WO2008129106A2 - Nanopartículas que comprenden una ciclodextrina y una molécula biológicamente activa y sus aplicaciones - Google Patents

Nanopartículas que comprenden una ciclodextrina y una molécula biológicamente activa y sus aplicaciones Download PDF

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WO2008129106A2
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Juan Manuel Irache Garreta
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Definitions

  • the invention relates to nanoparticles, with bioadhesive characteristics, comprising a biodegradable polymer, a cyclodextrin or a derivative thereof, and a biologically active molecule.
  • the invention also relates to a process for its production, with compositions containing said nanoparticles and with their applications.
  • nanospheres have a polymeric matrix type structure, in which the active ingredient is dispersed, while the nanocapsules have a core that contains the active ingredient, surrounded by a shell, such as a polymeric shell. Due to the high specific surface area of these systems, the active ingredient can also be adsorbed on the surface of the nanoparticular system.
  • the oral route is the most popular and attractive route for the administration of medications.
  • the use of this route is associated with a significant increase in the acceptance of medication by the patient and with lower healthcare costs.
  • a significant number of drugs have a very low efficacy when administered through this route.
  • This phenomenon may be due to one or more of the following factors that determine the oral bioavailability of a drug: (i) low permeability of the active molecule to pass through the mucosa (usually associated with hydrophilic drugs), (ii) low stability in the gastrointestinal environment (presence of extreme pH values, enzymes, etc.), (iii) incomplete release of the drug from the dosage form, (iv) low solubility of the active substance in the gastrointestinal environment (associated with hydrophobic drugs ), and V) Presystemic metabolism
  • Nanoparticulate systems allow, on numerous occasions, to significantly increase the bioavailability of the biologically active molecule and, thus, offer new administration strategies.
  • the improvement in bioavailability obtained after using these vehicles can be explained by the ability of polymeric nanoparticles to develop bioadhesive interactions with the gastrointestinal mucosa tract.
  • these transporters can interact and develop adhesive interactions with various components of the mucosa.
  • the bioadhesive characteristics of the nanoparticles may vary and allow, in certain cases, to reach the surface of the entericito, and, eventually, develop bioadhesive interactions in very specific regions of the gastrointestinal tract. All these phenomena lead to (i) an increase in the residence time of the pharmaceutical form in intimate contact with the mucosal surface, or to (ii) a specific location of the vehicle (with the drug) in a certain area.
  • Illustrative examples of drugs whose oral bioavailability increases by encapsulation or association with nanoparticles include salmon calcitonin, furosemide, avarol, dicumarol, nifedipine, fiuoropyrimidines, plasmids, etc.
  • PLGA lactic and glycolic acids
  • organic solvents such as chloroform, dichloromethane, acetone and ethyl acetate and insoluble in aqueous media; However, they are able to capture water and swell to a greater or lesser extent, depending on their molecular weight and composition.
  • PLGA can be quite hydrophobic compared to many of the antigens it carries.
  • both hydration and degradation of PLGA are essential requirements for the release of antigen during the erosion phase.
  • This erosion produces a fairly acidic microenvironment due to the accumulation of degradation products of the polymer, lactic and glycolic acids; the pH may drop to be of the order of 2-3.
  • the released proteins undergo hydrolysis and aggregation in the acidified medium and many antigens lose their antigenic capacity.
  • its high price could limit its use and favor the search for other less expensive materials.
  • chitosan is a cellulose-like polymer that comes from the deacetylation of chitin, a major component of the exoskeleton of crustaceans. Chitosan can be formulated in nanoparticles of different sizes where the drug is incorporated. Chitosan particles are capable of increasing the absorption of proteins in the mucosal surface, inducing a transient opening of the narrow junctions. In addition, chitosan can have an immunomodulatory effect, stimulating the production of cytokines in vitro and improving the natural Th2 / Th3 balance at the level of mucous membranes in the absence of antigen.
  • Cyclodextrins are a group of cyclic oligosaccharides, obtained by enzymatic degradation of starch. They are composed of units of ⁇ -1,4-glucopyranoside linked together, forming a truncated cone-like structure with a hydrophobic internal cavity.
  • CDs can contain more than 15 units of ⁇ -1,4- glucopiranose, although the most abundant contain 6 ( ⁇ -CD), 7 ( ⁇ -CD) or 8 ( ⁇ -CD) units of ⁇ -l, 4-glucopiranose.
  • ⁇ -CD and its derivatives are the most commonly used, in particular, 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (OH- ⁇ -CD).
  • This CD has a high aqueous solubility, a lower toxicity as well as a more hydrophobic cavity compared to the compound of origin ( ⁇ -CD).
  • cyclodextrins can provide, to the host molecule, stability and increase in aqueous solubility, which can lead to increases in the bioavailability of that molecule (eg, drug) and / or the reduction of adverse effects.
  • that molecule eg, drug
  • the ability to increase the loading capacity of liposomes and microparticles has been described in the literature.
  • CDs are capable of modifying the release profile of the encapsulated drug.
  • antitumor agents are administered parenterally, which raises various problems.
  • main advantages that would be the administration of antitumor agents by oral route, it is worth noting the increase in the quality of life of patients as well as the reduction of healthcare costs.
  • This route of administration would allow a continuous exposure of the cancer cells to the antitumor drug at an appropriate and sustained concentration level which can improve the therapeutic index and reduce side effects.
  • the vast majority of these drugs e.g., paclitaxel
  • Paclitaxel (Taxol®, Bristol Myers Squibb Company), a product extracted from the Taxus brevifolia tree, was first described in 1971 and since 1993 is the most widely used cancer chemotherapeutic agent worldwide. Paclitaxel acts at the cellular level promoting the polymerization of tubulin. Thus, the microtubules formed in the presence of paclitaxel are extraordinarily stable and non-functional, thus causing cell death due to the dynamic and functional inability of the microtubules for cell division. In Europe, this drug is indicated both as an individual agent and in combination with other cancer treatments for the treatment of ovarian, breast and non-small cell lung cancer, both advanced and metastatic.
  • paclitaxel is a substrate of glycoprotein- P, as well as other members of the ABC superfamily (ATP-binding cassette), such as BCRP and MRP2.
  • ABC protein transport superfamily plays a central role in the body's defense against toxic compounds and against some anticancer agents.
  • proteins glycoprotein-P, MRP2 and BCRP are located in the apical zone of the intestinal, hepatic and renal membranes, mediating the pumping of xenobiotics and toxins to the intestinal, biliary and urine lumen.
  • paclitaxel is formulated for clinical use and intravenously in a vehicle composed of Cremophor EL: ethanol (1: 1).
  • Cremophor EL ethanol (1: 1).
  • Abraxane ® Green et al. Annals of Oncology 17: 1263-1268, 2006.
  • said administration systems should have bioadhesive properties, should have the ability to incorporate varying amounts of lipophilic drugs, and, ideally, should be able to avoid the effect of P-glycoprotein on the transported drug.
  • nanoparticles of a biodegradable polymer such as the copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride (PVM / MA)
  • PVM / MA methyl vinyl ether and maleic anhydride
  • cyclodextrins bound to biologically active molecules allows to obtain nanoparticles with physicochemical characteristics and of bioadhesion to the gastrointestinal mucosa that make them systems of great interest as transporters of all types of biologically active molecules, especially, biologically active molecules of a hydrophobic (lipophilic) nature, such as paclitaxel.
  • These nanoparticles can prolong the residence time in the mucosa after oral administration.
  • said nanoparticles can improve the bioavailability of biologically active molecules that could be a substrate of the P-glycoprotein.
  • said nanoparticles can be used as systems for the administration of drugs with high toxicity (eg, cytostatics) by offering sustained and constant plasma levels of the biologically active molecule for periods of up to 24 hours, which allows alternative treatments to infusion hospital, allowing a reduction in the health cost of treatments with this type of drugs.
  • drugs with high toxicity eg, cytostatics
  • the invention provides nanoparticles with the ability to associate high amounts of biologically active molecules, especially hydrophobic in nature, for effective administration through mucous membranes, especially orally, because they have adequate bioadhesive characteristics that favor The interaction of the nanoparticles (containing the biologically active molecule) with the surface of the mucosa, are capable of transporting a wide range of biologically active molecules, especially, of lipophilic nature and, above all, of releasing the biologically active molecule by providing plasma levels sustained and constant thereof when administered orally or through any other mucosa of the body. If the transported biologically active molecule is a substrate of the P-glycoprotein, the nanoparticles of the invention are capable of preventing the action of this protein on the biologically active molecule in question.
  • the nanoparticles provided by this invention comprise a biodegradable polymer, a cyclodextrin or a derivative thereof, and a biologically active molecule.
  • a biodegradable polymer e.g., polyvinyl methyl ether and maleic anhydride and ⁇ -cyclodextrin ( ⁇ -CD), 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (OH- ⁇ -CD) or 6-monodeoxy-6- Monoamine- ⁇ -cyclodextrin (NH- ⁇ -CD) are easy to produce, and give excellent bioadhesion, size and zeta potential characteristics that make them suitable for the administration of biologically active molecules of hydrophobic nature (eg, paclitaxel).
  • the invention relates to nanoparticles comprising a biodegradable polymer, a cyclodextrin or a derivative thereof, and a biologically active molecule, useful for transporting biologically active molecules.
  • the biodegradable polymer is a copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride (PVM / MA).
  • the cyclodextrin is ⁇ -CD, OH- ⁇ -CD or NH- ⁇ -CD.
  • the biologically active molecule present in the nanoparticles of the invention is paclitaxel.
  • the nanoparticles allow spectacular increases in the oral bioavailability of paclitaxel, whose oral absorption is practically zero due to its physicochemical characteristics (high lipophilicity) and to be a substrate of the P-glycoprotein located in the gastrointestinal tract.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising said nanoparticles.
  • the invention relates to a process for the production of said nanoparticles.
  • Figure 2 is a photograph of the result obtained by subjecting a lyophilized sample of nanoparticles based on PVM / MA with ⁇ -cyclodextrin ( ⁇ -CD-NP) to scanning electron microscopy.
  • Figure 3 is a graph showing the release of RBITC from nanoparticles containing cyclodextrins ( ⁇ -CD-NP: nanoparticles based on
  • Figure 4 shows a bar chart depicting the distribution of (A) nanoparticles based on PVM / MA with hydroxypropyl- ⁇ -CD (OH- ⁇ -CD-NP); (B) PVM / MA based nanoparticles with ⁇ -CD; and (C) control nanoparticles (NP), in the mucosa of the gastrointestinal tract after oral administration of 10 mg of fluorescently labeled nanoparticles with RBITC.
  • the x axis represents the different segments of the mucosa; the y axis represents the fraction of nanoparticles attached to the mucosa; and the z axis represents the time after administration.
  • Figure 5 is a graph showing the bioadhesion curves obtained by representing the fraction of nanoparticles adhered in the entire gastrointestinal tract with respect to time.
  • the formulations represented are (•) OH- ⁇ -CD-NP; (A) ⁇ -CD-NP; and (B) NP Control.
  • Figure 6 is a set of photographs showing the fluorescence microscopy visualization of the control (A) and OH- ⁇ -CD-NP (B, C) nanoparticles adhered to the rat ileum after 2 hours of oral administration of a single dose of 10 mg.
  • PTX-NP conventional PVM / MA nanoparticles with paclitaxel
  • PTX- ⁇ -CD-NP PVM / MA and ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • PTX-OH- ⁇ -CD-NP PVM / MA and OH- ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • PTX-NH- ⁇ -CD-NP PVM / MA and NH- ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel.
  • Figure 8 is a set of graphs representing plasma concentrations of paclitaxel (PTX) as a function of time after administration in laboratory animals of the different PTX formulations. The results show the mean ⁇ standard deviation.
  • PTX paclitaxel
  • Taxol® commercial formulation of paclitaxel.
  • PTX-NP conventional PVM / MA nanoparticles with paclitaxel
  • PTX- ⁇ -CD-NP PVM / MA and ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • PTX-OH- ⁇ -CD-NP PVM / MA and OH- ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • PTX-NH- ⁇ -CD-NP PVM / MA and NH- ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • Taxol® commercial formulation with paclitaxel. The values obtained for the formulation of commercial taxol and PTX-NP overlap and appear on the X axis (Table 9).
  • the invention relates to nanoparticles, hereinafter nanoparticles of the invention, comprising a biodegradable polymer, a cyclodextrin or a derivative thereof, and a biologically active molecule.
  • nanoparticles of the invention possess adequate physicochemical, specificity and bioadhesion characteristics to the gastrointestinal mucosa, which makes them potentially useful systems for the transport of biologically active molecules, in particular, biologically active molecules of lipophilic nature (eg , paclitaxel, etc.) and / or biologically active molecules that are substrate of the P-glycoprotein.
  • the nanoparticles of the invention can improve the bioavailability of biologically active molecules, in general, and, in particular, of biologically active molecules of lipophilic nature and / or of biologically active molecules that can be a substrate for P-glycoprotein.
  • the nanoparticles of the invention can prolong the residence time in the mucosa after oral administration.
  • the nanoparticles of the invention can be used as a transport system for biologically active molecules with high toxicity, for example, cytostatics, because they offer sustained and constant plasma levels of such drugs for periods of up to 24 hours, which It allows the design of alternative treatments to hospital infusion, resulting in a reduction in the health cost of treatments with this type of drugs.
  • nanoparticle refers to spheres or shapes. similar with an average size of less than 1.0 micrometer ( ⁇ m).
  • the nanoparticles of the invention have an average particle size between 1 and 999 nanometers (nm), preferably between 10 and 900 nm. In a particular embodiment, the nanoparticles of the invention have an average particle size between 100 and 400 nm.
  • average size is meant the average diameter of the nanoparticle population that moves together in an aqueous medium.
  • the average size of these systems can be measured by standard procedures known to those skilled in the art and described, by way of illustration, in the experimental part that accompanies the examples described below.
  • the average particle size can be influenced mainly by the quantity and molecular weight of the biodegradable polymer, by the nature and quantity of the cyclodextrin, or derivative thereof, and by the nature and quantity of the biologically active molecule, present in the nanoparticles of the invention (in general, the greater the amount or molecular weight of said components, the average size of the nanoparticle will be increased), and by some parameters of the production process of said nanoparticles, such as the speed of agitation, etc.
  • Biodegradable Polymer The nanoparticles of the invention comprise a biodegradable polymer.
  • biodegradable refers to polymers that dissolve or degrade in a period of time that is acceptable for the desired application, in this case in vivo therapy, once they are exposed to a physiological solution. pH between 1 and 9, typically between 4 and 9, at a temperature between 25 ° C and 40 0 C.
  • biodegradable polymer known in the state of the art that results in the formation of nanoparticles can be used for the practice of the present invention.
  • biodegradable polymers include polyhydroxy acids, such as polylactic acid, polyglycolic acid, etc., and copolymers thereof, eg, poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA], etc .; polyanhydrides; polyesters; polysaccharides, eg, chitosan, etc.
  • the molecular weight of said biodegradable polymer can vary within a wide range. as long as it satisfies the established conditions of forming nanoparticles and being biodegradable.
  • the biodegradable polymer used is the copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride in anhydride form (PVM / MA).
  • PVM / MA copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride in anhydride form
  • the PVM / MA copolymer sold under the trade name Gantrez® AN can be used.
  • said PVM / MA copolymer has a molecular weight between 100 and 2,400 kDa, preferably between 200 and 2,000 kDa, more preferably between 180 and 250 kDa.
  • This biodegradable polymer (PVM / MA) can react with different hydrophilic substances, due to the presence of its anhydrous groups, without having to resort to the usual organic reagents (glutaraldehyde, carbodiimide derivatives, etc.) that possess an important toxicity.
  • the PVM / MA copolymer In an aqueous medium, the PVM / MA copolymer is insoluble, but its anhydride groups are hydrolyzed giving rise to carboxylic groups. The dissolution is slow and depends on the conditions in which it occurs. Due to the availability of functional groups in PVM / MA, covalent binding of molecules with nucleophilic groups, such as hydroxide or amino, takes place by simple incubation in an aqueous medium.
  • PVM / MA copolymer nanoparticles can be easily obtained by desolvating the copolymer, by adding, to an organic solution thereof, a first polar solvent (miscible with a solution of the copolymer) and subsequent addition of a second liquid non-solvent, such as a hydroalcoholic solution.
  • a crosslinking agent can be added.
  • the nanoparticles of the invention comprise, in addition to the biodegradable polymer, a cyclodextrin or a derivative thereof.
  • cyclodextrin includes any cyclic oligosaccharide composed of glucose units linked by ⁇ -1,4 ( ⁇ -1, 4-glucopyranosyl) glycosidic bonds. These units are produced as a result of an intramolecular transglycosylation reaction of starch degradation by the enzyme cyclodextrin glucanotransferase (CGTase).
  • CGTase cyclodextrin glucanotransferase
  • Cyclodextrin may contain more than 15 units of ⁇ -l, 4-glucopyranoside, although the most abundant contain 6, 7 or 8 units of ⁇ -l, 4-glucopyranoside, which constitute the so-called alpha-cyclodextrins ( ⁇ -CD ), beta-cyclodextrins ( ⁇ -CD) or gamma-cyclodextrins ( ⁇ -CD), respectively. All of them have a truncated cone type structure, with a hydrophobic internal cavity and a hydrophilic external face.
  • said cyclodextrin is an alpha-cyclodextrin, a beta-cyclodextrin or a gamma-cyclodextrin.
  • cyclodextrin derivative includes any cyclodextrin having at least one modified terminal hydroxyl group.
  • the chemical modification of cyclodextrins can alter their chemical-physical properties, improving the solubility, stability and controlling the chemical activity of the molecules with which they are bound (host molecules).
  • the incorporation, by reaction of the cyclodextrin OH groups, of alkyl, aryl, carboxyalkyl, cyanoalkyl, hydroxyalkyl, sulfoalkyl, amino, azido, heterocyclyl, acetyl, benzoyl, succinyl, and other phosphorus-containing groups, sulfur has been described , etc.
  • At least one of said terminal hydroxyl groups is modified, replacing hydrogen with a linear or branched CpC 8 alkyl group, eg, methyl, ethyl, propyl, etc .; UIaIqUiI (C 1 -C 8 ) SiIiO, eg, t-butyldimethylsilyl, etc .; Ci-C 8 hydroxyalkyl, eg, 2-hydroxyethyl, 2-hydroxypropyl, etc .; (C J- C 8 ) alkyl CaTbOmIo, optionally substituted by a carboxyl group, eg, acetyl, succinyl, etc .; arylcarbonyl, eg, benzoyl, etc .; cyanoalkyl (Ci-C 2 ), eg,
  • the mother cyclodextrins i.e., without derivatizing
  • the ⁇ -CD have a limited aqueous solubility compared to the acyclic saccharides due, in part, to the strong bonds between the crystalline cyclodextrin molecules.
  • the ⁇ -CD is capable of forming intramolecular hydrogen bonds between the secondary hydroxyl groups thereby producing unfavorable solution enthalpies, and therefore a low aqueous solubility.
  • the substitution of some of the hydrogen bonds with hydrophobic groups, such as methoxy- or ethoxy- results in an increase in aqueous solubility.
  • the aqueous solubility of ⁇ -CD is 1.85% (w / v) at room temperature but it can increase up to 150 times by increasing the degree of methylation (methyl- ⁇ -CD).
  • Another particularly important cyclodextrin derivative is 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (OH- ⁇ -CD), obtained after treatment of ⁇ -CD with propylene oxide, which has an aqueous solubility of 60% (w / v) .
  • these derivatives can improve the toxicological profile, the ability to encapsulate biologically active molecules and modulate their release profile.
  • the main problem of the mother cyclodextrins is nephrotoxicity after being administered parenterally, mainly for ⁇ -CD, due to its low aqueous solubility. Therefore, more hydrophilic derivatives, such as OH- ⁇ -CD, reduce these nephrotoxicity problems by being able to be eliminated more easily. The same is not true for methylated derivatives of ⁇ -CD, which, despite being more soluble than ⁇ -CD, would not be exempt from causing systemic toxicity, due to its greater ability to interact with endogenous lipids, which limits its use parenterally. On the contrary, toxicity studies carried out after oral administration show that cyclodextrins and their derivatives are not toxic by this route.
  • Cyclodextrins are water soluble macromolecules that have been approved for oral, parenteral and topical administration of drugs.
  • the applications of cyclodextrins in the oral administration of drugs are mainly due to the improvement in the oral bioavailability of the drug, due to the increase in solubility, increased stability of the drug in the gastrointestinal tract and / or in the formulation.
  • itraconazole which is marketed in the US and Europe associated with OH- ⁇ -CD for oral administration, significantly reducing the irritation that administered in isolation produces in the gastrointestinal tract.
  • cyclodextrins are also used for their power to increase the permeability of the drug through skin and mucous membranes, which results in a better and more uniform absorption of the drug.
  • drug activity after administration such as, for example, the complex formed between fiutamide and OH- ⁇ -CD, which substantially improves the absorption of the drug after oral administration.
  • said cyclodextrin derivative is a derivative of an alpha-cyclodextrin, or of a beta-cyclodextrin, or of a gamma-cyclodextrin.
  • Illustrative, non-limiting examples of cyclodextrin derivatives that can be used for the implementation of the present invention include ethyl- ⁇ -CD, heptakis (2,3,6-tri-O-ethyl) - ⁇ -CD, 2 -hydroxypropyl- ⁇ -CD, 2-O-2-hydroxypropyl- ⁇ -CD, 2- hydroxyethyl- ⁇ -CD, succinylated derivatives of ⁇ -CD, succinylated derivatives of 2-hydroxypropyl- ⁇ -CD, butyl- ⁇ -CD, he ⁇ takis (2,6-di-On-butyl) - ⁇ -CD, he ⁇ takis (2,6-di-On-pentyl) - ⁇ -CD,
  • the weight ratio between cyclodextrin, or derivative thereof, and the biodegradable polymer may vary within a wide range, in a particular embodiment, said cyclodextrin weight ratio (or derivative thereof): biodegradable polymer is 1: 1-10, preferably 1: 1-5, more preferably about 1: 4. In a particular embodiment, said biodegradable polymer is PVM / MA.
  • ⁇ -CD and its derivatives are the most commonly used, in particular, 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (OH- ⁇ -CD) since it has a high aqueous solubility, a low toxicity and a more hydrophobic cavity than that of ⁇ -CD.
  • OH- ⁇ -CD 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin
  • the cyclodextrin present in the nanoparticles of the invention has no substituted hydroxyl group.
  • said cyclodextrin is beta-cyclodextrin ( ⁇ -CD), which contains 7 units of ⁇ -1,4-glucopyranoside.
  • ⁇ -CD beta-cyclodextrin
  • biodegradable polymer is 1: 1-10, preferably 1: 1-5, 1: 4 ratios give good results.
  • approximately 0.25 mg of ⁇ -CD / mg biodegradable polymer gives an efficient association.
  • the amount of ⁇ -CD associated with the nanoparticles is approximately 90 micrograms / mg nanoparticle.
  • the cyclodextrin present in the nanoparticles of the invention is a more hydrophilic derivative of ⁇ -CD, such as a hydroxylated derivative of ⁇ -CD comprising one or more hydroxyalkyl groups (e.g., hydroxypropyl).
  • 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin OH- ⁇ -CD
  • the ratio, by weight, OH- ⁇ -CD: biodegradable polymer is 1: 1-10, preferably 1: 1-5, although a 1: 4 ratio yields good results.
  • approximately 0.25 mg of OH- ⁇ -CD / mg biodegradable polymer gives an efficient association.
  • the amount of ⁇ -CD associated with the nanoparticles is approximately 65 micrograms / mg nanoparticle.
  • the cyclodextrin present in the nanoparticles of the invention is a derivative of a CD having one or more terminal functional groups other than hydroxyl, eg, one or more amino groups, optionally substituted.
  • the amino groups may be substituted and have other functional groups, eg, CpC 4 alkyl; Illustrative examples of said substituted amino groups include methylamine, ethylamine, diethylamine, etc.).
  • said amino group is a free, unsubstituted amino group (-NH 2 ).
  • the cyclodextrin derivative present in the nanoparticles of the invention is 6-monodeoxy-6-monoamine- ⁇ -cyclodextrin (NH- ⁇ -CD).
  • the ratio, by weight, NH- ⁇ -CD: biodegradable polymer is 1: 1-10, preferably 1: 1-5, although a 1: 4 ratio yields good results.
  • These nanoparticles are characterized by having, in general, spherical shape and a size close to 150 nm.
  • the cyclodextrin, or derivative thereof, present in the nanoparticles of the invention is selected from the group consisting of ⁇ -cyclodextrin ( ⁇ -CD), 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (OH- ⁇ -CD) , 6-monodeoxy-6- monoamine- ⁇ -cyclodextrin (NH- ⁇ -CD) and mixtures thereof.
  • ⁇ -CD ⁇ -cyclodextrin
  • OH- ⁇ -CD 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin
  • NH- ⁇ -CD 6-monodeoxy-6- monoamine- ⁇ -cyclodextrin
  • nanoparticles based on a biodegradable polymer containing cyclodextrin allow the formation of direct bioadhesive interactions between these vehicles (nanoparticles) and surface components of the gastrointestinal tract. This close contact is of interest to increase the bioavailability of biologically active molecules when administered through some route that gives access to a mucosa (e.g., oral, rectal, vaginal, ocular or nasal).
  • a mucosa e.g., oral, rectal, vaginal, ocular or nasal.
  • nanoparticles based on a biodegradable polymer eg, PVM / MA
  • cyclodextrin empty nanoparticles, that is, without a biologically active molecule
  • said empty nanoparticles comprising a biodegradable polymer (eg, PVM / MA) and a cyclodextrin, or a derivative thereof can be obtained by two alternative methods, namely, by simultaneous incubation of the two components, biodegradable polymer (eg, PVM / MA) and cyclodextrin or derivative thereof (eg, ⁇ -CD, OH- ⁇ -CD or NH- ⁇ -CD) in the organic phase [alternative 1], or by incubation of the polymer nanoparticles biodegradable (eg, PVM / MA) with an aqueous cyclodextrin solution, or a derivative thereof (eg, ⁇ -CD, OH- ⁇ -CD or NH- ⁇ -CD) [alternative 2].
  • biodegradable polymer eg, PVM / MA
  • cyclodextrin or derivative thereof eg, ⁇ -CD, OH- ⁇ -CD or NH- ⁇ -CD
  • the nanoparticles of the invention comprise, in addition to the biodegradable polymer and a cyclodextrin or a derivative thereof, a biologically active molecule.
  • biologically active molecule refers to any substance that is administered to a subject, preferably a human being, for prophylactic or therapeutic purposes; that is, any substance that can be used in the treatment, cure, prevention or diagnosis of a disease or to improve the physical and mental well-being of humans and animals.
  • biologically active molecule includes both drugs and antigens and allergens.
  • the nanoparticles of the invention can incorporate one or more biologically active molecules regardless of the solubility characteristics thereof, although, said nanoparticles have proven to be a particularly useful system for the administration of biologically active molecules of hydrophobic nature.
  • the nanoparticles of the invention make it possible to modify the distribution of the biologically active molecule they contain when administered by a route that gives access to some mucosa of the organism (e.g., oral, rectal, nasal, vaginal, ocular, etc.).
  • a route that gives access to some mucosa of the organism e.g., oral, rectal, nasal, vaginal, ocular, etc.
  • the chemical nature of the biologically active molecule can vary over a wide range, from small molecules to macromolecular compounds (peptides, polynucleotides, etc.).
  • said biologically active molecule is a peptide or a protein.
  • peptide refers to a compound formed by amino acids linked by peptide bonds and includes oligopeptides (formed by 10 or less amino acids) and polypeptides (formed by more than 10 amino acids).
  • protein refers to high molecular mass macromolecules formed by linear chains of amino acids linked by peptide bonds; The proteins can be formed by one or several peptide chains.
  • said biologically active molecule is a nucleoside, a nucleotide, an oligonucleotide, a polynucleotide or a nucleic acid.
  • an "oligonucleotide” is a polymer of nucleotides linked by 5'-3 'phosphodiester bonds of length equal to or less than 50 nucleotides, while a “polynucleotide” is a polymer of nucleotides linked by 5'-bonds. 3 'phosphodiester of length greater than 50 units.
  • nucleic acid also refers to a nucleotide polymer linked by 5'-3 'phosphodiester bonds; Depending on whether it is ribonucleotides or deoxyribonucleotides, the nucleic acid will be RNA or DNA, respectively.
  • Nucleic acids perform different functions in the cells of living organisms such as the storage of genetic information and its transfer to the next generation (DNA) or the expression of that information during protein synthesis (mRNA and tRNA), it is a component Structural structure of cellular organelles, such as ribosomes (rRNA), catalyzes certain chemical reactions (ribozymes) and participates in mechanisms of regulation of gene expression (by complementary mRNA or mRNA RNA in ribointerference).
  • said biologically active molecule is a small (organic or inorganic) molecule; Generally, these molecules are obtained by chemical or semi-synthetic methods or, alternatively, are isolated from their sources.
  • said small (organic or inorganic) molecule has a relatively low molecular weight, generally, equal to or less than 5,000, typically, equal to or less than 2,500, advantageously, equal to or less than 1,500.
  • Numerous therapeutic active ingredients contain these characteristics and, therefore, can be used in the practice of the present invention.
  • the biologically active molecule present in the nanoparticles of the invention can be both a hydrophilic substance and a hydrophobic substance
  • the nanoparticles of the invention are particularly useful for administering biologically active molecules of hydrophobic nature. Therefore, in a particular embodiment, the biologically active molecule present in the nanoparticles of the invention is a hydrophobic substance.
  • a "hydrophobic substance” is a substance that, due to its properties or composition, is poorly soluble in aqueous media, typically having a solubility of less than 1% (1 gram of active ingredient in 100 ml of aqueous solvent) at 20 0 C, at a pH between 1-7.5 and atmospheric pressure.
  • any biologically active molecule of hydrophobic nature It can be used in the practice of the present invention.
  • biologically active molecules of a hydrophobic nature that may be present in the nanoparticles of the invention include antiparasitic agents (eg, albendazole, mebendazole, praziquantel, etc.); antifungals (eg, clotrimazole, itraconazole, etc.), antibiotics (eg, sulfamethiazol, gentamicin, griseofulvin, etc.), cardiotonics (eg, digoxin, etc.), antitumor agents (eg, camptothecin, methotrexate, docetaxel, fluorouracil, paclitaxel , etc.), immunosuppressants (eg, tacrolimus, cyclosporine), (gluco) corticosteroids (eg, cortisone, dexamethasone, prednisolone, pre
  • the biologically active molecule present in the nanoparticles of the invention is a substance that is a substrate of the P-glycoprotein.
  • an important application of the nanoparticles of the invention lies in their ability to minimize the negative effect of P-glycoprotein on the mucosal absorption of a certain drug.
  • P-glycoprotein (PGY1; enzyme EC 3.6.3.44) is a protein that, in humans, is encoded by the ABCBl gene, also called the MDR1 gene (multidrug resistance 1).
  • P-glycoprotein functions as a transmembrane pump or transporter that transfers its substrates (usually drugs and other xenobiotics) from its intracellular domain to its extracellular domain.
  • P-glycoprotein Depending on its anatomical location, P-glycoprotein performs its function in 3 main ways: (1) P-glycoprotein limits the entry of the drug into the body after oral administration as a result of its expression in the luminous membrane of enterocytes ; (2) Once the drug has reached the bloodstream, the P-glycoprotein promotes its elimination in the bile and urine, as a consequence of its expression in the hepatocyte canalicular membrane and in the luminal membrane of the cells of the proximal tubules of the kidneys; and (3) already in the systemic blood circulation, limits the penetration of the drug into sensitive tissues.
  • a substrate substance of the P-glycoprotein refers to a substance, eg, a xenobiotic, with affinity to bind to the intracellular domain of the P-glycoprotein so that by consumption of ATP it can be transported outside the cell according to The following reaction:
  • P-glycoprotein substrates that may be present in the nanoparticles of the invention as biologically active molecules include, among others (Fromm MF; Trends 2004; 25: 423-429), anti-tumor agents (eg, docetaxel, ethoposide, imatinib, paclitaxel, teniposide, vinblastine, vincristine, anthracyclines (eg, doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, etc.), etc.); ⁇ -adrenoceptor antagonists (eg, bunitrolol, carvedilol, celiprolol, talinolol, etc.); Ca 2+ channel blockers (eg, diltiazem, mibefradil, verapamil, etc.); cardiotonic
  • said biologically active molecule is a hydrophobic substance or a substrate substance of the P-glycoprotein enzyme selected from the group consisting of actinomycin D, albendazole, amitriptyline, amprenavir, atorvastatin, bunitrolol, camptothecin, carvedilol, celiprolol, cyclosporine, clotrimazole , colchicine, cortisone, daunorubicin, debrisoquine, dexamethasone, digitoxin, digoxin, diltiazem, docetaxel, domperidone, doxorubicin, epirubicin, erythromycin, estradiol, etoposide, phenytoin, fexofenadine, FKozinavimol, Indigoxin, Griminol, Indigoxamine, Indigoxamine , losartan, lovastatin, mebendazole, methylpred
  • the biologically active molecule present in the nanoparticles of the invention is paclitaxel.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises nanoparticles of the invention containing one or more different drugs.
  • drugs include agents. belonging to different therapeutic groups, for example, anti-tumor agents, ⁇ -adrenoceptor antagonists, analgesic agents, Ca 2+ channel blockers, cardiotonic drugs, antiviral agents, steroids, immunosuppressants, anthemhetic drugs, antibiotics (eg, antibacterials, antifungals, antivirals, antiparasitic agents, etc.) antilipidemic agents, histamine H 1 receptor antagonists, anti-inflammatory agents, neuroprotectors, antiallergics, anti-asthmatics, antibiotics, pulmonary surfactants, etc.
  • agents. belonging to different therapeutic groups for example, anti-tumor agents, ⁇ -adrenoceptor antagonists, analgesic agents, Ca 2+ channel blockers, cardiotonic drugs, antiviral agents, steroids, immunosuppressants, anthemhetic drugs, antibiotics (eg, antibacterials, antifungals,
  • biologically active molecules that are substrates of the P-glycoprotein have a hydrophobic nature.
  • the biologically active molecule delivery system provided by the present invention contemplates the possibility of administering drugs from numerous therapeutic groups.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises nanoparticles of the invention that contain one or more different antigens for vaccination purposes or one or more different allergens for immunotherapeutic purposes as a biologically active molecule.
  • the term "antigen" refers to any substance capable of being recognized by the immune system of a subject and / or capable of inducing in a subject a humoral immune response or a cellular immune response that leads to the activation of B and / or T lymphocytes when introduced into a subject; by way of illustration, said term includes any immunogenic, native or recombinant product, obtained from a higher organism or from a microorganism, for example, a bacterium, a virus, a parasite, a protozoan, a fungus, etc., which contains one or more antigenic determinants, for example, structural components of said organisms; toxins, for example, exotoxins, etc.
  • antigen includes: "microbial” antigens, that is, microorganism antigens, including, but not limited to, viruses, bacteria, fungi and infectious parasites; said antigens include the intact microorganism as well as parts, fragments and derivatives thereof, either of natural or artificial origin, as well as synthetic or recombinant products that are identical or similar to the natural antigens of a microorganism and induce a specific immune response for that microorganism; in this sense, a compound is similar to a natural antigen of a microorganism if it induces an immune response (humoral and / or cellular) like that of the natural antigen of that microorganism; said antigens are used routinely by those skilled in the art; and "tumor" antigens, that is, substances, for example, peptides, associated with a tumor or a cancer ("t
  • EGF-R malignant glioblastoma
  • CEA medullary thyroid cancer
  • CD52 leukemia
  • human melanoma gplOO protein melanoma-A / MART-1 human melanoma protein
  • tyrosinase protein
  • NAl 7- A nt MAGE-3 protein; p53 protein; HPV16E7 protein; antigenic fragments of said antigens; etc.
  • allergen refers to a substance to which a subject is sensitive and causes an immune reaction, for example, allergenic extracts of pollens, allergenic extracts of insects, allergenic extracts of food or products.
  • food components present in saliva, tweezers or stingers of insects that induce a sensitivity reaction in a subject, components present in plants that induce a sensitivity reaction in a subject, etc., for example, protein extracts of pollens, such as grass pollen, allergic extracts of perennial Lolium, allergic extracts of olea (olive), etc .; Protein extracts of insects, such as dust mites, etc .; allergenic extracts of food components, etc.
  • any allergen can be used in the preparation of the nanoparticles loaded with allergen of the composition of the invention; however, in a particular embodiment, said allergen is ovalbumin (OVA), a protein widely used as an experimental allergenic model.
  • OVA ovalbumin
  • Illustrative, non-limiting examples of said biologically active molecules that may contain the nanoparticles of the invention include bacterial: cytoplasmic, periplasmic, cell envelope antigens (eg, inner membrane proteins, outer membrane proteins, lipopolysaccharides and mixed complexes, proteins associated to the cell wall, etc.), etc .; structure antigens superficial (eg, fimbriae, glycocalyx, flagellar, etc.), including those of intracellular pathogens, such as Brucella sp., Salmonella sp., etc .; eukaryotic microorganism antigens, both soluble and superficial; viral antigens, for example, matrix, capsid, envelope, internal (including enzymatic), allergens of animal species (mites, etc.), of plants (grasses, etc.), etc.
  • cell envelope antigens eg, inner membrane proteins, outer membrane proteins, lipopolysaccharides and mixed complexes, proteins associated to the cell wall, etc.
  • the nanoparticles of the invention can be obtained by a method, based on the solvent displacement method described, for example, in international patent application WO 02/069938, which comprises (i) the formation of a complex (cyclodextrin or derivative of the same) - (biologically active molecule), hereinafter complex [CD: MBA], and (ii) the incorporation of said complex [CD: MBA] to a solution of the biodegradable polymer in an organic solvent before the formation of nanoparticles.
  • a complex cyclodextrin or derivative of the same
  • biologically active molecule hereinafter complex [CD: MBA]
  • CD biologically active molecule
  • the formation of said complex [CD: MBA] comprises the addition of a solution of the biologically active molecule (MBA) in an organic solvent, such as an alcohol, for example, ethanol, on an aqueous solution of the cyclodextrin or derivative of it (CD).
  • an organic solvent such as an alcohol, for example, ethanol
  • the whole is subjected to agitation until equilibrium is reached.
  • water and organic solvent e.g., ethanol
  • any appropriate conventional method for example, under reduced evaporation or any other solvent removal system.
  • the CD: MBA molar ratio present in said complex [CD: MBA] can vary over a wide range depending on, among other factors of the cyclodextrin or derivative thereof (CD) and the biologically active molecule (MBA) present in said complex; however, in a particular embodiment, the CD: MBA molar ratio present in said complex [CD: MBA] is 1: 1-4, typically 1: 1-2. In a specific embodiment, when the biologically active molecule is paclitaxel, the CD: MBA molar ratio in said complex [CD: MBA] is 1: 1.
  • the incorporation of said complex [CD: MBA] to a solution of the biodegradable polymer in an organic solvent before the formation of nanoparticles can be carried out by adding said complex to the solution of biodegradable polymer and subsequent simultaneous incubation of both components, polymer biodegradable (eg, PVM / MA) and complex [CD: MBA], in the organic phase (eg, acetone) comprising the biodegradable polymer (eg, PVM / MA), for an appropriate period of time, typically between 10 and 60 minutes, at one temperature between 20 0 C and 30 0 C approximately (in a particular embodiment, when the biologically active molecule is paclitaxel, the incubation can be performed for a period of 30 minutes at room temperature (25 0 C)), stirring , for example, by using a mechanical, magnetic or ultrasonic stirrer); operating in this way, a high degree of association of the complex [CD: MBA] with the biodegradable polymer is obtained in general.
  • polymer biodegradable eg
  • this step comprises the simultaneous dissolution and / or dispersion of the biodegradable polymer and the complex [CD: MBA] in an organic solvent (eg, acetone).
  • an organic solvent eg, acetone.
  • the concentration of the biodegradable polymer is between 0.001% and 10% w / v and that of the complex [CDrMBA] between 0.001% and 5% w / v.
  • a certain volume of a miscible polar solvent is added with the dissolution of the polymers (eg, ethanol).
  • a crosslinking agent can be used to improve the stability of the nanoparticles, as described in WO 02/069938.
  • crosslinking agents include diamine molecules (eg, 1,3-diaminopropane, etc.), simple polysaccharides or saccharides, proteins, and, in general, any molecule that has functional groups capable of reacting with the present groups. in the biodegradable polymer, for example, with the anhydride groups present in PVM / MA.
  • a small amount of any of the indicated products should be added.
  • a similar volume of a second non-solvent liquid preferably a hydroalcoholic solution
  • a second non-solvent liquid preferably a hydroalcoholic solution
  • pharmaceutical grade water purified water or injectable water (pi) is used, depending on the application.
  • the organic phase: hydroalcoholic solution ratio is included in the range between 1: 1 and 1: 10 by volume.
  • the nanoparticles form instantly in the middle, under the appearance of a milky suspension.
  • the organic solvents can be removed by any suitable procedure such as evaporation under reduced pressure, leaving the nanoparticles in a stable aqueous suspension.
  • the nanoparticles can be purified by conventional means such as centrifugation, ultracentrifugation, tangential filtration, or evaporation, including the use of vacuum.
  • the nanoparticles can be lyophilized for long-term storage and preservation.
  • conventional cryoprotective agents such as sucrose, lactose or mannitol can be used, preferably in a concentration of between 0.1 and 10% by weight.
  • the nanoparticles of the invention based on a biodegradable polymer can be obtained by a method comprising incubating the biodegradable polymer nanoparticles (eg, PVM / MA) with an aqueous solution comprising the complex [CD: MBA] .
  • This alternative briefly comprises dissolving the biodegradable polymer in an organic solvent, such as acetone. Subsequently, on that solution, a certain volume of hydroalcoholic solution, such as ethanol, and, finally, a similar volume of water is added.
  • the nanoparticles form instantly in the medium under the appearance of a milky suspension.
  • the organic solvents are removed in a similar way as described in the previous procedure, for example, by evaporation under reduced pressure, the nanoparticles remaining in a stable aqueous suspension.
  • the biodegradable polymer nanoparticles are incubated in an aqueous solution comprising the previously obtained [CD: MBA] complex.
  • the incubation of the biodegradable polymer nanoparticles with the [CDrMBA] complex can be done under stirring (eg, by using a mechanical, magnetic or ultrasonic stirrer) for a certain period of time at an appropriate temperature under conditions similar to those mentioned in the previous procedure (eg, during a period of time generally comprised between 10 and 60 minutes at a temperature between 20 0 C and 30 0 C).
  • the nanoparticles are purified by conventional methods, for example, centrifugation, and, finally, lyophilized, if desired, following the same procedures described above.
  • the weight ratio MBA: biodegradable polymer present in the nanoparticles of the invention can vary within a wide range depending, among other factors of the biodegradable polymer (eg, PVM / MA) and the biologically active molecule (MBA) present in said nanoparticles; however, in a particular embodiment, the ratio MBA: biodegradable polymer, by weight, present in said nanoparticles of the invention is 1: 4-20, preferably 1:10.
  • the complex relationship [CD-MBA]: biodegradable polymer present in the nanoparticles of the invention can vary within a wide range depending, among other factors of the biodegradable polymer (eg, PVM / MA), of the cyclodextrin or derivative thereof and of the biologically active molecule (MBA) present in said nanoparticles; however, in a particular embodiment, the complex ratio [CD-MBA]: biodegradable polymer, by weight, present in said nanoparticles of the invention is 1: 1-20, advantageously 1: 2-20, preferably 3:10 ( approximately 1: 3.3), by weight. In a particular embodiment, the biodegradable polymer is PVM / MA.
  • the biologically active molecule is paclitaxel.
  • the cyclodextrin derivative is ⁇ -cyclodextrin ( ⁇ -CD), 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (OH- ⁇ -CD) or 6-monodeoxy-6-monoamine- ⁇ -cyclodextrin (NH- ⁇ - CD).
  • the biologically active molecule is paclitaxel and the molar ratio (cyclodextrin or derivative thereof): paclitaxel is 1: 1.
  • the [CD: MBA] complex is a ⁇ -CD: paclitaxel complex, in a 1: 1 molar ratio
  • the paclitaxel: biodegradable polymer (eg, PVM / MA) weight ratio is 1: 4 -20, although relations close to 1:10 give good results.
  • PVM / MA biodegradable polymer
  • approximately 0.25 mg of paclitaxel in the ⁇ -CD: paclitaxel complex, in a 1: 1 molar ratio, per mg of polymer gives an efficient association.
  • the amount of drug associated with the nanoparticles is approximately 40 micrograms of paclitaxel / mg nanoparticle.
  • These nanoparticles are characterized by having a spherical shape and a size close to 300 nm.
  • the [CD: MBA] complex is an OH- ⁇ -CD complex, in a 1: 1 molar ratio and the paclitaxel: biodegradable polymer ratio (eg, PVM / MA) is 1: 4- 20, although ratios close to 1: 10 give good results.
  • the amount of drug associated with the nanoparticles is approximately 170 micrograms of paclitaxel / mg nanoparticle.
  • the [CD: MBA] complex is an NH- ⁇ -CD complex, in a 1: 1 molar ratio and the paclitaxel: biodegradable polymer ratio (eg, PVM / MA) is 1: 4- 20, although relations close to 1:10 give good results.
  • the amount of drug associated with the nanoparticles is approximately 100 micrograms of paclitaxel / mg nanoparticle.
  • constant and sustained plasma levels are obtained for at least 24 hours, after reaching the plasma concentration maximum (Cmax) in a time of approximately 5 hours.
  • the maximum plasma concentration (Cmax) is similar to that obtained after administration of the commercial formulation intravenously.
  • the area under the plasma curve (AUC) of paclitaxel obtained by this formulation is approximately 5 times greater than that obtained by intravenous administration of the commercial drug administered at the same dose.
  • This formulation is characterized by offering an average residence time of the drug in the organism (MRT) of approximately 4 times greater than that obtained after the administration of the commercial formulation intravenously.
  • constant and sustained plasma levels are obtained for at least 24 hours after reaching the maximum plasma concentration (Cmax) in a time of approximately 6 hours.
  • the maximum plasma concentration is 2 times higher than that obtained after administration of the commercial formulation intravenously.
  • the area under the plasma curve (AUC) of paclitaxel obtained by this formulation is approximately 5 times greater than that obtained by intravenous administration of the commercial drug administered at the same dose.
  • This formulation is characterized by offering an average residence time of the drug in the organism (MRT) of approximately 3.5 times greater than that obtained after the administration of the commercial formulation intravenously.
  • a dose of 10 mg / kg of paclitaxel formulated in nanoparticles of the invention with NH- ⁇ -CD constant and sustained plasma levels are obtained for at least 24 hours after reaching the maximum plasma concentration (Cmax) in a time of approximately 4.7 hours.
  • the maximum plasma concentration is approximately half of that obtained after administration of the commercial formulation intravenously.
  • the area under the plasma curve (AUC) of paclitaxel obtained by this formulation is approximately similar to that obtained by intravenous administration of the commercial drug administered at the same dose.
  • This formulation is characterized by offering an average residence time of the drug in the organism (MRT) of approximately 3 times greater than that obtained after the administration of the commercial formulation intravenously.
  • the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one nanoparticle of the invention, and a pharmaceutically acceptable excipient, vehicle or adjuvant.
  • said biologically active molecule will be forming a complex with the cyclodextrin or derivative thereof and said complex, mostly, will be inside the nanoparticle of the invention; however, it could happen that a relatively proportion of said complex containing the biologically active molecule was also attached to the surface of the nanoparticle although most of it will be inside (e.g., encapsulated) of the nanoparticles of the invention.
  • the nanoparticles of the invention can be used to modify the distribution of the associated biologically active molecule when administered by a route that gives access to any mucosa of the organism (including the oral, rectal, nasal, vaginal or ocular route). Additionally, they can also be administered parenterally.
  • pharmaceutical compositions include any liquid composition (suspension or dispersion of the nanoparticles) for oral, oral, sublingual, topical, ocular, nasal, vaginal or parenteral administration; any composition in form gel, ointment, cream or balm for topical, ocular, nasal or vaginal administration; or any solid composition (tablets, capsules) for oral administration.
  • the pharmaceutical composition is administered orally.
  • said pharmaceutical composition is administered parenterally.
  • the pharmaceutical compositions described will comprise the excipients suitable for each formulation.
  • binders, disintegrants, lubricants, fillers, enteric coating, etc. will be included if necessary.
  • Oral solid formulations are prepared in conventional manner by mixing, dry or wet granulation and incorporating the nanoparticles of the invention.
  • the pharmaceutical compositions can also be adapted for parenteral administration, in the form of, for example, sterile lyophilized solutions, suspensions or products, in the appropriate dosage form; in this case, said pharmaceutical compositions will include suitable excipients, such as buffers, surfactants, etc. In any case, the excipients will be chosen based on the pharmaceutical form of administration selected.
  • a review of the different pharmaceutical forms of drug administration and their preparation can be found in the book "Treaty of Pharmacy Galenica", by C. Faul ⁇ i Trillo, 10 Edition, 1993, Luzán 5, S.A. of Editions.
  • the proportion of the biologically active molecule incorporated into the nanoparticle of the invention can vary within a wide range, for example, it can be up to 25% by weight with respect to the total weight of the nanoparticles. However, the appropriate proportion will depend in each case on the biologically active molecules incorporated.
  • the dose to be administered of nanoparticles of the invention can vary within a wide range, for example, between about 0.01 and about 10 mg per kg of body weight, preferably, between 0.1 and 2 mg per kg of body weight.
  • Said examples show the ability of said nanoparticles to develop bioadhesive interactions with the mucosa and to promote oral absorption of a biologically active molecule, such as paclitaxel.
  • a biologically active molecule such as paclitaxel.
  • paclitaxel when used as a biologically active molecule, its incorporation into said nanoparticles based on PVM / MA incorporating a cyclodextrin, in particular 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, allows to obtain constant and sustained plasma levels of said drug for at least 24 hours.
  • the process for the production of nanoparticles based on a biodegradable polymer (PVM / MA) incorporating a cyclodextrin, and, optionally, a biologically active molecule is a modification of a general procedure described above and based on the controlled desolvation of the polymer [ Arbos et al., J. Control. Relay, 83 (2002) 321-330].
  • a copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride (PVM / MA) and a certain amount of cyclodextrin, or, alternatively, of a cyclodextrin complex: biologically active molecule, obtained by conventional methods (eg, Hamada et al., J Biosci Bioeng 102 (4): 369-
  • the formed nanoparticles can be coated with a water-soluble biologically active molecule or with a ligand capable of conferring properties of
  • the nanoparticle suspension After homogenization of the nanoparticle suspension, it is evaporated under reduced pressure, for example, by using a rotary evaporator, such as a Büchi R-144 rotary evaporator (Switzerland) until both organic solvents are removed. Subsequently, the suspension is subjected to purification by ultracentrifugation (Sigma 3K30, rotor NM2150, Germany) or by tangential filtration, and eventually, the nanoparticles can be frozen at -80 0 C for subsequent lyophilization and long - term preservation (Virtis Genesis, New York, USA).
  • a rotary evaporator such as a Büchi R-144 rotary evaporator (Switzerland) until both organic solvents are removed.
  • the suspension is subjected to purification by ultracentrifugation (Sigma 3K30, rotor NM2150, Germany) or by tangential filtration, and eventually, the nanoparticles can be frozen at -80 0
  • nanoparticles The characterization of nanoparticles has led to several studies, which are described below. Among the physicochemical studies, the particle size and surface charge of the nanoparticles were determined, the latter by measuring the zeta potential. Both parameters were obtained by photonic correlation spectroscopy, using a Zetasizer nano Z-S (Malvern Instruments / Optilas, Spain).
  • the process performance was calculated by two methods. In the first one, the yield was calculated gravimetrically, using the weight of the lyophilized samples without cryoprotective agent, according to Equation 1:
  • Qimciai is the initial amount of PVM / MA added
  • Q PVM / MA is the amount of PVM / MA determined in the supernatants.
  • the morphology of the nanoparticles was observed by scanning electron microscopy (Zeiss, DSM 940A Germany). For this, the lyophilized nanoparticles were covered with a layer of molecular gold of about 9 nm (Emitech K550, Sputter-Coater, United Kingdom) and the photographs were taken with a Zeiss DMS 940 microscope
  • ⁇ -cyclodextrin ⁇ -cyclodextrin ( ⁇ -CD) and 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (OH- ⁇ -CD)
  • ⁇ -CD ⁇ -cyclodextrin
  • OH- ⁇ -CD 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin
  • the supernatants obtained after the nanoparticle purification process were diluted to 10 ml with purified water. After the addition of the internal standard (PEG 6000), 1 ml aliquots of supernatant were taken as a sample. The samples were analyzed using a Zorbax Eclipse XDB-Phenyl column (Agilent 150 mm x 2.1 mm) and a gradient water / acetonitrile mixture (see table 1) as a mobile phase at flow 0.25 ml / min.
  • the limit of quantification was 0.2 mg / ml for cyclodextrins and 0.05 mg / ml for polymer (PVM / MA). The accuracy did not exceed the 7% limit.
  • the amount of cyclodextrin (CD) associated with the nanoparticles was calculated as the difference between the amount of initially added CD and the amount of quantized CD in the supernatants.
  • the amount of paclitaxel encapsulated in the nanoparticles was determined by HPLC. The analysis was carried out on a model 1100 series LC chromatograph (Agilent, Waldbornn, Germany) coupled to a diode-array UV detection system. The data was analyzed on a Hewlett-Packard computer using the Chem-Station G2171 program. For the separation of paclitaxel, a Phenomenex Gemini C18 reverse phase column (150 mm x 3 mm; 5 ⁇ m) heated to 30 0 C was used.
  • 100 ⁇ l of aqueous nanoparticle suspension were taken and broken with 100 ⁇ l of acetonitrile. The solvents were evaporated (centrifuge-evaporator) and the sample was reconstituted in the mobile phase used. 100 ⁇ l aliquots were injected injected into the HPLC column for analysis.
  • Wistar male rats of average weight 225 g (Har ⁇ an, Spain), were kept under normal conditions free of food and water.
  • the animals were given orally 1 ml of aqueous suspension containing 10 mg of nanoparticles marked with RBITC.
  • the animals were sacrificed at different times (0.5, 1, 3 and 8 hours) by cervical dislocation.
  • the abdominal cavity was opened and the gastrointestinal tract was removed, which was divided into six anatomical regions: stomach (Sto), small intestine (II, 12, 13 and 14) and blind (Ce).
  • Each segment of the mucosa was opened longitudinally and rinsed with PBS (pH 7.4). In turn, each of these parts was cut into five similar portions and the tissue was digested with 1 ml of 3M NaOH for 24 hours.
  • Q 013x is the maximum initial capacity of nanoparticles attached to the gastrointestinal mucosa and is related to their ability to develop bioadhesive interactions
  • AUC a dh is the area under the curve of the fraction of adhered nanoparticles, and represents the intensity of bioadhesion.
  • MRT ad h (h) is the estimated average time that the formulations remain attached to the mucosa.
  • K adh is defined as removal rate of the adhered fraction in the mucosa All these parameters were estimated between 0 and 8 hours The calculations were made using the WinNonlin 1.5 program (Pharsight Corporation, USA).
  • nanoparticles containing cyclodextrins and, optionally, a biologically active molecule, in the gastrointestinal mucosa were observed by fluorescence microscopy.
  • mice were divided into 8 treatment groups (6 animals per group) and treated with single doses of 10 mg / kg (2.25 mg) of paclitaxel incorporated into any of the following formulations:
  • Taxol ® solution iv (Bristol-Myers Squibb, Madrid, Spain); (ii) Taxol ® oral solution;
  • paclitaxel -2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (OH- ⁇ -CD) [PTX-OH- ⁇ -CD] complex;
  • paclitaxel PTX
  • ⁇ -CD ⁇ -cyclodextrin
  • paclitaxel complex (v) paclitaxel complex (PTX) -6-monodeoxy-6-monoamine- ⁇ -cyclodextrin
  • paclitaxel -2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (OH- ⁇ -CD) - PVM / MA
  • NP nanoparticle [PTX-OH- ⁇ -CD-NP] complex
  • Animals were administered 1 ml of the different formulations, dissolved or dispersed in water, except in the case of solution iv (commercial formulation), which was administered in the tail vein (0.3 ml).
  • a blood volume of approximately 300 ⁇ l was extracted at different times, using ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) as an anticoagulant and recovering the animal's volume (rat) with an equivalent volume of physiological serum via intraperitoneal (ip) -
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the blood was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes and the supernatant (plasma) froze at a temperature of -80 0 C.
  • the study was carried out in accordance with the principles contained in the international animal experimentation guidelines (WHO Chronicle, 39 (2): 51-56, 1985; A CIOMS Ethical Code for Animal Experimentation) through a protocol approved by the Ethical Committee for Animal Experimentation of the University of Navarra.
  • Extraction of paclitaxel from plasma was performed by a liquid-liquid extraction procedure, using t-butyl methyl ether as the extraction solvent. For this, plasma aliquots (0.1 ml) were taken, adjusted to a volume of 1 ml with water and 0.2 ⁇ g of docetaxel was added as internal standard. Then, 4 ml of tert-butyl methyl ether was added and stirred for 1 minute. The samples were then centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes and the supernatant (organic phase) was collected and evaporated in an evaporator centrifuge (Savant, Barcelona, Spain).
  • the resulting solution was transferred to an injection vial.
  • the analytical method used has been validated, checking the linear relationship between the detector response and plasma paclitaxel concentrations over the concentration range between 40 and 3,200 ng / ml.
  • the calculated pharmacokinetic parameters were the following: the maximum concentration (C max ); the time in which the C m3x (t max ) is reached; the area under the plasma levels curve (AUCO-inf); the average residence time (MRT) and the biological half-life in the phase of terminal elimination (ti / 2z ), clearance (Cl) and the volume of distribution in steady state
  • the mean residence time (MRT) was calculated by the ratio between the value of the AUMC (area under the curve at the first moment of plasma concentration) and that of the AUC.
  • the clearance (Cl) as Dose x Bioavailability / AUC, and the volume of distribution at steady state (Vss) as the ratio between the clearance and the terminal elimination constant (k), calculated as 1 / MRT.
  • Figure 1 shows the amount of cyclodextrin associated with the nanoparticles as a function of the incubation time with the biodegradable polymer (PVM / MA) during the preparation of the nanoparticles.
  • PVM / MA biodegradable polymer
  • nanoparticles containing cyclodextrins were prepared by controlled desolvation after modification of a procedure described above [Arbos et al., J. Control. Relay, 83 (2002) 321-330]. For this, 25 mg of ⁇ -CD, OH- ⁇ -CD or NH- ⁇ -CD were dispersed in 2 ml of acetone with the help of ultrasound (Microson TM or in an ultrasonic bath for 1 minute under cooling).
  • the suspension was subjected to purification by ultracentrifugation (20 minutes at 27,000 xg) (Sigma 3k3O, NM 2150 rotor, Germany). The supernatants were removed and the residue was resuspended in water or in a 5% aqueous sucrose solution. Eventually, a part of the nanoparticles obtained were frozen at -8O 0 C for subsequent lyophilization and long-term preservation (Virtis Genesis, New York, USA).
  • Experimental conditions PVM / MA: 100 mg; cyclodextrin: 25 mg; incubation time: 30 min.
  • NP PVM / MA based nanoparticles without cyclodextrin.
  • the amount of cyclodextrin associated with the nanoparticles varies depending on the type of oligosaccharide used, being around 90 ⁇ g / mg for ⁇ -CD and 70 ⁇ g / mg for OH- ⁇ -CD and NH- ⁇ -CD .
  • Confirmation of the presence of CD associated with the nanoparticles based on PVM / MA was performed after the elementary analysis of the different formulations. The results obtained (Table 3) confirmed the presence of CD due to a significant increase in the proportion of oxygen in the formulations that carried the associated CD, as well as a decrease in the percentage of carbon, compared to the control nanoparticles (NP).
  • NP PVM / MA control nanoparticles without CD (empty);
  • ⁇ -CD-NP Nanoparticles based on PVM / MA with ⁇ -CD;
  • OH- ⁇ -CD-NP Nanoparticles based on PVM / MA with OH- ⁇ -CD;
  • NH- ⁇ -CD-NP Nanoparticles based on PVM / MA with NH- ⁇ -CD.
  • the morphology of the nanoparticles was observed by scanning electron microscopy (Zeiss, Germany), after which the typical spherical shape of the homogeneous nanoparticles with a size between 80 and 200 nm was observed.
  • the nanoparticles were prepared by controlled desolvation after modification of a procedure described above [Arbos et al., J. Control. Relay, 83 (2002)
  • the nanoparticle suspension was evaporated under reduced pressure. (Büchi R-144, Switzerland) until both organic solvents were removed and the final volume was adjusted with water to 10 ml.
  • an aqueous solution of rhodamine B isothiocyanate (RBITC) was added to the nanoparticles and allowed to incubate for 5 minutes, at room temperature and with magnetic stirring. Subsequently, the suspension was subjected to purification by ultracentrifugation (20 minutes at 27,000 xg) (Sigma 3k30, NM2150 rotor, Germany). The supernatants were removed and the residue was resuspended in water or in a 5% aqueous sucrose solution.
  • Experimental conditions PVM / MA: 100 mg; cyclodextrin: 25 mg; incubation time: 30 min.
  • NP PVM / MA based nanoparticles without CD control (empty) .
  • ⁇ -CD-NP PVM / MA based nanoparticles with ⁇ -CD.
  • OH- ⁇ -CD-NP PVM / MA based nanoparticles with OH- ⁇ -CD.
  • NH- ⁇ -CD-NP Nanoparticles based on PVM / MA with NH- ⁇ -CD.
  • Figure 3 shows the kinetics of RBITC release from the nanoparticles in simulated gastric medium (0-1 h) and in simulated intestinal medium (1 to 24 h) at 37 ⁇ 1 ° C.
  • the percentage of RBITC released after 24 hours of incubation was always less than 10% of the amount associated with the nanoparticles. Therefore, it can be assumed that the results obtained in subsequent bioadhesion studies as well as in fluorescence microscopy, the fluorescence intensity corresponds to the RBITC associated with the nanoparticles.
  • FIG. 4 shows the bioadhesion profile of the tested formulations, representing the fraction of adhered nanoparticles in the different segments of the gastrointestinal tract (stomach; small intestine: 11 -14; blind) 30 minutes, 1 h, 3 h and 8 h after oral administration, according to the methodology previously described.
  • the cyclodextrin associated nanoparticles showed a bioadhesion profile different from that of the control nanoparticles.
  • the OH- ⁇ -CD associated nanoparticles are characterized by an AUC at dh (parameter that measures the intensity of bioadhesive interactions) 1.5 times higher than that observed for control nanoparticles (NP).
  • the adhered fraction of the cyclodextrin-associated formulations showed a significantly lower removal rate (K 8Jh ) than that of the control NP (p ⁇ 0.01) and an average residence time (MRT adh ) of approximately 3.5 hours.
  • the nanoparticles associated with hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin have a greater capacity to establish bioadhesive interactions with the mucosa than the control nanoparticles.
  • Conventional nanoparticles were not able to reach the enterocytes despite their ability to penetrate the mucus layer that covers the mucosa.
  • the cyclodextrin-associated nanoparticles adhered significantly in the intestine enterocytes.
  • aqueous solution of cyclodextrin ( ⁇ -CD, OH- ⁇ -CD or NH- ⁇ -CD) was prepared which was added over an ethanolic solution of the drug paclitaxel (PTX) in an 80:20 ratio (v: v ), and with a molar ratio drug: cyclodextrin (1: 1).
  • the mixture was kept under magnetic stirring (300 rpm), in darkness and at room temperature until equilibrium was reached (at least 72 hours). Then, the ethanol was removed under evaporation under reduced pressure and the suspension (0.45 ⁇ m) was filtered to remove undissolved drug crystals.
  • the nanoparticles were obtained by controlled desolvation after modification of a procedure described above (Arbos et al, 2002, cited sup.). For this, a certain amount of the previously formed complex between paclitaxel and cyclodextrin ( ⁇ -CD, OH- ⁇ -CD or NH- ⁇ -CD) was dispersed in 2 ml of acetone. This suspension was added to a solution of 100 mg of the copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride (PVM / MA) [Gantrez® AN 119] in 3 ml of acetone and the mixture was allowed to incubate for 30 minutes.
  • PVM / MA copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride
  • Figure 7 shows the evolution of PTX content in nanoparticles containing cyclodextrins and PTX, as a function of the amount and type of cyclodextrin used.
  • Table 7 shows the amount of encapsulated PTX when initially added in 10 mg depending on the different cyclodextrins used to form the complex.
  • Table 7 Amount of PTX associated with different nanoparticle formulations depending on the type of cyclodextrin used (initial amount of paclitaxel added: 10 mg)
  • PTX-NP conventional PVM / MA nanoparticles with paclitaxel
  • PTX- ⁇ -CD-NP PVM / MA and ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • PTX-OH- ⁇ -CD-NP PVM / MA and OH- ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • PTX-NH- ⁇ -CD-NP PVM / MA and NH- ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel.
  • Paclitaxel is a drug that is characterized by presenting a dose-dependent pharmacokinetic profile. Therefore, it was previously necessary to determine the pharmacokinetic profile after intravenously or orally administering the commercial formulation of paclitaxel at the dose selected for its nanoparticle formulation (10 mg / kg).
  • PTX-NP conventional PVM / MA nanoparticles with paclitaxel
  • PTX- ⁇ -CD-NP PVM / MA and ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • PTX-OH- ⁇ -CD-NP PVM / MA and OH- ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • PTX-NH- ⁇ -CD-NP PVM / MA and NH- ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel.
  • Table 8 summarizes the main physicochemical characteristics of the nanoparticles tested in the pharmacokinetic study.
  • Control nanoparticles show a size close to 200 nm with a negative surface charge of -38 mV.
  • nanoparticles containing the PTX-CD complex are encapsulated significantly higher (close to 300 nm) and show similar zeta potential in all cases.
  • the presence of the PTX-CD complex does not exert any effect on the manufacturing performance of nanoparticles that varies between 50-60%.
  • the pharmacokinetic study was divided into three phases.
  • the dose of paclitaxel selected was 10 mg / kg. After administration, a blood volume of approximately 300 ⁇ l was extracted at different times (0.10, 30, 60, 90, 180, 360, 480 minutes, 24 and 30 hours), using EDTA as an anticoagulant and recovering the blood volume of the animal (rat) with an equivalent volume of physiological serum intraperitoneally (ip) -
  • the pharmacokinetic analysis of the results obtained after the administration of paclitaxel was performed using the noncompartmental adjustment procedure of the WiNNonlin 1.5 pharmacokinetic adjustment program (Pharsight Corporation, Mountain View, United States).
  • Table 9 shows the values of the pharmacokinetic parameters obtained after performing a non-compartmental analysis of the experimental data obtained after administering the different formulations of paclitaxel in nanoparticles.
  • the value of AUC and MRT experiences significant variations depending on the type of cyclodextrin used in the formulation.
  • oral formulations of PTX-OH- ⁇ -CD-NP and PTX- ⁇ -CD-NP were obtained similar AUC values.
  • the maximum concentration reached was significantly higher than that achieved in the rest of formulations in a period of 6 and 5 hours, respectively.
  • the average residence time of the drug in the organism (MRT) was similar for the three formulations with cyclodextrins. These values were between 3 and 5 times higher than those achieved after administering the commercial formulation (Taxol) intravenously.
  • T 1 Z 22 the elimination half - life of the drug in the terminal phase was similar for the formulations of nanoparticles containing cyclodextrin and paclitaxel, and, in any case, less than that obtained for the commercial formulation administered intravenous (Taxol ® ).
  • PTX-OH- ⁇ -CD-NP PVM / MA and OH- ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • PTX- ⁇ -CD-NP PVM / MA and ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • PTX-NH- ⁇ -CD-NP PVM / MA and NH- ⁇ -CD nanoparticles with paclitaxel
  • PTX-NP conventional PVM / MA nanoparticles with paclitaxel.

Abstract

Las nanopartículas comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa. Dichas nanopartículas pueden asociar elevadas cantidades de moléculas biológicamente activas, especialmente, de naturaleza hidrófoba, y liberar la molécula biológicamente activa proporcionando unos niveles plasmáticos sostenidos y constantes de la misma cuando son administradas por vía oral o a través de cualquier otra mucosa del organismo.

Description

NANOPARTÍCULAS QUE COMPRENDEN UNA CICLODEXTRINA Y UNA MOLÉCULA BIOLÓGICAMENTE ACTIVA Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con unas nanopartículas, con características bioadhesivas, que comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa. La invención también se relaciona con un procedimiento para su producción, con composiciones que contienen dichas nanopartículas y con sus aplicaciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En los últimos años, se ha desarrollado el uso de nanopartículas poliméricas biodegradables como vehículos para la administración de fármacos, especialmente, por vía oral. Las nanopartículas se definen, en general, como sistemas coloidales de tipo partícula sólida, con un tamaño inferior al micrómetro, constituidas por polímeros naturales o sintéticos. Dependiendo del proceso seguido en su elaboración se pueden obtener dos tipos de estructuras: nanoesferas o nanocápsulas. Las nanoesferas tienen una estructura de tipo matriz polimérica, en la que se encuentra dispersado el principio activo, mientras que las nanocápsulas poseen un núcleo que contiene el principio activo, rodeado de una cubierta, tal como una cubierta polimérica. Debido a la elevada superficie específica de estos sistemas el principio activo también puede ser adsorbido sobre la superficie del sistema nanoparticular.
La vía oral es la vía más popular y atractiva para la administración de medicamentos. El uso de esta vía se asocia con un aumento significativo de la aceptación de la medicación por parte del paciente y con menores costes sanitarios. Sin embargo, un importante número de fármacos presenta una eficacia muy baja cuando se administran por medio de esa vía. Este fenómeno puede ser debido a uno o varios de los siguientes factores que condicionan la biodisponibilidad oral de un fármaco: (i) baja permeabilidad de la molécula activa para atravesar la mucosa (asociado generalmente a fármacos de naturaleza hidrófila), (ii) baja estabilidad en el ambiente gastrointestinal (presencia de valores de pH extremos, enzimas, etc.), (iii) liberación incompleta del fármaco desde la forma de dosificación, (iv) baja solubilidad del principio activo en el ambiente gastrointestinal (asociado a fármacos de naturaleza hidrófoba), y (v) metabolismo presistémico.
Los sistemas nanoparticulados permiten, en numerosas ocasiones, aumentar de forma significativa la biodisponibilidad de la molécula biológicamente activa y, así, ofrecer nuevas estrategias de administración. La mejora de la biodisponibilidad obtenida tras utilizar estos vehículos se puede explicar mediante la habilidad de las nanopartículas poliméricas para desarrollar interacciones bioadhesivas con el tracto de la mucosa gastrointestinal. Así, cuando una suspensión de nanopartículas se administra por la vía oral, estos transportadores pueden interaccionar y desarrollar interacciones adhesivas con diversos componentes de la mucosa. Dependiendo de ciertos parámetros físico-químicos (tales como la naturaleza del polímero, tamaño, carga superficial o la presencia de ciertos recubrimientos o ligandos en el vehículo), las características bioadhesivas de las nanopartículas pueden variar y permitir, en ciertos casos, alcanzar la superficie del entericito, y, eventualmente, desarrollar interacciones bioadhesivas en regiones muy concretas del tracto gastrointestinal. Todos estos fenómenos conducen a (i) un incremento del tiempo de residencia de la forma farmacéutica en contacto íntimo con la superficie de la mucosa, o a (ii) una localización específica del vehículo (con el fármaco) en una determinada zona. Una vez que las nanopartículas están adheridas a la mucosa, éstas pueden promover la absorción del fármaco transportado y su acceso a la circulación sistémica mediante diversos mecanismos. Ejemplos ilustrativos de fármacos cuya biodisponibilidad oral aumenta mediante su encapsulación o asociación a nanopartículas incluyen calcitonina de salmón, furosemida, avarol, dicumarol, nifedipina, fiuoropirimidinas, plásmidos, etc.
Como polímeros biodegradables para la fabricación de sistemas particulados tienen especial importancia los homo- y co-polímeros de los ácidos láctico y glicólico (PLGA) ya que presentan una buena compatibilidad tisular, no son tóxicos y han sido usados durante muchos años como material de suturas reabsorbibles. Estos (co)polímeros son solubles en disolventes orgánicos, tales como cloroformo, diclorometano, acetona y acetato de etilo e insolubles en medios acuosos; sin embargo, son capaces de captar agua e hincharse en mayor o menor grado, dependiendo de su peso molecular y de su composición. Entre los inconvenientes que presentan estos polímeros merece la pena resaltar que el PLGA puede resultar bastante hidrófobo comparado con muchos de los antígenos que transporta. Además, tanto la hidratación como la degradación del PLGA son requisitos imprescindibles para la liberación del antígeno durante la fase de erosión. Esta erosión produce un microentorno bastante ácido debido a la acumulación de los productos de degradación del polímero, los ácidos láctico y glicólico; el pH puede bajar hasta ser del orden de 2-3. En estas condiciones, las proteínas liberadas sufren hidrólisis y agregación en el medio acidificado y muchos antígenos pierden su capacidad antigénica. Finalmente, su elevado precio podría limitar su uso y favorecería la búsqueda de otros materiales menos costosos.
Como alternativa a los poliésteres, las nanopartículas preparadas con otros polímeros han resultado ser adecuadas para la administración de fármacos por vía oral. Uno de los polímeros más utilizados es el quitosano. El quitosano es un polímero similar a la celulosa que proviene de la desacetilación de la quitina, componente mayoritario del exoesqueleto de los crustáceos. El quitosano puede formularse en nanopartículas de diferentes tamaños donde lleva el fármaco incorporado. Las partículas de quitosano son capaces de aumentar la absorción de proteínas en la superficie mucosa, induciendo una apertura transitoria de las uniones estrechas. Además, el quitosano puede tener un efecto inmunomodulador, estimulando la producción de citoquinas in vitro y mejorando el balance natural Th2/Th3 a nivel de mucosas en ausencia de antígeno.
Recientemente, se ha propuesto el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez®], como material biodegradable para producir nanopartículas (Arbos et al., J. Control. Reléase, 83 (2002) 321-330). Estos copolímeros PVM/MA son ampliamente utilizados como espesantes, estabilizantes de soluciones acuosas, componentes de adhesivos dentales, parches transdérmicos y en comprimidos bucales. Entre las principales ventajas de estos polianhídridos merece la pena destacar su bajo coste, su baja toxicidad oral y la disponibilidad de grupos funcionales que pueden reaccionar fácilmente con moléculas que contengan grupos hidroxilo o amino (Arbos et al., J. Control. Reléase, 89 (2003) 19-30). De este modo, en un medio acuoso, el grupo anhídrido se hidroliza dando lugar a dos grupos carboxilos y esta reacción permite unir ligandos fácilmente a la cadena polimérica o bien a la superficie de las nanopartículas preparadas. Las ciclodextrinas (CD) son un grupo de oligosacáridos cíclicos, obtenidos por degradación enzimática del almidón. Están compuestas por unidades de α-1,4- glucopiranosa unidas entre sí, formando una estructura de tipo cono truncado con una cavidad interna hidrófoba. Las CD pueden contener más de 15 unidades de α-1,4- glucopiranosa, aunque las más abundantes contienen 6 (α-CD), 7 (β-CD) ú 8 (γ-CD) unidades de α-l,4-glucopiranosa. En aplicaciones farmacéuticas, la β-CD y sus derivados son los más utilizados, en particular, la 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (OH- β-CD). Esta CD presenta una elevada solubilidad acuosa, una toxicidad inferior así como una cavidad más hidrófoba en comparación con el compuesto de origen (β-CD). Los complejos formados mediante la utilización de ciclodextrinas pueden proporcionar, a la molécula huésped, estabilidad y aumento de solubilidad acuosa, lo que puede llevar a incrementos de la biodisponibilidad de esa molécula (e.g., fármaco) y/o la reducción de efectos adversos. Además, se ha descrito en la literatura la capacidad de aumentar la capacidad de carga de liposomas y micropartículas. Asimismo, las CD son capaces de modificar el perfil de liberación del fármaco encapsulado.
Numerosos agentes antitumorales se administran por vía parenteral, lo que plantea diversos problemas. Entre las principales ventajas que supondría la administración de agentes antitumorales por vía oral, merece la pena destacar el aumento de la calidad de vida de los pacientes así como la reducción de los costes sanitarios. Esta vía de administración permitiría una exposición continua de las células cancerosas al fármaco antitumoral a un nivel de concentración apropiado y sostenido lo que puede mejorar el índice terapéutico y reducir los efectos secundarios. Sin embargo, la gran mayoría de estos fármacos (e.g., paclitaxel) presentan una baja biodisponibilidad al ser administrados por vía oral.
El paclitaxel (Taxol®, Bristol Myers Squibb Company), un producto extraído del árbol Taxus brevifolia, fue descrito por primera vez en 1.971 y desde 1.993 es el agente quimioterápico contra el cáncer más empleado en todo el mundo. El paclitaxel actúa a nivel celular promoviendo la polimerización de la tubulina. De este modo, los microtúbulos formados en presencia de paclitaxel son extraordinariamente estables y no funcionales, causando así la muerte celular por la incapacidad dinámica y funcional de los microtúbulos para la división celular. En Europa, este fármaco está indicado tanto como agente individual como en combinación con otros tratamientos oncológicos para el tratamiento de cáncer de ovario, de mama y de células pulmonares no pequeñas, tanto avanzado como metastático.
El principal inconveniente de este fármaco radica en su escasa biodisponibilidad oral debido a su baja solubilidad acuosa y al efecto de metabolismo de primer paso principalmente. Tras la administración oral, el paclitaxel es sustrato de la glicoproteina- P, así como de otros miembros de la superfamilia ABC (ATP-binding cassette), tales como BCRP y MRP2. La superfamilia ABC transportadora de proteínas juega un papel central en la defensa del organismo frente a compuestos tóxicos y frente a algunos agentes anticancerosos. Dichas proteínas (glicoproteina-P, MRP2 y BCRP) están localizadas en la zona apical de las membranas intestinal, hepática y renal, mediando el bombeo de xenobióticos y toxinas a la luz intestinal, biliar y orina. Además, tanto la glicoproteina-P como MRP2 se localizan conjuntamente junto con CYP3 A4, glutation- S-transferasas y UDP-glucuronosiltransferasas lo que supone una actuación sinérgica en la regulación de la biodisponibilidad oral de los fármacos administrados. Por todo ello, actualmente, el paclitaxel está formulado para su uso en clínica y por vía intravenosa en un vehículo compuesto por Cremophor EL:etanol (1 :1). Con el fin de prevenir y minimizar los efectos tóxicos del Cremophor EL por vía intravenosa y mejorar el índice terapéutico del fármaco, recientemente, se ha comercializado una nueva formulación basada en la encapsulación del fármaco en nanopartículas de albúmina denominada Abraxane® (Green et al. Annals of Oncology 17:1263-1268, 2006).
Por tanto, existe la necesidad de desarrollar sistemas de administración de fármacos capaces de aumentar la biodisponibilidad cuando se administran por vía oral de numerosos principios activos, especialmente, de aquellos fármacos de naturaleza lipófila y/o que sean sustrato de la glicoproteína-P (e.g., paclitaxel). Ventajosamente, dichos sistemas de administración deberían tener propiedades bioadhesivas, deberían tener la capacidad de incorporar cantidades variables de fármacos lipófilos, e, idealmente, deberían ser capaces de evitar el efecto de la glicoproteína-P sobre el fármaco transportado. Estos objetivos pueden ser conseguidos mediante las nanopartículas proporcionadas por la presente invención.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que la asociación de las nanopartículas de un polímero biodegradable, tal como el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA), con ciclodextrinas unidas a moléculas biológicamente activas, permite obtener unas nanopartículas con características fisicoquímicas y de bioadhesión a la mucosa gastrointestinal que las convierten en sistemas de gran interés como transportadores de todo tipo de moléculas biológicamente activas, especialmente, moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba (lipófila), tal como el paclitaxel. Dichas nanopartículas pueden prolongar el tiempo de residencia en la mucosa tras su administración oral. Además, dichas nanopartículas pueden mejorar la biodisponibilidad de moléculas biológicamente activas que pudieran ser sustrato de la glicoproteína-P. Asimismo, dichas nanopartículas pueden utilizarse como sistemas para la administración de fármacos con elevada toxicidad (e.g., citostáticos) al ofrecer niveles plasmáticos sostenidos y constantes de la molécula biológicamente activa durante periodos de tiempo de hasta 24 horas, lo que posibilita tratamientos alternativos a la perfusión hospitalaria, permitiendo un abaratamiento del coste sanitario de los tratamientos con este tipo de fármacos.
Por tanto, la invención proporciona unas nanopartículas con capacidad para asociar elevadas cantidades de moléculas biológicamente activas, especialmente, de naturaleza hidrófoba, para su administración efectiva a través de mucosas, especialmente, por vía oral, debido a que presentan unas características bioadhesivas adecuadas que favorecen la interacción de las nanopartículas (conteniendo la molécula biológicamente activa) con la superficie de la mucosa, son capaces de transportar un amplio rango de moléculas biológicamente activas, especialmente, de naturaleza lipófila y, sobretodo, de liberar la molécula biológicamente activa proporcionando unos niveles plasmáticos sostenidos y constantes del mismo cuando son administradas por vía oral o a través de cualquier otra mucosa del organismo. Si la molécula biológicamente activa transportada es sustrato de la glicoproteína-P, las nanopartículas de la invención son capaces de evitar la acción de esta proteína sobre la molécula biológicamente activa en cuestión.
Las nanopartículas proporcionadas por esta invención comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa. En particular, se ha encontrado que nanopartículas formadas por un copolímero de polivinil metil éter y anhídrido maleico y β-ciclodextrina (β-CD), 2- hidroxipropil-β-ciclodextrina (OH-β-CD) ó 6-monodeoxi-6-monoamino-β-ciclodextrina (NH-β-CD) son fáciles de producir, y dan excelentes características de bioadhesión, tamaño y potencial zeta que las hace adecuadas para la administración de moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba (e.g., paclitaxel). Además, se ha encontrado que la selección del tipo de ciclodextrina utilizada en su producción permite modular convenientemente las características de estas nanopartículas lo cual puede ser aprovechado ventajosamente según el tipo de molécula biológicamente activa a transportar y/o el modo de administración de la formulación farmacéutica. Por último, se ha encontrado que la incorporación del paclitaxel en estas nanopartículas permite incrementar de forma muy importante la biodisponibilidad oral del mismo, minimizando el efecto de la glicoproteína-P a nivel de la mucosa gastrointestinal.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención se relaciona con nanopartículas que comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa, útiles para el transporte de moléculas biológicamente activas. En una realización particular, el polímero biodegradable es un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA). En otra realización particular, la ciclodextrina es β-CD, OH-β-CD o NH-β-CD.
En una realización particular, la molécula biológicamente activa presente en las nanopartículas de la invención es paclitaxel. En este caso, las nanopartículas permiten aumentos espectaculares de la biodisponibilidad oral del paclitaxel, cuya absorción oral es prácticamente nula debido a sus características fisico-químicas (elevada lipofilia) y a ser sustrato de la glicoproteína-P localizada en el tracto gastrointestinal.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende dichas nanopartículas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de dichas nanopartículas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una gráfica que muestra la variación de la cantidad de ciclodextrina (CD) asociada a las nanopartículas de PMVTMA en función del tipo de CD utilizada [β-CD: β -ciclodextrina; OH-β-CD: 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina; NH- β-CD: 6-monodesoxi-6-monoamino-β-ciclodextrina] y del tiempo de incubación de ésta con el copolímero de metilviniléter y anhídrido maleico (PVM/MA) (100 mg) antes de la preparación de las nanopartículas. Los resultados muestran la media ± desviación típica (n = 8). La Figura 2 es una fotografía del resultado obtenido al someter una muestra liofilizada de nanopartículas a base de PVM/MA con β-ciclodextrina (β-CD-NP) a microscopía de barrido electrónico.
La Figura 3 es una gráfica que muestra la liberación de RBITC desde nanopartí culas que contienen ciclodextrinas (β-CD-NP: nanopartículas a base de
PVM/MA con β-CD; OH-β-CD-NP: nanopartículas a base de PVM/MA con OH-β-CD; NH-β-CD-NP: nanopartículas a base de PVM/MA con NH-β-CD) y de las nanopartículas control (NP) tras su incubación en medio gástrico simulado (durante la primera hora: 0-1 h) y en medio intestinal simulado (1 a 24h) a 37±1°C. Los datos muestran la media ± desviación típica (n=3).
La Figura 4 muestra un diagrama de barras que representa la distribución de (A) nanopartículas a base de PVM/MA con hidroxipropil-β-CD (OH-β-CD-NP); (B) nanopartículas a base de PVM/MA con β-CD; y (C) nanopartículas control (NP), en la mucosa del tracto gastrointestinal tras la administración oral de 10 mg de nanopartículas marcadas fluorescentemente con RBITC. El eje x representa los diferentes segmentos de la mucosa; el eje y representa la fracción de nanopartículas adherida a la mucosa; y el eje z representa el tiempo después de la administración.
La Figura 5 es una gráfica que muestra las curvas de bioadhesión obtenidas al representar la fracción de nanopartículas adherida en el tracto gastrointestinal entero respecto al tiempo. Las formulaciones representadas son (•) OH-β-CD-NP; (A) β-CD- NP; y (B) NP Control. Los valores representan la media ± desviación estándar (n=3).
La Figura 6 es un conjunto de fotografías que muestran la visualización por microscopía de fluorescencia de las nanopartículas control (A) y OH-β-CD-NP (B, C) adheridas al íleo de rata tras 2 horas de la administración oral de una única dosis de 10 mg.
La Figura 7 es una gráfica que muestra la evolución de la cantidad de paclitaxel (PTX) encapsulado en diferentes formulaciones en función del tipo de ciclodextrina utilizada y la cantidad de fármaco añadido inicialmente. Los resultados muestran media±desviación típica (n = 6). PTX-NP: nanopartículas convencionales de PVM/MA con paclitaxel; PTX-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y β-CD con paclitaxel; PTX-OH-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y OH-β-CD con paclitaxel; y PTX- NH-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y NH-β-CD con paclitaxel.
La Figura 8 es un conjunto de gráficas que representan las concentraciones plasmáticas de paclitaxel (PTX) en función del tiempo tras la administración en animales de laboratorio de las distintas formulaciones de PTX. Los resultados muestran la media ± desviación típica. (A) Vía intravenosa, dosis: 10 mg/kg. Taxol®: formulación comercial de paclitaxel. (B) Vía oral, dosis: 10 mg/kg. Taxol®: formulación comercial de paclitaxel; PTX-β-CD: complejo β-CD con paclitaxel; PTX- OH-β-CD: complejo OH-β-CD con paclitaxel; PTX-NH-β-CD: complejo NH-β-CD con paclitaxel. (C) Vía oral, dosis: 10 mg/kg. PTX-NP: nanopartículas convencionales de PVM/MA con paclitaxel; PTX-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y β-CD con paclitaxel; PTX-OH-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y OH-β-CD con paclitaxel; PTX-NH-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y NH-β-CD con paclitaxel; Taxol®: formulación comercial con paclitaxel. Los valores obtenidos para la formulación de taxol comercial y PTX-NP se superponen y aparecen sobre el eje de las X (Tabla 9).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Nanopartículas
En un aspecto, la invención se relaciona con unas nanopartículas, en adelante nanopartículas de la invención, que comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa. Las nanopartículas de la invención poseen unas adecuadas características físico- químicas, de especificidad y de bioadhesión a la mucosa gastrointestinal, lo que las convierte en sistemas potencialmente útiles para el transporte de moléculas biológicamente activas, en particular, moléculas biológicamente activas de naturaleza lipófila (e.g., paclitaxel, etc.) y/o moléculas biológicamente activas que sean sustrato de la glicoproteína-P. Las nanopartículas de la invención pueden mejorar la biodisponibilidad de moléculas biológicamente activas, en general, y, en particular, de moléculas biológicamente activas de naturaleza lipófila y/o de moléculas biológicamente activas que puedan ser sustrato de la glicoproteína-P. De hecho, las nanopartículas de la invención pueden prolongar el tiempo de residencia en la mucosa tras su administración por vía oral. Asimismo, las nanopartículas de la invención pueden ser utilizados como sistema de transporte de moléculas biológicamente activas con elevada toxicidad, por ejemplo, citostáticos, debido a que ofrecen niveles plasmáticos sostenidos y constantes de tales fármacos durante periodos de tiempo de hasta 24 horas, lo que permite el diseño de tratamientos alternativos a la perfusión hospitalaria, redundando en un abaratamiento del coste sanitario de los tratamientos con este tipo de fármacos.
El término "nanopartícula", tal como aquí se utiliza, se refiere a esferas o formas similares con un tamaño medio inferior a 1,0 micrómetro (μm). En general, las nanopartículas de la invención presentan un tamaño medio de partícula comprendido entre 1 y 999 nanómetros (nm), preferentemente entre 10 y 900 nm. En una realización particular, las nanopartículas de la invención presentan un tamaño medio de partícula comprendido entre 100 y 400 nm.
Por "tamaño medio" se entiende el diámetro promedio de la población de nanopartículas que se mueve conjuntamente en un medio acuoso. El tamaño medio de estos sistemas se puede medir por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia y que se describen, a modo ilustrativo, en la parte experimental que acompaña a los ejemplos descritos más adelante. El tamaño medio de las partículas puede verse influenciado principalmente por la cantidad y peso molecular del polímero biodegradable, por la naturaleza y cantidad de la ciclodextrina, o derivado de la misma, y por la naturaleza y cantidad de la molécula biológicamente activa, presentes en las nanopartículas de la invención (en general, a mayor cantidad o peso molecular de dichos componentes, el tamaño medio de la nanopartícula se incrementará), y por algunos parámetros del procedimiento de producción de dichas nanopartículas, tales como la velocidad de agitación, etc.
Polímero biodegradable Las nanopartículas de la invención comprenden un polímero biodegradable. El término "biodegradable", tal como aquí se utiliza, se refiere a polímeros que se disuelven o degradan en un periodo de tiempo que es aceptable para la aplicación deseada, en este caso terapia in vivo, una vez que se exponen a una solución fisiológica de pH comprendido entre 1 y 9, típicamente, entre 4 y 9, a una temperatura comprendida entre 25°C y 400C.
Prácticamente cualquier polímero biodegradable conocido en el estado de la técnica que dé lugar a la formación de nanopartículas puede ser utilizado para la puesta en práctica de la presente invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos polímeros biodegradables incluyen polihidroxiácidos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., y copolímeros de éstos, e.g., poli(ácido láctico-co-glicólico) [PLGA], etc.; polianhídridos; poliésteres; polisacáridos, e.g., quitosano, etc. El peso molecular de dicho polímero biodegradable puede variar dentro de un amplio intervalo siempre y cuando satisfaga las condiciones establecidas de formar nanopartículas y ser biodegradable.
En una realización particular, el polímero biodegradable utilizado es el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico en forma anhídrido (PVM/MA). En una realización concreta puede utilizarse, por ejemplo, el copolímero PVM/MA comercializado con la denominación comercial Gantrez® AN. En una realización particular, dicho copolímero PVM/MA tiene un peso molecular comprendido entre 100 y 2.400 kDa, preferentemente entre 200 y 2.000 kDa, más preferentemente entre 180 y 250 kDa. Este polímero biodegradable (PVM/MA) resulta particularmente ventajoso ya que se utiliza ampliamente en tecnología farmacéutica debido a su baja toxicidad (DL50 = 8-9 g/kg por vía oral) y excelente biocompatibilidad. Además, es fácil de obtener, tanto por la cantidad como por su precio. Este polímero biodegradable (PVM/MA) puede reaccionar con distintas sustancias hidrófilas, debida a la presencia de sus grupos anhídridos, sin tener que recurrir a los reactivos orgánicos usuales (glutaraldehído, derivados de carbodiimida, etc.) que poseen una toxicidad importante. En un medio acuoso, el copolímero PVM/MA es insoluble, pero sus grupos anhídrido se hidrolizan dando lugar a unos grupos carboxílicos. La disolución es lenta y depende de las condiciones en las que se produce. Debido a la disponibilidad de grupos funcionales en PVM/MA, la unión covalente de moléculas con grupos nucleofílicos, tales como hidróxido o amino, tiene lugar por simple incubación en un medio acuoso.
La solicitud de patente internacional WO 02/069938, cuyo contenido se incorpora en esta descripción por referencia, describe nanopartículas de copolímero PVM/MA. A modo ilustrativo, dichas nanopartículas de copolímero PVM/MA pueden obtenerse fácilmente por desolvatación del copolímero, mediante la adición, a una solución orgánica del mismo, de un primer disolvente polar (miscible con una disolución del copolímero) y posterior adición de un segundo líquido no disolvente, tal como una solución hidroalcohólica. Opcionalmente, se puede adicionar un agente reticulante.
Ciclodextrina y sus derivados
Las nanopartículas de la invención comprenden, además del polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "ciclodextrina" incluye cualquier oligosacárido cíclico compuesto por unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos α-1,4 (α-l,4-glucopiranosa). Estas unidades se producen como resultado de una reacción de transglicosilación intramolecular de la degradación del almidón por la enzima ciclodextrina glucanotransferasa (CGTasa). La "ciclodextrina" puede contener más de 15 unidades de α-l,4-glucopiranosa, aunque las más abundantes contienen 6, 7 ú 8 unidades de α-l,4-glucopiranosa, que constituyen las denominadas alfa-ciclodextrinas (α-CD), beta-ciclodextrinas (β-CD) o gamma-ciclodextrinas (γ-CD), respectivamente. Todas ellas tienen una estructura de tipo cono truncado, con una cavidad interna hidrófoba y una cara externa hidrófila. Esto es debido a que los grupos hidroxilo se encuentran orientados hacia el exterior de la ciclodextrina mientras que en su cavidad interna, de carácter hidrófobo, esta cubierta por los hidrógenos del grupo metileno así como por oxígenos tipo éter. De este modo es capaz de actuar como hospedador atrapando a la molécula huésped de forma completa o parcial. En una realización particular, dicha ciclodextrina es una alfa-ciclodextrina, una beta-ciclodextrina o una gamma-ciclodextrina.
El término "derivado de ciclodextrina", tal como se utiliza en esta descripción, incluye cualquier ciclodextrina que presenta, al menos, un grupo hidroxilo terminal modificado. La modificación química de las ciclodextrinas puede alterar sus propiedades químico-físicas, mejorando la solubilidad, estabilidad y controlando la actividad química de las moléculas con las que están unidas (moléculas huésped). Se ha descrito la incorporación, mediante reacción de los grupos OH de las ciclodextrinas, de grupos alquilo, arilo, carboxialquilo, cianoalquilo, hidroxialquilo, sulfoalquilo, amino, azido, heterociclilos, acetilo, benzoilo, succinilo, y otros grupos que contienen fósforo, azufre, etc. (Robyt (1998) "Essentials of carbohidrate chemistry", Ed. Charles R. Cantor, Springer Advanced Text in Chemistry). En una realización particular, al menos, uno de dichos grupos hidroxilo terminales está modificado, reemplazando el hidrógeno por un grupo alquilo CpC8 lineal o ramificado, e.g., metilo, etilo, propilo, etc.; UIaIqUiI(C1-C8)SiIiIo, e.g., t-butildimetilsililo, etc.; hidroxialquilo Ci-C8, e.g., 2- hidroxietilo, 2-hidroxipropilo, etc.; alquil(C J-C8)CaTbOmIo, opcionalmente sustituido por un grupo carboxilo, e.g., acetilo, succinilo, etc.; arilcarbonilo, e.g., benzoilo, etc.; cianoalquil(Ci-C2), e.g., cianometilo, cianoetilo; amino, opcionalmente sustituido; azido; sulfo; sulfoalquilo (Ci-C4); o por un radical de un sacárido, e.g., glucosilo, manosilo, etc. En otra realización particular, dos o más de los grupos hidroxilo terminales de una CD, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, ó 7 grupos hidroxilo terminales presentes en una β-CD, están modificados por alguno de dichos grupos.
Las ciclodextrinas madre (es decir, sin derivatizar), en particular, la β-CD, tienen una solubilidad acuosa limitada comparada con los sacáridos acíclicos debido, en parte, a las fuertes uniones entre las moléculas de la ciclodextrina en estado cristalino. Además, la β-CD es capaz de formar enlaces de hidrógeno intramoleculares entre los grupos hidroxilo secundarios produciendo de este modo entalpias de solución desfavorables, y, por tanto, una baja solubilidad acuosa. La sustitución de alguno de los enlaces de hidrógeno por grupos hidrófobos, tales como metoxi- o etoxi-, tiene como resultado el aumento de la solubilidad acuosa. Por ejemplo, la solubilidad acuosa de la β-CD es del 1,85% (p/v) a temperatura ambiente pero ésta puede aumentar hasta 150 veces al aumentar el grado de metilación (metil-β-CD). Otro derivado de ciclodextrina particularmente importante es la 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (OH-β-CD), obtenido tras el tratamiento de la β-CD con óxido de propileno, que tiene una solubilidad acuosa del 60% (p/v). Igualmente, estos derivados pueden mejorar el perfil toxicológico, la capacidad para encapsular moléculas biológicamente activas y modular su perfil de liberación. El principal problema de las ciclodextrinas madre es la nefrotoxicidad tras ser administradas por vía parenteral, principalmente para la β-CD, debido a su baja solubilidad acuosa. Por ello, los derivados más hidrófilos, tales como la OH-β-CD, disminuyen esos problemas de nefrotoxicidad al poder ser eliminados más fácilmente. No ocurre lo mismo para los derivados metilados de la β-CD, que, a pesar de ser más soluble que la β-CD, no estarían exentos de provocar toxicidad sistémica, debido a su mayor capacidad para interaccionar con lípidos endógenos, lo que limita su uso por vía parenteral. Por el contrario, los estudios de toxicidad realizados tras la administración por vía oral muestran que las ciclodextrinas así como sus derivados no son tóxicas por esta vía.
Las ciclodextrinas son macromoléculas solubles en agua que han sido aprobadas para la administración de fármacos por vía oral, parenteral y tópica. Las aplicaciones de las ciclodextrinas en la administración oral de fármacos se deben, principalmente, a la mejora en la biodisponibilidad oral del fármaco, debido al aumento de la solubilidad, aumento de la estabilidad del fármaco en el tracto gastrointestinal y/o en la formulación. Además, para determinados fármacos, resulta interesante el potencial de las ciclodextrinas en la reducción de la irritación local producida por el propio fármaco, el control de la liberación del fármaco a lo largo del tracto gastrointestinal o bien el enmascaramiento de caracteres organolépticos desagradables, entre otros. Tal es el caso del itraconazol, que está comercializado en EEUU y Europa asociado a la OH-β-CD para su administración por vía oral, reduciéndose de manera importante la irritación que administrado de manera aislada produce en el tracto gastrointestinal.
Por otro lado, las ciclodextrinas también son utilizadas por su poder de aumentar la permeabilidad del fármaco a través de piel y mucosas, lo que produce una mejor absorción y más uniforme del fármaco. Esto se traduce en un aumento de la actividad de fármaco tras su administración, tal como, por ejemplo, el complejo formado entre la fiutamida y la OH-β-CD, que mejora sustancialmente la absorción del fármaco tras su administración por vía oral.
En una realización particular, dicho derivado de ciclodextrina, es un derivado de una alfa-ciclodextrina, o de una beta-ciclodextrina, o de una gamma-ciclodextrina. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de derivados de ciclodextrina que se pueden utilizar para la puesta en práctica de la presente invención incluyen etil-β-CD, heptakis(2,3,6-tri-O-etil)-β-CD, 2-hidroxipropil-β-CD, 2-O-2-hidroxipropil-β-CD, 2- hidroxietil-β-CD, derivados succinilados de β-CD, derivados succinilados de 2-hidroxi- propil-β-CD, butil-β-CD, heρtakis(2,6-di-O-n-butil)-β-CD, heρtakis(2,6-di-O-n-pentil)- β-CD, metil-β-CD, metil-β-CD, carboximetil-β-CD, carboxietil-β-CD, heptakis(2,6-di- O-metil)-β-CD, heρtakis(2,3,6-tri-O-metil)-β-CD, acetil-β-CD, heptakis(3-O-acetil-2,6- di-O-n-pentil)-β-CD, heρtakis(3-O-acetil-2,6-di-O-metil)-β-CD, sulfo-β-CD, sulfa- propil-β-CD, n-butil-β-CD, heptakis(3-O-n-butiril-2,6-di-O-pentil)-β-CD, 2-cianoetil-β- CD, 6-monodeoxi-6-monoazido-β-CD, heptakis(2,3,6-tri-O-bencil)-β-CD, heptakis (2,3,6-tri-O-benzoil)-β-CD, 6-monodesoxi-6-monoamino-β-CD, heptakis(2,6-di-O-n- pentil-3-O-trifluoroacetil)-β-CD, heptakis(2,3,6-tri-O-n-octil)-β-CD, heptakis(2,3-di-O- acetil-6-O-terbutildimetilsilil)-β-CD, heptakis(6-O-terbutildimetilsilil)-β-CD, heptakis (6-O-terbutildimetilsilil-2,3-di-O-metil)-β-CD, heptakis(2,6-di-terbutildimetilsilil)-β- CD, heptakis(2,3,6-tri-O-trifluoroacetil)-β-CD, heptakis(2,6-di-O-metil-3-O-n-pentil)- β-CD.
La relación en peso entre la ciclodextrina, o derivado de la misma, y el polímero biodegradable puede variar dentro de un amplio intervalo, en una realización particular, dicha relación en peso ciclodextrina (o derivado de la misma): polímero biodegradable es de 1:1-10, preferentemente de 1 :1-5, más preferentemente alrededor de 1 :4. En una realización particular, dicho polímero biodegradable es PVM/MA.
Como se ha mencionado previamente, en aplicaciones farmacéuticas, la β-CD y sus derivados son los más utilizados, en particular, la 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (OH-β-CD) ya que presenta una elevada solubilidad acuosa, una baja toxicidad y una cavidad más hidrófoba que la de la β-CD.
En una realización particular, la ciclodextrina presente en las nanopartículas de la invención no tiene ningún grupo hidroxilo sustituido. En una realización concreta, dicha ciclodextrina es la beta-ciclodextrina (β-CD), que contiene 7 unidades de α-1,4- glucopiranosa. Aunque la relación, en peso, β-CD:polímero biodegradable es de 1:1-10, preferentemente de 1 :1-5, relaciones 1:4 dan buenos resultados. A modo ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de β-CD/mg polímero biodegradable da una asociación eficiente. En este caso, la cantidad de β-CD asociada a las nanopartículas es de aproximadamente 90 microgramos/mg nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener, en general, forma esférica y un tamaño cercano a los 150 nm.
En otra realización particular, la ciclodextrina presente en las nanopartículas de la invención es un derivado más hidrófilo de la β-CD, tal como un derivado hidroxilado de la β-CD que comprende uno o más grupos hidroxialquilo (e.g., hidroxipropilo). En una realización particular preferida se utiliza la 2-hidroxiprolil-β-ciclodextrina (OH-β- CD). La relación, en peso, OH-β-CD:polímero biodegradable es de 1:1-10, preferentemente de 1 :1-5, aunque una relación 1 :4 rinde buenos resultados. A modo ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de OH-β-CD/mg polímero biodegradable da una asociación eficiente. En este caso, la cantidad de β-CD asociada a las nanopartículas es de aproximadamente 65 microgramos/mg nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener, en general, forma esférica y un tamaño cercano a los 150 nm.
En otra realización particular, la ciclodextrina presente en las nanopartículas de la invención es un derivado de una CD que presenta uno o más grupos funcionales terminales diferentes al hidroxilo, e.g., uno o más grupos amino, opcionalmente sustituidos. Los grupos amino, a su vez pueden estar sustituidos y presentar otros grupos funcionales, e.g., alquilo CpC4; ejemplos ilustrativos de dichos grupos amino sustituidos incluyen metilamina, etilamina, dietilamina, etc.). En una realización particular preferida, dicho grupo amino es un grupo amino libre, sin sustituir (-NH2). En diversos ensayos realizados, se ha observado que con dichos grupos, las nanopartículas de la invención administradas por vía oral se acumulan sobre ciertos segmentos del tracto intestinal, lo que permite una administración específica. En una realización concreta, el derivado de ciclodextrina presente en las nanopartículas de la invención es la 6-monodesoxi-6-monoamino-β-ciclodextrina (NH-β-CD). La relación, en peso, NH- β-CD:polímero biodegradable es de 1 :1-10, preferentemente de 1 :1-5, aunque una relación 1 :4 rinde buenos resultados. Estas nanopartículas se caracterizan por tener, en general, forma esférica y un tamaño cercano a los 150 nm. En una realización particular, la ciclodextrina, o derivado de la misma, presente en las nanopartículas de la invención se selecciona del grupo formado por β- ciclodextrina (β-CD), 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (OH-β-CD), 6-monodesoxi-6- monoamino-β-ciclodextrina (NH-β-CD) y sus mezclas.
Diversos ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que las nanopartículas a base de un polímero biodegradable que contienen ciclodextrina permiten la formación de interacciones bioadhesivas directas entre estos vehículos (nanopartículas) y componentes de la superficie del tracto gastrointestinal. Este estrecho contacto es de interés para aumentar la biodisponibilidad de moléculas biológicamente activas cuando se administran a través de alguna vía que dé acceso a una mucosa (e.g., vía oral, rectal, vaginal, ocular o nasal).
Las nanopartículas a base de un polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) que contienen ciclodextrina (nanopartículas vacías, es decir, sin molécula biológicamente activa) pueden ser obtenidas por un procedimiento basado en el método de desplazamiento del disolvente descrito, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 02/069938. A modo ilustrativo, dichas nanopartículas vacías que comprenden un polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y una ciclodextrina, o un derivado de la misma, pueden obtenerse por dos procedimientos alternativos, concretamente, mediante incubación simultánea de los dos componentes, polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y ciclodextrina o derivado de la misma (e.g., β-CD, OH-β-CD o NH-β-CD) en la fase orgánica [alternativa 1], o bien mediante incubación de las nanopartículas de polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) con una solución acuosa de ciclodextrina, o un derivado de la misma (e.g., β-CD, OH-β-CD o NH-β-CD) [alternativa 2].
Molécula biológicamente activa
Las nanopartículas de la invención comprenden, además del polímero biodegradable y de una ciclodextrina o un derivado de la misma, una molécula biológicamente activa.
El término "molécula biológicamente activa", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier sustancia que se administra a un sujeto, preferentemente un ser humano, con fines profilácticos o terapéuticos; es decir, cualquier sustancia que puede ser utilizada en el tratamiento, cura, prevención o diagnosis de una enfermedad o para mejorar el bienestar físico y mental de humanos y animales. En general, dicho término "molécula biológicamente activa" incluye tanto fármacos como antígenos y alérgenos.
Las nanopartículas de la invención pueden incorporar una o más moléculas biológicamente activas independientemente de las características de solubilidad de las mismas, aunque, dichas nanopartículas han resultado ser un sistema particularmente útil para la administración de moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba.
Las nanopartículas de la invención permiten modificar la distribución de la molécula biológicamente activa que contienen al ser administradas por una vía que dé acceso a alguna mucosa del organismo (e.g., oral, rectal, nasal, vaginal, ocular, etc.). La naturaleza química de la molécula biológicamente activa puede variar dentro de un amplio intervalo, desde moléculas pequeñas hasta compuestos macromoleculares (péptidos, polinucleótidos, etc.).
En una realización particular, dicha molécula biológicamente activa es un péptido o una proteína. Tal como aquí se utiliza, el término "péptido" se refiere a un compuesto formado por aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos e incluye oligopéptidos (formados por 10 o menos aminoácidos) y polipéptidos (formados por más de 10 aminoácidos). Asimismo, el término "proteína" tal como aquí se utiliza se refiere a macromoléculas de masa molecular elevada formadas por cadenas lineales de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos; las proteínas pueden estar formadas por una o varias cadenas peptídicas.
En otra realización particular, dicha molécula biológicamente activa es un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleótido, un polinucleótido o un ácido nucleico. Tal como aquí se utiliza, un "oligonucleótido" es un polímero de nucleótidos unidos por enlaces 5 '-3' fosfodiéster de longitud igual o inferior a 50 nucleótidos, mientras que un "polinucleótido" es un polímero de nucleótidos unidos por enlaces 5 '-3' fosfodiéster de longitud superior a 50 unidades. Asimismo, el término "ácido nucleico" se refiere también a un polímero de nucleótidos unidos por enlaces 5 '-3' fosfodiéster; dependiendo de si se trata de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos el ácido nucleico será ARN o ADN, respectivamente. Los ácidos nucleicos desempeñan distintas funciones en las células de los organismos vivos tales como el almacenamiento de la información genética y su transferencia a la generación siguiente (ADN) o la expresión de esa información durante la síntesis de proteínas (ARNm y ARNt), es componente estructural de orgánulos celulares, tales como los ribosomas (ARNr), cataliza ciertas reacciones químicas (ribozimas) y participa en mecanismos de regulación de la expresión génica (mediante ARN complementarios de ARNm o de ARNbc en la ribointerferencia). En otra realización particular, dicha molécula biológicamente activa es una molécula (orgánica o inorgánica) pequeña; generalmente, estas moléculas se obtienen por métodos de síntesis química o semisintéticos o, alternativamente, se aislan de sus fuentes. En una realización concreta, dicha molécula (orgánica o inorgánica) pequeña, tiene un peso molecular relativamente bajo, generalmente, igual o inferior a 5.000, típicamente, igual o inferior a 2.500, ventajosamente, igual o inferior a 1.500. Numerosos principios activos terapéuticos contienen estas características y, por tanto, pueden ser utilizados en la puesta en práctica de la presente invención.
Aunque la molécula biológicamente activa presente en las nanopartículas de la invención puede ser tanto una sustancia hidrófila como una sustancia hidrófoba, en una realización particular, las nanopartículas de la invención son particularmente útiles para administrar moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba. Por tanto, en una realización particular, la molécula biológicamente activa presente en las nanopartículas de la invención es una sustancia hidrófoba. Tal como aquí se utiliza, una "sustancia hidrófoba" es una sustancia que, por sus propiedades o composición, es poco soluble en medios acuosos, teniendo típicamente una solubilidad inferior al 1% (1 gramo de principio activo en 100 mi de disolvente acuoso) a 200C, en un pH comprendido entre 1- 7,5 y presión atmosférica.
Prácticamente cualquier molécula biológicamente activa de naturaleza hidrófoba puede ser utilizada en la puesta en práctica de la presente invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba que pueden estar presentes en las nanopartículas de la invención incluyen agentes antiparasitarios (e.g., albendazol, mebendazol, praziquantel, etc.); antifúngicos (e.g., clotrimazol, itraconazol, etc.), antibióticos (e.g., sulfametiazol, gentamicina, griseofulvina, etc.), cardiotónicos (e.g., digoxina, etc.), agentes antitumorales (e.g., camptotecina, metotrexato, docetaxel, fluorouracilo, paclitaxel, etc.), inmunosupresores (e.g., tacrolimus, ciclosporina), (gluco)corticoides (e.g., cortisona, dexametasona, prednisolona, prednisona, triamcinolona, etc.), etc. En otra realización particular, la molécula biológicamente activa presente en las nanopartículas de la invención es una sustancia que es sustrato de la glicoproteína-P. De hecho, una importante aplicación de las nanopartículas de la invención radica en su capacidad para minimizar el efecto negativo de la glicoproteína-P sobre la absorción a través de mucosas de un determinado fármaco. Como es conocido, la glicoproteína-P (PGYl; enzima EC 3.6.3.44) es una proteína que, en los seres humanos, está codificada por el gen ABCBl, también denominado gen MDRl (multidrug resistance 1). La glicoproteína-P funciona como una bomba o transportador transmembrana que transfiere sus sustratos (generalmente fármacos y otros xenobióticos) desde su dominio intracelular a su dominio extracelular. Dependiendo de su localización anatómica, la glicoproteína-P realiza su función de 3 formas principales: (1) la glicoproteína-P limita la entrada del fármaco en el organismo después de su administración oral como resultado de su expresión en la membrana luminar de los enterocitos; (2) una vez que el fármaco ha alcanzado la circulación sanguínea, la glicoproteína-P promueve su eliminación en la bilis y en la orina, como consecuencia de su expresión en la membrana canalicular de los hepatocitos y en la membrana luminar de las células de los túbulos proximales de los ríñones; y (3) ya en la circulación sanguínea sistémica, limita la penetración del fármaco en los tejidos sensibles.
Por tanto, una sustancia sustrato de la glicoproteína-P se refiere a una sustancia, e.g., un xenobiótico, con afinidad para unirse al dominio intracelular de la glicoproteína-P de manera que mediante consumo de ATP puede ser transportada al exterior de la célula según la siguiente reacción:
ATP + H2O + xenobiótico(dentro) = ADP + fosfato + xenobiótico(füera) Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de sustratos conocidos de la glicoproteína- P que pueden estar presentes en las nanopartículas de la invención como moléculas biológicamente activas incluyen, entre otros (Fromm MF; Trends 2004; 25: 423-429), agentes anti-tumorales (e.g., docetaxel, etoposido, imatinib, paclitaxel, teniposido, vinblastina, vincristina, antraciclinas (e.g., doxorubicina, daunorubicina, epirubicina, etc.), etc.); antagonistas de β-adrenoceptor (e.g., bunitrolol, carvedilol, celiprolol, talinolol, etc.); bloqueantes de canales de Ca2+ (e.g., diltiazem, mibefradil, verapamil, etc.); fármacos cardiotónicos (e.g., digitoxina, digoxina, quinidina, etc.), agentes antivirales (e.g., amprenavir, indinavir, nelfinavir, saquinavir, ritonavir, etc.); esteroides (e.g., dexametasona, metilprednisolona, etc.); inmunosupresores (e.g., ciclosporina A, sirolimus, tacrolimus, etc.); fármacos antiheméticos (domperidona, ondansetron, etc.); antibióticos (e.g., eritromicina, levofloxacino, etc.); agentes antilipidémicos (e.g., atorvastatina, lovastatina, etc.); antagonistas de receptores H1 de la histamina (e.g., fexofenadina, terfenadina, etc.); y fármacos de otros grupos terapéuticos (e.g., amitriptilina, colchicina, debrisoquina, itraconazol, losartan, morfina, fenitoina, rifampina, actinomicina D, topotecan, estradiol, rapamicina, FK506, etc).
En una realización particular, dicha molécula biológicamente activa es una sustancia hidrófoba o una sustancia sustrato de la enzima glicoproteína-P seleccionada del grupo formado por actinomicina D, albendazol, amitriptilina, amprenavir, atorvastatina, bunitrolol, camptotecina, carvedilol, celiprolol, ciclosporina, clotrimazol, colchicina, cortisona, daunorubicina, debrisoquina, dexametasona, digitoxina, digoxina, diltiazem, docetaxel, domperidona, doxorubicina, epirubicina, eritromicina, estradiol, etoposido, fenitoina, fexofenadina, FK506, fluorouracilo, gentamicina, griseofulvina, imatinib, indinavir, itraconazol, levofloxacino, losartan, lovastatina, mebendazol, metilprednisolona, metotrexato, mibefradil, morfina, nelfinavir, ondansetron, paclitaxel, praziquantel, prednisolona, prednisona, quinidina, rapamicina, rifampicina, saquinavir, sirolimus, sulfametiazol, ritonavir, tacrolimus, talinolol, teniposido, terfenadina, topotecan, triamcinolona, verapamil, vinblastina, vincristina y sus mezclas.
En una realización preferida, la molécula biológicamente activa presente en las nanopartículas de la invención es paclitaxel.
En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende nanopartículas de la invención que contienen uno o más fármacos diferentes. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos fármacos incluyen agentes pertenecientes a distintos grupos terapéuticos, por ejemplo, agentes anti-tumorales, antagonistas de β-adrenoceptor, agentes analgésicos, bloqueantes de canales de Ca2+, fármacos cardiotónicos, agentes antivirales, esteroides, inmunosupresores, fármacos antiheméticos, antibióticos (e.g., antibacterianos, antifúngicos, antivirales, antiparasitarios, etc.) agentes antilipidémicos, antagonistas de receptores H1 de la histamina, agentes antiinflamatorios, neuroprotectores, antialérgicos, antiasmáticos, antibióticos, surfactantes pulmonares, etc.
Como puede apreciarse, algunas moléculas biológicamente activas que son sustrato de la glicoproteína-P tienen naturaleza hidrófoba. Asimismo, el sistema de administración de moléculas biológicamente activas proporcionado por la presente invención contempla la posibilidad de administrar fármacos de numerosos grupos terapéuticos.
En otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende nanopartículas de la invención que contienen uno o más antígenos diferentes con fines vacunales o bien uno o más alérgenos diferentes con fines inmuno- terapéuticos como molécula biológicamente activa.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "antígeno" se refiere a cualquier sustancia capaz de ser reconocida por el sistema inmune de un sujeto y/o capaz de inducir en un sujeto una respuesta inmune humoral o una respuesta inmune celular que conduce a la activación de linfocitos B y/o T cuando se introduce en un sujeto; a modo ilustrativo, dicho término incluye cualquier producto inmunogénico, nativo o recombinante, obtenido de un organismo superior o de un microorganismo, por ejemplo, una bacteria, un virus, un parásito, un protozoo, un hongo, etc., que contiene uno o más determinantes antigénicos, por ejemplo, componentes estructurales de dichos organismos; toxinas, por ejemplo, exotoxinas, etc. Prácticamente cualquier antígeno puede ser utilizado en la elaboración de nanopartículas de la invención cargadas con antígeno. A modo ilustrativo, no limitativo, el término "antígeno" incluye: antígenos "microbianos", es decir, antígenos de microorganismos, incluyendo, aunque sin limitarse, virus, bacterias, hongos y parásitos infecciosos; dichos antígenos incluyen el microorganismo intacto así como partes, fragmentos y derivados de los mismos, bien de origen natural o artificial, así como productos sintéticos o recombinantes que son idénticos o similares a los antígenos naturales de un microorganismo e inducen una respuesta inmune específica para ese microorganismo; en este sentido, un compuesto es similar a un antígeno natural de un microorganismo si induce una respuesta inmune (humoral y/o celular) como la del antígeno natural de ese microorganismo; dichos antígenos se utilizan de forma rutinaria por los expertos en la materia; y antígenos "tumorales", es decir, sustancias, por ejemplo, péptidos, asociadas a un tumor o a un cáncer ("marcador tumoral"), que es capaz de provocar una respuesta immune, en particular, cuando es presentado en el contexto de una molécula del CMH, e.g., Her2 (cáncer de mama); GD2
(neuroblastoma); EGF-R (glioblastoma maligno); CEA (cáncer de tiroide medular); CD52 (leucemia); proteína gplOO de melanoma humano; proteína melan-A/MART-1 de melanoma humano; tirosinasa; proteína
NAl 7- A nt; proteína MAGE-3; proteína p53; proteína HPV16E7; fragmentos antigénicos de dichos antígenos; etc.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "alérgeno" se refiere a una sustancia a la que un sujeto es sensible y provoca una reacción inmunitaria, por ejemplo, extractos alergénicos de pólenes, extractos alergénicos de insectos, extractos alergénicos de alimentos o productos alimenticios, componentes presentes en saliva, pinzas o aguijones de insectos que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, componentes presentes en plantas que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, etc., por ejemplo, extractos proteicos de pólenes, tal como el polen de gramíneas, extractos alergénicos de Lolium perenne, extractos alergénicos de olea (olivo), etc.; extractos proteicos de insectos, tal como de ácaros del polvo, etc.; extractos alergénicos de componentes alimentarios, etc. Prácticamente cualquier alérgeno puede ser utilizado en la elaboración de las nanopartículas cargadas con alérgeno de la composición de la invención; no obstante, en una realización particular, dicho alérgeno es la ovoalbúmina (OVA), una proteína ampliamente utilizada como modelo alergénico experimental.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas moléculas biológicamente activas que pueden contener las nanopartículas de la invención incluyen antígenos bacterianos: citoplasmáticos, periplásmicos, de la envoltura celular (e.g., proteínas de membrana interna, proteínas de membrana externa, lipopolisacáridos y complejos mixtos, proteínas asociadas a la pared celular, etc.), etc.; antígenos de estructuras superficiales (e.g., fimbriae, glicocálix, flagelares, etc.), incluyendo los de patógenos intracelulares, como por ejemplo Brucella sp., Salmonella sp., etc; antígenos de microorganismnos eucariotas, tanto solubles como superficiales; antígenos virales, por ejemplo, matriciales, de cápsides, de envolturas, internos (incluidos enzimáticos), alérgenos de especies animales (ácaros, etc.), de plantas (gramíneas, etc.), etc.
Las nanopartículas de la invención pueden obtenerse mediante un procedimiento, basado en el método de desplazamiento del disolvente descrito, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 02/069938, que comprende (i) la formación de un complejo (ciclodextrina o derivado de la misma)-(molécula biológicamente activa), en adelante complejo [CD:MBA], y (ii) la incoporación de dicho complejo [CD:MBA] a una solución del polímero biodegradable en un disolvente orgánico antes de la formación de nanopartículas.
Brevemente, la formación de dicho complejo [CD:MBA] comprende la adición de una solución de la molécula biológicamente activa (MBA) en un disolvente orgánico, tal como un alcohol, por ejemplo, etanol, sobre una solución acuosa de la ciclodextrina o derivado de la misma (CD). El conjunto se somete a agitación hasta alcanzar el equilibrio. Posteriormente, se eliminan el agua y el disolvente orgánico (e.g., etanol) por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, bajo evaporación reducida o cualquier otro sistema de eliminación de disolventes. La relación molar CD:MBA presente en dicho complejo [CD:MBA] puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otros factores de la ciclodextrina o derivado de la misma (CD) y de la molécula biológicamente activa (MBA) presentes en dicho complejo; no obstante, en una realización particular, la relación molar CD:MBA presente en dicho complejo [CD:MBA] es 1:1-4, típicamente 1 :1-2. En una realización concreta, cuando la molécula biológicamente activa es paclitaxel, la relación molar CD:MBA en dicho complejo [CD:MBA] es 1 :1.
La incoporación de dicho complejo [CD:MBA] a una solución del polímero biodegradable en un disolvente orgánico antes de la formación de nanopartículas puede llevarse a cabo mediante adición de dicho complejo a la solución de polímero biodegradable y posterior incubación simultánea de ambos componentes, polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y complejo [CD:MBA], en la fase orgánica (e.g., acetona) que comprende el polímero biodegradable (e.g., PVM/MA), durante un periodo de tiempo apropiado, típicamente comprendido entre 10 y 60 minutos, a una temperatura comprendida entre 200C y 300C aproximadamente (en una realización particular, cuando la molécula biológicamente activa es paclitaxel, la incubación se puede realizar durante un periodo de tiempo de 30 minutos a temperatura ambiente (250C)), bajo agitación, por ejemplo, mediante el empleo de un agitador mecánico, magnético o ultrasonidos); operando de esta manera, se obtiene, en general, un alto grado de asociación del complejo[CD:MBA] al polímero biodegradable. Brevemente, esta etapa comprende la disolución y/o dispersión simultánea del polímero biodegradable y el complejo [CD:MBA] en un disolvente orgánico (e.g., acetona). La incubación de la mezcla se realiza bajo agitación a temperatura ambiente durante un determinado periodo de tiempo. Preferentemente, la concentración del polímero biodegradable está comprendida entre 0,001% y 10% p/v y la del complejo [CDrMBA] entre 0,001% y 5% p/v. Opcionalmente, sobre dicha solución, si se desea, se adiciona un volumen determinado de un disolvente polar miscible con la disolución de los polímeros (e.g., etanol). También, opcionalmente, si se desea, se puede utilizar un agente reticulante para mejorar la estabilidad de las nanopartículas, tal como se describe en WO 02/069938. Ejemplos ilustrativos de agentes reticulantes que pueden utilizarse incluyen las moléculas diaminadas (e.g., 1,3-diaminopropano, etc.), polisacáridos o sacáridos simples, proteínas, y, en general, cualquier molécula que presente grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos presentes en el polímero biodegradable, por ejemplo, con los grupos anhídrido presentes en PVM/MA. No obstante, en general, no resulta necesario reticular pues esto tiene lugar de forma simultánea debido a la presencia de la ciclodextrina o derivado de la misma. En caso de que se deseara reticular, se debería añadir una cantidad pequeña de cualquiera de los productos indicados. A continuación, para formar las nanopartículas de la invención, sobre la mezcla anterior se añade un volumen similar de un segundo líquido no disolvente, preferentemente una solución hidroalcohólica. En una realización particular, se utiliza agua de calidad farmacéutica (agua purificada o agua para inyectables (p.i.), según la aplicación). Preferentemente, la relación fase orgánica: solución hidroalcohólica está incluida dentro del intervalo comprendido entre 1 :1 y 1 :10 en volumen. Las nanopartículas se forman instantáneamente en el medio, bajo apariencia de una suspensión lechosa. Los disolventes orgánicos pueden ser eliminados por cualquier procedimiento adecuado tal como evaporación a presión reducida, quedando las nanopartículas en una suspensión acuosa estable. Eventualmente, si se desea, las nanopartículas se pueden purificar por medios convencionales tales como centrifugación, ultracentrifugación, filtración tangencial, o evaporación, incluyendo la utilización de vacío. Finalmente, si se desea, las nanopartículas se pueden liofilizar para su almacenaje y conservación a largo término. Para facilitar la liofilización se pueden utilizar agentes crioprotectores habituales tales como sacarosa, lactosa o manitol, preferentemente en una concentración comprendida entre el 0,1 y el 10% en peso.
Alternativamente, las nanopartículas de la invención, a base de un polímero biodegradable pueden ser obtenidas mediante un procedimiento que comprende la incubación de las nanopartículas de polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) con una solución acuosa que comprende el complejo [CD:MBA]. Esta alternativa comprende, brevemente, la disolución del polímero biodegradable en un disolvente orgánico, tal como acetona. Posteriormente, sobre esa solución, se adiciona un volumen determinado de solución hidroalcohólica, tal como etanol, y, finalmente, un volumen similar de agua. Las nanopartículas se forman instantáneamente en el medio bajo la apariencia de una suspensión lechosa. Los disolventes orgánicos son eliminados de forma similar a como se ha descrito en el procedimiento anterior, por ejemplo, por evaporación a presión reducida, quedando las nanopartículas en una suspensión acuosa estable. Seguidamente, las nanopartículas de polímero biodegradable se incuban en una solución acuosa que comprende el complejo [CD:MBA] previamente obtenido. La incubación de las nanopartículas de polímero biodegradable con el complejo [CDrMBA] puede realizarse bajo agitación (e.g., mediante el empleo de un agitador mecánico, magnético o ultrasonidos) durante un periodo determinado de tiempo a una temperatura apropiada en condiciones similares a las mencionadas en relación con el procedimiento anterior (e.g., durante un periodo de tiempo comprendido, en general, entre 10 y 60 minutos, a una temperatura comprendida entre 200C y 300C). Posteriormente, las nanopartículas se purifican por métodos convencionales, por ejemplo, centrifugación, y, finalmente, se liofilizan, si se desea, siguiendo los mismos procedimientos descritos anteriormente.
La relación ponderal MBA:polímero biodegradable presente en las nanopartículas de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otros factores del polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y de la molécula biológicamente activa (MBA) presentes en dichas nanopartículas; no obstante, en una realización particular, la relación MBA:polímero biodegradable, en peso, presente en dichas nanopartículas de la invención es 1:4-20, preferentemente, 1:10.
La relación complejo [CD-MBA] :polímero biodegradable presente en las nanopartículas de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otros factores del polímero biodegradable (e.g., PVM/MA), de la ciclodextrina o derivado de la misma y de la molécula biológicamente activa (MBA) presentes en dichas nanopartículas; no obstante, en una realización particular, la relación complejo [CD-MBA] :polímero biodegradable, en peso, presente en dichas nanopartículas de la invención es 1:1-20, ventajosamente 1 :2-20, preferentemente, 3:10 (aproximadamente 1 :3,3), en peso. En una realización particular, el polímero biodegradable es PVM/MA.
En otra realización particular, la molécula biológicamente activa es paclitaxel. En otra realización particular, el derivado de ciclodextrina es β-ciclodextrina (β- CD), 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (OH-β-CD) ó 6-monodesoxi-6-monoamino-β- ciclodextrina (NH-β-CD). En otra realización particular, la molécula biológicamente activa es paclitaxel y la relación molar (ciclodextrina o derivado de la misma):paclitaxel es 1 : 1.
En una realización concreta, el complejo [CD:MBA] es un complejo β- CD:paclitaxel, en una relación molar 1:1, y la relación en peso paclitaxel :polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) es de 1 :4-20, aunque relaciones próximas a 1:10 dan buenos resultados. A modo ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de paclitaxel en el complejo β-CD:paclitaxel, en una relación molar 1 :1, por mg de polímero da una asociación eficiente. En este caso la cantidad de fármaco asociada a las nanopartículas es de, aproximadamente, 40 microgramos de paclitaxel/mg nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener forma esférica y un tamaño cercano a los 300 nm.
En otra realización concreta, el complejo [CD:MBA] es un complejo OH-β-CD, en una relación molar 1 :1 y la relación en peso paclitaxel :polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) es de 1 :4-20, aunque relaciones próximas a 1 :10 dan buenos resultados. A modo ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de paclitaxel en el complejo OH-β- CD:paclitaxel, en una relación molar 1:1, por mg de polímero da una asociación eficiente. En este caso la cantidad de fármaco asociada a las nanopartículas es de, aproximadamente, 170 microgramos de paclitaxel/mg nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener forma esférica y un tamaño cercano a los 300 nm.
En otra realización concreta, el complejo [CD:MBA] es un complejo NH-β-CD, en una relación molar 1 :1 y la relación en peso paclitaxel:polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) es de 1 :4-20, aunque relaciones próximas a 1:10 dan buenos resultados. A modo ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de paclitaxel en el complejo OH-β- CD:paclitaxel, en una relación molar 1:1, por mg de polímero da una asociación eficiente. En este caso la cantidad de fármaco asociada a las nanopartículas es de, aproximadamente, 100 microgramos de paclitaxel/mg nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener forma esférica y un tamaño cercano a los 300 nm.
En una realización particular, al administrar por vía oral una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel formulado en nanopartículas de la invención con β-CD, se obtienen niveles plasmáticos constantes y sostenidos durante, al menos, 24 horas, tras alcanzar la concentración plasmática máxima (Cmax) en un tiempo de aproximadamente 5 horas. La concentración plasmática máxima (Cmax) es similar a la obtenida tras la administración de la formulación comercial por vía intravenosa. El área bajo la curva plasmática (AUC) de paclitaxel obtenida por esta formulación es de, aproximadamente, 5 veces superior a la obtenida por administración intravenosa del medicamento comercial administrado a la misma dosis. Esta formulación se caracteriza por ofrecer un tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo (MRT) de aproximadamente 4 veces superior al que se obtiene tras la administración de la formulación comercial por vía intravenosa.
En otra realización particular, al administrar por vía oral una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel formulado en nanopartículas de la invención con OH-β-CD, se obtienen niveles plasmáticos constantes y sostenidos durante, al menos, 24 horas, tras alcanzar la concentración plasmática máxima (Cmax) en un tiempo de aproximadamente 6 horas. La concentración plasmática máxima es 2 veces superior a la obtenida tras administración de la formulación comercial por vía intravenosa. El área bajo la curva plasmática (AUC) de paclitaxel obtenida por esta formulación es de, aproximadamente, 5 veces superior a la obtenida por administración intravenosa del medicamento comercial administrado a la misma dosis. Esta formulación se caracteriza por ofrecer un tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo (MRT) de aproximadamente 3,5 veces superior al que se obtiene tras la administración de la formulación comercial por vía intravenosa.
En otra realización particular, al administrar por vía oral una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel formulado en nanopartículas de la invención con NH-β-CD, se obtienen niveles plasmáticos constantes y sostenidos durante, al menos, 24 horas, tras alcanzar la concentración plasmática máxima (Cmax) en un tiempo de aproximadamente 4,7 horas. La concentración plasmática máxima es de aproximadamente la mitad de la obtenida tras administración de la formulación comercial por vía intravenosa. El área bajo la curva plasmática (AUC) de paclitaxel obtenida por esta formulación es, aproximadamente, similar a la obtenida por administración intravenosa del medicamento comercial administrado a la misma dosis. Esta formulación se caracteriza por ofrecer un tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo (MRT) de aproximadamente 3 veces superior al que se obtiene tras la administración de la formulación comercial por vía intravenosa.
Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende, al menos, una nanopartícula de la invención, y un excipiente, vehículo o adyuvante, farmacéuticamente aceptable.
En general, dicha molécula biológicamente activa estará formando un complejo con la ciclodextrina o derivado de la misma y dicho complejo, mayoritariamente, estará en el interior de la nanopartícula de la invención; no obstante, podría suceder que una proporción relativamente de dicho complejo que contiene la molécula biológicamente activa estuviera también unida a la superficie de la nanopartícula si bien la mayor parte del mismo estará en el interior (e.g., encapsuladas) de las nanopartículas de la invención.
Las nanopartículas de la invención pueden utilizarse para modificar la distribución de la molécula biológicamente activa asociada al ser administradas por una vía que dé acceso a alguna mucosa del organismo (incluyendo la vía oral, rectal, nasal, vaginal u ocular). Adicionalmente, también pueden administrarse por vía parenteral. Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier composición líquida (suspensión o dispersión de las nanopartículas) para administración oral, bucal, sublingual, tópica, ocular, nasal, vaginal o parenteral; cualquier composición en forma de gel, pomada, crema o bálsamo para su administración tópica, ocular, nasal o vaginal; o cualquier composición sólida (comprimidos, cápsulas) para su administración oral. En una realización particular, la composición farmacéutica se administra por vía oral. En otra realización particular, dicha composición farmacéutica se administra por vía parenteral.
Las composiciones farmacéuticas descritas comprenderán los excipientes adecuados para cada formulación. Por ejemplo, en el caso de formulaciones orales en forma de comprimidos o cápsulas se incluirán si es necesario agentes aglutinantes, desintegrantes, lubricantes, agentes de carga, recubrimiento entérico, etc. Las formulaciones sólidas orales se preparan de forma convencional por mezclado, granulación en seco o húmedo e incorporando las nanopartículas de la invención. Las composiciones farmacéuticas también pueden ser adaptadas para su administración parenteral, en forma de, por ejemplo, soluciones, suspensiones o productos liofilizados, estériles, en la forma de dosificación apropiada; en este caso, dichas composiciones farmacéuticas incluirán los excipientes adecuados, tales como tampones, tensioactivos, etc. En cualquier caso, los excipientes se elegirán en función de la forma farmacéutica de administración seleccionada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
La proporción de la molécula biológicamente activa incorporada en la nanopartícula de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, puede ser de hasta un 25% en peso respecto al peso total de las nanopartículas. No obstante, la proporción adecuada dependerá en cada caso de la moléculas biológicamente activa incorporada.
La dosis a administrar de nanopartículas de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal, preferentemente, entre 0,1 y 2 mg por kg de peso corporal.
La invención se describe a continuación mediante unos ejemplos que no son limitativos de la invención, sino ilustrativos.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos describen la producción y caracterización de nanopartículas a base de un polímero biodegradable (PVM/MA) que incorporan una ciclodextrina (Ejemplos 1-5) y de nanopartículas a base de un polímero biodegradable (PVM/MA) que incorporan una ciclodextrina y una molécula biológicamente activa (Ejemplos 6 y 7) que se encuentra asociada a la ciclodextrina y/o al polímero biodegradable (PVM/MA) que constituye la matriz de dichas nanopartículas. Dichos ejemplos ponen de manifiesto la capacidad de dichas nanopartículas de desarrollar interacciones bioadhesivas con la mucosa y de promover la absorción oral de una molécula biológicamente activa, tal como el paclitaxel. Como puede apreciarse en dichos ejemplos, cuando se utiliza paclitaxel como molécula biológicamente activa, su incorporación en dichas nanopartículas a base de PVM/MA que incorporan una ciclodextrina, en particular, 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina, permite obtener niveles plasmáticos constantes y sostenidos de dicho fármaco durante, al menos, 24 horas.
A continuación se describen los métodos generales utilizados para la producción y caracterización de dichas nanopartículas.
A. Producción de nanopartículas que contienen ciclodextrinas. y. opcionalmente. una molécula biológicamente activa
El procedimiento para la producción de nanopartículas a base de un polímero biodegradable (PVM/MA) que incorporan una ciclodextrina, y, opcionalmente, una molécula biológicamente activa, es una modificación de un procedimiento general descrito anteriormente y basado en la desolvatación controlada del polímero [Arbos et al., J. Control. Reléase, 83 (2002) 321-330]. Para ello, un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) y una cantidad determinada de ciclodextrina, o, alternativamente, de un complejo ciclodextrina:molécula biológicamente activa, obtenido por métodos convencionales (e.g., Hamada et al., J Biosci Bioeng 102(4):369-
71, 2006), en acetona bajo agitación magnética. Tras la incubación, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionan un disolvente orgánico miscible (etanol) y un volumen similar de agua desionizada, dando lugar a la formación de las nanopartículas bajo apariencia de una suspensión lechosa. A continuación, se retiran los disolventes orgánicos (etanol y acetona) mediante evaporación bajo presión reducida, quedando las partículas en una suspensión acuosa estable. Opcionalmente, las nanopartículas formadas pueden ser recubiertas con una molécula biológicamente activa hidrosoluble o con un ligando capaz de conferir a la nanopartícula resultante propiedades de
"targeting" específico. Tras dejar homogeneizar la suspensión de nanopartículas, ésta se evapora bajo presión reducida, por ejemplo, mediante el empleo de un rotavapor, tal como un rotavapor Büchi R- 144 (Suiza) hasta eliminar ambos disolventes orgánicos. Posteriormente, la suspensión se somete a purificación por ultracentrifugación (Sigma 3k30, rotor NM2150, Alemania) o mediante filtración tangencial, y, eventualmente, las nanopartículas pueden congelarse a -800C para su posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis Génesis, Nueva York, EEUU).
B. Caracterización físico-química de las nanopartículas
La caracterización de las nanopartículas ha conllevado diversos estudios, que se describen a continuación. Entre los estudios físico-químicos se determinó el tamaño de partícula y la carga superficial de las nanopartículas, ésta última mediante la medida del potencial zeta. Ambos parámetros fueron obtenidos por espectroscopia de correlación fotónica, utilizando un Zetasizer nano Z-S (Malvern Instruments/Optilas, España).
El rendimiento del proceso se calculó por dos métodos. En el primero se calculó el rendimiento de forma gravimétrica, utilizando el peso de las muestras liofilizadas sin agente crioprotector, según la Ecuación 1 :
Rendimiento = (Peso del liofilizado/Peso inicial) x 100 [Ecuación 1] donde peso inicial es el peso del polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y de la ciclodextrina añadida a las formulaciones; y peso del liofilizado es el peso de las formulaciones tras el proceso de liofilización. El segundo método se basó en la cuantificación mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplado a un detector de tipo ELSD (evaporative light - scattering detection) (Agüeros et al., J. Pharm. and Biomed. Anal., 39 (2005) 495-502) mediante el método descrito abajo que permite la cuantificación de las ciclodextrinas y del copolímero PVM/MA. El rendimiento, en este caso, se calculó según la Ecuación 2: Rendimiento = (Qmiαai - QPVM/MA) x 100 [Ecuación 2] donde
Qimciai es la cantidad inicial de PVM/MA añadida; y
QPVM/MA es la cantidad de PVM/MA determinada en los sobrenadantes. La morfología de las nanopartículas se observó por microscopía electrónica de barrido (Zeiss, DSM 940A Alemania). Para ello, las nanopartículas liofilizadas se cubrieron con una capa de oro molecular de unos 9 nm (Equipo Emitech K550, Sputter- Coater, Reino Unido) y las fotografías se realizaron con un microscopio Zeiss DMS 940
A (Estados Unidos).
Para confirmar la presencia de ciclodextrinas asociadas a las nanopartículas (método de cuantificación descrito abajo) se procedió al análisis elemental de las diferentes formulaciones de nanopartículas, utilizando un analizador elemental modelo LECO CHN-900 (LECO Corporation, Estados Unidos).
Cuantificación de la cantidad de ciclodextrina asociada a las nanopartículas
Para determinar la cantidad de ciclodextrina no aminada [e.g., β-ciclodextrina (β-CD) y 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (OH-β-CD)] asociada a las nanopartículas se utilizó un método de HPLC acoplado a un detector tipo ELSD. El análisis se realizó en un cromatógrafo modelo 1100 series LC (Agilent, Waldbornn, Alemania) y los datos se analizaron en un ordenador Hewlett-Packard mediante el programa Chem-Station G2171 (Agüeros et al., J. Pharm. and Biomed. Anal., 39 (2005) 495-502).
Para el análisis de las muestras, los sobrenadantes obtenidos tras el proceso de purificación de las nanopartículas, se diluyeron hasta 10 mi con agua purificada. Tras la adición del patrón interno (PEG 6000), se tomaron, como muestra, alícuotas de 1 mi de sobrenadante. Las muestras se analizaron utilizando una columna Zorbax Eclipse XDB- Phenyl (Agilent 150 mm x 2,1 mm) y una mezcla de agua/acetonitrilo en gradiente (ver tabla 1) como fase móvil a flujo 0,25 ml/min.
Tabla 1 Condiciones de gradiente para la fase móvil (A: acetonitrilo; B: agua)
Figure imgf000033_0001
Las condiciones del detector (ELSD) se optimizaron hasta conseguir la máxima sensibilidad de acuerdo con el gradiente utilizado en la fase móvil (Temperatura de
Nebulizador: 115°C; Flujo de Nitrógeno: 3,2 ml/min). La separación cromatográfica de las diferentes ciclodextrinas, del PVM/MA y del patrón interno (PEG 6000) se llevó a cabo en menos de 15 minutos. Los tiempos de retención fueron de: 1 ,08 ± 0,05 minutos para el PVM/MA;
4,58 ± 0,07 minutos para la β-CD;
10,27 ± 0,06 para la OH-β-CD; y
13,60 ± 0,04 minutos para el patrón interno.
El límite de cuantificación fue de 0,2 mg/ml para las ciclodextrinas y de 0,05 mg/ml para el polímero (PVM/MA). La precisión no superó el límite del 7%.
En el caso de la cuantificación de ciclodextrina aminada [e.g., 6-monodesoxi-6- monoamino-β-ciclodextrina (NH-β-CD)] asociada a las nanopartículas se utilizó una variante del método descrito arriba para evitar el solapamiento de los picos de la ciclodextrina y el polímero. Por ello, las muestras se analizaron utilizando una columna NH2-Zorbax (Agilent 4,6 x 150 mm, 5 μm), calentada a 400C y una mezcla de metanol/agua (80/20 v/v) como fase móvil a un flujo de 1 ml/min. Las condiciones del detector (ELSD) fueron las siguientes: Temperatura de Nebulizador: 710C y Flujo de
Nitrógeno: 1,9 ml/min. La separación cromatográfica de la 6-monodesoxi-6- monoamino-β-ciclodextrina, se llevó a cabo en menos de 7 minutos. El tiempo de retención fue de 3,8 ± 0,07 minutos.
Finalmente, la cantidad de ciclodextrina (CD) asociada a las nanopartículas se calculó como la diferencia entre la cantidad de CD añadida inicialmente y la cantidad de CD cuantificada en los sobrenadantes.
Cuantificación de RBITC
La cantidad de rodamina B isotiocianato (RBITC) incorporada en las nanopartículas se determinó por colorimetría a una longitud de onda de 540 nm (Labsystems iEMS Reader MF, Finlandia). Para esta cuantificación, se utilizaron curvas de calibrado de RBITC en NaOH 0,1 N en un intervalo de 5 - 50 μg/ml; r = 0,999. La cantidad de RBITC se estimó como la diferencia entre la cantidad inicial añadida y la cantidad encontrada después de la hidrólisis total de una determinada cantidad de nanopartículas en NaOH 0,1N (24 h, 370C). Liberación de RBITC
La cinética de liberación de RBITC desde las nanopartículas se realizó en tubos de diálisis Vivaspin® 100,000 MWCO (VIVASPIN, Hannover, Alemania). Para ello, 10 mg de nanopartículas se dispersaron en 1 mi de medio gástrico simulado (0-1 h) o medio intestinal simulado (1 a 24h) (USP XXIII) a 37±1°C. A determinados tiempos, las suspensiones de nanopartículas se centrifugaron (5.000 x g, 15 min) y la cantidad de RBITC en los filtrados se cuantificó por colorimetría (λ=540 nm).
Cuantificación de paclitaxel
La cantidad de paclitaxel encapsulado en las nanopartículas se determinó por HPLC. El análisis se llevo a cabo en un cromatógrafo modelo 1100 series LC (Agilent, Waldbornn, Alemania) acoplado a un sistema de detección UV de diodo-array. Los datos se analizaron en un ordenador Hewlett-Packard mediante el programa Chem- Station G2171. Para la separación del paclitaxel se utilizó una columna de fase reversa Phenomenex Gemini C18 (150 mm x 3 mm; 5 μm) calentada a 300C. La fase móvil estaba compuesta por una mezcla de solución reguladora de fosfatos (pH= 2; 0,01 M) y acetonitrilo (en proporción 50/50 en volumen), y fue bombeada a un flujo de 0,5 ml/min. La detección se realizó a 228 nm. Para el análisis de las muestras en fresco, se tomaron 100 μl de suspensión acuosa de nanopartículas y se rompieron con 100 μl de acetonitrilo. Los disolventes se evaporaron (centrífuga-evaporadora) y la muestra se reconstituyó en la fase móvil utilizada. Se inyectaron alícuotas de 100 μl se inyectan en la columna HPLC para su análisis.
C. Estudios de bioadhesión
Los estudios de bioadhesión se llevaron a cabo utilizando el protocolo descrito previamente [Arbos et al., Int. J. Pharm., 242 (2002) 129-136], de acuerdo con las normas del Comité Ético de la Universidad de Navarra y con legislación europea en animales de experimentación (86/609/EU).
Para ello, ratas macho Wistar, de peso medio 225 g (Harían, España), se mantuvieron bajo condiciones normales libres de comida y agua. A los animales se les administró por vía oral 1 mi de suspensión acuosa que contenía 10 mg de nanopartículas marcadas con RBITC. Los animales se sacrificaron a diferentes tiempos (0,5, 1, 3 y 8 horas) mediante dislocación cervical. La cavidad abdominal se abrió y se retiró el tracto gastrointestinal, que fue dividido en seis regiones anatómicas: estómago (Sto), intestino delgado (II, 12, 13 y 14) y ciego (Ce). Cada segmento de la mucosa fue abierto longitudinalmente y enjuagado con PBS (pH 7,4). A su vez, cada una de estas partes se cortó en cinco porciones similares y se digirió el tejido con 1 mi de NaOH 3 M durante 24 horas. Para extraer la rodamina se emplearon 2 mi de metanol, se agitó durante 1 minuto con el vortex y después se centrifugó a 2,000 x g durante 10 minutos (Centrífuga 5804R, Rotor A-4-44, Alemania). Alícuotas de 1 mi de los sobrenadantes obtenidos se diluyeron con agua (3 mi) y se analizaron por espectro fluorimetría a λex 540 nm y λem 580 nm (GENios, Austria) para estimar la fracción de nanopartículas adherida a la mucosa. Las rectas de calibrado se prepararon mediante adición de soluciones de RBITC en NaOH 3 M (0,5-10 μg/ml) a segmentos de tejidos control, que fueron sometidos a las mismas etapas de extracción (r>0,996). Para poder comparar las diferentes formulaciones, se estudiaron las curvas y cinéticas de bioadhesion. Para ello, se representó la fracción de nanopartículas adheridas frente al tiempo obteniéndose así las curvas de bioadhesion. A partir de éstas, y utilizando la aplicación informática WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, EEUU), se determinaron los parámetros cinéticos de bioadhesion: Qmax, AUCadh, Tmax, MRTa(1h and Kadh (Arbos et al., J. Control. Reléase, 89 (2003) 19-30). Q013x (mg), es la capacidad inicial máxima de nanopartículas adheridas a la mucosa gastrointestinal y está relacionada con la capacidad de éstas de desarrollar interacciones bioadhesivas. AUCadh (mg.h), es el área bajo la curva de la fracción de nanopartículas adheridas, y representa la intensidad de bioadhesion. MRTadh (h), es el tiempo medio estimado que las formulaciones permanecen adheridas a la mucosa. Kadh es definida como velocidad de eliminación de la fracción adherida en la mucosa. Todos estos parámetros fueron estimados entre 0 y 8 horas. Los cálculos se realizaron utilizando el programa WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, USA).
D. Visualización de las nanopartículas adheridas a la mucosa
La visualización de las nanopartículas que contienen ciclodextrinas y, opcionalmente, una molécula biológicamente activa, en la mucosa gastrointestinal se observó por microscopía de fluorescencia. Para ello, se utilizaron las formulaciones que contenían RBITC. Dichas formulaciones (10 mg de nanopartículas) se administraron por vía oral a los animales de laboratorio (ratas macho Wistar) que, dos horas después, fueron sacrificados. Tras el sacrificio, el tracto gastrointestinal fue extraído, recogiendo distintas porciones del intestino delgado que se lavaron con tampón fosfato salino (pH=7,4; 0,15 M), tal como se ha descrito anteriormente para los estudios de bioadhesión. Las diferentes secciones intestinales fueron tratadas con O.C.T.™ (Sakura, Países Bajos) y congeladas en nitrógeno líquido. Posteriormente las muestras del tejido fueron cortadas en secciones de 5 μm de espesor en un criostato (2800 Frigocut E, Reichert-Jung, Alemania), y fijadas a soportes para su visualización por microscopía de fluorescencia.
E. Estudios farmacocinéticos
Los estudios farmacocinéticos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas del Comité Ético de la Universidad de Navarra así como de la legislación europea en animales de experimentación (86/609/EU). Para ello, ratas macho Wistar, de peso medio 225 g (Harían, España), se aislaron en jaulas metabólicas 12 horas antes de la administración de las formulaciones, sin acceso a comida, pero permitiéndoles el acceso libre al agua de bebida.
Los animales se dividieron en 8 grupos de tratamiento (6 animales por grupo) y se trataron con dosis únicas de 10 mg/kg (2,25 mg) de paclitaxel incorporado en alguna de las siguientes formulaciones:
(i) solución i.v. de Taxol® (Bristol-Myers Squibb, Madrid, España); (ii) solución oral de Taxol®;
(iii) complejo paclitaxel (PTX)-2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (OH-β-CD) [PTX-OH-β-CD];
(iv) complejo paclitaxel (PTX)-β-ciclodextrina (β-CD) [PTX-β-CD];
(v) complejo paclitaxel (PTX)-6-monodesoxi-6-monoamino-β-ciclodextrina
(NH-β-CD) [PTX-NH-β-CD];
(vi) complejo paclitaxel (PTX)-2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (OH-β-CD)- nanopartícula a base de PVM/MA (NP) [PTX-OH-β-CD-NP];
(vii) complejo paclitaxel (PTX)- β-ciclodextrina (β-CD)-nanopartícula a base de PVM/MA (NP) [PTX-β-CD-NP]; y (viii) complejo paclitaxel (PTX)-6-monodesoxi-6-monoamino-β-ciclodextrina- nanopartícula a base de PVM/MA (NP) [PTX-NH-β-CD-NP]. A los animales se les administró 1 mi de las distintas formulaciones, disueltas o dispersas en agua, excepto en el caso de la solución i.v. (formulación comercial), que se administró en la vena de la cola (0,3 mi).
Tras la administración se procedió a extraer, a diferentes tiempos, un volumen de sangre de aproximadamente 300 μl, utilizando ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante y recuperando la volemia del animal (rata) con un volumen equivalente de suero fisiológico via intraperitoneal (i.p.)- La sangre se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante (plasma) se congeló a una temperatura de -800C. El estudio se realizó de acuerdo con los principios recogidos en las guías internacionales de experimentación animal (WHO Chronicle, 39 (2): 51 - 56, 1985; A CIOMS Ethical Code for Animal Experimentation) mediante protocolo aprobado por el Comité Ético de experimentación animal de la Universidad de Navarra.
Pretratamiento de las muestras
La extracción del paclitaxel a partir de plasma se realizó mediante un procedimiento de extracción líquido-liquido, utilizando t-butilmetiléter como disolvente de extracción. Para ello, se tomaron alícuotas de plasma (0,1 mi), se ajustaron a un volumen de 1 mi con agua y se les añadió 0,2 μg de docetaxel como patrón interno. A continuación, se añadieron 4 mi de ter-butilmetiléter y se agitó durante 1 minuto. Después, se centrifugaron las muestras a 10.000 rpm durante 10 minutos y se recogió el sobrenadante (fase orgánica) que se evaporó en una centrifuga evaporadora (Savant, Barcelona, España). El extracto así obtenido se reconstituyó en 200 μl de una mezcla (50/50 v/v) de acetonitrilo y solución reguladora de fosfatos (pH=2; 0,01 M) mediante agitación con vortex durante 1 minuto. La solución resultante fue transferida a un vial de inyección.
Método analítico: HPLC La cuantificación del paclitaxel se realizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección ultravioleta-visible. Como patrón interno se ha utilizado docetaxel. El análisis se llevó a cabo en un cromatógrafo modelo 1100 series LC (Agilent, Waldbornn, Alemania). Los datos se analizaron en un ordenador Hewlett- Packard mediante el programa Chem-Station G2171. Para la separación del paclitaxel se utilizó una columna de fase reversa Gemini Cl 8 (Phenomenex) 150 mm x 3 mm; 5 μm, calentada a 300C. La fase móvil estaba compuesta por una mezcla de solución reguladora de fosfatos (pH=2; 0,01 M) y acetonitrilo (en proporción 50/50 en volumen), y fue propulsada a través de la columna a un flujo de 0,5 ml/min. La detección se realizó a 228 nm.
El método analítico utilizado ha sido validado, comprobándose la relación lineal entre la respuesta del detector y las concentraciones de paclitaxel en plasma a lo largo del intervalo de concentraciones comprendido entre 40 y 3.200 ng/ml..
Análisis Farmacocinético
El análisis farmacocinético de los datos de concentraciones plasmáticas a lo largo del tiempo obtenidos tras la administración de paclitaxel se realizó utilizando el procedimiento de ajuste nocompartimental del programa de ajuste farmacocinético WiNNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, EEUU).
Los parámetros farmacocinéticos calculados fueron los siguientes: la concentración máxima (Cmax); el tiempo en el cual se alcanza la Cm3x (tmax); el área bajo la curva de niveles plasmáticos (AUCO-inf ); el tiempo de residencia media (MRT) y la semivida biológica en la fase de eliminación terminal (ti/2z), aclaramiento (Cl) y el volumen de distribución en estado de equilibrio estacionario
El tiempo de residencia media (MRT) se calculó mediante el cociente entre el valor del AUMC (área bajo la curva en el primer momento de la concentración plasmática) y el del AUC. El aclaramiento (Cl) como Dosis x Biodisponibilidad / AUC, y el volumen de distribución en estado de equilibrio estacionario (Vss) como el cociente entre el aclaramiento y la constante de eliminación terminal (k), calculada como 1/MRT.
F. Análisis estadístico
Para el estudio de bioadhesión y farmacocinética, las formulaciones se analizaron utilizando el test no paramétrico "Mann-Whitney". Valores de P < 0,05 se consideraron significativos. Todos los cálculos se hicieron con el programa estadístico de software SPSS® (SPSS® 10, Microsoft, Estados Unidos). EJEMPLO 1
Optímización del procedimiento de asociación entre un polímero biodegradable (PVM/MA) y una ciclodextrina para obtener nanopartículas Las nanopartículas se prepararon por desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento descrito anteriormente [Arbos et al., J. Control. Reléase, 83 (2002) 321-330]. Para ello, el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) y una cantidad determinada de β-ciclodextrina (β-CD), 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (OH-β-CD) ó 6-monodesoxi-6-monoamino-β-ciclodextrina (NH-β-CD) se incubaron en acetona bajo agitación magnética. Tras la incubación, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionaron un disolvente orgánico miscible (etanol) y un volumen similar de agua desionizada, dando lugar a la formación de las nanopartículas bajo apariencia de una suspensión lechosa. Tras dejar homogeneizar la suspensión de nanopartículas, ésta se evaporó bajo presión reducida (rotavapor Büchi R- 144, Suiza) hasta eliminar ambos disolventes orgánicos. Posteriormente, la suspensión se purificó por ultracentrifugación (Sigma 3k30, rotor N°-12150, Alemania). Una parte de las nanopartículas obtenidas se congeló a -800C para su posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis Génesis, Nueva York, EEUU).
La Figura 1 muestra la cantidad de ciclodextrina asociada a las nanopartículas en función del tiempo de incubación con el polímero biodegradable (PVM/MA) durante la preparación de las nanopartículas. En todos los casos, se observó un tiempo óptimo de incubación entre la CD y el polímero. Este tiempo de incubación fue de 30 minutos. Por último, es de destacar que la β-CD se asocia de forma más eficaz a las nanopartículas de PVM/MA que su derivado hidroxilado (OH-β-CD) o aminado (NH-β-CD). En función de los resultados obtenidos, para estudios posteriores se seleccionaron las siguientes condiciones experimentales: relación ciclodextrina: copolímero PVM/MA (1 :4); y - tiempo de incubación 30 minutos.
EJEMPLO 2
Producción de nanopartículas que contienen ciclodextrinas
2.1 Producción de nanopartículas que contienen ciclodextrinas Las nanopartículas se prepararon por desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento descrito anteriormente [Arbos et al., J. Control. Reléase, 83 (2002) 321-330]. Para ello, 25 mg de β-CD, OH-β-CD o NH-β-CD se dispersaron en 2 mi de acetona con ayuda de ultrasonidos (Microson™ o en baño de ultrasonidos durante 1 minuto bajo enfriamiento). Esta suspensión se adicionó a una solución de 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] en 3 mi de acetona y se dejó incubar la mezcla durante 30 minutos. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionaron 10 mi de etanol y 10 mi de agua desionizada. La mezcla resultante se dejó homogeneizar durante 5 minutos. A continuación, la suspensión de nanopartículas fue evaporada bajo presión reducida (Büchi R- 144, Suiza) hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajustó con agua a 10 mi. Posteriormente, la suspensión se sometió a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g) (Sigma 3k3O, rotor NM 2150, Alemania). Los sobrenadantes se eliminaron y el residuo se resuspendió en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Eventualmente, una parte de las nanopartículas obtenidas se congelaron a -8O0C para su posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis Génesis, Nueva York, EEUU).
2.2 Caracterización físico-química de las distintas nanopartículas a base de PVM/MA que contienen ciclodextrinas obtenidas
La determinación de las características físico-químicas permitió comprobar cómo, independientemente de la CD utilizada, las nanopartículas presentaban tamaños y cargas de superficie similares. Además, esta carga era similar a la de las nanopartículas no tratadas con lo que se puede estimar que la mayor parte de la CD se encontraba localizada en el interior de las nanopartículas y no adsorbidas sobre su superficie. La Tabla 2 resume las características fisico-químicas principales de las nanopartículas analizadas. Tabla 2
Características físico-químicas de las diferentes formulaciones de nanopartículas a base de
PVM/MA que contienen ciclodextrinas
Figure imgf000042_0001
Los datos muestran la media ± la desviación estándar (SD) (n=12). Condiciones experimentales: PVM/MA: 100 mg; ciclodextrina: 25 mg; tiempo de incubación: 30 min. Los datos muestran la media ± SD (n=12). NP: nanopartículas a base de PVM/MA sin ciclodextrina.
Como puede observarse en la Tabla 2, independientemente de la ciclodextrina utilizada, las nanopartículas presentaban tamaños y cargas de superficie similares. Además, esta carga era similar a la de las partículas no tratadas con lo que se puede estimar que la mayor parte de la ciclodextrina se encontraba localizada en el interior de las nanopartículas y no adsorbidas sobre su superficie. La asociación entre las ciclodextrinas y las nanopartículas a base de PVM/MA permite obtener nanopartículas de tamaño más pequeño que las convencionales (NP). Como se muestra en la Tabla 2, las nanopartículas a base de PVM/MA que contienen ciclodextrinas muestran un tamaño cercano a los 150 nm. Esta disminución en el tamaño podría estar asociada al alto rendimiento del proceso de fabricación de las nanopartículas. Estos rendimientos se obtuvieron mediante la determinación de su peso al final del proceso y tras su liofilización. Los rendimientos de fabricación se expresan en porcentaje, calculado respecto a la masa inicial del copolímero PVM/MA y la ciclodextrina.
La cantidad de ciclodextrina asociada a las nanopartículas varía en función del tipo de oligosacárido utilizado, siendo de alrededor de 90 μg/mg para la β-CD y de 70 μg/mg para la OH-β-CD y la NH-β-CD. La confirmación de la presencia de CD asociadas a las nanopartículas a base de PVM/MA se realizó tras el análisis elemental de las diferentes formulaciones. Los resultados obtenidos (Tabla 3) confirmaron la presencia de CD debido a un aumento importante en la proporción de oxígeno en las formulaciones que llevaban la CD asociada, así como una disminución del porcentaje de carbono, en comparación con las nanopartículas control (NP).
Tabla 3 Resultados del análisis elemental de las formulaciones control (NP) y de las formulaciones de nanopartículas a base de PVM/MA asociadas a CD
Figure imgf000043_0001
NP: Nanopartículas a base de PVM/MA control sin CD (vacías); β-CD-NP: Nanopartículas a base de PVM/MA con β-CD; OH-β-CD-NP: Nanopartículas a base de PVM/MA con OH-β-CD; NH-β-CD-NP: Nanopartículas a base de PVM/MA con NH-β-CD.
La morfología de las nanopartículas se observó por microscopía electrónica de barrido (Zeiss, Alemania), tras la cual se observó la típica forma esférica de las nanopartículas, homogéneas y de un tamaño comprendido entre 80 y 200 nm. La Figura
2 muestra los resultados de someter una muestra liofilizada de nanopartículas a base de PVM/MA con β-CD (β-CD-NP) a microscopía de barrido electrónico.
EJEMPLO 3 Producción de nanopartículas que contienen ciclodextrinas y RBITC
Las nanopartículas se prepararon por desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento descrito anteriormente [Arbos et al., J. Control. Reléase, 83 (2002)
321-330]. Para ello, 25 mg de β-CD, OH-β-CD o NH-β-CD se dispersaron en 2 mi de acetona con ayuda de ultrasonidos (Microson™ o en baño de ultrasonidos durante 1 minuto bajo enfriamiento). Esta suspensión se adicionó a una solución de 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] en 3 mi de acetona y se dejó incubar la mezcla durante 30 minutos. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionaron 10 mi de etanol y 10 mi de agua desionizada. La mezcla resultante se dejó homogeneizar durante 5 minutos. A continuación, la suspensión de nanopartículas fue evaporada bajo presión reducida (Büchi R- 144, Suiza) hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajustó con agua a 10 mi. A continuación, se añadió a las nanopartículas una solución acuosa de rodamina B isotiocianato (RBITC) y se dejó incubar durante 5 minutos, a temperatura ambiente y con agitación magnética. Posteriormente, la suspensión se sometió a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g) (Sigma 3k30, rotor NM2150, Alemania). Los sobrenadantes se eliminaron y el residuo se resuspendió en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Eventualmente, una parte de las nanopartículas obtenidas se congelaron a -800C para su posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis Génesis, Nueva York, EEUU). La cantidad de RBITC se estimó como diferencia entre la cantidad inicial añadida y la cantidad encontrada después de la hidrólisis total de una determinada cantidad de nanopartículas en NaOH 0,1 N (24 h, 37°C). La Tabla 4 muestra los valores de RBITC (μg RBITC/ mg nanopartícula) para las diferentes formulaciones ensayadas.
Tabla 4
RBITC (μg/mg) asociada a las nanopartículas
Figure imgf000044_0001
Los datos muestran la media ± SD (n=8). Condiciones experimentales: PVM/MA: 100 mg; ciclodextrina: 25 mg; tiempo de incubación: 30 min. NP: Nanopartículas a base de PVM/MA control sin CD (vacías).β-CD-NP: Nanopartículas a base de PVM/MA con β-CD.OH-β-CD-NP: Nanopartículas a base de PVM/MA con OH-β-CD.NH-β-CD-NP: Nanopartículas a base de PVM/MA con NH-β-CD.
La Figura 3 muestra la cinética de liberación de RBITC desde las nanopartículas en medio gástrico simulado (0-1 h) y en medio intestinal simulado (1 a 24 h) a 37±1°C. En todos los casos, se constató que el porcentaje de RBITC liberado tras 24 horas de incubación, fue siempre inferior al 10% de la cantidad asociada a las nanopartículas. Por ello, se puede asumir que los resultados obtenidos en los posteriores estudios de bioadhesión así como en la microscopía de fluorescencia, la intensidad de fluorescencia corresponde a la RBITC asociada a las nanopartículas. EJEMPLO 4
Evaluación de las características bioadhesivas de las nanopartículas que contienen ciclodextrinas en el tracto gastrointestinal de ratas La Figura 4 muestra el perfil de bioadhesión de las formulaciones ensayadas, representando la fracción de nanopartículas adheridas en los diferentes segmentos del tracto gastrointestinal (estómago; intestino delgado: 11-14; ciego) a 30 minutos, 1 h, 3 h y 8 h tras la administración oral, de acuerdo con la metodología descrita previamente. Como puede observarse en dicha figura, las nanopartículas asociadas a ciclodextrinas mostraron un perfil de bioadhesión diferente al de las nanopartículas control. En trabajos recientes, el potencial bioadhesivo del copolímero PVM/MA demostró ser mucho mayor incorporado a las nanopartículas que cuando se administró en forma de una solución acuosa simple (Arbos et al., J. Control. Reléase, 89 (2003) 19-30). Este hecho concuerda con trabajos previos que sugerían que la forma de nanopartícula facilitaría tanto el contacto inicial como las interacciones adhesivas con los componentes de la mucosa.
Pasados 30 minutos de la administración, todas las formulaciones ensayadas mostraron un máximo de bioadhesión en el estómago y en el jejuno (porción 12 en la Figura 4). En cualquier caso, parece observarse una mayor interacción con las nanopartículas asociadas a la OH-β-CD. Por lo tanto, 30 minutos después de la administración, se puede decir que alrededor del 12-20% de la dosis administrada de las formulaciones se encuentran adheridas al estómago y aproximadamente entre el 14-22% en el intestino delgado. Dichos valores son significativamente diferentes a los encontrados para las nanopartículas convencionales (a base de PVM/MA) sin CD que menos del 10% y no más del 12% de la dosis administrada se encuentra adherida al estómago e intestino delgado, respectivamente.
A partir de 1 h tras la administración, se puede observar cómo la fracción de nanopartículas con ciclodextrinas adheridas a la mucosa gastrointestinal va disminuyendo y moviéndose a porciones distales del tracto. En cualquier caso, se puede observar que dicha distribución es homogénea y ninguna formulación muestra especificidad por alguna región del tracto gastrointestinal.
Para poder comparar el potencial adhesivo de las diferentes formulaciones, se estudiaron las curvas y cinéticas de bioadhesión. Para ello, se representó la fracción de nanopartículas adheridas frente al tiempo obteniéndose así las curvas de bioadhesión. Esas curvas están representadas en la Figura 5. A partir de éstas, y utilizando la aplicación informática WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, EEUU), se determinaron los parámetros cinéticos de bioadhesión: Qmax, AUCadh, Tmax, MRT3Jh and Kadh (Arbos et al., J. Control. Reléase, 89 (2003) 19-30). La Tabla 5 recoge estos parámetros.
Tabla 5 Parámetros de bioadhesión para las distintas formulaciones de nanopartículas
Figure imgf000046_0001
Los resultados se expresan como media ± SD (n =3). * p< 0,05 OH-β-CD-NP y β-CD-NP vs. NP. ** p< 0,01 OH-β-CD-NP y β-CD-NP vs. NP. Qmax (mg): cantidad máxima de nanopartículas adheridas a la mucosa. AUCadh (mg.h): área bajo la curva de bioadhesión. Kadh (K1): velocidad de eliminación de la fracción adherida. MRTadh (h): tiempo de residencia medio de la fracción adherida de nanopartículas. OH-β-CD-NP: Nanopartículas a base de PVM/MA con OH-β-CD. β-CD-NP: Nanopartículas a base de PVM/MA con β-CD. NP: Nanopartículas a base de PVM/MA control sin CD (vacías).
Como puede observarse, las nanopartículas asociadas a OH-β-CD están caracterizadas por una AUCadh (parámetro que mide la intensidad de las interacciones bioadhesivas) 1,5 veces superior a la observada para las nanopartículas control (NP). Igualmente, la fracción adherida de las formulaciones asociadas a ciclodextrinas mostraban una velocidad de eliminación (K8Jh) significativamente inferior que la de las NP control (p<0,01) y un tiempo de residencia medio (MRTadh) de aproximadamente 3,5 horas. Estos resultados permiten suponer que la presencia de ciclodextrinas (principalmente OH-CD) puede facilitar la interacción con la mucosa gastrointestinal y desarrollar interacciones adhesivas con componentes de la mucosa más fuertes que las NP.
EJEMPLO 5
Visualización de las nanopartículas que contienen ciclodextrinas en la mucosa gastrointestinal
La visualización de la distribución de las nanopartículas asociadas a ciclodextrinas en la mucosa gastrointestinal se observó por microscopía de fluorescencia. Para ello, las diferentes formulaciones marcadas con RBITC se administraron a animales de laboratorio. Dos horas después de su administración, los animales fueron sacrificados y se examinaron diversas porciones del intestino delgado. La Figura 6 muestra unas fotografías que permiten observar la distribución de las nanopartículas en muestras de íleo.
En concordancia con los estudios de bioadhesión in vivo, las nanopartículas asociadas a hidroxipropil-β-ciclodextrina presentan mayor capacidad establecer interacciones bioadhesivas con la mucosa que las nanopartículas control. Las nanopartículas convencionales no fueron capaces de alcanzar los enterocitos a pesar de su habilidad para penetrar en la capa de mucus que tapiza la mucosa. Por el contrario, las nanopartículas asociadas a ciclodextrina se adhirieron significativamente en los enterocitos del intestino.
EJEMPLO 6
Nanopartículas con ciclodextrinas conteniendo paclitaxel
El procedimiento para la fabricación de nanopartículas que contienen ciclodextrinas con paclitaxel se divide en dos etapas diferentes:
1) Producción del complejo paclitaxel-ciclodextrina, que incluye tanto la formación como la purificación del complejo formado; y
2) Producción de nanopartículas conteniendo el complejo paclitaxel-ciclodextrina.
Producción del complejo Paclitaxel-Ciclodextrina
Para ello, se preparó una solución acuosa de ciclodextrina (β-CD, OH-β-CD o NH- β-CD) que se añadió sobre una solución etanólica del fármaco paclitaxel (PTX) en una proporción 80:20 (v:v), y con una relación molar fármaco: ciclodextrina (1:1). La mezcla se mantuvo en agitación magnética (300 rpm), en oscuridad y a temperatura ambiente hasta alcanzar el equilibrio (al menos, 72 horas). A continuación, se eliminó el etanol bajo evaporación a presión reducida y se filtró la suspensión (0,45 μm) para eliminar los cristales de fármaco no disuelto. Finalmente, se eliminó completamente el agua de la solución acuosa final por evaporación bajo presión reducida quedando el complejo paclitaxel-ciclodextrina bajo la apariencia de un polvo blanco. Producción de nanopartículas conteniendo el complejo paclitaxel-ciclodextrína
Las nanopartículas se obtuvieron por desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento descrito anteriormente (Arbos et al, 2002, citado suprά). Para ello, una cantidad determinada del complejo formado previamente entre el paclitaxel y la ciclodextrina (β-CD, OH-β-CD o NH-β-CD) se dispersó n 2ml de acetona. Esta suspensión se adicionó a una solución de 100 mg del copolímero de metil vinü éter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] en 3 mi de acetona y se dejó incubar la mezcla durante 30 minutos. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionaron 10 mi de etanol y 10 mi de agua desionizada. La mezcla resultante se dejó homogeneizar durante 5 minutos. A continuación, la suspensión de nanopartículas fue evaporada bajo presión reducida (Büchi R- 144, Suiza) hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajustó con agua a 10 mi. Posteriormente, la suspensión se sometió a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g) (Sigma 3k30, rotor N°-12150, Alemania). Los sobrenadantes se eliminaron y el residuo se resuspendió en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Una parte de las nanopartículas obtenidas se congeló a -800C para su posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis Génesis, Nueva York, EEUU).
Optimización del proceso de encapsulación del complejo paclitaxel-ciclodextrina en las nanopartículas
La Figura 7 muestra la evolución del contenido en PTX en las nanopartículas que contienen ciclodextrinas y PTX, en función de la cantidad y tipo de ciclodextrina utilizada. En primer lugar, merece la pena destacar que el PTX por sí solo, es decir, sin formar complejo con las CD, no es capaz de incluirse en las nanopartículas, siendo eliminado en el proceso de purificación de las nanopartículas por filtración. Por ello, se hace necesaria la formación del complejo paclitaxel-ciclodextrina (PTX-CD). Para las diferentes ciclodextrinas utilizadas se observó cómo las mejores eficacias de encapsulación se obtuvieron cuando el PTX forma complejo con la OH-β-CD, seguido de la NH-β-CD y de la β-CD sin sustituir. Asimismo se ensayaron también diferentes cantidades de PTX (5, 7,5, 10 y 25 mg), siempre guardando la relación molar 1 : 1 con la ciclodextrina correspondiente, y se observó cómo para cantidades superiores a 10 mg de PTX [PTX:PVM/MA (1 :10)], no se obtuvieron mayores cantidades de fármaco encapsulado, y, por consiguiente se observó una disminución en la eficacia de encapsulación del complejo PTX-CD en las NP. Tras estos ensayos, se determinó que, en las condiciones ensayadas, la cantidad óptima de PTX a incluir en las diferentes formulaciones era de 10 mg, obteniéndose así los mejores rendimientos. La Tabla 7 muestra la cantidad de PTX encapsulado cuando inicialmente se añadáin 10 mg en función de las diferentes ciclodextrinas utilizadas para formar el complejo.
Tabla 7 Cantidad de PTX asociado a diferentes formulaciones de nanopartículas en función del tipo de ciclodextrina utilizada (cantidad inicial de paclitaxel añadida: 10 mg)
Figure imgf000049_0001
Los resultados muestran media ± desviación típica (n = 6). PTX-NP: nanopartículas convencionales de PVM/MA con paclitaxel; PTX-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y β- CD con paclitaxel; PTX-OH-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y OH-β-CD con paclitaxel; y PTX-NH-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y NH-β-CD con paclitaxel.
EJEMPLO 7
Estudio farmacocinético tras administración oral de distintas formulaciones de paclitaxel
El paclitaxel es un fármaco que se caracteriza por presentar un perfil farmacocinético dosis-dependiente. Por tanto, previamente fue necesario determinar el perfil farmacocinético tras administrar por vía intravenosa u oral la formulación comercial de paclitaxel a la dosis seleccionada para su formulación en nanoparticulas (lO mg/kg).
Los estudios farmacocinéticos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas del Comité Ético de la Universidad de Navarra así como de la legislación Europea en animales de experimentación (86/609/EU). Para ello, ratas macho Wistar, de peso medio 225 g (Harían, España), se aislaron en jaulas metabólicas 12 horas antes de la administración de las formulaciones, sin acceso a comida, pero permitiéndoles el acceso libre al agua de bebida.
Tabla 8
Características físico-químicas de las diferentes formulaciones con complejo paclitaxel-ciclodextrina utilizadas en los estudios farmacocinéticas
Figure imgf000050_0001
Los resultados muestran media ± desviación típica (n = 8). PTX-NP: nanopartículas convencionales de PVM/MA con paclitaxel; PTX-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y β- CD con paclitaxel; PTX-OH-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y OH-β-CD con paclitaxel; y PTX-NH-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y NH-β-CD con paclitaxel.
La Tabla 8 resume las características físico-químicas principales de las nanopartículas ensayadas en el estudio farmacocinético. Las nanopartículas control (PTX-NP) muestran un tamaño cercano a los 200 nm con una carga superficial negativa de -38 mV. Por otra parte, las nanopartículas que contienen encapsulado el complejo PTX-CD son significativamente mayores (cercanas a los 300 nm) y muestran un potencial zeta similar en todos los casos. Por último, es de destacar que la presencia del complejo PTX-CD no ejerce ningún efecto sobre el rendimiento de fabricación de las nanopartículas que varía entre el 50-60%. El estudio farmacocinético se dividió en tres fases. En el primer estudio se administrarton 10 mg/kg de la formulación comercial de paclitaxel (Taxol®) por vía intravenosa (i.v.) y oral a dos grupos de ratas macho Wistar (n= 6). El segundo estudio consistió en administrar por vía oral soluciones de paclitaxel (10 mg/kg) con (i) β-CD, (ii) OH-β-CD, o (iii) NH-β-CD, a grupos de ratas compuestos de 6 animales. Finalmente, para el estudio farmacocinético de las diferentes formulaciones se administraron por vía oral a distintos grupos de animales las diferentes formulaciones de nanopartículas (i) PTX-OH-β-CD-NP, (ii) PTX-β-CD-NP, (iii) PTX-NH-β-CD-NP, o (iv) PTX-NP a los animales. La dosis de paclitaxel seleccionada fue de 10 mg/kg. Tras la administración se procedió a extraer a diferentes tiempos (0,10, 30, 60, 90, 180, 360, 480 minutos, 24 y 30 horas) un volumen de sangre de aproximadamente 300 μl, utilizando EDTA como anticoagulante y recuperando la volemia del animal (rata) con un volumen equivalente de suero fisiológico via intraperitoneal (i.p.)- El análisis farmacocinético de los resultados obtenidos tras la administración de paclitaxel se realizó utilizando el procedimiento de ajuste nocompartimental del programa de ajuste farmacocinético WiNNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, Estados Unidos).
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 8. Como se puede observar, la administración i.v. de la formulación convencional (taxol comercial) muestra un pico de concentración de paclitaxel en plasma en la primera toma de muestra, seguido de una disminución bifásica a lo largo del tiempo. Dicho perfil es similar al descrito por otros autores (Yeh et al., Pharm Res 22(6): 867-74, 2005). Cuando dicha formulación comercial se administró por vía oral (Figura 8B), los niveles plasmáticos de paclitaxel fueron nulos. Resultados similares se obtuvieron al administrar los complejos PTX:CD, ninguno de ellos permitió detectar o cuantificar niveles significativos de paclitaxel en el tiempo. Por el contrario, al administrar por vía oral las formulaciones de paclitaxel en nanopartículas conteniendo ciclodextrinas y paclitaxel se pudo comprobar que estas formulaciones daban lugar a niveles plasmáticos sostenidos en el tiempo durante, al menos, 24 horas. En el periodo de tiempo comprendido desde las 4 horas hasta las 24 horas posterior a la administración de dichas nanopartículas se pudo observar para las tres formulaciones un "plateau" de concentración plasmática típico de las formulaciones que liberan el fármaco con cinéticas de orden 0. En cualquier caso, las formulaciones PTX-β-CD-NP y PTX-OH- β -CD-NP permiten obtener niveles plasmáticos sensiblemente superiores (3-4 veces) a los obtenidos con la formulación PTX-NH-β- CD-NP. También es interesante resaltar que la administración de paclitaxel en nanopartículas convencionales no permitió la absorción del fármaco.
La Tabla 9 recoge los valores de los parámetros farmacocinéticos obtenidos tras realizar un análisis no compartimental de los datos experimentales obtenidos tras administrar las distintas formulaciones de paclitaxel en nanopartículas. Como puede observarse en dicha tabla, el valor de AUC y MRT experimenta variaciones significativas en función del tipo de ciclodextrina empleada en la formulación. En el caso de las formulaciones orales de PTX-OH- β -CD-NP y PTX-β-CD-NP se obtuvieron valores de AUC similares. En ambas formulaciones orales (PTX-OH-β-CD-NP y PTX- β-CD-NP) la concentración máxima alcanzada resultó ser significativamente mayor que la alcanzada en el resto de formulaciones en un periodo de tiempo de 6 y 5 horas, respectivamente. El tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo (MRT) fue similar para las tres formulaciones con ciclodextrinas. Estos valores fueron entre 3 y 5 veces superiores a los alcanzados tras administrar la formulación comercial (Taxol ) por vía intravenosa.
Del mismo modo, la semivida de eliminación del fármaco en la fase terminal (T1Z22) fue similar para las formulaciones de nanopartículas que contenían ciclodextrina y paclitaxel, y, en cualquier caso, inferior a la obtenida para la formulación comercial administrada por vía intravenosa (Taxol®).
Tabla 9 Parámetros farmacocinéticos de las diferentes formulaciones ensayadas
Figure imgf000052_0001
* p< 0.05 PTX-OH β-CD-NP, PTX-β-CD-NP y PTX-NH β-CD-NP vs. formulación comercial (Taxol )
Test U de Mann Whitney.
AUC0.mf : área bajo la curva de niveles plasmáticos; Cn13x: concentración máxima; T103x: tiempo en el cual se alcanza la C103x; MRT: tiempo de residencia media; T1^2: semivida biológica en la fase de eliminación terminal Cl/F: aclaramiento (Cl=Dosis x Biodisponibilidad/AUC); Vss: volumen de distribución en estado de equilibrio (Vss=Dosis x AUMC/ AUC2). Los valores de aclaramiento y volumen de distribución están normalizados frente al valor de la biodisponibilidad oral de cada formulación
PTX-OH-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y OH-β-CD con paclitaxel; PTX-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y β-CD con paclitaxel; PTX-NH-β-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y NH-β-CD con paclitaxel; y PTX-NP: nanopartículas convencionales de PVM/MA con paclitaxel.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una nanopartícula que comprende un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa.
2. Nanopartícula según la reivindicación 1, en la que dicho polímero biodegradable es un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA).
3. Nanopartícula según la reivindicación 1, en la que dicha ciclodextrina, o derivado de la misma, se selecciona del grupo formado por β-ciclodextrina, 2- hidroxipropil-β-ciclodextrina, 6-monodesoxi-6-monoamino-β-ciclodextrina y sus mezclas.
4. Nanopartícula según la reivindicación 1, que comprende dos o más moléculas biológicamente activas.
5. Nanopartícula según la reivindicación 1, en la que dicha molécula biológicamente activa es una molécula química pequeña, una proteína, un péptido, un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleótido, un polinucleótido o un ácido nucleico.
6. Nanopartícula según la reivindiación 1, en la que dicha molécula biológicamente activa es un fármaco, un antígeno o un alérgeno.
7. Nanopartícula según la reivindicación 1, en la que dicha molécula biológicamente activa es una sustancia hidrófoba o una sustancia sustrato de la enzima glicoproteína-P.
8. Nanopartícula según la reivindicación 7, en la que dicha molécula biológicamente activa se selecciona del grupo formado por actinomicina D, albendazol, amitriptilina, amprenavir, atorvastatina, bunitrolol, camptotecina, carvedilol, celiprolol, ciclosporina, clotrimazol, colchicina, cortisona, daunorubicina, debrisoquina, dexametasona, digitoxina, digoxina, diltiazem, docetaxel, domperidona, doxorubicina, epirubicina, eritromicina, estradiol, etoposido, fenitoina, fexofenadina, FK506,
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) fluorouracilo, gentamicina, griseofulvina, imatinib, indinavir, itraconazol, levofloxacino, losartan, lovastatina, mebendazol, metilprednisolona, metotrexato, mibefradil, morfina, nelfinavir, ondansetron, paclitaxel, praziquantel, prednisolona, prednisona, quinidina, rapamicina, rifampicina, saquinavir, sirolimus, sulfametiazol, ritonavir, tacrolimus, talinolol, teniposido, terfenadina, topotecan, triamcinolona, verapamil, vinblastina, vincristina y sus mezclas.
9. Una composición farmacéutica que comprende, al menos, una nanopartícula que comprende un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un excipiente, vehículo o adyuvante, farmacéuticamente aceptable.
10. Un procedimiento para la producción de nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende la etapa de incubar simultáneamente dicho polímero biodegradable y un complejo (ciclodextrina o derivado de la misma):(molécula biológicamente activa) (complejo [CDrMBA]), en un disolvente orgánico, antes de proceder a la desolvatación de dicho polímero biodegradable con una solución hidroalcohólica; o, alternativamente, la etapa de incubar nanopartículas de dicho polímero biodegradable con una solución acuosa que comprende dicho complejo [CDiMBA].
11. Una composición farmacéutica que comprende, al menos, una nanopartícula que comprende un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un excipiente, vehículo o adyuvante, farmacéuticamente aceptable, en la que dicha molécula biológicamente activa es paclitaxel.
12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que dicho polímero biodegradable es un copolímero de PVM/MA.
13. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, en la que dicha ciclodextrina se selecciona entre β -ciclodextrina, 2-hidroxipropil-β- ciclodextrina, 6-monodesoxi-6-monoamino-β-ciclodextrina y sus mezclas.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
14. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que dicha nanopartícula comprende:
Componente % en peso respecto al total
Copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) 75,00 - 95,00% β-ciclodextrina 10,00 - 24,99%
Paclitaxel 0,01 - 15,00%
o, alternativamente,
Componente % en peso respecto al total
Copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) 70,00 - 95,00% 2-Hidroxipropü-β-ciclodextrina 5,00 - 24,99% Paclitaxel 0,01 - 20,00%
o, alternativamente,
Componente % en peso respecto al total Copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) 75,00 - 95,00% 6-monodesoxi-6-monoamino-β-ciclodextrina 5,00 - 24,99%
Paclitaxel 0,01 - 20,00%
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
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