WO2009121997A2 - Nanopartículas pegiladas que comprenden una molécula biológicamente activa y sus aplicaciones - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to pegylated nanoparticles, based on a biocompatible polymer and a polyethylene glycol, which contain a biologically active molecule, useful as systems for oral administration of said biologically active molecules.
- the invention also relates to a process for its production, with compositions containing said pegylated nanoparticles and with their applications.
- nanoparticles are defined as colloidal systems of solid polymer particles smaller than the micrometer (typically between 10-1000 nm), consisting of natural or synthetic polymers. Depending on the method of preparation, they are subdivided into matrix nanospheres and vesicular nanocapsules (Marcháis et al., Journal Drug Dev Ind Pharm 24 (1998) 883-888).
- the nanospheres are matrix forms formed by a three-dimensional polymeric network in which the drug is physically and uniformly dispersed, while the nanocapsules are vesicular systems formed by an internal cavity that contains the drug and is surrounded by a polymeric membrane or wall. In both cases, due to the high specific surface area of these systems, the molecules of the biologically active substance may be trapped or adsorbed on the surface of the nanoparticles.
- One of the most important features offered by nanoparticles lies in their capacity for controlled release of the incorporated drug, which, together with its small size, allows the design of transport systems suitable for administration by different routes (oral, parenteral, ocular) and whose therapeutic applications are a consequence of its distribution in the organism.
- the oral route is the most popular and attractive route for drug administration.
- this route is associated with a significant increase in the acceptance of medication by the patient and with lower healthcare costs.
- a significant number of drugs have a very low efficacy when administered by this route.
- This phenomenon may be due to one or more of the following factors that determine the oral bioavailability of a drug: (i) low permeability of the active molecule to pass through the mucosa (usually associated with hydrophilic drugs), (ii) incomplete release of the drug from the dosage form, (iii) presystemic metabolism, (iv) low solubility of the active ingredient in the gastrointestinal environment (associated with drugs of a hydrophobic nature), and (v) low stability in the gastrointestinal environment (presence of values of pH extremes, enzymes, etc.).
- Illustrative examples of drugs whose oral bioavailability increases by encapsulation or association with nanoparticles include salmon calcitonin, furosemide, estradiol, avarol, dicumarol, nifedipine and fluoropyrimidines.
- the polymers with the greatest pharmaceutical application are those derived from methyl vinyl ether (Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology (1981) 1053-1069).
- the main copolymer of methyl vinyl ether is obtained after polymerization with maleic anhydride from acetylene, obtaining poly (methyl vinyl ether-co-maleic anhydride) (PVM / MA), marketed by ISP TM under the trademark Gantrez "AN
- PVM / MA copolymer is structurally composed of two distinct functional groups that have characteristics of Different solubility: a hydrophobic ester group and an anhydride group.
- the carboxylic group is a solubilizer, since it tends to dissolve the polymer when it is ionized, and the ester group is hydrophobic, since it delays the penetration of water into the polymer.
- PVM / MA synthetic copolymers have very diverse applications. Gantrez ® AN is widely used as a thickener and flocculant, dental adhesive, oral tablet excipient, transdermal patch excipient, etc.
- PEG polyethylene glycol
- EO ethylene oxide
- PEGs have high aqueous solubility and low toxicity. Its derivatives include mono-, di- and polyesters, but they can also react with other products to give rise to ethers, amines and acetals, among others. It is one of the most popular polymers for surface modification of active molecule transporters. In fact, it has been proven that PEGs reduce the interactions of nanoparticles with macrophage phagocytic system (MPS) cells, thus prolonging the circulation of nanoparticles in the bloodstream after parenteral administration. With respect to their use orally, the association of polyethylene glycols with conventional nanoparticles allows them to be protected against enzymatic attack in digestive fluids.
- MPS macrophage phagocytic system
- polyethylene glycols are capable of reducing the activity of P-glycoprotein and enzymatic complexes associated with cytochrome P450, interfering with the structure of the apical membrane and, as a consequence, directly or indirectly, affecting the function of said conveyors.
- intestinal permeability has been studied, in vitro, an indispensable requirement for oral bioavailability (Johnson et al, AAPS PharmSci 4 (2002) E40) (Collnot et al, Mol Pharm 4 (2007) 465-474).
- Paclitaxel (Taxol®, Bristol Myers Squibb Company), a product extracted from the Taxus brevifolia tree, was first described in 1971 and since 1993 is the most widely used cancer chemotherapeutic agent worldwide. Paclitaxel acts at the cellular level promoting the polymerization of tubulin. Thus, the microtubules formed in the presence of paclitaxel are extraordinarily stable and non-functional, thus causing cell death due to the dynamic and functional incapacity of microtubules for cell division. In Europe, this drug is indicated both as an individual agent and in combination with other cancer treatments for the treatment of ovarian, breast and non-small cell lung cancer, both advanced and metastatic.
- paclitaxel is a substrate for P-glycoprotein, as well as other members of the ABC superfamily (ATP-binding cassette), such as BCRP and MRP2.
- the ABC protein transport superfamily plays a central role in the body's defense against toxic compounds and against some anticancer agents.
- These proteins are located in the apical zone of the intestinal, hepatic and renal membranes, mediating the pumping of xenobiotics and toxins to the intestinal, biliary and urine lumen.
- both P-glycoprotein and MRP2 are located together with CYP3A4, glutathione-S-transferases and UDP-glucuronosyltransferases, which is a synergistic action in the regulation of oral bioavailability of the drugs administered.
- paclitaxel is formulated for clinical use and intravenously in a vehicle composed of Cremophor EL: ethanol (1: 1).
- Cremophor EL ethanol
- a new formulation based on the encapsulation of the drug in albumin nanoparticles called Abraxane ® (Green et al. Annals of Oncology 17: 1263-1268, 2006).
- said pegylated nanoparticles can be applied for oral administration (or through other mucous membranes) of numerous drugs including those that are substrates of P-glycoprotein and / or of the enzyme complexes associated with cytochrome P-450 (eg, paclitaxel), as well as for the administration of drugs with high toxicity (eg, cytostatics) by offering sustained and constant plasma levels of the biologically active molecule for very high periods of time (eg, at least 48 hours, in the case of paclitaxel ), which allows alternative treatments to hospital infusion, allowing a lower cost of the health cost of treatments with this type of drugs and a improvement in the patient's quality of life.
- drugs including those that are substrates of P-glycoprotein and / or of the enzyme complexes associated with cytochrome P-450 (eg, paclitaxel), as well as for the administration of drugs with high toxicity (eg, cytostatics) by offering sustained and constant plasma levels of the biologically active molecule for very high
- the invention provides nanoparticles that solve the problems mentioned above, that is, nanoparticles capable of associating high amounts of biologically active molecules (eg, paclitaxel) for effective administration through the oral route. Therefore, these nanoparticles have suitable bioadhesive characteristics that favor the interaction of the pharmaceutical form that contains the biologically active drug or molecule with the mucosal surface. In addition, said nanoparticles allow the drug to be released by providing sustained and constant plasma levels thereof when administered orally or through any other mucosa of the organism.
- biologically active molecules eg, paclitaxel
- said nanoparticles minimize the effect of P-glycoprotein and / or the enzyme complex associated with cytochrome P450, in the event that the drug is a substrate for said P-glycoprotein and / or the enzyme complex associated with cytochrome P450.
- the invention relates to pegylated nanoparticles comprising a biocompatible polymer, a polyethylene glycol or a derivative thereof, and a biologically active molecule selected from the group consisting of actinomycin D, albendazole, aldosterone, alprazolam, amiodarone, amitriptyline , amprenavir, assadolin, atorvastatin, bunitrolol, buspirone, camptothecin, carbamazepine, carvedilol, celiprolol, cyclosporine A, cimetidine, clotrimazole, colchicine, cortisone, daunorubicin, debrisoquine, dexamethasone, diazepaxine, dozeximine, digzexamine, digzexamine, digzexamine, digzexamine, digzexamine, digzexamine, digzexamine, digzexamine, digzexamine, digzexamine, digzexamine
- the biocompatible polymer is a copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride (PVM / MA).
- the polyethylene glycol (PEG) is PEG 2000, PEG 6000 or PEG 10000.
- the biologically active molecule is paclitaxel. In this case, oral administration of the pegylated nanopops containing paclitaxel allows a dramatic increase in the oral bioavailability of paclitaxel, whose oral absorption is practically nil due to its physicochemical characteristics
- the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising said pegylated nanoparticles containing a biologically active molecule.
- the invention relates to a process for the production of said pegylated nanoparticles containing a biologically active molecule.
- PTX-NP PVM / MA nanoparticles with paclitaxel
- PTX-NP-gli PVM / MA nanoparticles and glycine with paclitaxel
- PTX-NP2 PVM / MA and PEG 2000 nanoparticles with paclitaxel
- PTX-NP6 PVM / MA and PEG 6000 nanoparticles with paclitaxel
- PTX-NP PVM / MA and PEG 2000 nanoparticles with paclitaxel
- PTX-NP6 PVM / MA and PEG 6000 nanoparticles with paclitaxel
- PTX-NP PVM / MA and PEG 6000 nanoparticles with paclit
- NPlO PVM / MA and PEG 10000 nanoparticles with paclitaxel.
- Figure 2 shows the plasma concentrations of paclitaxel (PTX) as a function of time after administration in laboratory animals of the different PTX formulations. The results show the values of the mean ⁇ standard deviation.
- Figure 2A shows the plasma concentration of PTX as a function of time after intravenous (iv) administration of a 10 mg / kg dose of Taxol® (commercial formulation of paclitaxel).
- Figure 2B shows the PTX plasma concentration as a function of time after oral administration of a dose of 10 mg / kg of Taxol® (commercial formulation of paclitaxel).
- Figure 2C shows the plasma concentration of PTX as a function of time after oral administration of a dose of 10 mg / kg of the following formulations: PTX-NP-gli: control nanoparticles of PVM / MA and paclitaxel ( with the addition of glycine);
- PTX-NP2 PVM / MA and PEG 2000 nanoparticles with paclitaxel
- PTX-NP6 PVM / MA and PEG 6000 nanoparticles with paclitaxel
- PTX-NP10 PVM / MA and PEG 10000 nanoparticles with paclitaxel.
- Figure 5 is a graph showing the in vivo antitumor activity of
- Taxol ® and pegylated nanoparticles were administered at a dose of 10 mg / kg, while pegylated nanoparticles were administered at a dose of
- Figure 6 is a graph showing the concentration of the Factor of
- VEGF Vascular Endothelial Growth
- Nanoparticles in one aspect, relates to pegylated nanoparticles, hereinafter nanoparticles of the invention, comprising a biocompatible polymer, a polyethylene glycol or a derivative thereof, and a biologically active molecule.
- the nanoparticles of the invention possess adequate physical-chemical characteristics, specificity and bioadhesion to the gastrointestinal mucosa, which makes them potentially useful systems for the transport of biologically active molecules, including in particular, biologically active molecules of lipophilic nature, biologically active molecules that are a substrate for the P-glycoprotein or the enzyme complex associated with the cytochrome P450.
- the nanoparticles of the invention improve the oral bioavailability of said biologically active molecules, in general, and, in particular, of biologically active molecules of lipophilic nature and / or of biologically active molecules that can be a substrate for P-glycoprotein.
- the nanoparticles of the invention can prolong the residence time of the biologically active molecule in the mucosa after oral administration.
- the nanoparticles of the invention can be used as a transport system for biologically active molecules with high toxicity, for example, cytostatics, because they offer sustained and constant plasma levels of such drugs for periods of time. elevated, which allows the design of alternative treatments to hospital infusion, resulting in a reduction in the health cost of treatments with this type of drugs.
- nanoparticle refers to similar spheres or shapes with an average size of less than 1.0 micrometer ( ⁇ m).
- the nanoparticles of the invention have an average particle size between 1 and 999 nanometers (nm), preferably between 10 and 900 nm.
- the nanoparticles of the invention have an average particle size between 100 and 400 nm.
- average size is meant the average diameter of the nanoparticle population that moves together in an aqueous medium. The average size of these systems can be measured by standard procedures known to those skilled in the art and described, by way of illustration, in the experimental part that accompanies the examples described below.
- the average particle size can be influenced mainly by the quantity and molecular weight of the biocompatible polymer, by the nature and quantity of the PEG, or derived from it, and by the nature and quantity of the biologically active molecule, present in the nanoparticles of the invention (in general, at a greater amount or molecular weight of said components, the average size of the nanoparticle will be increased), and by some parameters of the production process of said nanoparticles, such as the stirring speed, etc.
- the nanoparticles of the invention comprise a biocompatible polymer.
- a biocompatible polymer Virtually any biocompatible polymer known in the state of the art that allows obtaining nanoparticles can be used for the implementation of the present invention.
- said biocompatible polymers include polyhydroxy acids, such as polylactic acid, polyglycolic acid, etc., and copolymers thereof, eg, poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA], etc .; polyanhydrides; polyesters; polysaccharides, eg, chitosan, etc.
- the molecular weight of said biocompatible polymer can vary within a wide range as long as it satisfies the established conditions of forming nanoparticles and being biocompatible
- the biocompatible polymer used is the copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride in anhydride form (PVM / MA).
- PVM / MA copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride in anhydride form
- the PVM / MA copolymer sold under the trade name Gantrez® AN can be used.
- said PVM / MA copolymer has a molecular weight between 100 and 2,400 kDa, preferably between 200 and 2,000 kDa, more preferably between 180 and 250 kDa.
- This biodegradable polymer (PVM / MA) can react with different hydrophilic substances, due to the presence of its anhydrous groups, without having to resort to the usual organic reagents (glutaraldehyde, carbodiimide derivatives, etc.) that possess an important toxicity.
- the PVM / MA copolymer In an aqueous medium, the PVM / MA copolymer is insoluble, but its anhydride groups are hydrolyzed giving rise to carboxylic groups. The dissolution is slow and depends on the conditions in which it occurs.
- the nanoparticles of the invention comprise, in addition to the biocompatible polymer, a polyethylene glycol or a derivative thereof.
- polyethylene glycol includes any water-soluble hydrophilic polymer containing ether groups linked by optionally branched 2 or 3 carbon alkyl groups.
- this definition includes polyethylene glycols, polypropylene glycols, branched or not, and also copolymers (eg, block or random) that include the two types of units.
- the term also includes derivatives on the terminal hydroxyl groups, which may be modified (one or both of the ends) to introduce alkoxy, acrylate, methacrylate, alkyl, amino, phosphate, isothiocyanate, sulfhydryl, mercapto, sulfate, etc. groups.
- Polyethylene glycol may have substituents on alkylene groups. Preferably these substituents, if present, are alkyl groups.
- Polyethylene glycols are water soluble polymers that have been approved for oral, parenteral and topical (FDA) drug administration.
- Polyethylene glycols are manufactured by polymerization of ethylene oxide (EO) or propylene (OP) in the presence of water, monoethylene glycol or diethylene glycol as initiators of the reaction, in alkaline medium
- EO ethylene oxide
- OP propylene
- alkaline medium 1,2-Epoxide Polymers: Ethylene Oxyde Polymers and Copolymers " in Encyclopedia of Polymer Science and Engineering; Mark, HF (Ed.), Jonh Wiley and Sons Inc., 1986, pp.
- (n) is the number of units or monomers of EO; alternatively the units contain propylene groups.
- polyethylene glycols products with average molecular weights (or molecular mass) between 200 and 35,000 are known as polyethylene glycols (PEGs).
- PEGs polyethylene glycols
- the term PEG is usually used in combination with a numerical value. Within the pharmaceutical industry, the number indicates the average molecular weight, while in the cosmetic industry the number that accompanies the letters PEG refers to the polymerized units that form the molecule (Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowev R. C, Sheskey PJ Weller PJ.
- PEGs are included in the different pharmacopoeias, although the nomenclature differs (International Harmonization: Polyethylene glycol (PEG): Pharmeuropa 1999, 11, 612-614). According to the Handbook of Pharmaceutical Excipients (Fourth Edition), 2003 Edited by RCRowe, PJSheskey and PJWeller Published by the Pharmaceutical Press (London, UK) and the American Pharmaceutical Association (Washington, USA). Polyoxyethylene glycols are also called polyethylene glycols, macrogoles, macrogola or PEG.
- the British Pharmacopeia (British Pharmacopeia) uses the term “polyethylene glycols” and "macrogols”; the European Pharmacopoeia (Ph Eur) uses “polyethylene glycols” and “Macrogola”, while the North American Pharmacopoeia (USP) uses “polyethylene glycol (s)”.
- PEGs with molecular weight less than 400 are nonvolatile liquids at room temperature.
- PEG 600 shows a melting point comprised between 17 and 22 0 C
- PEGs with mean molecular weights comprised between 800 and 2000 are pasty materials with low melting points.
- Above a molecular weight greater than 3000 PEGs are solid and, commercially, up to PEG 35000 can be found.
- the melting point of PEGs increases with increasing molecular weight, the boiling point increases to a maximum value of 6O 0 C.
- the molecular weight increases, its aqueous solubility decreases.
- an amount close to 50% m / m can be dissolved in water.
- PEGs are considered low toxic and low immunogenic (Hermansky SJ et al., Food Chem. Toxic, 1995, 33, 139-140; Final Report on the Safety Assessment of PEGs: JACT, 1993, 12, 429-457; Polyethylene glycol, 21 CFR 172.820, FDA).
- the permissible daily intake, defined by WHO, is 10 mg / kg weight (Polyethylene glycols; Twenty-third report of the Joint FAO / WHO Expert Committee on Food Additives; World Health Organization, Geneva; Technical Report Series 1980, 648, 17-18).
- PEG derivatives have similar advantages to traditional PEGs, for example, their aqueous solubility, physiological inactivity, low toxicity and stability under very diverse conditions. These derivatives include very varied products and are characterized by the functional group that substitutes hydroxyl, eg, optionally substituted amino groups, phenols, aldehydes, isothiocyanates, mercapto, etc.
- polyethylene glycol derivatives that can be used in the invention include: polyoxyethylene esters, such as PEG monomethyl ether monosuccinimidyl succinate ester; PEG monomethyl ether monocarboxymethyl ester; PEG adipate; PEG distearate; PEG monostearate; PEG hydroxystearate; PEG dilaurate; PEG dioleate, PEG monooleate, PEG monoricinooleate; PEG of coconut oil esters; etc.; polyoxyethylene alkyl ethers, such as PEG monomethyl ether or methoxy PEG (mPEG); PEG dimethyl ether; etc.; others, such as poly (ethylene glycol terephthalate); polyoxyethylene derivatives and esters of sorbitan and fatty acids; copolymers of ethylene oxide and propylene oxide; copolymers of ethylene oxide with acrylamide; etc.; and PEG derivatives such as 0.0-bis- (2-aminoethyl) polyethylene
- the PEG is not branched and the hydroxyl groups are not substituted.
- the PEG to be used preferably has a molecular weight between 400 and 35,000 Da. Tests carried out by the inventors have shown that when PEG with a molecular weight of approximately 2,000 Da is used, the pegylated nanoparticles are produced with greater capacity to favor the absorption of the biologically active molecule (eg, paclitaxel).
- the PEG used in the manufacture of the nanoparticles of the invention has a molecular weight equal to or greater than 400, preferably equal to or greater than 1,000 (PEG 1000), more preferably comprised between 1,500 and 10,000 Da, even more preferably, equal to or greater than 2,000 Da (PEG 2000), with PEG having a molecular weight between 2,000 Da (PEG 2000) and 6,000 Da (PEG 6000) being especially preferred since they provide good results.
- the weight ratio PEG (or derivative thereof): biocompatible polymer can vary within a wide range; however, in a particular embodiment, the weight ratio PEG: biocompatible polymer is 1: 2-20, preferably 1: 2-10, more preferably about 1: 8. Thus, in a specific embodiment of the invention PEG 2000, PEG 6000 or PEG 10000 is used, in a weight ratio with respect to the 1: 8 polymer (PVM / MA).
- the PEG used in the production of the nanoparticles of the invention has a blocked terminal hydroxyl group, for example, by a methyl ether derivative, which reduces its hydrophilicity and can even change the structure of the nanoparticle.
- a greater percentage of the PEG chains would be included inside and only a small part of them would be located on the surface of the nanoparticles.
- This feature allows modulating the characteristics of the nanoparticles by blocking the hydroxyl groups or by introducing other functional groups. In this sense, mPEG would contribute to modify the release of the drug by modifying the porosity of the polymer matrix.
- the PEG has terminal functional groups other than hydroxyl, such as amino groups. These amino groups in turn can be substituted and have functional groups. In a preferred embodiment, the amino groups are -NH 2 . Oral administration of pegylated nanoparticles with a PEG containing said amino groups causes them to accumulate on certain segments of the intestinal tract, allowing specific administration.
- PEG polyethylene glycol 2000, 6000 or 10000
- PEG 2000, PEG 6000 or PEG 10000 polyethylene glycol 2000 methyl ether (mPEG 2000); 0,0-bis- (2-aminoethyl) polyethylene glycol 2000 (DAE-PEG 2000); and 0,0 -bis- (2- aminopropyl) polypropylene glycol - polyethylene glycol - polypropylene glycol (DAP-PEG 2000).
- the selection of the PEG allows modulating at will the characteristics of the system that is generated.
- the use of mixtures of polyethylene glycols of different types adds another variability factor. From a practical point of view this is important for adapt and select the most appropriate system for each active molecule and for each mode of administration.
- the nanoparticle of the invention comprises, in addition to the biocompatible polymer and a polyethylene glycol or derivative thereof, a biologically active molecule selected from the group consisting of actinomycin D, albendazole, aldosterone, alprazolam, amiodarone, amitriptyline, amprenavir, assadolin, atorvastatin , bunitrolol, buspirone, camptothecin, carbamazepine, carvedilol, celiprolol, cyclosporine A, cimetidine, clotrimazole, colchicine, cortisone, daunorubicin, debrisoquine, dexamethasone, diazepam, digitoxin, digoxin, diltiaximine, doceta, imicromine, doceta, trichromine, doceta, epicinetin, dicta, epicinetin, dicta, trichrometone, docetaine
- biologically active molecule refers to any substance (eg, a drug or active ingredient of a medicament) that is administered to a subject, preferably a human being, for prophylactic or therapeutic purposes; that is, any substance that can be used in the treatment, cure, prevention or diagnosis of a disease or to improve the physical and mental well-being of humans and animals.
- derivative applied to a biologically active molecule, as used herein, includes prodrugs and analogs of said biologically active molecule.
- the nanoparticles of the invention may incorporate one or more of said biologically active molecules regardless of their solubility characteristics, although, said nanoparticles may be particularly useful for oral administration of biologically active molecules of hydrophobic nature or of compounds that they are a substrate of the P-glycoprotein or the enzymatic complex associated with the cytochrome P450.
- the biologically active molecule present in the nanoparticles of the invention is paclitaxel.
- the nanoparticles of the invention allow modifying the distribution of the biologically active molecule they contain when administered by a route that gives access to some mucosa of the organism (e.g., oral, etc.).
- the weight ratio (biologically active molecule) / (biocompatible substance) in the nanoparticles of the invention may vary within a wide range; however, in a particular embodiment, said weight ratio (biologically active molecule) / (biocompatible polymer) is comprised between 1/1 and 1/20 w / w (weight / weight).
- the incorporation of the biologically active molecule into the pegylated nanoparticles can be carried out by a method such as that described in ES 2246694, which comprises incorporating the biologically active molecule into a solution comprising the biocompatible polymer and polyethylene glycol, in an appropriate solvent. (eg, acetone), before the formation of the nanoparticles.
- a solvent eg, acetone
- the invention relates to a process for the production of the nanoparticles of the invention, hereinafter method of the invention, which comprises simultaneously incubating a biocompatible polymer, a polyethylene glycol or a derivative thereof, and a molecule biologically active selected from the group consisting of actinomycin D, albendazole, aldosterone, alprazolam, amiodarone, amitriptyline, amprenavir, asadolin, atorvastatin, bunitrolol, buspirone, camptothecin, carbamazepine, carvedilol, celiprolol, cyclosporine A, cimetidine, cimetidine, cimetidine, cimetidine, cortimicol , debrisoquine, dexamethasone, diazepam, digitoxin, digoxin, diltiazem, docetaxel, domperidone, doxorubi
- the process of the invention for producing pegylated nanoparticles containing a biologically active molecule consists in a modification of a general procedure described above and based on the controlled desolvation of the polymer after the joint incubation of the copolymer and polyethylene glycol [Arbos et al, J Control Relay 83 (2002) 321-330; ES 2246694; WO05 / 104648] which includes, as a fundamental difference with the procedures developed above, the addition of a compound that enables the solubilization of the biologically active molecule (if necessary).
- the nanoparticles of the invention can be obtained by a method comprising incorporating a solution of the biologically active molecule in a suitable solvent (eg, acetone), into a solution comprising the biocompatible polymer and PEG in a suitable solvent (generally, the same as that of the biologically active molecule solution) before the formation of the nanoparticles.
- a suitable solvent eg, acetone
- a solvent eg, ethanol
- a solution (usually aqueous) of a compound that enables solubilization of the biologically active molecule to said suspension of pegylated nanoparticles containing the biologically active molecule is added and allowed to homogenize.
- the biologically active molecule is paclitaxel and the compound that allows solubilization of said drug is glycine, which is added in an aqueous solution of glycine and sodium edetate and glycine.
- the organic phase / hydroalcoholic solution ratio can vary over a wide range, typically, said ratio is between 1/1 and 1/10 v / v (volume / volume). Then, if desired, the organic solvents are removed by conventional methods.
- the resulting suspension if desired, is subjected to purification by conventional methods (eg, by ultracentrifugation, etc.).
- the supernatants were removed and the residue, if desired, resuspended or frozen at -8O 0 C for subsequent lyophilization and long-term preservation by conventional methods.
- the concentration of the biocompatible polymer, as well as that of the PEG or derivative thereof and of the biologically active molecule may vary within a wide range; however, in a particular embodiment, the concentration of the biocompatible polymer is between 0.001 and 10% w / v, the concentration of the polyethylene glycol or derivative thereof between 0.001 and 5% w / v, and the concentration of said biologically active molecule between 0.001 and 5% w / v.
- said biocompatible polymer is PVM / MA;
- PEG is a PEG selected from PEG 2000, PEG 6000 and PEG 10000;
- the biologically active molecule is paclitaxel;
- acetone is the solvent of the solution comprising the biocompatible polymer and PEG as well as the solvent of the solution of said biologically active molecule (paclitaxel).
- the process of the invention further comprises the removal of organic solvents and / or the purification of pegylated nanoparticles.
- the invention provides pegylated nanoparticles containing paclitaxel.
- Said nanoparticles can be obtained by a method comprising: a) suspending, on the one hand, polyethylene glycol and biocompatible polymer (eg, PVM / MA) in acetone and keeping the resulting mixture under stirring; b) adding an acetonic solution of paclitaxel to said suspension containing the polymer (eg, PVM / MA) and polyethylene glycol, and incubating the resulting mixture under stirring; c) desolvate the polymer by adding ethanol and water incorporating, in addition, an aqueous solution of glycine and disodium edetate and allow to homogenize for an appropriate period of time (eg, 10 minutes); and d) evaporate the organic solvents (eg, under reduced pressure) and adjust the final volume with a glycine solution; and e) if desired, purify the resulting suspension by an appropriate conventional method and the residue, if desired, is
- the concentration of the bio compatible polymer, as well as that of the PEG or derivative thereof and of the paclitaxel can vary within a wide range; however, in a particular embodiment, the concentration of the biocompatible polymer is between 0.001 and 10% w / v, the concentration of the polyethylene glycol or derivative thereof between 0.001 and 5% w / v, and the concentration of paclitaxel between 0.001 and 5 % p / v.
- said biocompatible polymer is PVM / MA; and the PEG is a PEG selected from PEG 2000, PEG 6000 and PEG 10000, preferably, PEG 2000.
- the weight ratio paclitaxel: biocompatible polymer is 1: 2-20, although close ratios at a weight ratio of 1: 10 give good results.
- 10 mg of paclitaxel added to an acetone dispersion containing 100 mg of polymer and 12.5 mg of PEG 2000 gives an efficient association.
- the amount of drug associated with the nanoparticles is approximately 150 micrograms of paclitaxel per mg nanoparticle. These nanoparticles are characterized by having a size close to 180 nm.
- the area under the plasma curve (AUC) of paclitaxel obtained by this formulation is approximately 0.7 times that obtained by intravenous administration of the commercial drug administered at the same dose.
- This formulation is characterized by offering an average residence time of the drug in the organism (MRT) of approximately 15 times greater than that obtained after the administration of the commercial formulation intravenously.
- the area under the plasma curve (AUC) of paclitaxel obtained by this formulation is approximately 0.4 times greater than that obtained by intravenous administration of the commercial drug administered at the same dose.
- This formulation is characterized by offering an average residence time of the drug in the organism (MRT) of approximately 15 times greater than that obtained after the administration of the commercial formulation intravenously.
- the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising at least one nanoparticle of the invention, and a pharmaceutically acceptable excipient, vehicle or adjuvant.
- the biologically active molecule present in the nanoparticle of the invention will be inside the nanoparticle of the invention; however, it could happen that part of said biologically active molecule was also attached to the surface of the nanoparticle although most of it will be inside (e.g., encapsulated) of the nanoparticles of the invention.
- the nanoparticles of the invention can be used to modify the distribution of the associated biologically active molecule when administered by a route that gives access to some mucosa of the organism, preferably, orally.
- compositions include any liquid composition (suspension or dispersion of the nanoparticles) for oral, oral, sublingual, etc .; or any solid composition (e.g., capsules, etc.) for oral administration. Therefore, in a particular embodiment, the pharmaceutical composition provided by this invention is administered orally.
- the pharmaceutical compositions described will comprise the excipients suitable for each formulation.
- Solid oral formulations are prepared in a conventional manner by methods known to those skilled in the art.
- the Excipients will be chosen based on the dosage form of administration selected. A review of the different pharmaceutical forms of drug administration and their preparation can be found in the book "Galenica Pharmacy Treaty", by C. Faul ⁇ i Trillo, 10 Edition, 1993, Luzán 5, SA de Ediduc.
- the proportion of the biologically active molecule incorporated in the nanoparticle of the invention can vary within a wide range, for example, it can be up to 25% by weight with respect to the total weight of the nanoparticles. However, the appropriate proportion will depend in each case on the biologically active molecules incorporated.
- the dose to be administered of nanoparticles of the invention can vary within a wide range, for example, between about 0.01 and about 10 mg per kg of body weight, preferably, between 0.1 and 2 mg per kg of body weight.
- the invention provides a pharmaceutical composition comprising pegylated nanoparticles of the invention comprising a biocompatible polymer, a polyethylene glycol or a derivative thereof, and paclitaxel or a derivative thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
- said biocompatible polymer is a copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride (PVM / MA).
- said pharmaceutical composition is formulated in the form of a pharmaceutical form of administration suitable for oral administration or via a mucosal access route, preferably, for oral administration.
- said pharmaceutical composition is in lyophilized form together with a cryoprotective agent.
- the invention provides a pharmaceutical composition comprising:
- the invention provides a pharmaceutical composition comprising: Component% by weight with respect to total
- Paclitaxel 0.01-20.00 The invention is described below by examples that are not limiting of the invention, but illustrative.
- the following examples describe the production and characterization of nanoparticles based on a biodegradable polymer (PVM / MA) that incorporate different types of polyethylene glycols and a biologically active molecule (paclitaxel).
- PVM / MA biodegradable polymer
- Said examples show the ability of said pegylated nanoparticles to promote oral absorption of said biologically active molecule (paclitaxel).
- paclitaxel when paclitaxel is used as a biologically active molecule, its incorporation into said pegylated nanoparticles allows maintaining constant and sustained plasma levels of said drug for at least 48 hours.
- paclitaxel included in pegylated PVM / MA nanoparticles has proven effective in reducing tumor growth in mice inoculated with Lewis lung carcinoma cells.
- the general materials and methods used for the production and characterization of said nanoparticles are described, as well as for the pharmacokinetic study thereof in both rats and mice and for the pharmacodynamic study in a mur
- Paclitaxel USP 26 grade> 99.5%
- Glycine and acetone and ethanol organic solvents were supplied by VWR Prolabo (France).
- the rest of the materials used were HPLC grade, supplied by Merck (Germany), and the deionized water also used in the analysis was prepared by a water purification system (Wasserlab, Pamplona, Spain).
- the procedure followed for the production of the pegylated nanoparticles based on PVM / MA and PEG containing a biologically active molecule is a modification of a general procedure described above and based on the controlled desolvation of the polymer after the joint incubation of the copolymer (PVM / MA) and polyethylene glycol (PEG) [Arbos et al, J Control Relay 83 (2002) 321-330; ES 2246694; WO05 / 104648] which includes, as a fundamental difference with the procedures previously developed, the addition of glycine to allow the solubilization of paclitaxel.
- paclitaxel were obtained by incorporating an acetonic solution of paclitaxel to the solution of PVM / MA and PEG in acetone before the formation of the nanoparticles. Briefly, on the one hand, 12.5 mg of PEG (2000, 6000 or 10,000) were dispersed in 3 ml of acetone by ultrasonication (approximately 20 minutes) and on the other, 100 mg of the PVM / MA copolymer also in 2 ml of acetone. Then, one of said suspensions was incorporated over the other and the resulting mixture was kept under stirring.
- an acetonic solution of paclitaxel (5, 7.5 or 10 mg of paclitaxel in 0.5 ml of acetone) was added in the organic phase (acetone) containing the polymer (PVM / MA) and PEG and incubated together for a period of approximately 1 hour under stirring (mechanical or magnetic stirrer), and subsequently 10 ml of ethanol were added, obtaining a suspension of pegylated nanoparticles containing paclitaxel. Then 10 mi were added of an aqueous solution of glycine (50 mg) and disodium edetate (20 mg) to said suspension of pegylated nanoparticles containing paclitaxel and allowed to homogenize for 10 minutes.
- the process performance was calculated gravimetrically, using the weight of lyophilized samples without cryoprotective agent (Arbos et al., Int J Pharm 242 (2002) 129-136). This value was corroborated by high performance liquid chromatography (HPLC) with detection by evaporative scattered light detector (ELSD) [Zabaleta et al., J Pharm Biomed Anal 44 (2007) 1072-1078] following the method described below and allowing the quantification of the PEGs and the PVM / MA.
- HPLC high performance liquid chromatography
- ELSD evaporative scattered light detector
- the quantification of the PEGs was carried out by HPLC coupled to a detector type ELSD 2000 Alltech (United States).
- the chromatograph used for the analysis was the 1100 series LC model (Agilent, Germany), an Alltech nitrogen generator (Analytical Engineering, Barcelona, Spain) was used as a nitrogen gas source for the ELSD and the data was analyzed on a Hewlett computer -Packard through the Chem-Station G2171 program [Zabaleta et al, J Pharm Biomed Anal 44 (2007) 1072-1078].
- Chromatographic separation was carried out at 4O 0 C using a PL Aquagel-OH 30 column (Agilent 300 mm x 7.5 mm; 8 ⁇ m) and the composition of the mobile phase was a mixture of methane 1 / water gradient (Table 1 ) at flow 1 ml / min.
- Table 1 Mobile phase conditions in gradient (A: methanol, C: water).
- the detector conditions were optimized until maximum sensitivity was achieved according to the gradient used in the mobile phase (nebulizer temperature: HO 0 C; nitrogen flow: 3 1 / min).
- the supernatants obtained after the nanoparticle purification process were diluted to 10 ml with purified water.
- 1 ml aliquots of supernatant were taken and 20 ⁇ l of this was injected into the column.
- the chromatographic separation of the different polyethylene glycols (PEGs) and the PVM / MA was completed in less than 14 minutes.
- the retention time was 4.48 ⁇ 0.06 minutes for the PVM / MA, 7.71 ⁇ 0.01 minutes for the PEG 2000, 6.92 ⁇ 0.02 for the PEG 6000 and 6.55 ⁇ 0 , 01 minutes for PEG 10000.
- the limit of quantification was 0.075 mg / ml for PEGs and 0.25 mg / ml for PVM / MA. The accuracy did not exceed the 8% limit.
- the amount of paclitaxel encapsulated in the pegylated nanoparticles was determined by HPLC. The analysis was carried out on a model 1100 series LC chromatograph (Agilent, Germany) coupled to a diode-array ultraviolet (UV) detection system. The data was analyzed on a Hewlett-Packard computer using the Chem-Station G2171 program. For the separation of paclitaxel, a Phenomenex Gemini Cl 8 reverse phase column (150 mm x 3 mm; 5 ⁇ m) heated to 3O 0 C was used.
- 200 ⁇ l of aqueous nanoparticle suspension were taken, breaking them with 1 ml of dimethylsulfoxide. 10 ⁇ l aliquots were injected into the HPLC column for analysis.
- the animals were divided into 6 treatment groups (6 animals per group) and treated with single doses of 10 mg / kg (2.25 mg) of paclitaxel incorporated into any of the following formulations: (i) intravenous solution (iv) from Taxol ® (Bristol-Myers Squibb, Madrid,
- a blood volume of approximately 300 ⁇ l was extracted at different times, using ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) as an anticoagulant and recovering the animal's volume (rat) with an equivalent volume of physiological serum intraperitoneally (ip) .
- EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
- the blood was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes and the supernatant (plasma) froze at a temperature of -8O 0 C.
- Extraction of paclitaxel from plasma was performed by a liquid-liquid extraction procedure, using t-butyl methyl ether as the extraction solvent. For this, plasma aliquots (0.1 ml) were taken, adjusted to a volume of 1 ml with water and 0.2 ⁇ g of docetaxel was added as internal standard. Then, 4 ml of tert-butyl methyl ether was added and stirred for 1 minute. The samples were then centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes and the supernatant (organic phase) was collected and evaporated in an evaporator centrifuge (Savant, Barcelona, Spain).
- the resulting solution was transferred to an injection vial.
- paclitaxel The quantification of paclitaxel was performed by high performance liquid chromatography with ultraviolet-visible detection. As internal standard, docetaxel was used. The analysis was carried out on a model 1 100 series chromatograph LC (Agilent, Germany). The data was analyzed on a Hewlett-Packard computer using the Chem-Station G2171 program. For the separation of paclitaxel, a Gemini C18 reverse phase column (Phenomenex) 150 mm x 3 mm was used; 5 ⁇ m, heated to 3O 0 C.
- the pharmacokinetic analysis of the plasma concentration data over time obtained after the administration of paclitaxel was performed using the noncompartmental adjustment procedure of the WiNNonlin 1.5 pharmacokinetic adjustment program (Pharsight Corporation, Mountain View, USA).
- the calculated pharmacokinetic parameters were the following: maximum concentration (C max ), time in which C max is reached (t max ), the area under the plasma levels curve (AUCo-inf), the average residence time (MRT ), the biological half-life in the terminal elimination phase (ti / 2 Z ) and the oral bioavailability (F) of paclitaxel.
- the mean residence time (MRT) was calculated by the ratio between the value of the AUMC (area under the curve at the first moment of plasma concentration) and that of the AUC.
- Oral bioavailability (F) was calculated by the ratio between the value of the AUC of each formulation with respect to the AUC of the commercial formulation (Taxol ® ).
- Pegylated nanoparticles containing paclitaxel were obtained according to the procedure previously described in section B of the Materials and Methods. Since paclitaxel (PTX) alone is not able to be included in the PVM / MA nanoparticles (Gantrez ® AN 119) and is eliminated in the process of purification by filtration, in the form of crystals without solubilizing, it did it was necessary to add a component (glycine) to the formulation that, in addition to increasing its solubility, improved its encapsulation in the nanoparticles, as shown in Table 2.
- a component glycine
- PEGs polyethylene glycols
- FIG. 1 shows the evolution of the PTX content in the pegylated nanoparticles, as a function of the amount of PTX used and the type of PEG used.
- PTX-NP PVM / MA-based nanoparticles and paclitaxel
- PTX-NP-gli PVM / MA-based control nanoparticles and paclitaxel with glycine addition 1.2.2 Characterization of pegylated particles containing paclitaxel
- Table 3 summarizes the main physicochemical characteristics of the nanoparticles tested in the pharmacokinetic study.
- the control nanoparticles (PTX-NP-gli) had a size close to 180 nm with a negative surface charge of -45 mV.
- the pegylated nanoparticles containing the PTX encapsulated showed similar sizes between them and with respect to the control nanoparticles and a somewhat less negative surface charge (around -40 mV) than the non-pegylated nanoparticles.
- glycine to conventional non-pegylated nanoparticles (PTX-NP) did not modify their performance but did significantly increase the amount of encapsulated PTX.
- the presence of the PEG also had no effect on the manufacturing performance of the nanoparticles that varied between 50% and 60%.
- PTX-NP PVM / MA-based nanoparticles and paclitaxel
- PTX-NP-gli PVM / MA-based control nanoparticles and paclitaxel with glycine addition
- Paclitaxel is a drug that is characterized by presenting a dose-dependent pharmacokinetic profile. Therefore, it was previously necessary to determine the pharmacokinetic profile after intravenous (i.v.) or oral administration of the commercial formulation of paclitaxel at the dose selected for nanoparticle formulation.
- the pharmacokinetic study was divided into 2 phases.
- the second study consisted of administering different nanoparticle formulations orally to different groups of animals: PTX-NP, PTX-NP-gli, PTX-NP2, PTX-NP6, and PTX-NPlO.
- the dose of paclitaxel selected was 10 mg / kg.
- a blood volume of approximately 300 ⁇ l was extracted at different times (0, 10, 30, 60, 90, 180, 360, 480 minutes, 24 hours, 32 and 48 hours), using EDTA as anticoagulant and recovering the animal's volemia (rat) with an equivalent volume of physiological serum intraperitoneally (ip).
- the pharmacokinetic analysis of the data obtained after the administration of paclitaxel was performed using the non-compartmental adjustment procedure of the WiNNonlin 1.5 pharmacokinetic adjustment program (Pharsight Corporation, Mountain View, United States). The results obtained are shown in Figure 2.
- iv administration of the conventional formulation shows a peak of plasma drug concentration in the first sample, followed by a biphasic decrease over weather.
- AUCo-mf area under the plasma levels curve
- C max maximum concentration
- T max time in which C max is reached
- MRT average residence time
- Ty 22 biological half-life in the phase of terminal elimination. ND: not determined.
- the objective was to evaluate the pharmacokinetics and antitumor activity of pegylated nanoparticles loaded with paclitaxel in mice.
- tumors were induced in female C57BL / 6J mice by subcutaneous inoculation of Lewis lung carcinoma cells (3LL).
- Pegylated nanoparticles loaded with paclitaxel The pegylated nanoparticles loaded with paclitaxel used in this study were the pegylated nanoparticles loaded with paclitaxel produced as described in Example 1.
- mice Female C57BL / 6J mice (4-6 weeks old) (Har ⁇ an, Spain) were housed in normal conditions with free access to food and water. The animals were placed in metabolic cages and fasted overnight to avoid coprophagy but allowing free access to water.
- the pharmacokinetic study was performed by oral administration to mice of a single dose of 10 mg / kg of paclitaxel (approximately 0.18 mg).
- the following formulations were tested: (i) TaxoT; (ii) paclitaxel loaded in PVM / MA nanoparticles pegylated with PEG2000 (PTX-NP2); (iii) paclitaxel loaded in PVM / MA nanoparticles pegylated with PEG6000 (PTX-NP6); (iv) paclitaxel loaded in PVM / MA nanoparticles pegylated with PEG10000 (PTX-NPlO) and (v) paclitaxel loaded in conventional PVM / MA nanoparticles (PTX-NP-gli).
- Taxol ® was also administered intravenously to mice at the same dose (10 mg / kg).
- the amount of plasma paclitaxel was determined by HPLC as described in Example 1. Docetaxel (DTX) was used as the internal standard. The plasma paclitaxel concentration was calculated from the chromatographic zone of PTX / DTX with calibration curves. The stock solutions of PTX and DTX in ethanol were cooled and calibration curves were created over the range of 40-3.200 ng / ml (r 2 > 0.999). An aliquot (100 ⁇ l) of plasma sample was mixed with 25 ⁇ l of internal standard solution (docetaxel, 4 ⁇ g / ml in methanol, previously evaporated).
- the execution time was 14 minutes.
- the quantification limit was calculated as 80 ng / ml with a relative standard deviation of 5.2%. Precision values on the same day (intraday test) at low, medium and high concentrations of PTX were always within the acceptable limits (-1.81 and 3.49%) at all concentrations tested.
- the kinetic drug analysis of the concentration-time data was analyzed using a non-compartmental model using WinNonlin 5.2 software (Pharsight Corporation, Mountain View, USA).
- the pharmacokinetic parameters evaluated were: the peak of maximum concentration (C max ), the time at which the maximum concentration is reached (T max ), the half-life of the terminal phase (ti / 2 ), the area under the concentration curve -time from time 0 to ⁇ (AUCo- ⁇ ), the average time of residence (MRT) and the real oral bioavailability of PTX (F R ).
- the relative bioavailability (F r ) was calculated according to: AUC ora i
- the average residence time (MRT) was calculated as AUMC (area under the concentration-time curve in the first moment) divided by AUC.
- mice Female C57BL / 6J mice (4-6 weeks old) were obtained from Har ⁇ an (Spain). To produce tumors, Lewis lung cancer cells (3LL) (IxIO 5 cells in physiological saline) were injected subcutaneously into the right side of the mice when they weighed approximately 18-20 g. The therapeutic application was initiated when the tumor reached approximately a volume of 100 mm 3 in approximately 12 days (defined as day 1) after tumor inoculation.
- 3LL Lewis lung cancer cells
- mice were divided into 5 groups (ten animals per group) with different treatments: (i) PBS (negative control); (ii) Taxol ® iv (10 mg / kg dose); (iii) Oral Taxol ® (10 mg / kg dose); (iv) PTX-NP2 (10 mg / kg dose) and (v) PTX-
- NP2 dose of 25 mg / kg. Animals treated iv with Taxol ® received a dose of 10 mg / kg daily for 9 days. Similarly, animals in the negative control group also received an administration of PBS every day (9 days).
- animals treated orally with nanoparticle or Taxol ® formulations received a dose of paclitaxel every 3 days (on days 1, 4 and 7).
- VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
- Tumor growth Tumor volume was measured periodically as a sign of efficacy after treatment administration. Tumor growth was followed by measurements with caliper and its volume was calculated using the following formula:
- V [length x (width) 2 ] / 2
- VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
- FIG 3 shows the paclitaxel-time concentration profile in C57BL / 6J mice after intravenous administration of Taxol ® at a dose of 10 mg / kg of paclitaxel.
- the pharmacokinetic parameters are summarized in Table 5 and were obtained by non-compartmental analysis. The average AUC, which was 91,039 ng / h mi and the maximum concentration (C max ) of 64,676 ng / ml, was calculated. The MRT was 1.75 h while the tm observed for paclitaxel of 2.34 h.
- Figure 4 shows the plasma concentration-time profile after oral administration of a single dose of 10 mg / kg of paclitaxel or loaded in different nanoparticle formulations or as commercial Taxol ® .
- the highest C max value within the different pegylated nanoparticles was for PTX-NP2 followed by PTX-NP6 and PTX-NP10.
- the AUC of paclitaxel for pegylated nanoparticles was 5 to 13 times higher than that of conventional nanoparticles.
- the AUC values were 2.6 and 1.7 times higher than the AUC obtained for PTX-NPlO, respectively.
- the mean residence time (MRT) of the plasma drug and U / 2 was found to be significantly longer when PTX was administered in nanoparticle formulations orally than when administered as Taxol ® iv.
- paclitaxel MRT was higher than that obtained with PTX-NP2 and PTX-NPlO, as well as the terminal elimination half-life, which was 1.6 and 1.3 times higher than that of PTX-NP2 and PTX- NP10 respectively.
- F r the relative oral bioavailability of pegylated nanoparticles was found to be superior to that of the control nanoparticles.
- F R was found to be related to the molecular weight (Pm) of the PEG used. Therefore, by increasing the Pm of the PEG used for pegylation of nanoparticles, a decrease in F r of paclitaxel was observed. In fact, F r was found to be approximately 3 times higher for PTX-NP2 versus PTX-NP10, while F R for PTX-NP6 was approximately 2 times higher than that of PTX-NP10.
- PTX-NP2 PVM / MA and PEG2000 nanoparticles with paclitaxel
- PTX-NP6 PVM / MA and PEG6000 nanoparticles with paclitaxel
- PTX-NPlO nanoparticles and PEG10000 with paclitaxel
- PTX-NP PVM / MA nanoparticles control with paclitaxel.
- Figure 5 shows the change in tumor volume as a function of time after administration of 10 mg / kg of paclitaxel once the tumors reached a measurable size of approximately 100 mm 3 (day 1).
- the control group which received oral PBS and Taxol ® iv, was administered every day from day 1 to 9 (9 doses of 10 mg / kg), while oral Taxol® and PTX-NP2 were administered on days 1, 4 and 7 (3 doses of 10 mg / kg).
- Pegylated nanoparticles were also administered at 25 mg / kg (3 doses).
- mice treated with PBS exceeded 900 mm 3 on day 8 and their last measurement was approximately 1,740 mm 3 .
- the tumor volume of mice that received oral Taxol ® increased to 1,400 mm 3 .
- the tumor volume of mice after administration of 9 doses of paclitaxel iv was 770 ⁇ 123 mm, 2.25 times lower than the tumor volume for mice treated with PBS.
- mice For pegylated nanoparticles containing paclitaxel and administered at a dose of 10 mg / kg every 3 days for 9 days (3 doses), the tumor volume of mice remained low (below 300 mm 3 ) until the sixth day of the experiment (see Table 6). Then, the tumors of the mice began to grow rapidly and at the end of the experiment (day 9), the average volume of the tumors was slightly higher than those of mice treated intravenously with Taxol ® ( Figure 5).
- mice with a tumor volume less than 400 mm 3 were 62.5% for the group treated iv with Taxol ® , 50% for the group treated orally with Taxol ® and 100% for groups treated with pegylated nanoparticles.
- mice with a tumor volume less than 400 mm 3 on day 6 after administration Percentage of mice with a tumor volume less than 400 mm 3 on day 6 after administration
- VEGF plasma VEGF was determined in mice. This factor is directly related to tumor growth.
- Figure 4 shows the concentration of VEGF over time for the different formulations tested.
- the VEGF profile from day 1 to 9 in mice treated with oral Taxol ® was similar to the group treated with PBS.
- plasma VEGF levels increased rapidly over time.
- the amount of plasma VEGF was lower than that of the controls.
- mice treated intravenously with the commercial formulation of paclitaxel were approximately 2 times lower than those obtained in mice treated with oral Taxol or PBS.
- PTX-NP2 administered at a dose of 10 mg / kg presented levels of VEGF similar to those observed in mice treated intravenously with Taxol.
- the VEGF levels were 1.5 times lower than those of animals treated with the same formulation at 10 mg / kg.
- pegylated nanoparticles had plasma levels of paclitaxel for at least 72 h. This fact can be explained by a sustained release of the drug from the nanoparticles attached to the intestinal mucosa. As proof of this idea, it was calculated that paclitaxel MRT, when loaded in pegylated nanoparticles, was approximately 3O h, while for Taxol ® , administered iv, this parameter was only 1.75 h ( Table 5).
- VEGF is a critical factor for the expansion of the vasculature and, therefore, tumor growth.
- plasma VEGF levels should decrease due to the effect of paclitaxel.
- paclitaxel included in pegylated PVM / MA nanoparticles appears to be effective in reducing tumor growth in mice inoculated with Lewis lung carcinoma cells.
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Abstract
Se describen unas nanopartculas pegiladas, a base de un polmero biocompatible y un polietilenglicol, que contienen una molcula biolgicamente activa, e.g., paclitaxel, 5 tiles como sistemas para la administracin oral de dicha molculas biolgicamente activa.
Description
NANOPARTICULAS PEGILADAS QUE COMPRENDEN UNA MOLÉCULA BIOLÓGICAMENTE ACTIVA Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con unas nanopartículas pegiladas, a base de un polímero biocompatible y un polietilenglicol, que contienen una molécula biológicamente activa, útiles como sistemas para la administración oral de dicha moléculas biológicamente activa. La invención también se relaciona con un procedimiento para su producción, con composiciones que contienen dichas nanopartículas pegiladas y con sus aplicaciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En los últimos años, se ha producido un interés creciente en el desarrollo de sistemas particulares que mejoren las propiedades biofarmacéuticas de los fármacos cuando se administren por vía oral. Con este objetivo se ha propuesto el uso de transportadores poliméricos (nanopartículas). De hecho, las nanopartículas se definen como sistemas coloidales de partículas poliméricas sólidas de tamaño inferior al micrómetro (típicamente entre 10-1000 nm), constituidas por polímeros naturales o sintéticos. Dependiendo del método de preparación, se subdividen en nanoesferas matriciales y nanocápsulas vesiculares (Marcháis et al., Journal Drug Dev Ind Pharm 24 (1998) 883-888). Las nanoesferas son formas matriciales formadas por una red tridimensional polimérica en la que el fármaco está física y uniformemente disperso, mientras que las nanocápsulas son sistemas vesiculares formados por una cavidad interna que contiene el fármaco y que está rodeada por una membrana o pared polimérica. En ambos casos, debido a la elevada superficie específica de estos sistemas, las moléculas de la sustancia biológicamente activa pueden estar atrapadas o quedar adsorbidas en la superficie de las nanopartículas. Una de las características más importantes que ofrecen las nanopartículas radica en su capacidad para la liberación controlada del fármaco incorporado, que, unido a su pequeño tamaño, permiten el diseño de sistemas transportadores adecuados para ser administrados por distintas vías (oral, parenteral, ocular) y cuyas aplicaciones terapéuticas son consecuencia de su distribución en el organismo.
La vía oral es la vía más popular y atractiva para la administración de fármacos. El uso de esta vía se asocia con un aumento significativo de la aceptación de la medicación por parte del paciente y con menores costes sanitarios. Sin embargo, un importante número de fármacos presenta una eficacia muy baja cuando se administran mediante esta vía. Este fenómeno puede ser debido a uno o varios de los siguientes factores que condicionan la biodisponibilidad oral de un fármaco: (i) baja permeabilidad de la molécula activa para atravesar la mucosa (asociado generalmente a fármacos de naturaleza hidrófila), (ii) liberación incompleta del fármaco desde la forma de dosificación, (iii) metabolismo presistémico, (iv) baja solubilidad del principio activo en el ambiente gastrointestinal (asociado a fármacos de naturaleza hidrófoba), y (v) baja estabilidad en el ambiente gastrointestinal (presencia de valores de pH extremos, enzimas, etc.).
Los sistemas coloidales, tales como las nanop articulas, han sido propuestos para superar algunos de estos obstáculos, tratando de esconder el fármaco del ataque enzimático y aumentando así su biodisponibilidad oral. En principio, estos transportadores poseen una gran superficie específica lo que facilita su interacción con el soporte biológico (mucosa gastrointestinal) y permite incrementar la difusión de algunos fármacos a través de ella. Igualmente, el control de la liberación del fármaco permite prolongar en el tiempo el efecto de moléculas con semi-vidas biológicas bajas y, además, son capaces de proteger los fármacos frente a su eventual degradación. Por ello, la asociación de determinados fármacos a las nanop articulas ha permitido, en ocasiones, aumentar de forma significativa la biodisponibilidad oral de la molécula activa. Ejemplos ilustrativos de fármacos cuya biodisponibilidad oral aumenta mediante su encapsulación o asociación a nanopartículas incluyen calcitonina de salmón, furosemida, estradiol, avarol, dicumarol, nifedipina y fluoropirimidinas.
Dentro de la familia de los vinil éteres, los polímeros con mayor aplicación farmacéutica son los derivados del metil vinil éter (Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology (1981) 1053-1069). El principal copolímero de metil vinil éter se obtiene tras la polimerización con anhídrido maleico a partir de acetileno, obteniéndose el poli(metil vinil éter-co-anhídrido maleico) (PVM/MA), comercializado por ISP™ bajo la marca comercial Gantrez" AN. El copolímero PVM/MA está compuesto estructuralmente por dos grupos funcionales diferenciados que tienen características de
solubilidad diferentes: un grupo éster hidrófobo y un grupo anhídrido. El grupo carboxílico es un solubilizante, ya que tiende a disolver el polímero cuando se ioniza, y el grupo éster es hidrofóbico, ya que retrasa la penetración del agua en el polímero. Los copolímeros sintéticos PVM/MA tienen aplicaciones muy diversas. El Gantrez® AN se utiliza ampliamente como espesante y floculante, adhesivo dental, excipiente en comprimidos bucales, excipiente en parches transdérmicos, etc. Por otra parte se ha descrito el uso de estos copolímeros para la liberación controlada de fármacos (Heller, J Appl Polym Sci 22 (1978) 1991-2009), y, en formas matriciales, para la liberación tópica de fármacos en el ojo (Firme et al., J Pharm Sci 80 (1991) 670-673; Finne et al., Int J Pharm 65 (1990) 19-27).
En los últimos años, el grupo de investigación al que pertenecen los inventores ha desarrollado y presentado una serie de patentes relacionadas con nanopartículas a base de estos copolímeros (ES 200601399; Arbos et al, J Control Reléase 96 (2004) 55-65; ES 2178961 (2001)). Estas nanopartículas han demostrado una gran versatilidad para poder encapsular proteínas y fármacos de síntesis química. Por otra parte, presentan propiedades bioadhesivas que las hacen atractivas para su utilización en la administración oral de fármacos. Por último, presentan la ventaja de poder modificar su superficie de forma fácil, homogénea y repetitiva lo que les hace ideales para poder modular su distribución en el organismo. En este contexto, la asociación de las nanopartículas con polímeros convenientes puede modificar sus características fisicoquímicas e, indirectamente, su distribución e interacción con el medio biológico. Una posible estrategia es la unión de una o más cadenas de polietilenglicol (PEG) a las nanopartículas, proceso conocido como pegilación u obtención de nanopartículas furtivas. Los polietilenglicoles (PEG) o también llamados "macrogoles", son un grupo de polímeros formados por polimerización del óxido de etileno (EO) con agua bajo catálisis alcalina que después será neutralizada. Están compuestos por dos grupos hidroxilo primarios terminales y una cadena central carbonada, responsable de la variación de peso molecular entre un polietilenglicol y otro, y que condiciona además su consistencia líquida o sólida. Los PEG presentan una elevada solubilidad acuosa y una baja toxicidad. Entre sus derivados destacan los mono-, di- y poliésteres, pero también pueden reaccionar con otros productos para dar lugar a éteres, aminas y acétales, entre
otros. Se trata de uno de los polímeros más populares para la modificación de la superficie de transportadores de moléculas activas. De hecho, se ha comprobado que los PEG reducen las interacciones de las nanopartículas con las células del sistema fagocítico macrofágico (MPS), prolongando así la circulación de las nanopartículas en el torrente sanguíneo tras la administración parenteral de las mismas. Con respecto a su uso por vía oral, la asociación de polietilenglicoles a las nanopartículas convencionales permite protegerlas contra el ataque enzimático en los líquidos digestivos. Esto es debido a su potencial para rechazar las proteínas, minimizando así su interacción con la mucina y otras proteínas presentes en el lumen, lo que puede llevar a incrementos de la biodisponibilidad de ese fármaco y/o reducción de efectos adversos. Además, se ha demostrado que los polietilenglicoles son capaces de reducir la actividad de la glicoproteína-P y de complejos enzimáticos asociados al citocromo P450, interfiriendo en la estructura de la membrana apical y, como consecuencia, directa o indirectamente, afectando a la función de dichos transportadores. Para ello, se ha estudiado la permeabilidad intestinal, in vitro, requisito indispensable para la biodisponibilidad oral (Johnson et al, AAPS PharmSci 4 (2002) E40) (Collnot et al, Mol Pharm 4 (2007) 465-474).
Numerosos fármacos, entre los que se incluyen diversos agentes antitumorales, se administran por vía parenteral, lo que plantea diversos problemas. Entre las principales ventajas que supondría la administración de agentes antitumorales por vía oral, merece la pena destacar el aumento de la calidad de vida de los pacientes así como la reducción de los costes sanitarios. Esta vía de administración permitiría una exposición continua de las células cancerosas al fármaco antitumoral a un nivel de concentración apropiado y sostenido lo que puede mejorar el índice terapéutico y reducir los efectos secundarios. Sin embargo, la gran mayoría de estos fármacos (e.g., paclitaxel) presentan una baja biodisponibilidad al ser administrados por vía oral.
El paclitaxel (Taxol®, Bristol Myers Squibb Company), un producto extraído del árbol Taxus brevifolia, fue descrito por primera vez en 1.971 y desde 1.993 es el agente quimioterápico contra el cáncer más empleado en todo el mundo. El paclitaxel actúa a nivel celular promoviendo la polimerización de la tubulina. De este modo, los microtúbulos formados en presencia de paclitaxel son extraordinariamente estables y no funcionales, causando así la muerte celular por la incapacidad dinámica y funcional de
los microtúbulos para la división celular. En Europa, este fármaco está indicado tanto como agente individual como en combinación con otros tratamientos oncológicos para el tratamiento de cáncer de ovario, de mama y de células pulmonares no pequeñas, tanto avanzado como metastático. El principal inconveniente de este fármaco radica en su escasa biodisponibilidad oral debido a su baja solubilidad acuosa y al efecto de metabolismo de primer paso principalmente. Tras la administración oral, el paclitaxel es sustrato de la glicoproteína- P, así como de otros miembros de la superfamilia ABC (ATP-binding cassette), tales como BCRP y MRP2. La superfamilia ABC transportadora de proteínas juega un papel central en la defensa del organismo frente a compuestos tóxicos y frente a algunos agentes anticancerosos. Dichas proteínas (glicoproteína-P, MRP2 y BCRP) están localizadas en la zona apical de las membranas intestinal, hepática y renal, mediando el bombeo de xenobióticos y toxinas a la luz intestinal, biliar y orina. Además, tanto la glicoproteína-P como MRP2 se localizan conjuntamente junto con CYP3A4, glutation- S-transferasas y UDP-glucuronosiltransferasas lo que supone una actuación sinérgica en la regulación de la biodisponibilidad oral de los fármacos administrados.
Por todo ello, actualmente, el paclitaxel está formulado para su uso en clínica y por vía intravenosa en un vehículo compuesto por Cremophor EL:etanol (1 :1). Con el fin de prevenir y minimizar los efectos tóxicos del Cremophor EL por vía intravenosa y mejorar el índice terapéutico del fármaco, recientemente, se ha comercializado una nueva formulación basada en la encapsulación del fármaco en nanopartículas de albúmina denominada Abraxane® (Green et al. Annals of Oncology 17: 1263-1268, 2006).
Adicionalmente, se están empleando diversas estrategias para desarrollar formulaciones de paclitaxel, principalmente para su administración por vía oral, la más aceptada por los pacientes y con menores costes y mayores beneficios. Estas estrategias incluyen el uso de pro fármacos (Hennenfent et al, Ann Oncol 17 (2006) 735-749; Sabbatini et al, J Clin Oncol 22 (2004) 4523-4531), análogos (Cassinelli et al, Clin Cáncer Res 8 (2002) 2647-2654; Broker et al, Clin Cáncer Res 13 (2007) 3906-3912), emulsiones y liposomas (Hennenfent et al, Ann Oncol 17 (2006) 735-749), para evitar los efectos adversos derivados de su vehiculización así como para solventar su resistencia atribuida a la glicoproteína-P y otros transportadores, mejorando así su
biodisponibilidad oral. Además, la adminisistración simultánea de inhibidores de la glicoproteína-P, tales como verapamilo o ciclosporina A, mejora la biodisponibilidad del fármaco, aumentando su absorción oral y disminuyendo su eliminación (van Asperen et al, Clin Cáncer Res 4 (1998) 2293-2297). Por tanto, existe la necesidad de desarrollar sistemas de administración de fármacos capaces de aumentar la biodisponibilidad de numerosos principios activos (fármacos) cuando se administran por vía oral, por ejemplo, fármacos de naturaleza lipófila o que sean sustrato de la glicoproteína-P (e.g., paclitaxel). Ventajosamente, dichos sistemas de administración deberían tener la capacidad de incorporar cantidades variables de fármacos lipófilos, e, idealmente, deberían ser capaces de evitar el efecto de la glicoproteína-P sobre el fármaco transportado. Estos objetivos pueden ser conseguidos mediante las nanopartículas proporcionadas por la presente invención.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que la modificación y recubrimiento de las nanopartículas de un polímero biocompatible, tal como el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA), con un polietilenglicol permite obtener nanopartículas pegiladas capaces de encapsular cantidades importantes de moléculas biológicamente activas (e.g., paclitaxel). Dichas nanopartículas pegiladas cargadas con una molécula biológicamente activa (e.g., fármaco o principio activo) proporcionadas por esta invención permiten la absorción de dicha molécula biológicamente activa (e.g., paclitaxel) a través de la mucosa oral y la obtención de niveles plasmáticos importantes y sostenidos de dicha molécula biológicamente activa durante, al menos, 48 horas. Por otra parte, dichas nanopartículas pegiladas pueden ser aplicadas para la administración oral (o a través de otras mucosas) de numerosos fármacos incluyendo aquellos que sean sustratos de la glicoproteína-P y/o de los complejos enzimáticos asociados al citocromo P-450 (e.g., paclitaxel), así como para la administración de fármacos con elevada toxicidad (e.g., citostáticos) al ofrecer niveles plasmáticos sostenidos y constantes de la molécula biológicamente activa durante periodos de tiempo muy elevado (e.g., al menos, 48 horas, en el caso del paclitaxel), lo que posibilita tratamientos alternativos a la perfusión hospitalaria, permitiendo un abaratamiento del coste sanitario de los tratamientos con este tipo de fármacos y una
mejora en la calidad de vida del paciente.
Por tanto, la invención proporciona unas nanopartículas que solucionan los problemas mencionados anteriormente, es decir, unas nanopartículas con capacidad para asociar elevadas cantidades de moléculas biológicamente activas (e.g., paclitaxel) para su administración efectiva a través de la vía oral. Por ello, estas nanopartículas poseen unas características bioadhesivas adecuadas que favorecen la interacción de la forma farmacéutica que contiene el fármaco o molécula biológicamente activa con la superficie de la mucosa. Además, dichas nanopartículas permiten liberar el fármaco proporcionando niveles plasmáticos sostenidos y constantes del mismo cuando son administradas por vía oral o a través de cualquier otra mucosa del organismo. Asimismo, dichas nanopartículas minimizan el efecto de la glicoproteína-P y/o del complejo enzimático asociado al citocromo P450, en el caso de que el fármaco sea sustrato de dicha glicoproteína-P y/o del complejo enzimático asociado al citocromo P450. Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con nanopartículas pegiladas que comprenden un polímero biocompatible, un polietilenglicol o un derivado del mismo, y una molécula biológicamente activa seleccionada del grupo formado por actinomicina D, albendazol, aldosterona, alprazolam, amiodarona, amitriptilina, amprenavir, asimadolina, atorvastatina, bunitrolol, buspirona, camptotecina, carbamazepina, carvedilol, celiprolol, ciclosporina A, cimetidina, clotrimazol, colchicina, cortisona, daunorubicina, debrisoquina, dexametasona, diazepam, digitoxina, digoxina, diltiazem, docetaxel, domperidona, doxorubicina, efavirenz, epirubicina, eritromicina, ergotamina, estradiol, estradiol glucurónico, erlotinib, etopósido, fenitoína, fentanilo, felodipina, fenotiacinas, fexofenadina, fluoroquinolonas, fluorouracilo, FK-506, gentamicina, griseofulvina, hidrocortisona, imatinib, indinavir, itraconazol, ivermectina, ketoconazol, kaemferol, levofloxacina, lidocaína, loperamida, losarían, lovastatina, mebendazol, metilprednisolona, metotrexato, mibefradil, midazolam, misoldipina, morfina, nelfinavir, nicardina, nitrendipina, nifedipina, ondansetron, paclitaxel, pentazocina, praziquantel, prednisolona, prednisona, quercetina, quinidina, ranitidina, rapamicina, rifabutin, rifampicina, ritonavir, saquinavir, sirolimus, sulfametiazol, tacrolimus, tamoxifen, talinolol, tenipósido, terfenadina, tetracicilina, topotecan, triamcinolona, valspodar, verapamil, vinblastina,
vincristina, vindesina, zopiclona, sus derivados, y sus mezclas.
En una realización particular, el polímero biocompatible es un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA). En otra realización particular, el polietilenglicol (PEG) es PEG 2000, PEG 6000 o PEG 10000. En otra realización particular, la molécula biológicamente activa es paclitaxel. En este caso, la administración por vía oral de las nanop articulas pegiladas conteniendo paclitaxel permite obtener un aumento espectacular de la biodisponibilidad oral del paclitaxel, cuya absorción oral es prácticamente nula debido a sus características físico-químicas
(elevada lipofilia) y al hecho de ser sustrato de la glicoproteína-P localizada en el tracto gastrointestinal .
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende dichas nanopartículas pegiladas que contienen una molécula biológicamente activa.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de dichas nanopartículas pegiladas que contienen una molécula biológicamente activa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una gráfica que muestra la variación de la cantidad de paclitaxel (PTX) encapsulado en las diferentes formulaciones en función del tipo de polietilenglicol utilizado y de la cantidad de fármaco añadido inicialmente. Los resultados muestran los valores de la media ± desviación típica (n = 6). PTX-NP: nanopartículas de PVM/MA con paclitaxel; PTX-NP-gli: nanopartículas de PVM/MA y glicina con paclitaxel; PTX-NP2: nanopartículas de PVM/MA y PEG 2000 con paclitaxel; PTX-NP6: nanopartículas de PVM/MA y PEG 6000 con paclitaxel; PTX-
NPlO: nanopartículas de PVM/MA y PEG 10000 con paclitaxel.
La Figura 2 muestra las concentraciones plasmáticas de paclitaxel (PTX) en función del tiempo tras la administración en animales de laboratorio de las distintas formulaciones de PTX. Los resultados muestran los valores de la media ± desviación típica. En la Figura 2A se muestra la concentración plasmática de PTX en función del tiempo tras la administración por vía intravenosa (i.v.), de una dosis de 10 mg/kg de Taxol® (formulación comercial de paclitaxel). En la Figura 2B se muestra la
concentración plasmática de PTX en función del tiempo tras la administración por vía oral, de una dosis de 10 mg/kg de Taxol® (formulación comercial de paclitaxel). En la Figura 2C se muestra la concentración plasmática de PTX en función del tiempo tras la administración por vía oral, de una dosis de 10 mg/kg de las siguientes formulaciones: PTX-NP-gli: nanopartículas control de PVM/MA y paclitaxel (con adición de glicina);
PTX-NP2: nanopartículas de PVM/MA y PEG 2000 con paclitaxel;
PTX-NP6: nanopartículas de PVM/MA y PEG 6000 con paclitaxel; y
PTX-NP10: nanopartículas de PVM/MA y PEG 10000 con paclitaxel. La Figura 3 es una gráfica que muestra el perfil de concentración de paclitaxel en plasma-tiempo tras la administración intravenosa de una dosis de 10 mg/kg de Taxol®. Los datos se expresan como la media ± DE (n=6).
La Figura 4 es una gráfica que muestra los niveles plasmáticos de Paclitaxel tras la administración oral de una única dosis de 10 mg/kg de PTX cargado en nanopartículas de PVM/MA pegiladas. Los datos se expresan como la media ± DE (n=6).
La Figura 5 es una gráfica que muestra la actividad antitumoral in vivo de
Taxol® y nanopartículas pegiladas. Las flechas indican los tiempos de administración por vía i.v. (flechas blancas) u oral (flechas negras). Se administró Taxol® a una dosis de 10 mg/kg, mientras que las nanopartículas pegiladas se administraron a una dosis de
10 mg/kg o bien de 25 mg/kg.
La Figura 6 es una gráfica que muestra la concentración del Factor de
Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) frente al tiempo en ratones tratados con las diferentes formulaciones sometidas a prueba. Las flechas indican los tiempos de administración por vía i.v. (flechas blancas) u oral (flechas negras). PTX-NP2: formulación de nanopartículas pegiladas con PEG 2000 (10 mg/kg ó 25 mg/kg).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Nanopartículas En un aspecto, la invención se relaciona con unas nanopartículas pegiladas, en adelante nanopartículas de la invención, que comprenden un polímero biocompatible, un polietilenglicol o un derivado del mismo, y una molécula biológicamente activa
seleccionada del grupo formado por actinomicina D, albendazol, aldosterona, alprazolam, amiodarona, amitriptilina, amprenavir, asimadolina, atorvastatina, bunitrolol, buspirona, camptotecina, carbamazepina, carvedilol, celiprolol, ciclosporina A, cimetidina, clotrimazol, colchicina, cortisona, daunorubicina, debrisoquina, dexametasona, diazepam, digitoxina, digoxina, diltiazem, docetaxel, domperidona, doxorubicina, efavirenz, epirubicina, eritromicina, ergotamina, estradiol, estradiol glucurónico, erlotinib, etopósido, fenitoína, fentanilo, felodipina, fenotiacinas, fexofenadina, fluoroquinolonas, fluorouracilo, FK-506, gentamicina, griseofulvina, hidrocortisona, imatinib, indinavir, itraconazol, ivermectina, ketoconazol, kaemferol, levofloxacina, lidocaína, loperamida, losartan, lovastatina, mebendazol, metilprednisolona, metotrexato, mibefradil, midazolam, misoldipina, morfina, nelfinavir, nicardina, nitrendipina, nifedipina, ondansetron, paclitaxel, pentazocina, praziquantel, prednisolona, prednisona, quercetina, quinidina, ranitidina, rapamicina, rifabutin, rifampicina, ritonavir, saquinavir, sirolimus, sulfametiazol, tacrolimus, tamoxifen, talinolol, tenipósido, terfenadina, tetracicilina, topotecan, triamcinolona, valspodar, verapamil, vinblastina, vincristina, vindesina, zopiclona, sus derivados, y sus mezclas.
Las nanopartículas de la invención poseen unas características físico-químicas adecuadas, de especificidad y de bioadhesión a la mucosa gastrointestinal, lo que las convierte en sistemas potencialmente útiles para el transporte de moléculas biológicamente activas, incluyendo en particular, moléculas biológicamente activas de naturaleza lipófila, moléculas biológicamente activas que sean sustrato de la glicoproteína-P o del complejo enzimático asociado al citocromo P450. Las nanopartículas de la invención mejoran la bio disponibilidad oral de dichas moléculas biológicamente activas, en general, y, en particular, de moléculas biológicamente activas de naturaleza lipófila y/o de moléculas biológicamente activas que puedan ser sustrato de la glicoproteína-P. De hecho, las nanopartículas de la invención pueden prolongar el tiempo de residencia de la moléculas biológicamente activa en la mucosa tras su administración por vía oral. Asimismo, las nanopartículas de la invención pueden ser utilizadas como sistema de transporte de moléculas biológicamente activas con elevada toxicidad, por ejemplo, citostáticos, debido a que ofrecen niveles plasmáticos sostenidos y constantes de tales fármacos durante periodos de tiempo
elevados, lo que permite el diseño de tratamientos alternativos a la perfusión hospitalaria, redundando en un abaratamiento del coste sanitario de los tratamientos con este tipo de fármacos.
El término "nanopartícula", tal como aquí se utiliza, se refiere a esferas o formas similares con un tamaño medio inferior a 1,0 micrómetro (μm). En general, las nanopartículas de la invención presentan un tamaño medio de partícula comprendido entre 1 y 999 nanómetros (nm), preferentemente entre 10 y 900 nm. En una realización particular, las nanopartículas de la invención presentan un tamaño medio de partícula comprendido entre 100 y 400 nm. Por "tamaño medio" se entiende el diámetro promedio de la población de nanopartículas que se mueve conjuntamente en un medio acuoso. El tamaño medio de estos sistemas se puede medir por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia y que se describen, a modo ilustrativo, en la parte experimental que acompaña a los ejemplos descritos más adelante. El tamaño medio de las partículas puede verse influenciado principalmente por la cantidad y peso molecular del polímero biocompatible, por la naturaleza y cantidad del PEG, o derivado del mismo, y por la naturaleza y cantidad de la molécula biológicamente activa, presentes en las nanopartículas de la invención (en general, a mayor cantidad o peso molecular de dichos componentes, el tamaño medio de la nanopartícula se incrementará), y por algunos parámetros del procedimiento de producción de dichas nanopartículas, tales como la velocidad de agitación, etc.
Polímero biocompatible
Las nanopartículas de la invención comprenden un polímero biocompatible. Prácticamente cualquier polímero biocompatible conocido en el estado de la técnica que permita obtener nanopartículas puede ser utilizado para la puesta en práctica de la presente invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos polímeros biocompatibles incluyen polihidroxiácidos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., y copolímeros de éstos, e.g., poli(ácido láctico-co-glicólico) [PLGA], etc.; polianhídridos; poliésteres; polisacáridos, e.g., quitosano, etc. El peso molecular de dicho polímero biocompatible puede variar dentro de un amplio intervalo siempre y cuando satisfaga las condiciones establecidas de formar nanopartículas y ser
biocompatible.
En una realización particular, el polímero biocompatible utilizado es el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico en forma anhídrido (PVM/MA). En una realización concreta puede utilizarse, por ejemplo, el copolímero PVM/MA comercializado con la denominación comercial Gantrez® AN. En una realización particular, dicho copolímero PVM/MA tiene un peso molecular comprendido entre 100 y 2.400 kDa, preferentemente entre 200 y 2.000 kDa, más preferentemente entre 180 y 250 kDa. Este polímero biocompatible (PVM/MA) resulta particularmente ventajoso ya que se utiliza ampliamente en tecnología farmacéutica debido a su baja toxicidad (DL50 = 8-9 g/kg por vía oral) y excelente biocompatibilidad. Además, es fácil de obtener, tanto por la cantidad como por su precio. Este polímero biodegradable (PVM/MA) puede reaccionar con distintas sustancias hidrófilas, debido a la presencia de sus grupos anhídridos, sin tener que recurrir a los reactivos orgánicos usuales (glutaraldehído, derivados de carbodiimida, etc.) que poseen una toxicidad importante. En un medio acuoso, el copolímero PVM/MA es insoluble, pero sus grupos anhídrido se hidrolizan dando lugar a unos grupos carboxílicos. La disolución es lenta y depende de las condiciones en las que se produce. Debido a la disponibilidad de grupos funcionales en PVM/MA, la unión covalente de moléculas con grupos nucleofílicos, tales como hidróxido o amino, tiene lugar por simple incubación en un medio acuoso. La solicitud de patente internacional WO 02/069938, cuyo contenido se incorpora en esta descripción por referencia, describe nanopartículas (no pegiladas) de copolímero PVM/MA, mientras que la solicitud de patente internacional WO 05/104648 describe el desarrollo y aplicación de nanopartículas pegiladas.
Polietilenglicol y sus derivados
Las nanopartículas de la invención comprenden, además del polímero biocompatible, un polietlenglicol o un derivado del mismo.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "polietilenglicol" incluye cualquier polímero hidrofílico soluble en agua que contiene grupos éter unidos por grupos alquilénico de 2 ó 3 carbonos, opcionalmente ramificados. Así esta definición incluye polietilenglicoles, polipropilenglicoles, ramificados o no, y también copolímeros (e.g., bloque o al azar) que incluyen los dos tipos de unidades. El término
también incluye derivados sobre los grupos hidroxilo terminales, que pueden estar modificados (uno o los dos de los extremos) para introducir grupos alcoxi, acrilato, metacrilato, alquilo, amino, fosfato, isotiocianato, sulfhidrilo, mercapto, sulfato, etc. El polietilenglicol (incluyendo el polipropilenglicol) puede presentar sustituyentes sobre los grupos alquileno. De forma preferente estos sustituyentes, si están presentes, son grupos alquilo.
Los polietilenglicoles son polímeros solubles en agua que han sido aprobados para la administración de fármacos por vía oral, parenteral y tópica (FDA). Los polietilenglicoles se fabrican por polimerización del óxido de etileno (EO) o de propileno (OP) en presencia de agua, monoetilenglicol o dietilenglicol como iniciadores de la reacción, en medio alcalino (1,2-Epoxide Polymers: Ethylene Oxyde Polymers and Copolymers" in Encyclopedia of Polymer Science and Engineering; Mark, H. F. (Ed.), Jonh Wiley and Sons Inc., 1986, pp. 225-273). Cuando se alcanza el peso molecular deseado (controlado generalmente mediante medidas en proceso de la viscosidad) la reacción de polimerización se termina por neutralización del catalizador con un ácido (ácido láctico, ácido acético u otros). El resultado es un polímero lineal de estructura muy simple:
HO - (CH2-CH2-O)n - H
donde (n) es el número de unidades o monómeros de EO; alternativamente las unidades contienen grupos propileno.
Aunque técnicamente todos estos productos deberían llamarse poli(oxialquilenos), los productos con pesos moleculares (o masa molecular) medios entre 200 y 35.000 son conocidos como polietilenglicoles (PEGs). Este término de polietilenglicol es normalmente usado para indicar la influencia significativa de los grupos terminales hidroxilos en las propiedades físico-químicas de estas moléculas. El término PEG suele ser utilizado en combinación con un valor numérico. Dentro de la industria farmacéutica, el número indica el peso molecular medio, mientras que en la industria cosmética el número que acompaña a las letras PEG se refiere a las unidades de EO polimerizadas y que forman la molécula (Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowev R. C, Sheskey P. J., Weller PJ. (Eds.), 4th Edition, Pharmaceutical
Press and American Pharmaceutical Association, London, UK, 2003). Los PEGs están recogidos en las distintas farmacopeas, aunque la nomenclatura difiere (International Harmonisation: Polyethylene glycol (PEG): Pharmeuropa 1999, 11, 612-614). Según el Handbook of Pharmaceutical Excipients (Fourth Edition), 2003 Edited by R.C.Rowe, P.J.Sheskey and P.J.Weller Published by the Pharmaceutical Press (London, UK) and the American Pharmaceutical Association (Washington, USA). Los polioxietilen- glicoles también se denominan polietilenglicoles, macrogoles, macrogola o PEG. La Farmacopea Británica (British Pharmacopeia) usa el término "polietilenglicoles" y "macrogols"; la Farmacopea Europea (Ph Eur) usa "polietilenglicoles" y "Macrogola", mientras que la Farmacopea Norteamericana (USP) usa "polyethylene glycol(s)".
Los PEGs con peso molecular inferior a 400 son líquidos no volátiles a temperatura ambiente. PEG 600 muestra un punto de fusión comprendido entre 17 y 220C, mientras que los PEGs con pesos moleculares medios comprendidos entre 800 y 2000 son materiales pastosos con bajos puntos de fusión. Por encima de un peso molecular superior a 3000, los PEGs son sólidos y, comercialmente, se puede encontrar hasta PEG 35000. Por otra parte, aunque el punto de fusión de los PEGs aumenta al aumentar el peso molecular, el punto de ebullición aumenta hasta un valor máximo de 6O0C. Igualmente, al aumentar el peso molecular, disminuye su solubilidad acuosa. De todas formas, para PEG 35000, se puede disolver en agua una cantidad cercana al 50% m/m.
Desde un punto de vista toxicológico, los PEGs son considerados como poco tóxicos y poco inmunógenos (Hermansky SJ et al., Food Chem. Toxic, 1995, 33, 139- 140; Final Report on the Safety Assessment of PEGs: J.A. C. T., 1993, 12, 429-457; Polyethylene glycol, 21 CFR 172.820, FDA). La ingesta diaria admisible, definida por la WHO, es de 10 mg/kg peso (Polyethylene glycols; Twenty-third report of the Joint FAO/WHO Expert Comittee on Food Additives; World Health Organisation, Geneva; Technical Report Series 1980, 648, 17-18).
Los derivados de PEG presentan ventajas similares a los PEGs tradicionales, por ejemplo, su solubilidad acuosa, inactividad fisiológica, baja toxicidad y estabilidad bajo condiciones muy diversas. Estos derivados incluyen productos muy variados y se caracterizan por el grupo funcional que sustituye al hidroxilo, e.g., grupos amino opcionalmente sustituidos, fenoles, aldehidos, isotiocianatos, mercapto, etc. Entre los
derivados de polietilenglicol que se pueden utilizar en la invención cabe destacar: polioxietilen esteres, tales como PEG monometiléter monosuccinimidil succinato éster; PEG monometil éter monocarboximetil éster; PEG adipato; PEG diestearato; PEG monoestearato; PEG hidroxiestearato; PEG dilaurato; PEG dioleato, PEG monooleato, PEG monoricinooleato; PEG de esteres de aceite de coco; etc.; polioxietilen alquil éteres, tales como PEG monometil éter o metoxi PEG (mPEG); PEG dimetiléter; etc.; otros, tales como poli(etilenglicol tereftalato); derivados de polioxietilen y esteres de sorbitano y ácidos grasos; copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno; copolímeros de óxido de etileno con acrilamida; etc.; y derivados de PEG tales como 0,0 - bis-(2-aminoetil) polietilenglicol (DAE- PEG 2000); 0,0 -bis-(2-aminopropil)polipropilenglicol-polietilenglicol- polipropilenglicol; etc. En una realización particular, el PEG no está ramificado y los grupos hidroxilo no están sustituidos. En esta realización particular, el PEG a utilizar tiene, preferentemente, un peso molecular comprendido entre 400 y 35.000 Da. Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que, cuando se utiliza PEG con un peso molecular de 2.000 Da aproximadamente, se producen las nanopartículas pegiladas con mayor capacidad para favorecer la absorción de la molécuila biológicamente activa (e.g., paclitaxel). Por tanto, en una ralización particular preferida de la invención, el PEG utilizado en la fabricación de las nanopartículas de la invención tiene un peso molecular igual o superior a 400, preferentemente igual o superior a 1.000 (PEG 1000), más preferentemente comprendido entre 1.500 y 10.000 Da, aún más preferentemente, igual o superior a 2.000 Da (PEG 2000), siendo especialmente preferido el PEG con un peso molecular comprendido entre 2.000 Da (PEG 2000) y 6.000 Da (PEG 6000) puesto que proporcionan buenos resultados.
La relación en peso PEG (o derivado del mismo) :polímero biocompatible puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realización particular, la relación en peso PEG:polímero biocompatible es de 1 :2-20, preferentemente de 1 :2-10, más preferentemente alrededor de 1 :8. Así, en una realización concreta de la invención se utiliza PEG 2000, PEG 6000 o PEG 10000, en una relación en peso respecto al
polímero (PVM/MA) de 1 :8.
En otra realización particular, el PEG utilizado en la producción dé las nanopartículas de la invención presenta un grupo hidroxilo terminal bloqueado, por ejemplo, mediante un derivado de éter metílico, lo que reduce su hidrofilia e incluso puede cambiar la estructura de la nanopartícula. En este caso, un porcentaje mayor de las cadenas de PEG estaría incluido en el interior y solamente una pequeña parte de las mismas se localizaría en la superficie de las nanopartículas. Esta particularidad permite modular las características de las nanopartículas mediante el bloqueo de los grupos hidroxilo o bien la introducción de otros grupos funcionales. En este sentido, el mPEG contribuiría a modificar la liberación del fármaco modificando la porosidad de la matriz polimérica.
En otra realización particular, el PEG presenta grupos funcionales terminales diferentes al hidroxilo, tales como grupos amino. Estos grupos amino a su vez pueden estar sustituidos y presentar grupos funcionales. En una realización preferida, los grupos amino son -NH2. La administración oral de nanopartículas pegiladas con un PEG que contiene dichos grupos amino hace que se acumulen sobre ciertos segmentos del tracto intestinal, lo que permite una administración específica.
A continuación, se indican, de forma ilustrativa no limitativa, las estructuras químicas de algunos polialquilenglicoles correspondientes a los grupos anteriormente mencionados con distintos tipos de grupos funcionales:
H (OCH2CH2)n OH H3C (OCH2CH2)n OH a) b)
H2N (CH2CH2O)n CH2CH2 NH2 H2NCHCH3CH2 (OCHCH3CH2) (OCH2CH2)n (OCH2CHCH3) NH2 C) d)
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de PEG que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen concretos incluyen el polietilenglicol 2000, 6000 ó 10000
(PEG 2000, PEG 6000 o PEG 10000); el éter metílico de polietilenglicol 2000 (mPEG 2000); 0,0 -bis-(2-aminoetil) polietilenglicol 2000 (DAE-PEG 2000); y 0,0 -bis-(2- aminopropil) polipropilenglicol - polietilenglicol - polipropilenglicol (DAP-PEG 2000).
La selección del PEG permite modular a voluntad las características del sistema que se genera. El uso de mezclas de polietilenglicoles de diferentes tipos añade un factor más de variabilidad. Desde el punto de vista práctico esto es importante para
adaptar y seleccionar el sistema más adecuado para cada molécula activa y para cada modo de administración.
Molécula biológicamente activa La nanopartícula de la invención comprenden, además del polímero biocompatible y de un polietilenglicol o derivado del mismo, una molécula biológicamente activa seleccionada del grupo formado por actinomicina D, albendazol, aldosterona, alprazolam, amiodarona, amitriptilina, amprenavir, asimadolina, atorvastatina, bunitrolol, buspirona, camptotecina, carbamazepina, carvedilol, celiprolol, ciclosporina A, cimetidina, clotrimazol, colchicina, cortisona, daunorubicina, debrisoquina, dexametasona, diazepam, digitoxina, digoxina, diltiazem, docetaxel, domperidona, doxorubicina, efavirenz, epirubicina, eritromicina, ergotamina, estradiol, estradiol glucurónico, erlotinib, etopósido, fenitoína, fentanilo, felodipina, fenotiacinas, fexofenadina, fluoroquinolonas, fluorouracilo, FK-506, gentamicina, griseofulvina, hidrocortisona, imatinib, indinavir, itraconazol, ivermectina, ketoconazol, kaemferol, levofloxacina, lidocaína, loperamida, losartan, lovastatina, mebendazol, metilprednisolona, metotrexato, mibefradil, midazolam, misoldipina, morfina, nelfmavir, nicardina, nitrendipina, nifedipina, ondansetron, paclitaxel, pentazocina, praziquantel, prednisolona, prednisona, quercetina, quinidina, ranitidina, rapamicina, rifabutin, rifampicina, ritonavir, saquinavir, sirolimus, sulfametiazol, tacrolimus, tamoxifen, talinolol, tenipósido, terfenadina, tetracicilina, topotecan, triamcinolona, valspodar, verapamil, vinblastina, vincristina, vindesina, zopiclona, sus derivados, y sus mezclas.
El término "molécula biológicamente activa", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier sustancia (e.g., un fármaco o principio activo de un medicamento) que se administra a un sujeto, preferentemente un ser humano, con fines profilácticos o terapéuticos; es decir, cualquier sustancia que puede ser utilizada en el tratamiento, cura, prevención o diagnosis de una enfermedad o para mejorar el bienestar físico y mental de humanos y animales. El término "derivado", aplicado a un molécula biológicamente activa, tal como aquí se utiliza, incluye profármacos y análogos de dicha molécula biológicamente activa.
Las nanopartículas de la invención pueden incorporar una o más de dichas moléculas biológicamente activas independientemente de las características de solubilidad de las mismas, aunque, dichas nanopartículas pueden ser particularmente útiles para la administración por vía oral de moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba o de compuestos que sean sustrato de la glicoproteína-P o del complejo enzimático asociado al citocromo P450.
En una realización particular, la molécula biológicamente activa presente en las nanopartículas de la invención es paclitaxel.
Las nanopartículas de la invención permiten modificar la distribución de la molécula biológicamente activa que contienen al ser administradas por una vía que dé acceso a alguna mucosa del organismo (e.g., oral, etc.).
La relación en peso (molécula biológicamente activa)/(po limero biocompatible) en las nanopartículas de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realización particular, dicha relación en peso (molécula biológicamente activa)/(polímero biocompatible) está comprendida entre 1/1 y 1/20 p/p (peso/peso).
Procedimiento de obtención de las nanopartículas de la invención
La incorporación de la molécula biológicamente activa a las nanopartículas pegiladas puede llevarse a cabo mediante un procedimiento como el descrito en ES 2246694, que comprende la incorporación de la molécula biológicamente activa a una solución que comprende el polímero biocompatible y el polietilenglicol, en un disolvente apropiado (e.g., acetona), antes de la formación de las nanopartículas.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de las nanopartículas de la invención, en adelante procedimiento de la invención, que comprende incubar simultáneamente un polímero biocompatible, un polietilenglicol o un derivado del mismo, y una molécula biológicamente activa seleccionada del grupo formado por actinomicina D, albendazol, aldosterona, alprazolam, amiodarona, amitriptilina, amprenavir, asimadolina, atorvastatina, bunitrolol, buspirona, camptotecina, carbamazepina, carvedilol, celiprolol, ciclosporina A, cimetidina, clotrimazol, colchicina, cortisona, daunorubicina, debrisoquina, dexametasona, diazepam, digitoxina, digoxina, diltiazem, docetaxel, domperidona, doxorubicina, efavirenz, epirubicina, eritromicina, ergotamina, estradiol, estradiol
glucurónico, erlotinib, etopósido, fenitoína, fentanilo, felodipina, fenotiacinas, fexofenadina, fluoroquinolonas, fluorouracilo, FK-506, gentamicina, griseofülvina, hidrocortisona, imatinib, indinavir, itraconazol, ivermectina, ketoconazol, kaemferol, levofloxacina, lidocaína, loperamida, losartan, lovastatina, mebendazol, metilprednisolona, metotrexato, mibefradil, midazolam, misoldipina, morfina, nelfmavir, nicardina, nitrendipina, nifedipina, ondansetron, paclitaxel, pentazocina, praziquantel, prednisolona, prednisona, quercetina, quinidina, ranitidina, rapamicina, rifabutin, rifampicina, ritonavir, saquinavir, sirolimus, sulfametiazol, tacrolimus, tamoxifen, talinolol, tenipósido, terfenadina, tetracicilina, topotecan, triamcinolona, valspodar, verapamil, vinblastina, vincristina, vindesina, zopiclona, sus derivados, y sus mezclas.
En una realización particular, el procedimiento de la invención para producir nanopartículas pegiladas que contienen una molécula biológicamente activa sconsiste en una modificación de un procedimiento general descrito anteriormente y basado en la desolvatación controlada del polímero tras la incubación conjunta del copolímero y el polietilenglicol [Arbos et al, J Control Reléase 83 (2002) 321-330; ES 2246694; WO05/104648] que incluye, como diferencia fundamental con los procedimientos desarrollados anteriormente, la adición de un compuesto que posibilite la solubilización de la molécula biológicamente activa (en caso necesario). En una realización particular, las nanopartículas de la invención pueden obtenerse mediante un procedimiento que comprende la incorporación de una solución de la molécula biológicamente activa en un disolvente adecuado (e.g., acetona), a una solución que comprende el polímero biocompatible y el PEG en un disolvente adecuado (generalmente, el mismo que el de la solución de la molécula biológicamente activa) antes de la formación de las nanopartículas. Tras incubar durante un periodo de tiempo apropiado bajo agitación se añade un disolvente (e.g., etanol) para obtener una suspensión de nanopartículas pegiladas que contenían la molécula biológicamente activa. Seguidamente, se adiciona, en su caso, una solución (normalmente acuosa) de un compuesto que posibilita la solubilización de la molécula biológicamente activa a dicha suspensión de nanopartículas pegiladas que contienen la molécula biológicamente activa y se deja homogeneizar. En una realización particular, la molécula biológicamente activa es paclitaxel y el compuesto que permite la solubilización de
dicho fármaco es la glicina, que se añade en una solución acuosa de glicina y edetato sódico y glicina. En este caso, la relación fase orgánica/solución hidroalcohólica puede variar en un amplio intervalo, típicamente, dicha relación está comprendida entre 1/1 y 1/10 v/v (volumen/volumen). A continuación, si se desea, se eliminan los disolventes orgánicos por métodos convencionales. La suspensión resultante, si se desea, se somete a purificación por métodos convencionales (e.g., mediante ultracentrifugación, etc.). Los sobrenadantes se eliminaron y el residuo, si se desea, se resuspende o se congela a -8O0C para su posterior liofilización y conservación a largo plazo por métodos convencionales. La concentración del polímero biocompatible, así como la del PEG o derivado del mismo y de la molécula biológicamente activa puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realización particular, la concentración del polímero biocompatible está comprendida entre 0,001 y 10% p/v, la concentración del polietilenglicol o derivado del mismo entre 0,001 y 5% p/v, y la concentración de dicha molécula biológicamente activa entre 0,001 y 5% p/v.
En una realización particular, dicho polímero biocompatible es PVM/MA; el PEG es un PEG seleccionado entre PEG 2000, PEG 6000 y PEG 10000; la molécula biológicamente activa es paclitaxel; y la acetona es el disolvente de la solución que comprende el polímero biocompatible y el PEG así como el disolvente de la solución de dicha molécula biológicamente activa (paclitaxel).
En otra realización particular, el procedimiento de la invención comprende, además, la eliminación de los disolventes orgánicos y/o la purificación de las nanopartículas pegiladas.
En una realización concreta, la invención proporciona nanopartículas pegiladas que contienen paclitaxel. Dichas nanopartículas pueden obtenerse mediante un procedimiento que comprende: a) suspender, por una parte, el polietilenglicol y el polímero biocompatible (e.g., PVM/MA) en acetona y mantener la mezcla resultante en agitación; b) añadir una solución acetónica de paclitaxel a dicha suspensión que contiene el polímero (e.g., PVM/MA) y el polietilenglicol, e incubar la mezcla resultante bajo agitación; c) desolvatar el polímero mediante adición de etanol y agua incorporando,
además, una solución acuosa de glicina y edetato disódico y dejar homogeneizar durante un periodo de tiempo apropiado (e.g., 10 minutos); y d) evaporar los disolventes orgánicos (e.g., bajo presión reducida) y ajustar el volumen final con una solución de glicina; y e) si se desea, purificar la suspensión resultante por un método convencional apropiado y el residuo, si se desea, se resuspende en un solución acuosa de un crioprotector (e.g., sacarosa, lactosa, manitol, etc.) y se liofiliza. La concentración del polímero bio compatible, así como la del PEG o derivado del mismo y del paclitaxel puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realización particular, la concentración del polímero biocompatible está comprendida entre 0,001 y 10% p/v, la concentración del polietilenglicol o derivado del mismo entre 0,001 y 5% p/v, y la concentración de paclitaxel entre 0,001 y 5% p/v.
En una realización particular, dicho polímero biocompatible es PVM/MA; y el PEG es un PEG seleccionado entre PEG 2000, PEG 6000 y PEG 10000, preferentemente, PEG 2000.
En otra realización particular, la relación en peso paclitaxel:polímero biocompatible es de 1 :2-20, aunque relaciones cercanas a una relación en peso de 1 :10 dan buenos resultados. A modo ilustrativo, 10 mg de paclitaxel añadidos a una dispersión de acetona conteniendo 100 mg de polímero y 12,5 mg de PEG 2000 da una asociación eficiente. En este caso la cantidad de fármaco asociada a las nanopartículas es de aproximadamente 150 microgramos de paclitaxel por mg nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener un tamaño cercano a los 180 nm.
En una realización particular, la administración por vía oral una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel formulado en nanopartículas pegiladas con PEG 2000, permitió obtener niveles plasmáticos constantes y sostenidos durante al menos 48 horas, tras alcanzar la concentración plasmática máxima (Cmax) en un tiempo de aproximadamente 6 horas. El área bajo la curva plasmática (AUC) de paclitaxel obtenida por esta formulación es de, aproximadamente, 0,7 veces a la obtenida por administración intravenosa del medicamento comercial administrado a la misma dosis. Esta formulación se caracteriza por ofrecer un tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo (MRT) de aproximadamente 15 veces superior al que se obtiene tras la administración de la formulación comercial por vía intravenosa.
En otra realización particular, la administración por vía oral una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel formulado en nanop articulas pegiladas con PEG 6000, permitió obtener niveles plasmáticos constantes y sostenidos durante al menos 48 horas, tras alcanzar la concentración plasmática máxima (Cmax) en un tiempo de aproximadamente 3 horas. El área bajo la curva plasmática (AUC) de paclitaxel obtenida por esta formulación es de, aproximadamente, 0,4 veces superior a la obtenida por administración intravenosa del medicamento comercial administrado a la misma dosis. Esta formulación se caracteriza por ofrecer un tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo (MRT) de aproximadamente 15 veces superior al que se obtiene tras la administración de la formulación comercial por vía intravenosa.
Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende, al menos, una nanopartícula de la invención, y un excipiente, vehículo o adyuvante, farmacéuticamente aceptable.
En general, la molécula biológicamente activa presente en la nanopartícula de la invención estará en el interior de la nanopartícula de la invención; no obstante, podría suceder que parte de dicha molécula biológicamente activa estuviera también unida a la superficie de la nanopartícula si bien la mayor parte del mismo estará en el interior (e.g., encapsuladas) de las nanopartículas de la invención.
Las nanopartículas de la invención pueden utilizarse para modificar la distribución de la molécula biológicamente activa asociada al ser administradas por una vía que dé acceso a alguna mucosa del organismo, preferentemente, por vía oral.
Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier composición líquida (suspensión o dispersión de las nanopartículas) para administración oral, bucal, sublingual, etc.; o cualquier composición sólida (e.g., cápsulas, etc.) para su administración oral. Por tanto, en una realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención se administra por vía oral.
Las composiciones farmacéuticas descritas comprenderán los excipientes adecuados para cada formulación. Las formulaciones sólidas orales se preparan de forma convencional por métodos conocidos por los técnicos en la materia. Los
excipientes se elegirán en función de la forma farmacéutica de administración seleccionada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S. A. de Ediciones. La proporción de la molécula biológicamente activa incorporada en la nanopartícula de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, puede ser de hasta un 25% en peso respecto al peso total de las nanop articulas. No obstante, la proporción adecuada dependerá en cada caso de la moléculas biológicamente activa incorporada. La dosis a administrar de nanopartículas de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal, preferentemente, entre 0,1 y 2 mg por kg de peso corporal.
En una realización particular, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende nanopartículas pegiladas de la invención que comprenden un polímero biocompatible, un polietilenglicol o un derivado del mismo, y paclitaxel o un derivado del mismo, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización concreta, dicho polímero biocompatible es un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA). En otra realización concreta, dicha composición farmacéutica se formula en forma de una forma farmacéutica de administración adecuada para su administración por vía oral o por una vía de acceso a mucosas, preferentemente, para su administración por vía oral. En otra realización concreta, dicha composición farmacéutica se encuentra en forma liofilizada junto con un agente crioprotector.
En una realización concreta, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende:
Componente % en peso respecto total
Copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) 75,00 - 95,00
Polietilenglicol 2000 5,00 - 24,99
Paclitaxel 0,01 - 15,00 En otra realización concreta, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende:
Componente % en peso respecto total
Copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) 70,00 - 95,00
Polietilenglicol 6000 5,00 - 24,99
Paclitaxel 0,01 - 20,00 La invención se describe a continuación mediante unos ejemplos que no son limitativos de la invención, sino ilustrativos.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos describen la producción y caracterización de nanopartículas a base de un polímero biodegradable (PVM/MA) que incorporan distintos tipos de polietilenglicoles y una molécula biológicamente activa (paclitaxel). Dichos ejemplos ponen de manifiesto la capacidad de dichas nanopartículas pegiladas de promover la absorción oral de dicha molécula biológicamente activa (paclitaxel). Como puede apreciarse en dichos ejemplos, cuando se utiliza paclitaxel como molécula biológicamente activa, su incorporación en dichas nanopartículas pegiladas permite mantener niveles plasmáticos constantes y sostenidos de dicho fármaco durante, al menos, 48 horas. Asimismo, el paclitaxel incluido en nanopartículas de PVM/MA pegiladas ha resultado ser eficaz para reducir el crecimiento tumoral en ratones inoculados con células de carcinoma pulmonar de Lewis. A continuación, se describen los materiales y métodos generales utilizados para la producción y caracterización de dichas nanopartículas, así como para el estudio farmacocinético de las mismas tanto en ratas como en ratones y para el estudio farmacodinámico en un modelo murino de cáncer.
EJEMPLO 1
Producción y caracterización de nanopartículas pegiladas que contienen paclitaxel
1.1 Materiales y Métodos
1.1.1 Materiales
El poli(metil vinil éter-co-anhídrido maleico) [PVM/MA], conocido como Gantrez® AN 1 19 (PM 200.000), fue donado por ISP™ (Barcelona, España). Los
polietilenglicoles (PEGs) 2000, 6000 y 10000 (PEG 2000, PEG 6000 y PEG 10000) así como el edetato disódico se obtuvieron de Fluka (Suiza). El paclitaxel (USP 26 grado >99,5%) fue suministrado por 2 ICEC (Reino Unido) y el docetaxel (Taxotere®) por Aventis-Pharma (Francia). La glicina y los disolventes orgánicos acetona y etanol fueron suministrados por VWR Prolabo (Francia). El resto de materiales utilizados fueron de grado HPLC, suministrados por Merck (Alemania), y el agua desionizada empleada también en el análisis fue preparada por un sistema de purificación de agua (Wasserlab, Pamplona, España).
1.1.2 Procedimiento general de producción de nanopartículas pegiladas que contienen una molécula biológicamente activa (paclitaxel)
El procedimiento seguido para la producción de las nanopartículas pegiladas a base de PVM/MA y PEG que contienen una molécula biológicamente activa es una modificación de un procedimiento general descrito anteriormente y basado en la desolvatación controlada del polímero tras la incubación conjunta del copolímero (PVM/MA) y el polietilenglicol (PEG) [Arbos et al, J Control Reléase 83 (2002) 321- 330; ES 2246694; WO05/104648] que incluye, como diferencia fundamental con los procedimientos desarrollados anteriormente, la adición de glicina para permitir la solubilización de paclitaxel. Las nanopartículas pegiladas que contenían una molécula biológicamente activa
(paclitaxel) se obtuvieron mediante la incorporación de una solución acetónica de paclitaxel a la solución de PVM/MA y PEG en acetona antes de la formación de las nanopartículas. Brevemente, se dispersaron, por un lado, 12,5 mg de PEG (2000, 6000 ó 10000) en 3 mi de acetona mediante ultrasonicación (aproximadamente 20 minutos) y por otro, 100 mg del copolímero PVM/MA también en 2 mi de acetona. A continuación, se incorporó una de dichas suspensiones sobre la otra y la mezcla resultante se mantuvo en agitación. Posteriormente, se adicionó una solución acetónica de paclitaxel (5, 7,5 ó 10 mg de paclitaxel en 0,5 mi de acetona) en la fase orgánica (acetona) que contenía el polímero (PVM/MA) y el PEG y se incubaron conjuntamente durante un periodo de tiempo aproximado de 1 hora bajo agitación (agitador mecánico o magnético), y, posteriormente, se adicionaron 10 mi de etanol, obteniéndose una suspensión de nanopartículas pegiladas que contenían paclitaxel. A continuación, se adicionaron 10 mi
de una solución acuosa de glicina (50 mg) y edetato disódico (20 mg) a dicha suspensión de nanopartículas pegiladas que contenían paclitaxel y se dejó homogeneizar durante 10 minutos. Finalmente, se evaporaron los disolventes orgánicos bajo presión reducida y el volumen final se ajustó con solución de glicina a 10 mi. La suspensión se sometió a purificación por ultracentrifugación en tubos Vivaspin (20 minutos a 3.000 x g). Los sobrenadantes se eliminaron y el residuo se resuspendió en solución de glicina o en una solución de glicina y sacarosa al 5%. Eventualmente pueden congelarse a -8O0C para su posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis Génesis, Nueva York, EEUU).
1.1.3 Caracterización físico-química de las nanopartículas
La caracterización de las nanopartículas ha conllevado diversos estudios, que se describen a continuación. Dentro de los estudios físico-químicos se determinó el tamaño de partícula y la carga superficial de las nanopartículas, ésta última mediante la medida del potencial zeta. Ambos parámetros fueron obtenidos por espectroscopia de correlación fotónica (PC S) utilizando un Zetasizer nano Z-S (Malvern Instruments/Optilas, España).
El rendimiento del proceso se calculó gravimétricamente, utilizando el peso de las muestras liofilizadas sin agente crioprotector (Arbos et al., Int J Pharm 242 (2002) 129-136). Dicho valor se corroboró mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección mediante detector evaporativo de luz dispersa (ELSD) [Zabaleta et al., J Pharm Biomed Anal 44 (2007) 1072-1078] siguiendo el método descrito abajo y que permite la cuantificación de los PEGs y del PVM/MA.
La cuantificación de los PEGs se realizó mediante HPLC acoplado a un detector tipo ELSD 2000 Alltech (Estados Unidos). El cromatógrafo utilizado para el análisis fue el modelo 1100 series LC (Agilent, Alemania), como fuente de gas nitrógeno para el ELSD se empleó un generador de nitrógeno Alltech (Ingeniería Analítica, Barcelona, España) y los datos se analizaron en un ordenador Hewlett-Packard mediante el programa Chem-Station G2171 [Zabaleta et al, J Pharm Biomed Anal 44 (2007) 1072- 1078]. La separación cromatográfica se llevó a cabo a 4O0C utilizando una columna PL Aquagel-OH 30 (Agilent 300 mm x 7.5 mm; 8 μm) y la composición de la fase móvil fue una mezcla de metano 1/agua en gradiente (Tabla 1) a flujo 1 ml/min.
Tabla 1 Condiciones de fase móvil en gradiente (A: metanol, C: agua).
Las condiciones del detector (ELSD) se optimizaron hasta conseguir la máxima sensibilidad de acuerdo con el gradiente utilizado en la fase móvil (temperatura de nebulizador: HO0C; flujo de nitrógeno: 3 1/min). Para el análisis de las muestras, los sobrenadantes obtenidos tras el proceso de purificación de las nanopartículas, se diluyeron hasta 10 mi con agua purificada. Como muestra para su posterior análisis se tomaron alícuotas de 1 mi de sobrenadante y 20 μl de éste se inyectaron en la columna. La separación cromatográfica de los diferentes polietilenglicoles (PEGs) y del PVM/MA se completó en menos de 14 minutos. El tiempo de retención fue de 4,48 ± 0,06 minutos para el PVM/MA, 7,71 ± 0,01 minutos para el PEG 2000, 6,92 ± 0,02 para el PEG 6000 y 6,55 ± 0,01 minutos para el PEG 10000. El límite de cuantificación fue de 0,075 mg/ml para los PEGs y 0,25 mg/ml para el PVM/MA. La precisión no superó el límite del 8%.
1.1.4 Cuantificación del paclitaxel La cantidad del paclitaxel encapsulado en las nanopartículas pegiladas se determinó por HPLC. El análisis se llevo a cabo en un cromatógrafo modelo 1100 series LC (Agilent, Alemania) acoplado a un sistema de detección ultravioleta (UV) de diodo- array. Los datos se analizaron en un ordenador Hewlett-Packard mediante el programa Chem-Station G2171. Para la separación del paclitaxel se utilizó una columna de fase reversa Phenomenex Gemini Cl 8 (150 mm x 3 mm; 5 μm) calentada a 3O0C. La fase móvil estaba compuesta por una mezcla de solución reguladora de fosfatos (pH= 2; 0,01 M) y acetonitrilo (en proporción 50/50 en volumen), y fue bombeada a un flujo de 0,5 ml/min. La detección se realizó a 228 nm.
Para el análisis de las muestras en fresco, se tomaron 200 μl de suspensión acuosa de nanopartículas, rompiéndose las mismas con 1 mi de dimetilsulfóxido. Se inyectaron alícuotas de 10 μl en la columna HPLC para su análisis.
1.1.5 Estudios farmacocinéticos en ratas
Los estudios farmacocinéticos en ratas se llevaron a cabo de acuerdo con las normas del Comité Ético de la Universidad de Navarra así como de la legislación europea en animales de experimentación (86/609/EU). Para ello, ratas macho Wistar, de peso medio 225 g (Harían, España), se aislaron enjaulas metabólicas 12 horas antes de la administración de las formulaciones, sin acceso a comida, pero permitiéndoles el acceso libre al agua de bebida.
Los animales se dividieron en 6 grupos de tratamiento (6 animales por grupo) y se trataron con dosis únicas de 10 mg/kg (2,25 mg) de paclitaxel incorporado en alguna de las siguientes formulaciones: (i) solución intravenosa (i. v.) de Taxol® (Bristol-Myers Squibb, Madrid,
España);
(ii) solución oral de Taxol®;
(iii) nanopartículas a base de PVM/MA conteniendo paclitaxel [PTX-NP]; (iv) nanopartículas a base de PVM/MA pegiladas con PEG2000 conteniendo paclitaxel [PTX-NP2];
(v) nanopartículas a base de PVM/MA pegiladas con PEG6000 conteniendo paclitaxel [PTX-NP6]; y (vi) nanopartículas a base de PVM/MA pegiladas con PEG10000 conteniendo paclitaxel [PTX-NPlO]. A los animales se les administró 1 mi de las distintas formulaciones, disueltas o dispersas en agua, excepto en el caso de la solución i.v. (formulación comercial), que se administró mediante bolus i.v. en la vena de la cola (0,3 mi).
Tras la administración se procedió a extraer, a diferentes tiempos, un volumen de sangre de aproximadamente 300 μl, utilizando ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante y recuperando la volemia del animal (rata) con un volumen equivalente de suero fisiológico vía intraperitoneal (i.p.). La sangre se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante (plasma) se congeló a una
temperatura de -8O0C. El estudio se realizó de acuerdo con los principios recogidos en las guías internacionales de experimentación animal (WHO Chronicle, 39 (2): 51 - 56, 1985; A CIOMS Ethical Code for Animal Experimentation) siguiendo un protocolo aprobado por el Comité Ético de experimentación animal de la Universidad de Navarra (Protocolo n°: 076-06).
Pretratamiento de las muestras
La extracción del paclitaxel a partir de plasma se realizó mediante un procedimiento de extracción líquido-liquido, utilizando t-butilmetiléter como disolvente de extracción. Para ello se tomaron alícuotas de plasma (0,1 mi), se ajustaron a un volumen de 1 mi con agua y se les añadió 0,2 μg de docetaxel como patrón interno. A continuación, se añadieron 4 mi de ter-butilmetiléter y se agitó durante 1 minuto. Después, se centrifugaron las muestras a 10.000 rpm durante 10 minutos y se recogió el sobrenadante (fase orgánica) que se evaporó en una centrifuga evaporadora (Savant, Barcelona, España). El extracto así obtenido se reconstituyó en 125 μl de una mezcla (50/50 v/v) de acetonitrilo y solución reguladora de fosfatos (pH= 2; 0,01 M) mediante agitación con vortex durante 1 minuto. La solución resultante fue transferida a un vial de inyección.
Método analítico: HPLC
La cuantificación del paclitaxel se realizó por cromatografía líquida de alta resolución con detección ultravioleta-visible. Como patrón interno se utilizó docetaxel. El análisis se llevó a cabo en un cromatógrafo modelo 1 100 series LC (Agilent, Alemania). Los datos se analizaron en un ordenador Hewlett-Packard mediante el programa Chem-Station G2171. Para la separación del paclitaxel se utilizó una columna de fase reversa Gemini C18 (Phenomenex) 150 mm x 3 mm; 5 μm, calentada a 3O0C. La fase móvil estaba compuesta por una mezcla de solución reguladora de fosfatos (pH= 2; 0,01 M) y acetonitrilo (en proporción 50/50 en volumen), y fue propulsada a través de la columna a un flujo de 0,5 ml/min. La detección se realizó a 228 nm. El método analítico utilizado ha sido validado, comprobándose la relación lineal entre la respuesta del detector y las concentraciones de paclitaxel en plasma a lo largo del intervalo de concentraciones comprendido entre 40 y 3.200 ng/ml.
Análisis farmacocinético
El análisis farmacocinético de los datos de las concentraciones plasmáticas a lo largo del tiempo obtenidos tras la administración de paclitaxel se realizó utilizando el procedimiento de ajuste nocompartimental del programa de ajuste farmacocinético WiNNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, USA).
Los parámetros farmacocinéticos calculados fueron los siguientes: concentración máxima (Cmax), tiempo en el cual se alcanza la Cmax (tmax), el área bajo la curva de niveles plasmáticos (AUCo-inf ), el tiempo de residencia media (MRT), la semivida biológica en la fase de eliminación terminal (ti/2Z) y la biodisponibilidad oral (F) del paclitaxel.
El tiempo de residencia media (MRT) se calculó mediante el cociente entre el valor del AUMC (área bajo la curva en el primer momento de la concentración plasmática) y el del AUC. La biodisponibilidad oral (F) se calculó mediante el cociente entre el valor del AUC de cada formulación respecto al AUC de la formulación comercial (Taxol®).
1.1.6 Análisis estadístico
Para el estudio farmacocinético, las formulaciones se analizaron utilizando el test no paramétrico "Mann-Whitney". Valores de P<0,05 se consideraron significativos. Todos los cálculos se hicieron con el programa estadístico de software SPSS® (SPSS® 10, Microsoft, Estados Unidos).
1.2 Resultados
1.2.1 Optimización del proceso de encapsulación del paclitaxel en las nanopartículas pegiladas
Las nanopartículas pegiladas conteniendo paclitaxel fueron obtenidas según el procedimiento previamente descrito en el apartado B de los Materiales y Métodos. Dado que el paclitaxel (PTX) por sí solo no es capaz de incluirse en las nanopartículas de PVM/MA (Gantrez® AN 119) y es eliminado en el proceso de purificación por filtración de las mismas, en forma de cristales sin solubilizar, se hizo
necesario adicionar a la formulación un componente (glicina) que, además de aumentar su solubilidad, mejoraba su encapsulación en las nanopartículas, tal como se muestra en la Tabla 2. Para la preparación de las nanopartículas se utilizaron diferentes polietilenglicoles (PEGs), que variaban en su peso molecular, y se observó la mejora de la eficacia de encapsulación del PTX, destacando las nanopartículas producidas con PEG 2000 y seguido de los otros 2 tipos, las producidas con PEG 6000 y PEG 10000.
Asimismo, se ensayaron también diferentes cantidades de paclitaxel (5, 7,5, 10 mg), empleando siempre la misma cantidad de PEG (12,5 mg) en los diferentes tipos de nanopartículas, observándose que se obtenía mayor cantidad de fármaco encapsulado al aumentar la cantidad añadida, y, por tanto, una mayor eficacia de encapsulación del PTX en las nanopartículas. La Figura 1 muestra la evolución del contenido en PTX en las nanopartículas pegiladas, en función de la cantidad de PTX empleada y del tipo de PEG utilizado.
Tras estos ensayos, se determinó que la cantidad óptima de PTX a incluir inicialmente en las diferentes formulaciones era de 10 mg de PTX ( 1 : 10 PTX/PVM/MA), obteniéndose así los mejores rendimientos. La Tabla 2 muestra la cantidad de PTX encapsulado cuando inicialmente se añadieron 10 mg en función de los diferentes PEGs utilizados. Merece la pena destacar que, tal como se ha mencionado antes, la glicina facilita la resuspensión de las nanopartículas liofilizadas.
Tabla 2
Cantidad de PTX asociado a las diferentes formulaciones de nanopartículas pegiladas en función del tipo de PEG utilizado (cantidad inicial de paclitaxel añadida: 10 mg). Los resultados muestran media ± desviación típica (n = 6)
Los datos muestran la media ± la desviación típica (n = 6) PTX-NP: nanopartículas a base de PVM/MA y paclitaxel PTX-NP-gli: nanopartículas control a base de PVM/MA y paclitaxel con adición de glicina
1.2.2 Caracterización de las partículas pegiladas conteniendo paclitaxel
La Tabla 3 resume las características físico-químicas principales de las nanopartículas probadas en el estudio farmacocinético. Las nanopartículas control (PTX-NP-gli) tenían un tamaño cercano a los 180 nm con una carga superficial negativa de -45 mV. Por otra parte, las nanopartículas pegiladas que contienen encapsulado el PTX mostraron tamaños similares entre ellas y respecto a las nanopartículas control y una carga superficial algo menos negativa (alrededor de -40 mV) que las nanoparticulas no pegiladas. Se observó también que la adición de glicina a las nanopartículas no pegiladas convencionales (PTX-NP), no modificó el rendimiento de las mismas pero sí aumentó significativamente la cantidad de PTX encapsulado. Por último, es de destacar que la presencia del PEG tampoco ejerció ningún efecto sobre el rendimiento de fabricación de las nanopartículas que variaba entre el 50% y el 60%.
Tabla 3 Características físico-químicas de las diferentes formulaciones con PEGs utilizadas en los estudios farmacocinéticos
Los datos muestran la media ± la desviación estándar (n = 8) PTX-NP: nanopartículas a base de PVM/MA y paclitaxel PTX-NP-gli: nanopartículas control a base de PVM/MA y paclitaxel con adición de glicina
1.2.3 Estudio farmacocinético de las nanopartículas pegiladas conteniendo paclitaxel tras su administración oral en animales de laboratorio
El paclitaxel es un fármaco que se caracteriza por presentar un perfil farmacocinético dosis-dependiente. Por tanto, previamente fue necesario determinar el perfil farmacocinético tras administrar por vía intravenosa (i.v.) u oral la formulación comercial de paclitaxel a la dosis seleccionada para su formulación en nanoparticulas
(lO mg/kg).
Los estudios farmacocinéticos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas del
Comité Ético de la Universidad de Navarra así como de la legislación europea en animales de experimentación (86/609/EU). Para ello, ratas macho Wistar, de peso medio 225 g (Harían, España), se aislaron en jaulas metabólicas 12 horas antes de la administración de las formulaciones, sin acceso a comida, pero permitiéndoles el acceso libre al agua de bebida.
El estudio farmacocinético se dividió en 2 fases. En el primer estudio se administró 10 mg/kg de la formulación comercial de paclitaxel (Taxol®) por vía i.v. y oral a dos grupos de ratas macho Wistar (n= 6). El segundo estudio consistió en administrar, por vía oral, a distintos grupos de animales, las diferentes formulaciones de nanopartículas: PTX-NP, PTX-NP-gli, PTX-NP2, PTX-NP6, y PTX-NPlO. La dosis de paclitaxel seleccionada fue de 10 mg/kg.
Tras la administración se procedió a extraer a diferentes tiempos (0, 10, 30, 60, 90, 180, 360, 480 minutos, 24 horas, 32 y 48 horas) un volumen de sangre de aproximadamente 300 μl, utilizando EDTA como anticoagulante y recuperando la volemia del animal (rata) con un volumen equivalente de suero fisiológico vía intraperitoneal (i.p.). El análisis farmacocinético de los datos obtenidos tras la administración de paclitaxel se realizó utilizando el procedimiento de ajuste no compartimental del programa de ajuste farmacocinético WiNNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, Estados Unidos). Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2. Como se puede observar en la Figura 2A, la administración i.v. de la formulación convencional muestra un pico de concentración de fármaco en plasma en la primera toma de muestra, seguido de una disminución bifásica a lo largo del tiempo. Dicho perfil es similar al descrito por otros autores en la bibliografía [Wiernik et al, Journal Cáncer Res 47 (1987) 2486-2493; Yeh et al, Journal Pharm Res 22 (2005) 867-874]. Cuando dicha formulación comercial se administra por vía oral (Figura 2B), los niveles plasmáticos de paclitaxel son nulos. Por el contrario, al administrar por vía oral las formulaciones de paclitaxel en nanopartículas pegiladas (Figura 2C) se pudo comprobar que estas formulaciones daban lugar a niveles plasmáticos sostenidos en el tiempo. Dichos niveles plasmáticos eran más elevados y más prolongados para PTX-NP2 que para PTX-NP6 o para PTX-NP10. En realidad, se pudo constatar cómo la pegilación permitía la absorción de paclitaxel, aunque el aumento del peso molecular del PEG utilizado para pegilar las nanopartículas afectaba
negativamente a la absorción del fármaco. La Tabla 4 recoge los valores de los parámetros farmacocinéticos obtenidos tras realizar un análisis no compartimental de los datos experimentales obtenidos tras administras las distintas formulaciones de paclitaxel en nanopartículas. Para PTX-NP2 y PTX-NP6, los niveles plasmáticos de fármaco se mantenían durante, al menos, 48 horas. Comparando ambas formulaciones se puede observar que tanto la Cmax como el AUC son significativamente mayores para PTX-NP2 que para PTX-NP6. Igualmente, la F para PTX-NP2 y PTX-NP6 fue de 0,7 y 0,4 respectivamente. Dicho valor, para las nanopartículas no pegiladas (PTX-NP-gli), fue de 0,09 y para la formulación comercial fue de 0.
Tabla 4 Parámetros farmacocinéticos de las diferentes formulaciones ensayadas
AUCo-mf: área bajo la curva de niveles plasmáticos; Cmax: concentración máxima; Tmax: tiempo en el cual se alcanza la Cmax; MRT: tiempo de residencia media; Ty22: semivida biológica en la fase de eliminación terminal. ND: no determinado.
EJEMPLO 2
Efecto antitumoral de nanopartículas cargadas con paclitaxel administradas por vía oral en un modelo de tumor murino
En el presente estudio, el objetivo era evaluar la farmacocinética y la actividad antitumoral de las nanopartículas pegiladas cargadas con paclitaxel en ratones. Con este fin, se indujeron tumores en ratones C57BL/6J hembra mediante inoculación subcutánea de células de carcinoma pulmonar de Lewis (3LL).
2.1 Materiales y Métodos
2.1.1 Nanopartículas pegiladas cargadas con paclitaxel
Las nanopartículas pegiladas cargadas con paclitaxel usadas en este estudio fueron las nanopartículas pegiladas cargadas con paclitaxel producidas tal como se describe en el Ejemplo 1.
2.1.2 Estudio farmacocinético de paclitaxel en ratones
Administración de nanopartículas cargadas con paclitaxel a ratones
Se realizaron experimentos con animales de acuerdo con el reglamento del comité responsable de la Universidad de Navarra en línea con los principios recogidos en las guías internacionales de experimentación con animales [N. Ho ward- Jones, A CIOMS ethical code for animal experimentation. WHO Chron 39 (1985) 51-56] y siguiendo un protocolo aprobado por el Comité Ético de la Universidad de Navarra (número de protocolo 011-08).
Se alojaron ratones C57BL/6J hembra (de 4-6 semanas de edad) (Harían, España) en condiciones normales con libre acceso a alimento y agua. Se colocaron los animales enjaulas metabólicas y se sometieron a ayuno durante la noche para evitar la coprofagia pero permitiendo libre acceso al agua.
Se realizó el estudio farmacocinético mediante la administración oral a ratones de una única dosis de 10 mg/kg de paclitaxel (aproximadamente 0,18 mg). Se sometieron a prueba las siguientes formulaciones: (i) TaxoT; (ii) paclitaxel cargado en nanopartículas de PVM/MA pegiladas con PEG2000 (PTX-NP2); (iii) paclitaxel cargado en nanopartículas de PVM/MA pegiladas con PEG6000 (PTX-NP6); (iv) paclitaxel cargado en nanopartículas de PVM/MA pegiladas con PEG10000 (PTX- NPlO) y (v) paclitaxel cargado en nanopartículas de PVM/MA convencionales (PTX- NP-gli). Además, Taxol® también se administró por vía i.v. a ratones a la misma dosis (10 mg/kg).
Se administraron todas las formulaciones dispersadas o disueltas en 1 mi de agua (por vía oral) o solución salina (por vía intravenosa). Tras la administración, se recogieron muestras de sangre de 200 μl a diferentes tiempos, tras 0, 10, 30, 60, 90, 180, 240, 360, 480 minutos y 24, 32, 48 y 72 h. Se empleó ácido etilendiamintetraacético (EDTA) como anticoagulante. Se recuperó la volemia por vía intraperitoneal con un volumen igual de solución salina normal precalentada a temperatura corporal. Se centrifugaron las muestras de sangre durante 10 minutos a 10.000 rpm y se almacenó la
fracción de plasma sobrenadante a -8O0C hasta el análisis por HPLC.
Cuantifícación por HPLC de paclitaxel en muestras de plasma
Se determinó la cantidad de paclitaxel en plasma mediante HPLC tal como se describió en el Ejemplo 1. Se usó docetaxel (DTX) como patrón interno. Se calculó la concentración de paclitaxel en plasma a partir de la zona cromatográfica de PTX/DTX con curvas de calibración. Se refrigeraron las disoluciones madre de PTX y DTX en etanol y se crearon curvas de calibración a lo largo del intervalo de 40-3.200 ng/ml (r2>0,999). Se mezcló una alícuota (100 μl) de muestra de plasma con 25 μl de disolución de patrón interno (docetaxel, 4 μg/ml en metanol, evaporado previamente). Tras mezclar con vórtex, se llevó a cabo la extracción líquido -líquido añadiendo 4 mi de terc-butilmetil éter tras la agitación suave con vórtex (1 minuto). Se centrifugó la mezcla durante 10 minutos a 5.000 rpm, y entonces se transfirió la fase orgánica a un vial limpio y se evaporó hasta sequedad (Savant, Barcelona, España). Finalmente, se disolvió el residuo en 125 μl de disolución reconstitución (acetonitrilo - tampón fosfato 0,01 M pH=2; 50/50 v/v) y se transfirió a viales de un inyector automático, se taparon y se colocaron en el inyector automático de HPLC. Se inyectó una alícuota de 100 μl de cada muestra en la columna de HPLC.
En estas condiciones experimentales, el tiempo de ejecución era de 14 minutos. Se calculó el límite de cuantificación como 80 ng/ml con una desviación estándar relativa del 5,2%. Los valores de precisión durante el mismo día (ensayo intradía) a bajas, medias y altas concentraciones de PTX estaban siempre dentro de los límites aceptables (-1,81 y 3,49%) en todas las concentraciones sometidas a prueba.
Análisis de datos farmacocinéticos
Se analizó el análisis fármaco cinético de los datos de concentración-tiempo, obtenidos antes de la administración de las diferentes formulaciones de paclitaxel, usando un modelo no compartimental que usaba el software WinNonlin 5.2 (Pharsight Corporation, Mountain View, EE.UU.). Los parámetros farmacocinéticos evaluados fueron: el pico de concentración máxima (Cmax), el tiempo en el que se alcanza la concentración máxima (Tmax), la semivida de la fase terminal (ti/2), el área bajo la curva de concentración-tiempo desde el tiempo 0 hasta ∞ (AUCo-∞), el tiempo medio de
residencia (MRT) y la biodisponibilidad oral realtiva de PTX (FR). La biodisponibilidad relativa (Fr) se calculó según: AUCorai
Fr=
en la que AUCorai y AUC1 V. eran el área bajo la curva de concentración-tiempo tras la administración oral e i.v., respectivamente.
Se calculó el tiempo medio de residencia (MRT) como AUMC (área bajo la curva de concentración-tiempo en el primer momento) dividido entre AUC.
2.1.3 Estudio farmacodinámico en ratones con tumor
Se aplicaron los protocolos con animales de acuerdo con el reglamento de la
Legislación Europea sobre experimentos con animales (86/609/EU) [N. Howard- Jones,
A CIOMS ethical code for animal experimentation. WHO Chron 39 (1985) 51-56] y siguiendo un protocolo aprobado por el Comité Ético de la Universidad de Navarra
(número de protocolo 011-08).
Se obtuvieron ratones C57BL/6J hembras (de 4-6 semanas de edad) de Harían (España). Para producir tumores se inyectaron células de cáncer de pulmón de Lewis (3LL) (IxIO5 células en solución salina fisiológica) por vía subcutánea en el costado derecho de los ratones cuando pesaban aproximadamente 18-20 g. Se inició la aplicación terapéutica cuando el tumor alcanzó aproximadamente un volumen de 100 mm3 en aproximadamente 12 días (definido como día 1) tras la inoculación del tumor.
Con este fin, se dividieron los ratones en 5 grupos (diez animales por grupo) con diferentes tratamientos: (i) PBS (control negativo); (ii) Taxol® i.v. (dosis de 10 mg/kg); (iii) Taxol® oral (dosis de 10 mg/kg); (iv) PTX-NP2 (dosis de 10 mg/kg) y (v) PTX-
NP2 (dosis de 25 mg/kg). Los animales tratados por vía i.v. con Taxol® recibieron una dosis de 10 mg/kg diariamente durante 9 días. De manera similar, los animales en el grupo control negativo también recibieron una administración de PBS cada día (9 días).
Por el contrario, los animales tratados por vía oral con formulaciones de nanopartículas o Taxol® recibieron una dosis de paclitaxel cada 3 días (en los días 1, 4 y 7).
Se obtuvo sangre (250 μl) antes del tratamiento y a las 6, 24, 48 y 72 horas tras el tratamiento del plexo retroorbital. Se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos y
se almacenó la fracción de plasma sobrenadante a -2O0C hasta un análisis posterior del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF).
Crecimiento del tumor Se midió periódicamente el volumen del tumor como señal de la eficacia tras la administración de los tratamientos. Se siguió el crecimiento del tumor mediante mediciones con compás calibrador y se calculó su volumen usando la siguiente fórmula:
V = [longitud x (anchura)2]/2
en la que la longitud (L) es el diámetro más largo y la anchura (W) es el diámetro más corto perpendicular a la longitud [J. L. Eiseman et al. Clin Cáncer Res 10 (2004) 6669- 6676]. Se obtuvo el porcentaje de inhibición del volumen del tumor comparando el volumen del tumor en el grupo control con los otros grupos.
Determinación del VEGF
Se usó el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) en plasma de ratones como indicativo de la angiogénesis de los diferentes tratamientos. Para determinar el VEGF se usó el kit de inmunoensayo Quantikine Mouse VEGF (R&D Sytems, Inc., Minneapolis, EE.UU.). Se llevó a cabo el estudio siguiendo las instrucciones del kit y se leyó la placa a 450 y 540 nm usando un lector de placas de microtitulación (Labsystems iEMS Reader MF). También se realizó una curva patrón construida con VEGF de ratón para extrapolar los datos experimentales.
2.1.4 Análisis estadístico
Se expresaron los resultados como valores medios ± DE. Se usó Kruskal-Wallis no paramétrico seguido de la prueba U de Mann-Whitney con la corrección de
Bonferroni para investigar las diferencias estadísticas. En todos los casos, se consideró que p < 0,05 era significativo. Se realizaron todos los cálculos usando el programa de software estadístico SPSS® (SPSS® 15.0, Microsoft, EE.UU.).
2.2 Resultados
2.2.1 Farmacocinética de paclitaxel en ratones
La Figura 3 muestra el perfil de concentración de paclitaxel-tiempo en ratones C57BL/6J tras la administración intravenosa de Taxol® a una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel. Los parámetros farmacocinéticos se resumen en la Tabla 5 y se obtuvieron mediante análisis no compartimental. Se calculó el AUC media que fue de 91.039 ng/h mi y la concentración máxima (Cmax) de 64.676 ng/ml. El MRT fue de 1,75 h mientras que el tm observado para paclitaxel de 2,34 h. La Figura 4 muestra el perfil de concentración plasmática-tiempo tras la administración oral de una única dosis de 10 mg/kg de paclitaxel o bien cargado en diferentes formulaciones de nanopartículas o bien como Taxol® comercial. Para Taxol®, los niveles plasmáticos detectados en muestras de plasma eran muy bajos, con una Cmax de 15 ng/h, que estaba por debajo del límite de cuantificación de la técnica de HPLC (80 ng/ml). Por el contrario, para las nanopartículas pegiladas, los niveles plasmáticos de paclitaxel aumentaron con el tiempo durante las primeras 3-6 h después de la administración seguido de una disminución moderada en el punto de tiempo de 8 h. Entonces, los niveles plasmáticos de paclitaxel seguían siendo altos y casi constantes durante al menos 72 h después de la administración. En cualquier caso, se encontró que los niveles plasmáticos de paclitaxel obtenidos tras la administración bien de PTX-NP2 o bien de PTX-NP6 eran superiores a los obtenidos tras la administración de PTX- NPlO. Para las nanopartículas convencionales, a pesar de que eran significativamente superiores que para Taxol®, los niveles plasmáticos de paclitaxel seguían siendo inferiores que para las nanopartículas pegiladas. La Tabla 5 resume los parámetros farmacocinéticos evaluados mediante un análisis no compartimental de los datos experimentales obtenidos tras la administración oral de las diferentes formulaciones de paclitaxel a ratones. Se encontró que la Cmax de paclitaxel para el fármaco administrado por vía i.v. era 16, 33 y 42 veces superior a la de PTX-NP2, PTX-NP6 y PTX-NP10, respectivamente. Por el contrario, la Cmax para nanopartículas pegiladas era aproximadamente 4-12 veces superior a la de las nanopartículas convencionales. El valor de Cmax más alto dentro de las diferentes nanopartículas pegiladas era para PTX-NP2 seguido de PTX-NP6 y PTX-NP10.
De manera similar, el AUC de paclitaxel para las nanopartículas pegiladas era entre 5 y 13 veces superior al de las nanopartículas convencionales. Además, para PTX- NP2 y PTX-NP6, los valores de AUC eran 2,6 y 1,7 veces superiores al AUC obtenida para PTX-NPlO, respectivamente. Se encontró que el tiempo medio de residencia (MRT) del fármaco en plasma y e l U/2 eran significativamente superiores cuando se administró PTX en las formulaciones de nanopartículas por vía oral que cuando se administró como Taxol® por vía i.v.. Para PTX-NP6, el MRT de paclitaxel era superior al obtenido con PTX- NP2 y PTX-NPlO, así como la semivida de eliminación terminal, que era 1,6 y 1,3 veces superior a la de PTX-NP2 y PTX-NP10 respectivamente.
En general, se encontró que la biodisponibilidad oral relativa (Fr) de nanopartículas pegiladas era superior a la de las nanopartículas control. Además, se encontró que FR estaba relacionada con el peso molecular (Pm) del PEG usado. Por tanto, aumentando el Pm del PEG usado para la pegilación de nanopartículas se observó una disminución de la Fr de paclitaxel. De hecho, se encontró que Fr era aproximadamente 3 veces superior para PTX-NP2 frente a PTX-NP10, mientras que la FR para PTX-NP6 era aproximadamente 2 veces superior a la de PTX-NP10.
Tabla 5 Parámetros farmacocinéticos de las diferentes formulaciones sometidas a prueba.
* Prueba U de Man-Whitney entre PTX-NP6 y PTX-NP10 frente a Taxol i.v. (valor de p < 0,05).
** Prueba U de Man-Whitney entre PTX-NP frente a Taxol® i.v. (valor Ac p < 0,01). t Prueba U de Man-Whitney entre PTX-NP2 frente a PTX-NP6 y PTX-NP10, PTX-NP6 frente a PTX-NP 10 y PTX-NP, PTX-NP 10 frente a PTX-NP (valor de p < 0,05).
J Prueba U de Man-Whitney entre PTX-NP2 frente a PTX-NP (valor Ac p < 0,01).
AUCo-∞: área bajo la curva de concentración-tiempo desde el tiempo O hasta ∞; Cmax: pico de concentración máxima; Tmax: tiempo hasta el pico de concentración; MRT: tiempo medio de residencia; ti/2z: semivida de la fase terminal.
PTX-NP2: nanopartículas de PVM/MA y PEG2000 con paclitaxel; PTX-NP6: nanopartículas de PVM/MA y PEG6000 con paclitaxel; PTX-NPlO: nanopartículas y PEG10000 con paclitaxel y PTX-NP: nanopartículas de PVM/MA control con paclitaxel.
2.2.2 Crecimiento del tumor
La Figura 5 muestra el cambio en el volumen del tumor como función del tiempo tras la administración de 10 mg/kg de paclitaxel una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medible de aproximadamente 100 mm3 (día 1). Al grupo control, que recibió PBS por vía oral y Taxol® i.v., se le administró cada día desde el día 1 hasta el 9 (9 dosis de 10 mg/kg), mientras que Taxol® oral y PTX-NP2 se administraron los días 1, 4 y 7 (3 dosis de 10 mg/kg). También se administraron nanopartículas pegiladas a 25 mg/kg (3 dosis).
Los resultados muestran claramente la eficacia potenciada de paclitaxel cuando se administran nanopartículas pegiladas con PEG 2000. El volumen del tumor de ratones tratados con PBS superaba los 900 mm3 en el día 8 y su última medición era de aproximadamente 1.740 mm3. De manera similar, el volumen del tumor de ratones que recibieron Taxol® oral aumentó hasta 1.400 mm3. Por el contrario, el volumen del tumor de ratones tras la administración de 9 dosis de paclitaxel por vía i.v. fue de 770 ± 123 mm , 2,25 veces inferior al volumen del tumor para ratones tratados con PBS. Para nanopartículas pegiladas que contenían paclitaxel y que se administraron a una dosis de 10 mg/kg cada 3 días durante 9 días (3 dosis), el volumen del tumor de ratones seguía siendo bajo (por debajo de 300 mm3) hasta el sexto día del experimento (véase la Tabla 6). Entonces, los tumores de los ratones empezaron a crecer rápidamente y al final del experimento (día 9), el volumen medio de los tumores era ligeramente superior a los de ratones tratados por vía intravenosa con Taxol® (Figura 5). Cuando se administraron por vía oral nanopartículas pegiladas (PTX-NP2) a una dosis de 25 mg/kg cada 3 días (3 dosis), se encontró que el volumen de los tumores al final del experimento era significativamente inferior al volumen medido en ratones tratados por vía intravenosa con Taxol® (p<0,05). De manera similar, en el día 6 después de la administración, se encontró que el volumen promedio del tumor de ratones tratados con nanopartículas pegiladas era aproximadamente 1,5 veces más pequeño que el volumen del tumor de ratones tratados con Taxol® por vía intravenosa (Tabla 6). Por otra parte, en el día 6, se
encontró que el porcentaje de ratones con un volumen del tumor inferior a 400 mm3 era del 62,5% para el grupo tratado por vía i.v. con Taxol®, del 50% para el grupo tratado por vía oral con Taxol® y del 100% para los grupos tratados con nanopartículas pegiladas.
Tabla 6
Porcentaje de ratones con un volumen del tumor inferior a 400 mm3 en el día 6 después de la administración
2.2.3 Determinación del VEGF
Con el fin de probar que el paclitaxel está implicado en la angiogénesis tumoral, se determinó el VEGF en plasma de ratones. Este factor está relacionado directamente con el crecimiento tumoral. La Figura 4 muestra la concentración del VEGF en el plazo de tiempo para las diferentes formulaciones sometidas a prueba. El perfil del VEGF desde el día 1 hasta el 9 en ratones tratados con Taxol® oral fue similar al grupo tratado con PBS. Para los ratones que recibieron ambos tratamientos (bien Taxol oral o bien PBS), los niveles del VEGF en plasma aumentaron rápidamente con el tiempo. Por el contrario, para los ratones tratados por vía intravenosa con Taxol®, la cantidad del VEGF en plasma fue inferior a la de los controles. Al final del experimento, los niveles del VEGF cuantificados en ratones tratados por vía i.v. con la formulación comercial de paclitaxel eran aproximadamente 2 veces inferiores a los obtenidos en los ratones tratados con Taxol oral o PBS. Por otra parte, PTX-NP2 administrado a una dosis de 10 mg/kg presentó niveles del VEGF similares a los observados en ratones tratados por vía intravenosa con Taxol. En los animales tratados con PTX-NP2 a la dosis alta, los
niveles del VEGF fueron 1,5 veces inferiores a los de los animales tratados con la misma formulación a 10 mg/kg.
3. Discusión En este ejemplo se ha evaluado la eficacia del paclitaxel cargado en nanopartículas pegiladas en un modelo de tumor murino basado en ratones de tipo natural C57BL/6J hembra, que tienen el gen mdrla que codifica para la glicoproteína-P expresada en el tejido intestinal [Schinkel AH et al, CeIl 77 (1994) 491-502].
Al igual que sucede en ratas, cuando se administra Taxol® por vía i.v., la disposición del paclitaxel no es lineal (Figura 3). Este hecho parece estar relacionado con la presencia de Chremophor EL en la fórmula de dicho producto (Taxol®). El perfil de los niveles plasmáticos de paclitaxel frente al tiempo puede ajustarse a un decrecimiento biexponencial (Figura 3), ya descrito. A una dosis de 10 mg/kg, los niveles plasmáticos de paclitaxel disminuyeron rápidamente, y 8 h después de su administración, no pudieron cuantificarse niveles del fármaco. Se calculó que el AUC media y la semivida terminal (ti/2) para paclitaxel eran de aproximadamente 91 mg/h mi y 2,34 h, respectivamente. Estos resultados concuerdan con los datos publicados por otros autores, quienes administraron Taxol® a la misma dosis en ratones hembra tipo- salvaje (wt). En comparación, cuando se administró Taxol® a ratones por vía oral, las concentraciones plasmáticas de paclitaxel eran muy bajas (aproximadamente 15 ng/ml). Estos niveles eran inferiores a los encontrados anteriormente por Van Asperen y colaboradores, quienes informaron que la Cmax de paclitaxel era de aproximadamente 80 ng/ml [J. van Asperen et al. Clin Cáncer Res 4 (1998) 2293-2297]. En cualquier caso, estos niveles bajos de paclitaxel plasmático cuando se administró por vía oral parecen estar relacionados principalmente con el efecto de la bomba de eflujo de la glicoproteína-P intestinal. Por tanto, usando ratones deficientes con ausencia completa de glicoproteína-P intestinal, la absorción de paclitaxel aumentó hasta 6 veces cuando se comparó con los ratones wt.
Para nanopartículas de PVM/MA pegiladas, la bio disponibilidad oral relativa de paclitaxel alcanzó valores de aproximadamente el 90% para PTX-NP2, del 60% para PTX-NP6 y del 30% para PTX-NP10, mientras que para nanopartículas no pegiladas se encontró que la biodisponibilidad oral era del 6%. Estos resultados, tal como los
descritos anteriormente en ratas (Ejemplo 1), estarían relacionados con las propiedades bioadhesivas de las diferentes nanopartículas pegiladas. De manera similar a los resultados anteriores usando ratas, la Fr en ratones resultaba sumamente afectada por el Pm del PEG usado para la preparación de las nanopartículas. La mayoría de las estrategias usadas para potenciar la biodisponibilidad oral de paclitaxel en ratones se han basado en la combinación de paclitaxel con inhibidores de glicoproteína-P. Por tanto, la biodisponibilidad oral de paclitaxel en ratones aumentó hasta el 67% cuando se administró conjuntamente paclitaxel con ciclosporina A (CsA). De manera similar, cuando el paclitaxel estaba asociado a GF 120918 (un bloqueante de glicoproteína-P), la biodisponibilidad oral del paclitaxel aumentó hasta el 40%.
Otro punto interesante observado con nanopartículas pegiladas era que estas formulaciones presentaban niveles plasmáticos de paclitaxel durante al menos 72 h. Este hecho puede explicarse mediante una liberación sostenida del fármaco a partir de las nanopartículas adheridas en la mucosa intestinal. Como prueba de esta idea, se calculó que el MRT de paclitaxel, cuando estaba cargado en nanopartículas pegiladas, era de aproximadamente 3O h, mientras que para el Taxol®, administrado por vía i.v., este parámetro era de tan solo 1,75 h (Tabla 5).
Dentro de las diferentes nanopartículas pegiladas, los niveles plasmáticos más altos de paclitaxel se obtuvieron con PTX-NP2. Por este motivo, se seleccionó esa formulación para evaluar la actividad antitumoral in vivo del paclitaxel.
Para el modelo murino de cáncer, se usaron células de carcinoma pulmonar de Lewis (3LL). El paclitaxel ha mostrado un efecto antiproliferativo de esas células in vitro [Ono K. et al., Br J Cáncer 86 (2002) 1803-1812]. Usando este modelo, se demostró que las nanopartículas pegiladas administradas por vía oral reducen el crecimiento tumoral en comparación con los controles tratados, por la misma vía de administración, con Taxol® o PBS. Es posible obtener una efecto similar cuando se administran 9 dosis de paclitaxel como Taxol® (1 dosis de 10 mg/kg cada día durante 9 dosis) ó 3 dosis del fármaco en nanopartículas pegiladas (1 dosis de 10 mg/kg cada 3 días durante 9 días). Estos resultados parecen indicar que la presencia de niveles sostenidos y no muy altos de paclitaxel en plasma puede ser tan eficaz como el modo de administración tradicional.
Cuando se administró paclitaxel en nanopartículas pegiladas a una dosis de 25 mg/kg, el efecto antitumoral de este fármaco fue notablemente superior al efecto observado a una dosis de 10 mg/kg. En este caso, una dosis de 25 mg/kg de paclitaxel administrado por vía oral cada 3 días (durante un periodo de tiempo total de 9 días), demostró una capacidad muy alta para controlar el crecimiento tumoral. De hecho, al final del experimento (día 9), el volumen de los tumores en ratones era de aproximadamente 380 mm3, es decir, tan solo unas 3 veces superior al volumen observado al comienzo del experimento. En el mismo periodo de tiempo, para los animales tratados por vía i.v. con Taxol® (10 mg/kg), el volumen del tumor era de aproximadamente 6 veces superior al del comienzo del experimento. Todos estos resultados coinciden con los datos notificados anteriormente por otros autores quienes observaron un efecto antitumoral mejorado con paclitaxel cargado en liposomas administrados a ratones por vía i.v. cada 2 días. Dichos autores supusieron que una liberación sostenida de paclitaxel a partir de los liposomas era la base de ese efecto antitumoral mejorado en comparación con la administración de paclitaxel en Chremophor EL.
Todos estos efectos inducidos por el paclitaxel concuerdan con los niveles plasmáticos del VEGF (Figura 6). El VEGF es un factor crítico para la expansión de la vasculatura y, por tanto, el crecimiento tumoral. De hecho, teniendo en cuenta que las células tumorales producen VEGF y que el paclitaxel induce la muerte de las células tumorales, los niveles plasmáticos del VEGF deberían disminuir debido al efecto del paclitaxel. En este caso, los niveles plasmáticos del VEGF en ratones en el día 10 oscilaban desde la concentración más alta hasta la más baja tal como sigue: PBS = Taxol® oral > Taxol® i.v. = PTX-NP2 (10 mg/kg) > PTX-NP2 (25 mg/kg). Por tanto, estos hechos son pruebas complementarias de que las nanopartículas pegiladas ofrecen una liberación continua y sostenida de paclitaxel "activo" en ratones durante al menos 72 h cuando se administra por vía oral.
En conclusión, el paclitaxel incluido en nanopartículas de PVM/MA pegiladas, especialmente a una dosis de 25 mg/kg, parece ser eficaz para reducir el crecimiento tumoral en ratones inoculados con células de carcinoma pulmonar de Lewis.
Claims
1. Una nanopartícula pegilada que comprende un polímero biocompatible, un polietilenglicol o un derivado del mismo, y una molécula biológicamente activa seleccionada del grupo formado por actinomicina D, albendazol, aldosterona, alprazolam, amiodarona, amitriptilina, amprenavir, asimadolina, atorvastatina, bunitrolol, buspirona, camptotecina, carbamazepina, carvedilol, celiprolol, ciclosporina A, cimetidina, clotrimazol, colchicina, cortisona, daunorubicina, debrisoquina, dexametasona, diazepam, digitoxina, digoxina, diltiazem, docetaxel, domperidona, doxorubicina, efavirenz, epirubicina, eritromicina, ergotamina, estradiol, estradiol glucurónico, erlotinib, etopósido, fenitoína, fentanilo, felodipina, fenotiacinas, fexofenadina, fluoroquinolonas, fluorouracilo, FK-506, gentamicina, griseofulvina, hidrocortisona, imatinib, indinavir, itraconazol, ivermectina, ketoconazol, kaemferol, levofloxacina, lidocaína, loperamida, losarían, lovastatina, mebendazol, metilprednisolona, metotrexato, mibefradil, midazolam, misoldipina, morfina, nelfmavir, nicardina, nitrendipina, nifedipina, ondansetron, paclitaxel, pentazocina, praziquantel, prednisolona, prednisona, quercetina, quinidina, ranitidina, rapamicina, rifabutin, rifampicina, ritonavir, saquinavir, sirolimus, sulfametiazol, tacrolimus, tamoxifen, talinolol, tenipósido, terfenadina, tetracicilina, topotecan, triamcinolona, valspodar, verapamil, vinblastina, vincristina, vindesina, zopiclona, sus derivados, y sus mezclas.
2. Nanopartícula según la reivindicación 1 , en la que dicho polímero biocompatible es un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA).
3. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho polímero biocompatible tiene un peso molecular comprendido entre 100 y 2.400 kDa, preferentemente entre 200 y 2.000 kDa, más preferentemente, entre 180 y 250 kDa.
4. Nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho polietilenglicol o derivado del mismo tiene un peso molecular comprendido entre 400 y 35.000 Da.
5. Nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho polietilenglicol se selecciona del grupo formado por un polietilenglicol, un polipropilenglicol, un copolímero que comprende un polietilenglicol y un polipropilenglicol, y sus mezclas.
6. Nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho polietilenglicol presenta, al menos, un grupo hidroxilo terminal modificado, preferentemente con un grupo alcoxi, acrilato, metacrilato, alquilo, amino, fosfato, isotiocianato, sulfhidrilo, mercapto o sulfato.
7. Nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho polietilenglicol se selecciona del grupo formado por polietilenglicol 2000, polietilenglicol 6000, polietilenglicol 10000 y sus mezclas.
8. Nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la relación en peso polietilenglicol:polímero biocompatible es de 1 :2-20, preferentemente de 1 :2-10, más preferentemente alrededor de 1 :8.
9. Nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la relación entre dicha molécula biológicamente activa y el polímero biocompatible está comprendida entre 1/1 y 1/20 p/p (peso/peso).
10. Nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha molécula biológicamente activa es paclitaxel o un derivado del mismo.
11. Una nanopartícula pegilada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, como medicamento.
12. Una composición farmacéutica que comprende, al menos, una nanopartícula pegilada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, junto con un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, en una forma farmacéutica de administración por vía oral.
14. Empleo de una nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la elaboración de una composición farmacéutica.
15. Un procedimiento para la producción de nanopartículas pegiladas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende incubar simultáneamente un polímero biocompatible, un polietilenglicol o un derivado del mismo, y una molécula biológicamente activa seleccionada del grupo formado por actinomicina D, albendazol, aldosterona, alprazolam, amiodarona, amitriptilina, amprenavir, asimadolina, atorvastatina, bunitrolol, buspirona, camptotecina, carbamazepina, carvedilol, celiprolol, ciclo sporina A, cimetidina, clotrimazol, colchicina, cortisona, daunorubicina, debrisoquina, dexametasona, diazepam, digitoxina, digoxina, diltiazem, docetaxel, domperidona, doxorubicina, efavirenz, epirubicina, eritromicina, ergotamina, estradiol, estradiol glucurónico, erlotinib, etopósido, fenitoína, fentanilo, felodipina, fenotiacinas, fexofenadina, fluoroquinolonas, fluorouracilo, FK-506, gentamicina, griseofulvina, hidrocortisona, imatinib, indinavir, itraconazol, ivermectina, ketoconazol, kaemferol, levofloxacina, lidocaína, loperamida, losarían, lovastatina, mebendazol, metilprednisolona, metotrexato, mibefradil, midazolam, misoldipina, morfina, nelfinavir, nicardina, nitrendipina, nifedipina, ondansetron, paclitaxel, pentazocina, praziquantel, prednisolona, prednisona, quercetina, quinidina, ranitidina, rapamicina, rifabutin, rifampicina, ritonavir, saquinavir, sirolimus, sulfametiazol, tacrolimus, tamoxifen, talinolol, tenipósido, terfenadina, tetracicilina, topotecan, triamcinolona, valspodar, verapamil, vinblastina, vincristina, vindesina, zopiclona, sus derivados, y sus mezclas.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, que comprende, además, el desecado, opcionalmente en presencia de un agente crioprotector, de las nanopartículas pegiladas que contienen la molécula biológicamente activa.
17. Una composición farmacéutica que comprende nanopartículas pegiladas que comprenden un polímero biocompatible, un polietilenglicol o un derivado del mismo, y paclitaxel o un derivado del mismo, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Composición farmacéutica según la reivindicación 17, en la que dicho polímero biocompatible es un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA).
19. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 7 ó 1 8, en forma liofilizada o en una forma farmacéutica de administración adecuada para su administración por vía oral o por una vía de acceso a mucosas.
20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19, en forma liofilizada que comprende, además, un diluyente de uso farmacéutico o un agente crioprotector .
21. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, que comprende: Componente % en peso respecto total Copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) 75,00 - 95,00 Polietilenglicol 2000 5,00 - 24,99
Paclitaxel 0,01 - 15,00
22. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, que comprende: Componente % en peso respecto total Copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) 70,00 - 95,00
Polietilenglicol 6000 5,00 - 24,99
Paclitaxel 0,01 - 20,00
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