WO2008086916A1 - Neue alkalische protease aus bacillus gibsonii und wasch- und reinigungsmittel enthaltend diese neue alkalische protease - Google Patents

Neue alkalische protease aus bacillus gibsonii und wasch- und reinigungsmittel enthaltend diese neue alkalische protease Download PDF

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WO2008086916A1
WO2008086916A1 PCT/EP2007/063346 EP2007063346W WO2008086916A1 WO 2008086916 A1 WO2008086916 A1 WO 2008086916A1 EP 2007063346 W EP2007063346 W EP 2007063346W WO 2008086916 A1 WO2008086916 A1 WO 2008086916A1
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WO
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polypeptide
polynucleotide
acid sequence
amino acid
seq
Prior art date
Application number
PCT/EP2007/063346
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English (en)
French (fr)
Inventor
Petra Siegert
Susanne Wieland
Julia Engelskirchen
Marion Merkel
Karl-Heinz Maurer
Cornelius Bessler
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Henkel Ag & Co. Kgaa
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Filing date
Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to a novel subtilisin-type alkaline protease from Bacillus gibsonii and to sufficiently related proteins and their derivatives. It also relates to detergents and cleaners with this new Subtilisin-type alkaline protease, sufficiently related proteins and their derivatives, corresponding washing and cleaning processes and their use in detergents and cleaners, and other technical uses.
  • Enzymes are well-established active ingredients in detergents and cleaners. Proteases cause the degradation of protein-containing stains on the cleaning material, such as textiles or hard surfaces. At best, there are synergies between the enzymes and the remaining components of the funds concerned.
  • the development of detergent proteases is based on naturally, preferably microbially formed enzymes. Such are optimized by per se known mutagenesis method, for example, point mutagenesis, deletion, insertion or fusion with other proteins or protein parts or other modifications for use in detergents and cleaners.
  • subtilisins occupy an outstanding position due to their favorable enzymatic properties such as stability or pH optimum.
  • subtilisins are attributed to the serine proteases due to the catalytically active amino acids. They are naturally formed and secreted by microorganisms, especially Bacillus species. They act as nonspecific endopeptidases, that is, they hydrolyze any acid amide linkages that are internal to peptides or proteins. Their pH optimum is usually in the clearly alkaline range. An overview of this family is provided, for example, by the article "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" by R. Siezen, pages 75-95 in “Subtilisin enzymes", edited by R. Bott and C. Betzel, New York, 1996. Subtilisins are suitable for a variety of technical uses, as components of cosmetics and especially as active ingredients of detergents or cleaners.
  • subtilisin BPN ' which from Bacillus amyloliquefaciens, or ß. subtilis is from the work of Vasantha et al. (1984) in J. Bacteriol., Volume 159, pp. 811-819 and JA Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Volume V ⁇ _, pp. 7911-7925.
  • Subtilisin BPN ' serves as a reference enzyme of the subtilisins, in particular with regard to the numbering of the positions.
  • the protease subtilisin Carlsberg is described in the publications of EL Smith et al. (1968) in J. Biol. Chem., Volume 243, pp.
  • subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase ®, or Savinase ® from Novozymes. They are originally from Bac / 7 / ⁇ / s strains, which are disclosed in the application GB 1243784.
  • subtilisin DY is originally from Nedkov et al. Chem., 1985, in Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 366, pp. 421-430.
  • subtilisin-type proteases isolated from Bacillus strains are described in the recent patent applications WO03 / 054185 and WO03 / 054184 and in the unpublished patent application DE102006022216.
  • a strategy to improve the washing performance of the subtilisins is to substitute statistically or specifically in the known molecules individual amino acids against others and to check the variants obtained for their contributions to the washing performance.
  • the enzymes can also be improved with regard to their allergenicity with certain amino acid exchanges or deletions.
  • subtilisins In order to improve the washing performance of subtilisins, numerous applications have followed the strategy of inserting additional amino acids into the active loops. This strategy should, in principle, be applicable to all subtilisins belonging to one of subgroups I-S1 (true subtilisins) or I-S2 (highly alkaline subtilisins).
  • Another strategy of performance improvement is to change the surface charges and / or the isoelectric point of the molecules and, above that, their interactions with the substrate. Furthermore, point mutants with reduced pH dependent molecular charge variation have been described. From this principle, a method was also derived for the identification of variants, which should be suitable for use in detergents and cleaners; All disclosed variants have at least one exchange in position 103. Generally, variations in the literature are very often described as having an exchange at position 103, optionally combined with a variety of other possible substitutions.
  • An alternative way of improving the performance of detergents and cleaners is to increase the hydrophobicity of the molecules, which may affect the stability of the enzyme. Another way to modulate the performance of proteases is by forming fusion proteins.
  • fusion proteins from proteases and an inhibitor such as the Streptomyces subtilisin inhibitor are disclosed in the literature.
  • Another possibility is, for example, the coupling to the cellulase-derived cellulose binding domain (CBD) to increase the concentration of active enzyme in the immediate vicinity of the substrate or the coupling of a peptide linker and therefrom polymers to reduce the allergenicity or immunogenicity.
  • CBD cellulase-derived cellulose binding domain
  • methods for generating statistical amino acid replacements can be based on the phage display.
  • a modern direction of enzyme development is to combine elements from known, related proteins via statistical methods into new enzymes that have previously unattainable properties. Such methods are also summarized under the generic term recombination. These include, for example, the following methods: the StEP method (Zhao et al., 1998, Nat. Biotechnol., Vol. 6, pp. 258-261), random priming recombination (Shao et al., (1998), Nucleic Acids Res., Vol. 26, pp. 681-683), DNA shuffling (Stemmer, WPC (1994), Nature, Vol. 370, pp.
  • Another, and in particular complementary, strategy is to increase the stability of the proteases in question and thereby increase their effectiveness.
  • Stabilization via coupling to a polymer has been described, for example, for proteases used in cosmetics; As a result, a better skin compatibility could be achieved.
  • stabilizers by point mutations are more common, especially for detergents and cleaners.
  • proteases can be stabilized, in particular also with regard to use at elevated temperatures, by exchanging certain tyrosine residues for others.
  • Other described possibilities for stabilization via point mutagenesis are, for example:
  • proteases are used to improve the washing or cleaning performance together with ⁇ -amylases and other detergent enzymes, in particular lipases can be.
  • lipases can be used in detergents in combination with other active ingredients such as bleaching agents or soil release agents.
  • proteases established for use in detergents are also suitable for cosmetic purposes or for organic-chemical synthesis.
  • proteases with different properties, such as the reaction conditions, the stability or the substrate specificity.
  • the technical utility of the proteases depends on other factors such as stability of the enzyme to high temperatures, oxidizing agents, denaturation by surfactants, folding effects, or desired synergies with other ingredients.
  • the present invention therefore an object of the invention to find another, not yet known protease.
  • the wild-type enzyme should preferably be characterized as being at least close to the enzymes established for this purpose when used in an appropriate composition. In particular, the contribution to the performance of a detergent or cleaning agent was of interest.
  • proteases in particular of the subtilisin type, which have improved stability with respect to the prior art to temperature influences, pH fluctuations, denaturing or oxidizing agents, proteolytic degradation, high temperatures, acidic or alkaline conditions or to a change in the redox ratios.
  • Other tasks can be seen in a reduced immunogenicity or reduced allergenic effect.
  • Another particular object of the present invention was to find proteases which at temperatures of 20 to 60 0 C, a good washing performance, preferably an improved washing performance in comparison to the disclosed in the prior art proteases, in particular those of the subtilisin type have ,
  • Another particular object of the present invention has been to find proteases which have improved detergency relative to at least one soiling, preferably with respect to multiple soils, with respect to the homologous proteases known in the art.
  • proteases Other subtasks have been to provide nucleic acids encoding such proteases, and to provide vectors, host cells, and methods of production that can be used to obtain such proteases. Furthermore, appropriate means, in particular washing and cleaning agents, appropriate washing and cleaning methods and corresponding uses for such proteases should be made available. Finally, technical applications for the proteases found should be defined.
  • subtilisin-type alkaline proteases having amino acid sequences which are as described in the sequence listing under SEQ ID NO. 2 amino acid sequence given from position 115 to 383 are at least 97.5% identical and / or differ in relation to this amino acid sequence at most in 6 amino acid positions.
  • the subtilisin type naturally occurring alkaline protease underlying the present invention is obtainable from the culture supernatant of a new Bacillus gibsonii strain obtained from DSMZ (Deutsche Collection of microorganisms and cell cultures) has been identified as such. A deposit of this strain did not take place. Instead, for the purpose of reworkability according to the Budapest Treaty, a plasmid containing the nucleic acid sequence of the enzyme according to the invention, with DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig) with the accession number DSM 18912 deposited.
  • DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig
  • the present patent application pursued the strategy of finding from a natural habitat a protease-producing microorganism and thus a naturally formed enzyme that meets the requirements as completely as possible.
  • the nucleotide sequence of the novel alkaline protease from Bacillus gibsonii according to the invention is shown in the sequence listing of the present application under SEQ ID NO. 1 indicated. It includes 1152 bp.
  • the deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO. 2 indicated. It comprises 383 amino acids, followed by a stop codon. Of these, the first 114 amino acids are unlikely to be present in the mature protein, so the mature protein is expected to be 269 amino acids in length.
  • the measure of homology is a percentage of identity, such as may be determined, for example, according to the method given by D. J. Lipman and W. R. Pearson in Science 227 (1985), pp. 1435-1441. This indication may refer to the entire protein or to the respective region to be assigned.
  • a broad homology term, similarity also includes conserved variations, that is, amino acids with similar chemical activity, as these usually perform similar chemical activities within the protein. With nucleic acids one knows only the percentage of identity.
  • subtilisin HP302 from Bacillus gibsonii (described in DE 102006022216) with 88% identity
  • subtilisin TI-1 from Bacillus gibsonii (described in WO03 / 054184) with 88% identity
  • Subtilisin TII-5 from Bacillus gibsonii (described in WO03 / 054185) with 86% identity.
  • subtilisin HP302 from Bacillus gibsonii (described in DE 102006022216) with 87% identity
  • subtilisin TI-1 from Bacillus gibsonii (described in WO03 / 054184) with 86% identity
  • Subtilisin TII-5 from Bacillus gibsonii (described in WO03 / 054185) with 84% identity.
  • Subtilisin HP302 from Bacillus gibsonii (described in DE 102006022216) with 96% identity
  • Subtilisin TI-1 from Bacillus gibsonii (described in WO03 / 054184 ) with 95% identity
  • Subtilisin TII-5 from Bacillus gibsonii (described in WO03 / 054185) with 92% identity.
  • subtilisin HP302 from Bacillus gibsonii (described in DE 102006022216) with 97% identity
  • subtilisin TI-1 from Bacillus gibsonii (described in WO03 / 054184 ) with 96% identity
  • Subtilisin TII-5 from Bacillus gibsonii (described in WO03 / 054185) with 91% identity.
  • this alkaline protease is to be regarded as a subtilisin.
  • An object of the present invention is thus any polypeptide, in particular any hydrolase, especially any subtilisin-type alkaline protease, having an amino acid sequence which is at least 96.5% identical to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2 and / or with respect to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2 deviates at most in 14 amino acid positions.
  • those polypeptides whose amino acid sequence to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2 is more preferably at least 97% or 97.5%, more preferably at least 98% or 98.5%, especially at least 99% or 99, 5% identical and / or those whose amino acid sequence in relation to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2 at most in 13, 12, 11, 10, 9, 8 or 7, in particular at most in 6, 5, 4, 3 or 2 amino acid positions, more preferably at most deviates in one amino acid position.
  • Very particular preference is given to a protein having an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • amino acids 1 to 14 are to be regarded as leader peptide, wherein amino acids 1 to 27 presumably represent the signal peptide, and the mature protein is expected to extend from positions 115 to 383 according to SEQ ID NO: 2.
  • the position 384 is thus occupied by a stop codon, so actually corresponds to no amino acid.
  • this position is included according to the invention in the region corresponding to the mature protein.
  • a further subject of the present invention is thus any polypeptide, in particular any hydrolase, in particular any subtilisin-type alkaline protease having an amino acid sequence which is at least 97.5 to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2 from position 115 to position 383 % is identical and / or deviates in relation to this amino acid sequence at most in 6 amino acid positions.
  • polypeptides whose amino acid sequence is identical to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2 from position 115 to position 383 at least 98% or 98.5%, more preferably at least 99% or 99.5%, and / or those whose amino acid sequence differs at most in 5 or 4, in particular at most in 3 or 2 amino acid positions, particularly preferably at most in an amino acid position with respect to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2 from position 115 to 383.
  • Very particular preference is given here to a protein having an amino acid sequence from position 115 to 383 according to SEQ ID NO: 2.
  • cleavage site is not located between the 114th and the 115th amino acids of SEQ ID NO: 2 but at a different location this information refers to the actual cleavage site or to the actual mature protein.
  • Another object of the present invention are also fragments, in particular the mature protein, provided that they are new compared to the prior art.
  • a further subject of the present invention are therefore also polypeptides which have an amino acid sequence with at least 81, preferably at least 90, 100 or 120, particularly preferably at least 150, 175 or 200, in particular at least 225 or 250, consecutive amino acids of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2, in particular the amino acid sequence of position 115 to 383 according to SEQ ID NO: 2.
  • Another object of the present invention are therefore also polypeptides having an amino acid sequence with at least 127, preferably at least 140, 160 or 170, more preferably at least 180, 190 or 200, especially at least 220, 240 or 250 consecutive amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO : 2, in particular the amino acid sequence of position 115 to 383 according to SEQ ID NO: 2, or at most differ in an amino acid position thereof.
  • Another object of the present invention are therefore also polypeptides having an amino acid sequence with at least 171, preferably at least 180, 190 or 200, more preferably at least 210, 220 or 230, especially at least 240, 250 or 260 consecutive amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO : 2, in particular the amino acid sequence from position 115 to 383 according to SEQ ID NO: 2, or at most in two amino acid positions, preferably at most in one amino acid position, deviate therefrom.
  • Another object of the present invention are therefore also polypeptides having an amino acid sequence having at least 192, preferably at least 200, 210 or 220, more preferably at least 230, 240 or 250 consecutive amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, in particular the amino acid sequence of position 115th to 383 according to SEQ ID NO. 2, or at most in three, preferably at most in two, more preferably at most in one position, deviate therefrom.
  • Another object of the present invention are therefore also polypeptides having an amino acid sequence from position 164 to position 382 of the in SEQ ID NO. 2 or at most in six or five, preferably at most in four or three, more preferably at most in two positions, especially at most in one position, deviate therefrom.
  • amino acids 1 to 114 are likely to be the leader peptide, with amino acids 1 to 27 believed to represent the signal peptide and amino acids 28 to 114 corresponding to the propeptide.
  • a further subject of the present invention are therefore polypeptides having an amino acid sequence from position 1 to 114 and from position 28 to 114 according to SEQ ID NO: 2 as well as polypeptides starting from these amino acid sequences in at most 4, preferably in at most 3 or 2 amino acid positions differ in exactly one amino acid position.
  • Another object of the present invention are polypeptides which are encoded by the polynucleotides according to the invention, mentioned below.
  • polypeptides which are derived from a nucleotide sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 nucleotide sequence is as similar as possible, in particular over the portion of the positions 1 15 to 384 of the polypeptide according to SEQ ID NO. 2 corresponds.
  • these nucleic acids encode proteins whose properties are increasingly similar to those of the alkaline protease according to the invention from Bacillus gibsonii, in particular the mature protein. Again, as for all subsequent embodiments, it again applies that these details refer to the actual mature protein, if it should turn out that the cleavage site of the protein is at a different site than indicated above.
  • subtilisin HP302 from Bacillus gibsonii (described in DE 102006022216), subtilisin TI-1 from Bacillus gibsonii (described in WO03 / 054184) and subtilisin TII-5 from Bacillus gibsonii (described in WO 03/054185) preferably those polypeptides according to the invention which, compared with this closest prior art, have an improved washing performance with respect to at least one soiling, preferably with respect to at least two soils, in particular selected from grass on cotton, milk / oil on cotton, Whole / carbon black on cotton, chocolate milk / carbon black on cotton and blood / milk on cotton, in particular at a washing temperature of 20 to 60 0 C, preferably 30 0 C, and preferably when used in a liquid detergent.
  • the most preferred embodiment of the invention is any subtilisin-type alkaline protease whose amino acid sequence is identical to that shown in SEQ ID NO. 2 overall amino acid sequence, preferably in the positions 1 15 to 383 is identical and / or their amino acid sequence of the in SEQ ID NO. 1 nucleotide sequence, preferably from positions 343 to 1 152, can be derived.
  • protease not yet known in the prior art. It is, as indicated in the examples, isolatable, manufacturable and usable. It is also characterized, as also documented in the examples, by the fact that, when used in an appropriate agent, it at least approximates, or even exceeds, the performance of enzymes established for this purpose.
  • the polypeptides according to the invention are preferably enzymes, particularly preferably hydrolases, in particular proteases, particularly preferably endo-peptidases, in particular proteases of the subtilisin type, or parts thereof.
  • the polypeptides according to the invention are therefore preferably able to hydrolyze acid amide bonds of proteins, in particular those which are located inside the proteins.
  • the parts of the polypeptides may, in particular, be protein domains which may be suitable, for example, for the formation of functional chimeric enzymes.
  • proteases which can be used in particular in detergents, it can serve as a naturally occurring, microbially formed enzyme as a starting point for mutagenesis methods known per se, for example point mutagenesis, fragmentation, deletion, insertion or fusion with other proteins or protein parts or Other modifications for the desired use to be optimized.
  • Such optimizations can be, for example, adjustments to temperature influences, pH fluctuations, redox ratios and / or other influences that are relevant for the technical fields of application. For example, an improvement in oxidation resistance, stability to denaturing agents or proteolytic degradation, high temperatures, acidic or strongly alkaline conditions, a change in sensitivity to calcium ions or other cofactors, a reduction in immunogenicity or allergenic activity are desired.
  • the surface charges or the loops involved in the catalysis or substrate binding can be changed.
  • One starting point for this is an alignment with known proteases. This makes it possible to locate positions which, if necessary, could lead to an improvement in the properties of the protein.
  • mutagenesis methods are based on the associated nucleotide sequence shown in SEQ ID NO. 1, or for this purpose sufficiently similar nucleotide sequences, the further below be presented as a separate subject of the invention.
  • Corresponding molecular biology methods are described in the prior art, for example in manuals such as those of Fritsch, Sambrook and Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.
  • polypeptides according to the invention are those protein variants which have one or more amino acid exchanges in the positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 and 268 in the count of the alkaline Protease from Bacillus lentus.
  • Chimeric proteins according to the invention have in the broadest sense a proteolytic activity. This may be exercised or modified by a moiety derived from a polypeptide of the invention.
  • the chimeric proteins can therefore also lie outside the range claimed above over their entire length.
  • the purpose of such a fusion is to introduce or modify a particular function or partial function using the fused protein portion of the invention.
  • it is irrelevant whether such a chimeric protein consists of a single polypeptide chain or several subunits.
  • a polypeptide according to the invention or parts thereof via peptidic linkers or directly as a fusion protein with binding domains from other proteins, for example the cellulose-binding domain, thereby making the hydrolysis of the substrate more effective.
  • binding domain could also be derived from a protease, such as to enhance the binding of the protein of the invention to a protease substrate. This increases the local protease concentration, which may be advantageous in individual applications, for example in the treatment of raw materials.
  • proteins according to the invention can also be linked with amylases or cellulases, for example, in order to perform a dual function.
  • polypeptides according to the invention obtainable by insertion mutation are to be assigned to their basic similarity because of the chimeric proteins according to the invention.
  • This subheading also includes substitution variants, ie those in which individual regions of the molecule have been replaced by elements from other proteins.
  • the purpose of insertion and suppression mechanisms is to combine individual properties, functions or partial functions of proteins according to the invention with those of other proteins.
  • This also includes, for example, variants to be obtained via shuffling or recombination of partial sequences from different proteases.
  • proteins can be obtained which have not previously been described. Such techniques allow drastic effects to very subtle activity modulations.
  • such mutations are random priming recombinations according to a statistical method attributable to the Directed Evolution field, such as StEP (Zhao et al., 1998, Nat. Biotechnol., Vol. 16, pp. 258-261) (Shao et al., (1998) Nucleic Acids Res., Vol. 26, pp. 681-683), DNA shuffling (Stemmer, WP, C. (1994), Nature, Vol. 370, pp. 389-391) or recursive sequence recombination (RSR; 27230, WO 97/20078, WO 95/22625) or the method RACHITT (Coco, WM et al. (2001), Nat.
  • Inversion mutagenesis ie a partial sequence reversal, can be regarded as a special form of both the deletion and the insertion. Such variants can also be generated purposefully or randomly.
  • subtilisins are preferred.
  • endopeptidases especially of the groups 3.4.21 serine proteinases, 3.4.22 cysteine proteinases, 3.4.23 aspartate proteinases and 3.4.24 metalloproteinases.
  • serine proteinases 3.4.21
  • subtilisins see “Subtilases: Subtilisin-like Proteases” by R. Siezen, pages 75-95 in “Subtilisin enzymes", issued by R. Bott and C. Betzel, New York, 1996).
  • subtilisins of group IS-2 the highly alkaline subtilisins, are preferred.
  • active molecules are preferred to inactive ones, since, for example, the proteolysis carried out is of importance, for example, in the fields of application set out below.
  • the above-mentioned fragments also have a proteolytic activity in the broadest sense, for example for complexing a substrate or for forming a structural element required for the hydrolysis. They are preferred if, taken alone, they can already be used for the hydrolysis of another protein without the need for further protease components to be present. This refers to the activity that can be exerted by a protease per se; the possibly simultaneously necessary presence of buffer substances, cofactors etc. remains unaffected.
  • deletion variants proteins of the invention, as in the case of the fusion proteins.
  • Preferred representatives of this subject invention include those which per se are capable of hydrolyzing a protein substrate without the need for further protease components to be present.
  • a preferred embodiment are all such polypeptides according to the invention carried out so far, which are characterized in that they are additionally stabilized.
  • proteases according to the invention can be increased, for example, by coupling to polymers. It requires that the proteins be linked to such polymers via a chemical coupling step prior to their use in appropriate agents.
  • Another way to stabilize against elevated temperature and the action of surfactants would be the stabilization via the exchange of amino acids that are close to the N-terminus, against those that come into contact with the rest of the molecule via non-covalent interactions and thus a Contribute to the maintenance of the globular structure.
  • a preferred embodiment are all such polypeptides according to the invention carried out so far, which are characterized in that they are additionally derivatized.
  • Derivatives are understood as meaning proteins which are derived from the exported proteins by an additional modification. Such modifications may include, for example, stability, substrate specificity or binding strength to the substrate or enzymatic activity influence. They can also serve to reduce the allergenicity and / or immunogenicity of the protein and thus, for example, increase its skin compatibility.
  • Such derivatizations can be carried out, for example, biologically, for example in connection with the protein biosynthesis by the producing host organism.
  • Particularly noteworthy here are couplings of low-molecular compounds such as lipids or oligosaccharides.
  • derivatizations can also be carried out chemically, for example by the chemical transformation of a side chain or by covalent bonding of another, for example macromolecular, compound to the protein.
  • another, for example macromolecular, compound for example, such a coupling of amines to carboxyl groups of the enzyme to change the isoelectric point done.
  • macromolecules such as proteins, for example via bifunctional chemical compounds, can be bound to proteins according to the invention. Such a macromolecule may be a binding domain, for example.
  • Such derivatives are particularly suitable for use in detergents or cleaners.
  • protease inhibitors can also be linked to the proteins according to the invention via linkers, in particular amino acid linkers. Couplings with other macromolecular compounds such as polyethylene glycol improve the molecule for other properties such as stability or skin compatibility.
  • Derivatives of proteins according to the invention can in the broadest sense also be understood to mean preparations of these enzymes.
  • a protein may be associated with various other substances, for example from the culture of the producing microorganisms.
  • a protein may also have been deliberately added to certain other substances, for example to increase its storage stability. Therefore, all preparations of a protein according to the invention are also according to the invention. This is also independent of whether or not it actually exhibits this enzymatic activity in a particular preparation. Because it may be desired that it has no or only low activity during storage, and unfolds its proteolytic function only at the time of use. This can be controlled, for example, via appropriate accompanying substances such as protease inhibitors.
  • a preferred embodiment is any of those proteins, protein fragments, fusion proteins or derivatives characterized by having at least one antigenic determinant in common with one of the polypeptides of the invention described above.
  • a preferred embodiment are all such polypeptides according to the invention which have hitherto been carried out and which are characterized in that they are obtainable from a natural source, in particular from a microorganism.
  • These may be, for example, unicellular fungi or bacteria. Because they are usually easier to win and handle as multicellular organisms or cell cultures derived from multicellular organisms; although these may represent useful options for specific embodiments and thus are not excluded in principle from the subject invention.
  • Particularly preferred among these are those from gram-positive bacteria. Because they have no outer membrane and thus release secreted proteins directly into the surrounding medium.
  • Very particularly preferred are those from gram-positive bacteria of the genus Bacillus.
  • Bacillus proteases have from the outset favorable properties for various technical applications. These include some stability to elevated temperature, oxidizing or denaturing agents.
  • microbial proteases have the greatest experience in terms of their biotechnological production, for example the construction of favorable cloning vectors, the selection of host cells and growth conditions or the estimation of risks, such as allergenicity.
  • Bacilli are also established as production organisms with a particularly high production output in technical processes. The wealth of experience that has been acquired for the production and use of these proteases also benefits further developments of these enzymes according to the invention. This concerns, for example, their compatibility with other chemical compounds, such as the ingredients of detergents or cleaners.
  • Bacillus gibsonii in particular from the strain of Bacillus gibsonii used according to the invention, are preferred.
  • the embodiment of the enzyme according to the invention was originally obtained. Its associated sequences are given in the Sequence Listing. From this or related strains, the variants described above can be prepared in particular using standard molecular biological methods, such as PCR and / or per se known point mutagenesis method.
  • a further solution of the problem and thus a separate subject of the invention are the nucleic acids which serve to realize the invention.
  • a person skilled in the art will be able to prepare complete genes by known DNA and / or amino acid sequences via methods that are generally known today, such as, for example, chemical synthesis or the polymerase chain reaction (PCR) in conjunction with molecular biological and / or proteinchemical standard methods.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Such methods are known for example from the "Encyclopaedia of Biochemistry", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, Volume 1, pp. 267-271 and Volume 2, pp. 227-229. This is possible in particular if it is possible to fall back on a strain deposited in a master collection.
  • PCR primers which can be synthesized by means of a known sequence and / or isolated mRNA molecules, the relevant genes can be synthesized from such strains, cloned and, if desired, further processed, for example mutagenized.
  • Nucleic acids form the starting point of almost all molecular biological investigations and further developments as well as the production of proteins. These include, in particular, the sequencing of the genes and the derivation of the associated amino acid sequence, any type of mutagenesis (see above) and the expression of the proteins.
  • Mutagenesis for the development of proteins with specific properties is also referred to as "protein engineering”. Properties to be optimized have already been exemplified above. Such mutagenesis may be targeted or by random methods, for example, with subsequent activity-directed recognition and / or selection (screening and selection) on the cloned genes, such as hybridization with nucleic acid probes, or on the gene products, the proteins, be done about their activity.
  • the further development of the proteases according to the invention can also be carried out in particular in the "Protein engineering” publication by PNBryan (2000) in Biochim. Biophys. Ada, vol. 1543, pp. 203-222, are presented.
  • Another object of the present invention are therefore also polynucleotides encoding polypeptides according to the invention, in particular hydrolases, especially subtilisin-type alkaline proteases.
  • the present invention therefore relates in particular to polynucleotides selected from the group consisting of: a) polynucleotide having a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1, b) polynucleotide having a nucleic acid sequence from position 1 to 342 according to SEQ ID NO: 1, c) polynucleotide with a nucleic acid sequence from position 1 to 81 according to SEQ ID NO: 1, d) polynucleotide having a nucleic acid sequence from position 82 to 342 according to SEQ ID NO: 1, e) polynucleotide having a nucleic acid sequence from position 343 to 1152 according to SEQ ID NO: 1, f) polynucleotide encoding a polypeptide having an amino acid sequence according to
  • polynucleotide according to (b) or (d) with up to 25, preferably up to 22, 20, 18, 16 or 15, particularly preferably up to 14, 13, 12, 11 or 10, especially up to 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 or 2 mutations, most preferably with exactly one mutation, m) polynucleotides having a sequence homology or identity of at least 90%, preferably at least 91, 92, 93, 94 or 95%, more preferably at least 96, 97, 98 or 99%, with respect to a polynucleotide according to (a) or (e), n) polynucleotides having a sequence homology or identity of at least 93 %, preferably at least 94, 95 or 96%, particularly preferably at least 97, 98 or 99%, with respect to a polynucleotide according to (d), o) under stringent conditions with a polynucleotide according to (d), o) under stringent conditions with a polynucleotide according to
  • the polynucleotides may be present as a single strand or as a double strand.
  • Subject matter of the invention are, besides the deoxyribonucleic acids, also the homologous and complementary ribonucleic acids.
  • the present invention also relates, in particular, to those polynucleotides in which certain regions have been replaced by other regions, taking account of the differing codon usage of a host organism used for the expression, in order to enable the expression of the polypeptide according to the invention.
  • nucleic acids according to the invention described above are increasingly preferred among the nucleic acids according to the invention described above:
  • microorganism is a Gram-positive bacterium
  • Gram-positive bacterium is one of the genus Bacillus
  • Bacillus species Bacillus gibsonii in particular the strain used in the invention.
  • a separate subject of the invention are vectors which contain one of the previously described nucleic acid regions according to the invention, in particular one which codes for one of the polypeptides according to the invention designated above.
  • vectors are in great numbers and variation, both for the Cloning and for expression commercially available. These include, for example, vectors derived from bacterial plasmids, bacteriophages or viruses, or predominantly synthetic vectors. Furthermore, they are differentiated according to the type of cell types in which they are able to establish themselves, for example vectors for gram-negative, gram-positive bacteria, yeast or higher eukaryotes. They form suitable starting points for example for molecular biological and biochemical investigations and for the expression of the relevant gene or associated protein.
  • vectors of the invention are cloning vectors.
  • cloning vectors are suitable in addition to the storage, the biological amplification or the selection of the gene of interest for its molecular biological characterization. At the same time they represent transportable and storable forms of the claimed nucleic acids and are also starting points for molecular biological techniques that are not bound to cells, such as the PCR or / n-wfro mutagenesis method.
  • vectors according to the invention are expression vectors.
  • expression vectors are the basis for realizing the corresponding nucleic acids in biological production systems and thus to produce the associated proteins.
  • Preferred embodiments of this subject matter of the invention are expression vectors carrying genetic elements necessary for expression, for example the natural promoter originally located in front of this gene or a promoter from another organism. These elements can be arranged for example in the form of a so-called expression cassette. Alternatively, individual or all regulatory elements may also be provided by the respective host cell. With particular preference, the expression vectors are matched to the selected expression system, in particular the host cell (see below), with regard to further properties, for example the optimal copy number.
  • the expression vector contains as far as possible only the relevant gene as an insert and no larger 5 'or 3' noncoding regions.
  • Such inserts are obtained, for example, when the fragment obtained after statistical treatment of the chromosomal DNA of the starting strain with a restriction enzyme has been cut again after sequencing before integration into the expression vector.
  • An example of an expression vector is the vector pAWA22.
  • Other vectors are available to those skilled in the art and are commercially available in large numbers.
  • a separate subject of the invention are cells which contain a polynucleotide according to the invention after genetic engineering modification.
  • these cells contain the genetic information for the synthesis of a protein according to the invention.
  • these are to be understood as meaning those cells which have been provided with the nucleic acids according to the invention by methods known per se or which are derived from such cells.
  • suitable suitable host cells are those which can be cultivated relatively easily and / or yield high product yields.
  • This genetic information can either be extrachromosomally as a separate genetic element, ie be present in bacteria in plasmidaler localization or integrated into a chromosome.
  • the choice of a suitable system depends on issues such as the nature and duration of storage of the gene, or the organism or the type of mutagenesis or selection. For example, based on bacteriophages - and their specific host cells - the prior art described mutagenesis and selection processes for the development of detergent enzymes.
  • the polynucleotide according to the invention is preferably part of one of the above-described vectors according to the invention, in particular of a cloning or expression vector.
  • those cells are preferred which express a polypeptide of the invention and preferably secrete.
  • host cells that make up the proteins enable their biotechnological production.
  • all organisms that is prokaryotes, eukaryotes or cyanophyta, are suitable as host cells for protein expression.
  • host cells which can be genetically well handled, for example, the transformation with the expression vector, its stable establishment and the regulation of expression, for example, unicellular fungi or bacteria.
  • preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling. This concerns, for example, easy culturing, high growth rates, low demands on fermentation media and good production and Secretion rates for foreign proteins.
  • laboratory strains are selected which are aligned to the expression. Such are available commercially or via publicly available strain collections.
  • Each protein of the invention can thus be theoretically obtained from a variety of host organisms. From the abundance of various systems available in the prior art, the optimal expression systems for the individual case must be determined experimentally.
  • host cells which are themselves protease-negative and thus do not degrade proteins formed.
  • Preferred embodiments are those host cells which are regulatable in activity by virtue of corresponding genetic elements, for example by controlled addition of chemical compounds, by changing the culture conditions or depending on the respective cell density.
  • This controllable expression allows very economical production of the proteins of interest; It can be realized, for example, via a corresponding element on the relevant vector.
  • the gene, expression vector and host cell are matched to one another, which relates, for example, to the genetic elements required for expression (ribosome binding site, promoters, terminators) or the codon usage.
  • host cells which are bacteria.
  • bacteria are characterized by short generation times and low demands on the cultivation conditions. As a result, inexpensive methods can be established. In addition, bacteria have a wealth of experience in fermentation technology. For a specific production gram-negative or gram-positive bacteria may be suitable for a variety of reasons to be determined experimentally in individual cases, such as nutrient sources, product formation rate, time requirement, etc.
  • it is a gram-negative bacterium, in particular one of the genera Escherichia coli or Klebsiella, in particular strains of E. coli K12, E. coli B or Klebsiella planticola, and more particularly derivatives of the strains Escherichia coli BL21 (DE3 ) E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E coli XL-1 or Klebsiella planticola (Rf).
  • Gram-negative bacteria such as E. coli
  • a variety of proteins are secreted into the periplasmic space. This can be advantageous for special applications.
  • WO 01/81597 A1 discloses a method according to which it is achieved that gram-negative bacteria also eject the expressed proteins. Such a system is also suitable for the production of proteins according to the invention.
  • the Gram-negative bacteria which are mentioned as preferred are generally light, that is to say commercially or accessible via public strain collections and, in conjunction with other components which are likewise available in large numbers, such as vectors, can be optimized for specific production conditions.
  • it is a Gram-positive bacterium, in particular one of the genera Bacillus, Staphylococcus or Corynebacteria, more particularly of the species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii, B gibsonii, B. pumilus or ß. alcalophilus, Staphylococcus carnosus or Corynebacterium glutamicum.
  • gram-positive bacteria have the gram-negative compared to the fundamental difference, secreted proteins readily deliver into the nutrient medium surrounding the cells, from which, if desired, the expressed proteins according to the invention can be purified directly from the nutrient medium.
  • they are related or identical to most of the organisms of origin for technically important subtilisins and usually form even comparable subtilisins, so that they have a similar codon Usage and their protein synthesizer is naturally aligned accordingly.
  • a further advantage may be that a mixture of proteins according to the invention with the subtilisins formed endogenously by the host strains can be obtained by this process. Such a co-expression is also apparent from the application WO 91/02792. Should it not be desired, the protease genes naturally present in the host cell would have to be permanently or temporarily inactivated.
  • host cells which are eukaryotic cells, preferably of the genus Saccharomyces.
  • fungi such as Actinomycetes or even yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces.
  • Thermophilic fungal expression systems are presented, for example, in WO 96/02653 A1. Such are particularly suitable for the expression of temperature-resistant variants.
  • Modifications that eukaryotic systems perform, especially in connection with protein synthesis include, for example, the binding of low molecular weight compounds such as membrane anchors or oligosaccharides. Such oligosaccharide modifications may be desirable, for example, to reduce allergenicity.
  • coexpression with the enzymes naturally produced by such cells, such as cellulases may be advantageous.
  • An independent subject of the invention are processes for the preparation of a polypeptide according to the invention. This includes any method for producing a polypeptide of the invention described above, for example, chemical synthesis methods.
  • Embodiments of the present invention may also be cell-free expression systems in which protein biosynthesis is understood in vitro. All of the elements already described above can also be combined to form new methods for producing proteins according to the invention. It is conceivable for each protein according to the invention a variety of possible combinations of process steps, so that optimal procedures must be determined experimentally for each specific case.
  • nucleotide sequence has been adapted in one, preferably a plurality of codons to the codon usage of the host strain.
  • a separate subject of the invention are agents which contain the abovementioned polypeptides according to the invention.
  • compositions especially mixtures, formulations, solutions, etc., the utility of which is improved by addition of a protein of the invention described above, within the scope of the present invention.
  • these may be, for example, solid mixtures, for example powders with freeze-dried or encapsulated proteins, or gel or liquid agents.
  • Preferred formulations contain, for example, buffer substances, stabilizers, reaction partners and / or cofactors of the proteases and / or other ingredients synergistic with the proteases.
  • this appropriation is to be understood as the areas of application set out below. Further fields of application emerge from the prior art and are described, for example, in US Pat Handbook "Industrial Enzymes and their Applications" by H. UhNg, Wiley-Verlag, New York, 1998.
  • Possible fields of use here are, in particular, the use for obtaining or treating raw materials or intermediates in textile production, in particular for removing protective layers on fabrics, in particular wool or silk, and the use for the care of textiles, the natural fibers, in particular wool or silk, contain.
  • natural fibers such as wool or silk
  • the natural raw materials are treated with agents according to the invention which, for example, help to smooth the shingled surface structure based on protein structures and thus counteract entanglement.
  • the invention also relates to processes for the treatment of textile raw materials and for textile care, in which polypeptides according to the invention are used in at least one of the process steps.
  • processes for textile raw materials, fibers or textiles with natural constituents, in particular those with wool or silk may be, for example, processes in which materials for processing in textiles are prepared, for example for anti-fungal finishing, or, for example, for processes which enrich the cleaning of worn textiles with a nourishing component.
  • Another use according to the invention is the use of the polypeptides according to the invention in cosmetic agents.
  • This is understood to mean all types of cleansing and conditioning agents for human skin or hair, in particular cleansing agents.
  • the agent may also be a pharmaceutical agent depending on the purpose of use.
  • proteases also play a crucial role in the cell renewal process of the human skin (desquamation) (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venera /, Volume 71 (1991), pp. 471-474). Accordingly, proteases are also used as bioactive components in skin care agents to aid in the breakdown of desmosome structures that are increased in dry skin.
  • the use of subtilisin proteases with amino acid substitutions in the positions R99G / A / S, S154D / E and / or L211 D / E for cosmetic purposes is described, for example, in WO 97/07770 A1.
  • proteases according to the invention can be further developed via the corresponding point mutations.
  • proteases according to the invention in particular those which are controlled in their activity, for example after mutagenesis or by addition of corresponding substances interacting with them, are also suitable as active components in skin or hair cleansing or care preparations.
  • compositions according to the invention are shampoos, soaps, washing lotions, creams, peels and oral, dental or denture care agents mentioned.
  • these compositions may also contain constituents, as mentioned below for detergents and cleaners.
  • proteolytic enzymes for cosmetic purposes are also included in this subject matter, in particular in appropriate agents, such as shampoos, soaps or washing lotions, or in care products that are offered, for example in the form of creams. Also, the use in a peeling drug, or the use for its production is included in this article.
  • a particularly preferred subject according to the invention are detergents and cleaners containing polypeptides according to the invention. Because as in the embodiments of In the case of detergents and cleaners containing a protease which is preferred according to the invention, surprisingly, an increase in the washing power compared to agents with conventionally employed proteases could be ascertained.
  • the washing performance or the cleaning performance of a washing or cleaning agent is to be understood as meaning the effect which the agent in question has on the soiled articles, for example textiles or objects with hard surfaces.
  • Individual components of such agents, in particular the enzymes according to the invention are assessed with regard to their contribution to the washing or cleaning performance of the entire detergent or cleaning agent. It should be noted in particular that from the enzymatic properties of an enzyme can not be readily deduced to its contribution to the washing performance of an agent. Rather, in addition to the enzymatic activity, factors such as stability, substrate binding, binding to the items to be cleaned or interactions with other ingredients of the detergents or cleaning agents, in particular possible synergy effects in the removal of the contaminants, also play a role here.
  • Another object of the present invention are therefore detergents and cleaning agents, in particular surfactant and / or bleach-containing, containing a polypeptide of the invention.
  • the detergents and cleaning agents according to the invention may be any conceivable type of cleaning agent, both concentrates and agents to be used undiluted, for use on a commercial scale, in the washing machine or in hand washing or cleaning.
  • These include, for example, detergents for textiles, carpets, or natural fibers, for which according to the present invention the term laundry detergent is used.
  • laundry detergent includes, for example, dishwashing detergents for dishwashers or manual dishwashing detergents or cleaners for hard surfaces such as metal, glass, porcelain, ceramics, tiles, stone, painted surfaces, plastics, wood or leather; for such according to the present invention, the term cleaning agent is used.
  • sterilizing and disinfecting agents are to be regarded as detergents and cleaners in the sense of the invention.
  • Embodiments of the present invention include all of the prior art and / or all suitable administration forms of the washing or cleaning agents according to the invention. These include, for example, solid, powdery, liquid, gelatinous or pasty agents, optionally also of several phases, compressed or uncompressed; further include, for example: extrudates, granules, tablets or pouches, packed both in large containers and in portions.
  • the detergents or cleaners according to the invention contain the above-described polypeptides according to the invention, in particular alkaline subtilisin-type proteases, in an amount of from 2 ⁇ g to 20 mg, preferably from 5 ⁇ g to 17.5 mg, particularly preferably 20 ⁇ g to 15 mg, most preferably from 50 ⁇ g to 10 mg per gram of the agent. Included are all integer and non-integer values lying between these numbers.
  • protease activity in such agents can be determined by the method described in Tenside, Vol. 7 (1970), pp. 125-132. It is accordingly stated in PE (protease units).
  • a washing or cleaning agent according to the invention optionally contains further ingredients such as further enzymes, enzyme stabilizers, surfactants, for.
  • further ingredients such as further enzymes, enzyme stabilizers, surfactants, for.
  • surfactants for.
  • the nonionic surfactants used are preferably alkoxylated, advantageously ethoxylated, in particular primary, alcohols having preferably 8 to 18 carbon atoms and on average 1 to 12 moles of ethylene oxide (EO) per mole of alcohol, in which the alcohol radical is linear or preferably methyl-branched in the 2-position can, or may contain linear and methyl-branched radicals in the mixture, as they are usually present in Oxoalkoholresten.
  • alcohol ethoxylates with linear radicals of alcohols of native origin having 12 to 18 carbon atoms, for example of coconut, palm, tallow or oleyl alcohol, and on average 2 to 8 EO per mole of alcohol are preferred.
  • Preferred ethoxylated alcohols include, for example, C 2 - 14 alcohols with 3 EO or 4 EO, C 9 n-alcohol with 7 EO, C-ms alcohols containing 3 EO, 5 EO, 7 EO or 8 EO, C 12 -i 8 -alcohols with 3 EO, 5 EO or 7 EO and mixtures of these, such as mixtures of C 12 -i 4 -alcohol with 3 EO and C 12 -i 8 -alcohol with 5 EO.
  • the specified degrees of ethoxylation represent statistical averages that can be a whole or a fractional number for a particular product.
  • Preferred alcohol ethoxylates have a narrow homolog distribution (narrow rank ethoxylates, NRE).
  • NRE narrow rank ethoxylates
  • fatty alcohols with more than 12 EO can also be used. Examples of these are tallow fatty alcohol with 14 EO, 25 EO, 30 EO or 40 EO.
  • nonionic surfactants used either as the sole nonionic surfactant or in combination with other nonionic surfactants are alkoxylated, preferably ethoxylated or ethoxylated and propoxylated fatty acid alkyl esters, preferably having from 1 to 4 carbon atoms in the alkyl chain, especially fatty acid methyl esters.
  • alkyl polyglycosides Another class of nonionic surfactants that can be used to advantage are the alkyl polyglycosides (APG).
  • APG alkyl polyglycosides
  • Usable Alkypolyglycoside meet the general formula RO (G) Z , in which R is a linear or branched, especially in the 2-position methyl-branched, saturated or unsaturated, aliphatic radical having 8 to 22, preferably 12 to 18 carbon atoms and G is the symbol which is a glycose unit having 5 or 6 C atoms, preferably glucose.
  • the degree of glycosylation z is between 1, 0 and 4.0, preferably between 1, 0 and 2.0 and in particular between 1, 1 and 1, 4.
  • Preference is given to using linear alkyl polyglucosides that is to say alkyl polyglycosides in which the polyglycosyl radical is a glucose radical and the alkyl radical is an n-alkyl radical.
  • Nonionic surfactants of the amine oxide type for example N-cocoalkyl N, N-dimethylamine oxide and N-tallow alkyl N, N-dihydroxyethyl amine oxide, and the fatty acid alkanolamides may also be suitable.
  • the proportion of these nonionic surfactants is preferably not higher than that of the ethoxylated fatty alcohols, especially not more than half of them.
  • surfactants are polyhydroxy fatty acid amides of the formula (I)
  • RCO is an aliphatic acyl radical having 6 to 22 carbon atoms
  • R ⁇ is hydrogen
  • [Z] is a linear or branched polyhydroxyalkyl radical having 3 to 10 carbon atoms and 3 to 10 hydroxyl groups.
  • the polyhydroxy fatty acid amides are known substances which can usually be obtained by reductive amination of a reducing sugar with ammonia, an alkylamine or an alkanolamine and subsequent acylation with a fatty acid, a fatty acid alkyl ester or a fatty acid chloride.
  • the group of polyhydroxy fatty acid amides also includes compounds of the formula (II) R 1 -OR 2 R-CO-N- [Z] (II)
  • R is a linear or branched alkyl or alkenyl radical having 7 to 12 carbon atoms
  • R 1 is a linear, branched or cyclic alkyl radical or an aryl radical having 2 to 8 carbon atoms
  • R 2 is a linear, branched or cyclic alkyl radical or an aryl radical or an oxy-alkyl radical having 1 to 8 carbon atoms
  • Ci_ 4 alkyl or phenyl radicals are preferred
  • [Z] is a linear polyhydroxyalkyl radical whose alkyl chain is substituted with at least two hydroxyl groups, or alkoxylated, preferably ethoxylated or propoxylated derivatives thereof residue.
  • [Z] is preferably obtained by reductive amination of a reducing sugar, for example glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, mannose or xylose.
  • a reducing sugar for example glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, mannose or xylose.
  • the N-alkoxy- or N-aryloxy-substituted compounds can be converted into the desired polyhydroxy fatty acid amides, for example, by reaction with fatty acid methyl esters in the presence of an alkoxide as catalyst.
  • anionic surfactants for example, those of the sulfonate type and sulfates are used.
  • surfactants of the sulfonate type are preferably C 9 - 13 alkylbenzenesulfonates, olefin sulfonates, that is, mixtures of alkene and hydroxyalkanesulfonates and disulfonates, as they are for example from C
  • alkanesulfonates from C 2 - 18 are obtained, for example, alkanes by sulfochlorination or sulfoxidation and subsequent hydrolysis or neutralization.
  • the esters of CC are preferably C 9 - 13 alkylbenzenesulfonates, olefin sulfonates, that is, mixtures
  • Sulfo fatty acids for example the CC-sulfonated methyl esters of hydrogenated coconut, palm kernel or tallow fatty acids.
  • sulfated fatty acid glycerol esters are to be understood as meaning the mono-, di- and triesters and mixtures thereof, as obtained in the preparation by esterification of a monoglycerol with 1 to 3 moles of fatty acid or in the transesterification of triglycerides with 0.3 to 2 moles of glycerol.
  • Preferred sulfated fatty acid glycerol esters are the sulfonation products of saturated fatty acids having 6 to 22 carbon atoms, for example caproic acid, caprylic acid, capric acid, myristic acid, lauric acid, palmitic acid, stearic acid or behenic acid.
  • Alk (en) yl sulfates are the alkali and especially the sodium salts of the Schwefelhoffreraumester C 2 -C 8 fatty alcohols, for example coconut fatty alcohol, tallow fatty alcohol, lauryl, myristyl, cetyl or stearyl alcohol, or d 0 -C 2 o Oxo alcohols and those half esters secondary alcohols of these chain lengths are preferred. Also preferred are alk (en) ylsulfates of said chain length, which contain a synthetic, produced on a petrochemical basis straight-chain alkyl radical, which have an analogous degradation behavior as the adequate compounds based on oleochemical raw materials.
  • Ci 2 -Ci 6 alkyl sulfates and Ci 2 -Ci 5 alkyl sulfates and Ci 4 -Ci 5 alkyl sulfates are preferred.
  • 2,3-alkyl sulfates are also suitable anionic surfactants.
  • the sulfuric acid monoesters of straight-chain or branched C 7 ethoxylated with 1 to 6 moles of ethylene oxide are suitable.
  • 2 i-alcohols such as 2-methyl-branched Cg-n-alcohols having on average 3.5 mol of ethylene oxide (EO) or C 12 -i 8 -fatty alcohols having 1 to 4 EO, are suitable. Due to their high foaming behavior, they are only used in detergents in relatively small amounts, for example in amounts of up to 5% by weight, usually from 1 to 5% by weight.
  • Suitable anionic surfactants are also the salts of alkylsulfosuccinic acid, which are also referred to as sulfosuccinates or as sulfosuccinic acid esters and the monoesters and / or diesters of sulfosuccinic acid with alcohols, preferably fatty alcohols and in particular ethoxylated fatty alcohols.
  • alcohols preferably fatty alcohols and in particular ethoxylated fatty alcohols.
  • Preferred sulfosuccinates contain C 8 -i 8 -fatty alcohol residues or mixtures of these.
  • Particularly preferred sulfosuccinates contain a fatty alcohol radical which is derived from ethoxylated fatty alcohols, which in themselves constitute nonionic surfactants (description see above).
  • Sulfosuccinates whose fatty alcohol residues are derived from ethoxylated fatty alcohols with a narrow homolog distribution, are again particularly preferred.
  • alk (en) ylsuccinic acid having preferably 8 to 18 carbon atoms in the alk (en) yl chain or salts thereof.
  • anionic surfactants are particularly soaps into consideration.
  • Suitable are saturated fatty acid soaps, such as the salts of lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, hydrogenated erucic acid and behenic acid and, in particular, soap mixtures derived from natural fatty acids, for example coconut, palm kernel or tallow fatty acids.
  • the anionic surfactants may be in the form of their sodium, potassium or ammonium salts and as soluble salts of organic bases, such as mono-, di- or triethanolamine.
  • the anionic surfactants are preferably present in the form of their sodium or potassium salts, in particular in the form of the sodium salts.
  • the surfactants may be contained in the detergents or detergents according to the invention overall in an amount of preferably from 5% by weight to 50% by weight, in particular from 8% by weight to 30% by weight, based on the finished composition ,
  • Detergents or cleaners according to the invention may contain bleaches.
  • bleaches include the compounds which serve as bleaches and deliver H 2 O 2 in water, the sodium percarbonate, the sodium perborate tetrahydrate and the sodium perborate monohydrate are of particular importance.
  • Other useful bleaching agents are, for example, peroxopyrophosphates, citrate perhydrates and H 2 O 2 -producing peracidic salts or peracids, such as persulfates or persulfuric acid.
  • the urea peroxohydrate percarbamide represented by the formula H 2 N-CO-NH 2 2 O 2 can be described H.
  • the means for cleaning hard surfaces for example in automatic dishwashing, they may, if desired, also contain bleaching agents from the group of organic bleaches, although their use is also possible in principle for laundry detergents.
  • Typical organic bleaches are the diacyl peroxides, such as dibenzoyl peroxide.
  • Other typical organic bleaches are the peroxyacids, examples of which include the alkyl peroxyacids and the aryl peroxyacids.
  • Preferred representatives are the peroxybenzoic acid and its ring-substituted derivatives, such as alkylperoxybenzoic acids, but also peroxy- ⁇ -naphthoic acid and magnesium monoperphthalate, the aliphatic or substituted aliphatic peroxyacids, such as peroxylauric acid, peroxystearic acid, ⁇ -phthalimidoperoxycaproic acid (Phthalimidoperoxyhexanoic acid, PAP), o-carboxybenzamidoperoxycaproic acid, N-nonenylamidoperadipic acid and N-nonylamidopersuccinates, and aliphatic and araliphatic peroxydicarboxylic acids, such as 1, 12-diperoxycarboxylic acid, 1, 9-diperoxyazelaic acid, diperoxysebacic acid, diperoxybrassic acid, the diperoxyphthalic acids, 2-decyldiperoxybutane-1,4-d
  • the content of bleach detergent or cleaning agent may be from 1 to 40% by weight and in particular from 10 to 20% by weight, with perborate monohydrate or percarbonate being advantageously used.
  • the agents may also contain bleach activators.
  • bleach activators it is possible to use compounds which, under perhydrolysis conditions, give aliphatic peroxycarboxylic acids having preferably 1 to 10 C atoms, in particular 2 to 4 C atoms, and / or optionally substituted perbenzoic acid. Suitable substances are those which carry O- and / or N-acyl groups of the stated C atom number and / or optionally substituted benzoyl groups.
  • polyacylated alkylenediamines in particular tetraacetylethylenediamine (TAED), acylated triazine derivatives, in particular 1,5-diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazine (DADHT), acylated glycolurils, in particular 1, 3,4,6 Tetraacetylglycoluril (TAGU), N-acylimides, in particular N-nonanoylsuccinimide (NOSI), acylated phenolsulfonates, in particular n-nonanoyl or isononanoyloxybenzenesulfonate (n- or iso-NOBS), acylated hydroxycarboxylic acids, such as triethyl-O-acetylcitrate (TEOC), Carboxylic acid anhydrides, in particular phthalic anhydride, isatoic anhydride and / or succinic
  • hydrophilic substituted acyl acetals known from the German patent application DE 196 16 769 and the acyllactams described in the German patent application DE 196 16 770 and the international patent application WO 95/14075 are also preferably used.
  • the combinations of conventional bleach activators known from German patent application DE 44 43 177 can also be used.
  • nitrile derivatives such as cyanopyridines, nitrile quats, for example N-alkylammonium acetonitriles, and / or cyanamide derivatives can be used.
  • Preferred bleach activators are sodium 4- (octanoyloxy) benzenesulfonate, n-nonanoyl or isononanoyloxybenzenesulfonate (n- or iso-NOBS), undecenoyloxybenzenesulfonate (UDOBS), sodium dodecanoyloxybenzenesulfonate (DOBS), decanoyloxybenzoic acid (DOBA, OBC 10) and / or Dodecanoyloxybenzenesulfonate (OBS 12), as well as N-methylmorpholinum acetonitrile (MMA).
  • Such bleach activators can be used in the customary amount range of from 0.01 to 20% by weight, preferably in amounts of from 0.1 to 15% by weight, in particular from 1% to 10% by weight, based on the total composition, be included.
  • bleach catalysts may also be included.
  • These substances are bleach-enhancing transition metal salts or transition metal complexes such as Mn, Fe, Co, Ru or Mo-salene complexes or carbonyl complexes.
  • Mn, Fe, Co, Ru, Mo, Ti, V and Cu complexes with N-containing tripod ligands and also Co, Fe, Cu and Ru ammine complexes are suitable as bleach catalysts, wherein such compounds are preferably used, which are described in DE 19709284 A1.
  • Detergents or cleaners according to the invention generally comprise one or more builders, in particular zeolites, silicates, carbonates, organic cobuilders and, where there are no ecological reasons against their use, also the phosphates.
  • builders in particular zeolites, silicates, carbonates, organic cobuilders and, where there are no ecological reasons against their use, also the phosphates.
  • the latter are particularly preferred builders to be used in automatic dishwashing detergents.
  • crystalline, layered sodium silicates of the general formula NaMSi x O 2x + I yH 2 O, where M is sodium or hydrogen, x is a number from 1, 6 to 4, preferably 1, 9 to 4.0 and y is a number from 0 to 20 and preferred values for x are 2, 3 or 4.
  • M sodium or hydrogen
  • x is a number from 1, 6 to 4, preferably 1, 9 to 4.0
  • y is a number from 0 to 20 and preferred values for x are 2, 3 or 4.
  • Preferred crystalline layered silicates of the formula given are those in which M is sodium and x assumes the values 2 or 3.
  • both ⁇ - and ⁇ -sodium disilicates Na 2 Si 2 O 5 YH 2 O are preferred.
  • Such compounds are commercially available, for example, under the name SKS® (Clariant company).
  • SKS-6 ® is a ⁇ -sodium having the formula Na 2 Si 2 O 5 ⁇ yH 2 O
  • SKS-7 ® is predominantly a beta-sodium disilicate.
  • acids for example citric acid or carbonic acid
  • SKS- 9® or SKS- 10® is formed from the ⁇ -sodium disilicate.
  • SKS- 10® commercially available under the name SKS- 9® or SKS- 10® (Clariant)
  • the alkalinity of the layered silicates can be suitably influenced.
  • Phyllosilicates doped with phosphate or with carbonate have altered crystal morphologies in comparison with the ⁇ -sodium disilicate, dissolve more rapidly and show an increased calcium binding capacity in comparison with ⁇ -sodium disilicate.
  • phyllosilicates of the general empirical formula x Na 2 O • y SiO 2 • z P 2 O 5 in which the ratio x to y is a number 0.35 to 0.6, the ratio x to z a number from 1, 75 to 1200 and the ratio y to z correspond to a number from 4 to 2800, described in the patent application DE 196 01 063.
  • the solubility of the layered silicates can also be increased by using particularly finely divided layered silicates.
  • compounds from the crystalline layer silicates with other ingredients can be used.
  • compounds with cellulose derivatives which have advantages in the disintegrating effect and are used in particular in detergent tablets and compounds with polycarboxylates, for example citric acid, or polymeric polycarboxylates, for example copolymers of acrylic acid, may be mentioned.
  • amorphous sodium silicates with a Na 2 O: SiO 2 modulus of from 1: 2 to 1: 3.3, preferably from 1: 2 to 1: 2.8 and in particular from 1: 2 to 1: 2.6, which Delayed and have secondary washing properties.
  • the dissolution delay compared to conventional amorphous sodium silicates may have been caused in various ways, for example by surface treatment, compounding, compacting / compacting or by overdrying.
  • the term "amorphous" is also understood to mean "X-ray amorphous”.
  • the silicates do not yield sharp X-ray reflections typical of crystalline substances in X-ray diffraction experiments, but at most one or more maxima of the scattered X-rays having a width of several degrees of diffraction angle. However, it may well even lead to particularly good builder properties if the silicate particles provide blurred or even sharp diffraction maxima in electron diffraction experiments. This is to be interpreted as meaning that the products have microcrystalline regions of size 10 to a few hundred nm, values of up to max. 50 nm and in particular up to max. 20 nm are preferred. Particularly preferred compacted / compacted amorphous silicates, compounded amorphous silicates and overdried X-ray amorphous silicates.
  • An optionally usable, finely crystalline, synthetic and bound water-containing zeolite is preferably zeolite A and / or P.
  • zeolite P zeolite MAP ® (commercial product from Crosfield) is particularly preferred.
  • zeolite X and mixtures of A, X and / or P are particularly preferred.
  • Commercially available and preferably usable in the context of the present invention is, for example, a cocrystal of zeolite X and zeolite A (about 80% by weight of zeolite X) ), which is sold by the company CONDEA Augusta SpA under the brand name VEGOBOND AX ® and by the formula
  • Suitable zeolites have an average particle size of less than 10 ⁇ m (volume distribution, measuring method: Coulter Counter) and preferably contain 18 to 22% by weight, in particular 20 to 22% by weight, of bound water.
  • phosphates as builders are possible, unless such use should not be avoided for environmental reasons.
  • alkali metal phosphates with particular preference of pentasodium or pentakalium triphosphate (sodium or potassium tripolyphosphate) in the washing and cleaning industry have the greatest importance.
  • Alkali metal phosphates is the summary term for the alkali metal (especially sodium and potassium) salts of various phosphoric acids, in which one can distinguish metaphosphoric acids (HPO 3 ) n and orthophosphoric H 3 PO 4 in addition to higher molecular weight representatives.
  • the phosphates combine several advantages: they act as alkali carriers, prevent lime deposits on machine parts or lime incrustations in fabrics and also contribute to the cleaning performance.
  • Sodium dihydrogen phosphate, NaH 2 PO 4 exists as dihydrate (density 1, 91 like 3 , melting point 60 °) and as monohydrate (density 2.04 like 3 ). Both salts are white powders which are very slightly soluble in water and which lose the water of crystallization when heated and at 200 ° C. into the weak acid diphosphate (disodium hydrogen diphosphate, Na 2 H 2 P 2 O 7 ), at higher temperature in sodium trimetaphosphate (Na 3 P 3 O 9 ) and Maddrell's salt (see below).
  • NaH 2 PO 4 is acidic; It arises when phosphoric acid is adjusted to a pH of 4.5 with sodium hydroxide solution and the mash is sprayed.
  • Potassium dihydrogen phosphate (primary or monobasic potassium phosphate, potassium biphosphate, KDP), KH 2 PO 4 , is a white salt of density 2.33, like '3 a melting point of 253 0 C [decomposition to form potassium polyphosphate (KPO 3 ) J and is readily soluble in water.
  • Disodium hydrogen phosphate (secondary sodium phosphate), Na 2 HPO 4 , is a colorless, very slightly water-soluble crystalline salt. It exists anhydrous and with 2 mol. (Density 2.066 like '3 , loss of water at 95 °), 7 mol. (Density 1, 68 like “3 , melting point 48 0 C with loss of 5 H 2 O) and 12 mol (Density 1, 52 like "3 , melting point 35 0 C with loss of 5 H 2 O), becomes anhydrous at 100 ° C and goes on stronger heating in the diphosphate Na 4 P 2 O 7 .
  • Disodium hydrogen phosphate is prepared by neutralization of phosphoric acid with soda solution using phenolphthalein as an indicator.
  • Dipotassium hydrogen phosphate (secondary or dibasic potassium phosphate), K 2 HPO 4 , is an amorphous, white salt that is readily soluble in water.
  • Triphosphate tertiary or tribasic potassium phosphate
  • K 3 PO 4 is a white, deliquescent, granular powder with a density of 2.56 '3 , has a melting point of 1340 ° and is in water with alkaline Reaction slightly soluble, for example, when heating Thomas slag with coal and potassium sulphate Despite the higher price, in the detergent industry, the more soluble, therefore highly effective, potassium phosphates often preferred over corresponding sodium compounds.
  • Tetrasodium diphosphate (sodium pyrophosphate), Na 4 P 2 O 7 , exists in anhydrous form (density 2.534 '3 , melting point 988 0 C, also indicated 88O 0 C) and as decahydrate (density 1, 815-1, 836 like "3 , melting point 94 0 C with loss of water). Both substances are colorless crystals which dissolve in water with an alkaline reaction, crystals.
  • Na 4 P 2 O 7 is formed when disodium phosphate is heated to> 200 ° C, or by reacting phosphoric acid with soda in a stoichiometric ratio and the solution
  • the decahydrate complexes heavy metal salts and hardness agents and therefore reduces the hardness of the water.
  • Kali diphosphate potassium pyrophosphate
  • K 4 P 2 O 7 exists in the form of the trihydrate and produces a colorless, hygroscopic powder with a density of 2.33 like '3 , which is soluble in water, wherein the pH of the 1% solution at 25 0 C is 10.4.
  • Condensation of the NaH 2 PO 4 or of the KH 2 PO 4 gives rise to relatively high molecular weight sodium and potassium phosphates, in which cyclic representatives, the sodium or potassium metaphosphates and chain-type, the sodium or potassium polyphosphates, can be distinguished. Especially for the latter are a variety of Names in use: Melted or calcined phosphates, Graham's salt, Kurrolsches and Maddrell's salt. All higher sodium and potassium phosphates are collectively referred to as condensed phosphates.
  • pentasodium triphosphate Na 5 P 3 Oi 0 , sodium tripolyphosphate
  • n 3.
  • 100 g of water at room temperature dissolve about 17 g, at 6O 0 C about 20 g, at 100 0 C, about 32 g of the salt water-free salt; after two hours of heating the solution to 100 0 C caused by hydrolysis about 8% orthophosphate and 15% diphosphate.
  • pentasodium triphosphate In the preparation of pentasodium triphosphate, phosphoric acid is reacted with soda solution or sodium hydroxide solution in a stoichiometric ratio and the solution is dehydrated by spraying. Similar to Graham's salt and sodium diphosphate, pentasodium triphosphate dissolves many insoluble metal compounds (including lime soaps, etc.). Pentakaliumtriphosphat, K 5 P 3 O 10 (potassium tripolyphosphate), for example, in the form of a 50 wt .-% solution (> 23% P 2 O 5 , 25% K 2 O) in the trade. The potassium polyphosphates are widely used in the washing and cleaning industry. There are also sodium potassium tripolyphosphates which can also be used in the context of the present invention. These arise, for example, when hydrolyzed sodium trimetaphosphate with KOH:
  • organic cobuilders it is possible in particular to use in the detergents and cleaners according to the invention polycarboxylates or polycarboxylic acids, polymeric polycarboxylates, polyaspartic acid, polyacetals, optionally oxidized dextrins, further organic cobuilders (see below) and phosphonates. These classes of substances are described below.
  • Useful organic builder substances are, for example, the polycarboxylic acids which can be used in the form of their sodium salts, polycarboxylic acids meaning those carboxylic acids which carry more than one acid function. These are, for example, citric acid, adipic acid, succinic acid, glutaric acid, malic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, sugar acids, aminocarboxylic acids, nitrilotriacetic acid (NTA), if such use can not be avoided for ecological reasons, and mixtures of these.
  • Preferred salts are the salts of polycarboxylic acids such as citric acid, adipic acid, succinic acid, glutaric acid, tartaric acid, sugar acids and mixtures thereof.
  • the acids themselves can also be used. In addition to their builder effect, they also typically have the property of an acidifying component and thus also serve to set a lower and milder pH of detergents or cleaners, unless the pH resulting from the mixture of the other components is desired.
  • system and environmentally compatible acids such as citric acid, acetic acid, tartaric acid, malic acid, lactic acid, glycolic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, gluconic acid and any mixtures of these are to be mentioned.
  • mineral acids, in particular sulfuric acid or bases, in particular ammonium or alkali hydroxides can serve as pH regulators.
  • Such regulators are contained in the agents according to the invention in amounts of preferably not more than 20% by weight, in particular from 1.2% by weight to 17% by weight.
  • polymeric polycarboxylates for example the alkali metal salts of polyacrylic acid or of polymethacrylic acid, for example those having a relative molecular weight of 500 to 70,000 g / mol.
  • the molecular weights stated for polymeric polycarboxylates are weight-average molar masses M w of the particular acid form, which were determined in principle by means of gel permeation chromatography (GPC), a UV detector being used. The measurement was carried out against an external polyacrylic acid standard, which provides realistic molecular weight values due to its structural relationship with the polymers investigated. These data differ significantly from the molecular weight data, in which polystyrene sulfonic acids are used as standard. The molar masses measured against polystyrenesulfonic acids are generally significantly higher than the molecular weights specified in this document.
  • Suitable polymers are in particular polyacrylates, which preferably have a molecular weight of from 2,000 to 20,000 g / mol. Because of their superior solubility, the short-chain polyacrylates, which have molecular weights of from 2,000 to 10,000 g / mol, and particularly preferably from 3,000 to 5,000 g / mol, may again be preferred from this group.
  • copolymeric polycarboxylates in particular those of acrylic acid with methacrylic acid and of acrylic acid or methacrylic acid with maleic acid.
  • Copolymers of acrylic acid with maleic acid which contain 50 to 90% by weight of acrylic acid and 50 to 10% by weight of maleic acid have proven to be particularly suitable.
  • Their relative molecular weight, based on free acids, is generally from 2,000 to 70,000 g / mol, preferably from 20,000 to 50,000 g / mol and in particular from 30,000 to 40,000 g / mol.
  • the (co) polymeric polycarboxylates can be used either as a powder or used as an aqueous solution.
  • the content of the (co) polymeric polycarboxylates may be from 0.5 to 20% by weight, in particular from 1 to 10% by weight.
  • the polymers may also contain allylsulfonic acids such as allyloxybenzenesulfonic acid and methallylsulfonic acid as a monomer.
  • biodegradable polymers of more than two different monomer units for example those which contain as monomers salts of acrylic acid and maleic acid and vinyl alcohol or vinyl alcohol derivatives or as monomers salts of acrylic acid and 2-alkylallylsulfonic acid and sugar derivatives.
  • copolymers are those which have as monomers preferably acrolein and acrylic acid / acrylic acid salts or acrolein and vinyl acetate.
  • polymeric aminodicarboxylic acids their salts or their precursors.
  • polyaspartic acids or their salts and derivatives are particularly preferred.
  • polyacetals which can be obtained by reacting dialdehydes with polyolcarboxylic acids which have 5 to 7 C atoms and at least 3 hydroxyl groups.
  • Preferred polyacetals are obtained from dialdehydes such as glyoxal, glutaraldehyde, terephthalaldehyde and mixtures thereof and from polyol carboxylic acids such as gluconic acid and / or glucoheptonic acid.
  • dextrins for example oligomers or polymers of carbohydrates, which can be obtained by partial hydrolysis of starches.
  • the hydrolysis can be carried out by customary, for example acid or enzyme catalyzed processes.
  • it is hydrolysis products having average molecular weights in the range of 400 to 500 000 g / mol.
  • a polysaccharide with a dextrose equivalent (DE) in the range from 0.5 to 40, in particular from 2 to 30 is preferred, DE being a customary measure of the reducing action of a polysaccharide in comparison to dextrose, which is a DE of 100 has.
  • DE dextrose equivalent
  • Both maltodextrins with a DE of between 3 and 20 and dry glucose syrups with a DE of between 20 and 37 and also yellow dextrins and white dextrins with relatively high molecular weights in the range from 2 000 to 30 000 g / mol are useful.
  • oxidized derivatives of such dextrins are their reaction products with oxidizing agents which are capable of oxidizing at least one alcohol function of the saccharide ring to the carboxylic acid function.
  • oxidizing agents which are capable of oxidizing at least one alcohol function of the saccharide ring to the carboxylic acid function.
  • Particularly preferred organic builders for inventive Agents are oxidized starches, or their derivatives from the applications EP 472042, WO 97/25399, and EP 755944.
  • Ethylenediamine-N, N'-disuccinate is preferably used in form of its sodium or magnesium salts. Also preferred in this context are glycerol disuccinates and glycerol trisuccinates. Suitable amounts are in zeolith-, carbonate and / or silicate-containing formulations between 3 and 15 wt .-%.
  • organic cobuilders are, for example, acetylated hydroxycarboxylic acids or their salts, which may optionally also be present in lactone form and which contain at least 4 carbon atoms and at least one hydroxyl group and a maximum of two acid groups.
  • phosphonates are, in particular, hydroxyalkane or aminoalkanephosphonates.
  • hydroxyalkane phosphonates 1-hydroxyethane-1,1-diphosphonate (HEDP) is of particular importance as a co-builder. It is preferably used as the sodium salt, the disodium salt neutral and the tetrasodium salt alkaline (pH 9).
  • Preferred aminoalkane phosphonates are ethylenediamine tetramethylene phosphonate (EDTMP), diethylene triamine pentamethylene phosphonate (DTPMP) and their higher homologs. They are preferably in the form of neutral sodium salts, eg. B.
  • the builder used here is preferably HEDP from the class of phosphonates.
  • the aminoalkanephosphonates also have a pronounced heavy metal binding capacity. Accordingly, in particular if the agents also contain bleach, it may be preferable to use aminoalkanephosphonates, in particular DTPMP, or to use mixtures of the phosphonates mentioned.
  • Builder substances may optionally be present in the detergents or cleaners according to the invention in amounts of up to 90% by weight. They are preferably contained in amounts of up to 75% by weight. Detergents according to the invention have builder contents of, in particular, from 5% by weight to 50% by weight. In agents according to the invention for the cleaning of hard surfaces, in particular for the automated cleaning of dishes, the content of builder substances is in particular from 5% by weight to 88% by weight, wherein preferably no water-insoluble builder materials are used in such agents.
  • inventive means for the particular machine cleaning of dishes are 20 wt .-% to 40 wt .-% of water-soluble organic builder, in particular alkali, 5 wt .-% to 15 wt .-% alkali carbonate and 20 wt .-% to 40 wt .-% Alkalidisilikat included.
  • Solvents that can be used in the liquid to gelatinous compositions of detergents and cleaners for example, from the group of monohydric or polyhydric alcohols, alkanolamines or glycol ethers, provided that they are miscible in the specified concentration range with water.
  • the solvents are preferably selected from ethanol, n- or i-propanol, butanols, ethylene glycol methyl ether, ethylene glycol ethyl ether, ethylene glycol propyl ether, ethylene glycol mono-n-butyl ether, diethylene glycol methyl ether, diethylene glycol ethyl ether, propylene glycol methyl, -ethyl or -propyl ether, dipropylene glycol monomethyl, or -ethyl ether, di-isopropylene glycol monomethyl, or -ethyl ether, methoxy, ethoxy or Butoxytriglykol, 1-butoxyethoxy-2-propanol, 3-methyl-3-methoxybutanol, propylene glycol t-butyl ether and mixtures of these solvents.
  • Solvents may be used in the liquid to gelled detergents and cleaners according to the invention in amounts of between 0.1 and 20% by weight, but preferably below 15% by weight and in particular below 10% by weight.
  • one or more thickeners or thickening systems can be added to the composition according to the invention.
  • These high-molecular substances which are also called swelling agents, usually absorb the liquids and swell up to finally pass into viscous true or colloidal solutions.
  • Suitable thickeners are inorganic or polymeric organic compounds.
  • the inorganic thickeners include, for example, polysilicic acids, clay minerals such as montmorillonites, zeolites, silicas and bentonites.
  • the organic thickeners are derived from the groups of natural polymers, modified natural polymers and fully synthetic polymers.
  • Such naturally derived polymers include, for example, agar-agar, carrageenan, tragacanth, gum arabic, alginates, pectins, polyoses, guar gum, locust bean gum, starch, dextrins, gelatin and casein.
  • Modified natural products, which are used as thickeners come mainly from the group of modified starches and celluloses.
  • Fully synthetic thickeners are polymers such as polyacrylic and polymethacrylic compounds, vinyl polymers, polycarboxylic acids, polyethers, polyimines, polyamides and polyurethanes.
  • the thickeners may be present in an amount of up to 5% by weight, preferably from 0.05 to 2% by weight, and more preferably from 0.1 to 1.5% by weight, based on the finished composition .
  • the washing and cleaning agent according to the invention may optionally contain further conventional ingredients sequestering agent, electrolyte and other auxiliaries, such as optical brighteners, grayness inhibitors, silver corrosion inhibitors, dye transfer inhibitors, foam inhibitors, abrasives, dyes and / or fragrances, as well as microbial active ingredients, UV-absorbents and / or enzyme stabilizers.
  • Detergents according to the invention may contain, as optical brighteners, derivatives of diaminostilbenedisulfonic acid or their alkali metal salts.
  • derivatives of diaminostilbenedisulfonic acid or their alkali metal salts for example, salts of 4,4'-bis (2-anilino-4-morpholino-1, 3,5-triazinyl-6-amino) stilbene-2,2'-disulphonic acid or similarly constructed compounds which are substituted for the morpholino Group carry a diethanolamino group, a methylamino group, an anilino group or a 2-methoxyethylamino group.
  • brighteners of the substituted diphenylstyrene type may be present, for example the alkali metal salts of 4,4'-bis (2-sulfostyryl) -diphenyl, 4,4'-bis (4-chloro-3-sulfostyryl) -diphenyl, or 4- (4-chlorostyryl) -4 '- (2-sulfostyryl) -diphenyls.
  • Mixtures of the aforementioned optical brightener can be used.
  • Graying inhibitors have the task of keeping suspended from the textile fiber dirt suspended in the fleet.
  • Water-soluble colloids of mostly organic nature are suitable for this purpose, for example starch, glue, gelatin, salts of ether carboxylic acids or ether sulfonic acids of starch or of cellulose or salts of acidic sulfuric acid esters of cellulose or starch.
  • water-soluble polyamides containing acidic groups are suitable for this purpose.
  • starch derivatives can be used, for example aldehyde starches.
  • cellulose ethers such as carboxymethylcellulose (Na salt), methylcellulose, hydroxyalkylcellulose and mixed ethers, such as methylhydroxyethylcellulose, methylhydroxypropylcellulose, methylcarboxymethylcellulose and mixtures thereof, for example in amounts of from 0.1 to 5% by weight, based on the compositions ,
  • silver corrosion inhibitors can be used in dishwashing detergents according to the invention.
  • dishwashing detergents Such are known in the art, for example benzotriazoles, iron (III) chloride or CoSO 4 .
  • benzotriazoles iron (III) chloride
  • CoSO 4 a silver corrosion inhibitor for use in conjunction with enzymes
  • particularly suitable silver corrosion inhibitors for use in conjunction with enzymes are manganese, titanium, zirconium, hafnium, vanadium, cobalt or cerium salts and / or complexes where the said metals are present in one of the oxidation states II, III, IV, V or VI.
  • Examples of such compounds are MnSO 4 , V 2 O 5 , V 2 O 4 , VO 2 , TiOSO 4 , K 2 TiF 6 , K 2 ZrF 6 , Co (NO 3 ) 2 , Co (NO 3 ) 3 , and the like mixtures.
  • soil-release or “soil repellents” are mostly polymers which impart soil repellency when used in a laundry detergent detergent and / or aid in the soil release performance of the other detergent ingredients. A similar effect can also be observed in their use in hard surface cleaners.
  • Particularly effective and long-known soil release agents are copolyesters with dicarboxylic acid, alkylene glycol and polyalkylene glycol units. Examples of these are copolymers or copolymers of polyethylene terephthalate and polyoxyethylene glycol (DT 16 17 141, or DT 22 00 911).
  • German Offenlegungsschrift DT 22 53 063 acidic agents which contain, inter alia, a copolymer of a dibasic carboxylic acid and an alkylene or cycloalkylene polyglycol.
  • Polymers of ethylene terephthalate and polyethylene oxide terephthalate and their use in detergents are described in German patents DE 28 57 292 and DE 33 24 258 and European patent EP 0 253 567.
  • European patent EP 066 944 relates to compositions containing a copolyester of ethylene glycol, polyethylene glycol, aromatic dicarboxylic acid and sulfonated aromatic dicarboxylic acid in certain molar ratios.
  • European Patent EP 0 185 427 discloses methyl or ethyl end-capped polyesters having ethylene and / or propylene terephthalate and polyethylene oxide terephthalate units and detergents containing such soil release polymer.
  • European patent EP 0 241 984 relates to a polyester which, besides oxyethylene groups and terephthalic acid units, also contains substituted ethylene units and also glycerine units.
  • European Patent EP 0 241 985 discloses polyesters which, in addition to oxyethylene groups and terephthalic acid units, contain 1, 2-propylene, 1, 2-butylene and / or 3-methoxy-1, 2-propylene groups and also glycerol units and with d - Are capped to C 4 alkyl groups.
  • European Patent EP 0 274 907 describes sulfoethyl end-capped terephthalate-containing soil release polyesters. According to the European patent application EP 0 357 280, by sulfonation of unsaturated terminal groups, soil-release polyesters containing terephthalate, alkylene glycol and poly-C 2 - 4 prepared glycol units.
  • International Patent Application WO 95/32232 relates to acidic, aromatic soil release polymers.
  • WO 97/31085 discloses non-polymeric soil repellent active ingredients for multi-functional cotton materials: a first entity, which may be cationic, for example, is capable of adsorption to the cotton surface by electrostatic interaction, and a second Unit that is hydrophobic is responsible for the retention of the drug at the water / cotton interface.
  • the color transfer inhibitors which are suitable for use in textile detergents according to the invention include in particular polyvinylpyrrolidones, polyvinylimidazoles, polymeric N-oxides such as poly (vinylpyridine-N-oxide) and copolymers of vinylpyrrolidone with vinylimidazole.
  • foam inhibitors When used in automated cleaning processes, it may be advantageous to add foam inhibitors to the agents concerned.
  • foam inhibitors are, for example, soaps of natural or synthetic origin, which have a high proportion of Ci 8 -C 24 fatty acids.
  • Suitable non-surfactant foam inhibitors are, for example, organopolysiloxanes and mixtures thereof with microfine, optionally signed silica and paraffins, waxes, microcrystalline waxes and mixtures thereof with signed silica or bistearylethylenediamide. It is also advantageous to use mixtures of various foam inhibitors, for example those of silicones, paraffins or waxes.
  • the foam inhibitors in particular silicone and / or paraffin-containing foam inhibitors, are bound to a granular, water-soluble, or dispersible carrier substance.
  • a granular, water-soluble, or dispersible carrier substance In particular, mixtures of paraffins and bistearylethylenediamides are preferred.
  • a hard surface cleaning agent according to the invention may contain abrasive constituents, in particular from the group comprising quartz flours, wood flours, plastic flours, chalks and glass microspheres and mixtures thereof.
  • Abrasives are preferably present in the detergents according to the invention in an amount of not more than 20% by weight, in particular in an amount of from 5 to 15% by weight.
  • Dyes and fragrances are added to detergents and cleaners in order to improve the aesthetic appearance of the products and to provide the consumer with a visually and sensory "typical and unmistakable" product in addition to the washing and cleaning performance.
  • perfume oils or fragrances individual perfume compounds, for example the synthetic products of the ester type, ethers, aldehydes, ketones, alcohols and hydrocarbons can be used.
  • Fragrance compounds of the ester type are, for example, benzyl acetate, phenoxyethyl isobutyrate, p-tert-butylcyclohexyl acetate, linalyl acetate, dimethylbenzylcarbinyl acetate, phenylethyl acetate, linalyl benzoate, benzyl formate, ethylmethylphenyl glycinate, allylcyclohexyl propionate, styrallyl propionate and benzyl salicylate.
  • the ethers include, for example, benzyl ethyl ether, to the aldehydes, for example, the linear alkanals having 8-18 C atoms, citral, citronellal, citronellyloxyacetaldehyde, cyclamen aldehyde, hydroxycitronellal, lilial and bourgeonal, to the ketones, for example, the ionone, ⁇ -lsomethylionon and methyl cedryl ketone, to the alcohols anethole, citronellol, eugenol, geraniol, linalool, phenylethyl alcohol and terpineol, the hydrocarbons include mainly the terpenes such as limonene and pinene.
  • fragrance oils may also contain natural fragrance mixtures such as are available from vegetable sources, for example, pine, citrus, jasmine, patchouly, rose or ylang-ylang oil. Also suitable are muscatel, sage, chamomile, clove, lemon balm, mint, cinnamon, lime, juniper, vetiver, olibanum, galbanum and labdanum, and orange blossom, neroliol, orange peel and sandalwood.
  • the content of detergents and cleaners to dyes is less than 0.01 wt .-%, while perfumes can account for up to 2 wt .-% of the total formulation.
  • the fragrances can be incorporated directly into the detergents or cleaners, but it can also be advantageous to apply the fragrances to carriers, which enhance the adhesion of the perfume to the items to be cleaned and provide a slower release of fragrance for long-lasting fragrance, especially of treated textiles.
  • carrier materials for example, cyclodextrins have been proven, the cyclodextrin-perfume complexes can be additionally coated with other excipients.
  • a further preferred carrier for fragrances is the described zeolite X, which can also absorb fragrances instead of or in mixture with surfactants. Preference is therefore given to washing and cleaning agents containing the described zeolite X and fragrances, which are preferably at least partially absorbed on the zeolite.
  • Preferred dyes the selection of which presents no difficulty to the skilled person, have a high storage stability and insensitivity to the other ingredients of the agents and to light and no pronounced substantivity to textile fibers so as not to stain them.
  • Detergents or cleaners may contain antimicrobial agents to combat microorganisms. Depending on the antimicrobial spectrum and mechanism of action, a distinction is made between bacteriostatic agents and bactericides, fungistatics and fungicides, etc. Important substances from these groups are, for example, benzalkonium chlorides, alkylarylsulfonates, halophenols and phenolmercuric acetate.
  • antimicrobial action and antimicrobial active substance have the usual meaning within the scope of the teaching according to the invention, which is described, for example, by KH Wallophen in "Praxis der Sterilisation, Disinfection - Conservation: Germ Identification - Company Hygiene” (5th edition - Stuttgart, New York: Thieme, 1995
  • Suitable antimicrobial agents are preferably selected from the groups of alcohols, amines, aldehydes, antimicrobial acids or their salts, carboxylic esters, acid amides, phenols, phenol derivatives, diphenyls, diphenylalkanes, Urea derivatives, oxygen, nitrogen acetals and formals, benzamidines, isothiazolines, phthalimide derivatives, pyridine derivatives, antimicrobial surface-active compounds, guanidines, antimicrobial amphoteric compounds, quinolines, 1, 2-dibromo-2,4-dicyanobutane, iodo-2-propyl butyl
  • the antimicrobial agent may be selected from ethanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butanediol, phenoxyethanol, 1,2-propylene glycol, glycerol, undecylenic acid, benzoic acid, salicylic acid, dihydracetic acid, o-phenylphenol, N-methylmorpholine.
  • acetonitrile MMA
  • 2-benzyl-4-chlorophenol 2,2'-methylenebis (6-bromo-4-chlorophenol), 4,4'-dichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (dichlosan), 2,4 , 4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (trichlosan), chlorhexidine, N- (4-chlorophenyl) -N- (3,4-dichlorophenyl) -urea, N, N'-1-iodo-decanediyldi-i -pyridinyl ⁇ -ylidene ⁇ to ⁇ i-octanamine ⁇ dihydrochloride, N, N'-bis (4-chlorophenyl) nyl) -3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecandiimidamide, glucoprotamines, antimicrobial surface-active quaternary
  • Ethylene bis (N-butylphenylbiguanide), ethylene bis (2,5-diethoxyphenylbiguanide), ethylene bis (2,4-dimethylphenyl biguanide), ethylene bis (o-diphenylbiguanide), ethylene bis (mixed amyl naphthyl biguanide) , N-butyl-ethylene-bis (phenylbiguanide), trimethylene bis (o-tolylbiguanide), N-butyl-trimethyl-bis- (phenyl biguanide) and the corresponding salts such as acetates, gluconates, hydrochlorides, hydrobromides, citrates, bisulfites, Fluorides, polymaleates, N-cocosalkyl sarcosinates, phosphites, hypophosphites, perfluorooctanoates, silicates, sorbates, salicylates, maleates, tartrates, fumarates,
  • halogenated xylene and cresol derivatives such as p-chlorometacresol or p-chloro-meta-xylene, and natural antimicrobial agents of plant origin (for example, from spices or herbs), animal and microbial origin.
  • antimicrobial surface-active quaternary compounds a natural antimicrobial agent of plant origin and / or a natural antimicrobial agent of animal origin, most preferably at least one natural antimicrobial agent of plant origin from the group comprising caffeine, theobromine and theophylline and essential oils such as eugenol, thymol and geraniol, and / or at least one natural antimicrobial agent of animal origin from the group comprising enzymes such as protein from milk, lysozyme and lactoperoxidase, and / or at least one antimicrobial surface-active quaternary compound having an ammonium, sulfonium, phosphonium, iodonium or arsonium group, peroxo compounds and chlorine compounds become. Also substances of microbial origin, so-called bacteriocins, can be used.
  • the quaternary ammonium compounds (QAV) suitable as antimicrobial agents have the general formula (R 1 ) (R 2 ) (R 3 ) (R 4 ) N + X " , in which R 1 to R 4 are identical or different C-
  • the radicals preferably at least one of the radicals a chain length of 8 to 18, in particular 12 to 16 C-atoms.
  • QACs can be prepared by reacting tertiary amines with alkylating agents, such as, for example, methyl chloride, benzyl chloride, dimethyl sulfate, dodecyl bromide, but also ethylene oxide.
  • alkylating agents such as, for example, methyl chloride, benzyl chloride, dimethyl sulfate, dodecyl bromide, but also ethylene oxide.
  • alkylating agents such as, for example, methyl chloride, benzyl chloride, dimethyl sulfate, dodecyl bromide, but also ethylene oxide.
  • alkylating agents such as, for example, methyl chloride, benzyl chloride, dimethyl sulfate, dodecyl bromide, but also ethylene oxide.
  • the alkylation of tertiary amines with a long alkyl radical and two methyl groups succeeds particularly easily, and the quaternization of tertiary
  • Suitable QACs are, for example, benzalkonium chloride (N-alkyl-N, N-dimethylbenzylammonium chloride, CAS No. 8001-54-5), benzalkone B (m, p-dichlorobenzyldimethyl-C 12 -alkylammonium chloride, CAS No. 58390-78-6), benzoxonium chloride (benzyldodecylbis (2-hydroxyethyl) ammonium chloride), cetrimonium bromide (N-hexadecyl-N, N-trimethylammonium bromide, CAS No.
  • benzetonium chloride N, N-dimethyl-N- [2- [2- [p- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenoxy] ethoxy] ethyl] benzylammonium chloride, CAS No. 121-54-0
  • dialkyldimethylammonium chlorides such as di-n-decyldimethylammonium chloride (CAS No. 7173-51-5-5), didecyldi-methylammonium bromide (CAS No. 2390-68-3 ), Dioctyl-dimethyl-ammonium chloride, 1-cetylpyridinium chloride (CAS No.
  • QUATS are the benzalkonium chlorides with C 8 -C 8 alkyl, in particular Ci ⁇ -C M -Aklyl-benzyl-dimethyl-ammonium chloride.
  • Benzalkonium halides and / or substituted benzalkonium halides are for example commercially available as Barquat ® ex Lonza, Marquat® ® ex Mason, Variquat ® ex Witco / Sherex and Hyamine ® ex Lonza and as Bardac ® ex Lonza.
  • Other commercially obtainable antimicrobial agents are hexaminium N- (3-chloroallyl) as Dowicide and Dowicil ® ® ex Dow, Benzethonium as Hyamine ® 1622 ex Rohm & Haas, methylbenzethonium as Hyamine ® 10X ex Rohm & Haas, cetylpyridinium chloride such Cepacol ex Merrell Labs.
  • the antimicrobial agents are used in amounts of 0.0001 wt .-% to 1 wt .-%, preferably from 0.001 wt .-% to 0.8 wt .-%, particularly preferably from 0.005 wt .-% to 0.3 wt .-% and in particular from 0.01 to 0.2 wt .-% used.
  • the detergents or cleaners according to the invention may contain UV absorbents (UV absorbers) which are applied to the treated textiles and improve the lightfastness of the fibers and / or the lightfastness of other formulation constituents.
  • UV absorbents UV absorbers
  • Under UV absorber are organic substances (sunscreen) to understand, which are able to absorb ultraviolet rays and the absorbed energy in the form of longer-wave radiation, for example, to give off heat.
  • Compounds having these desired properties include, for example, the non-radiative deactivating compounds and derivatives of benzophenone having substituents in the 2- and / or 4-position. Also suitable are substituted benzotriazoles, in the 3-position phenyl-substituted acrylates (cinnamic acid derivatives, optionally with cyano groups in the 2-position), salicylates, organic Ni complexes and natural substances such as umbelliferone and the body's own urocanic acid.
  • the biphenyl and, above all, stilbene derivatives as described for example in EP 0728749 A are described and commercially available as Tinosorb FD ® ® or Tinosorb FR ex Ciba.
  • UV-B absorbers may be mentioned: 3-Benzylidencampher or 3-Benzylidennorcampher and its derivatives, for example 3- (4-methylbenzylidene) camphor, as described in EP 0693471 B1; 4-aminobenzoic acid derivatives, preferably 2-ethylhexyl 4- (dimethylamino) benzoate, 2-octyl 4- (dimethylamino) benzoate and 4- (dimethylamino) benzoic acid ester; Esters of cinnamic acid, preferably 4-methoxycinnamic acid 2-ethylhexyl ester, 4-methoxycinnamic acid propyl ester, 4-methoxycinnamic acid isoamyl ester, 2-cyano-3,3-phenylcinnamic acid 2-ethylhexyl ester (octocrylene); Esters of salicylic acid, preferably 2-ethylhexyl salicylate,
  • Ketotricyclo (5.2.1.0) decane derivatives as described in EP 0694521 B1.
  • 2-phenylbenzimidazole-5-sulfonic acid and its alkali metal, alkaline earth metal, ammonium, alkylammonium, alkanolammonium and glucammonium salts Sulfonic acid derivatives of benzophenones, preferably 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonic acid and its salts
  • Sulfonic acid derivatives of 3-Benzylidencamphers such as 4- (2-oxo-3-bornylidenme- thyl) benzenesulfonic acid and 2-methyl-5- (2-oxo-3-bomylidene) sulfonic acid and salts thereof.
  • UV-A and UV-B filters can also be used in mixtures.
  • insoluble photoprotective pigments namely finely dispersed, preferably nano-metal oxides or salts, are also suitable for this purpose.
  • suitable metal oxides are in particular zinc oxide and titanium dioxide and, in addition, oxides of iron, zirconium, silicon, manganese, aluminum and cerium and mixtures thereof.
  • silicates (talc) barium sulfate or zinc stearate can be used.
  • the oxides and salts are already used in the form of the pigments for skin-care and skin-protecting emulsions and decorative cosmetics.
  • the particles should have an average diameter of less than 100 nm, preferably between 5 and 50 nm and in particular between 15 and 30 nm. They may have a spherical shape, but it is also possible to use those particles which have an ellipsoidal or otherwise deviating shape from the spherical shape.
  • the pigments may also be surface-treated, that is to say hydrophilized or hydrophobicized.
  • Typical examples are coated titanium dioxides, such as, for example, titanium dioxide T 805 (Degussa) or Eusolex® T2000 (Merck; preferred hydrophilic coating agents are silicones and particularly preferably trialkoxyoctylsilanes or simethicones.) Micronized zinc oxide is preferably used see the review by P. Finkel in S ⁇ FW Journal 122 (1996), p. 543.
  • the UV absorbents are usually used in amounts of from 0.01% by weight to 5% by weight, preferably from 0.03% by weight to 1% by weight.
  • compositions according to the invention may comprise further enzymes in addition to the proteins according to the invention for increasing the washing or cleaning performance, it being possible in principle to use all enzymes established for this purpose in the prior art.
  • These include in particular other proteases, amylases, lipases, hemicellulases, cellulases or oxidoreductases, and preferably mixtures thereof.
  • These enzymes are basically of natural origin; Starting from the natural molecules, improved variants are available for use in detergents and cleaners, which are preferably used accordingly.
  • Compositions according to the invention preferably contain these further enzymes in total amounts of 1 ⁇ 10 -6 to 5 percent by weight, based on active protein.
  • those of the subtilisin type are preferred.
  • subtilisins BPN 'and Carlsberg examples thereof are the subtilisins BPN 'and Carlsberg, the protease PB92, the subtilisins 147 and 309, the alkaline protease from Bacillus lentus, subtilisin DY and the enzymes thermitase, proteinase K and the subtilases, but not the subtilisins in the narrower sense Proteases TW3 and TW7.
  • Subtilisin Carlsberg in a developed form under the trade names Alcalase ® from Novozymes A / S, Bagsvaerd, Denmark.
  • the subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase ®, or Savinase ® from Novozymes.
  • BLAP ® variants of the protease from Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1) to derive, in particular, in WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340 A2 and WO 03 / 038082 A2.
  • Other useful proteases from various Bacillus sp.- and ß. g / oson / V strains are evident from the patent applications WO 03/054185, WO 03/056017, WO 03/055974 and WO 03/054184.
  • proteases are, for example, under the trade names Durazym ®, relase ®, Everlase® ®, Nafizym, Natalase ®, Kannase® ® and Ovozymes ® from Novozymes, under the trade names Purafect ®, Purafect ® OxP and Properase.RTM ® by the company Genencor, that under the trade name Protosol® ® from Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, under the trade name Wuxi ® from Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, under the trade names Proleather® ® and protease P ® by the company Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, and the enzyme available under the name Proteinase K-16 from Kao Corp., Tokyo, Japan.
  • amylases which can be used according to the invention are the ⁇ -amylases from Bacillus licheniformis, from ⁇ . amyloliquefaciens or from ß. stearothermophilus and their improved for use in detergents and cleaners further developments.
  • the enzyme from ß. licheniformis is available from Novozymes under the name Termamyl ® and from Genencor under the name Purastar® ® ST.
  • Development products of this ⁇ -amylase are available from Novozymes under the trade names Duramyl ® and Termamyl ® ultra, from Genencor under the name Purastar® ® OxAm and from Daiwa Seiko Inc., Tokyo, Japan, as Keistase ®.
  • the ⁇ -amylase of ⁇ . amyloliquefaciens is sold by Novozymes under the name BAN ®, and variants derived from the ⁇ -amylase from B.. stearothermophilus under the names BSG ® and Novamyl ®, likewise from Novozymes. Further usable commercial products are, for example, the amylase LT® and Stainzyme®, the latter also from Novozymes.
  • ⁇ -amylase from Bacillus sp. Disclosed in the application WO 02/10356 A2 for this purpose.
  • a 7-7 (DSM 12368) and described in the application WO 02/44350 A2 cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) from ß. agaradherens (DSM 9948).
  • CCTase cyclodextrin glucanotransferase
  • DSM 9948 cyclodextrin glucanotransferase
  • amylolytic enzymes which belong to the sequence space of ⁇ -amylases, which is defined in the application WO 03/002711 A2, and those which are described in the application WO 03/054177 A2 can be used.
  • fusion products of the molecules mentioned can be used, for example those from application DE 10138753 A1.
  • compositions according to the invention may contain lipases or cutinases, in particular because of their triglyceride-cleaving activities, but also in order to generate in situ peracids from suitable precursors.
  • lipases or cutinases include, for example, the lipases originally obtainable from Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) or further developed, in particular those with the amino acid exchange D96L. They are sold, for example, by Novozymes under the trade names Lipolase ®, Lipolase Ultra ®, LipoPrime® ®, Lipozyme® ® and Lipex ®.
  • the cutinases can be used, which were originally isolated from Fusarium solani pisi and Humicola insolens.
  • lipases are available from Amano under the designations Lipase CE ®, Lipase P ®, Lipase B ®, or lipase CES ®, Lipase AKG ®, Bacillis sp. Lipase® , Lipase AP® , Lipase M- AP® and Lipase AML® are available. From the company Genencor, for example, the lipases, or cutinases can be used, the initial enzymes were originally isolated from Pseudomonas mendocina and Fusarium solanii.
  • Detergents according to the invention may contain cellulases, depending on the purpose, as pure enzymes, as enzyme preparations or in the form of mixtures in which the individual components advantageously supplement each other in terms of their various performance aspects.
  • These performance aspects include in particular contributions to the primary washing performance, to the secondary washing performance of the agent
  • EG endoglucanase
  • Novozymes A useful fungal, endoglucanase (EG) -rich cellulase preparation, or its further developments are offered by Novozymes under the trade name Celluzyme ®.
  • Further commercial products of this company are Cellusoft® ® and Renozyme ®. The latter is based on the application WO 96/29397 A1. Performance-enhanced cellulase variants For example, see the application WO 98/12307 A1.
  • the cellulases disclosed in the application WO 97/14804 A1 can be used; For example, it revealed 20 kD EG Melanocarpus, available from AB Enzymes, Finland, under the trade names Ecostone® ® and Biotouch ®. Further commercial products from AB Enzymes are Econase® ® and ECOPULP ®. Other suitable cellulases from Bacillus sp. CBS 670.93 and CBS 669.93 are disclosed in WO 96/34092 A2, wherein those derived from Bacillus sp. CBS 670.93 from the company Genencor under the trade name Puradax ® is available. Further commercial products of the company Genencor are "Genencor detergent cellulase L" and lndiAge ® Neutra.
  • compositions according to the invention may, in particular for the removal of certain problem soiling, comprise, in addition to the polypeptides according to the invention, further enzymes which are combined under the term hemicellulases.
  • further enzymes which are combined under the term hemicellulases.
  • Suitable mannanases are available, for example under the name Gamanase ® and Pektinex AR ® from Novozymes, under the name Rohapec ® B1 L from AB Enzymes and under the name Pyrolase® ® from Diversa Corp., San Diego, CA, USA ,
  • a suitable ß-glucanase from a ß. alcalophilus results from the application WO 99/06573 A1.
  • the from ß. subtilis derived beta-glucanase is available under the name Cereflo ® from Novozymes.
  • detergents and cleaners according to the invention may be oxidoreductases, for example oxidases, oxygenases, catalases, peroxidases, such as halo, chloro, bromo, lignin, glucose or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (phenol oxidases, polyphenol oxidases) contain.
  • oxidases oxygenases, catalases, peroxidases, such as halo, chloro, bromo, lignin, glucose or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (phenol oxidases, polyphenol oxidases) contain.
  • Suitable commercial products Denilite® ® 1 and 2 from Novozymes should be mentioned.
  • organic, particularly preferably aromatic, compounds which interact with the enzymes in order to enhance the activity of the relevant oxidoreductases (enhancers) or to ensure the flow of electrons (mediators) at greatly varying redox potentials between the oxidizing enzymes and the soils.
  • the enzymes additionally employed in agents according to the invention are either originally derived from microorganisms, such as the genera Bacillus, Streptomyces, Humicola or Pseudomonas, and / or are produced by biotechnological methods known per se by suitable microorganisms, for example by transgenic expression hosts of the genera Bacillus or filamentous fungi.
  • the purification of the relevant enzymes is conveniently carried out by conventional methods, for example by precipitation, sedimentation, concentration, filtration of the liquid phases, microfiltration, ultrafiltration, exposure to chemicals, deodorization or suitable combinations of these steps.
  • Agents according to the invention can be added to the polypeptides according to the invention as well as the additionally used enzymes in any form established according to the prior art. These include, for example, the solid preparations obtained by granulation, extrusion or lyophilization or, especially in the case of liquid or gel-form detergents, solutions of the enzymes, advantageously as concentrated as possible, sparing in water and / or added with stabilizers.
  • these proteins can be encapsulated for both the solid and liquid dosage forms, for example, by spray-drying or extruding the enzyme solution together with a preferably natural polymer or in the form of capsules, for example those in which the enzymes are entrapped as in a solidified gel or in those of the core-shell type, in which an enzyme-containing core is coated with a water, air and / or chemical impermeable protective layer.
  • a preferably natural polymer or in the form of capsules for example those in which the enzymes are entrapped as in a solidified gel or in those of the core-shell type, in which an enzyme-containing core is coated with a water, air and / or chemical impermeable protective layer.
  • further active ingredients for example stabilizers, emulsifiers, pigments, bleaches or dyes, may additionally be applied.
  • Such capsules are applied by methods known per se, for example by shaking or rolling granulation or in fluid-bed processes.
  • such granules for example by applying
  • a protein contained in an agent according to the invention in particular also the polypeptide according to the invention, can be protected against damage, for example inactivation, denaturation or decomposition, for example by physical influences, oxidation or proteolytic cleavage, especially during storage.
  • damage for example inactivation, denaturation or decomposition, for example by physical influences, oxidation or proteolytic cleavage, especially during storage.
  • inhibition of proteolysis is particularly preferred, especially if the agents also contain proteases.
  • Preferred agents according to the invention contain stabilizers for this purpose.
  • One group of stabilizers are reversible protease inhibitors.
  • Benzamidine hydrochloride, borax, boric acids, boronic acids or their salts or esters are frequently used for this purpose, including, in particular, derivatives with aromatic groups, for example ortho, meta or para-substituted phenylboronic acids, in particular 4-formylphenylboronic acid, or the salts or Esters of the compounds mentioned.
  • peptide aldehydes that is oligopeptides with a reduced C-terminus, especially those of 2 to 50 monomers are used for this purpose.
  • the peptidic reversible protease inhibitors include, among others, ovomucoid and leupeptin.
  • enzyme stabilizers are aminoalcohols, such as mono-, di-, triethanol- and -propanolamine and mixtures thereof, aliphatic carboxylic acids up to Ci 2, such as succinic acid, other dicarboxylic acids or salts of said acids. End-capped fatty acid amide alkoxylates are also suitable for this purpose. Certain organic acids used as builders are capable, as disclosed in WO 97/18287, of additionally stabilizing a contained enzyme.
  • Lower aliphatic alcohols but especially polyols such as glycerol, ethylene glycol, propylene glycol or sorbitol are other frequently used enzyme stabilizers.
  • Di-glycerol phosphate also protects against denaturation due to physical influences.
  • calcium and / or magnesium salts are used, such as calcium acetate or calcium formate.
  • Polyamide oligomers or polymeric compounds such as lignin, water-soluble vinyl copolymers or cellulose ethers, acrylic polymers and / or polyamides stabilize the enzyme preparation, inter alia, against physical influences or pH fluctuations.
  • Polyamine N-oxide containing polymers act simultaneously as enzyme stabilizers and as dye transfer inhibitors.
  • Other polymeric stabilizers are linear C 8 -C 8 polyoxyalkylenes.
  • alkylpolyglycosides can stabilize the enzymatic components of the agent according to the invention and are able, preferably, to additionally increase their performance.
  • Crosslinked N-containing compounds preferably perform a dual function as soil release agents and as enzyme stabilizers. Hydrophobic, nonionic polymer stabilizes in particular an optionally contained cellulase.
  • Reducing agents and antioxidants increase the stability of the enzymes to oxidative degradation;
  • sulfur-containing reducing agents are familiar.
  • Other examples are sodium sulfite and reducing sugars.
  • peptide-aldehyde stabilizers for example of polyols, boric acid and / or borax, the combination of boric acid or borate, reducing salts and succinic acid or other dicarboxylic acids or the combination of boric acid or borate with polyols or polyamino compounds and with reducing salts.
  • the effect of peptide-aldehyde stabilizers is favorably enhanced by the combination with boric acid and / or boric acid derivatives and polyols, and still further by the additional action of divalent cations, such as calcium ions.
  • agents of the invention can be offered in all conceivable forms, polypeptides of the invention in all appropriate for the addition to the respective agents These include, for example, liquid formulations, solid granules or capsules.
  • the encapsulated form lends itself to protecting the enzymes or other ingredients from other ingredients, such as bleaches, or to allow for controlled release.
  • Such capsules are disclosed, for example, with the patent applications WO 97/24177 and DE 19918267.
  • a possible encapsulation method is that the proteins are encapsulated in this substance, starting from a mixture of the protein solution with a solution or suspension of starch or a starch derivative. Such an encapsulation process is described in the application WO 01/38471.
  • the proteins - polypeptides according to the invention as well as optionally contained further enzymes - can be used, for example, in dried, granulated and / or encapsulated form. They may be added separately, ie as a separate phase, or with other ingredients together in the same phase, with or without compaction. If microencapsulated enzymes are to be processed in solid form, the water can be removed by methods known from the prior art from the aqueous solutions resulting from the workup, such as spray drying, centrifuging or by solubilization. The particles obtained in this way usually have a particle size between 50 and 200 microns.
  • the proteins may be added to liquid, gelatinous or pasty agents according to the invention in a concentrated aqueous or non-aqueous solution, suspension or emulsion starting from a protein recovery and preparation carried out in the prior art, but also in gel form or encapsulated or as a dried powder.
  • Such detergents or cleaners according to the invention are generally prepared by simple mixing of the ingredients which can be added in bulk or as a solution in an automatic mixer.
  • a cleaning agent according to the invention in particular a hard surface cleaner according to the invention, may also contain one or more propellants (INCI propellants), usually in an amount of 1 to 80% by weight, preferably 1 to 5 to 30% by weight, in particular 2 to 10 wt .-%, particularly preferably 2.5 to 8 wt .-%, most preferably 3 to 6 wt .-%, contained.
  • one or more propellants ICI propellants
  • Propellants are inventively usually propellants, especially liquefied or compressed gases.
  • propellants especially liquefied or compressed gases.
  • the choice depends on the product to be sprayed and the field of application.
  • compressed gases such as nitrogen, carbon dioxide or nitrous oxide, which are generally insoluble in the liquid detergent, the Operating pressure with each valve actuation.
  • Detergent-soluble or even solvent-acting liquefied gases (liquefied gases) as propellants offer the advantage of constant operating pressure and uniform distribution because the propellant vaporizes in the air, taking up more than a hundred times that volume.
  • blowing agents are accordingly: butanes, carbon dioxides, dimethyl carbonates, dimethyl ether, ethanes, Hydrochlorofluorocarbon 22, hydrochlorofluorocarbon 142b, hydrofluorocarbon 152a, hydrofluorocarbon 134a, hydrofluorocarbon 227ea, isobutanes, isopentanes, nitrogen, nitrous oxides, pentanes, propanes.
  • Chlorofluorocarbons (chlorofluorocarbons, CFCs) as propellant are, however, preferably largely and in particular completely dispensed with because of their harmful effect on the ozone shield of the atmosphere, which protects against hard UV radiation, the so-called ozone layer.
  • Preferred blowing agents are liquefied gases.
  • Liquid gases are gases that can be performed at mostly already low pressures and 2O 0 C from the gaseous to the liquid state.
  • under liquefied gases are the hydrocarbons propane, propene, butane, butene, isobutane (2-methylpropane), isobutene (2-methylpropene), which are obtained in oil refineries as by-products from distillation and cracking of petroleum and in natural gas treatment during gasoline separation. Isobutylene) and mixtures thereof.
  • the cleaning agent particularly preferably contains propane, butane and / or isobutane, in particular propane and butane, as one or more propellants, more preferably propane, butane and isobutane.
  • an important task of the enzyme preparation and in particular of the polypeptides according to the invention is, as stated above, the primary washing performance.
  • the proteases contained in detergents can also fulfill the function of activating other enzymatic constituents by proteolytic cleavage or inactivating them after a corresponding action time.
  • An embodiment of the present invention are also those agents with protease-sensitive material capsules which are hydrolyzed, for example, by proteins of the invention at an intended time and release their contents. Polypeptides of the invention can thus also be used for inactivation, activation or release reactions, in particular in multiphase agents.
  • a further embodiment of this subject matter accordingly also represents the use of a polypeptide according to the invention for the activation, deactivation or release of ingredients of detergents or cleaners.
  • the agent with a polypeptide of the invention is designed so that it can be used regularly as a care product, for example by added to the washing process, applied after washing or applied independently of the washing.
  • the desired effect is to maintain a smooth surface texture of the fabric over a long period of time and / or to prevent and / or reduce damage to the fabric.
  • a separate subject of the invention are processes for the automated cleaning of textiles or of hard surfaces, in which at least one of the process steps uses a polypeptide according to the invention.
  • polypeptide according to the invention is used in an amount of 40 ⁇ g to 4 g, preferably from 50 ⁇ g to 3 g, particularly preferably from 100 ⁇ g to 2 g and very particularly preferably from 200 ⁇ g to 1 g per application becomes. Included are all integer and non-integer values lying between these numbers.
  • Methods for cleaning textiles are generally distinguished by the fact that various cleaning-active substances are applied to the items to be cleaned in a plurality of process steps and washed off after the action time, or that the items to be cleaned are otherwise treated with a detergent or a solution of this agent.
  • a single substep of such a process for the mechanical cleaning of textiles may be that, if desired, in addition to stabilizing compounds, Salts or buffer substances is the only detergent-active component of a polypeptide of the invention is applied. This represents a particularly preferred embodiment of the present invention.
  • the relevant polypeptides according to the invention are provided in the context of one of the formulations set forth above for agents according to the invention, preferably detergents or cleaners according to the invention.
  • agents according to the invention preferably detergents or cleaners according to the invention.
  • a separate subject of the invention is the use of an inventive alkaline protease described above for cleaning textiles or hard surfaces.
  • Proteases according to the invention can be used, in particular according to the properties described above and the processes described above, to eliminate proteinaceous impurities from textiles or from hard surfaces.
  • Embodiments include, for example, hand washing, manual removal of stains from fabrics or hard surfaces, or use in conjunction with a machine process.
  • alkaline proteases according to the invention are provided in the context of one of the formulations set forth above for compositions according to the invention, preferably detergents or cleaners.
  • Another object of the present invention is also a product comprising a composition according to the invention or a detergent or cleaning agent according to the invention, in particular a hard surface cleaner according to the invention, and a spray dispenser.
  • the product may be both a single-chamber and a multi-chamber container, in particular a two-chamber container.
  • the spray dispenser is preferably a manually activated spray dispenser, in particular selected from the group consisting of aerosol spray dispensers (also known as spray can), pressure-building spray dispensers, pump spray dispensers and trigger spray dispensers, in particular pump spray dispensers and trigger spray dispensers with a transparent polyethylene or polyethylene terephthalate container.
  • Spray dispensers are described in more detail in WO 96/04940 (Procter & Gamble) and the US patents cited therein about spray dispensers, to which reference is made in this regard and the contents of which are hereby incorporated by reference.
  • Triggersprühspender and pump sprayer have over compressed gas tanks the advantage that no propellant must be used.
  • the enzyme in this embodiment may optionally also be added to the composition in a form immobilized on particles and thus metered as cleaning foam.
  • Example 1 Isolation and identification of a proteolytically active bacterial strain
  • 0.1 g of a soil sample was suspended in 1 ml of sterile NaCl and on milk powder agar plates (1, 5% agar, 0.1% K 2 HPO4, 0.5% yeast extract, 1% peptone, 1% milk powder, 0.02% MgSO 4 * 7H 2 O, 0.4% Na 2 CO 3 , pH 10) and incubated at 30 °.
  • a proteolytically active bacterium was isolated on the basis of a clarification farm, which was named Bacillus gibsonii by the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). was identified.
  • Table 1 Microbiological properties of the Bacillus gibsonii strain
  • the proteolytically active bacterium was in TBY medium (0.5% NaCl, 0.5% yeast extract, 1% tryptone, pH 7.4) cultured for 16 hours at 3O 0 C.
  • the total DNA of this bacterium was isolated, digested with the restriction enzyme Sau 3A and the resulting fragments cloned into the vector pAWA22.
  • This vector was transformed into the host strain Bacillus subtilis DB 104 (Kawamura and Doi (1984), J. Bacteriol., Vol. 160 (1), pp. 442-444).
  • the transformants were first on DM3 medium (8 g / l agar, 0.5 M succinic acid, 3.5 g / l K 2 HPO 4 , 1, 5 g / l KH 2 PO 4 , 20 mM MgCl 2 , 5 g / l Casiaminoacids, 5 g / l yeast extract, 6 g / l glucose,
  • proteolytically active clones were determined by their Lysies identified. One of the resulting proteolytically active clones was selected, the plasmid was isolated and the insert was sequenced according to standard methods.
  • the approximately 1.5 kb insert contained an open reading frame of approximately 1.2 kb. Whose sequence is in the sequence listing under the name SEQ ID NO. 1 indicated. It covers 1152 bp.
  • the deduced amino acid sequence comprises 383 amino acids followed by a stop codon. It is in the sequence listing under SEQ ID NO. 2 indicated. Of these, the first 114 amino acids are unlikely to be present in the mature protein, so the mature protein is expected to be 269 amino acids in length.
  • Table 2 Homology of the alkaline protease from Bacillus gibsonii to the nearest similar proteins. In this mean:
  • amino acid sequences of these proteases are also compared with one another in the alignment of FIG.
  • standardized contaminated textiles were used by the Eidgenössische Material-Prüfungs- und-Versuchsweg, St. Gallen, Switzerland (EMPA), or the Waschereiutzs GmbH, Krefeld.
  • the following stains and textiles were used: A (grass on cotton, EMPA 164), B (milk / oil on cotton, PC-10), C (whole / soot on cotton, 10N), D (chocolate milk / soot on cotton, C-03), E (cocoa, EMPA 112) and F (blood / milk on cotton, C-5 (044)).
  • control detergent used was a detergent base formulation of the following composition (all).
  • Ci ⁇ - cis fatty alcohol sulfate sodium salt
  • Ci 2 -C 8 fatty alcohol with 7 EO 20%
  • the detergent base recipe was for the different
  • subtilisin TI-1 (WO03 / 054184), subtilisin TII-5 (WO03 / 054185), ⁇ . / enfrvs-Alkaline Protease F 49 (WO 95/23221) or the inventive
  • protease of the invention from ß. gibsonii at 4O 0 C on some soils exceeds the homologous proteases HP302, TII-5 and TI-1 (stains B and D) and with respect to the other soils give comparable values to these proteases and that the protease according to the invention in relation to all stains with the exception of soiling C gives better values than the established protease ⁇ . / enfrvs Alkaline Protease F49.
  • Example 3 The experiment was carried out essentially as described in Example 3. The following stains and textiles were used: A (grass on cotton, EMPA 164), B (milk / oil on cotton, PC-10), C (whole / soot on cotton, 10N), D (chocolate milk / soot on cotton, C-03), E (cocoa, EMPA 112) and F (blood / milk on cotton, C-5 (044)).
  • the control detergent used was a detergent base formulation of the following composition (all figures in percent by weight): 0.3- 0.5% xanthan gum, 0.2-0.4% anti-foaming agent, 6-7% glycerol, 0 , 3-0.5% ethanol, 4-7% FAEOS, 24-28% nonionic surfactants, 1% boric acid, 1-2% sodium citrate (dihydrate), 2-4% soda, 14-16% coconut fatty acids, 0 , 5% HEDP, 0-0.4% PVP, 0-0.05% optical brightener, 0-0.001% dye, remainder demineralized water
  • the detergent base formulation was treated with the following proteases for the different test series: Subtilisin HP302 (DE102006022216), subtilisin TI-1 (WO03 / 054184), subtilisin TII-5 (WO03 / 054185), ⁇ . / enfrvs-Alkaline Protease F 49 (WO 95/23221) or the protease according to the invention
  • the whiteness of the washed fabrics was measured.
  • the measurement was carried out on a Minolta CM508d spectrometer, illuminant D65, 10.
  • the device is calibrated beforehand with a supplied white standard.
  • the results obtained are summarized as percent remission, that is to say as percentages in comparison to the white standard, together with the respective initial values in Table 4. Indicated are the mean values from 3 measurements each. They allow a direct conclusion on the contribution of the enzyme contained to the washing performance of the agent used.
  • protease of the invention from ß. gibsonii at 4O 0 C in a liquid detergent with respect to all soiling only with the exception of soiling E (cocoa), the homologous proteases Subtilisin HP302, Subtilisin TII-5 and Subtilisin TI-1 in part significantly exceeds.
  • FIG. 1 Alignment of the amino acid sequences of the invention
  • FIG. 2 The pBC16-derived expression vector pAWA22, which has a

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ aus Bacillus gibsonii sowie hinreichend verwandte Proteine und deren Derivate. Sie betrifft außerdem Wasch- und Reinigungsmittel mit dieser neuen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ, hinreichend verwandten Proteinen und deren Derivaten, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren und deren Verwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln sowie weitere technische Einsatzmöglichkeiten.

Description

„Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease"
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ aus Bacillus gibsonii sowie hinreichend verwandte Proteine und deren Derivate. Sie betrifft außerdem Wasch- und Reinigungsmittel mit dieser neuen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ, hinreichend verwandten Proteinen und deren Derivaten, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren und deren Verwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln sowie weitere technische Einsatzmöglichkeiten.
Enzyme sind etablierte aktive Inhaltsstoffe von Wasch- und Reinigungsmitteln. Proteasen bewirken dabei den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut, wie beispielsweise Textilien oder harten Oberflächen. Günstigenfalls ergeben sich Synergieeffekte zwischen den Enzymen und den übrigen Bestandteilen der betreffenden Mittel. Die Entwicklung von Waschmittelproteasen beruht auf natürlicherweise, vorzugsweise mikrobiell gebildeten Enzymen. Solche werden über an sich bekannte Mutagenese-Verfahren, beispielsweise Punktmutagenese, Deletion, Insertion oder Fusion mit anderen Proteinen oder Proteinteilen oder über sonstige Modifikationen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln optimiert. Unter den Wasch- und Reinigungsmittelproteasen nehmen Subtilisine aufgrund ihrer günstigen enzymatischen Eigenschaften wie Stabilität oder pH-Optimum eine herausragende Stellung ein.
Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62), insbesondere Subtilisine werden aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren den Serin-Proteasen zugerechnet. Sie werden natürlicherweise von Mikroorganismen, insbesondere von Bacillus-Spezies gebildet und sekretiert. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen, das heißt sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über diese Familie bietet beispielsweise der Artikel "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in "Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996. Subtilisine eignen sich für eine Vielzahl von technischen Verwendungsmöglichkeiten, als Bestandteile von Kosmetika und insbesondere als aktive Inhaltsstoffe von Wasch- oder Reinigungsmitteln.
Im folgenden werden die wichtigsten Subtilisine und die wichtigsten Strategien für ihre technische Weiterentwicklung aufgeführt.
Das Subtilisin BPN', welches aus Bacillus amyloliquefaciens, beziehungsweise ß. subtilis stammt, ist aus den Arbeiten von Vasantha et al. (1984) in j. Bacteriol., Volume 159, S. 811-819 und von J. A. Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Volume V\_, S. 7911-7925 bekannt. Subtilisin BPN' dient insbesondere hinsichtlich der Numerierung der Positionen als Referenzenzym der Subtilisine. Die Protease Subtilisin Carlsberg wird in den Publikationen von E. L. Smith et al. (1968) in J. Biol. Chem., Volume 243, S. 2184-2191 , und von Jacobs et al. (1985) in Nucl. Acids Res., Band 13, S. 8913-8926 vorgestellt. Sie wird natürlicherweise von Bacillus licheniformis gebildet und ist unter dem Handelsnamen Maxatase® von der Firma Genencor International Inc., Rochester, New York, USA, sowie unter dem Handelsnamen Alcalase® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich.
Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise Savinase® von der Firma Novozymes vertrieben. Sie stammen ursprünglich aus ßac/7/ι/s-Stämmen, die mit der Anmeldung GB 1243784 offenbart werden.
Das Subtilisin DY ist ursprünglich von Nedkov et al. 1985 in Biol. Chem Hoppe-Seyler, Band 366, S. 421-430 beschrieben worden.
Weitere Proteasen vom Subtilisin-Typ, die aus Bacillus-Stämmen isoliert worden sind, werden in den jüngeren Patentanmeldungen WO03/054185 und WO03/054184 sowie in der noch nicht veröffentlichten Patentanmeldung DE102006022216 beschrieben.
Eine Strategie, um die Wasch leistung der Subtilisine zu verbessern, besteht darin, statistisch oder gezielt in den bekannten Molekülen einzelne Aminosäuren gegen andere zu substituieren und die erhaltenen Varianten auf ihre Beiträge zur Waschleistung zu überprüfen. Die Enzyme können mit bestimmten Aminosäureaustauschen oder Deletionen auch hinsichtlich ihrer Allergenizität verbessert werden.
Um die Waschleistung der Subtilisine zu verbessern, wurde in zahlreichen Anmeldungen die Strategie der Insertion zusätzlicher Aminosäuren in die aktiven Loops verfolgt. Diese Strategie sollte prinzipiell auf alle Subtilisine anwendbar sein, die einer der Untergruppen I-S1 (wahre Subtilisine) oder I-S2 (hochalkalische Subtilisine) angehören.
Eine andere Strategie der Leistungsverbesserung besteht darin, die Oberflächenladungen und/oder den isoelektrischen Punkt der Moleküle und darüber ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat zu verändern. Ferner wurden Punktmutanten mit verringerter pH-Wert-abhängiger Molekülladungsvariation beschrieben. Aus diesem Prinzip wurde auch ein Verfahren zur Identifizierung von Varianten abgeleitet, die für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet sein sollen; dabei weisen alle offenbarten Varianten mindestens einen Austausch in Position 103 auf. Generell werden in der Literatur sehr häufig Varianten mit einem Austausch an Position 103 beschrieben, gegebenenfalls kombiniert mit einer Vielzahl anderer möglicher Austausche. Eine alternative Möglichkeit zur Leistungsverbesserung in Wasch- und Reinigungsmitteln besteht darin, die Hydrophobizität der Moleküle zu erhöhen, was einen Einfluss auf die Stabilität des Enzyms haben kann. Eine andere Methode, die Leistungsfähigkeit von Proteasen zu modulieren, besteht in der Bildung von Fusionsproteinen. So werden in der Literatur beispielsweise Fusionsproteine aus Proteasen und einem Inhibitor wie dem Streptomyces-Subtilisin-Inhibitor offenbart. Eine andere Möglichkeit ist beispielsweise die Kopplung an die von Cellulasen abgeleitete Cellulosebindungsdomäne (CBD) zur Erhöhung der Konzentration an aktivem Enzym in unmittelbarer Nähe zum Substrat oder die Kopplung eines Peptidlinkers und daran von Polymeren, um die Allergenizität beziehungsweise Immunogenizität herabzusetzen.
Methoden zum Erzeugen von statistischen Aminosäureaustauschen können beispielsweise auf dem Phage Display beruhen. Eine moderne Richtung der Enzymentwicklung besteht darin, Elemente aus bekannten, miteinander verwandten Proteinen über statistische Verfahren zu neuen Enzymen zu kombinieren, die bislang nicht erreichte Eigenschaften aufweisen. Solche Verfahren werden auch unter dem Oberbegriff Rekombination zusamengefasst. Dazu gehören beispielsweise folgende Verfahren: Die StEP-Methode (Zhao et al. (1998), Nat. Biotechnol., Band ^6, S. 258-261 ), Random priming recombination (Shao et al., (1998), Nucleic Acids Res., Band 26, S. 681-683), DNA-Shuffling (Stemmer, W. P. C. (1994), Nature, Band 370, S. 389-391 ) oder Recursive sequence recombination (RSR; WO 98/27230, WO 97/20078, WO 95/22625) oder die Methode RACHITT (Coco, W.M. et al. (2001 ), Nat. Biotechnol., Band ^j), S. 354-359). Einen Überblick über derartige Methoden vermittelt auch der Aufsatz "Gerichtete Evolution und Biokatalyse" von Powell et al. (2001 ), Angew. Chem., Band H3, S. 4068-4080.
Eine weitere, insbesondere ergänzende Strategie besteht darin, die Stabilität der betreffenden Proteasen zu erhöhen und damit ihre Wirksamkeit zu erhöhen. Eine Stabilisierung über Kopplung an ein Polymer ist etwa für Proteasen beschrieben worden, die in Kosmetika eingesetzt werden; hierdurch konnte eine bessere Hautverträglichkeit erreicht werden. Insbesondere für Wasch- und Reinigungsmittel sind dagegen Stabilisierungen durch Punktmutationen geläufiger. So können Proteasen etwa dadurch stabilisiert werden, insbesondere auch hinsichtlich des Einsatzes bei höheren Temperaturen, dass man bestimmte Tyrosin-Reste gegen andere austauscht. Andere beschriebene Möglichkeiten zur Stabilisierung über Punktmutagenese sind beispielsweise:
- Austausch bestimmter Aminosäurereste gegen Prolin;
- Einführung polarerer oder geladenerer Gruppen auf der Oberfläche des Moleküls;
- Verstärkung der Bindung von Metallionen, insbesondere über Mutagenese der Calcium-Bindungsstellen;
- Blockade der Autolyse durch Modifikation oder Mutagenese;
- Ermittlung der zur Stabilisierung relevanten Positionen über eine Analyse der dreidimensionalen Struktur.
Es ist bekannt, dass Proteasen zur Verbesserung der Wasch- beziehungsweise Reinigungsleistung zusammen mit α-Amylasen und weiteren Waschmittelenzymen, insbesondere Lipasen, eingesetzt werden können. Ebenso ist der Einsatz von Proteasen in Waschmitteln in Kombination mit anderen Wirkstoffen wie etwa Bleichmitteln oder Soil-Release-Wirkstoffen dem Fachmann bekannt.
Es ist ferner bekannt, dass einige für den Einsatz in Waschmitteln etablierte Proteasen auch für kosmetische Zwecke oder für die organisch-chemische Synthese geeignet sind.
Die hier beispielhaft dargestellten, diversen technischen Einsatzgebiete erfordern Proteasen mit unterschiedlichen Eigenschaften, was beispielsweise die Reaktionsbedingungen, die Stabilität oder die Substratspezifität angeht. Umgekehrt hängen die technischen Einsatzmöglichkeiten der Proteasen, beispielsweise im Kontext einer Wasch- oder Reinigungsmittelrezeptur, von weiteren Faktoren wie Stabilität des Enzyms gegenüber hohen Temperaturen, gegenüber oxidierenden Agentien, dessen Denaturierung durch Tenside, von Faltungseffekten oder von erwünschten Synergien mit anderen Inhaltsstoffen ab.
Somit besteht nach wie vor ein hoher Bedarf an technisch einsetzbaren Proteasen, die aufgrund der Vielzahl ihrer Einsatzgebiete in ihrer Gesamtheit ein breites Spektrum an Eigenschaften bis hin zu sehr subtilen Leistungsunterschieden abdecken.
Die Basis hierfür wird durch neue Proteasen erweitert, welche ihrerseits hinsichtlich spezieller Einsatzgebiete gezielt weiterentwickelt werden können.
Der vorliegenden Erfindung lag also die Aufgabe zugrunde, eine weitere, noch nicht bekannte Protease aufzufinden. Das Wildtyp-Enzym sollte sich vorzugsweise dadurch auszeichnen, dass es bei Verwendung in einem entsprechenden Mittel den für diesen Zweck etablierten Enzymen zumindest nahekommt. Hierbei war insbesondere der Beitrag zur Leistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels von Interesse.
Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung können darin gesehen werden, Proteasen, insbesondere vom Subtilisin-Typ, bereitzustellen, die gegenüber dem Stand der Technik eine verbesserte Stabilität gegenüber Temperatureinflüssen, pH-Wert-Schwankungen, denaturierenden oder oxidierenden Agentien, proteolytischem Abbau, hohen Temperaturen, sauren oder alkalischen Bedingungen oder gegenüber einer Veränderung der Redox-Verhältnisse aufweisen. Weitere Aufgaben können in einer verringerten Immunogenität bzw. verringerten allergenen Wirkung gesehen werden.
Weitere besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Proteasen ausfindig zu machen, die bei Temperaturen von 20 bis 60 0C eine gute Waschleistung, vorzugsweise eine verbesserte Waschleistung im Vergleich zu den im Stand der Technik offenbarten Proteasen, insbesondere denjenigen vom Subtilisin-Typ, aufweisen. Eine weitere besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Proteasen ausfindig zu machen, die in Bezug auf die im Stand der Technik bekannten homologen Proteasen eine verbesserte Waschleistung in Bezug auf zumindest eine Anschmutzung, vorzugsweise in Bezug auf mehrere Anschmutzungen, aufweisen.
Weitere Teilaufgaben bestanden darin, Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die für derartige Proteasen kodieren, und Vektoren, Wirtszellen und Herstellverfahren zur Verfügung zu stellen, die zur Gewinnung derartiger Proteasen genutzt werden können. Ferner sollten entsprechende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten für derartige Proteasen zur Verfügung gestellt werden. Schließlich sollten technische Einsatzmöglichkeiten für die gefundenen Proteasen definiert werden.
Die Lösung der Aufgabe besteht in Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ mit Aminosäuresequenzen, die zu der im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 2 von Position 115 bis 383 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 97,5 % identisch sind und/oder in Bezug zu dieser Aminosäuresequenz höchstens in 6 Aminosäurepositionen abweichen.
Zunehmend bevorzugt sind jeweils solche mit einem zunehmenden Maß an Identität mit der neuen Alkalischen Protease aus Bacillus gibsonii, also solche, die nur in 5, 4, 3 oder 2 Aminosäurepositionen, vorzugsweise nur in einer Aminosäureposition abweichen, und ganz besonders bevorzut ist die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii selbst.
Weitere Lösungen der Aufgabe, beziehungsweise Lösungen der Teilaufgaben und somit jeweils eigene Erfindungsgegenstände bestehen in Nukleinsäuren, deren Sequenzen zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz hinreichendnlich sind und/oder für erfindungsgemäße Proteasen codieren, in entsprechenden Vektoren, Zellen beziehungsweise Wirtszellen und Herstellverfahren. Ferner werden entsprechende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten für derartige Proteasen zur Verfügung gestellt. Schließlich werden technische Einsatzmöglichkeiten für die gefundenen Proteasen definiert.
Als nächstliegender Stand der Technik sind die Offenlegungsschriften WO03/054185 und WO03/054184 sowie die noch unveröffentlichte Patentanmeldung DE 102006022216 anzusehen, in denen die Verwendung sehr stark homologer Enzyme in Wasch- und Reinigungsmitteln beschrieben wird.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende, natürlicherweise gebildete Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ ist, wie anhand der Beispiele nachvollzogen werden kann, aus dem Kulturüberstand eines neuen Bacillus gibsonii-Siammes erhältlich, der von der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) als solcher identifiziert worden ist. Eine Hinterlegung dieses Stammes erfolgte nicht. Stattdessen wurde zum Zwecke der Nacharbeitbarkeit gemäß Budapester Vertrag ein Plasmid, das die Nukleinsäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms enthält, bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig) mit der Hinterlegungsnummer DSM 18912 hinterlegt.
Die vorliegende Patentanmeldung verfolgte die Strategie, aus einem natürlichen Habitat einen Protease-bildenden Mikroorganismus und somit ein natürlicherweise gebildetes Enzym aufzufinden, das die gestellten Anforderungen möglichst vollständig erfüllt.
Solch ein Enzym konnte, wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, mit der Alkalischen Protease aus Bacillus gibsonii gefunden werden.
Die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen neuen Alkalischen Protease aus Bacillus gibsonii ist im Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung unter SEQ ID NO. 1 angegeben. Sie umfasst 1152 bp. Die hiervon abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO. 2 angegeben. Sie umfasst 383 Aminosäuren, gefolgt von einem Stopp-Codon. Hiervon sind die ersten 114 Aminosäuren wahrscheinlich nicht im maturen Protein enthalten, so dass sich für das mature Protein voraussichtlich eine Länge von 269 Aminosäuren ergibt.
Diese Sequenzen wurden mit den aus allgemein zugänglichen Datenbanken Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http://www.genebio.com/sprot.html) und GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) erhältlichen Proteasesequenzen verglichen, um die Proteine mit der größten Homologie zu ermitteln.
Das Maß für die Homologie ist ein Prozentsatz an Identität, wie er beispielsweise nach der von D. J. Lipman und W. R. Pearson in Science 227 (1985), S. 1435-1441 angegebenen Methode bestimmt werden kann. Diese Angabe kann sich auf das gesamte Protein oder auf den jeweils zuzuordnenden Bereich beziehen. Ein weiter gefaßter Homologie-Begriff, die Ähnlichkeit, bezieht auch konservierte Variationen, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität in die Betrachtung mit ein, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Bei Nukleinsäuren kennt man nur den Prozentsatz an Identität.
Auf der Ebene der DNA wurden für das gesamte Gen folgende drei Gene als nächstähnliche identifiziert: (1.) Subtilisin HP302 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in DE 102006022216) mit 88% Identität, (2.) Subtilisin TI-1 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054184) mit 88% Identität, (3.) Subtilisin TII-5 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054185) mit 86% Identität. Auf der Ebene der für das mature Protein kodierenden DNA wurden die folgenden drei Gene als die nächstähnlichen identifiziert: (1.) Subtilisin HP302 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in DE 102006022216) mit 87% Identität, (2.) Subtilisin TI-1 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054184) mit 86% Identität, (3.) Subtilisin TII-5 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054185) mit 84% Identität.
Auf der Ebene der für das Propeptid kodierenden DNA wurden die folgenden drei Gene als die nächstähnlichen identifiziert: (1.) TII-5 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054185) mit 92% Identität, (2.) TI-1 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054184) mit 91 % Identität, (3.) HP302 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in DE 102006022216) mit 89% Identität.
Auf der Ebene der für das Signalpeptid kodierenden DNA wurden die folgenden drei Gene als die nächstähnlichen identifiziert: (1.) TII-5 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054185) mit 98% Identität, (2.) HP302 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in DE 102006022216) mit 95% Identität, (3.) TI-1 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054184) mit 94% Identität.
Auf der Ebene der Aminosäuren des gesamten Präproproteins wurden als nächstähnliche identifiziert: (1.) Subtilisin HP302 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in DE 102006022216) mit 96% Identität, (2.) Subtilisin TI-1 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054184) mit 95% Identität, (3.) Subtilisin TII-5 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054185) mit 92% Identität.
Auf der Ebene der Aminosäuren des maturen Proteins wurden als nächstähnliche identifiziert: (1.) Subtilisin HP302 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in DE 102006022216) mit 97% Identität, (2.) Subtilisin TI-1 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054184) mit 96% Identität, (3.) Subtilisin TII-5 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054185) mit 91 % Identität.
Auf der Ebene der Aminosäuren des Propeptids wurden als nächstähnliche identifiziert: (1.) TII-5 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054185) mit 93% Identität, (2.) HP302 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in DE 102006022216) mit 91 % Identität, (3.) TI-1 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054184) mit 90% Identität.
Aufgrund der zu erkennenden Übereinstimmungen und der Verwandtschaft zu den anderen angegebenen Subtilisinen ist diese Alkalische Protease als ein Subtilisin anzusehen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit jedes Polypeptid, insbesondere jede Hydrolase, vor allem jede Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 96,5% identisch ist und/oder in Bezug zu der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz höchstens in 14 Aminosäurepositionen abweicht. Zunehmend bevorzugt sind darunter solche Polypeptide, deren Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 97% oder 97,5%, besonders bevorzugt zu mindestens 98% oder 98,5%, vor allem zu mindestens 99% oder 99,5% identisch ist und/oder solche, deren Aminosäuresequenz in Bezug zu der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz höchstens in 13, 12, 11 , 10, 9, 8 oder 7, insbesondere höchstens in 6, 5, 4, 3 oder 2 Aminosäurepositionen, besonders bevorzugt höchstens in einer Aminosäureposition abweicht. Ganz besonders bevorzugt ist ein Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
Denn es ist zu erwarten, dass deren Eigenschaften denen der erfindungsgemäßen Alkalischen Protease aus ß. gibsonii zunehmend ähnlich sind.
Wie bereits erwähnt, sind aufgrund eines Vergleichs der N-terminalen Sequenzen vermutlich die Aminosäuren 1 bis 1 14 als Leaderpeptid anzusehen, wobei die Aminosäuren 1 bis 27 vermutlich das Signalpeptid darstellen, und erstreckt sich das mature Protein voraussichtlich von den Positionen 115 bis 383 gemäß der SEQ ID NO: 2. Die Position 384 wird demnach von einem Stopp-Codon eingenommen, entspricht also eigentlich keiner Aminosäure. Da aber auch die Information über das Ende eines codierenden Bereichs als wichtiger Bestandteil einer Aminosäuresequenz angesehen werden kann, wird diese Position erfindungsgemäß in den Bereich einbezogen, der dem maturen Protein entspricht.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit jedes Polypeptid, insbesondere jede Hydrolase, vor allem jede Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO: 2 von Position 115 bis Postion 383 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 97,5% identisch ist und/oder in Bezug zu dieser Aminosäuresequenz höchstens in 6 Aminosäurepositionen abweicht.
Zunehmend bevorzugt sind darunter solche Polypeptide, deren Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO: 2 von Position 115 bis Position 383 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu jeweils 98% oder 98,5%, besonders bevorzugt mindestens zu 99% oder 99,5% identisch ist und/oder solche, deren Aminosäuresequenz in Bezug zu der in SEQ ID NO: 2 von Position 115 bis 383 angegebenen Aminosäuresequenz höchstens in 5 oder 4, insbesondere höchstens in 3 oder 2 Aminosäurepositionen, besonders bevorzugt höchstens in einer Aminosäureposition abweicht. Ganz besonders bevorzugt ist hierbei ein Protein mit einer Aminosäuresequenz von Position 115 bis 383 gemäß SEQ ID NO: 2.
Sollte sich, beispielsweise durch eine N-terminale Sequenzierung des in vivo von Bacillus gibsonii freigesetzten proteolytischen Proteins, herausstellen, dass die Spaltstelle nicht zwischen der 114. und der 115. Aminosäure gemäß SEQ ID NO: 2 sondern an einer anderen Stelle liegt, so beziehen sich diese Angaben auf die tatsächliche Spaltstelle bzw. auf das tatsächliche mature Protein. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Fragmente insbesondere des maturen Proteins, sofern diese gegenüber dem Stand der Technik neu sind.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 81 , vorzugsweise mindestens 90, 100 oder 120, besonders bevorzugt mindestens 150, 175 oder 200, vor allem mindestens 225 oder 250, aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, insbesondere der Aminosäuresequenz von Position 115 bis 383 gemäß SEQ ID NO: 2, umfassen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher ebenso Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 127, vorzugsweise mindestens 140, 160 oder 170, besonders bevorzugt mindestens 180, 190 oder 200, vor allem mindestens 220, 240 oder 250 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, insbesondere der Aminosäuresequenz von Position 115 bis 383 gemäß SEQ ID NO: 2, umfassen oder höchstens in einer Aminosäureposition davon abweichen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher ebenso Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 171 , vorzugsweise mindestens 180, 190 oder 200, besonders bevorzugt mindestens 210, 220 oder 230, vor allem mindestens 240, 250 oder 260 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, insbesondere der Aminosäuresequenz von Position 115 bis 383 gemäß SEQ ID NO: 2, umfassen oder höchstens in zwei Aminosäurepositionen, vorzugsweise höchstens in einer Aminosäureposition, davon abweichen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher ebenso Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 192, vorzugsweise mindestens 200, 210 oder 220, besonders bevorzugt mindestens 230, 240 oder 250 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, insbesondere der Aminosäuresequenz von Position 115 bis 383 gemäß SEQ ID NO. 2, umfassen oder höchstens in drei, vorzugsweise höchstens in zwei, besonders bevorzugt höchstens in einer Position, davon abweichen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher ebenso Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz von Position 164 bis Position 382 der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Sequenz umfassen oder aber höchstens in sechs oder fünf, vorzugsweise höchstens in vier oder drei, besonders bevorzugt höchstens in zwei Positionen, vor allem höchstens in einer Position, davon abweichen.
Da auch das Signalpeptid und das Propeptid Einheiten darstellen, die als solche von erfindungsgemäßem Interesse sind, sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung solche Peptide, die zu diesen Polypeptiden homolog sind, sofern sie neu sind. Wie gesagt handelt es sich voraussichtlich bei den Aminosäuren 1 bis 114 um das Leaderpeptid, wobei die Aminosäuren 1 bis 27 vermutlich das Signalpeptid und entsprechend die Aminosäuren 28 bis 114 das Propeptid darstellen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz von Position 1 bis 114 sowie von Position 28 bis 114 gemäß SEQ ID NO: 2 sowie Polypeptide, die ausgehend von diesen Aminosäuresequenzen in höchstens 4, vorzugsweise in höchstens 3 oder 2 Aminosäurepositionen, vor allem in genau einer Aminosäureposition abweichen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Polypeptide, die von den erfindungsgemäßen, weiter unten genannten Polynukleotiden kodiert werden.
Zunehmend bevorzugt sind darunter solche Polypeptide, die sich von einer Nukleotidsequenz ableiten, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz möglichst ähnlich ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Positionen 1 15 bis 384 des Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht.
Denn es ist zu erwarten, dass diese Nukleinsäuren für Proteine kodieren, deren Eigenschaften denen der erfindungsgemäßen Alkalischen Protease aus Bacillus gibsonii, insbesondere dem maturen Protein zunehmend ähnlich sind. Auch hier, wie für alle nachfolgenden Ausführungsformen gilt wiederum, dass sich diese Angaben auf das tatsächliche mature Protein beziehen, falls sich herausstellen sollte, dass die Spaltstelle des Proteins an einer anderen Stelle als oben angegeben liegt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind angesichts des nächstliegenden Standes der Technik, nämlich angesichts der Proteasen Subtilisin HP302 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in DE 102006022216), Subtilisin TI-1 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054184) und Subtilisin TII-5 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054185) bevorzugt solche erfindungsgemäßen Polypeptide, die gegenüber diesem nächstliegenden Stand der Technik eine verbesserte Waschleistung in Bezug auf mindestens eine Anschmutzung, vorzugsweise in Bezug auf mindestens zwei Anschmutzungen, insbesondere ausgewählt aus Gras auf Baumwolle, Milch/Öl auf Baumwolle, Ganzei/Ruß auf Baumwolle, Schokomilch/Ruß auf Baumwolle und Blut/Milch auf Baumwolle, insbesondere bei einer Waschtemperatur von 20 bis 6O0C, bevorzugt 3O0C, und bevorzugt bei Einsatz in einem Flüssigwaschmittel aufweisen. Ganz besonders bevorzugt liegt hierbei eine verbesserte Waschleistung bei 3O0C bei Einsatz in einem Flüssigwaschmittel in Bezug auf alle der zuvor genannten Anschmutzungen vor.
Die erfindungsgemäß am meisten bevorzugte Ausführungsform ist jede Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ, deren Aminosäuresequenz mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz insgesamt, vorzugsweise in den Positionen 1 15 bis 383 identisch ist und/oder deren Aminosäuresequenz von der in SEQ ID NO. 1 angebenen Nukleotidsequenz, vorzugsweise von den Positionen 343 bis 1 152, abgeleitet werden kann.
Denn um eine solche handelt es sich bei der neu gefundenen und mit der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellten Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii.
Diese ist eine im Stand der Technik noch nicht bekannte Protease. Sie ist, wie in den Beispielen angegeben, isolierbar, herstellbar und einsetzbar. Sie zeichnet sich, wie ebenfalls in den Beispielen dokumentiert, zusätzlich dadurch aus, dass sie bei Verwendung in einem entsprechenden Mittel den für diesen Zweck etablierten Enzymen in der Leistung zumindest nahekommt, beziehungsweise sie sogar übertrifft.
Bei den erfindungsgemäßen Polypeptiden handelt es sich vorzugsweise um Enzyme, besonders bevorzugt um Hydrolasen, insbesondere um Proteasen, besonders bevorzugt um Endo-Peptidasen, vor allem um Proteasen vom Subtilisin-Typ, oder um Teile davon. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind daher vorzugsweise dazu in der Lage, Säureamidbindungen von Proteinen zu hydrolysieren, insbesondere solche die im Inneren der Proteine liegen. Bei den Teilen der Polypeptide kann es sich insbesondere um Protein-Domänen handeln, die etwa zur Bildung funktionsfähiger chimärer Enzyme geeignet sein können.
Für die Entwicklung von technischen, insbesondere in Waschmitteln einsetzbaren Proteasen kann sie als ein natürlicherweise, mikrobiell gebildetes Enzym als Ausgangspunkt dienen, um über an sich bekannte Mutagenese-Verfahren, beispielsweise Punktmutagenese, Fragmentierung, Deletion, Insertion oder Fusion mit anderen Proteinen oder Proteinteilen oder über sonstige Modifikationen für den gewünschten Einsatz optimiert zu werden. Derartige Optimierungen können beispielsweise Anpassungen an Temperatur-Einflüsse, pH-Wert-Schwankungen, Redox-Verhältnissen und/oder sonstigen Einflüsse, sein, die für die technischen Einsatzgebiete relevant sind. Gewünscht sind beispielsweise eine Verbesserung der Oxidationsbeständigkeit, der Stabilität gegenüber denaturierenden Agentien oder proteolytischem Abbau, gegenüber hohen Temperaturen, sauren oder stark alkalischen Bedingungen, eine Veränderung der Sensitivität gegenüber Calciumionen oder anderen Cofaktoren, eine Senkung der Immunogenität oder der allergenen Wirkung.
Hierfür können beispielsweise durch gezielte Punktmutationen die Oberflächenladungen oder die an der Katalyse oder Substratbindungen beteiligten Loops geändert werden. Ein Ausgangspunkt hierfür ist ein Alignment mit bekannten Proteasen. Dieses ermöglicht, Positionen ausfindig zu machen, durch deren Veränderung gegebenenfalls eine Verbesserung der Eigenschaften des Proteins erreicht werden könnte.
Die Mutagenese-Verfahren beruhen auf der zugehörigen Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO. 1 angegeben ist, beziehungsweise den hierzu hinreichend ähnlichen Nukleotidsequenzen, die weiter unten als eigener Erfindungsgegenstand dargestellt werden. Entsprechende molekularbiologische Methoden sind im Stand der Technik beschrieben, so beispielsweise in Handbüchern wie dem von Fritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher neben den bereits zuvor als erfindungsgemäß genannten auf Punkt- bzw. Substitutionsmutation beruhenden Proteinvarianten auch alle von den zuvor genannten erfindungsgemäßen Polypeptiden, insbesondere von Polypeptiden mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 bzw. von Position 115 bis Position 383 gemäß SEQ ID NO: 2, durch Insertionsmutagenese und/oder Substitutionsmutagenese und/oder Inversionsmutagenese und/oder durch Fusion mit mindestens einem anderen Protein oder Proteinfragment abgeleiteten Polypeptide, insbesondere solche Polypeptide mit Insertionen und/oder Deletionen und/oder Inversionen von bis zu 50 Aminosäuren, besonders bevorzugt von bis zu 40, 30 oder 20, insbesondere von bis zu 15, 10 oder 5, vor allem von bis zu 4, 3 oder 2 Aminosäuren, vor allem mit Deletionen und/oder Insertionen von genau einer Aminosäure.
So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne dass dadurch die proteolytische Aktivität verloren geht. Solche Mutationen werden beispielsweise in WO 99/49057 A1 beschrieben. WO 01/07575 A2 lehrt, dass durch derartige Deletionen die Allergenizität betreffender Proteasen gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden kann. Die Fragmentierung kommt dem später ausgeführten Aspekt der Insertions- oder Substitutionsmutagenese und/oder Fusion mit anderen Enzymen zugute. Hinsichtlich des beabsichtigten Einsatzes dieser Enzyme ist es besonders bevorzugt, wenn sie auch nach der Fragmentierung oder Deletionsmutagenese eine proteolytische Aktivität besitzen.
Zahlreiche Dokumente des Stands der Technik offenbaren auch vorteilhafte Wirkungen von Insertionen und Substitutionen in Subtilasen; darunter auch die Publikationen WO 99/49057 und WO 01/07575. Prinzipiell gehören hierzu neben der Substitution einzelner Aminosäuren auch die Substitution mehrerer zusammenhängender Aminosäuren. Hierzu gehören auch Neukombinationen von größeren Enzymabschnitten, so den oben genannten Fragmenten, mit anderen Proteasen oder Proteinen anderer Funktion. So ist es beispielsweise in Anlehnung an WO 99/57254 möglich, ein erfindungsgemäßes Protein oder Teile davon über peptidische Linker oder direkt als Fusionsprotein mit Bindungsdomänen aus anderen Proteinen, etwa der Cellulose-Bindungsdomäne, zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu gestalten. Ebenso können erfindungsgemäße Proteine beispielsweise auch mit Amylasen oder Cellulasen verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben.
Unter den erfindungsgemäßen Polypeptiden sind solche Proteinvarianten bevorzugt, die einen oder mehrere Aminosäureaustausche in den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus aufweisen.
Erfindungsgemäße chimäre Proteine weisen im weitesten Sinne eine proteolytische Aktivität auf. Diese kann von einem Molekülteil ausgeübt oder modifiziert werden, das sich von einem erfindungsgemäßen Polypeptid herleitet. Die Chimären Proteine können über ihre Gesamtlänge hinweg somit auch außerhalb des oben beanspruchten Bereichs liegen. Der Sinn einer solchen Fusion besteht beispielsweise darin, mithilfe des heranfusionierten erfindungsgemäßen Proteinteils eine bestimmte Funktion oder Teilfunktion einzuführen oder zu modifizieren. Es ist dabei im Sinne der vorliegenden Erfindung unwesentlich, ob solch ein chimäres Protein aus einer einzelnen Polypeptidkette oder mehreren Untereinheiten besteht. Zur Realisierung der letztgenannten Alternative ist es beispielsweise möglich, posttranslational oder erst nach einem Aufreinigungsschritt durch eine gezielte proteolytische Spaltung eine einzelne chimäre Polypeptidkette in mehrere zu zerlegen.
So ist es beispielsweise in Anlehnung an WO 99/57254 möglich, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Teile davon über peptidische Linker oder direkt als Fusionsprotein mit Bindungsdomänen aus anderen Proteinen, etwa der Cellulose-Bindungsdomäne, zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu gestalten. Solch eine Bindungsdomäne könnte auch aus einer Protease stammen, etwa um die Bindung des erfindungsgemäßen Proteins an ein Protease-Substrat zu verstärken. Dies erhöht die lokale Protease-Konzentration, was in einzelnen Anwendungen, beispielsweise in der Behandlung von Rohstoffen vorteilhaft sein kann. Ebenso können erfindungsgemäße Proteine beispielsweise auch mit Amylasen oder Cellulasen verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben.
Die durch Insertionsmutation erhältlichen erfindungsgemäßen Polypeptide sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den erfindungsgemäßen Chimären Proteinen zuzuordnen. Hierher gehören auch Substitutionsvarianten, also solche, bei denen einzelne Bereiche des Moleküls gegen Elemente aus anderen Proteinen ersetzt worden sind.
Der Sinn von Insertions- und Su bstitutionsm utagenese besteht wie bei der Hybridbildung darin, einzelne Eigenschaften, Funktionen oder Teilfunktionen erfindungsgemäßer Proteine mit denen anderer Proteine zu kombinieren. Hierzu gehört beispielsweise auch über ein Shuffling oder Neukombination von Teilsequenzen aus verschiedenen Proteasen zu erhaltende Varianten. Dadurch können Proteine erhalten werden, die zuvor noch nicht beschrieben worden sind. Solche Techniken erlauben drastische Effekte bis hin zu sehr subtilen Aktivitätsmodulationen.
Vorzugsweise werden solche Mutationen nach einem statistischen, dem Bereich Directed Evolution zuzuordnenden Verfahren, wie beispielsweise nach der StEP-Methode (Zhao et al. (1998), Nat. Biotechnol., Band 16, S. 258-261 ), der Random priming recombination (Shao et al., (1998), Nucleic Acids Res., Band 26, S. 681-683), dem DNA-Shuffling (Stemmer, WP. C. (1994), Nature, Band 370, S. 389-391 ) oder Recursive sequence recombination (RSR; WO 98/27230, WO 97/20078, WO 95/22625) oder der Methode RACHITT (Coco, W.M. et al. (2001 ), Nat. Biotechnol., Band 19, S. 354-359) durchgeführt. Zweckmäßigerweise sind derartige Verfahren mit einem auf die Mutagenese und Expression folgenden Selektions- oder Screening-Verfahren gekoppelt, um Varianten mit den gewünschten Eigenschaften zu erkennen. Da diese Techniken auf der DNA-Ebene ansetzen, steht mit den jeweils zugehörigen neu erzeugten Genen der Ausgangspunkt für die biotechnologische Produktion zur Verfügung.
Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Solche Varianten können ebenfalls zielgerichtet oder zufallsgemäß erzeugt werden.
Bevorzugt sind all solche bislang ausgeführten erfindungsgemäßen Polypeptiden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie an sich Protein zu hydrolysieren vermögen.
Solche werden nach der offiziellen Enzyme Nomenclature 1992 der IUBMB unter 3.4 (Peptidasen) zusammengefaßt. Hierunter sind Endopeptidasen, besonders der Gruppen 3.4.21 Serin-Proteinasen, 3.4.22 Cystein-Proteinasen, 3.4.23 Aspartat-Proteinasen und 3.4.24 Metallo-Proteinasen bevorzugt. Unter diesen sind Serin-Proteinasen (3.4.21 ) besonders bevorzugt, hierunter Subtilasen und hierunter ganz besonders Subtilisine (vergleiche "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in "Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996). Hierunter sind wiederum die Subtilisine der Gruppe IS-2, der hochalkalischen Subtilisine, bevorzugt.
Hierbei sind aktive Moleküle inaktiven gegenüber bevorzugt, da beispielsweise in den unten ausgeführten Einsatzgebieten insbesondere die ausgeübte Proteolyse von Bedeutung ist.
Auch die oben ausgeführten Fragmente besitzen im weitesten Sinne eine proteolytische Aktivität, etwa zur Komplexierung eines Substrats oder zur Ausbildung eines für die Hydrolyse erforderlichen Strukturelements. Bevorzugt sind sie, wenn sie für sich betrachtet bereits zur Hydrolyse eines anderen Proteins eingesetzt werden können, ohne dass weitere Protease-Komponenten anwesend sein müssen. Dies betrifft die Aktivität, die von einer Protease an sich ausgeübt werden kann; die möglicherweise gleichzeitig notwendige Anwesenheit von Puffersubstanzen, Cofaktoren etc. bleibt hiervon unberührt.
Ein Zusammenspiel unterschiedlicher Molekülteile zur Hydrolyse von Proteinen besteht in Deletionsmutanten naturgemäß eher als in Fragmenten und ergibt sich insbesondere in Fusionsproteinen, ganz besonders solchen, die aus einem Shuffling verwandter Proteine hervorgegangen sind. Sofern dadurch eine im weitesten Sinne proteolytische Funktion aufrechterhalten, modifiziert, spezifiziert oder auch erst erreicht wird, handelt es sich bei den Deletionsvarianten wie bei den Fusionsproteinen um erfindungsgemäße Proteine. Bevorzugte Vertreter dieses Erfindungsgegenstands sind darunter die, die an sich dazu in der Lage sind, ein Protein-Substrat zu hydrolysieren, ohne dass weitere Protease-Komponenten anwesend sein müssen.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellen all solche bislang ausgeführten erfindungsgemäßen Polypeptide dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie zusätzlich stabilisiert sind.
Dadurch wird ihre Stabilität bei der Lagerung und/oder während ihres Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozess erhöht, so dass ihre Aktivität länger anhält und damit verstärkt wird. Die Stabilität erfindungsgemäßer Proteasen kann beispielsweise durch Kopplung an Polymere erhöht werden. Sie erfordert, dass die Proteine vor ihrem Einsatz in entsprechenden Mitteln über einen chemischen Kopplungsschritt mit derartigen Polymeren verbunden werden.
Bevorzugt sind Stabilisierungen, die über Punktmutagenese des Moleküls selbst möglich sind. Denn diese erfordern im Anschluss an die Proteingewinnung keine weiteren Arbeitsschritte. Einige hierfür geeigneten Punktmutationen sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt. So können Proteasen etwa dadurch stabilisiert werden, dass man bestimmte Tyrosin-Reste gegen andere austauscht.
Andere Möglichkeiten sind beispielsweise:
- Der Austausch bestimmter Aminosäurereste gegen Prolin;
- die Einführung polarerer oder geladener Gruppen auf der Oberfläche des Moleküls;
- Veränderung der Bindung von Metallionen, insbesondere der Calcium-Bindungsstellen.
- Gemäß des Patents US 5453372 können Proteine durch bestimmte Mutationen auf der Oberfläche gegen den Einfluß von denaturierenden Agentien wie Tensiden geschützt werden.
Eine andere Möglichkeit zur Stabilisierung gegenüber erhöhter Temperatur und dem Einwirken von Tensiden wäre die Stabilisierung über den Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellen all solche bislang ausgeführten erfindungsgemäßen Polypeptide dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie zusätzlich derivatisiert sind.
Unter Derivaten werden solche Proteine verstanden, die sich über eine zusätzliche Modifikation von den ausgeführten Proteinen ableiten. Derartige Modifikationen können beispielsweise die Stabilität, Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können auch dazu dienen, um die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen.
Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch erfolgen, etwa im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch den produzierenden Wirtsorganismus. Hier sind Kopplungen niedrig molekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben.
Derivatisierungen können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette oder durch kovalente Bindung einer anderen, beispielsweise makromolekularen Verbindung an das Protein. Beispielsweise kann so eine Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen des Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts erfolgen. Es können ferner etwa Makromoleküle wie Proteine, etwa über bifunktionelle chemische Verbindungen, an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. Bei einem solchen Makromolekül kann es sich etwa um eine Bindungsdomäne handeln. Solche Derivate eignen sich besonders für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln. Analog können auch Protease-Inhibitoren über Linker, insbesondere Aminosäure-Linker an die erfindungsgemäßen Proteine gebunden werden. Kopplungen mit sonstigen makromolekularen Verbindungen, wie etwa Polyethylenglykol verbessern das Molekül hinsichtlich weiterer Eigenschaften wie Stabilität oder Hautverträglichkeit.
Unter Derivaten erfindungsgemäßer Proteine können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Enzyme verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit bestimmten anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine proteolytische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe wie etwa Protease-Inhibitoren gesteuert werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellen all diejenigen Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie wenigstens eine antigene Determinante mit einem der oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Polypeptiden gemeinsam haben.
Denn entscheidend für die enzymatischen Aktivitäten sind die Sekundärstrukturelemente eines Proteins und dessen dreidimensionale Faltung. So können in ihrer Primärstruktur deutlich voneinander abweichende Domänen räumlich weitgehend übereinstimmende Strukturen ausbilden und somit gleiches enzymatisches Verhalten ermöglichen. Solche Gemeinsamkeiten in der Sekundärstruktur werden üblicherweise als übereinstimmende antigene Determinanten von Antiseren oder reinen oder monoklonalen Antikörpern erkannt. Über immunchemische Kreuzreaktionen können somit einander ähnliche Proteine oder Derivate detektiert und zugeordnet werden. Deshalb werden in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung gerade auch solche Proteine einbezogen, die möglicherweise nicht über ihre Homologiewerte in der Primärstruktur, wohl aber über ihre immunchemische Verwandtschaft den oben definierten erfindungsgemäßen Proteinen, Proteinfragmenten, Fusionsproteinen oder Derivaten zugeordnet werden können.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellen all solche bislang ausgeführten erfindungsgemäßen Polypeptide dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie aus einer natürlichen Quelle, insbesondere aus einem Mikroorganismus erhältlich sind.
Dies können beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien sein. Denn sie lassen sich zumeist einfacher gewinnen und handhaben als vielzellige Organismen oder die von Vielzellern abgeleiteten Zellkulturen; obgleich diese für spezielle Ausführungsformen sinnvolle Optionen darstellen können und somit nicht grundsätzlich vom Erfindungsgegenstand ausgeschlossen sind.
Es ist möglich, dass natürlich vorkommende Produzenten zwar ein erfindungsgemäßes Enzym herstellen können, dieses aber unter den zunächst ermittelten Bedingungen nur in geringem Maße exprimieren und/oder in das umgebende Medium abgeben. Das schließt aber nicht aus, dass geeignete Umweltbedingungen oder sonstige Faktoren experimentell ermittelt werden können, unter deren Einwirken sie zu einer wirtschaftlich sinnvollen Produktion des erfindungsgemäßen Proteins angeregt werden können. Solch ein Regulationsmechanismus kann für die biotechnologische Produktion gezielt eingesetzt werden. Sollte auch dies nicht möglich sein, können sie immer noch der Isolierung des zugehörigen Gens dienen.
Besonders bevorzugt sind hierunter solche aus gram-positiven Bakterien. Denn diese besitzen keine äußere Membran und geben sezernierte Proteine somit unmittelbar ins umgebende Medium ab.
Ganz besonders bevorzugt sind solche aus gram-positiven Bakterien der Gattung Bacillus.
Bacillus-Proteasen weisen von vornherein günstige Eigenschaften für diverse technische Einsatzmöglichkeiten auf. Dazu gehören eine gewisse Stabilität gegenüber erhöhter Temperatur, oxidierenden oder denaturierenden Agentien. Zudem hat man mit mikrobiellen Proteasen die größten Erfahrungen hinsichtlich ihrer biotechnologischen Produktion, was beispielsweise die Konstruktion günstiger Klonierungsvektoren, die Auswahl von Wirtszellen und Wachstumsbedingungen oder die Abschätzung von Risiken, wie beispielsweise die Allergenizität, angeht. Bacilli sind zudem als Produktionsorganismen mit einer besonders hohen Produktionsleistung in technischen Prozessen etabliert. Der Erfahrungsschatz, den man für die Herstellung und den Einsatz dieser Proteasen erworben hat, kommt zudem erfindungsgemäßen Weiterentwicklungen dieser Enzyme zugute. Dies betrifft beispielsweise ihre Kompatibilität mit anderen chemischen Verbindungen, wie beispielsweise die Inhaltsstoffe von Wasch- oder Reinigungsmitteln.
Unter denen aus den Bacillus-Species, wiederum, sind solche aus der Spezies Bacillus gibsonii, insbesondere aus dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm von Bacillus gibsonii bevorzugt.
Denn aus diesem wurde die Ausführungsform des erfindungsgemäßen Enzyms ursprünglich erhalten. Seine zugehörigen Sequenzen sind im Sequenzprotokoll angegeben. Von diesem oder von verwandten Stämmen können die oben beschriebenen Varianten insbesondere unter Anwendung molekularbiologischer Standardmethoden, wie beispielsweise der PCR und/oder an sich bekannten Punktmutagenese-Verfahren hergestellt werden.
Eine weitere Lösung der Aufgabe und somit einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen die Nukleinsäuren dar, die der Verwirklichung der Erfindung dienen.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen vollständige Gene herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus dem "Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, Band 1 , S. 267-271 und Band 2, S. 227-229, bekannt. Dies ist insbesondere dann möglich, wenn auf einen bei einer Stammsammlung hinterlegten Stamm zurückgegriffen werden kann. Beispielsweise mit PCR-Primern, die anhand einer bekannten Sequenz synthetisierbar sind, und/oder über isolierte mRNA-Moleküle können aus solchen Stämmen die betreffenden Gene synthetisiert, kloniert und gewünschtenfalls weiter bearbeitet, beispielsweise mutagenisiert werden.
Nukleinsäuren bilden den Ausgangspunkt nahezu aller molekularbiologischen Untersuchungen und Weiterentwicklungen sowie der Produktion von Proteinen. Dazu gehören insbesondere die Sequenzierung der Gene und die Ableitung der zugehörigen Aminosäure-Sequenz, jede Art von Mutagenese (siehe oben) und die Expression der Proteine.
Mutagenese zur Entwicklung von Proteinen mit bestimmten Eigenschaften wird auch als "Protein Engineering" bezeichnet. Eigenschaften, auf die optimiert wird, sind weiter oben bereits beispielhaft ausgeführt worden. Solch eine Mutagenese kann zielgerichtet oder über zufallsgemäße Methoden, beispielsweise mit einem anschließenden auf die Aktivität gerichteten Erkennungs- und/oder Auswahlverfahren (Screening und Selektion) an den klonierten Genen, etwa über Hybridisierung mit Nukleinsäure-Sonden, oder an den Genprodukten, den Proteinen, etwa über ihre Aktivität durchgeführt werden. Die Weiterentwicklung der erfindungsgemäßen Proteasen kann insbesondere auch an den in der Publikation "Protein engineering" von P.N.Bryan (2000) in Biochim. Biophys. Ada, Band 1543, S. 203-222, vorgestellten Überlegungen ausgerichtet werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch Polynukleotide, die für erfindungsgemäße Polypeptide, insbesondere Hydrolasen, vor allem alkalische Proteasen vom Subtilisin-Typ, kodieren. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher insbesondere Polynukleotide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , b) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 1 bis 342 gemäß SEQ ID NO: 1 , c) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 1 bis 81 gemäß SEQ ID NO: 1 , d) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 82 bis 342 gemäß SEQ ID NO: 1 , e) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 343 bis 1152 gemäß SEQ ID NO: 1 , f) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, g) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 1 bis 114 gemäß SEQ ID NO: 2, h) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 28 bis 114 gemäß SEQ ID NO: 2, i) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 115 bis 383 gemäß SEQ ID NO: 2, j) Polynukleotid kodierend für ein erfindungsgemäßes Polypeptid, k) natürlicherweise vorkommende oder künstlich erzeugte Mutanten oder polymorphe Formen oder Allele eines Polynukleotids gemäß (a) oder (e) mit bis zu 80, vorzugsweise mit bis zu 75, 70, 65, 60 oder 55, besonders bevorzugt bis zu 50, 45, 40, 35 oder 30, insbesondere bis zu 25, 20, 15 oder 10, vor allem bis zu 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 oder 2 Mutationen, ganz besonders bevorzugt mit genau einer Mutation,
I) natürlicherweise vorkommende oder künstlich erzeugte Mutanten oder polymorphe Formen oder Allele eines Polynukleotids gemäß (b) oder (d) mit bis zu 25, vorzugsweise mit bis zu 22, 20, 18, 16 oder 15, besonders bevorzugt bis zu 14, 13, 12, 11 oder 10, vor allem bis zu 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 oder 2 Mutationen, ganz besonders bevorzugt mit genau einer Mutation, m) Polynukleotide mit einer Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 91 , 92, 93, 94 oder 95 %, besonders bevorzugt mindestens 96, 97, 98 oder 99 %, in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a) oder (e), n) Polynukleotide mit einer Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 93 %, vorzugsweise mindestens 94, 95 oder 96 %, besonders bevorzugt mindestens 97, 98 oder 99 %, in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (d), o) unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid gemäß (a) bis (i) hybridisierende Polynukleotide, wobei unter stringenten Bedingungen vorzugsweise zu verstehen ist Inkubation bei 6O0C in einer Lösung, enthaltend 0, IxSSC und 0,1 % Natriumdodecylsulfst (SDS), wobei 2OxSSC eine Lösung enthaltend 3 M Natriumchlorid und 0,3 M Natriumeitrat (pH 7.0) bezeichnet, p) Polynukleotide, bestehend aus mindestens 200, insbesondere mindestens 250, 300, 350 oder 400, besonders bevorzugt mindestens 450, 500, 550 oder 600, vor allem mindestens 650, 700, 750 oder 800 aufeinanderfolgenden Nukleinsäuren eines Polynukleotids gemäß (a), (b), (d), (e), (f), (g), (h) oder (i), q) Polynukleotide mit Deletionen und/oder Insertionen und/oder Inversionen von bis zu 50, vorzugsweise von bis zu 40, 30 oder 20, besonders bevorzugt von bis zu 15, 10 oder 5, insbesondere von bis zu 4, 3 oder 2 Nukleotiden, vor allem Insertionen und/oder Deletionen von genau einem Nukleotid in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a) bis (p), insbesondere in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a) oder (e), r) Polynukleotide, umfassend mindestens eines der unter (a) bis (q) genannten Polynukleotide, s) zu Polynukleotiden gemäß (a) bis (r) komplementäre Polynukleotide.
Die Polynukleotide können als Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Erfindungsgegenstand sind neben den Desoxyribonukleinsäuren auch die homologen und komplementären Ribonukleinsäuren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere auch solche Polynukleotide, in denen bestimmte Bereiche unter Berücksichtigung des differierenden Codon-Usage eines für die Expression herangezogenen Wirtsorganismus durch andere Bereiche ersetzt wurden, um die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids zu ermöglichen.
Entsprechend den oben gemachten Angaben sind unter den oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren folgende zunehmend bevorzugt:
- Solche, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie aus einer natürlichen Quelle, insbesondere aus einem Mikroorganismus erhältlich sind;
- hierunter solche, die dadurch gekennzeichnet sind, dass es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-positives Bakterium handelt;
- hierunter solche, die dadurch gekennzeichnet sind, dass es sich bei dem gram-positiven Bakterium um eines der Gattung Bacillus handelt; und
- hierunter solche, die dadurch gekennzeichnet sind, dass es sich bei der Bacillus-Spezies um Bacillus gibsonii, insbesondere um den erfindungsgemäß verwendeten Stamm handelt.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Vektoren, die einen der zuvor bezeichneten, erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche enthalten, insbesondere einen, der für eines der zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Polypeptide kodiert.
Denn um mit den erfindungsrelevanten Nukleinsäuren umzugehen, und damit insbesondere die Produktion erfindungsgemäßer Polypeptide vorzubereiten, werden sie geeigneterweise in Vektoren ligiert. Solche Vektoren sowie die zugehörigen Arbeitsmethoden sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Vektoren sind in großer Zahl und Variationsbreite, sowohl für die Klonierung als auch für die Expression kommerziell erhältlich. Dazu gehören beispielsweise Vektoren, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Bacteriophagen oder von Viren ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren. Ferner werden sie nach der Art der Zelltypen, in denen sie sich zu etablieren vermögen, beispielsweise nach Vektoren für gram-negative, für gram-positive Bakterien, für Hefen oder für höhere Eukaryonten unterschieden. Sie bilden geeignete Ausgangspunkte beispielsweise für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen sowie für die Expression des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Klonierungsvektoren.
Denn Klonierungsvektoren eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens für dessen molekularbiologische Charakterisierung. Gleichzeitig stellen sie transportierbare und lagerfähige Formen der beanspruchten Nukleinsäuren dar und sind auch Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die PCR oder /n-wfro-Mutagenese-Verfahren.
Vorzugsweise handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Expressionsvektoren.
Denn derartige Expressionsvektoren sind die Basis dafür, die entsprechenden Nukleinsäuren in biologischen Produktionssystemen zu realisieren und damit die zugehörigen Proteine zu produzieren. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind Expressionsvektoren, die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen, beispielsweise den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor oder einen Promotor aus einem anderen Organismus. Diese Elemente können beispielsweise in Form einer sogenannten Expressionskassette angeordnet sein. Alternativ können einzelne oder alle Regulationselemente auch von der jeweiligen Wirtszelle bereitgestellt werden. Besonders bevorzugt sind die Expressionsvektoren hinsichtlich weiterer Eigenschaften, wie beispielsweise die optimale Kopienzahl, auf das gewählte Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle (siehe unten) abgestimmt.
Vorteilhaft für eine hohe Expressionsrate ist es weiterhin, wenn der Expressionsvektor möglichst nur das betreffende Gen als Insert enthält und keine größeren 5'- oder 3'-nichtcodierenden Bereiche. Solche Inserts werden beispielsweise erhalten, wenn das nach statistischer Behandlung der chromosomalen DNA des Ausgangsstamms mit einem Restriktionsenzym erhaltene Fragment nach der Sequenzierung vor der Integration in den Expressionsvektor noch einmal gezielt geschnitten worden ist. Ein Beispiel für einen Expressionsvektor ist der Vektor pAWA22. Weitere Vektoren stehen dem Fachmann aus dem Stand der Technik zur Verfügung und werden in großer Zahl kommerziell angeboten.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Zellen, die nach gentechnischer Modifizierung ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthalten.
Denn diese Zellen enthalten die genetische Information zur Synthese eines erfindungsgemäßen Proteins. Hierunter sind im Gegensatz zu den oben beschriebenen, ebenfalls beanspruchten natürlichen Produzenten diejenigen Zellen gemeint, die nach an sich bekannten Verfahren mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren versehen worden sind, beziehungsweise die sich von solchen Zellen ableiten. Dafür werden geeigneterweise solche Wirtszellen ausgewählt, die sich vergleichsweise einfach kultivieren lassen und/oder hohe Produktausbeuten liefern.
Sie ermöglichen beispielsweise die Amplifikation der entsprechenden Gene, aber auch deren Mutagenese oder Transkription und Translation und letztlich die biotechnologische Produktion der betreffenden Proteine. Diese genetische Information kann entweder extrachromosomal als eigenes genetisches Element, das heißt bei Bakterien in plasmidaler Lokalisation vorliegen oder in ein Chromosom integriert sein. Die Wahl eines geeigneten Systems hängt von Fragestellungen, wie beispielsweise die Art und Dauer der Lagerung des Gens, beziehungsweise des Organismus oder die Art der Mutagenese oder Selektion ab. So sind im Stand der Technik beispielsweise auf Bakteriophagen - und deren spezifischen Wirtszellen - beruhende Mutagenese- und Selektionsverfahren zur Entwicklung von Waschmittelenzymen beschrieben.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polynukleotid Teil eines der oben bezeichneten, erfindungsgemäßen Vektoren, insbesondere eines Klonierungs- oder Expressionsvektors.
Denn hierdurch werden sie zur Realisierung der vorliegenden Erfindung relevant.
Weiterhin sind solche Zellen bevorzugt, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimieren und vorzugsweise sezernieren.
Denn erst die die Proteine bildenden Wirtszellen ermöglichen deren biotechnologische Produktion. Als Wirtszellen zur Proteinexpression eignen sich prinzipiell alle Organismen, das heißt Prokaryonten, Eukaryonten oder Cyanophyta. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch gut handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor, dessen stabile Etablierung und die Regulation der Expression angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Vorzugsweise werden Laborstämme gewählt, die auf die Expression ausgerichtet sind. Solche sind kommerziell oder über allgemein zugängliche Stammsammlungen erhältlich. Jedes erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise theoretisch aus einer Vielzahl von Wirtsorganismen gewonnen werden. Aus der Fülle an verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systeme müssen die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermitteln werden.
Besonders vorteilhaft sind Wirtszellen, die selbst Protease-negativ sind und somit gebildete Proteine nicht abbauen.
Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund entsprechender genetischer Elemente in ihrer Aktivität regulierbar sind, beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder in Abhängigkeit von der jeweiligen Zelldichte. Diese kontrollierbare Expression ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Proteine; sie ist beispielsweise über ein entsprechendes Element auf dem betreffenden Vektor realisierbar. Geeigneterweise sind Gen, Expressionsvektor und Wirtszelle aufeinander abgestimmt, was beispielsweise die zur Expression notwendigen genetischen Elemente (Ribosomen-Bindungsstelle, Promotoren, Terminatoren) oder die Codon-Usage betrifft.
Hierunter sind solche Expressionswirte bevorzugt, die das gebildete Protein ins umgebende Medium sekretieren, weil es dadurch vergleichseise einfach aufgearbeitet werden kann.
Weiterhin bevorzugt sind Wirtszellen, bei denen es sich um Bakterien handelt.
Denn Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren etabliert werden. Zudem verfügt man bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf etc. gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein gramnegatives Bakterium, insbesondere eines der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
Denn bei gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise E coli, werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. In der Anmeldung WO 01/81597 A1 wird ein Verfahren offenbart, nach welchem erreicht wird, daß auch gramnegative Bakterien die exprimierten Proteine ausschleusen. Solch ein System ist auch für die Herstellung erfindungsgemäßer Proteine geeignet. Die als bevorzugt genannten gramnegativen Bakterien sind in der Regel leicht, das heißt kommerziell oder über öffentliche Stammsammlungen zugänglich und im Zusammenspiel mit ebenfalls in großer Zahl zur Verfügung stehenden übrigen Komponenten wie etwa Vektoren auf spezifische Herstellbedingungen hin optimierbar.
In einer alternativen, nicht minder bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein grampositives Bakterium, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterien, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii, B. gibsonii, B. pumilus oder ß. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebactehum glutamicum.
Denn grampositive Bakterien besitzen den gramnegativen gegenüber den grundsätzlichen Unterschied, sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abzugeben, aus welchem sich, wenn das gewünscht ist, die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aus dem Nährmedium aufreinigen lassen. Zudem sind sie mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Subtilisine verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Subtilisine, so daß sie über eine ähnliche Codon-Usage verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist. Ein weiterer Vorteil kann darin bestehen, daß über dieses Verfahren eine Mischung erfindungsmäßer Proteine mit den endogen von den Wirtsstämmen gebildeten Subtilisinen erhalten werden kann. Solch eine Coexpression geht ebenfalls aus der Anmeldung WO 91/02792 hervor. Sollte sie nicht gewünscht sein, müßten die in der Wirtszelle natürlicherweise vorhandenen Proteasegene dauerhaft oder vorübergehend inaktiviert werden.
Weiter bevorzugt sind Wirtszellen, bei denen es sich um eukaryontische Zellen, vorzugsweise der Gattung Saccharomyces handelt.
Beispiele hierfür sind Pilze wie Actinomyceten oder eben Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Thermophile pilzliche Expressionssysteme werden beispielsweise in WO 96/02653 A1 vorgestellt. Solche eignen sich besonders zur Expression temperaturbeständiger Varianten. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen, kann vorteilhaft sein.
Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids dar. Dazu gehört jedes Verfahren zur Herstellung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Polypeptids, beispielsweise chemische Syntheseverfahren.
Demgegenüber bevorzugt sind jedoch alle im Stand der Technik etablierten, oben in einzelnen Aspekten bereits angesprochenen molekularbiologischen, mikrobiologischen, beziehungsweise biotechnologischen Herstellverfahren, die auf den oben bezeichneten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren aufbauen. Hierfür kann entsprechend dem oben Gesagten beispielsweise auf die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 1 angegebene Nukleinsäuren oder hiervon entsprechend abgeleitete Mutanten oder Teilsequenzen davon zurückgegriffen werden.
Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren, die unter Einsatz eines zuvor bezeichneten Vektors und besonders bevorzugt vorzugsweise unter Einsatz einer zuvor bezeichneten, vorteilhafterweise gentechnisch modifizierten Zelle erfolgen. Denn hierdurch wird die entsprechend bevorzugte genetische Information in mikrobiologisch verwertbarer Form zur Verfügung gestellt.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auf der Grundlage der zugehörigen Nukleinsäuresequenzen auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Alle bereits oben ausgeführten Elemente können auch zu neuen Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar, so daß optimale Verfahren für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden müssen.
Entsprechend dem oben Gesagten sind unter den genannten Verfahren solche bevorzugt, bei denen die Nukleotidsequenz in einem, vorzugsweise mehreren Codons an die Codon-Usage des Wirtsstamms angepaßt worden ist.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Mittel dar, die zuvor genannte erfindungsgemäße Polypeptide enthalten.
Hiermit werden alle Arten von Mitteln, insbesondere Gemische, Rezepturen, Lösungen etc., deren Einsetzbarkeit durch Zugabe eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins verbessert wird, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Es kann sich dabei je nach Einsatzgebiet beispielsweise um feste Gemische, beispielsweise Pulver mit gefriergetrockeneten oder verkapselten Proteinen, oder um gelförmige oder flüssige Mittel handeln. Bevorzugte Rezepturen enthalten beispielsweise Puffersubstanzen, Stabilisatoren, Reaktionspartner und/oder Cofaktoren der Proteasen und/oder andere mit den Proteasen synergistische Inhaltsstoffe. Insbesondere sind darunter Mittel für die weiter unten ausgeführten Einsatzgebiete zu verstehen. Weitere Einsatzgebiete gehen aus dem Stand der Technik hervor und werden beispielsweise in dem Handbuch „Industrial enyzmes and their applications" von H. UhNg, Wiley-Verlag, New York, 1998 dargestellt.
Mögliche Einsatzgebiete sind hierbei insbesondere die Verwendung zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben, insbesondere auf Wolle oder Seide, sowie die Verwendung zur Pflege von Textilien, die natürliche Fasern, insbesondere Wolle oder Seide, enthalten.
Denn insbesondere natürliche Fasern, wie beispielsweise Wolle oder Seide, zeichnen sich durch eine charakteristische, mikroskopische Oberflächenstruktur aus. Diese kann, wie am Beispiel der Wolle im Artikel von R. Breier in Melliand Textilbehchte vom 1.4.2000 (S. 263) ausgeführt worden ist, langfristig zu unerwünschten Effekten, wie etwa Verfilzung führen. Zur Vermeidung solcher Effekte werden die natürlichen Rohstoffe mit erfindungsgemäßen Mitteln behandelt, welche beispielsweise dazu beitragen, die auf Proteinstrukturen beruhende geschuppte Oberflächenstruktur zu glätten und damit einem Verfilzen entgegenwirken.
Erfindungsgegenstand sind entsprechend auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen und zur Textilpflege, bei denen in wenigstens einem der Verfahrensschritte erfindungsgemäße Polypeptide verwendet werden. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, insbesondere für solche mit Wolle oder Seide. Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine pflegende Komponente bereichern.
Weitere mögliche Einsatzgebiete sind etwa
- die Verwendung zur biochemischen Analyse oder zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen, darunter bevorzugt die Verwendung zur Endgruppenbestimmung im Rahmen einer Peptid-Sequenzanalyse;
- die Verwendung zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen;
- die Verwendung zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder, insbesondere zur Enthaarung von Leder;
- die Verwendung zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten; und
- die Verwendung zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln, insbesondere zur enzymatischen Behandlung von Sojamilch und/oder Sojamilchprodukten. Grundsätzlich wird der Einsatz der zuvor genannten erfindungsgemäßen Polypeptide in allen weiteren Technikgebieten, für die er sich als geeignet herausstellt, in den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen.
Eine weitere erfindungsgemäße Verwendungsmöglichkeit ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Polypeptide in kosmetischen Mitteln. Hierunter werden alle Arten von reinigenden und pflegenden Mitteln für menschliche Haut oder menschliches Haar verstanden, insbesondere reinigende Mittel. Bei dem Mittel kann es sich je nach Anwendungszweck auch um ein pharmazeutisches Mittel handeln.
Denn Proteasen spielen auch im Zellerneuerungsprozeß der menschlichen Haut (Desquamation) eine entscheidende Rolle (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venera/., Band 71 (1991 ), S. 471-474). Dementsprechend werden Proteasen auch als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln verwendet, um den Abbau der in trockener Haut vermehrten Desmosomenstrukturen zu unterstützen. Der Einsatz von Subtilisin-Proteasen mit Aminosäureaustauschen in den Positionen R99G/A/S, S154D/E und/oder L211 D/E für kosmetische Zwecke wird beispielsweise in WO 97/07770 A1 beschrieben. Entsprechend dem oben Gesagten können erfindungsgemäße Proteasen über die entsprechenden Punktmutationen weiterentwickelt werden. Somit eignen sich auch erfindungsgemäße Proteasen, insbesondere solche, die etwa nach Mutagenese oder durch Zugabe entsprechender, mit ihnen wechselwirkender Stoffe in ihrer Aktivität kontrolliert sind, als aktive Komponenten in Haut- oder Haar-Reinigungs- oder Pflegemitteln. Besonders bevorzugt sind solche Präparationen dieser Enzyme, die wie oben beschrieben, beispielsweise durch Kopplung an makromolekulare Träger (vergleiche US 5230891 ) stabilisiert und/oder durch Punktmutationen an hochallergenen Positionen derivatisiert sind, so daß sie für den Menschen eine höhere Hautverträglichkeit aufweisen.
Als Beispiele für erfindungsgemäße kosmetische und/oder pharmazeutische Mittel seien Shampoos, Seifen, Wasch lotionen, Cremes, Peelings sowie Mund-, Zahn- oder Zahnprothesenpflegemittel genannt. Diese Mittel können insbesondere auch Bestandteile enthalten, wie sie weiter unten für Wasch- und Reinigungsmittel genannt werden.
Dementsprechend werden auch entsprechende kosmetische Reinigungs- und Pflegeverfahren und die Verwendung derartiger proteolytischer Enzyme zu kosmetischen Zwecken in diesen Erfindungsgegenstand einbezogen, insbesondere in entsprechenden Mitteln, wie beispielsweise Shampoos, Seifen oder Waschlotionen, oder in Pflegemitteln, die beispielsweise in Form von Cremes angeboten werden. Auch die Verwendung in einem schälenden Arzneimittel, beziehungsweise die Verwendung zu dessen Herstellung ist in diesen Gegenstand eingeschlossen.
Einen erfindungsgemäß besonders bevorzugten Gegenstand stellen Wasch- und Reinigungsmittel dar, die erfindungsgemäße Polypeptide enthalten. Denn wie in den Ausführungsbeispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt wird, konnte für Wasch- und Reinigungsmittel mit einer erfindungsgemäß bevorzugten Protease überraschenderweise eine Steigerung der Waschleistung gegenüber Mitteln mit herkömmlicherweise eingesetzten Proteasen festgestellt werden.
Unter der Waschleistung oder der Reinigungsleistung eines Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittels ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung der Effekt zu verstehen, den das betrachtete Mittel auf die verschmutzten Artikel, beispielsweise Textilien oder Gegenstände mit harten Oberflächen ausübt. Einzelne Komponenten solcher Mittel, insbesondere die erfindungsgemäßen Enzyme, werden hinsichtlich ihres Beitrags zur Wasch- oder Reinigungsleistung des gesamten Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittels beurteilt. Es ist hierbei insbesondere zu berücksichtigen, dass aus den enzymatischen Eigenschaften eines Enzyms nicht ohne weiteres auf seinen Beitrag zur Waschleistung eines Mittels geschlossen werden kann. Vielmehr spielen hier neben der enzymatischen Aktivität insbesondere auch Faktoren wie Stabilität, Substratbindung, Bindung an das Reinigungsgut oder Wechselwirkungen mit anderen Inhaltsstoffen der Wasch- oder Reinigungsmittel, insbesondere auch mögliche Synergieeffekte bei der Entfernung der Verschmutzungen, eine Rolle.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Wasch- und Reinigungsmittel, insbesondere Tensid- und/oder Bleichmittel-haltige, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthalten.
Bei den erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsmitteln kann es sich um alle denkbaren Reinigungsmittelarten handeln, sowohl um Konzentrate als auch um unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche, beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet. Im weiteren Sinne sind auch Sterilisations- und Desinfektionsmittel als Wasch- und Reinigungsmittel im erfindungsgemäßen Sinne anzusehen.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle nach den Stand der Technik etablierten und/oder alle zweckmäßigen Darreichungsformen der erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel. Dazu zählen beispielsweise feste, pulverförmige, flüssige, gelförmige oder pastöse Mittel, gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen, komprimiert oder nicht komprimiert; ferner gehören beispielsweise dazu: Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere alkalische Proteasen vom Subtilisin-Typ, in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro Gramm des Mittels. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Die Proteaseaktivität in derartigen Mitteln kann nach der in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132 beschriebenen Methode ermittelt werden. Sie wird dementsprechend in PE (Protease-Einheiten) angegeben.
Bei dem Vergleich der Leistungen zweier Waschmittelenzyme, wie etwa in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung, muss zwischen proteingleichem und aktivitätsgleichem Einsatz unterschieden werden. Insbesondere bei gentechnisch erhaltenen, weitgehend nebenaktivitätsfreien Präparationen ist der proteingleiche Einsatz angebracht. Denn damit ist eine Aussage darüber möglich, ob dieselben Proteinmengen - als Maß für den Ertrag der fermentativen Produktion - zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Klaffen die jeweiligen Verhältnisse von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) auseinander, so ist ein aktivitätsgleicher Vergleich zu empfehlen, weil hierüber die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften verglichen werden. Generell gilt, daß eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Hierbei handelt es sich letztlich um eine ökonomische Erwägung.
Neben einem erfindungsgemäßen Polypeptid enthält ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe wie weitere Enzyme, Enzymstabilisatoren, Tenside, z. B. nichtionische, anionische und/oder amphotere Tenside, und/oder Bleichmittel, und/oder Builder, sowie gegebenenfalls weitere übliche Inhaltsstoffe, die im folgenden ausgeführt werden.
Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2- -Stellung methylverzweigt sein kann, beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, zum Beispiel aus Kokos-, Palm-, Taigfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise Ci2-14-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C9-n-Alkohol mit 7 EO, C-ms-Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C12-i8-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C12-i4-Alkohol mit 3 EO und C12-i8-Alkohol mit 5 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow ränge ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Taigfettalkohol mit 14 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO.
Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester.
Eine weitere Klasse von nichtionischen Tensiden, die vorteilhafterweise eingesetzt werden kann, sind die Alkylpolyglycoside (APG). Einsetzbare Alkypolyglycoside genügen der allgemeinen Formel RO(G)Z, in der R einen linearen oder verzweigten, insbesondere in 2-Stellung methylverzweigten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G das Symbol ist, das für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der Glycosylierungsgrad z liegt dabei zwischen 1 ,0 und 4,0, vorzugsweise zwischen 1 ,0 und 2,0 und insbesondere zwischen 1 ,1 und 1 ,4. Bevorzugt eingesetzt werden lineare Alkylpolyglucoside, also Alkylpolyglycoside, in denen der Polyglycosylrest ein Glucoserest und der Alkylrest ein n-Alkylrest ist.
Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl- N,N-dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide können geeignet sein. Der Anteil dieser nichtionischen Tenside liegt vorzugsweise nicht über dem der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere bei nicht mehr als der Hälfte davon.
Weitere geeignete Tenside sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (I),
R1 R-CO-N-[Z] (I)
in der RCO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R^ für Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht. Bei den Polyhydroxyfettsäureamiden handelt es sich um bekannte Stoffe, die üblicherweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers mit Ammoniak, einem Alkylamin oder einem Alkanolamin und nachfolgende Acylierung mit einer Fettsäure, einem Fettsäurealkylester oder einem Fettsäurechlorid erhalten werden können.
Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (II), R1-O-R2 R-CO-N-[Z] (II)
in der R für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R1 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R2 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei Ci_4-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest steht, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes.
[Z] wird vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers erhalten, beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden.
Als anionische Tenside werden beispielsweise solche vom Typ der Sulfonate und Sulfate eingesetzt. Als Tenside vom Sulfonat-Typ kommen dabei vorzugsweise C9-13-Alkylbenzolsulfonate, Olefinsulfonate, das heißt Gemische aus Alken- und Hydroxyalkansulfonaten sowie Disulfonaten, wie man sie beispielsweise aus C-|2-18-Monoolefinen mit end- oder innenständiger Doppelbindung durch Sulfonieren mit gasförmigem Schwefeltrioxid und anschließende Alkalische oder saure Hydrolyse der Sulfonierungsprodukte erhält, in Betracht. Geeignet sind auch Alkansulfonate, die aus Ci2-18-Alkanen beispielsweise durch Sulfochlorierung oder Sulfoxidation mit anschließender Hydrolyse beziehungsweise Neutralisation gewonnen werden. Ebenso sind auch die Ester von CC
-Sulfofettsäuren (Estersulfonate), zum Beispiel die CC-sulfonierten Methylester der hydrierten Kokos-, Palmkern- oder Taigfettsäuren geeignet.
Weitere geeignete Aniontenside sind sulfierte Fettsäureglycerinester. Unter Fettsäureglycerinestern sind die Mono-, Di- und Triester sowie deren Gemische zu verstehen, wie sie bei der Herstellung durch Veresterung von einem Monoglycerin mit 1 bis 3 Mol Fettsäure oder bei der Umesterung von Triglyceriden mit 0,3 bis 2 Mol Glycerin erhalten werden. Bevorzugte sulfierte Fettsäureglycerinester sind dabei die Sulfierprodukte von gesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, beispielsweise der Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Myristinsäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder Behensäure.
Als Alk(en)ylsulfate werden die Alkali- und insbesondere die Natriumsalze der Schwefelsäurehalbester der Ci2-Ci8-Fettalkohole, beispielsweise aus Kokosfettalkohol, Taigfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder der d0-C2o-Oxoalkohole und diejenigen Halbester sekundärer Alkohole dieser Kettenlängen bevorzugt. Weiterhin bevorzugt sind Alk(en)ylsulfate der genannten Kettenlänge, welche einen synthetischen, auf petrochemischer Basis hergestellten geradkettigen Alkylrest enthalten, die ein analoges Abbauverhalten besitzen wie die adäquaten Verbindungen auf der Basis von fettchemischen Rohstoffen. Aus waschtechnischem Interesse sind die Ci2-Ci6-Alkylsulfate und Ci2-Ci5-Alkylsulfate sowie Ci4-Ci5-Alkylsulfate bevorzugt. Auch 2,3-Alkylsulfate sind geeignete Aniontenside.
Auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C7.2i-Alkohole, wie 2-Methyl-verzweigte Cg-n-Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C12-i8-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO, sind geeignet. Sie werden in Reinigungsmitteln aufgrund ihres hohen Schaumverhaltens nur in relativ geringen Mengen, beispielsweise in Mengen bis 5 Gew.-%, üblicherweise von 1 bis 5 Gew.-%, eingesetzt.
Weitere geeignete Aniontenside sind auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C8-i8-Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside darstellen (Beschreibung siehe oben). Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettalkohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzusetzen.
Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierte Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern- oder Taigfettsäuren, abgeleitete Seifengemische.
Die anionischen Tenside einschließlich der Seifen können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.
Die Tenside können in den erfindungsgemäßen Reinigungs- oder Waschmitteln insgesamt in einer Menge von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bezogen auf das fertige Mittel, enthalten sein.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können Bleichmittel enthalten. Unter den als Bleichmittel dienenden, in Wasser H2O2 liefernden Verbindungen haben das Natriumpercarbonat, das Natriumperborattetrahydrat und das Natriumperboratmonohydrat besondere Bedeutung. Weitere brauchbare Bleichmittel sind beispielsweise Peroxopyrophosphate, Citratperhydrate sowie H2O2 liefernde persaure Salze oder Persäuren, wie Persulfate beziehungsweise Perschwefelsäure. Brauchbar ist auch das Harnstoffperoxohydrat Percarbamid, das durch die Formel H2N-CO-NH2 H2O2 beschrieben werden kann. Insbesondere beim Einsatz der Mittel für das Reinigen harter Oberflächen, zum Beispiel beim maschinellen Geschirrspülen, können sie gewünschtenfalls auch Bleichmittel aus der Gruppe der organischen Bleichmittel enthalten, obwohl deren Einsatz prinzipiell auch bei Mitteln für die Textilwäsche möglich ist. Typische organische Bleichmittel sind die Diacylperoxide, wie zum Beispiel Dibenzoylperoxid. Weitere typische organische Bleichmittel sind die Peroxysäuren, wobei als Beispiele besonders die Alkylperoxysäuren und die Arylperoxysäuren genannt werden. Bevorzugte Vertreter sind die Peroxybenzoesäure und ihre ringsubstituierten Derivate, wie Alkylperoxybenzoesäuren, aber auch Peroxy-α-Naphthoesäure und Magnesium-monoperphthalat, die aliphatischen oder substituiert ali- phatischen Peroxysäuren, wie Peroxylaurinsäure, Peroxystearinsäure, ε-Phthalimidoper- oxycapronsäure (Phthalimidoperoxyhexansäure, PAP), o-Carboxybenzamidoperoxycapronsäure, N-Nonenylamidoperadipinsäure und N-Nonenylamidopersuccinate, und aliphatische und araliphatische Peroxydicarbonsäuren, wie 1 ,12-Diperoxycarbonsäure, 1 ,9-Diperoxyazelainsäure, Diperoxysebacinsäure, Diperoxybrassylsäure, die Diperoxyphthalsäuren, 2-Decyldiperoxybutan-1 ,4-disäure, N,N-Terephthaloyl-di(6-aminopercapronsäure) können eingesetzt werden.
Der Gehalt der Wasch- oder Reinigungsmittel an Bleichmittel kann 1 bis 40 Gew.-% und insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, betragen, wobei vorteilhafterweise Perboratmonohydrat oder Percarbonat eingesetzt wird.
Um beim Waschen bei Temperaturen von 60 0C und darunter, und insbesondere bei der Wäschevorbehandlung eine verbesserte Bleichwirkung zu erreichen, können die Mittel auch Bleichaktivatoren enthalten. Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolyse- bedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1 ,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1 ,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glycolurile, insbesondere 1 ,3,4,6-Tetraacetylglycoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), acylierte Hydroxycarbonsäuren, wie Triethyl-O-acetylcitrat (TEOC), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, lsatosäureanhydrid und/oder Bernsteinsäureanhydrid, Carbonsäureamide, wie N-Methyldiacetamid, Glycolid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglycoldiacetat, Isopropenylacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und die aus den deutschen Patentanmeldungen DE 196 16 693 und DE 196 16 767 bekannten Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren in der europäischen Patentanmeldung EP 0 525 239 beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglucose (PAG), Pentaacetylfructose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin beziehungsweise Gluconolacton, Triazol beziehungsweise Triazolderivate und/oder teilchenförmige Caprolactame und/oder Caprolactamderivate, bevorzugt N-acylierte Lactame, beispielsweise N-Benzoylcaprolactam und N-Acetylcaprolactam, die aus den internationalen Patentanmeldungen WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 und WO 95/17498 bekannt sind. Die aus der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 769 bekannten hydrophil substituierten Acylacetale und die in der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 770 sowie der internationalen Patentanmeldung WO 95/14075 beschriebenen Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch die aus der deutschen Patentanmeldung DE 44 43 177 bekannten Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Ebenso können Nitrilderivate wie Cyanopyridine, Nitrilquats, zum Beispiel N-Alkylammoniumacetonitrile, und/oder Cyanamidderivate eingesetzt werden. Bevorzugte Bleichaktivatoren sind Natrium-4-(octanoyloxy)-benzolsulfonat, n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), Undecenoyloxybenzolsulfonat (UDOBS), Natrium- dodecanoyloxybenzolsulfonat (DOBS), Decanoyloxybenzoesäure (DOBA, OBC 10) und/oder Dodecanoyloxybenzolsulfonat (OBS 12), sowie N-Methylmorpholinum-acetonitril (MMA). Derartige Bleichaktivatoren können im üblichen Mengenbereich von 0,01 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 15 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 10 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, enthalten sein.
Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein. Bei diesen Stoffen handelt es sich um bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe wie beispielsweise Mn-, Fe-, Co-, Ru - oder Mo-Salenkomplexe oder -carbonylkomplexe. Auch Mn-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, V- und Cu-Komplexe mit N-haltigen Tripod-Liganden sowie Co-, Fe-, Cu- und Ru-Amminkomplexe sind als Bleichkatalysatoren geeignet, wobei solche Verbindungen bevorzugt eingesetzt werden, die in der DE 19709284 A1 beschrieben sind.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel enthalten in der Regel einen oder mehrere Builder, insbesondere Zeolithe, Silikate, Carbonate, organische Cobuilder und - wo keine ökologischen Gründe gegen ihren Einsatz sprechen - auch die Phosphate. Letztere sind insbesondere in Reinigungsmitteln für das maschinelle Geschirrspülen bevorzugt einzusetzende Gerüststoffe.
Zu nennen sind hier kristalline, schichtförmige Natriumsilicate der allgemeinen Formel NaMSixO2x+I yH2O, wobei M Natrium oder Wasserstoff bedeutet, x eine Zahl von 1 ,6 bis 4, vorzugsweise 1 ,9 bis 4,0 und y eine Zahl von 0 bis 20 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Derartige kristalline Schichtsilicate werden beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung EP 164514 beschrieben. Bevorzugte kristalline Schichtsilicate der angegebenen Formel sind solche, in denen M für Natrium steht und x die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl ß- als auch δ-Natriumdisilicate Na2Si2O5 YH2O bevorzugt. Im Handel befinden sich derartige Verbindungen beispielsweise unter der Bezeichnung SKS® (Firma Clariant). So handelt es sich bei SKS-6® vorwiegend um ein δ-Natriumdisilicat mit der Formel Na2Si2O5 ^yH2O, bei SKS-7® vorwiegend um das ß-Natriumdisilicat. Durch Reaktion mit Säuren (zum Beispiel Citronensäure oder Kohlensäure) entsteht aus dem δ-Natriumdisilicat Kanemit NaHSi2O5 yH2O, im Handel unter den Bezeichnungen SKS-9® beziehungsweise SKS-10® (Firma Clariant). Von Vorteil kann es auch sein, chemische Modifikationen dieser Schichtsilicate einzusetzen. So kann beispielsweise die Alkalität der Schichtsilicate geeignet beeinflußt werden. Mit Phosphat beziehungsweise mit Carbonat dotierte Schichtsilicate weisen im Vergleich zu dem δ-Natriumdisilicat veränderte Kristallmorphologien auf, lösen sich schneller und zeigen im Vergleich zu δ-Natriumdisilicat ein erhöhtes Calciumbindevermögen. So sind Schichtsilicate der allgemeinen Summenformel x Na2O • y SiO2 • z P2O5, in der das Verhältnis x zu y einer Zahl 0,35 bis 0,6, das Verhältnis x zu z einer Zahl von 1 ,75 bis 1200 und das Verhältnis y zu z einer Zahl von 4 bis 2800 entsprechen, in der Patentanmeldung DE 196 01 063 beschrieben. Die Löslichkeit der Schichtsilicate kann auch erhöht werden, indem besonders feinteilige Schichtsilicate eingesetzt werden. Auch Compounds aus den kristallinen Schichtsilicaten mit anderen Inhaltsstoffen können eingesetzt werden. Dabei sind insbesondere Compounds mit Cellulosederivaten, die Vorteile in der desintegrierenden Wirkung aufweisen und insbesondere in Waschmitteltabletten eingesetzt werden, sowie Compounds mit Polycarboxylaten, zum Beispiel Citronensäure, beziehungsweise polymeren Polycarboxylaten, zum Beispiel Copolymeren der Acrylsäure, zu nennen.
Einsetzbar sind auch amorphe Natriumsilikate mit einem Modul Na2O : SiO2 von 1 :2 bis 1 :3,3, vorzugsweise von 1 :2 bis 1 :2,8 und insbesondere von 1 :2 bis 1 :2,6, welche löseverzögert sind und Sekundärwascheigenschaften aufweisen. Die Löseverzögerung gegenüber herkömmlichen amorphen Natriumsilikaten kann dabei auf verschiedene Weise, beispielsweise durch Oberflächenbehandlung, Compoundierung, Kom paktierung/ Verdichtung oder durch Übertrocknung hervorgerufen worden sein. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter dem Begriff "amorph" auch "röntgenamorph" verstanden. Dies heißt, daß die Silikate bei Röntgenbeugungsexperimenten keine scharfen Röntgenreflexe liefern, wie sie für kristalline Substanzen typisch sind, sondern allenfalls ein oder mehrere Maxima der gestreuten Röntgenstrahlung, die eine Breite von mehreren Gradeinheiten des Beugungswinkels aufweisen. Es kann jedoch sehr wohl sogar zu besonders guten Buildereigenschaften führen, wenn die Silikatpartikel bei Elektronenbeugungsexperimenten verwaschene oder sogar scharfe Beugungsmaxima liefern. Dies ist so zu interpretieren, daß die Produkte mikrokristalline Bereiche der Größe 10 bis einige Hundert nm aufweisen, wobei Werte bis max. 50 nm und insbesondere bis max. 20 nm bevorzugt sind. Insbesondere bevorzugt sind verdichtete/kom paktierte amorphe Silikate, compoundierte amorphe Silikate und übertrocknete röntgenamorphe Silikate.
Ein gegebenenfalls einsetzbarer, feinkristalliner, synthetischer und gebundenes Wasser enthaltender Zeolith ist vorzugsweise Zeolith A und/oder P. Als Zeolith P wird Zeolith MAP® (Handelsprodukt der Firma Crosfield) besonders bevorzugt. Geeignet sind jedoch auch Zeolith X sowie Mischungen aus A, X und/oder P. Kommerziell erhältlich und im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt einsetzbar ist beispielsweise auch ein Co-Kristallisat aus Zeolith X und Zeolith A (ca. 80 Gew.-% Zeolith X), das von der Firma CONDEA Augusta S.p.A. unter dem Markennamen VEGOBOND AX® vertrieben wird und durch die Formel
nNa2O ■ (1-1I)K2O ■ AI2O3 ■ (2 - 2,5)SiO2 ■ (3,5 - 5,5) H2O
beschrieben werden kann. Geeignete Zeolithe weisen eine mittlere Teilchengröße von weniger als 10 μm (Volumenverteilung; Meßmethode: Coulter Counter) auf und enthalten vorzugsweise 18 bis 22 Gew.-%, insbesondere 20 bis 22 Gew.-% an gebundenem Wasser.
Selbstverständlich ist auch ein Einsatz der allgemein bekannten Phosphate als Buildersubstanzen möglich, sofern ein derartiger Einsatz nicht aus ökologischen Gründen vermieden werden sollte. Unter der Vielzahl der kommerziell erhältlichen Phosphate haben die Alkalimetallphosphate unter besonderer Bevorzugung von Pentanatrium- beziehungsweise Pentakaliumtriphosphat (Natriumbeziehungsweise Kaliumtripolyphosphat) in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie die größte Bedeutung.
Alkalimetallphosphate ist dabei die summarische Bezeichnung für die Alkalimetall- (insbesondere Natrium- und Kalium-) -Salze der verschiedenen Phosphorsäuren, bei denen man Metaphosphorsäuren (HPO3)n und Orthophosphorsäure H3PO4 neben höhermolekularen Vertretern unterscheiden kann. Die Phosphate vereinen dabei mehrere Vorteile in sich: Sie wirken als Alkaliträger, verhindern Kalkbeläge auf Maschinenteilen beziehungsweise Kalkinkrustationen in Geweben und tragen überdies zur Reinigungsleistung bei.
Natriumdihydrogenphosphat, NaH2PO4, existiert als Dihydrat (Dichte 1 ,91 gern 3, Schmelzpunkt 60°) und als Monohydrat (Dichte 2,04 gern 3). Beide Salze sind weiße, in Wasser sehr leicht lösliche Pulver, die beim Erhitzen das Kristallwasser verlieren und bei 2000C in das schwach saure Diphosphat (Dinatriumhydrogendiphosphat, Na2H2P2O7), bei höherer Temperatur in Natiumtrimetaphosphat (Na3P3O9) und Maddrellsches Salz (siehe unten), übergehen. NaH2PO4 reagiert sauer; es entsteht, wenn Phosphorsäure mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und die Maische versprüht wird. Kaliumdihydrogenphosphat (primäres oder einbasiges Kaliumphosphat, Kaliumbiphosphat, KDP), KH2PO4, ist ein weißes Salz der Dichte 2,33 gern'3, hat einen Schmelzpunkt von 2530C [Zersetzung unter Bildung von Kaliumpolyphosphat (KPO3)J und ist leicht löslich in Wasser.
Dinatriumhydrogenphosphat (sekundäres Natriumphosphat), Na2HPO4, ist ein farbloses, sehr leicht wasserlösliches kristallines Salz. Es existiert wasserfrei und mit 2 Mol. (Dichte 2,066 gern'3, Wasserverlust bei 95°), 7 Mol. (Dichte 1 ,68 gern"3, Schmelzpunkt 480C unter Verlust von 5 H2O) und 12 Mol. Wasser (Dichte 1 ,52 gern"3, Schmelzpunkt 350C unter Verlust von 5 H2O), wird bei 100°C wasserfrei und geht bei stärkerem Erhitzen in das Diphosphat Na4P2O7 über. Dinatriumhydrogenphosphat wird durch Neutralisation von Phosphorsäure mit Sodalösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator hergestellt. Dikaliumhydrogenphosphat (sekundäres od. zweibasiges Kaliumphosphat), K2HPO4, ist ein amorphes, weißes Salz, das in Wasser leicht löslich ist.
Trinatriumphosphat, tertiäres Natriumphosphat, Na3PO4, sind farblose Kristalle, die als Dodecahydrat eine Dichte von 1 ,62 gern"3 und einen Schmelzpunkt von 73-760C (Zersetzung), als Decahydrat (entsprechend 19-20% P2O5) einen Schmelzpunkt von 1000C und in wasserfreier Form (entsprechend 39-40% P2O5) eine Dichte von 2,536 gern'3 aufweisen. Trinatriumphosphat ist in Wasser unter Alkalischer Reaktion leicht löslich und wird durch Eindampfen einer Lösung aus genau 1 Mol Dinatriumphosphat und 1 Mol NaOH hergestellt. Trikaliumphosphat (tertiäres oder dreibasiges Kaliumphosphat), K3PO4, ist ein weißes, zerfließliches, körniges Pulver der Dichte 2,56 gern'3, hat einen Schmelzpunkt von 1340° und ist in Wasser mit Alkalischer Reaktion leicht löslich. Es entsteht zum Beispiel beim Erhitzen von Thomasschlacke mit Kohle und Kaliumsulfat. Trotz des höheren Preises werden in der Reinigungsmittel-Industrie die leichter löslichen, daher hochwirksamen, Kaliumphosphate gegenüber entsprechenden Natrium-Verbindungen vielfach bevorzugt.
Tetranatriumdiphosphat (Natriumpyrophosphat), Na4P2O7, existiert in wasserfreier Form (Dichte 2,534 gern'3, Schmelzpunkt 9880C, auch 88O0C angegeben) und als Decahydrat (Dichte 1 ,815-1 ,836 gern"3, Schmelzpunkt 940C unter Wasserverlust). Beide Substanzen sind farblose, in Wasser mit Alkalischer Reaktion lösliche Kristalle. Na4P2O7 entsteht beim Erhitzen von Dinatriumphosphat auf >200°C oder indem man Phosphorsäure mit Soda im stöchiometrischem Verhältnis umsetzt und die Lösung durch Versprühen entwässert. Das Decahydrat komplexiert Schwermetall-Salze und Härtebildner und verringert daher die Härte des Wassers. Kaliumdiphosphat (Kaliumpyrophosphat), K4P2O7, existiert in Form des Trihydrats und stellt ein farbloses, hygroskopisches Pulver mit der Dichte 2,33 gern'3 dar, das in Wasser löslich ist, wobei der pH-Wert der 1 %igen Lösung bei 250C 10,4 beträgt.
Durch Kondensation des NaH2PO4 beziehungsweise des KH2PO4 entstehen höhermolekulare Natrium- und Kaliumphosphate, bei denen man cyclische Vertreter, die Natrium- beziehungsweise Kaliummetaphosphate und kettenförmige Typen, die Natrium- beziehungsweise Kaliumpolyphosphate, unterscheiden kann. Insbesondere für letztere sind eine Vielzahl von Bezeichnungen in Gebrauch: Schmelz- oder Glühphosphate, Grahamsches Salz, Kurrolsches und Maddrellsches Salz. Alle höheren Natrium- und Kaliumphosphate werden gemeinsam als kondensierte Phosphate bezeichnet.
Das technisch wichtige Pentanatriumtriphosphat (Na5P3Oi0; Natriumtripolyphosphat) ist ein wasserfrei oder mit 6 H2O kristallisierendes, nicht hygroskopisches, weißes, wasserlösliches Salz der allgemeinen Formel NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na mit n=3. In 100 g Wasser lösen sich bei Zimmertemperatur etwa 17 g, bei 6O0C ca. 20 g, bei 1000C rund 32 g des kristallwasserfreien Salzes; nach zweistündigem Erhitzen der Lösung auf 1000C entstehen durch Hydrolyse etwa 8% Orthophosphat und 15% Diphosphat. Bei der Herstellung von Pentanatriumtriphosphat wird Phosphorsäure mit Sodalösung oder Natronlauge im stöchiometrischen Verhältnis zur Reaktion gebracht und die Lösung durch Versprühen entwässert. Ähnlich wie Grahamsches Salz und Natriumdiphosphat löst Pentanatriumtriphosphat viele unlösliche Metall-Verbindungen (auch Kalkseifen usw.). Pentakaliumtriphosphat, K5P3O10 (Kaliumtripolyphosphat), kommt beispielsweise in Form einer 50 Gew.-%-igen Lösung (> 23% P2O5, 25% K2O) in den Handel. Die Kaliumpolyphosphate finden in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie breite Verwendung. Weiter existieren auch Natriumkaliumtripolyphosphate, welche ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind. Diese entstehen beispielsweise, wenn man Natriumtrimetaphosphat mit KOH hydrolysiert:
(NaPO3)3 + 2 KOH ■* Na3K2P3O10 + H2O
Diese sind erfindungsgemäß genau wie Natriumtripolyphosphat, Kaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus diesen beiden einsetzbar; auch Mischungen aus Natriumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Gemische aus Natriumtripolyphosphat und Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat sind erfindungsgemäß einsetzbar.
Als organische Cobuilder können in den erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsmitteln insbesondere Polycarboxylate oder Polycarbonsäuren, polymere Polycarboxylate, Polyasparaginsäure, Polyacetale, gegebenenfalls oxidierte Dextrine, weitere organische Cobuilder (siehe unten) sowie Phosphonate eingesetzt werden. Diese Stoffklassen werden nachfolgend beschrieben.
Brauchbare organische Gerüstsubstanzen sind beispielsweise die in Form ihrer Natriumsalze einsetzbaren Polycarbonsäuren, wobei unter Polycarbonsäuren solche Carbonsäuren verstanden werden, die mehr als eine Säurefunktion tragen. Beispielsweise sind dies Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zuckersäuren, Aminocarbonsäuren, Nitrilotriessigsäure (NTA), sofern ein derartiger Einsatz aus ökologischen Gründen nicht zu vermeiden ist, sowie Mischungen aus diesen. Bevorzugte Salze sind die Salze der Polycarbonsäuren wie Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Weinsäure, Zuckersäuren und Mischungen aus diesen.
Auch die Säuren an sich können eingesetzt werden. Sie besitzen neben ihrer Builderwirkung typischerweise auch die Eigenschaft einer Säuerungskomponente und dienen somit auch zur Einstellung eines niedrigeren und milderen pH-Wertes von Wasch- oder Reinigungsmitteln, sofern nicht der sich durch die Mischung der übrigen Komponenten ergebende pH-Wert gewünscht ist. Insbesondere sind hierbei System- und umweltverträgliche Säuren wie Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Gluconsäure und beliebige Mischungen aus diesen zu nennen. Aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide können als pH-Regulatoren dienen. Derartige Regulatoren sind in den erfindungemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1 ,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.
Als Builder sind weiter polymere Polycarboxylate geeignet, dies sind beispielsweise die Alkalimetallsalze der Polyacrylsäure oder der Polymethacrylsäure, beispielsweise solche mit einer relativen Molekülmasse von 500 bis 70 000 g/mol.
Bei den für polymere Polycarboxylate angegebenen Molmassen handelt es sich im Sinne dieser Schrift um gewichtsmittlere Molmassen Mw der jeweiligen Säureform, die grundsätzlich mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt wurden, wobei ein UV-Detektor eingesetzt wurde. Die Messung erfolgte dabei gegen einen externen Polyacrylsäure-Standard, der aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit den untersuchten Polymeren realistische Molgewichtswerte liefert. Diese Angaben weichen deutlich von den Molgewichtsangaben ab, bei denen Polystyrolsulfonsäuren als Standard eingesetzt werden. Die gegen Polystyrolsulfonsäuren gemessenen Molmassen sind in der Regel deutlich höher als die in dieser Schrift angegebenen Molmassen.
Geeignete Polymere sind insbesondere Polyacrylate, die bevorzugt eine Molekülmasse von 2 000 bis 20 000 g/mol aufweisen. Aufgrund ihrer überlegenen Löslichkeit können aus dieser Gruppe wiederum die kurzkettigen Polyacrylate, die Molmassen von 2 000 bis 10 000 g/mol, und besonders bevorzugt von 3 000 bis 5 000 g/mol, aufweisen, bevorzugt sein.
Geeignet sind weiterhin copolymere Polycarboxylate, insbesondere solche der Acrylsäure mit Methacrylsäure und der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Maleinsäure. Als besonders geeignet haben sich Copolymere der Acrylsäure mit Maleinsäure erwiesen, die 50 bis 90 Gew.-% Acrylsäure und 50 bis 10 Gew.-% Maleinsäure enthalten. Ihre relative Molekülmasse, bezogen auf freie Säuren, beträgt im allgemeinen 2 000 bis 70 000 g/mol, vorzugsweise 20 000 bis 50 000 g/mol und insbesondere 30 000 bis 40 000 g/mol. Die (co-) polymeren Polycarboxylate können entweder als Pulver oder als wässerige Lösung eingesetzt werden. Der Gehalt der Mittel an (co-)polymeren Polycarboxylaten kann von 0,5 bis 20 Gew.-%, insbesondere 1 bis 10 Gew.-%, betragen.
Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit können die Polymere auch Allylsulfonsäuren, wie beispielsweise Allyloxybenzolsulfonsäure und Methallylsulfonsäure, als Monomer enthalten.
Insbesondere bevorzugt sind auch biologisch abbaubare Polymere aus mehr als zwei verschiedenen Monomereinheiten, beispielsweise solche, die als Monomere Salze der Acrylsäure und der Maleinsäure sowie Vinylalkohol beziehungsweise Vinylalkohol-Derivate oder die als Monomere Salze der Acrylsäure und der 2-Alkylallylsulfonsäure sowie Zucker-Derivate enthalten.
Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Acrolein und Vinylacetat aufweisen.
Ebenso sind als weitere bevorzugte Buildersubstanzen polymere Aminodicarbonsäuren, deren Salze oder deren Vorläufersubstanzen zu nennen. Besonders bevorzugt sind Polyasparaginsäuren beziehungsweise deren Salze und Derivate.
Weitere geeignete Buildersubstanzen sind Polyacetale, welche durch Umsetzung von Dialdehyden mit Polyolcarbonsäuren, welche 5 bis 7 C-Atome und mindestens 3 Hydroxylgruppen aufweisen, erhalten werden können. Bevorzugte Polyacetale werden aus Dialdehyden wie Glyoxal, Glutaraldehyd, Terephthalaldehyd sowie deren Gemischen und aus Polyolcarbonsäuren wie Gluconsäure und/oder Glucoheptonsäure erhalten.
Weitere geeignete organische Buildersubstanzen sind Dextrine, beispielsweise Oligomere beziehungsweise Polymere von Kohlenhydraten, die durch partielle Hydrolyse von Stärken erhalten werden können. Die Hydrolyse kann nach üblichen, beispielsweise säure- oder enzymkatalysierten Verfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise handelt es sich um Hydrolyseprodukte mit mittleren Molmassen im Bereich von 400 bis 500 000 g/mol. Dabei ist ein Polysaccharid mit einem Dextrose-Äquivalent (DE) im Bereich von 0,5 bis 40, insbesondere von 2 bis 30 bevorzugt, wobei DE ein gebräuchliches Maß für die reduzierende Wirkung eines Polysaccharids im Vergleich zu Dextrose ist, welche ein DE von 100 besitzt. Brauchbar sind sowohl Maltodextrine mit einem DE zwischen 3 und 20 und Trockenglucosesirupe mit einem DE zwischen 20 und 37 als auch sogenannte Gelbdextrine und Weißdextrine mit höheren Molmassen im Bereich von 2 000 bis 30 000 g/mol.
Bei den oxidierten Derivaten derartiger Dextrine handelt es sich um deren Umsetzungsprodukte mit Oxidationsmitteln, welche in der Lage sind, mindestens eine Alkoholfunktion des Saccharid rings zur Carbonsäurefunktion zu oxidieren. Besonders bevorzugte organische Builder für erfindungsgemäße Mittel sind oxidierte Stärken, beziehungsweise deren Derivate aus den Anmeldungen EP 472042, WO 97/25399, und EP 755944.
Auch Oxydisuccinate und andere Derivate von Disuccinaten, vorzugsweise Ethylendiamindisuccinat, sind weitere geeignete Cobuilder. Dabei wird
Ethylendiamin-N,N'-disuccinat (EDDS) bevorzugt in Form seiner Natrium- oder Magnesiumsalze verwendet. Weiterhin bevorzugt sind in diesem Zusammenhang auch Glycerindisuccinate und Glycerintrisuccinate. Geeignete Einsatzmengen liegen in zeolith-, carbonat- und/oder silicathaltigen Formulierungen zwischen 3 und 15 Gew.-%.
Weitere brauchbare organische Cobuilder sind beispielsweise acetylierte Hydroxycarbonsäuren beziehungsweise deren Salze, welche gegebenenfalls auch in Lactonform vorliegen können und welche mindestens 4 Kohlenstoffatome und mindestens eine Hydroxygruppe sowie maximal zwei Säuregruppen enthalten.
Eine weitere Substanzklasse mit Cobuildereigenschaften stellen die Phosphonate dar. Dabei handelt es sich insbesondere um Hydroxyalkan- beziehungsweise Aminoalkanphosphonate. Unter den Hydroxyalkanphosphonaten ist das 1-Hydroxyethan-1 ,1-diphosphonat (HEDP) von besonderer Bedeutung als Cobuilder. Es wird vorzugsweise als Natriumsalz eingesetzt, wobei das Dinatriumsalz neutral und das Tetranatriumsalz alkalisch (pH 9) reagiert. Als Aminoalkanphosphonate kommen vorzugsweise Ethylendiamintetramethylenphosphonat (EDTMP), Diethylentriaminpentamethylen- phosphonat (DTPMP) sowie deren höhere Homologe in Frage. Sie werden vorzugsweise in Form der neutral reagierenden Natriumsalze, z. B. als Hexanatriumsalz der EDTMP beziehungsweise als Hepta- und Octa-Natriumsalz der DTPMP, eingesetzt. Als Builder wird dabei aus der Klasse der Phosphonate bevorzugt HEDP verwendet. Die Aminoalkanphosphonate besitzen zudem ein ausgeprägtes Schwermetallbindevermögen. Dementsprechend kann es, insbesondere wenn die Mittel auch Bleiche enthalten, bevorzugt sein, Aminoalkanphosphonate, insbesondere DTPMP, einzusetzen, oder Mischungen aus den genannten Phosphonaten zu verwenden.
Darüberhinaus können alle Verbindungen, die in der Lage sind, Komplexe mit Erdalkaliionen auszubilden, als Cobuilder eingesetzt werden.
Buildersubstanzen können in den erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmitteln gegebenenfalls in Mengen bis zu 90 Gew.-% enthalten sein. Sie sind vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-% enthalten. Erfindungsgemäße Waschmittel weisen Buildergehalte von insbesondere 5 Gew.-% bis 50 Gew.-% auf. In erfindungsgemäßen Mitteln für die Reinigung harter Oberflächen, insbesondere zur maschinellen Reinigung von Geschirr, beträgt der Gehalt an Buildersubstanzen insbesondere 5 Gew.-% bis 88 Gew.-%, wobei in derartigen Mitteln vorzugsweise keine wasserunlöslichen Buildermaterialien eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel zur insbesondere maschinellen Reinigung von Geschirr sind 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% wasserlöslicher organischer Builder, insbesondere Alkalicitrat, 5 Gew.-% bis 15 Gew.-% Alkalicarbonat und 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% Alkalidisilikat enthalten.
Lösungsmittel, die in den flüssigen bis gelförmigen Zusammensetzungen von Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt werden können, stammen beispielsweise aus der Gruppe ein- oder mehrwertigen Alkohole, Alkanolamine oder Glycolether, sofern sie im angegebenen Konzentrationsbereich mit Wasser mischbar sind. Vorzugsweise werden die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n- oder i-Propanol, Butanolen, Ethylenglykolmethylether, Ethylenglykolethylether, Ethylenglykolpropylether, Ethylenglykolmono-n-butylether, Diethylenglykol-methylether, Diethylenglykolethylether, Propylenglykolmethyl-, -ethyl- oder -propyl-ether, Dipropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Di-isopropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Methoxy-, Ethoxy- oder Butoxytriglykol, 1-Butoxyethoxy-2-propanol, 3-Methyl-3-methoxybutanol, Propylen-glykol-t-butylether sowie Mischungen dieser Lösungsmittel.
Lösungsmittel können in den erfindungsgemäßen flüssigen bis gelförmigen Wasch- und Reinigungsmitteln in Mengen zwischen 0,1 und 20 Gew.-%, bevorzugt aber unter 15 Gew.-% und insbesondere unterhalb von 10 Gew.-% eingesetzt werden.
Zur Einstellung der Viskosität können der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ein oder mehrere Verdicker, beziehungsweise Verdickungssysteme zugesetzt werden. Diese hochmolekularen Stoffe, die auch Quell(ungs)mittel genannt werden, saugen meist die Flüssigkeiten auf und quellen dabei auf, um schließlich in zähflüssige echte oder kolloide Lösungen überzugehen.
Geeignete Verdicker sind anorganische oder polymere organische Verbindungen. Zu den anorganischen Verdickern zählen beispielsweise Polykieselsäuren, Tonmineralien wie Montmorillonite, Zeolithe, Kieselsäuern und Bentonite. Die organischen Verdicker stammen aus den Gruppen der natürlichen Polymere, der abgewandelten natürlichen Polymere und der vollsynthetischen Polymere. Solche aus der Natur stammenden Polymere sind beispielsweise Agar-Agar, Carrageen, Tragant, Gummi arabicum, Alginate, Pektine, Polyosen, Guar-Mehl, Johannisbrotbaumkernmehl, Stärke, Dextrine, Gelatine und Casein. Abgewandelte Naturstoffe, die als Verdicker verwendet werden, stammen vor allem aus der Gruppe der modifizierten Stärken und Cellulosen. Beispielhaft seien hier Carboxymethylcellulose und andere Celluloseether, Hydroxyethyl- und -propylcellulose sowie Kernmehlether genannt. Vollsynthetische Verdicker sind Polymere wie Polyacryl- und Polymethacryl-Verbindungen, Vinylpolymere, Polycarbonsäuren, Polyether, Polyimine, Polyamide und Polyurethane.
Die Verdicker können in einer Menge bis zu 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 2 Gew.-%, und besonders bevorzugt von 0,1 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf die fertige Zusammensetzung, enthalten sein. Das erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel kann gegebenenfalls als weitere übliche Inhaltsstoffe Sequestrierungsmittel, Elektrolyt^ und weitere Hilfsstoffe, wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Silberkorrosionsinhibitoren, Farbübertragungsinhibitoren, Schaum- inhibitoren, Abrasivstoffe, Färb- und/oder Duftstoffe, sowie mikrobielle Wirkstoffe, UV-Absorbenzien und/oder Enzymstabilisatoren enthalten.
Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1 ,3,5-triazinyl-6-amino)stilben-2,2'-disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe eine Diethanol- aminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-di- phenyls, oder 4-(4-Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden.
Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-SaIz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methyl- hydroxypropylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.
Um einen Silberkorrosionsschutz zu bewirken, können in erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln für Geschirr Silberkorrosionsinhibitoren eingesetzt werden. Solche sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise Benzotriazole, Eisen(lll)-chlorid oder CoSO4. Wie beispielsweise aus der europäischen Patentschrift EP 0 736 084 B1 bekannt ist, sind für die gemeinsame Verwendung mit Enzymen besonders geeignete Silberkorrosionsinhibitoren Mangan-, Titan-, Zirkonium-, Hafnium-, Vanadium-, Cobalt- oder Cersalze und/oder -komplexe, in denen die genannten Metalle in einer der Oxidationsstufen II, III, IV, V oder VI vorliegen. Beispiele für derartige Verbindungen sind MnSO4, V2O5, V2O4, VO2, TiOSO4, K2TiF6, K2ZrF6, Co(NO3)2, Co(NO3)3, sowie deren Gemische.
"Soil-Release"-Wirkstoffe oder "Soil-Repellents" sind zumeist Polymere, die bei der Verwendung in einem Waschmittel der Wäschefaser schmutzabstoßende Eigenschaften verleihen und/oder das Schmutzablösevermögen der übrigen Waschmittelbestandteile unterstützen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei deren Einsatz in Reinigungsmitteln für harte Oberflächen beobachtet werden. Besonders wirksame und seit langer Zeit bekannte Soil-Release-Wirkstoffe sind Copolyester mit Dicarbonsäure-, Alkylenglykol- und Polyalkylenglykoleinheiten. Beispiele dafür sind Copolymere oder Mischpolymere aus Polyethylenterephthalat und Polyoxyethylenglykol (DT 16 17 141 , beziehungsweise DT 22 00 911 ). In der deutschen Offenlegungsschrift DT 22 53 063 sind saure Mittel genannt, die unter anderem ein Copolymer aus einer dibasigen Carbonsäure und einem Alkylen- oder Cycloalkylenpolyglykol enthalten. Polymere aus Ethylenterephthalat und Polyethylenoxid-terephthalat und deren Einsatz in Waschmitteln sind in den deutschen Schriften DE 28 57 292 und DE 33 24 258 und der Europäischen Patentschrift EP 0 253 567 beschrieben. Das europäische Patent EP 066 944 betrifft Mittel, die einen Copolyester aus Ethylenglykol, Polyethylenglykol, aromatischer Dicarbonsäure und sulfonierter aromatischer Dicarbonsäure in bestimmten Molverhältnissen enthalten. Aus dem europäischen Patent EP 0 185 427 sind Methyloder Ethylgruppen-endverschlossene Polyester mit Ethylen- und/oder Propylen-terephthalat- und Polyethylenoxid-terephthalat-Einheiten und Waschmitel, die derartiges Soil-release-Polymer enthalten, bekannt. Das europäische Patent EP 0 241 984 betrifft einen Polyester, der neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten auch substituierte Ethyleneinheiten sowie Glycerineinheiten enthält. Aus dem europäischen Patent EP 0 241 985 sind Polyester bekannt, die neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten 1 ,2-Propylen-, 1 ,2-Butylen- und/oder 3-Methoxy-1 ,2-propylengruppen sowie Glycerineinheiten enthalten und mit d- bis C4-Alkylgruppen endgruppenverschlossen sind. Aus der europäischen Patentanmeldung EP 0 272 033 sind zumindest anteilig durch Ci_4-Alkyl- oder Acylreste endgruppenverschlossene Polyester mit Poly-propylenterephthalat- und Polyoxyethylenterephthalat-Einheiten bekannt. Das europäische Patent EP 0 274 907 beschreibt sulfoethyl-endgruppenverschlossene terephthalathaltige Soil-release-Polyester. Gemäß der europäischen Patentanmeldung EP 0 357 280 werden durch Sulfonierung ungesättigter Endgruppen Soil-Release-Polyester mit Terephthalat-, Alkylenglykol- und Poly-C2-4-Glykol-Einheiten hergestellt. Die internationale Patentanmeldung WO 95/32232 betrifft saure, aromatische schmutzablösevermögende Polyester. Aus der internationalen Patentanmeldung WO 97/31085 sind nicht polymere soil-repellent-Wirkstoffe für Materialien aus Baumwolle mit mehreren funktionellen Einheiten bekannt: Eine erste Einheit, die beispielsweise kationisch sein kann, ist zur Adsorption auf die Baumwolloberfläche durch elektrostatische Wechselwirkung befähigt, und eine zweite Einheit, die hydrophob ausgebildet ist, ist verantwortlich für das Verbleiben des Wirkstoffs an der Wasser/ Baumwolle-Grenzfläche.
Zu den für den Einsatz in erfindungsgemäßen Textilwaschmitteln in Frage kommenden Farb- übertragungsinhibitoren gehören insbesondere Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylimidazole, polymere N-Oxide wie Poly-(vinylpyridin-N-oxid) und Copolymere von Vinylpyrrolidon mit Vinylimidazol.
Beim Einsatz in maschinellen Reinigungsverfahren kann es von Vorteil sein, den betreffenden Mitteln Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an Ci8-C24-Fettsäuren aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls signierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit signierter Kieselsäure oder Bistearylethylendiamid. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granuläre, in Wasser lösliche, beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamiden bevorzugt.
Ein erfindungsgemäßes Reinigungsmittel für harte Oberflächen kann darüber hinaus abrasiv wirkende Bestandteile, insbesondere aus der Gruppe umfassend Quarzmehle, Holzmehle, Kunststoffmehle, Kreiden und Mikroglaskugeln sowie deren Gemische, enthalten. Abrasivstoffe sind in den erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln vorzugsweise in einer Menge von nicht mehr als 20 Gew.-%, insbesondere in einer Menge von 5 bis 15 Gew.-%, enthalten.
Färb- und Duftstoffe werden Wasch- und Reinigungsmitteln zugesetzt, um den ästhetischen Eindruck der Produkte zu verbessern und dem Verbraucher neben der Wasch- und Reinigungsleistung ein visuell und sensorisch "typisches und unverwechselbares" Produkt zur Verfügung zu stellen. Als Parfümöle beziehungsweise Duftstoffe können einzelne Riechstoffverbindungen, zum Beispiel die synthetischen Produkte vom Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstoffe verwendet werden. Riechstoffverbindungen vom Typ der Ester sind zum Beispiel Benzylacetat, Phenoxyethylisobutyrat, p-tert.-Butylcyclohexylacetat, Linalylacetat, Dimethylbenzyl-carbinylacetat, Phenylethylacetat, Linalylbenzoat, Benzylformiat, Ethylmethylphenyl-glycinat, Allylcyclohexylpropionat, Styrallylpropionat und Benzylsalicylat. Zu den Ethern zählen beispielsweise Benzylethylether, zu den Aldehyden zum Beispiel die linearen Alkanale mit 8-18 C-Atomen, Citral, Citronellal, Citronellyloxyacetaldehyd, Cyclamenaldehyd, Hydroxycitronellal, Lilial und Bourgeonal, zu den Ketonen zum Beispiel die Jonone, α-lsomethylionon und Methyl-cedrylketon, zu den Alkoholen Anethol, Citronellol, Eugenol, Geraniol, Linalool, Phenylethylalkohol und Terpineol, zu den Kohlenwasserstoffen gehören hauptsächlich die Terpene wie Limonen und Pinen. Bevorzugt werden jedoch Mischungen verschiedener Riechstoffe verwendet, die gemeinsam eine ansprechende Duftnote erzeugen. Solche Parfümöle können auch natürliche Riechstoffgemische enthalten, wie sie aus pflanzlichen Quellen zugänglich sind, zum Beispiel Pine-, Citrus-, Jasmin-, Patchouly-, Rosen- oder Ylang-Ylang-Öl. Ebenfalls geeignet sind Muskateller, Salbeiöl, Kamillenöl, Nelkenöl, Melissenöl, Minzöl, Zimtblätteröl, Lindenblütenöl, Wacholderbeeröl, Vetiveröl, Olibanumöl, Galbanumöl und Labdanumöl sowie Orangenblütenöl, Neroliol, Orangenschalenöl und Sandelholzöl. Üblicherweise liegt der Gehalt von Wasch- und Reinigungsmitteln an Farbstoffen unter 0,01 Gew.-%, während Duftstoffe bis zu 2 Gew.-% der gesamten Formulierung ausmachen können. Die Duftstoffe können direkt in die Wasch- oder Reinigungsmittel eingearbeitet werden, es kann aber auch vorteilhaft sein, die Duftstoffe auf Träger aufzubringen, die die Haftung des Parfüms auf dem Reinigungsgut verstärken und durch eine langsamere Duftfreisetzung für langanhaltenden Duft, insbesondere von behandelten Textilien sorgen. Als solche Trägermaterialien haben sich beispielsweise Cyclodextrine bewährt, wobei die Cyclodextrin-Parfüm-Komplexe zusätzlich noch mit weiteren Hilfsstoffen beschichtet werden können. Ein weiter bevorzugter Träger für Duftstoffe ist der beschriebene Zeolith X, der anstelle von oder in Mischung mit Tensiden auch Duftstoffe aufnehmen kann. Bevorzugt sind daher Wasch- und Reinigungsmittel, die den beschriebenen Zeolith X und Duftstoffe, die vorzugsweise zumindest teilweise an dem Zeolithen absorbiert sind, enthalten.
Bevorzugte Farbstoffe, deren Auswahl dem Fachmann keinerlei Schwierigkeit bereitet, besitzen eine hohe Lagerstabilität und Unempfindlichkeit gegenüber den übrigen Inhaltsstoffen der Mittel und gegen Licht sowie keine ausgeprägte Substantivität gegenüber Textilfasern, um diese nicht anzufärben.
Zur Bekämpfung von Mikroorganismen können Wasch- oder Reinigungsmittel antimikrobielle Wirkstoffe enthalten. Hierbei unterscheidet man je nach antimikrobiellem Spektrum und Wirkungsmechanismus zwischen Bakteriostatika und Bakteriziden, Fungistatika und Fungiziden usw. Wichtige Stoffe aus diesen Gruppen sind beispielsweise Benzalkoniumchloride, Alkylarylsulfonate, Halogenphenole und Phenolmercuriacetat. Die Begriffe antimikrobielle Wirkung und antimikrobieller Wirkstoff haben im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre die fachübliche Bedeutung, die beispielsweise von K. H. Wallhäußer in „Praxis der Sterilisation, Desinfektion - Konservierung : Keimidentifizierung - Betriebshygiene" (5. Aufl. - Stuttgart; New York : Thieme, 1995) wiedergegeben wird, wobei alle dort beschriebenen Substanzen mit antimikrobieller Wirkung eingesetzt werden können. Geeignete antimikrobielle Wirkstoffe sind vorzugsweise ausgewählt aus den Gruppen der Alkohole, Amine, Aldehyde, antimikrobiellen Säuren beziehungsweise deren Salze, Carbonsäureester, Säureamide, Phenole, Phenolderivate, Diphenyle, Diphenylalkane, Harnstoffderivate, Sauerstoff-, Stickstoff-acetale sowie -formale, Benzamidine, Isothiazoline, Phthalimidderivate, Pyridinderivate, antimikrobiellen oberflächenaktiven Verbindungen, Guanidine, antimikrobiellen amphoteren Verbindungen, Chinoline, 1 ,2-Dibrom-2,4-dicyanobutan, lodo-2-propyl-butyl-carbamat, lod, lodophore, Peroxoverbindungen, Halogenverbindungen sowie beliebigen Gemischen der voranstehenden.
Der antimikrobielle Wirkstoff kann dabei ausgewählt sein aus Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, 1 ,3-Butandiol, Phenoxyethanol, 1 ,2-Propylenglykol, Glycerin, Undecylensäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Dihydracetsäure, o-Phenylphenol, N-Methylmorpholin-acetonitril (MMA), 2-Benzyl-4-chlorphenol, 2,2'-Methylen-bis-(6-brom-4-chlorphenol), 4,4'-Dichlor-2'-hydroxydiphenylether (Dichlosan), 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenylether (Trichlosan), Chlorhexidin, N-(4-Chlorphenyl)-N-(3,4-dichlorphenyl)-harnstoff, N.N'^I .IO-decan-diyldi-i-pyridinyl^-yliden^bis^i-octanamin^dihydrochlorid, N,N'-Bis-(4-chlorphe- nyl)-3,12-diimino-2,4,11 ,13-tetraaza-tetradecandiimidamid, Glucoprotaminen, antimikrobiellen oberflächenaktiven quaternären Verbindungen, Guanidinen einschl. den Bi- und Polyguanidinen, wie beispielsweise 1 ,6-Bis-(2-ethylhexyl-biguanido-hexan)-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(N1, N1 '-phenyldiguanido-N5,N5')-hexan-tetrahydochlorid, 1 ,6-Di-(N1, N1 '-phenyl-N-i.N-i-methyldiguanido-Ns.Ns^-hexan-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(N1, N1 '-o-chlorophenyldiguanido- N5,N5')-hexan-dihydrochlorid, i .θ-Di^N-i.N-i'^.θ-dichlorophenyldiguanido-Ns.Ns^hexan-dihydrochlorid, 1 , 6-Di-[N1, N1 '-beta-(p-methoxyphenyl) diguanido-N5,N5']-hexane-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(N1, N1 '-alpha-methyl-.beta.-phenyldiguanido-N5,N5')-hexan-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(N1, N1 '-p-nitrophenyldiguanido-N5,N5')hexan-dihydrochlorid, omega:onnega-Di-( N-i.N-i'-phenyldiguanido-Ns.Ns^-di-n-propylether-dihydrochlorid, omegaionnega'-Di^N-i.N-i'-p-chlorophenyldiguanido-Ns.Ns^-di-n-propylether-tetrahydrochlorid, 1 ,6-Di-(N1, N1 '-2, 4- dichlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-tetrahydrochlorid, 1 ,6-Di-(N1, N1 '-p-methylphenyldiguanido- N5,N5')hexan-dihydrochlorid, i .θ-Di^N^N^Aδ-trichlorophenyldiguanido-Ns.Ns^hexan-tetrahydrochlorid, 1 , 6-Di-[N1, N-ι'-alpha-(p-chlorophenyl) ethyldiguanido-N5,N5'] hexan-dihydrochlorid, omegaOnnega-Di^N-i.N-i'-p-chlorophenyldiguanido-Ns.Ns^nn-xylene-dihydrochlorid, 1 ,12-Di-(N1, N1 '-p-chlorophenyldiguanido-N5, N5') dodecan-dihydrochlorid,
1 , 10-Di-(N1, N-i'-phenyldiguanido- N5,N5')-decan-tetrahydrochlorid, 1 , 12-Di-(N1, N-i'-phenyldiguanido- N5, N5') dodecan-tetrahydrochlorid, 1 , 6-Di-(N1, N-i'-o-chlorophenyldiguanido- N5, N5') hexan-dihydrochlorid, 1 , 6-Di-(N1, N1 '-o-chlorophenyldiguanido- N5, N5') hexan-tetrahydrochlorid, Ethylen-bis-( 1 -tolyl biguanid), Ethylen-bis-(p-tolyl biguanide), Ethylen-bis-(3,5-dimethylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(p-tert-amylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(nonylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(phenylbiguanid),
Ethylen-bis-(N-butylphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,5-diethoxyphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,4-dimethylphenyl biguanid), Ethylen-bis (o-diphenylbiguanid), Ethylen-bis (mixed amyl naphthylbiguanid), N-Butyl-ethylen-bis-(phenylbiguanid), Trimethylen bis (o-tolylbiguanid), N-Butyl-trimethyle- bis-(phenyl biguanide) und die entsprechenden Salze wie Acetate, Gluconate, Hydrochloride, Hydrobromide, Citrate, Bisulfite, Fluoride, Polymaleate, N-Cocosalkylsarcosinate, Phosphite, Hypophosphite, Perfluorooctanoate, Silicate, Sorbate, Salicylate, Maleate, Tartrate, Fumarate, Ethylendiamintetraacetate, Iminodiacetate, Cinnamate, Thiocyanate, Arginate, Pyromellitate, Tetracarboxybutyrate, Benzoate, Glutarate, Monofluorphosphate, Perfluorpropionate sowie beliebige Mischungen davon. Weiterhin eignen sich halogenierte XyIoI- und Kresolderivate, wie p-Chlormetakresol oder p-Chlor-meta-xylol, sowie natürliche antimikrobielle Wirkstoffe pflanzlicher Herkunft (zum Beispiel aus Gewürzen oder Kräutern), tierischer sowie mikrobieller Herkunft. Vorzugsweise können antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindungen, ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft und/oder ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft, äußerst bevorzugt mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft aus der Gruppe, umfassend Coffein, Theobromin und Theophyllin sowie etherische Öle wie Eugenol, Thymol und Geraniol, und/oder mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft aus der Gruppe, umfassend Enzyme wie Eiweiß aus Milch, Lysozym und Lactoperoxidase, und/oder mindestens eine antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindung mit einer Ammonium-, Sulfonium-, Phosphonium-, lodonium- oder Arsoniumgruppe, Peroxoverbindungen und Chlorverbindungen eingesetzt werden. Auch Stoffe mikrobieller Herkunft, sogenannte Bakteriozine, können eingesetzt werden.
Die als antimikrobielle Wirkstoffe geeigneten quaternären Ammoniumverbindungen (QAV) weisen die allgemeine Formel (R1)(R2)(R3)(R4) N+ X" auf, in der R1 bis R4 gleiche oder verschiedene C-|-C22-Alkylreste, C7-C28-Aralkylreste oder heterozyklische Reste, wobei zwei oder im Falle einer aromatischen Einbindung wie im Pyridin sogar drei Reste gemeinsam mit dem Stickstoffatom den Heterozyklus, zum Beispiel eine Pyridinium- oder Imidazoliniumverbindung, bilden, darstellen und X~ Halogenidionen, Sulfationen, Hydroxidionen oder ähnliche Anionen sind. Für eine optimale antimikrobielle Wirkung weist vorzugsweise wenigstens einer der Reste eine Kettenlänge von 8 bis 18, insbesondere12 bis 16, C-Atomen auf.
QAV sind durch Umsetzung tertiärer Amine mit Alkylierungsmitteln, wie zum Beispiel Methylchlorid, Benzylchlorid, Dimethylsulfat, Dodecylbromid, aber auch Ethylenoxid herstellbar. Die Alkylierung von tertiären Aminen mit einem langen Alkyl-Rest und zwei Methyl-Gruppen gelingt besonders leicht, auch die Quaternierung von tertiären Aminen mit zwei langen Resten und einer Methyl-Gruppe kann mit Hilfe von Methylchlorid unter milden Bedingungen durchgeführt werden. Amine, die über drei lange Alkyl-Reste oder Hydroxy-substituierte Alkyl-Reste verfügen, sind wenig reaktiv und werden bevorzugt mit Dimethylsulfat quaterniert.
Geeignete QAV sind beispielweise Benzalkoniumchlorid (N-Alkyl-N,N-dimethyl-benzyl-am- moniumchlorid, CAS No. 8001-54-5), Benzalkon B (m,p-Dichlorbenzyl-dimethyl-C12-alkyl- ammoniumchlorid, CAS No. 58390-78-6), Benzoxoniumchlorid (Benzyl-dodecyl-bis-(2-hy- droxyethyl)-ammonium-chlorid), Cetrimoniumbromid (N-Hexadecyl-N,N-trimethyl-ammonium- bromid, CAS No. 57-09-0), Benzetoniumchlorid (N,N-Dimethyl-N-[2-[2-[p-(1 ,1 ,3,3-tetrame- thylbutyl)-pheno-xy]ethoxy]ethyl]-benzylammoniumchlorid, CAS No. 121-54-0), Dialkyldime- thylammonium-chloride wie Di-n-decyl-dimethyl-ammoniumchlorid (CAS No. 7173-51-5-5), Didecyldi-methylammoniumbromid (CAS No. 2390-68-3), Dioctyl-dimethyl-ammoniumchloric, 1-Cetylpyridiniumchlorid (CAS No. 123-03-5) und Thiazoliniodid (CAS No. 15764-48-1 ) sowie deren Mischungen. Besonders bevorzugte QAV sind die Benzalkoniumchloride mit C8-Ci8-Alkylresten, insbesondere Ci∑-CM-Aklyl-benzyl-dimethyl-ammoniumchlorid.
Benzalkoniumhalogenide und/oder substituierte Benzalkoniumhalogenide sind beispielsweise kommerziell erhältlich als Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/ Sherex und Hyamine® ex Lonza, sowie Bardac® ex Lonza. Weitere kommerziell erhältliche antimikrobielle Wirkstoffe sind N-(3-Chlorallyl)-hexaminiumchlorid wie Dowicide® und Dowicil® ex Dow, Benzethoniumchlorid wie Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, Methylbenzethoniumchlorid wie Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, Cetylpyridiniumchlorid wie Cepacolchlorid ex Merrell Labs.
Die antimikrobiellen Wirkstoffe werden in Mengen von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 Gew.-% bis 0,8 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,005 Gew.-% bis 0,3 Gew.-% und insbesondere von 0,01 bis 0,2 Gew.-% eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel können UV-Absorbenzien (UV-Absorber) enthalten, die auf die behandelten Textilien aufziehen und die Lichtbeständigkeit der Fasern und/oder die Lichtbeständigkeit sonstiger Rezepturbestandteile verbessern. Unter UV-Absorber sind organische Substanzen (Lichtschutzfilter) zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längerwelliger Strahlung, zum Beispiel Wärme wieder abzugeben.
Verbindungen, die diese gewünschten Eigenschaften aufweisen, sind beispielsweise die durch strahlungslose Desaktivierung wirksamen Verbindungen und Derivate des Benzophenons mit Substituenten in 2- und/oder 4-Stellung. Weiterhin sind auch substituierte Benzotriazole, in 3-Stellung Phenylsubstituierte Acrylate (Zimtsäurederivate, gegebenenfalls mit Cyanogruppen in 2-Stellung), Salicylate, organische Ni-Komplexe sowie Naturstoffe wie Umbelliferon und die körpereigene Urocansäure geeignet. Besondere Bedeutung haben Biphenyl- und vor allem Stilbenderivate wie sie beispielsweise in der EP 0728749 A beschrieben werden und kommerziell als Tinosorb® FD oder Tinosorb® FR ex Ciba erhältlich sind. Als UV-B-Absorber sind zu nennen: 3-Benzylidencampher beziehungsweise 3-Benzylidennorcampher und dessen Derivate, zum Beispiel 3-(4-Methylbenzyliden)campher, wie in der EP 0693471 B1 beschrieben; 4-Aminobenzoesäurederivate, vorzugsweise 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-ethylhexylester, 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-octylester und 4-(Dimethylamino)benzoesäureamylester; Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4-Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4-Methoxyzimtsäurepro- pylester, 4-Methoxyzimtsäureisoamylester, 2-Cyano-3,3-phenylzimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene); Ester der Salicylsäure, vorzugsweise Salicylsäure-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4-isopropylbenzylester, Salicylsäurehomomenthylester; Derivate des Benzophenons, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'-methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon; Ester der Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2-ethylhexylester; Triazinderivate, wie zum Beispiel 2,4,6-Trianilino-(p-carbo-2'-ethyl-1 '-hexyloxy)-1 ,3,5-triazin und Octyl Triazon, wie in der EP 0818450 A1 beschrieben oder Dioctyl Butamido Triazone (Uvasorb® HEB); Propan-1 ,3-dione, wie zum Beispiel 1-(4-tert.Butylphenyl)-3-(4'methoxyphenyl)propan-1 ,3-dion;
Ketotricyclo(5.2.1.0)decan-Derivate, wie in der EP 0694521 B1 beschrieben. Weiterhin geeignet sind 2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure und deren Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Alkylammonium-, Alkanolammonium- und Glucammoniumsalze; Sulfonsäurederivate von Benzophenonen, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure und ihre Salze; Sulfonsäurederivate des 3-Benzylidencamphers, wie zum Beispiel 4-(2-Oxo-3-bornylidenme- thyl)benzol-sulfonsäure und 2-Methyl-5-(2-oxo-3-bornyliden)sulfonsäure und deren Salze.
Als typische UV-A-Filter kommen insbesondere Derivate des Benzoylmethans in Frage, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1 ,3-dion, 4-tert.-Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan (Parsol 1789),
1-Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)-propan-1 ,3-dion sowie Enaminverbindungen, wie beschrieben in der DE 19712033 A1 (BASF). Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden. Neben den genannten löslichen Stoffen kommen für diesen Zweck auch unlösliche Lichtschutzpigmente, nämlich feindisperse, vorzugsweise nanoisierte Metalloxide beziehungsweise Salze in Frage. Beispiele für geeignete Metalloxide sind insbesondere Zinkoxid und Titandioxid und daneben Oxide des Eisens, Zirkoniums, Siliciums, Mangans, Aluminiums und Cers sowie deren Gemische. Als Salze können Silicate (Talk), Bariumsulfat oder Zinkstearat eingesetzt werden. Die Oxide und Salze werden in Form der Pigmente bereits für hautpflegende und hautschützende Emulsionen und dekorative Kosmetik verwendet. Die Partikel sollten dabei einen mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen. Sie können eine sphärische Form aufweisen, es können jedoch auch solche Partikel zum Einsatz kommen, die eine ellipsoide oder in sonstiger Weise von der sphärischen Gestalt abweichende Form besitzen. Die Pigmente können auch oberflächenbehandelt, das heißt hydrophilisiert oder hydrophobiert vorliegen. Typische Beispiele sind ummantelte Titandioxide, wie zum Beispiel Titandioxid T 805 (Degussa) oder Eusolex® T2000 (Merck; als hydrophobe Coatingmittel kommen dafür bevorzugt Silicone und besonders bevorzugt Trialkoxyoctylsilane oder Simethicone in Frage. Vorzugsweise wird mikronisiertes Zinkoxid verwendet. Weitere geeignete UV-Lichtschutzfilter sind der Übersicht von P. Finkel in SÖFW-Journal 122 (1996), S. 543 zu entnehmen.
Die UV-Absorbenzien werden üblicherweise in Mengen von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,03 Gew.-% bis 1 Gew.-%, eingesetzt.
Erfindungsgemäße Mittel können zur Steigerung der Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung neben den erfindungsgemäßen Proteinen weitere Enzyme enthalten, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Hierzu gehören insbesondere weitere Proteasen, Amylasen, Lipasen, Hemicellulasen, Cellulasen oder Oxidoreduktasen, sowie vorzugsweise deren Gemische. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Mittel enthalten diese weiteren Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 x 10~6 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein. Unter den weiteren Proteasen sind solche vom Subtilisin-Typ bevorzugt. Beispiele hierfür sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise Savinase® von der Firma Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1 ) leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP® geführten Varianten ab, die insbesondere in WO 92/21760 A1 , WO 95/23221 A1 , WO 02/088340 A2 und WO 03/038082 A2 beschrieben werden. Weitere verwendbare Proteasen aus verschiedenen Bacillus sp.- und ß. g/öson/V-Stämmen gehen aus den Patentanmeldungen WO 03/054185, WO 03/056017, WO 03/055974 und WO 03/054184 hervor.
Weitere brauchbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozymes® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect®OxP und Properase® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.
Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbare Amylasen sind die α-Amylasen aus Bacillus licheniformis, aus ß. amyloliquefaciens oder aus ß. stearothermophilus sowie deren für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Weiterentwicklungen. Das Enzym aus ß. licheniformis ist von der Firma Novozymes unter dem Namen Termamyl® und von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar®ST erhältlich. Weiterentwicklungsprodukte dieser α-Amylase sind von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Duramyl® und Termamyl®ultra, von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar®OxAm und von der Firma Daiwa Seiko Inc., Tokyo, Japan, als Keistase® erhältlich. Die α-Amylase von ß. amyloliquefaciens wird von der Firma Novozymes unter dem Namen BAN® vertrieben, und abgeleitete Varianten von der α-Amylase aus ß. stearothermophilus unter den Namen BSG® und Novamyl®, ebenfalls von der Firma Novozymes. Weitere einsetzbare Handelsprodukte sind beispielsweise die Amylase-LT® und Stainzyme®, letztere ebenfalls von der Firma Novozymes.
Desweiteren sind für diesen Zweck die in der Anmeldung WO 02/10356 A2 offenbarte α-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) und die in der Anmeldung WO 02/44350 A2 beschriebene Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) aus ß. agaradherens (DSM 9948) hervorzuheben. Ferner sind die amylolytischen Enzyme einsetzbar, die dem Sequenzraum von α-Amylasen angehören, der in der Anmeldung WO 03/002711 A2 definiert wird, und die, die in der Anmeldung WO 03/054177 A2 beschrieben werden. Ebenso sind Fusionsprodukte der genannten Moleküle einsetzbar, beispielsweise die aus der Anmeldung DE 10138753 A1.
Darüber hinaus sind die unter den Handelsnamen Fungamyl® von der Firma Novozymes erhältlichen Weiterentwicklungen der α-Amylase aus Aspergillus niger und A. oryzae geeignet. Ein weiteres Handelsprodukt ist beispielsweise die Amylase-LT®.
Erfindungsgemäße Mittel können Lipasen oder Cutinasen, insbesondere wegen ihrer Triglycerid-spaltenden Aktivitäten enthalten, aber auch, um aus geeigneten Vorstufen in situ Persäuren zu erzeugen. Hierzu gehören beispielsweise die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen, beziehungsweise weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit dem Aminosäureaustausch D96L. Sie werden beispielsweise von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Lipolase®, Lipolase®Ultra, LipoPrime®, Lipozyme® und Lipex® vertrieben. Desweiteren sind beispielsweise die Cutinasen einsetzbar, die ursprünglich aus Fusarium solani pisi und Humicola insolens isoliert worden sind. Ebenso brauchbare Lipasen sind von der Firma Amano unter den Bezeichnungen Lipase CE®, Lipase P®, Lipase B®, beziehungsweise Lipase CES®, Lipase AKG®, Bacillis sp. Lipase®, Lipase AP®, Lipase M-AP® und Lipase AML® erhältlich. Von der Firma Genencor sind beispielsweise die Lipasen, beziehungsweise Cutinasen einsetzbar, deren Ausgangsenzyme ursprünglich aus Pseudomonas mendocina und Fusarium solanii isoliert worden sind. Als weitere wichtige Handelsprodukte sind die ursprünglich von der Firma Gist-Brocades vertriebenen Präparationen M1 Lipase® und Lipomax® und die von der Firma Meito Sangyo KK, Japan, unter den Namen Lipase MY-30®, Lipase OF® und Lipase PL® vertriebenen Enzyme zu erwähnen, ferner das Produkt Lumafast® von der Firma Genencor.
Erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere wenn sie für die Behandlung von Textilien gedacht sind, Cellulasen enthalten, je nach Zweck als reine Enzyme, als Enzympräparationen oder in Form von Mischungen, in denen sich die einzelnen Komponenten vorteilhafterweise hinsichtlich ihrer verschiedenen Leistungsaspekte ergänzen. Zu diesen Leistungsaspekten zählen insbesondere Beiträge zur Primärwaschleistung, zur Sekundärwaschleistung des Mittels
(Antiredepositionswirkung oder Vergrauungsinhibition) und Avivage (Gewebewirkung), bis hin zum Ausüben eines „stone washed"-Effekts.
Eine brauchbare pilzliche, Endoglucanase(EG)-reiche Cellulase-Präparation, beziehungsweise deren Weiterentwicklungen werden von der Firma Novozymes unter dem Handelsnamen Celluzyme® angeboten. Die ebenfalls von der Firma Novozymes erhältlichen Produkte Endolase® und Carezyme® basieren auf der 50 kD-EG, beziehungsweise der 43 kD-EG aus H. insolens DSM 1800. Weitere einsetzbare Handelsprodukte dieser Firma sind Cellusoft® und Renozyme®. Letzteres basiert auf der Anmeldung WO 96/29397 A1. Leistungsverbesserte Cellulase-Varianten gehen beispielsweise aus der Anmeldung WO 98/12307 A1 hervor. Ebenso sind die in der Anmeldung WO 97/14804 A1 offenbarten Cellulasen einsetzbar; beispielsweise die darin offenbarte 20 kD-EG aus Melanocarpus, die von der Firma AB Enzymes, Finnland, unter den Handelsnamen Ecostone® und Biotouch® erhältlich ist. Weitere Handelprodukte der Firma AB Enzymes sind Econase® und Ecopulp®. Weitere geeignete Cellulasen aus Bacillus sp. CBS 670.93 und CBS 669.93 werden in WO 96/34092 A2 offenbart, wobei die aus Bacillus sp. CBS 670.93 von der Firma Genencor unter dem Handelsnamen Puradax® erhältlich ist. Weitere Handelsprodukte der Firma Genencor sind „Genencor detergent cellulase L" und lndiAge®Neutra.
Erfindungsgemäße Mittel können insbesondere zur Entfernung bestimmter Problemanschmutzungen neben den erfindungsgemäßen Polypeptiden weitere Enzyme enthalten, die unter dem Begriff Hemicellulasen zusammengefaßt werden. Hierzu gehören beispielsweise Mannanasen, Xanthanlyasen, Pektinlyasen (=Pektinasen), Pektinesterasen, Pektatlyasen, Xyloglucanasen (=Xylanasen), Pullulanasen und ß-Glucanasen. Geeignete Mannanasen sind beispielsweise unter den Namen Gamanase® und Pektinex AR® von der Firma Novozymes, unter dem Namen Rohapec® B1 L von der Firma AB Enzymes und unter dem Namen Pyrolase® von der Firma Diversa Corp., San Diego, CA, USA erhältlich. Eine geeignete ß-Glucanase aus einem ß. alcalophilus geht beispielsweise aus der Anmeldung WO 99/06573 A1 hervor. Die aus ß. subtilis gewonnene ß-Glucanase ist unter dem Namen Cereflo® von der Firma Novozymes erhältlich.
Zur Erhöhung der bleichenden Wirkung können erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel Oxidoreduktasen, beispielsweise Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen, Peroxidasen, wie HaIo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucose- oder Mangan-peroxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen, Polyphenoloxidasen) enthalten. Als geeignete Handelsprodukte sind Denilite® 1 und 2 der Firma Novozymes zu nennen. Vorteilhafterweise werden zusätzlich vorzugsweise organische, besonders bevorzugt aromatische, mit den Enzymen wechselwirkende Verbindungen zugegeben, um die Aktivität der betreffenden Oxidoreduktasen zu verstärken (Enhancer) oder um bei stark unterschiedlichen Redoxpotentialen zwischen den oxidierenden Enzymen und den Anschmutzungen den Elektronenfluß zu gewährleisten (Mediatoren).
Die in erfindungsgemäßen Mitteln zusätzlich eingesetzten Enzyme stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, etwa der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, etwa durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder filamentöse Fungi.
Die Aufreinigung der betreffenden Enzyme erfolgt günstigerweise über an sich etablierte Verfahren, beispielsweise über Ausfällung, Sedimentation, Konzentrierung, Filtration der flüssigen Phasen, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Einwirken von Chemikalien, Desodorierung oder geeignete Kombinationen dieser Schritte. Erfindungsgemäßen Mitteln können die erfindungsgemäßen Polypeptide ebenso wie die zusätzlich eingesetzten Enzyme in jeder nach dem Stand der Technik etablierten Form zugesetzt werden. Hierzu gehören beispielsweise die durch Granulation, Extrusion oder Lyophilisierung erhaltenen festen Präparationen oder, insbesondere bei flüssigen oder gelförmigen Mitteln, Lösungen der Enzyme, vorteilhafterweise möglichst konzentriert, wasserarm und/oder mit Stabilisatoren versetzt.
Alternativ können diese Proteine sowohl für die feste als auch für die flüssige Darreichungsform verkapselt werden, beispielsweise durch Sprühtrocknung oder Extrusion der Enzymlösung zusammen mit einem, vorzugsweise natürlichen Polymer oder in Form von Kapseln, beispielsweise solchen, bei denen die Enzyme wie in einem erstarrten Gel eingeschlossen sind oder in solchen vom Kern-Schale-Typ, bei dem ein enzymhaltiger Kern mit einer Wasser-, Luft- und/oder Chemikalien-undurchlässigen Schutzschicht überzogen ist. In aufgelagerten Schichten können zusätzlich weitere Wirkstoffe, beispielsweise Stabilisatoren, Emulgatoren, Pigmente, Bleich- oder Farbstoffe aufgebracht werden. Derartige Kapseln werden nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Schüttel- oder Rollgranulation oder in Fluid-bed-Prozessen aufgebracht. Vorteilhafterweise sind derartige Granulate, beispielsweise durch Aufbringen polymerer Filmbildner, staubarm und aufgrund der Beschichtung lagerstabil.
Weiterhin ist es möglich, zwei oder mehrere Enzyme, etwa ein erfindungsgemäßes Polypeptid und ein weiteres Enzym, zusammen zu konfektionieren, so dass ein einzelnes Granulat mehrere Enzymaktivitäten aufweist.
Ein in einem erfindungsgemäßen Mittel enthaltenes Protein, insbesondere auch das erfindungsgemäße Polypeptid, kann besonders während der Lagerung gegen Schädigungen wie beispielsweise Inaktivierung, Denaturierung oder Zerfall etwa durch physikalische Einflüsse, Oxidation oder proteolytische Spaltung geschützt werden. Bei mikrobieller Gewinnung der Proteine und/oder Enzyme ist eine Inhibierung der Proteolyse besonders bevorzugt, insbesondere wenn auch die Mittel Proteasen enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Mittel enthalten zu diesem Zweck Stabilisatoren.
Eine Gruppe von Stabilisatoren sind reversible Proteaseinhibitoren. Häufig werden hierfür Benzamidin-Hydrochlorid, Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester eingesetzt, darunter vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa Ortho-, meta- oder para-substituierte Phenylboronsäuren, insbesondere 4-Formylphenyl-Boronsäure, beziehungsweise die Salze oder Ester der genannten Verbindungen. Auch Peptidaldehyde, das heißt Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, insbesondere solche aus 2 bis 50 Monomeren werden zu diesem Zweck eingesetzt. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehören unter anderem Ovomucoid und Leu- peptin. Auch spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren für die Protease Subtilisin sowie Fusionsproteine aus Proteasen und spezifischen Peptid-Inhibitoren sind hierfür geeignet. Weitere Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-, Triethanol- und -Propanolamin und deren Mischungen, aliphatische Carbonsäuren bis zu Ci2, wie beispielsweise Bernsteinsäure, andere Dicarbonsäuren oder Salze der genannten Säuren. Auch endgruppenverschlossene Fettsäureamidalkoxylate sind für diesen Zweck geeignet. Bestimmte als Builder eingesetzte organische Säuren vermögen, wie in WO 97/18287 offenbart, zusätzlich ein enthaltenes Enzym zu stabilisieren.
Niedere aliphatische Alkohole, vor allem aber Polyole, wie beispielsweise Glycerin, Ethylenglykol, Propylenglykol oder Sorbit sind weitere häufig eingesetzte Enzymstabilisatoren. Auch Di-Glycerinphosphat schützt gegen Denaturierung durch physikalische Einflüsse. Ebenso werden Calcium- und/oder Magnesiumsalze eingesetzt, wie beispielsweise Calciumacetat oder Calcium-Formiat.
Polyamid-Oligomere oder polymere Verbindungen wie Lignin, wasserlösliche Vinyl-Copolymere oder Cellulose-Ether, Acryl-Polymere und/oder Polyamide stabilisieren die Enzym-Präparation unter anderem gegenüber physikalischen Einflüssen oder pH-Wert-Schwankungen. Polyamin-N-Oxid-enthaltende Polymere wirken gleichzeitig als Enzymstabilisatoren und als Farbübertragungsinhibitoren. Andere polymere Stabilisatoren sind lineare C8-Ci8 Polyoxyalkylene. Auch Alkylpolyglycoside können die enzymatischen Komponenten des erfindungsgemäßen Mittels stabilisieren und vermögen vorzugsweise diese zusätzlich in ihrer Leistung zu steigern. Vernetzte N-haltige Verbindungen erfüllen vorzugsweise eine Doppelfunktion als Soil-Release-Agentien und als Enzym-Stabilisatoren. Hydrophobes, nichtionisches Polymer stabilisiert insbesondere eine gegebenenfalls enthaltene Cellulase.
Reduktionsmittel und Antioxidantien erhöhen die Stabilität der Enzyme gegenüber oxidativem Zerfall; hierfür sind beispielsweise schwefelhaltige Reduktionsmittel geläufig. Andere Beispiele sind Natrium-Sulfit und reduzierende Zucker.
Besonders bevorzugt werden Kombinationen von Stabilisatoren eingesetzt, beispielsweise aus Polyolen, Borsäure und/oder Borax, die Kombination von Borsäure oder Borat, reduzierenden Salzen und Bernsteinsäure oder anderen Dicarbonsäuren oder die Kombination von Borsäure oder Borat mit Polyolen oder Polyaminoverbindungen und mit reduzierenden Salzen. Die Wirkung von Peptid-Aldehyd-Stabilisatoren wird günstigerweise durch die Kombination mit Borsäure und/oder Borsäurederivaten und Polyolen gesteigert und noch weiter durch die zusätzliche Wirkung von zweiwertigen Kationen, wie zum Beispiel Calcium-Ionen.
Da erfindungsgemäße Mittel in allen denkbaren Formen angeboten werden können, stellen erfindungsgemäße Polypeptide in allen für die Zugabe zu den jeweiligen Mitteln zweckmäßigen Formulierungen jeweilige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Dazu gehören beispielsweise flüssige Formulierungen, feste Granulate oder Kapseln.
Die verkapselte Form bietet sich an, um die Enzyme oder andere Inhaltsstoffe vor anderen Bestandteilen, wie beispielsweise Bleichmitteln, zu schützen oder um eine kontrollierte Freisetzung (controlled release) zu ermöglichen. Je nach der Größe dieser Kapseln wird nach MiIIi-, Mikro- und Nanokapseln unterschieden, wobei Mikrokapseln für Enzyme besonders bevorzugt sind. Solche Kapseln werden beispielsweise mit den Patentanmeldungen WO 97/24177 und DE 19918267 offenbart. Eine mögliche Verkapselungsmethode besteht darin, dass die Proteine, ausgehend von einer Mischung der Proteinlösung mit einer Lösung oder Suspension von Stärke oder einem Stärkederivat, in dieser Substanz verkapselt werden. Ein solches Verkapselungsverfahren wird mit der Anmeldung WO 01/38471 beschrieben.
Im Fall fester Mittel können die Proteine - erfindungsgemäße Polypeptide ebenso wie gegebenenfalls enthaltene weitere Enzyme - beispielsweise in getrockneter, granulierter und/oder verkapselter Form eingesetzt werden. Sie können separat, das heißt als eigene Phase, oder mit anderen Bestandteilen zusammen in derselben Phase, mit oder ohne Kompaktierung zugesetzt werden. Sollen mikroverkapselte Enzyme in fester Form verarbeitet werden, so kann das Wasser mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren aus den sich aus der Aufarbeitung ergebenden wäßrigen Lösungen entfernt werden, wie Sprühtrocknung, Abzentrifugieren oder durch Umsolubilisieren. Die auf diese Weise erhaltenen Teilchen haben üblicherweise eine Teilchengröße zwischen 50 und 200 μm.
Flüssigen, gelförmigen oder pastösen erfindungsgemäßen Mitteln können die Proteine ausgehend von einer nach dem Stand der Technik durchgeführten Proteingewinnung und Präparation in konzentrierter wäßriger oder nichtwäßriger Lösung, Suspension oder Emulsion zugesetzt werden, aber auch in Gelform oder verkapselt oder als getrocknetes Pulver. Derartige erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe hergestellt, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können.
Ein erfindungsgemäßes Reinigungsmittel, insbesondere ein erfindungsgemäßer Reiniger für harte Oberflächen, kann auch ein oder mehrere Treibmittel (INCI Propellants), üblicherweise in einer Menge von 1 bis 80 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 30 Gew.-%, insbesondere 2 bis 10 Gew.-%, besonders bevorzugt 2,5 bis 8 Gew.-%, äußerst bevorzugt 3 bis 6 Gew.-%, enthalten.
Treibmittel sind erfindungsgemäß üblicherweise Treibgase, insbesondere verflüssigte oder komprimierte Gase. Die Wahl richtet sich nach dem zu versprühenden Produkt und dem Einsatzgebiet. Bei der Verwendung von komprimierten Gasen wie Stickstoff, Kohlendioxid oder Distickstoffoxid, die im allgemeinen in dem flüssigen Reinigungsmittel unlöslich sind, sinkt der Betriebsdruck mit jeder Ventilbetätigung. Im Reinigungsmittel lösliche oder selbst als Lösungsmittel wirkende verflüssigte Gase (Flüssiggase) als Treibmittel bieten den Vorteil gleichbleibenden Betriebsdrucks und gleichmäßiger Verteilung, denn an der Luft verdampft das Treibmittel und nimmt dabei ein mehrhundertfaches Volumen ein.
Geeignet sind demgemäß folgende gemäß INCI bezeichnete Treibmittel: Butane, Carbon Dioxide, Dimethyl Carbonate, Dimethyl Ether, Ethane, Hydrochlorofluorocarbon 22, Hydrochlorofluorocarbon 142b, Hydrofluorocarbon 152a, Hydrofluorocarbon 134a, Hydrofluorocarbon 227ea, Isobutane, Isopentane, Nitrogen, Nitrous Oxide, Pentane, Propane. Auf Chlorfluorkohlenstoffe (Fluorchlorkohlenwasserstoffe, FCKW) als Treibmittel wird jedoch wegen ihrer schädlichen Wirkung auf den - vor harter UV-Strahlung schützenden - Ozon-Schild der Atmosphäre, die sogenannte Ozon-Schicht, vorzugsweise weitgehend und insbesondere vollständig verzichtet.
Bevorzugte Treibmittel sind Flüssiggase. Flüssiggase sind Gase, die bei meist schon geringen Drücken und 2O0C vom gasförmigen in den flüssigen Zustand übergeführt werden können. Insbesondere werden unter Flüssiggasen jedoch die - in Ölraffinerien als Nebenprodukte bei Destillation und Kracken von Erdöl sowie in der Erdgas-Aufbereitung bei der Benzinabscheidung anfallenden - Kohlenwasserstoffe Propan, Propen, Butan, Buten, Isobutan (2-Methylpropan), Isobuten (2-Methylpropen, Isobutylen) und deren Gemische verstanden.
Besonders bevorzugt enthält das Reinigungsmittel als ein oder mehrere Treibmittel Propan, Butan und/oder Isobutan, insbesondere Propan und Butan, äußerst bevorzugt Propan, Butan und Isobutan.
Eine wichtige Aufgabe der Enzym präparation und insbesondere der erfindungsgemäßen Polypeptide ist wie zuvor ausgeführt die primäre Waschleistung. Neben der primären Waschleistung können die in Waschmitteln enthaltenen Proteasen jedoch ferner die Funktion erfüllen, andere enzymatische Bestandteile durch proteolytische Spaltung zu aktivieren oder nach entsprechender Einwirkzeit zu inaktivieren. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind ebenso solche Mittel mit Kapseln aus proteasesensitivem Material, welche beispielsweise von erfindungsgemäßen Proteinen zu einem beabsichtigten Zeitpunkt hydrolysiert werden und ihren Inhalt freisetzen. Erfindungsgemäße Polypeptide können somit auch zu Inaktivierungs-, Aktivierungs- oder Freisetzungsreaktionen verwendet werden, insbesondere in mehrphasigen Mitteln.
Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt entsprechend auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur Aktivierung, Deaktivierung oder Freisetzung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln dar.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid so konzipiert, dass es regelmäßig als Pflegemittel verwendet werden kann, beispielsweise indem es dem Waschprozess zugesetzt, nach dem Waschen angewendet oder unabhängig von dem Waschen appliziert wird. Der gewünschte Effekt besteht darin, eine glatte Oberflächenstruktur des Textils über einen langen Zeitraum zu erhalten und/oder Schädigungen des Gewebes vorzubeugen und/oder zu verringern.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, bei denen wenigstens in einem der Verfahrensschritte ein erfindungsgemäßes Polypeptid verwendet wird.
Darunter sind solche Verfahren bevorzugt, bei denen das erfindungsgemäße Polypeptid in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt wird. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind.
Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung dieses Mittels behandelt wird. Das gleiche gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, welche unter dem Begriff harte Oberflächen zusammengefasst werden. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um erfindungsgemäße Proteine bereichert werden, und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.
Da bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide natürlicherweise bereits eine proteinauflösende Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen, wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner Teilschritt eines solchen Verfahrens zur maschinellen Reinigung von Textilien darin bestehen, dass gewünschtenfalls neben stabilisierenden Verbindungen, Salzen oder Puffersubstanzen als einzige reinigungsaktive Komponente ein erfindungsgemäßes Polypeptid aufgebracht wird. Dies stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform solcher Verfahren werden die betreffenden erfindungsgemäßen Polypeptide im Rahmen einer der oben ausgeführten Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel, vorzugsweise erfindungsgemäße Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittel, bereitgestellt. Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung einer oben beschriebenen erfindungsgemäßen Alkalische Protease zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar.
Entsprechend bevorzugt gelten für diese Verwendungen die oben ausgeführten Konzentrationsbereiche.
Denn erfindungsgemäße Proteasen können, insbesondere entsprechend den oben beschriebenen Eigenschaften und den oben beschriebenen Verfahren dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen im Rahmen einer der oben ausgeführten Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel, vorzugsweise Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittel bereitgestellt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Erzeugnis, enthaltend eine erfindungsgemäße Zusammensetzung bzw. ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel, insbesondere einen erfindungsgemäßen Reiniger für harte Oberflächen, und einen Sprühspender. Bei dem Erzeugnis kann es sich hierbei sowohl um ein Einkammer- als auch um ein Mehrkammerbehältnis, insbesondere ein Zweikammerbehältnis handeln. Bevorzugt ist der Sprühspender hierbei ein manuell aktivierter Sprühspender, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Aerosolsprühspender (Druckgasbehälter; auch u.a. als Spraydose bezeichnet), selbst Druck aufbauende Sprühspender, Pumpsprühspender und Triggersprühspender, insbesondere Pumpsprühspender und Triggersprühspender mit einem Behälter aus transparentem Polyethylen oder Polyethylenterephthalat. Sprühspender werden ausführlicher in der WO 96/04940 (Procter & Gamble) und den darin zu Sprühspendern zitierten US-Patenten, auf die in dieser Hinsicht sämtlich Bezug genommen und deren Inhalt hiermit in diese Anmeldung aufgenommen wird, beschrieben. Triggersprühspender und Pumpzerstäuber besitzen gegenüber Druckgasbehältern den Vorteil, daß kein Treibmittel eingesetzt werden muß. Durch geeignete, partikelgängige Aufsätze, Düsen etc. (sog. "nozzle-Ventile") auf dem Sprühspender kann das Enzym in dieser Ausführungsform gegebenenfalls auch in auf Partikeln immobilisierter Form dem Mittel beigefügt werden und so als Reinigungsschaum dosiert werden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, ohne sie darauf zu beschränken. Ausführungsbeispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1 : Isolierung und Identifizierung eines proteolytisch aktiven Bakterienstamms
0,1g einer Bodenprobe wurden in 1 ml steriler NaCI suspendiert und auf Milchpulverhaitigen Agarplatten (1 ,5% Agar, 0,1 % K2HPO4, 0,5% Hefeextrakt, 1 % Pepton, 1 % Milchpulver, 0.02%MgSO4*7H2O, 0,4% Na2CO3, pH 10) ausplattiert und bei 30° inkubiert. Anhand eines Klärungshofes wurde ein proteolytisch aktives Bakterium isoliert, welches von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) als Bacillus gibsonii. identifiziert wurde.
Tabelle 1 : Mikrobiologische Eigenschaften des Bacillus gibsonii-Siammes
(Bestimmung der DSMZ)
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0001
Beispiel 2: Klonierung und Sequenzierung der maturen Protease
Das proteolytisch aktive Bakterium wurde in TBY-Medium (0,5% NaCI, 0,5%Hefeextrakt, 1 % Trypton, pH 7,4) für 16 Stunden bei 3O0C kultiviert. Die Gesamt-DNA dieses Bakteriums wurde isoliert, mit dem Restriktionsenzym Sau 3A verdaut und die erhaltenen Fragmente in den Vektor pAWA22 kloniert. Dabei handelt es sich um einen von pBC16 abgeleiteten Expressionsvektor für den Einsatz in Bacillus-Spezies (Bernhard et al. (1978), J. Bacteήol., Band 133 (2), S. 897-903). Dieser Vektor wurde in den Wirtsstamm Bacillus subtilis DB 104 (Kawamura und Doi (1984), J. Bacteriol., Band 160 (1 ), S. 442-444) transformiert.
Die Transformanten wurden zunächst auf DM3-Medium (8 g/l Agar, 0,5 M Bernsteinsäure, 3,5 g/l K2HPO4, 1 ,5 g/l KH2PO4, 20 mM MgCI2, 5 g/l Casiaminoacids, 5 g/l Hefeextrakt, 6 g/l Glucose,
0,1 g/l BSA) regeneriert und dann auf TBY-Skimmilk-Platten (10 g/l Pepton, 10 g/l Milchpulver (siehe oben), 5 g/l Hefe, 5 g/l NaCI, 15 g/l Agar) überimpft. Proteolytisch aktive Klone wurden anhand ihrer Lysehöfe identifiziert. Aus den erhaltenen proteolytisch aktiven Klonen wurde einer ausgewählt, dessen Plasmid isoliert und das Insert nach Standardmethoden sequenziert.
Das ca. 1 ,5 kb große Insert enthielt einen offenen Leserahmen von ca. 1 ,2 kb. Dessen Sequenz ist im Sequenzprotokoll unter der Bezeichnung SEQ ID NO. 1 angegeben. Es umfaßt 1152 bp. Die hiervon abgeleitete Aminosäuresequenz umfaßt 383 Aminosäuren, gefolgt von einem Stopp-Codon. Sie ist im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 2 angegeben. Hiervon sind die ersten 114 Aminosäuren wahrscheinlich nicht im maturen Protein enthalten, so dass sich für das mature Protein voraussichtlich eine Länge von 269 Aminosäuren ergibt.
Diese Sequenzen wurden mit den aus den allgemein zugänglichen Datenbanken Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http://www.genebio.com/sprot.html) und GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) erhältlichen Proteasesequenzen verglichen. Als nächstähnliche Enzyme wurden die drei in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellten identifiziert.
Tabelle 2: Homologie der Alkalischen Protease aus Bacillus gibsonii zu den nächstähnlichen Proteinen. Darin bedeuten:
Quelle Dokument, in dem die Sequenz offenbart ist;
Ident. k. DNA Identität auf DNA-Ebene für die komplette DNA in %;
Ident. m. DNA Identität auf DNA-Ebene für die für das mature Protein kodierende DNA in %; Ident. Proprä. Identität auf Aminosäure-Ebene, bezogen auf das Propräprotein, in %; Ident. m. Prot. Identität auf Aminosäure-Ebene, bezogen auf das mature Protein, in %; n. nicht in den Datenbanken angegeben.
Figure imgf000063_0001
Die Aminosäuresequenzen dieser Proteasen werden auch im Alignment der Figur 1 miteinander verglichen.
Beispiel 3: Ermittlung der Waschleistung bei Einsatz in handelsüblichem pulverförmigem Waschmittel
Für dieses Beispiel wurden standardisiert verschmutze Textilien eingesetzt, die von der Eidgenössischen Material-Prüfungs- und -Versuchsanstalt, St. Gallen, Schweiz (EMPA), oder der Wäschereiforschungsanstalt, Krefeld, bezogen worden waren. Dabei wurden folgende Anschmutzungen und Textilien verwendet: A (Gras auf Baumwolle, EMPA 164), B (Milch/Öl auf Baumwolle, PC-10), C (Ganzei/Ruß auf Baumwolle, 10N), D (Schokomilch/Ruß auf Baumwolle, C-03), E (Kakao, EMPA 112) sowie F (Blut/Milch auf Baumwolle, C-5 (044)).
Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen auf ihre Waschleistung hin untersucht. Dafür wurden die Ansätze für 60 Minuten bei einer Temperatur von 4O0C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,9 g des Waschmittels pro Liter Waschflotte. Es wurde mit Stadtwasser mit einer Wasserhärte von etwa 16° deutscher Härte gewaschen.
Als Kontroll-Waschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender Zusammensetzung (alle
Angaben in Gewichts-Prozent): 10 % lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz),
1 ,5 % Ci∑-Cis-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0 % Ci2-Ci8-Fettalkohol mit 7 EO, 20 %
Natriumcarbonat, 6,5 % Natriumhydrogencarbonat, 4,0 % amorphes Natriumdisilikat,
17 % Natriumcarbonat-peroxohydrat, 4,0 % TAED, 3,0 % Polyacrylat, 1 ,0 %
Carboxymethylcellulose, 1 ,0 % Phosphonat, 25 % Natriumsulfat, Rest: Schauminhibitoren, optischer Aufheller, Duftstoffe. Die Waschmittel-Basis-Rezeptur wurde für die verschiedenen
Versuchsreihen aktivitätsgleich mit folgenden Proteasen versetzt: Subtilisin HP302
(DE102006022216), Subtilisin TI-1 (WO03/054184), Subtilisin TII-5 (WO03/054185), ß. /enfrvs-Alkalische Protease F 49 (WO 95/23221 ) beziehungsweise die erfindungsgemäße
Protease aus ß. gibsonii.
Nach dem Waschen wurde der Weißheitsgrad der gewaschenen Textilien gemessen. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Minolta CM508d, Lichtart D65, 10. Das Gerät wird zuvor mit einem mitgelieferten Weißstandard kalibriert. Die erhaltenen Ergebnisse werden als Prozent Remission, das heißt als Prozentangaben im Vergleich zum Weißstandard, zusammen mit den jeweiligen Anfangswerten in Tabelle 3 zusammengestellt. Angegeben sind die Mittelwerte aus jeweils 3 Messungen. Sie erlauben einen unmittelbaren Rückschluss auf den Beitrag des enthaltenen Enzyms zur Waschleistung des verwendeten Mittels.
Tabelle 3: Waschergebnisse mit pulverförmigem Waschmittel bei 4O0C
Figure imgf000064_0001
Man erkennt, dass die erfindungsgemäße Protease aus ß. gibsonii bei 4O0C an einigen Anschmutzungen die homologen Proteasen HP302, TII-5 und TI-1 übertrifft (Anschmutzungen B und D) und in Bezug auf die anderen Anschmutzungen vergleichbare Werte zu diesen Proteasen liefert und dass die erfindungsgemäße Protease in Bezug auf alle Anschmutzungen mit Ausnahme von Anschmutzung C bessere Werte liefert als die etablierten Protease ß. /enfrvs-Alkalische Protease F49.
Beispiel 4: Ermittlung der Waschleistung bei Einsatz in einem handelsüblichem Flüssigwaschmittel
Die Versuchsdurchführung erfolgte im Wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben. Dabei wurden folgende Anschmutzungen und Textilien verwendet: A (Gras auf Baumwolle, EMPA 164), B (Milch/Öl auf Baumwolle, PC-10), C (Ganzei/Ruß auf Baumwolle, 10N), D (Schokomilch/Ruß auf Baumwolle, C-03), E (Kakao, EMPA 112) sowie F (Blut/Milch auf Baumwolle, C-5 (044)).
Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen auf ihre Waschleistung hin untersucht. Dafür wurden die Ansätze für 60 Minuten bei einer Temperatur von 4O0C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,9 g des Waschmittels pro Liter Waschflotte. Es wurde mit Stadtwasser mit einer Wasserhärte von etwa 16° deutscher Härte gewaschen.
Als Kontrollwaschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3- 0,5% Xanthan Gum, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS, 24-28% Nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1-2% Natriumeitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP, 0-0,4% PVP, 0-0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser Die Waschmittel-Basis-Rezeptur wurde für die verschiedenen Versuchsreihen aktivitätsgleich mit folgenden Proteasen versetzt: Subtilisin HP302 (DE102006022216), Subtilisin TI-1 (WO03/054184), Subtilisin TII-5 (WO03/054185), ß. /enfrvs-Alkalische Protease F 49 (WO 95/23221 ) beziehungsweise die erfindungsgemäße Protease aus ß. gibsonii.
Nach dem Waschen wurde der Weißheitsgrad der gewaschenen Textilien gemessen. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Minolta CM508d, Lichtart D65, 10. Das Gerät wird zuvor mit einem mitgelieferten Weißstandard kalibriert. Die erhaltenen Ergebnisse werden als Prozent Remission, das heißt als Prozentangaben im Vergleich zum Weißstandard, zusammen mit den jeweiligen Anfangswerten in Tabelle 4 zusammengestellt. Angegeben sind die Mittelwerte aus jeweils 3 Messungen. Sie erlauben einen unmittelbaren Rückschluss auf den Beitrag des enthaltenen Enzyms zur Waschleistung des verwendeten Mittels.
Tabelle 4: Waschergebnisse mit Flüssigwaschmittel bei 4O0C
Figure imgf000066_0001
Man erkennt, dass die erfindungsgemäße Protease aus ß. gibsonii bei 4O0C in einem Flüssigwaschmittel in Bezug auf alle Anschmutzungen nur mit Ausnahme der Anschmutzung E (Kakao) die homologen Proteasen Subtilisin HP302, Subtilisin TII-5 und Subtilisin TI-1 zum Teil deutlich übertrifft.
Beschreibung der Figuren
Figur 1 : Alignment der Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen
Protease aus Bacillus gibsonii mit den nächstähnlichen bekannten Subtilisinen, jeweils in der maturen, das heißt prozessierten Form.
Folgende Nummern stehen für folgende Proteasen:
1 Erfindungsgemäße Protease
2 Subtilisin HP302 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in DE102006022216)
3 Subtilisin TI-1 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054184)
4 Subtilisin TII-5 aus Bacillus gibsonii (beschrieben in WO03/054185)
Figur 2: Der von pBC16 abgeleitete Expressionsvektor pAWA22, der einen
Promotor aus ß. licheniformis (PromPLi) und stromabwärts davon eine BcI I-Restriktionsschnittstelle aufweist (vergleiche Beispiel 2 und Bernhard et al. (1978), J. Bacteriol., 133 (2), S. 897-903).

Claims

Patentansprüche
1. Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , b) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 1 bis 342 gemäß SEQ ID NO: 1 , c) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 1 bis 81 gemäß SEQ ID NO: 1 , d) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 82 bis 342 gemäß SEQ ID NO: 1 , e) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 343 bis 1152 gemäß SEQ ID NO: 1 , f) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, g) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 1 bis 114 gemäß SEQ ID NO: 2, h) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 28 bis
114 gemäß SEQ ID NO: 2, i) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 115 bis
383 gemäß SEQ ID NO: 2, j) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid gemäß Anspruch 13, k) natürlicherweise vorkommende oder künstlich erzeugte Mutanten oder polymorphe Formen oder Allele eines Polynukleotids gemäß (a) oder (e) mit bis zu 80 Mutationen, I) natürlicherweise vorkommende oder künstlich erzeugte Mutanten oder polymorphe Formen oder Allele eines Polynukleotids gemäß (b) oder (d) mit bis zu 25 Mutationen, m) Polynukleotide mit einer Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 90 % in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a) oder (e), n) Polynukleotide mit einer Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 93 % in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (d), o) unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid gemäß (a) bis (i) hybridisierende
Polynukleotide, p) Polynukleotide bestehend aus mindestens 200 aufeinanderfolgenden Nukleinsäuren eines
Polynukleotids gemäß (a), (b), (d), (e), (f), (g), (h) oder (i), q) Polynukleotide mit Deletionen und/oder Insertionen und/oder Inversionen von bis zu 50
Nukleotiden in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a) bis (p), r) Polynukleotide umfassend mindestens eines der unter (a) bis (q) genannten Polynukleotide, s) zu Polynukleotiden gemäß (a) bis (r) komplementäre Polynukleotide.
2. Polynukleotid nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es für eine Hydrolase kodiert.
3. Polynukleotid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Hydrolase um eine Protease handelt.
4. Polynukleotid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Protease um eine alkalische Protease vom Subtilisin-Typ handelt.
5. Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid dazu in der Lage ist, Peptid-Bindungen zu spalten.
6. Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer natürlichen Quelle, insbesondere aus einem Mikroorganismus, erhältlich ist.
7. Polynukleotid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-positives Bakterium handelt.
8. Polynukleotid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem gram-positiven Bakterium um eines der Gattung Bacillus handelt.
9. Polynukleotid nach vorhergehendem Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Bacillus-Spezies um Bacillus gibsonii handelt.
10. Verfahren zur Herstellung und/oder identifzierung eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukleotid chemisch synthetisiert, anhand einer Sonde aus einer Genbank isoliert oder durch Polymeraseketten-Reaktion erhalten wird.
11. Vektor umfassend ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
12. Vektor nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Klonierungsvektor oder Expressionsvektor handelt.
13. Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, b) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 1 bis 114 gemäß SEQ ID NO: 2, c) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 28 bis 114 gemäß SEQ ID NO: 2, d) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 115 bis 383 gemäß SEQ ID NO: 2, e) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 164 bis 382 gemäß SEQ ID NO: 2, f) natürlicherweise vorkommende oder künstlich erzeugte Mutanten, polymorphe Formen oder Allele eines Polypeptids gemäß (a) mit bis zu 14 Mutationen, g) natürlicherweise vorkommende oder künstlich erzeugte Mutanten, polymorphe Formen oder Allele eines Polypeptids gemäß (b) oder (c) mit bis zu 4 Mutationen, h) natürlicherweise vorkommende oder künstlich erzeugte Mutanten, polymorphe Formen oder
Allele eines Polypeptids gemäß (d) oder (e) mit bis zu 6 Mutationen, i) Polypeptide, die eine Sequenzhomologie oder-identität von mindestens 96,5 % in Bezug auf ein
Polypeptid gemäß (a) besitzen, j) Polypeptide, die eine Sequenzhomologie oder-identität von mindestens 97,5 % in Bezug auf ein
Polypeptid gemäß (d) besitzen, k) Polypeptide, die von einem Polynukleotid gemäß Anspruch 1 kodiert werden, I) Polypeptide, bestehend aus mindestens 81 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der
Aminosäuresequenz gemäß (a) oder (d), m) Polypeptide, bestehend aus mindestens 127 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der
Aminosäuresequenz gemäß (a) oder (d), wobei gegebenenfalls eine Abweichung in einer
Aminosäureposition vorliegen kann, n) Polypeptide bestehend aus mindestens 171 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der
Aminosäuresequenz gemäß (a) oder (d), wobei gegebenenfalls Abweichungen in bis zu zwei
Aminosäurepositionen vorliegen können, o) Polypeptide bestehend aus mindestens 192 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der
Aminosäuresequenz gemäß (a) oder (d), wobei gegebenenfalls Abweichungen in bis zu drei
Aminosäurepositionen vorliegen können, p) Polypeptide mit Insertionen und/oder Deletionen und/oder Inversionen von bis zu 50
Aminosäuren in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) bis (o), q) Polypeptide, umfassend mindestens eines der unter (a) bis (p) genannten Polypeptide.
14. Polypeptid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Hydrolase handelt.
15. Polypeptid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Hydrolase um eine Protease handelt.
16. Polypeptid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Protease um eine Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ handelt.
17. Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid dazu in der Lage ist, Peptid-Bindungen zu spalten.
18. Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid zusätzlich derivatisiert ist.
19. Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich stabilisiert ist.
20. Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem Mikroorganismus erhältlich ist.
21. Polypeptid nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-positives Bakterium handelt.
22. Polypeptid nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem gram-positivem Bakterium um eines der Gattung Bacillus handelt.
23. Polypeptid nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Bacillus-Spezies um Bacillus gibsonii handelt.
24. Zelle umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einen Vektor nach Anspruch 11 oder 12.
25. Zelle, die eines der in den Ansprüchen 13 bis 19 bezeichnetes Polypeptid exprimiert oder zu dessen Expression angeregt werden kann, insbesondere unter Einsatz eines der in den Ansprüchen 1 bis 9 bezeichneten Polynukleotids und/oder unter Einsatz eines Vektors gemäß Anspruch 11 oder 12.
26. Zelle gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Bakterium handelt, insbesondere eines, das das gebildete Protein ins umgebende Medium sezerniert.
27. Zelle nach Anspruch 26, wobei es sich um ein gramnegatives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
28. Zelle nach Anspruch 26, wobei es sich um ein grampositives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii, B. gibsonii, B. pumilus oder ß. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum.
29. Zelle nach einem der Anspruch 25, wobei es sich um eine eukaryontische Zelle handelt, vorzugsweise eine der Gattung Saccharomyces.
30. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellung unter Verwendung eines Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder eines Vektors nach Anspruch 11 oder 12 und/oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 24 bis 29 erfolgt, wobei die Nukleinsäuresequenz gegebenenfalls dem Codon-Usage der Wirtszelle angepasst ist.
31. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 23 enthält.
32. Zusammensetzung nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Waschoder Reinigungsmittel handelt.
33. Zusammensetzung nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein kosmetisches oder pharmazeutisches Mittel handelt.
34. Zusammensetzung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Shampoo, eine Seife, eine Waschlotion, eine Creme, ein Peeling oder ein Mund-, Zahn- oder Zahnprothesenpflegemittel handelt.
35. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Polypeptid in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels enthält.
36. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass sie weitere Enzyme, insbesondere andere Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Oxidoreduktasen und/oder Lipasen enthält.
37. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine weitere Komponente enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tensiden, Buildern, Säuren, alkalischen Substanzen, Hydrotropen, Lösungsmitteln, Verdickungsmitteln, Bleichmitteln, Farbstoffen, Parfüms, Korrosionsinhibitoren, Sequestriermitteln, Elektrolyten, optischen Aufhellern, Vergrauungsinhibitoren, Silberkorrosionsinhibitoren, Farbübertragungsinhibitoren, Schauminhibitoren, Abrasivstoffen, UV-Absorbenzien, Lösungsmitteln, Abrasivstoffen, Antistatika, Perlglanzmitteln und Hautschutzmitteln.
38. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine feste, gelförmige, pastöse oder flüssige Zusammensetzung handelt.
39. Erzeugnis enthaltend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 23 oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 38 und einen Sprühspender zur Dosierung des Polypeptids und/oder der Zusammensetzung als Aerosol und/oder als Schaum.
40. Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 23 aktiv wird, insbesondere in einer Menge von 40 μg bis 96 g, vorzugsweise von 50 μg bis 72 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 48 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 24 g pro Anwendung.
41. Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 23 aktiv wird, insbesondere für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
42. Verfahren zur Hydrolyse von Biofilmen auf Oberflächen oder zur Entfernung von Schmutzresten von Oberflächen durch Inkubation mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 23 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 38, gegebenenfalls unter Verwendung eines Erzeugnisses nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die zu behandelnde Oberfläche mit dem Polypeptid und/oder der Zusammensetzung behandelt wird.
43. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23, einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 38 oder eines Erzeugnisses nach Anspruch 39 zur Zerstörung und/oder Entfernung von Biofilmen und/oder zur Entfernung von Schmutzresten von Oberflächen und/oder zur Reinigung von Textilien.
44. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23 zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln.
45. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23, einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 38 oder eines Erzeugnisses nach Anspruch 39 zur hydrolytischen Spaltung von Peptidbindungen.
46. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23 zur biochemischen Analyse oder zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen.
47. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23 zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen.
48. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23 zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder.
49. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23 zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben.
50. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23 zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, insbesondere zur Behandlung von Wolle oder Seide oder woll- oder seidenhaltigen Mischtextilien.
51. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23 zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten.
52. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23 zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln.
53. Erzeugnis aus einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 38 und einer Mehrkammerflasche.
54. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 23 zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung.
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