 3의 구조를 가지는 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 제공한다.
Figure 112010040924341-pat00003
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체의 제조방법을 제공한다:
링커 작용기를 가진 클로린 유도체를 제조하는 단계; 및
상기에서 제조된 링커 작용기를 가진 클로린 유도체에 항암 화학요법제를 접합시켜 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 얻는 단계.
본 발명에서, 클로린 유도체는 광역학적 치료 효과를 나타내기 위하여 빛에 의하여 활성화될 수 있는 화합물이다.
본 발명에서, 상기 링커 작용기는 바람직하기로는 에틸렌디아민이다.
본 발명에서, 상기 클로린 유도체는 스피루리나 맥시마(Spirulina maxima) 조류로부터 추출된 것일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 함유하는 광감작제를 제공한다.
본 발명에서, 상기 광감작제는 650 nm 내지 800 nm 범위의 광선에 대하여 광감작 활성을 보이는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 암 치료용 조성물은 광역학 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 암은 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 및 신경계의 암으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 암 치료용 조성물은 정맥 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 두개 내 주사, 종양 내 주사, 상피내 주사, 피부관통전달, 식도 투여, 복부 투여, 동맥 주사, 관절내 주사, 및 구강내 투여로 이루어진 군 중에서 선택된 경로로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 통상의 방법에 따라 멸균 수용액, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼 또는 유제 등의 형태의 비경구 투여를 위한 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우 보통 사용하는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 접합체의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 접합체는 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001~100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 함유하는 광감각제를 유효성분으로 포함하는 조성물; 및
파장이 650 nm 내지 800 nm 범위인 광선을 조사하기 위한 광원을 포함하는, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
클로린(chlorin)은 하기 화학식 4의 구조를 가지는 화합물로서 중심에 4개의 메틴 결합(linkage)으로 연결된 피롤과 피롤린으로 이루어진 거대한 헤테로고리 방향성 환이다. 마그네슘-함유 클로린은 클로로필로 불리며, 엽록체 내 중심 광감작 색소이다.
Figure 112010040924341-pat00004
본 발명에서, 클로린 유도체는 상기 클로린을 기본 골격 구조로 가지는 화합물을 의미한다. 클로린 및 클로린 유도체는 이들의 광감작성 때문에 광역학적 치료에서 광감작제로서 효과적으로 이용된다. 특히, 클로린 및 클로린 유도체는, 한편으로는 우수한 스펙트럼 특성과 낮은 독성을 가지며, 다른 한편으로는 다양한 화학적 전환이 수행되는 것을 가능하게 하는 많은 반응 중심점들을 가지기 때문에, 광감작제를 합성하는데 더욱 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 클로린 유도체로는, 그 중 특히 클로로필로부터 얻을 수 있는 메틸페오포르비드-a, 피로페오포르비드-a 및 메틸피로페오포르비드-a 가 있으나 이들 화합물에 제한되는 것은 아니다. 상기 메틸페오포르비드-a, 피로페오포르비드-a 및 메틸피로페오포르비드-a는 이들이 포토프린 II　보다 ~670 nm에서 훨씬 더 긴 적색 광선으로 활성화되고 장기간의 정상 조직 광독성을 덜 생산할 수 있기 때문에 잠재성이 있는 새로운 화합물의 한 종류로서 사용한다. 본 발명에서 사용한 클로린 유도체는 낮은 농도에서도 PDT 효과가 좋고, 종양 내 선택성이 높으며, 추출 과정에서 수율이 높아 상업적 유용성이 뛰어난 장점을 가진다. 그러나, 농도가 높아질수록 암흑 독성을 나타내게 된다.
본 발명의 일실시예에서는 클로린 유도체로서 천연 클로린의 혼합물을 생산하는 조류의 한 종류인 스피루리나 맥시마(Spirulina Maxima)로부터 얻어지는 메틸페오포르비드-a(MP-a), 피로페오포르비드-a 및 메틸 피로페오포르비드-a(MPP-a)를 본 발명의 접합체를 제조하기 위한 출발 물질로서 사용하였다.
한편, 항암 화학요법제(chemotherapeutic agent)는 종양세포, 즉 암의 증식을 억제하는 성질을 갖는 화학물질을 총칭한다. 항암 화학요법제는 가능한 정상세포의 손상 없이 유해한 종양세포를 파괴하는 것을 그 목적으로 하지만 실질적으로 암세포가 정상세포와 유사하기 때문에 정상세포에 대한 독성도 함께 가지고 있는 경우가 많다.
본 발명에서는 대표적인 항암 화학요법제로서 시스플라틴과 파클리탁셀을 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 클로린 유도체로서 클로로필로부터 얻을 수 있는 클로린 유도체와, 시스 플라틴 및 파클리탁셀과 같은 대표적인 항암 화학요법제의 접합체를 제공한다.
이러한 접근을 통해 세포 증식 억제 활성의 항암 화학요법제와 광역학적 활성의 클로린 유도체를 결합시킴으로써 항암 화학요법제에 의한 '세포 증식 억제 치료'와 클로린 화합물에 의한 '광역학적 치료'의 조합이 이루어지고 사실상 이들 작용의 상승작용이 일어나게 된다.
본 발명에서 "세포 증식 억제", "세포 성장 저해" 또는 이와 유사한 형태의 용어는 세포수의 증가현상을 억제하는 것으로 어느정도까지의 모든 저해, 예를 들어 약 20 % 이상, 약 50 % 이상, 약 90 % 이상, 약 99 % 이상과 완벽한 억제 즉, 100 % 저해를 포함하는 뜻이다.
본 발명에서 "광역학 치료(PDT)"란 광감작제(약물), 빛 그리고 산소의 조합에 의한 치료를 말한다. 구체적으로, 먼저 광감작제를 인체에 투여하게 되면 광감작제가 병소 즉, 종양 조직에 축적되게 되고 이후 가시광선을 조사하게 되면 일중항산소의 생산을 최대화하여 종양이 선택적으로 파괴되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 시스플라틴, 파클리탁셀과 같은 항암 화학요법제와 천연 클로린, 특별히 가장 풍부한 클로로필 a의 유도체를 결합시켜 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 합성한다. 이러한 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체는 항암 화학요법제 부분의 세포 증식 억제 활성과, 방사선 조사 하에 클로린 유도체 광감작제의 광역학적 활성을 가져야만 한다.
본 발명에서, 링커 작용기는 항암 화학요법제와 클로린 유도체 각각의 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 선택해야 한다. 본 발명에서는 이러한 링커 작용기로서 에틸렌디아민을 사용하였으나, 항암 화학요법제와 클로린 유도체 각각의 활성에 영향을 미치지 않으면서 상기 두 화합물을 접합시킬 수 있는 링커 작용기라면 어느 것이나 사용 가능하다.
본 발명의 구체적 실시예에서, 항암 화학요법제와 클로린 유도체는 접합된 후 각각 그 활성 즉, 세포증식 억제활성과 빛이 있을 때 광감작제로서의 활성이 보존됨을 확인하였다.
구체적으로, 도 23과 도 24를 보면 세포성장 억제 효과면에서 PDT를 실시하지 않았을 때 각각 단독 물질에 비해 그 이상의 효과가 나타났으며, 도 25를 보면 광감작 활성 면에서 PDT를 실시한 경우 각각의 단독 물질들과 동등한 효과를 나타냄을 확인하였다.
특히, 도 24를 보면 PDT를 실시하지 않았을 때 즉, 레이저가 없는 상태에서 시스플라틴 단독 물질이 암세포 또는 정상세포에 대해 세포성장 저해 효과가 없고 클로린 유도체 또한 자체 독성을 나타내지 않는 농도인 0.25uM에서 본 발명의 접합체는 암세포에 대하여 세포 성장 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 즉, 0.25uM의 농도만으로도 본 발명의 접합체는 암세포에 대해 세포성장 억제 효과를 나타낸다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 접합체는 항암 화학요법제 단독물질에 비하여 낮은 농도로도 세포증식 억제 활성이 우수하므로 정상 세포에 대한 독성은 감소되고 낮은 농도에 대한 내성이 감소되어 종래 항암 화학요법제의 단점으로 알려진 정상세포에 대한 독성과 낮은 농도일 때 세포증식 억제효과가 없는 내성을 극복할 수 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 접합체는 레이저가 없을 때 낮은 농도로도 암치료 효과가 뛰어나 정상세포에 대한 부작용 없이 암치료용 조성물로서 사용할 수 있다.
한편, 도 26을 보면 본 발명의 접합체는 빛이 없을 때 클로린 유도체 단독에 비하여 5-10uM의 고농도에서도 낮은 암흑독성을 나타냄을 알 수 있다. 광감작제는 빛이 없을 때 세포 독성이 없고 빛이 있을 때만 세포 독성을 나타내는 것이 중요하다. 즉, 암흑 독성이 낮아야 한다. 본 발명의 접합체는 고농도에서도 낮은 암흑독성을 나타내기 때문에 고농도가 필요한 항암 화학요법제에 접합하여 광역학과 화학요법을 동시에 수행하여 효율적으로 세포증식을 억제하여 암을 치료할 수 있다.
더 나아가, 도 28을 보면 0.5uM에서는 클로린 유도체 단독 물질과 본 발명의 접합체가 모두 포화 축적되었으나 이보다 낮은 농도인 0.25uM에서는 클로린 유도체 단독 물질에 비해 본 발명의 접합체가 암세포에 더욱 잘 축적되는 것을 알 수 있다.
또한, 도 29를 보면 본 발명의 접합체는 클로린 유도체 단독 물질에 비해 체내로부터 빨리 제거될 수 있음을 알 수 있다. 이는 처리 48시간 이후에 확연히 차이가 났다.
본 발명에서 광감작제로서 사용한 클로린 유도체는 다른 광감작제에 비해 낮은 독성을 나타내고 종양 선택성이 우수한데, 상기 내용을 종합해 볼 때 본 발명의 접합체는 이러한 클로린 유도체에 항암 화학요법제가 접합됨에 따라 클로린 유도체 단독 물질에 비하여 암흑독성도 더욱 낮고 체내에서의 종양 선택성이 더욱 증가하며 체내로부터의 배출 시간도 더욱 현저히 빨라졌다. 따라서, 본 발명의 접합체는 암치료를 위한 광감작제로서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다(도 2):
클로로필-a로부터 메틸페오포르비드-a를 합성하는 단계;
상기 메틸페오포르비드-a로부터 메틸 피로페오포르비드-a를 합성하는 단계;
상기 메틸 피로페오포르비드-a로부터 피로페오포르비드-a를 합성하는 단계;
상기 피로페오포르비드-a로부터 173-N-에틸렌디아민 피로페오포르비드-a를 합성하는 단계; 및
상기 173-N-에틸렌디아민 피로페오포르비드-a에 항암 화학요법제를 결합시키는 단계.
본 발명의 바람직한 일 구현예로서, 항암 화학요법제가 시스플라틴인 경우 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체를 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다(도 3):
클로로필-a로부터 메틸페오포르비드-a를 합성하는 단계;
상기 메틸페오포르비드-a로부터 메틸 피로페오포르비드-a를 합성하는 단계;
상기 메틸 피로페오포르비드-a로부터 피로페오포르비드-a를 합성하는 단계;
상기 피로페오포르비드-a로부터 173-N-에틸렌디아민 피로페오포르비드-a를 합성하는 단계; 및
상기 173-N-에틸렌디아민 피로페오포르비드-a에 K2PtCl4를 반응시켜 피로페오포르비드-a 173-N-에틸렌디아민 플래티늄 클로라이드를 합성하는 단계.
본 발명의 바람직한 일 구현예로서, 항암 화학요법제가 파클리탁셀인 경우 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체를 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다(도 4):
클로로필-a로부터 메틸페오포르비드-a를 합성하는 단계;
상기 메틸페오포르비드-a로부터 메틸 피로페오포르비드-a를 합성하는 단계;
상기 메틸 피로페오포르비드-a로부터 피로페오포르비드-a를 합성하는 단계; 및
상기 피로페오포르비드-a에 파클리탁셀을 반응시켜 피로페오포르비드-a-파클리탁셀 접합체를 합성하는 단계.
이하, 본 발명의 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 제조하는 방법을 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명의 바람직한 일 구현예로서, 항암 화학요법제가 시스플라틴인 경우 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체를 제조하는 방법을 상세히 설명한다.
스피루리나 맥시마(Spirulina maxima) 조류에 아세톤을 처리하여 클로로필 a를 추출 분리하고 이를 산성 하에서 메탄올로 처리하여 메틸페오포르비드-a(1 MPa)를 얻는다. 이 과정을 간략히 나타내면 하기 반응식 1과 같다.
[반응식 1]
Figure 112010040924341-pat00005
본 발명에서, 클로로필 a는 스피루리나 맥시마로부터 분리하여 얻을 수도 있고 상업적으로 입수 가능한 것을 사용할 수도 있다.
그 다음, 메틸페오포르비드-a를 콜리딘 내에서 환류시켜 메틸 피로페오포르비드-a(2 MPPa)를 얻는다. 이 과정을 간략히 나타내면 하기 반응식 2와 같다.
[반응식 2]
Figure 112010040924341-pat00006

이후, 메틸 피로페오포르비드-a를 THF 내에서 HCl로 처리하여 피로페오포르비드-a(3 PPa)를 얻는다. 이 과정을 간략히 나타내면 하기 반응식 3과 같다.
[반응식 3]
Figure 112010040924341-pat00007

그 다음, 피로페오포르비드-a(PPa)를 N-히드록시숙시닉이미드(NHS) 및 디시클로헥실 카르보디미드(DCC)와 함께 디클로로메탄에 용해시킨 후 트리에틸아민을 첨가하여 반응시킴으로써 PPa-NHS를 얻고, 여기에 tert-Butoxycarbonyl (Boc)으로 보호된 에틸렌 디아민(EDA)를 첨가하여 반응시킴으로써 PPa-EDA-Boc을 얻은 다음, 여기에 트리플루오르아세트산(TFA)을 첨가하여 반응시킴으로써 173-N-에틸렌디아민 피로페오프로비드-a(173-N-EDA-PPa, 4)를 얻는다. 이 과정을 간략히 나타내면 하기 반응식 4와 같다.
[반응식 4]
Figure 112010040924341-pat00008
(I) 디클로로메탄 내 디시클로헥실 카르보디이미드 (DCC), N-히드록시숙시닉이미드 (NHS), 및 트리에틸아민(TEA); (II) 디클로로메탄 내 EDA-Boc, (III) 디클로로메탄 내 트리플루오르아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA).
마지막으로, 173-N-에틸렌디아민 피로페오프로비드-a에 시스플라틴을 결합시키게 된다.
시스플라틴을 결합시키기 위하여 173-N-에틸렌디아민 피로페오프로비드-a에 K2PtCl4를 반응시켜 모노-피로페오포르비드-a-173-N-(2-아미노에틸)아미드 플래티늄 클로라이드[mono-Pyropheophorbide-a-173-N-(2-aminoethyl)amide platinum chloride, 5] 또는 디-피로페오포르비드-a-173-N-(2-아미노에틸)아미드 플래티늄 클로라이드[di-Pyropheophorbide-a-173-N-(2-aminoethyl)amide platinum chloride, 6]를 얻는다. 173-N-에틸렌디아민 피로페오프로비드-a의 말단 아민기가 K2PtCl4의 Pt와 결합하여 링커 역할을 감당하게 된다. 이 과정을 간략히 나타내면 하기 반응식 5와 같다.
[반응식 5]
Figure 112010040924341-pat00009

둘째로, 본 발명의 바람직한 다른 일 구현예로서, 항암 화학요법제가 파클리탁셀인 경우 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체를 제조하는 방법을 상세히 설명한다.
파클리탁셀을 결합시키는 경우에도 스피루리나 맥시마(Spirulina maxima) 조류에서 클로로필 a를 추출 분리하고 이를 산성 하에서 메탄올로 처리하여 메틸페오포르비드-a(1 MPa)를 얻은 다음, 메틸페오포르비드-a를 콜리딘 내에서 환류시켜 메틸 피로페오포르비드-a(2 MPPa)를 얻는 이후, 메틸 피로페오포르비드-a를 THF 내에서 HCl로 처리하여 피로페오포르비드-a(3 PPa)를 얻는 단계까지는 상기 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체 제조 방법과 동일하다.
이후, 상기 피로페오포르비드-a에 곧바로 파클리탁셀을 반응시켜 피로페오포르비드-a-파클리탁셀 접합체(PPa-taxol, 7)를 얻는다. 이 과정을 간략히 나타내면 하기 반응식 6과 같다.
[반응식 6]
Figure 112010040924341-pat00010
본 발명은 세포 증식 억제 활성을 갖는 항암 화학요법제와 광역학적 활성을 갖는 클로린 유도체를 접합시킴으로써 종양세포의 증식을 억제하면서 동시에 광역학적 치료를 할 수 있으며, 항암 화학요법제의 독성을 감소시키고 내성을 피할 수 있으므로 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 변형된 야블론스키 다이아그램을 나타낸 것이다. 여기에서 1은 흡수, 2는 비방사성 붕괴, 3은 형광, 4는 계간 교차, 5는 인광, 6은 에너지 전달을 의미한다.
도 2는 본 발명의 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 제조하는 과정을 간략히 나타낸 흐름도이다.
도 3은 시스-플라틴과 클로린 유도체의 접합체 합성 과정을 간략히 나타낸 것이다.
도 4는 파클리탁셀과 클로린 유도체의 접합체 합성 과정을 간략히 나타낸 것이다.
도 5는 메틸페오포르비드-a의 UV 스펙트럼이다.
도 6은 메틸페오포르비드-a의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 7은 메틸 피로페오포르비드-a의 UV 스펙트럼이다.
도 8은 메틸 피로페오포르비드-a의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 9는 메틸 피로페오포르비드-a의 질량 분석 스펙트럼이다.
도 10은 피로페오포르비드-a의 UV 스펙트럼이다.
도 11은 피로페오포르비드-a의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 12는 피로페오포르비드-a의 질량 분석 스펙트럼이다.
도 13은 173-N-에틸렌디아민 피로페오프로비드-a의 UV 스펙트럼이다.
도 14는 173-N-에틸렌디아민 피로페오프로비드-a의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 15는 173-N-에틸렌디아민 피로페오프로비드-a의 질량 분석 스펙트럼이다.
도 16은 173-N-에틸렌디아민 피로페오프로비드-a의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 17은 피로페오포르비드-a 173-N-에틸렌디아민 플래티늄 클로라이드의 UV 스펙트럼이다.
도 18은 피로페오포르비드-a 173-N-에틸렌디아민 플래티늄 클로라이드의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 19는 피로페오포르비드-a 173-N-에틸렌디아민 플래티늄 클로라이드의 질량 분석 스펙트럼이다.
도 20은 피로페오포르비드-a 173-N-에틸렌디아민 플래티늄 클로라이드의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 21은 피로페오포르비드-a-파클리탁셀 접합체의 MALDI-질량 스펙트럼이다.
도 22는 피로페오포르비드-a-파클리탁셀 접합체의 HPLC 결과를 나타낸다.
도 23은 PDT를 실시하지 않은 경우 0.06125, 0.125 및 0.25uM에서 본 발명의 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체에 의한 암세포 성장 억제 효과를 접합되기 전의 클로린 유도체 및 시스플라틴 각각의 암세포 성장 억제 효과와 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 24는 PDT를 실시하지 않은 경우 0.25 및 0.5uM에서 본 발명의 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체에 의한 암세포 성장 억제 효과를 접합되기 전의 클로린 유도체 및 시스플라틴 각각의 암세포 성장 억제 효과와 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 PDT를 실시한 경우 0.25 및 0.5uM에서 본 발명의 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체에 의한 암세포 성장 억제 효과를 접합되기 전의 클로린 유도체 및 시스플라틴 각각의 암세포 성장 억제 효과와 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 26은 PDT를 실시하지 않은 경우 5 및 10uM에서 본 발명의 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체에 의한 암세포 성장 억제 효과를 접합되기 전의 클로린 유도체 및 파클리탁셀 각각의 암세포 성장 억제 효과와 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 27은 PDT를 실시한 경우 5 및 10uM에서 본 발명의 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체에 의한 암세포 성장 억제 효과를 접합되기 전의 클로린 유도체 및 파클리탁셀 각각의 암세포 성장 억제 효과와 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 28은 본 발명의 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체의 종양 선택성을 조사하기 위하여 공초점 현미경 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 본 발명의 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체의 종양에서의 배출 시간을 조사하기 위하여 공초점 현미경 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 스피루리나 맥시마 조류로부터 메틸페오포르비드-a(MPa, 화합물 1)의 합성
건조된 스피루리나 맥시마(Spirulina maxima) 조류 500 g을 2 시간 동안 질소 하에서 2 L의 아세톤으로 환류시켰다. 그 다음 상청액을 뜨거울 때 뷰너 깔때기 상에서 와트만 여과지로 여과시키고, 여분의 아세톤을 상기에서 남은 고형물에 첨가하였다. 상기 동일한 과정에 따라 추출과 여과 과정을 3회 반복하였다. 녹색 여과액을 증발시키고 잔사물을 300 ml의 아세톤에 다시 용해시킨 후 냉장고에서 냉각시킨 다음 적색의 고형 불순물을 제거하기 위하여 여과하였다. 페오피틴-a를 함유하는 여과액을 증발시키고, 질소 하, 어두운 곳, 실온에서 12.5 시간 동안 5% 황산의 메탄올 용액(500 ml)으로 처리하였다. 상기 용액을 디클로로메탄(~500 ml)으로 희석하고 물(~500 ml)로 헹구고, 10% 탄산수소나트륨 수용액(~500 ml)으로 헹군 다음 다시 물로 3회 헹구었다. 유기층을 분리해내고 무수 황산나트륨 상에서 건조한 다음 건조한 상태가 되도록 증발시켰다. 잔사물을 실리카 겔 60(230-400 메쉬) 상에서 디클로로메탄 내 2% 아세톤으로 용출시켜 컬럼 크로마토그래피함으로써 정제하였다. 생성물을 디클로로메탄/메탄올로 재결정시켰다. 생성물의 UV 스펙트럼을 측정한 결과 도 5와 같았다. 도 5를 보면, 클로린 고리의 2개의 베이스 피크가 λ412.5 (1.52) nm 및 λ667.6(0.655) nm에서 관찰되었으며, 다른 작은 피크들이 λ - 507,9nm; 537,7nm; 610,4nm에서 관찰되었다. 한편, 생성물(MPa)의 500 MHz 1H NMR 스펙트럼을 클로로포름 내에서 측정한 결과를 도 6에 나타내었다. δ 및 J H-H 값을 이용하여 정해진 시그널은 1D 양성자 스펙트럼에 마크되었다. 총 39개의 양성자에 해당하는 δ -2 내지 10 영역의 시그널은 NMR 스펙트럼 결과로부터 11개의 단일, 4개의 다중, 3개의 이중 및 1개의 4중 시그널로서 관찰되었으며, 이로부터 메틸페오포르비드-a가 형성됨을 확인할 수 있었다. 2개의 NH 양성자는 빠른 교환으로 인해 대략 - 4 ppm에서 넓은 시그널로 나타났다.
수율: 0.4%. R f : 불순물로부터 분리된 순수한 MPa에 대하여 0.4(디클로로메탄 내 2% 아세톤). UV-vis (CH 2 Cl 2 ): λ max, nm (log ε) 667.6 (0.655), 610.4 (0.124), 537.7 (0.145), 507.9 (0.158), 412.5 (1.52). 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 , TMS int ): δ H, ppm 9.50 (1H, s, 5-meso-H), 9.35 (1H, s, 10-meso-H), 8.55 (1H, s, 20-meso-H), 7.97 (1H, m, 31-CH), 6.30 및 6.19 (2H, dd, 32-CH 2 ), 6.25 (1H, s, 132-CH), 4.46 (1H, m, 18-CH), 4.21 (1H, m, 17-CH), 3.88 (3H, s, 134-OCH 3 ), 3.65 (2H, q, 81-CH 2 ), 3.68 (3H, s, 174-OCH 3 ), 3.57 (3H, s, 121-CH 3 ), 3.39 (3H, s, 21-CH 3 ), 3.21 (3H, s, 71-CH 3 ), 2.63-2.17 (4H, m, 171 및 172 - 2 × CH 2 ), 1.81 (3H, d, 181-CH 3 ), 1.68 (3H, t, 82-CH 3 ), 0.53 및 -1.63 (2H, 각각 s, br, 2 × NH).
실시예 2: 메틸페오포르비드-a로부터 메틸피로페오포르비드-a(MPPa, 화합물 2) 합성
메틸페오포르비드-a(1 g, 1.65 mmol)를 콜리딘(100 ml, 재증류된 것, KOH 상에서 보관된 것)에 용해시켜 2.5 시간 동안 환류시켰다. 냉각시킨 후, 상기 용액을 메틸 클로라이드(methyl chloride, MC)로 희석시키고 2N HCl(5×200 ml)로 세척한 다음 물로 2 번 세척하였다. 복합 유기 상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 용매를 진공 로테이터로 제거하였다. 잔사물을 실리카 겔 60(230-400 메쉬) 상에서 MC 내 2% 아세톤(acetone, Ace)으로 용출하여 정제하고, 메틸 클로라이드(methyl chloride, MC)/헥산(hexane, Hex)으로 재결정시켰다. 생성물의 UV 스펙트럼을 측정한 결과 도 7과 같았다. 도 7을 보면, 클로린 고리의 2개의 베이스 피크가 λ414.1 nm 및 λ667.7 nm에서 관찰되었으며, 다른 작은 피크들이 λ =508,5nm; 539,2nm and 610,5nm에서 관찰되었다. 한편, 생성물(MPPa)의 500 MHz 1H NMR 스펙트럼을 클로로포름 내에서 측정한 결과를 도 8에 나타내었다. δ 및 J H-H 값을 이용하여 정해진 시그널은 1D 양성자 스펙트럼에 마크되었다. 총 37개의 양성자에 해당하는 δ -2 내지 10 영역의 시그널은 NMR 스펙트럼 결과로부터 10개의 단일, 4개의 다중, 3개의 이중 및 2개의 4중 시그널로서 관찰되었으며, 이로부터 이전 화합물과 다른 2개의 양성자에 의해 메틸피로페오포르비드-a가 형성됨을 확인할 수 있었다. 2개의 NH 양성자는 빠른 교환으로 인해 대략 - 4 ppm에서 넓은 시그널로 나타났다. 아울러, 생성물(MPPa)의 질량 스펙트럼을 도 9에 나타내었다. 생성물의 분자량은 548,7g/mol으로서 계산되었으며, EI-질량 분석법을 통한 분석을 통해 549 (M+, 100)로서 검출되었다.
수율: 85.15%. R f : 0.28 (MC 내 2% Ace). UV-vis (CH 2 Cl 2 ): λ max, nm (log ε) 667.7 (0.24), 610.5 (0.036), 539.2 (0.043), 508.5 (0.049), 414.1 (0.558). 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 , TMS int ): δ H, ppm 9.46 (1H, s, 5-meso-H), 9.35 (1H, s, 10-meso-H), 8.56 (1H, s, 20-meso-H), 8.04 (1H, m, 31-CH), 6.31 및 6.19 (각각 1H, dd, 32-CH 2 ), 5.31 및 5.15 (2H, q, J=20.1 Hz, 132-CH 2 ), 4.51 (1H, m, 18-CH), 4.29 (1H, m, 17-CH), 3.66 (5H, s, 174-OCH 3 및 81-CH 2 서로 다른 것과 겹침), 3.63 (3H, s, 121-CH 3 ), 3.41 (3H, s, 21-CH 3), 3.22 (3H, s, 71-CH 3 ), 2.70-2.58 (2H, m, 171-CH 2 ), 2.33-2.31 (2H, m, 172-CH 2 ), 1.82 (3H, d, 181-CH 3 ), 1.69 (3H, t, 82-CH 3 ), 0.44 및 -1.70 (각각 1H, br, s, 2×NH).
실시예 3: 메틸피로페오포르비드-a로부터 피로페오포르비드-a(PPa, 화합물 3) 합성
메틸피로페오포르비드-a (1.166 g, 2.125 mmol)를 THF(230 ml)에 용해시켰다. 4N HCl의 수용액(580 ml)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 4 시간 동안 질소 대기 하, 실온에서 교반하였다. 디클로로메탄(150 ml)을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 수용성 층을 분리해내고 유기 층을 산을 없애기 위하여 물로 수회 세척하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과한 다음 농축하였다. 잔사물을 디클로로메탄/헥산으로 재결정시켰다. 잔사물을 실리카 겔 60(230-400 메쉬) 상에서 MC 내 5% MeOH로 용출시켜 정제하였다. 생성물의 UV 스펙트럼을 측정한 결과 도 10과 같았다. 도 10을 보면, 클로린 고리의 2개의 베이스 피크가 λ413.9 nm 및 λ667.5 nm에서 관찰되었으며, 다른 작은 피크들이 λ =508,9 nm; 539 nm; 609.8 nm에서 관찰되었다. 한편, 생성물(PPa)의 500 MHz 1H NMR 스펙트럼을 클로로포름 내에서 측정한 결과를 도 11에 나타내었다. δ 및 J H-H 값을 이용하여 정해진 시그널은 1D 양성자 스펙트럼에 마크되었다. 총 34(1)개의 양성자에 해당하는 δ -2 내지 10 영역의 시그널은 NMR 스펙트럼 결과로부터 8개의 단일, 5개의 다중, 3개의 이중 및 2개의 4중 시그널로서 관찰되었으며, 이로부터 이전 화합물과 다른 2개의 양성자에 의해 피로페오포르비드-a가 형성됨을 확인할 수 있었다. 카르복실기의 양성자는 상기 양성자가 중수소에 의해 교환되기 때문에 나타나지 않았다. 2개의 NH 양성자는 빠른 교환으로 인해 대략 - 4 ppm에서 넓은 시그널로 나타났다. 아울러, 생성물(PPa)의 질량 스펙트럼을 도 12에 나타내었다. 생성물의 분자량은 534,7g/mol으로서 계산되었으며, EI-질량 분석법을 통한 분석을 통해 535 (M+, 100%)로서 검출되었다.
수율: 1.0 g (88.5%). R f : 0.25 (MC 내 5% MeOH). UV-vis (CH 2 Cl 2 ): λ max, nm (log ε) 667.5 (0.52), 609.8 (0.08), 539.0 (0.094), 508.9 (0.107), 413.9 (1.24). 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 , TMS int ): δ H, ppm 9.45 (1H, s, 5-meso-H), 9.34 (1H, s, 10-meso-H), 8.53 (1H, s, 20-meso-H), 8.02 (1H, m, 31-CH), 6.29 및 6.17 (2H, dd, 32-CH 2 ), 5.29 및 5.13 (2H, dd, 132-CH 2 ), 4.48 (1H, m, 18-CH), 4.32 (1H, m, 17-CH), 3.66 (2H, q, 81-CH 2 ), 3.63 (3H, s, 121-CH 3 ), 3.38 (3H, s, 21-CH 3), 3.20 (3H, s, 71-CH 3 ), 2.72-2.58 (2H, m, 171-CH 2 ), 2.38-2.25 (2H, m, 172-CH 2 ), 1.82 (3H, d, J=7.2 Hz, 181-CH 3 ), 1.67 (3H, t, J=7.8 Hz, 82-CH 3 ), 0.48 및 -1.70 (1H, br, s, NH). EI-MS(아세톤): m/z; 535 [M+].
실시예 4: 피로페오포르비드-a로부터 17 3 -N-에틸렌디아민 피로페오프로비드-a(17 3 -N-EDA-PPa, 화합물 4) 합성
피로페오포르비드-a(화합물 3, 200 mg, 0.374 mmol), 디시클로헥실 카르보디미드(DCC)(116 mg, 0.563 mmol), N-히드록시숙시닉이미드(NHS)(64 mg, 0.348 mmol)을 5 ml의 무수 디클로로메탄에 용해시키고, 3 방울의 트리에틸아민(TEA)을 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 22 시간 동안 실온에서 어두운 조건으로 질소 대기 하에서 교반하였다. 반응 생성물을 아세톤 내 30%의 메탄올을 용리액으로 사용하여 TLC에 의하여 모니터하였다. Rf: 0.603 (디클로로메탄 내 5 % 메탄올)
(t)ert-(B)ut(o)xy(c)arbonyl(Boc)로서 보호된 에틸렌 디아민(EDA)(120 mg)을 상기 반응 생성물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 실온에서 아르곤 하에 교반하고, 매 10분 마다 디클로로메탄 내 5% 메탄올을 용리액으로 사용하여 TLC를 통해 모니터하였다. 그 다음, 1 ml의 물을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 20 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 추출한 다음 상기 추출물을 100 ml의 물로 두 번 세척하였다. 유기 층을 물로부터 분리해내고 무수 황산나트륨 상에서 1 시간 동안 건조시켰다. 그 다음, 디클로로메탄의 추출물을 깔대기 상에서 면을 통해 여과하고 증발 회전기를 통해 농축시켰다. 그 후, 잔사물을 소량의 디클로로메탄에 용해시키고 냉장고에서 냉각시켰다. 냉각된 용액을 깔대기 상에서 탈지면을 통해 여과하고, 차가운 디클로로메탄으로 세척한 다음 증발 회전기를 통해 농축시켰다. 건조된 PPa-EDA-Boc을 용리액으로서 디클로로메탄 내 5% 메탄올을 사용하여 컬럼 크로마토그래피를 통해 실리카 겔(70-230 메쉬; h=10cm, d=3.5cm) 상에서 정제하였다. 그 다음 잔사물을 농축시키고 아세톤으로 헹군 후 디클로로메탄에 용해시키고 건조시켰다. Rf:0.276 (디클로로메탄 내 5% 메탄올)
1 H-NMR (500 MHz, CDCI 3 , TMS int ): δH ppm 9.32 (s, 1H, 10-meso-H), 9.27 (s, 1H, 5-meso-H), 8.53 (s, 1H, 20-meso-H), 7.82 (dd, 1H, 31-CH, J=12Hz, J=12Hz), 6.22(dd, 1H, 32-CH (trans), J=0,5 Hz, J=Hz) and 6.15 (dd, 1H, 32-CH (cis) J=3 Hz, J=1,5Hz), 5.97 (brs, 1H, 173-NH), 5.19 (p, 2H, 132-CH 2, J=68.5Hz), 4.76 (brs, 1H, 175-NH), 4.48 (m, 1H, 18-CH), 4.29 (m, 1H, 17-CH), 3.6 (q, 2H, 81-CH 2 ), 3.4 (s, 3H, 121-CH 3 ), 3.39 (s, 3H, 21-CH 3), 3.22 (s, 3H, 71-CH 3 ), 3.17(m, 2H, 174-CH2), 3.06 (m, 2H, 175-CH2), 2.682-2.010 (m, 4H, 171-CH 2 , 172-CH 2 ), 1.78 (d, 3H, J=7.5 Hz, 181-CH 3 ), 1.63 (t, 3H, J=7.5 Hz, 82-CH 3 ), 1.21(s, 9H, 176-3CH3), 0.4 (br.s, 1H, 21-NH), -1.64 (br.s, 1H, 22-NH).
정제된 화합물을 4 ml의 무수 디클로로메탄에 용해시키고, 4 ml의 트리플루오르산(TFA)를 상기 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 20 분 동안 실온에서 대기 하에 교반하였다(TLC, CH2Cl2:MeOH, 95:5에 의해 용출). 1 ml의 톨루엔을 상기 혼합물에 첨가하고 감압 하에 증발시켰다. 잔사물을 헥산, 에테르로 세척하고, 감압 하에 건조시켰다. 생성물의 UV 스펙트럼을 측정한 결과 도 13과 같았다. 도 13을 보면, 클로린 고리의 2개의 베이스 피크가 λ410 nm 및 λ666.0 nm에서 각각 관찰되었다. 한편, 생성물(PPa-173-N-EDA)의 500 MHz 1H NMR 스펙트럼을 DMSO 내에서 측정한 결과를 도 14에 나타내었다. δ 및 J H-H 값을 이용하여 정해진 시그널은 1D 양성자 스펙트럼에 마크되었다. 총 39개의 양성자에 해당하는 δ -2 내지 10 영역의 시그널은 NMR 스펙트럼 결과로부터 9개의 단일, 7개의 다중, 3개의 이중 및 2개의 4중 시그널로서 관찰되었으며, 각각 173- NH, 174-CH2 및 175-CH2에 해당하는 δ 7,86, δ 3.1 및 2.61에서의 넓은 단일 시그널과 2개의 다중 시그널이 관찰되었다. 이로부터 이전 화합물과 다른 4개의 양성자에 의해 173-N-EDA 피로페오포르비드-a가 형성됨을 확인할 수 있었다. 또한, 대략 5 ppm에서 나타나는 피크의 모양이 변화되었고 상기 양성자가 근처 양성자와 접촉되기 때문에 다중 피크로 되었다. 2개의 NH 양성자는 빠른 교환으로 인해 대략 - 4 ppm에서 넓은 시그널로 나타났다. 아울러, 생성물(PPa-173-N-EDA)의 질량 스펙트럼을 도 15에 나타내었다. 생성물의 분자량은 576.7g/mol으로서 계산되었으며, EI-질량 분석법을 통한 분석에서 나타난 베이스 피크는 577 m/z M+1(100%)에서 관찰되었다. 더 나아가, 생성물(PPa-173-N-EDA)의 FT-IR 스펙트럼을 도 16에 나타내었다. 도 16을 보면, 에틸렌 디아민 단량체의 아민기와 아미드기의 피크가 각각 3450 cm-1, 1220 cm-1에서 명백히 다르게 나타났다. 또한, 피로페오포르비드-a의 C-H 스트레치, 케톤기, 에스테르기 및 비닐기(C=C) 피크들이 2850-2900 cm-1, 1680 cm-1 and 1600 cm-1에 명백히 나타났다.
수율: 80 mg (37%). R f : 0.28 (아세톤 내 30% MeOH). UV-vis (MeOH): λ m ax, nm (abso) 666 (0.391), 538.5 (0.180), 511.7 (0.140), 410 (0.688), 340 (0.323), 323(0.376), 264(0.513). 1 H-NMR (300 MHz, DMSO, TMS int ): δH, ppm 9.74 (s, 1H, 10-meso-H), 9.46 (s, 1H, 5-meso-H), 8.91 (s, 1H, 20-meso-H), 8.23 (dd, 1H, 31-CH, J=17.5Hz, J=12Hz), 7.86 (brs, 1H, 173-NH), 6.39(dd, 1H, 32-CH (trans), J=17,7 Hz, J=1,5Hz) 및 6.22 (dd, 1H, 32-CH (cis) J=11,5 Hz, J=1,5Hz), 5.19 (q, 2H, 132-CH 2, J=19.5Hz), 4.58 (m, 1H, 18-CH), 4.33 (1H, m, 17-CH), 3.71 (q, 2H, 81-CH 2 ), 3.62 (s, 3H, 121-CH 3 ), 3.48 (s, 3H, 21-CH 3), 3.22 (s, 3H, 71-CH 3 ), 3.10(m, 2H, 174-CH2), 2.61 (m, 2H, 175-CH2), 2.05-2.39 (m, 4H, 171-CH 2 , 172-CH 2 ), 1.79 (d, 3H, J=6.5 Hz, 181-CH 3 ), 1.63 (t, 3H, J=7.5 Hz, 82-CH 3 ), 0.28(br.s, 1H, 21-NH), -1.95 (br.s, 1H, 22-NH). FABMS (m-NBA): m/z ; 577 [M+1]. FT-IR ν KBr(cm-1): 3450, 2850-2900, 1680, 1600, 1220.
실시예 5: 17 3 -N-에틸렌디아민 피로페오프로비드-a로부터 모노-피로페오포르비드-a-17 3 -N-(2-아미노에틸)아미드 플래티늄 클로라이드(화합물 5) 합성
173-N-에틸렌디아민 피로페오프로비드-a(20 mg, 0.093 mmol)를 3 ml의 메탄올과 1.5 ml의 아세톤에 용해시켰다. K2PtCl4(14 mg, 0.04 mmol)을 1 ml의 물에 용해시키고 교반하면서 상기 용액에 천천히 첨가하였다. 48시간 후에 침전물을 여과하고 물로 3 회 세척한 다음, 메탄올:에테르 1:9 혼합용매로 세척하고 에테르로 세척하였다. 잔사물을 건조시키고 용리액으로서 메탄올:아세톤 1:2 혼합용매를 사용하여 TLC를 통해 모니터하였다. 생성물의 UV 스펙트럼을 측정한 결과 도 17과 같았다. 도 17을 보면, 2개의 베이스 피크가 각각 410 nm 및 666 nm에서 416.2 nm 및 669 nm으로 변화됨을 알 수 있다. 다른 작은 피크들은 변화하지 않았다. 한편, 생성물의 500 MHz 1H NMR 스펙트럼을 DMSO 내에서 측정한 결과를 도 18에 나타내었다. δ 및 J H-H 값을 이용하여 정해진 시그널은 1D 양성자 스펙트럼에 마크되었다. 총 39개의 양성자에 해당하는 δ -2 내지 10 영역의 시그널은 NMR 스펙트럼 결과로부터 9개의 단일, 7개의 다중, 3개의 이중 및 2개의 4중 시그널로서 관찰되었으며, 각각 173- NH, 174-CH2 및 175-CH2에 해당하는 δ 7,86, δ 3.1 및 2.61에서의 넓은 단일 시그널과 2개의 다중 시그널이 관찰되었다. 이로부터 이전 화합물과 동일한 양성자에 의해 모노-피로페오포르비드-a-173-N-(2-아미노에틸)아미드 플래티늄 클로라이드가 형성됨을 확인할 수 있었다. 2개의 NH 양성자는 빠른 교환으로 인해 대략 - 4 ppm에서 넓은 시그널로 나타났다. 아울러, 생성물의 질량 스펙트럼을 도 19에 나타내었다. 도 19를 통해 확인할 수 있듯이, 상기 생성물의 분자량(M+2)에 해당하는 843 m/z에서 피크가 관찰되었다. 더 나아가, 생성물의 FT-IR 스펙트럼을 도 20에 나타내었다. 도 20을 보면, 에틸렌 디아민 단량체의 아민기와 아미드기의 피크가 각각 3450 cm-1, 1220 cm-1에서 명백히 다르게 나타났다. 또한, 피로페오포르비드-a의 C-H 스트레치, 케톤기, 에스테르기 및 비닐기(C=C) 피크들이 2850-2900 cm-1, 1680 cm-1 and 1600 cm-1에 명백히 나타났다. 착물 내 Pt-N의 피크는 520 cm-1에 나타났다.
따라서, 상기 스펙트럼의 결과를 통해 클로린 유도체와 플래티늄 접합체의 구조를 확인할 수 있었다.
청갈색(brown-blue) 고체, 수율: 50% UV-vis (DMSO): λ m ax, nm (abso) 669 (0.49), 540.3 (0.317), 512.8 (0.284), 416.2 (0.749), 339.5(0.386), 323(0.479). 1 H-NMR (500 MHz, DMSO, TMS int ): δH ppm 9.77 (s, 1H, 10-meso-H), 9.48 (s, 1H, 5-meso-H), 8.92 (s, 1H, 20-meso-H), 8.25 (dd, 1H, 31-CH, J=9 Hz, J=11.5 Hz), 7.56 (brs, 1H, 173-NH), 6.40(dd, 1H, 32-CH (trans), J=18 Hz, J=12 Hz) and 6.22 (dd, 1H, 32-CH (cis) J=12 Hz, J=1,5Hz), 5.23 (q, 2H, 132-CH 2, J=12.5Hz), 4.57 (m, 1H, 18-CH), 4.34 (1H, m, 17-CH), 3.73 (q, 2H, 81-CH 2 ), 3.64 (s, 3H, 121-CH 3 ), 3.46 (s, 3H, 21-CH 3), 3.28 (s, 3H, 71-CH 3 ), 3.10(m, 2H, 174-CH2), 2.64 (m, 2H, 175-CH2), 2.05-2.39 (m, 4H, 171-CH 2 , 172-CH 2 ), 1.80 (d, 3H, J=1.5 Hz, 181-CH 3 ), 1.64 (t, 3H, J=0.5 Hz, 82-CH 3 ), 0.3 (br.s, 1H, 21-NH), -1.93 (br.s, 1H, 22-NH). FABMS (m-NBA): m/z; 842.2325 [M+1]. FT-IR ν KBr(cm-1): 3450, 2850-2900, 1680, 1600, 1220, 520.
실시예 6: 피로페오포르비드-a(PPa, 화합물 3)로부터 피로페오포르비드-a-파클리탁셀 접합체(화합물 6) 합성
상업적으로 입수가능하고 화학적으로 확인된 파클리탁셀을 본 실시예에 사용하였다. 상기 실시예 3에서 제조한 피로페오포르비드-a(화합물 3)(14.41 mg, 0.026 mmol), 파클리탁셀(PTX, 파클리탁셀)(23mg, 0.026 mmol), 디시클로헥실 카르보디미드(DCC)(11.12 mg, 0.053 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 4-Dimethylaminopyridine)(3.3 mg, 0.028 mmol)을 무수 디클로로메탄(4 ml)에 용해시켰다. 상기 반응 혼합물을 아르곤 하, 실온에서 어두운 조건으로 6 시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄(50 ml)과 물(100 ml)을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 수층을 물, 염산(5%), 염화나트륨과 물의 포화용액으로 세척하였다. 유기층은 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 그 다음 잔사물을 실리카 겔 60(230-400 메시) 상에서 디클로로메탄 내 10%의 아세톤으로 용리시킴으로써 정제하여 순수한 화합물 6, 피로페오포르비드-a-파클리탁셀 접합체를 얻었다. 마지막으로, 최종 생성물을 디클로로메탄/헥산으로 재결정하였다.
최종 생성물인 피로페오포르비드-a-파클리탁셀 접합체의 MALDI-질량 스펙트럼을 도 21에 나타내고, HPLC 결과를 도 22에 나타내었다. HPLC에서 용매 시스템은 아세톤:메탄올을 5:95로 사용하였고 파장은 660 nm이었으며 순도는 99.4%였다.
수율: 29.0 mg (81.5%); 갈회색 고체(brown-grey solid); Rf: 0.27 (2% 디클로로메탄 내 메탄올). UV-vis (in CDCI3): λ m ax, nm (Abs) 667.6 (0.94), 609.7 (0.289), 539.5 (0.322), 525.9 (0.0.248), 413.5(1.965), 323(0.596). 1H-NMR (500 MHz, DMSO, TMSint): δH, ppm 9.53 (s, 1H, 10-meso-H), 9.43 (s, 1H, 5-meso-H), 8.55 (s, 1H, 20-meso-H), 8.12(d, 2H, 3III, 7III-CH tax ), 8.03(dd, 1H, 31-CH, J=11Hz, J=11.5Hz), 7.65 (d, 2H, 3IIII, 7IIII-CH tax, J=6Hz), 7.48-7.31(m, 11H, 2II, 3II, 4II, 5II, 6II-CH, 4III, 5III, 6III-CH, 4IIII, 5IIII, 6IIII-CH tax), 6.79(d, 1H, 4I-NH tax, J=9Hz), 6.32(dd, 1H, 32-CH (trans), J=1.5 Hz, J=1 Hz) 및 6.2 (dd, 1H, 32-CH (cis), J=1.5 Hz, J=1.5Hz), 6.30(s, 1H, 10-CH tax), 6.25(t, 1H, 13-CH tax), 5.96(dd, 1H, 3I-CH tax, J=4Hz, J=3.5), 5.69(d, 1H, 2-CH tax, J=7Hz), 5.60(d, 1H, 21-CH tax, J=3.5Hz), 5.14 (q, 2H, 132-CH2, J=0.5Hz), 4.96(m, 1H, 5-CH tax, J=6Hz), 4.46-4.44(m, 2H, 18-CH and 7-CH tax, J=0.5Hz), 4.31-4.20 (m, 3H, 17-CH and 20-CH2 tax), 3.82(d, 1H, 3-CH tax, J=7Hz), 3.72 (q, 2H, 81-CH2, J=0), 3.67 (s, 3H, 121-CH3), 3.43 (s, 3H, 21-CH3), 3.27 (s, 3H, 71-CH3), 2.63-2.56(m, 7-OH tax), 2.63-2.33 (m, 5H, 171-CH2, 172-CH2 and 6a-CH tax), 2.44(s, 3H, 4-OAc-Me tax), 2.38-2.15(m, 2H, 14-CH2 tax), 2.23(s, 3H, 10-OAc-Me tax), 1.92(s, 3H, 19-CH3 tax), 1.89(m, 1H, 6b-CH tax), 1.83 (s,1-OH tax), 1.77 (d, 3H, 181-CH3, J=7.5 Hz), 1.72 (t, 3H, 82-CH3, J=0.5 Hz ), 1.69(s, 3H, 18-CH3 tax), 1.23(s, 3H, 17-CH3 tax), 1.14(s, 3H, 16-CH3 tax) 0.51 (br.s, 1H, 21-NH), -1.62 (br.s, 1H, 22-NH). MALDI-MS: C80H84O16N5에 대하여 m/z 1370.5734(100%).
실험예 1: 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체에 의한 암세포의 성장 억제 효과 조사
상기 실시예 5에서 제조된 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체인 173-N-에틸렌디아민 피로페오포르비드-a 플래티늄 디클로라이드(화합물 5)에 의한 암세포의 성장 억제 효과를 확인하기 위하여 인유두종바이러스 16 E6/E7을 발현하는 TC-1 세포주에서 세포성장 저해 효과를 조사하였다.
TC-1 세포주는 RPMI-1640 (Gibco BRL, Rockville, MD, USA)에 5% 우태아혈청 (FBS) (Gibco BRL), 0.22% 탄산수소나트륨 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 400 ㎎/L의 G418 (Sigma-Aldrich), 그리고 스트렙토마이신/페니실린 (Gibco BRL)을 첨가하여 사용하였고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
TC-1 세포주를 96 웰 플레이트에 3 × 103 cells/well로 분주한 후, 24 시간동안 배양시켜 0.06125, 0.125, 0.25, 0.5uM의 클로린 유도체, 시스플라틴, 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체를 24시간 동안 처리하였다. 그 다음 대조구와 처리구로 나누어 처리구는 662nm±3nm의 레이저를 사용하여 1.56 J/㎠로 PDT를 실시하고 대조구는 PDT를 실시하지 않았다. 이 후 대조구와 처리구 각각의 well에 5 ㎎/㎖의 MTT 용액 (Sigma-Aldrich)을 20 ㎕ 첨가하여 4 시간 동안 37℃에서 배양하고, 상층액을 제거 한 후, 디메틸설폭사이드 (DMSO, Sigma-Aldrich)를 100 ㎕/well로 첨가하여 쉐이커에서 10 초간 흔들어준 후, ELISA-reader (spectra max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 23 내지 도 25에 나타내었다. 도 23을 통해 알 수 있는 바와 같이, 0.06125, 0.125, 0.25uM의 농도에서 PDT를 실시하지 않은 경우 클로린 유도체와 시스플라틴은 대조군에 비해 세포성장 저해효과를 나타내지 않았으나, 클로린 유도체의 독성이 전혀 관찰되지 않으며 시스플라틴이 세포 성장 저해 효과를 나타내지 않는 농도인 0.06125, 0.125, 0.25uM에서 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체는 대조군에 비해 통계적으로 유의한 세포성장 저해 효과를 나타내었다. 아울러, 도 24를 통해 알 수 있는 바와 같이 PDT를 실시하지 않은 경우 0.25uM는 물론 0.5uM에서도 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체가 클로린 유도체 단독 또는 시스플라틴 단독에 비해 통계적으로 유의한 세포성장 저해 효과를 나타내었다. 한편, 도 25를 통해 알 수 있는 바와 같이 PDT 실시의 경우 클로린 유도체와 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체 간의 세포 성장 저해 효과의 차이가 없었으며, 세포 성장을 90% 이상 저해하였음을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체에 의한 암세포의 성장 억제 효과 조사
상기 실시예 6에서 제조된 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체인 피로페오포르비드-a-파클리탁셀 접합체(화합물 6)에 의한 암세포의 성장 억제 효과를 확인하기 위하여 인유두종바이러스 16 E6/E7을 발현하는 TC-1 세포주에서 세포성장 저해 효과를 조사하였다.
TC-1 세포주는 RPMI-1640 (Gibco BRL, Rockville, MD, USA)에 5% 우태아혈청 (FBS) (Gibco BRL), 0.22% 탄산수소나트륨 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 400 ㎎/L의 G418 (Sigma-Aldrich), 그리고 스트렙토마이신/페니실린 (Gibco BRL)을 첨가하여 사용하였고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
TC-1 세포주를 96 웰 플레이트에 3 × 103 cells/well로 분주한 후, 24 시간동안 배양시켜 5 및 10uM 각각의 클로린 유도체, 파클리탁셀, 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체를 24시간 동안 처리하였다. 그 다음 대조구와 처리구로 나누어 처리구는 662nm±3nm의 레이저를 사용하여 6.25 J/㎠로 PDT를 실시하고 대조구는 PDT를 실시하지 않았다. 이 후 24시간을 더 배양하고, 대조구와 처리구 각각의 well에 5 ㎎/㎖의 MTT 용액 (Sigma-Aldrich)을 20 ㎕ 첨가하여 4 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고 디메틸설폭사이드 (DMSO, Sigma-Aldrich)를 100 ㎕/well로 첨가하여 쉐이커에서 10 초간 흔들어준 후, ELISA-reader (spectra max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 26 및 도 27에 나타내었다. 도 26 및 도 27을 통해 알 수 있는 바와 같이, PDT를 실시하지 않은 경우 클로린 유도체의 독성이 나타나는 5 및 10uM에서 파클리탁셀-클로린 유도체 접합체의 독성은 현저히 감소한 반면(도 26), PDT 실시의 경우 클로린 유도체와 파클리탁셀-클로린 유도체 접합체 간의 세포 성장 저해 효과 차이는 거의 없는 것으로 나타났다(도 27).
실험예 3: 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체의 공초점 현미경 분석
상기 실시예 5에서 제조된 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체인 173-N-에틸렌디아민 피로페오포르비드-a 플래티늄 디클로라이드(화합물 5)의 종양 선택성을 조사하기 위하여 인유두종바이러스 16 E6/E7을 발현하는 TC-1 세포주에서 공초점 현미경 분석(Conforcal microscopy)을 수행하였다.
TC-1 세포주는 RPMI-1640 (Gibco BRL, Rockville, MD, USA)에 5% 우태아혈청 (FBS) (Gibco BRL), 0.22% 탄산수소나트륨 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 400 ㎎/L의 G418 (Sigma-Aldrich), 그리고 스트렙토마이신/페니실린 (Gibco BRL)을 첨가하여 사용하였고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
TC-1 세포주를 소독된 커버글라스를 넣은 6 웰 플레이트에 3 × 103 cells/well로 분주한 후, 24 시간동안 배양시켜 0.25 및 0.5uM 각각의 클로린 유도체 및 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체를 12시간 동안 처리하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 1X PBS 완충액으로 2번 씻어주고, 1% 파라포름알데하이드 1 ml를 15분간 처리하여 세포를 고정하였다. 고정 후 상층액을 제거하고, 1X PBS 완충액으로 1번 씻어주고 mounting 용액을 떨어뜨린 슬라이드 글라스 위에 올려 말린 후, 공초점 현미경(Conforcal microscopy, TCS SP2, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 형광을 분석하였다. 분석시 사용된 excitation 파장은 600 nm이고, emission 파장은 545 nm이었다.
분석 결과를 도 28에 나타내었다. 도 28을 보면 0.5uM에서는 클로린 유도체 단독 물질과 본 발명의 접합체가 모두 포화 축적되었으나 이보다 낮은 농도인 0.25uM에서는 클로린 유도체 단독 물질에 비해 본 발명의 접합체가 암세포에 더욱 잘 축적되는 것을 알 수 있다. 따라서, 도 28을 통해 시스플라틴-클로린 유도체의 접합체가 같은 농도의 클로린 유도체에 비해 종양 선택성이 증가함을 알 수 있었다.
실험예 4: 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체의 공초점 현미경 분석
상기 실시예 6에서 제조된 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체인 피로페오포르비드-a-파클리탁셀 접합체(화합물 6)의 종양에서의 배출 시간을 조사하기 위하여 인유두종바이러스 16 E6/E7을 발현하는 TC-1 세포주에서 공초점 현미경 분석(Conforcal microscopy)을 수행하였다.
TC-1 세포주는 RPMI-1640 (Gibco BRL, Rockville, MD, USA)에 5% 우태아혈청 (FBS) (Gibco BRL), 0.22% 탄산수소나트륨 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 400 ㎎/L의 G418 (Sigma-Aldrich), 그리고 스트렙토마이신/페니실린 (Gibco BRL)을 첨가하여 사용하였고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
TC-1 세포주를 6 웰 플레이트에 3 × 103 cells/well로 분주한 후, 24 시간동안 배양시켜 2uM 각각의 클로린 유도체 및 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체를 12, 24, 48 및 72 시간동안 처리하고, 상기 실험예 3에서 사용한 방법과 동일한 방법으로 공초점 현미경 분석(Conforcal microscopy)을 수행하였다. 다만, 이때에는 고정 후에 300nM의 DAPI 용액을 5분간 처리하여 핵의 모양 변화를 동시에 관찰하였다.
분석 결과를 도 29에 나타내었다. 도 29를 통해 48시간 이후 파클리탁셀-클로린 유도체의 접합체가 같은 농도의 클로린 유도체에 비해 종양에서의 배출 시간이 감소함을 알 수 있었다.

Claims (16)

  1. 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체:
    [화학식 1]
    Figure 112012059252156-pat00043

    [화학식 2]
    Figure 112012059252156-pat00044

    [화학식 3]
    Figure 112012059252156-pat00045
    .
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항의 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 광역학 치료용인 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 암은 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 및 신경계의 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 두개 내 주사, 종양 내 주사, 상피내 주사, 피부관통전달, 식도 투여, 복부 투여, 동맥 주사, 관절내 주사, 및 구강내 투여로 이루어진 군 중에서 선택된 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항의 접합체를 유효성분으로 포함하는 조성물; 및
    파장이 650 nm 내지 800 nm 범위인 광선을 조사하기 위한 광원을 포함하는, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암은 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 및 신경계의 암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 키트.
  13. 제1항의 접합체를 함유하는 광감작제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 광감작제는 650 nm 내지 800 nm 범위의 광선에 대하여 광감작 활성을 보이는 광감작제.
  15. 하기 단계를 포함하는 제1항의 화학식 1 또는 2로 표시되는 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체의 제조방법:
    하기 화학식 4의 링커 작용기를 가진 클로린 유도체를 제조하는 단계; 및
    [화학식 4]
    Figure 112012059252156-pat00046

    상기에서 제조된 링커 작용기를 가진 클로린 유도체에 플래티늄(Ⅳ) 클로라이드를 접합시켜 제1항의 화학식 1 또는 2로 표시되는 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 얻는 단계.
  16. 하기 단계를 포함하는 제1항의 화학식 3으로 표시되는 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체의 제조방법:
    하기 화학식 5의 링커 작용기를 가진 클로린 유도체를 제조하는 단계; 및
    [화학식 5]
    Figure 112012059252156-pat00047

    상기에서 제조된 링커 작용기를 가진 클로린 유도체에 파클리탁셀을 접합시켜 제1항의 화학식 3으로 표시되는 항암 화학요법제-클로린 유도체의 접합체를 얻는 단계.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101374820B1 (ko) * 2012-01-30 2014-03-17 광주과학기술원 페오포르바이드-α 컨쥬게이트 및 그의 용도
KR102320654B1 (ko) 2020-02-05 2021-11-02 가톨릭대학교 산학협력단 광역학 암조직 치료를 위한 광응답소재 조합 나노다이아몬드 입자

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100707655B1 (ko) 2005-07-18 2007-08-09 주식회사 라이트팜텍 포르피린 금속 착화합물 유도체
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040228871A1 (en) * 1999-06-03 2004-11-18 Tayyaba Hasan Treatment and analysis of proliferative disorders
KR100808630B1 (ko) * 2006-12-28 2008-02-29 광주과학기술원 클로린 화합물을 포함하는 경구투여용 항종양 조성물
KR100912446B1 (ko) * 2007-09-12 2009-08-14 인제대학교 산학협력단 항암활성을 가지는 클로린 유도체

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100707655B1 (ko) 2005-07-18 2007-08-09 주식회사 라이트팜텍 포르피린 금속 착화합물 유도체
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