WO2008049299A1 - Souche de streptomyces et procédé de conversion d'acide férulique en vanilline utilisant celle-ci - Google Patents

Souche de streptomyces et procédé de conversion d'acide férulique en vanilline utilisant celle-ci Download PDF

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WO2008049299A1
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vanillin
ferulic acid
liter
streptomyces
medium
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Ping Xu
Dongliang Hua
Shan Lin
Lifu Song
Cuiqing Ma
Zhaobin Zhang
Yiyong Zeng
Yi Du
Hong Chen
Li Gan
Zhonghao Wei
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Shanghai Apple Flavor & Fragrance Co., Ltd
Shanghai Kaixin Biotech Co., Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • the present invention belongs to the field of biotechnology, and in particular, to a strain of Streptomyces and a method for producing vanillin by biotransformation of ferulic acid using the strain of Streptomyces. Background technique
  • Vanillin also known as vanillin, vanillin, English name vanillin, molecular formula is C 8 H 8 0 3 , the amount of breakup is 152.14.
  • Vanillin has a white to yellowish needle crystal or powder. It is a characteristic aroma of vanilla bean, slightly sweet, and slowly oxidized to vanillic acid in moist air. The boiling point is 284 ⁇ 285 ° C, the relative density is 1.056, slightly soluble in water, soluble in organic solvents such as ethanol, ether, chloroform, glacial acetic acid, carbon disulfide and pyridine.
  • Vanillin is one of the world's largest and most versatile fragrances. It is known as the "King of Spices" and is widely used in chocolate, ice cream, candy and other foods as well as cigarettes, beverages and high-end cosmetics. It can be used not only as a flavoring and setting agent, but also as a preservative, preservative and antioxidant in foods. In the chemical industry, vanillin inhibits foaming of lubricants, as a whitening agent for galvanizing baths, and as an active agent for zinc plating. Vanillin is also an important intermediate for the synthesis of pharmaceuticals and is used as a base material for the production of L-dopa, L-methyldopa and papaverine. At present, the demand for vanillin in the world market is 15,000 tons per year, and it is growing at a rate of 10% per year.
  • Vanillin is the main component of natural vanilla, and its content in vanilla bean is about 15 ⁇ 20 g / kg.
  • Vanilla requires artificial pollination of flowers during planting. It is labor intensive and difficult to grow on a large scale. Extraction from plant materials cannot meet the growing market demand for natural vanillin. Its annual output is only about 2,000 tons.
  • Common synthetic substrates include eugenol, lignin, glyoxylic acid, baicalein and guaiacol. Domestically used is a nitrosation process using guaiacol and urotropine.
  • the method has long line, complicated separation process, low yield, serious environmental pollution, high consumption of raw materials, and has been eliminated abroad.
  • the main use of guaiacol and glyoxylate condensation process abroad is simple, the yield is high, but it is still in the research stage and cannot be applied to industrial production.
  • the chemical synthesis process is mature, the product purity is high, and the raw materials are widely available, but there are serious defects, such as serious environmental pollution, single product aroma, easy to be doped, and the safety of synthetic vanillin is also questioned.
  • Microorganisms such as Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, and Serratia have been found to produce vanillin by converting a variety of substrates, including ferulic acid, lignin, vanillic acid, eugenol, and Isoeugenol and the like, among which ferulic acid and eugenol are studied in more depth.
  • substrates including ferulic acid, lignin, vanillic acid, eugenol, and Isoeugenol and the like, among which ferulic acid and eugenol are studied in more depth.
  • the concentration of vanillin is very low, and it is still not up to the requirements of industrial production. It has been reported that many microorganisms capable of transforming ferulic acid to produce vanillin are produced at a yield of less than 10 g/L.
  • the present invention provides a strain of Streptomyces, which is named S/r ⁇ tom ⁇ ⁇ sp.
  • Inclined culture Streptomyces sp. r ⁇ t 0 ⁇ C ⁇ sp. Vl was inoculated on solid slant medium, and cultured for 24 hours under 30 ; conditions;
  • the cell culture time described in the step (3) is preferably 18 to 28 hours.
  • the concentration of ferulic acid added in the step (4) is preferably 5 to 15 g / liter.
  • the conversion time described in the step (4) is preferably 10 to 20 hours.
  • the amount of the macroporous adsorption resin to be added in the step (4) is preferably from 5% to 10%.
  • the liquid seed culture medium used for seed culture is: glucose 10 g/liter, yeast powder 5 g/liter, peptone 10 g/liter, wort 10 g / liter, sodium chloride 5 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize for 20 minutes under 115 conditions.
  • the solid slant medium was formulated to add 1.6% by mass of agar to the liquid seed culture medium.
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, sulfuric acid Magnesium 0.8 g / liter, sodium chloride 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 ° C for 20 minutes.
  • the invention has the advantages that: the method for producing vanillin by biotransformation of ferulic acid by using Streptomyces S ⁇ e tom ⁇ y sp.
  • Vl has mild reaction conditions, small environmental pollution, high product concentration, few by-products, short production cycle, and low cost. Low, simple extraction steps, clean production, environmentally friendly products, safe and reliable, solve many problems encountered in the long-term use of plant raw material extraction and chemical synthesis, and have great application prospects.
  • Fig. 1 is a graph showing the changes of ferulic acid and vanillin in the process of transforming ferulic acid to produce vanillin by Streptomyces ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ; ⁇ C sp. V-l.
  • Fig. 2 is a graph showing the changes of ferulic acid and vanillin in the process of continuous conversion of vanillin by continuous addition of high concentration of ferulic acid by Streptomyces 5 ⁇ to ⁇ c ⁇ sp. V-l. detailed description
  • the screening was able to convert ferulic acid to produce vanillin.
  • the strain has finally obtained a strain with good degradation ability and can accumulate a large amount of lansin, namely Streptomyces Streptcw ⁇ c ⁇ sp. Vl.
  • the strain was deposited with the China Center for Type Culture Collection on July 12, 2006, and preserved. The number is CCTCC M 206065.
  • the strain has a bright yellow hyphae, a pale yellow hyphae in the base, no hysteresis in the base, no rupture, spore oval, smooth surface, can use glucose, xylose, fructose, sucrose, can not liquefy gelatin, The hydrogen sulfide was not produced, and the 16S rDNA sequence of the Stmptomyces sp. V1 strain and the 16S rDNA sequence of the multi-strand mold reached 97 to 98%.
  • the solid medium formulation used is: glucose 10 g / liter, yeast powder 5 g / liter, peptone 10 g / liter, wort 10 g / liter , sodium chloride 5 g / liter, agar 16 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 ° C for 20 minutes.
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, magnesium sulfate 0.8 g / liter, sodium chloride 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 ° C for 20 minutes.
  • Example 2
  • Streptomyces sp. Vl cells were inserted into GY transformation medium at a percentage of 6% by volume after 24 hours of seed culture. After incubation for 18 hours, 5 g/L of ferulic acid was added, at 3 (TC conditions). The culture was shaken at 120 rpm, and the concentration of vanillin was measured after 20 hours.
  • Inclined culture Inject "»re; ⁇ m i y C sp. Vl into solid slant medium, at 3 (TC conditions, static) Set for 24 hours;
  • Vanillin concentration detection The transformed sample was extracted with analytically pure butyl acetate, and the vanillin concentration was measured by Varian 3380 gas chromatograph. The final vanillin concentration was 1.5 g/L, and the molar conversion was 38.3 %. .
  • the liquid seed culture medium used for seed culture is: glucose 10 g/liter, yeast powder 5 g/liter, peptone 10 g/liter, wort 10 g / liter, sodium chloride 5 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize for 20 minutes at 115 ⁇ .
  • the solid slant medium was formulated to add 1.6% by mass of agar to the liquid seed culture medium.
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, sulfuric acid Magnesium 0.8 g / liter, sodium chloride 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize for 20 minutes under 115 conditions.
  • Example 3
  • Streptomyces sp. Vl cells were inserted into GY transformation medium at a volume percentage of 6% after 24 hours of seed culture. After incubation for 28 hours, 5 g/L of ferulic acid was added at 30 °C. Incubate at 120 rpm. A sample was taken 20 hours later to determine the vanillin concentration.
  • Streptomyces sp. V-1 of the present embodiment biotransforms ferulic acid to produce vanillin, and the detailed steps involved are as follows:
  • Inclined culture will Sp. Vl was inoculated on solid slant medium, and cultured at 30 ° C for 24 hours;
  • Vanillin concentration detection The transformed sample was extracted with analytically pure butyl acetate, and the concentration of vanillin was measured by Varian 3380 gas chromatograph. The final vanillin concentration was 1.6 g/L, and the molar conversion was 40.8 %. .
  • the liquid seed culture medium used for seed culture is: glucose 10 g/liter, yeast powder 5 g/liter, peptone 10 g/liter, wort 10 g / liter, sodium chloride 5 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 °C for 20 minutes.
  • the solid slant medium was formulated to add 1.6% by mass of agar to the liquid seed culture medium. .
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, sulfuric acid Magnesium 0.8 g / liter, chlorine Sodium 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 ° C for 20 minutes.
  • Example 4
  • Streptomyces sp. Vl cells were inserted into GY transformation medium at a volume percentage of 6% after 24 hours of seed culture. After 24 hours of culture, the cells were added with 5 g/L of ferulic acid at 30 °C. Incubate at 120 rpm. A sample was taken 20 hours later to determine the vanillin concentration.
  • the Streptomyces repto yc ⁇ sp. V-1 of the present embodiment converts ferulic acid to produce vanillin, and the detailed steps involved are as follows:
  • Inclined culture Streptomyces S/r ⁇ tom ⁇ sp.V-l was inoculated on solid slant medium, and cultured at 30 ° C for 24 hours;
  • Vanillin concentration speculation The transformed sample was extracted with analytically pure butyl acetate, and the vanillin concentration was measured by Varian 3380 gas chromatograph. The final vanillin concentration was 2.0 g/L, and the molar conversion was 51.1. %.
  • the liquid seed culture medium used for seed culture is: glucose 10 g/liter, yeast powder 5 g/liter, peptone 10 g/liter, wort 10 g / liter, sodium chloride 5 g / liter, adjust P H to 7.2. Sterilize at 115 ° C for 20 minutes.
  • the solid slant medium was formulated to add a mass to volume ratio of 1.6% agar based on the liquid seed medium.
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, sulfuric acid Magnesium 0.8 g / liter, sodium chloride 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 ° C for 20 minutes.
  • Streptomyces sp. Vl cells were inserted into GY transformation medium at a volume percentage of 6% after 24 hours of seed culture. After culture for 24 hours, 10 g/L of ferulic acid was added at 30 °C. Incubate at 120 rpm. A sample was taken 20 hours later to determine the vanillin concentration.
  • V-1 is converted to ferulic acid to produce vanillin, and the detailed steps involved are as follows:
  • Inclined culture Streptomyces Strei ⁇ c ⁇ sp.V-1 was inoculated on a solid slant medium, and cultured under a condition of 30 Torr for 24 hours;
  • Vanillin concentration detection The transformed sample was extracted with analytically pure butyl acetate and then Varian 3380 gas color was used. The concentration of vanillin was measured by a spectrometer, and the final vanillin concentration was 5.0 g/liter, and the molar conversion was 63.8%.
  • the liquid seed culture medium used for seed culture is: glucose 10 g/liter, yeast powder 5 g/liter, peptone 10 g/liter, wort 10 g / liter, sodium chloride 5 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize for 20 minutes under 115 conditions.
  • the solid slant medium was formulated to add 1.6% by mass of agar to the liquid seed culture medium.
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, sulfuric acid Magnesium 0.8 g / liter, sodium chloride 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize for 20 minutes under 115 conditions.
  • Example 6
  • Streptomyces sp. Vl cells were inserted into GY transformation medium at a volume percentage of 6% inoculation after 24 hours of seed culture. After 24 hours of culture, the cells were added with 15 g/L of ferulic acid at 30 °C. Incubate at 120 rpm. A sample was taken 20 hours later to determine the vanillin concentration.
  • Streptomyces Strep o yc ⁇ sp. V-1 of this example converts ferulic acid to produce vanillin, and the detailed steps involved are as follows:
  • Inclined culture Streptomyces Stre;?to j c sp. V-l was inoculated on a solid slant medium, and cultured under a condition of 30 Torr for 24 hours;
  • the liquid seed culture medium used for seed culture is: glucose 10 g/liter, yeast powder 5 g/liter, peptone 10 g/liter, wort 10 g / liter, sodium chloride 5 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize for 20 minutes under 115 conditions.
  • the solid slant medium was formulated to add 1.6% by mass of agar to the liquid seed culture medium.
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, sulfuric acid Magnesium 0.8 g / liter, sodium chloride 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize for 20 minutes under 115 conditions.
  • Streptomyces sp. Vl cells were inserted into GY transformation medium at a volume percentage of 6% after 24 hours of seed culture. After 24 hours of culture, the cells were added with 10 g/L of ferulic acid and 120 rpm under 30 ⁇ conditions. /min shake culture. A sample was taken 17 hours later to determine the vanillin concentration.
  • Streptomyces of the present embodiment Sp. V-1 transforms ferulic acid to produce vanillin.
  • the detailed steps involved are as follows: (1) Inclined culture: Streptomyces sp. Vl is inoculated onto solid slant medium and allowed to stand at 30 °C. Cultivate for 24 hours; W 200
  • the liquid seed culture medium used for seed culture is: glucose 10 g/liter, yeast powder 5 g/liter, peptone 10 g/liter, wort 10 g / liter, sodium chloride 5 g / liter, adjust P H to 7.2. Sterilize at 115 °C for 20 minutes.
  • the solid slant medium was formulated to add a mass to volume ratio of 1.6% agar based on the liquid seed culture medium.
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, sulfuric acid Magnesium 0.8 g / liter, sodium chloride 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize for 20 minutes under 115 conditions.
  • Streptomyces sp. Vl cells were inserted into GY transformation medium at a volume percentage of 6% after 24 hours of seed culture. After culture for 24 hours, 10 g/L of ferulic acid was added at 30 °C. Incubate at 120 rpm. A sample was taken 15 hours later to determine the vanillin concentration.
  • Streptomyces Strepto yces sp. V- ⁇ of this example transforms ferulic acid to produce vanillin, and the detailed steps involved are as follows:
  • Inclined culture Streptomyces Streptomj ⁇ s sp. V-l was inoculated on solid slant medium, and cultured for 24 hours under 30 ; conditions;
  • the liquid seed culture medium used for seed culture is: glucose 10 g/liter, yeast powder 5 g/liter, peptone 10 g/liter, wort 10 g / liter, sodium chloride 5 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 ° C for 20 minutes.
  • the solid slant medium was formulated to add 1.6% by mass of agar to the liquid seed culture medium.
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, sulfuric acid Magnesium 0.8 g / liter, sodium chloride 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize for 20 minutes under 115 conditions. Streptomyces sp. Vl cells were inserted into GY transformation medium at a volume percentage of 6% after 24 hours of seed culture. After 24 hours of culture, 10 g/L of ferulic acid was added at 30 °C.
  • Inclined culture Streptomyces sp. Sfrepti W ⁇ c sp. V-l was inoculated on solid slant medium, and cultured under static conditions for 30 hours under 30 ; conditions;
  • Vanillin concentration detection The transformed sample was extracted with analytically pure butyl acetate, and the concentration of vanillin was measured by Varian 3380 gas chromatograph. The final vanillin concentration was 16.5 g/L, and the molar conversion was 46.8. %.
  • the liquid seed culture medium used for seed culture is: glucose 10 g/liter, yeast powder 5 g/liter, peptone 10 g/liter, wort 10 g / liter, sodium chloride 5 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize for 20 minutes at 115 ⁇ .
  • the solid slant medium was formulated to add 1.6% by mass of agar to the liquid seed culture medium.
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, sulfuric acid Magnesium 0.8 g / liter, sodium chloride 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 ° C for 20 minutes.
  • Streptomyces sp. Vl cells were inserted into GY transformation medium at a volume percentage of 6% after 24 hours of seed culture. After 24 hours of culture, 10 g/L of ferulic acid was added at 30 °C. After 120 hours of shaking culture at 120 rpm, add 8% (wet weight/volume) of macroporous adsorption resin DM11. When the concentration of ferulic acid is less than 2 g/L, add Awei at a rate of 5 g/L. The acid was brought to a final concentration of 45 g/l. Samples were taken after 55 hours to determine the vanillin concentration. The Streptomyces str ⁇ to yc ⁇ sp. V-1 of the present embodiment converts ferulic acid to produce vanillin, and the detailed steps involved are as follows:
  • Inclined culture Streptomyces St ⁇ to ⁇ c ⁇ sp.V-l was inoculated on solid slant medium, and cultured for 24 hours under 30 ; conditions;
  • Vanillin concentration detection The transformed sample was extracted with analytically pure butyl acetate, and the vanillin concentration was measured by Varian 3380 gas chromatograph. The final vanillin concentration was 19.2 g/L, and the molar conversion was 54.5 %. .
  • the liquid seed culture medium used for seed culture is: glucose 10 g/liter, yeast powder 5 g/liter, peptone 10 g/liter, wort 10 g / liter, sodium chloride 5 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 °C for 20 minutes.
  • the solid slant medium was formulated to add 1.6% by mass of agar to the liquid seed culture medium.
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, sulfuric acid Magnesium 0.8 g / liter, sodium chloride 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 °C for 20 minutes.
  • Streptomyces sp. Vl cells were inserted into GY transformation medium at a volume percentage of 6% inoculation after 24 hours of seed culture. After 24 hours of culture, the cells were added with 10 g/L of ferulic acid at 3 (TC conditions). After 120 hours of shaking culture at 120 rpm, add 10% (wet weight/volume) macroporous adsorption resin DM11. When the concentration of ferulic acid is less than 2 g/L, add abalone at a rate of 5 g/L. The acid was brought to a final concentration of 45 g/L. The vanillin concentration was measured after 55 hours. Streptomyces in this example Sp. Vl transforms ferulic acid to produce vanillin, and the detailed steps involved are as follows:
  • Inclined culture Streptomyces sp. V-l was inoculated on solid slant medium, and cultured at 30 ° C for 24 hours;
  • Transformation using the transformed cell culture solution obtained in the step (3), adding 10 g/l of ferulic acid, and incubating at 120 rpm for 12 hours at 120 rpm for 10 hours (wet weight / Volume) macroporous adsorption resin DM11, when ferulic acid concentration is less than 2 g / liter, ferulic acid is added at a rate of 5 g / liter each time to a final concentration of 45 g / liter.
  • Vanillin concentration detection The transformed sample was extracted with analytically pure butyl acetate, and the vanillin concentration was measured by Varian 3380 gas chromatograph. The final vanillin concentration was 17.5 g/L, and the molar conversion was 49.6%. .
  • the liquid seed culture medium used for seed culture is: glucose 10 g/liter, yeast powder 5 g/liter, peptone 10 g/liter, wort 10 g / liter, sodium chloride 5 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 °C for 20 minutes.
  • the solid slant medium was formulated to add 1.6% by mass of agar to the liquid seed culture medium.
  • the GY conversion medium used for transforming ferulic acid to produce vanillin is: 15 g/L of glucose, 8 g/L of yeast powder, sulfuric acid Magnesium 0.8 g / liter, sodium chloride 2 g / liter, adjust the pH to 7.2. Sterilize at 115 ° C for 20 minutes.

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Description

一株链霉菌及利用其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法 技术领域
本发明属于生物技术领域， 具体地说， 尤其涉及一株链霉菌及利用该株链霉菌生物 转化阿魏酸生产香兰素的方法。 背景技术
香兰素， 又名香草醛、 香荚兰素， 英文名为 vanillin, 分子式为 C8H803， 分手量为 152.14。香兰素外观为白色至微黄色针状结晶或粉末， 呈香荚兰豆特有的香气， 微甜， 在 潮湿的空气中缓慢氧化为香兰酸。沸点为 284〜285°C， 相对密度为 1.056， 微溶于水， 易 溶于乙醇、 乙醚、 氯仿、 冰醋酸、 二硫化碳和吡啶等有机溶剂。
香兰素是世界上产量最大、 用途最广的香料之一， 被誉为"香料之王"， 广泛应用于 巧克力、 冰激凌、 糖果等食品以及香烟、 饮料和高档化妆品中。 它不仅可以用作增香剂 和定香剂， 还可在食品中用作防腐剂、 保鲜剂和抗氧化剂。 在化学工业中， 香兰素可抑 制润滑剂发泡， 用作镀锌槽的增白剂、 锌电镀的活性剂。 香兰素也是重要的医药合成中 间体， 用作生产 L-多巴、 L-甲基多巴和罂粟碱的基础原料。 目前世界市场上香兰素的需 求为每年 1.5万吨， 且以每年 10%的速度增长。
目前常用的香兰素生产方法是植物原料提取法和化学合成法。 香兰素是天然香荚兰 的主要成分， 其在香荚兰豆中的含量约为 15〜20克 /千克。 香荚兰在种植过程中需要对 花朵进行人工授粉， 劳动强度大， 难以进行大规模栽种， 从植物原料提取不能满足日益 增长的天然香兰素市场需求， 其年产量仅为 2000吨左右。 目前市场上绝大多数的香兰素 产品是通过化学合成的， 常用的合成底物包括丁香酚、 木质素、 乙醛酸、 黄樟素和愈创 木酚等。 国内常用的是釆用愈创木酚和乌洛托品反应的亚硝化工艺， 该方法线路长， 分 离过程复杂， 收率低， 环境污染严重， 原料消耗高， 国外早已被淘汰。 国外主要釆用愈 创木酚和乙醛酸缩合工艺， 该工艺设备简单， 产率较高， 但还处于研究阶段， 未能应用 于工业化生产。 总体来说， 化学合成法工艺成熟， 产物纯度高， 原料来源广泛， 但存在 严重的缺陷， 比如环境污染严重， 产品香气单一， 易掺杂质， 合成香兰素的安全性也受 到质疑。
随着生活水平的提髙， 人们对天然绿色产品的需求也越来越高。 与化学合成相比， 生物法合成香兰素具有反应条件温和， 副产物少， 提取步骤简单， 生产清洁， 环境污染 低， 产品安全可靠等优点， 正日益受到人们的重视。 美国 FDA规定， 天然香料必须是由 来自于植物或动物的原料通过物理， 酶法或微生物加工过程得到的产品。在这种背景下， 应用各种廉价的天然原料通过生物技术生产香兰素成为研究的一个热点。 目前已经发现， 芽孢杆菌、 链霉菌、 假单胞菌和沙雷氏菌等微生物能利用转化多种底物生成香兰素， 这 些底物包括阿魏酸、 木质素、 香兰酸、 丁香酚和异丁香酚等等， 其中研究得较为深入的 是阿魏酸和丁香酚。 但以丁香酚为底物的生产工艺， 产物香兰素浓度很低， 目前还达不 到工业化生产的要求。 据报道能转化阿魏酸生产香兰素的微生物很多， 产量多在 10克 /升以下。 产量最高 的两株菌是 Rabenhorst ( 1996)报道的 Streptomyces setonii ATCC39116和 A.Mu eim(1998) 报道的
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sp. HR167, 香兰素浓度分别达到 12克 /升和 11.5克 /升。 由于香兰 素在 10克 /升以上就可以结晶， 以上两种已经接近产业化的水平。 但应用这两个菌株生 产香兰素时培养基成分较为复杂， 生产成本较高， 副产物较多包括香兰酸、 香兰醇和愈 创木酚等， 给产品的分离提取带来了相当的困难。 发明内容
针对目前市场对天然绿色产品的需要， 以及生物法生产香兰素得率较低、副产物多、 生产成本高等问题，本发明提供了一株链霉菌，该菌株名为 S/r^tom^^ sp. V-l ,于 2006 年 7月 12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 206065 ,其特征是： 气生菌丝亮黄色、 基内菌丝浅黄色， 基内菌丝无横隔、 不断裂， 孢子椭圆形、 表面光滑， 可利用葡萄糖、 木糖、 果糖、 蔗糖， 不能液化明胶， 不产硫化氢， 该菌株的 16S rDNA 序列与多株链霉菌的 16S rDNA序列相似性达到, 97〜98 %。
利用该株链霉菌 Streptomyces sp. V-l生物转化阿魏酸生产香兰素的方法， 其涉及的 详细步骤如下：
( 1 )斜面培养： 将链霉菌》r^t0 ^C^ sp. V-l接种固体斜面培养基上， 在 30Ό条件 下， 静置培养 24小时；
(2 )制备种子培养液： 用步骤（1 )所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 30Ό条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液；
(3 )转化细胞培养： 使用步骤（2 )所得的种子培养液， 按体积百分比 6 %的接种量 接入 GY转化培养基中， 在 30Ό条件下， 120转 /分钟振荡培养 10〜30小时；
(4 )转化：使用步骤（3 )所得的转化细胞培养液，加入 5〜15克 /升的阿魏酸， 30°C 条件下， 120转 /分钟振荡培养 12〜24小时。 在补加高浓度阿魏酸连续培养过程中， 振荡 培养 12小时后加入 2 %〜12 % (湿重 /体积） 大孔吸附树脂 DM11 , 当阿魏酸浓度低于 2 克 /升时以每次 5克 /升的速率补加阿魏酸至终浓度为 45克 /升， 120转 /分钟振荡培养至 55 小时。
其中， 步骤 （3 ) 中所述的菌体培养时间优选是 18〜28小时。
其中， 步骤 （4 ) 中所述的加入的阿魏酸浓度优选为 5〜15克 /升。
其中， 步骤 （4 ) 中所述的转化时间优选是 10〜20小时。
其中， 步骤 （4 ) 中所述的大孔吸附树脂加入量优选为是 5 %〜10 %。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 种子培养使用的液体种子培 养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化 钠 5克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 Ό条件下灭菌 20分钟。 固体斜面培养基配方为在液体种 子培养基基础上添加质量体积比 1.6 %的琼脂。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素 使用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯 化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115°C条件下灭菌 20分钟。 本发明的优点是： 使用链霉菌 S^e tom^ y sp. V-l生物转化阿魏酸生产香兰素的方 法反应条件温和， 环境污染小， 产物浓度高， 副产物少， 生产周期短， 成本低， 提取步 骤简单， 生产清洁， 产品环境友好， 安全可靠， 解决了长期以来釆用植物原料提取法和 化学合成法遇到的多种难题， 具有很大的应用前景。 附图说明
附图 1为链霉菌<¾^； ^ C sp. V-l转化阿魏酸生产香兰素的过程中阿魏酸和香兰 素的变化曲线。
附图 2为链霉菌 5 ^ to^c^ sp. V-l在补加高浓度阿魏酸连续转化生产香兰素的过 程中阿魏酸和香兰素的变化曲线。 具体实施方式
实施例 1: 链霉菌 Streptomyces sp. V-l的筛选
取果树周围的土壤，称取 5克溶于 100毫升生理盐水，充分混勾后取 10毫升加入 50 毫升 GY转化培养基中，在 30°C条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时后加入质量体积比 为 1 %的阿魏酸， 120转 /分钟振荡培养 20小时， 重复这一过程 3〜5次。 将培养的菌液 稀释 1,000,000倍涂布固体培养基上， 在 30'C条件下静置培养 20小时。 选取长出的单菌 落接种 50毫升的 GY转化培养基中， 振荡培养 24小时后加入 1 %质量体积比的阿魏酸， 120转 /分钟振荡培养 20小时， 筛选能够转化阿魏酸生成香兰素菌株，最终获得一株降解 能力较好、 能大量积累 兰素的菌株， 即链霉菌 Streptcw^c^ sp. V-l， 该菌株于 2006年 7月 12日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC M 206065。
' 该菌株其生菌丝亮黄色、基内菌丝浅黄色， 基内菌丝无横隔、不断裂， 孢子椭圆形、 表面光滑，可利用葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖，不能液化明胶，不产硫化氢，所述 Stmptomyces sp. V-l菌株的 16S rDNA与多 链霉菌的 16S rDNA序列相似性达到 97〜98 %。
在上 筛选转化阿魏酸生产香兰素的菌株的方法中， 使用的固体培养基配方为： 葡 萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化钠 5克 /升， 琼 脂 16克 /升， 调节 pH至 7.2。 115°C条件下灭菌 20分钟。
在上述筛选转化阿魏酸生产香兰素的菌株的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素使 用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯化 钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115°C条件下灭菌 20分钟。 实施例 2:
链霉菌 Streptomyces sp. V-l菌体在种子培养 24小吋后以体积百分比 6%接种量接入 GY转化培养基中， 菌体培养 18小时后加入 5克 /升阿魏酸， 在 3(TC条件下 120转 /分钟 振荡培养。 20小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例的链霉菌
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sp. V-l生物转化阿魏酸生产香兰素， 其涉及的详细 步骤如下：
( 1 )斜面培养： 将《»re;^miyC sp. V-l接种固体斜面培养基上， 在 3(TC条件下， 静 置培养 24小时；
(2)制备种子培养液： 用步骤（1 )所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 30°C条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液；
(3 )转化细胞培养： 使用步骤（2 )所得的种子培养液， 按体积百分比 6%的接种量 接入 GY转化培养基中， 在 30°C条件下， 120转 /分钟振荡培养 18小时；
(4)转化： 使用步骤 （3 )所得的转化细胞培养液， 加入 5克 /升的阿魏酸， 30Ό条 件下， 120转 /分钟振荡培养 20小时。
( 5 ) 香兰素浓度检测： 转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安 3380气相色 谱仪检测香兰素浓度， 最终香兰素浓度达到 1.5克 /升， 摩尔转化率为 38.3 %。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 种子培养使用的液体种子培 养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化 钠 5克 /升， 调节 pH至 7.2。 115Ό条件下灭菌 20分钟。 固体斜面培养基配方为在液体种 子培养基基础上添加质量体积比 1.6 %的琼脂。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素 使用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯 化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 Ό条件下灭菌 20分钟。 实施例 3:
链霉菌 Streptomyces sp. V-l菌体在种子培养 24小时后以体积百分比 6%接种量接入 GY转化培养基中， 菌体培养 28小时后加入 5克 /升阿魏酸， 在 30°C条件下 120转 /分钟 振荡培养。 20小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例的 Streptomyces sp. V-l生物转化阿魏酸生产香兰素， 其涉及的详细步骤如下：
( 1 )斜面培养： 将
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sp. V-l接种固体斜面培养基上， 在 30°C条件下， 静 置培养 24小时； ，
(2)制备种子培养液： 用步骤（1 )所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 30Ό条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液；
( 3 )转化细胞培养： 使用步骤（2 )所得的种子培养液， 按体积百分比 6 %的接种量 接入 GY转化培养基中， 在 30°C条件下， 120转 /分钟振荡培养 28小时；
(4 )转化： 使用步骤 （3 )所得的转化细胞培养液， 加入 5克 /升的阿魏酸， 30°C条 件下， 120转 /分钟振荡培养 20小时。
( 5 ) 香兰素浓度检测： 转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安 3380气相色 谱仪检测香兰素浓度， 最终香兰素浓度达到 1.6克 /升， 摩尔转化率为 40.8 %。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 种子培养使用的液体种子培 养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化 钠 5克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 °C条件下灭菌 20分钟。 固体斜面培养基配方为在液体种 子培养基基础上添加质量体积比 1.6 %的琼脂。 .
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素 使用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯 化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115°C条件下灭菌 20分钟。 实施例 4:
链霉菌 Streptomyces sp. V-l菌体在种子培养 24小时后以体积百分比 6%接种量接入 GY转化培养基中， 菌体培养 24小时后加入 5克 /升阿魏酸， 在 30°C条件下 120转 /分钟 振荡培养。 20小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例的链霉菌 repto yc^sp. V-1转化阿魏酸生产香兰素， 其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养： 将链霉菌 S/r^tom ^sp.V-l接种固体斜面培养基上， 在 30°C条件 下， 静置培养 24小时；
(2)制备种子培养液： 用歩骤（1)所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 3CTC条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液；
(3)转化细胞培养： 使用步骤（2)所得的种子培养液， 按体积百分比 6%的接种量 接入 GY转化培养基中， 在 30Γ条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时；
(4)转化： 使用步骤 （3)所得的转化细胞培养液， 加入 5克 /升的阿魏酸， 30°C条 件下， 120转 /分钟振荡培养 20小时。
(5)香兰素浓度捡测： 转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安 3380气相色 谱仪检测香兰素浓度， 最终香兰素浓度达到 2.0克 /升， 摩尔转化率为 51.1%。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 种子培养使用的液体种子培 养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化 钠 5克 /升， 调节 PH至 7.2。 115°C条件下灭菌 20分钟。 固体斜面培养基配方为在液体种 子培养基基础上添加质量体积比 1.6%的琼脂。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素 使用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯 化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115°C条件下灭菌 20分钟。 实施例 5:
链霉菌 Streptomyces sp. V-l菌体在种子培养 24小时后以体积百分比 6%接种量接入 GY转化培养基中， 菌体培养 24小时后加入 10克 /升阿魏酸， 在 30°C条件下 120转 /分钟 振荡培养。 20小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例的链霉菌
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V-1转化阿魏酸生产香兰素， 其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养： 将链霉菌 Strei^^c^sp.V-1接种固体斜面培养基上， 在 30Ό条件 下， 静置培养 24小时；
(2)制备种子培养液： 用步骤（1)所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 30Ό条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液；
(3)转化细胞培养： 使用步骤（2)所得的种子培养液， 按体积百分比 6%的接种量 接入 GY转化培养基中， 在 30Ό条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时；
(4)转化： 使用步骤 （3)所得的转化细胞培养液， 加入 10克 /升的阿魏酸， 30°C 条件下， 120转 /分钟振荡培养 20小时。
(5)香兰素浓度检测： 转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安 3380气相色 谱仪检测香兰素浓度， 最终香兰素浓度达到 5.0克 /升， 摩尔转化率为 63.8 %。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 种子培养使用的液体种子培 养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化 钠 5克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 Ό条件下灭菌 20分钟。 固体斜面培养基配方为在液体种 子培养基基础上添加质量体积比 1.6%的琼脂。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素 使用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯 化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 Ό条件下灭菌 20分钟。 实施例 6:
链霉菌 Streptomyces sp. V-l菌体在种子培养 24小时后以体积百分比 6 %接种量接入 GY转化培养基中，菌体培养 24小时后加入 15克 /升阿魏酸， 在 30°C条件下 120转 /分钟 振荡培养。 20小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例的链霉菌 Strep o yc^ sp. V-1转化阿魏酸生产香兰素， 其涉及的详细步骤如下：
( 1 )斜面培养： 将链霉菌 Stre;?to j c sp. V-l接种固体斜面培养基上， 在 30Ό条件 下， 静置培养 24小时；
(2 )制备种子培养液： 用步骤（1 )所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 30°C条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液；
( 3 )转化细胞培养： 使用步骤（2)所得的种子培养液， 按体积百分比 6 %的接种量 接入 GY转化培养基中， 在 30°C条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时；
(4)转化： 使用步骤 （3 ) 所得的转化细胞培养液， 加入 15克 /升的阿魏酸， 3(TC 条件下， 120转 /分钟振荡培养 20小时。
( 5 )香兰素浓度检测： 转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安 3380气相色 谱仪检测香兰素浓度， 最终香兰素浓度达到 6.5克 /升， 摩尔转化率为 55.3 %。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 种子培养使用的液体种子培 养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化 钠 5克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 Ό条件下灭菌 20分钟。 固体斜面培养基配方为在液体种 子培养基基础上添加质量体积比 1.6 %的琼脂。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素 使用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯 化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 Ό条件下灭菌 20分钟。 实施例 7：
链霉菌 Streptomyces sp. V-l菌体在种子培养 24小时后以体积百分比 6%接种量接入 GY转化培养基中，菌体培养 24小时后加入 10克 /升阿魏酸， 在 30Ό条件下 120转 /分钟 振荡培养。 17小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例的链霉菌
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sp. V-1转化阿魏酸生产香兰素， 其涉及的详细步骤如下： ( 1 )斜面培养： 将链霉菌 Streptomyces sp. V-l接种固体斜面培养基上， 在 30°C条件 下， 静置培养 24小时； W 200
(2 )制备种子培养液： 用步骤（1 )所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 30°C条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液；
(3 )转化细胞培养： 使用步骤（2 )所得的种子培养液， 按体积百分比 6 %的接种量 接入 GY转化培养基中， 在 3(TC条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时；
(4)转化： 使用步骤 （3 )所得的转化细胞培养液， 加入 10克 /升的阿魏酸， 30Ό 条件下， 120转 /分钟振荡培养 17小时。
( 5 ) 香兰素浓度检测： 转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安 3380气相色 谱仪检测香兰素浓度， 最终香兰素浓度达到 5.75克 /升， 摩尔转化率为 73.4%。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 种子培养使用的液体种子培 养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化 钠 5克 /升， 调节 PH至 7.2。 115 °C条件下灭菌 20分钟。 固体斜面培养基配方为在液体种 子培养基基础上添加质量体积比 1.6 %的琼脂。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素 使用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯 化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 Ό条件下灭菌 20分钟。 实施例 8：
链霉菌 Streptomyces sp. V-l菌体在种子培养 24小时后以体积百分比 6%接种量接入 GY转化培养基中， 菌体培养 24小时后加入 10克 /升阿魏酸， 在 30°C条件下 120转 /分钟 振荡培养。 15小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例的链霉菌 Strepto yces sp. V-Ι转化阿魏酸生产香兰素， 其涉及的详细步骤如下：
( 1 )斜面培养： 将链霉菌 Streptomj^ s sp. V-l接种固体斜面培养基上， 在 30Ό条件 下， 静置培养 24小时；
(2 )制备种子培养液： 用步骤（1 )所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 30Ό条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液；
(3 )转化细胞培养： 使用步骤（2)所得的种子培养液， 按体积百分比 6%的接种量 接入 GY转化培养基中， 在 30°C条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时；
(4 )转化： 使用步骤 （3 )所得的转化细胞培养液， 加入 10克 /升的阿魏酸， 30Ό 条件下， 120转 /分钟振荡培养 15小时。
( 5 )香兰素浓度检测： 转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安 3380气相色 谱仪检测香兰素浓度， 最终香兰素浓度达到 4.6克 /升， 摩尔转化率为 58.7%。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 种子培养使用的液体种子培 养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化 钠 5克 /升， 调节 pH至 7.2。 115°C条件下灭菌 20分钟。 固体斜面培养基配方为在液体种 子培养基基础上添加质量体积比 1.6 %的琼脂。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素 使用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯 化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115Ό条件下灭菌 20分钟。 链霉菌 Streptomyces sp. V-l菌体在种子培养 24小时后以体积百分比 6%接种量接入 GY转化培养基中，菌体培养 24小时后加入 10克 /升阿魏酸，在 30°C条件下 120转 /分钟振 荡培养 12小时后补加 5%大孔吸附树脂 DM11 (湿重 /体积）， 当阿魏酸浓度低于 2克 /升 时以每次 5克 /升的速率补加阿魏酸至终浓度为 45克 /升。 55小时后取样测定香兰素浓度。 本实施例的链霉菌 Streptomyces sp. V-l转化阿魏酸生产香兰素， 其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养： 将链霉菌 SfreptiW^c sp.V-l接种固体斜面培养基上， 在 30Ό条件 下， 静置培养 24小时；
(2)制备种子培养液： 用步骤（1)所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 30Ό条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液；
, (3)转化细胞培养： 使用步骤（2)所得的种子培养液， 按体积百分比 6%的接种量 接入 GY转化培养基中， 在 30°C条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时；
(4)转化： 使用步骤（3)所得的转化细胞培养液， 加入 10克 /升的阿魏酸， 30°C 条件下， 120转 /分钟振荡培养 12小时， 补加 5% (湿重 /体积）大孔吸附树脂 DM11, 当 阿魏酸浓度低于 2克 /升时以每次 5克 /升的速率补加阿魏酸至终浓度为 45克 /升。
(5) 香兰素浓度检测： 转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安 3380气相色 谱仪检测香兰素浓度， ,终香兰素浓度达到 16.5克 /升， 摩尔转化率为 46.8%。
在上述利用该链霉 转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 种子培养使用的液体种子培 养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化 钠 5克 /升， 调节 pH至 7.2。 115Ό条件下灭菌 20分钟。 固体斜面培养基配方为在液体种 子培养基基础上添加质量体积比 1.6%的琼脂。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素 使用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯 化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115°C条件下灭菌 20分钟。 实施例 10：
链霉菌 Streptomyces sp. V-l菌体在种子培养 24小时后以体积百分比 6%接种量接入 GY转化培养基中，菌体培养 24小时后加入 10克 /升阿魏酸，在 30°C条件下 120转 /分钟振 荡培养 12小时后补加 8% (湿重 /体积） 大孔吸附树脂 DM11,当阿魏酸浓度低于 2克 /升 时以每次 5克 /升的速率补加阿魏酸至终浓度为 45克 /升。 55小时后取样测定香兰素浓度。 本实施例的链霉菌 Str^to yc^sp. V-1转化阿魏酸生产香兰素， 其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养： 将链霉菌 St ^to^c^sp.V-l接种固体斜面培养基上， 在 30Ό条件 下， 静置培养 24小时；
(2)制备种子培养液： 用步骤（1)所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 30Ό条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液；
(3)转化细胞培养： 使用步骤（2)所得的种子培养液， 按体积百分比 6%的接种量 接入 GY转化培养基中， 在 30Ό条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时；
(4)转化： 使用步骤 （3)所得的转化细胞培养液， 加入 10克 /升的阿魏酸， 30Ό 条件下， 120转 /分钟振荡培养 12小时后补加 8% (湿重 /体积）大孔吸附树脂 DM11, 当 阿魏酸浓度低于 2克 /升时以每次 5克 /升的速率补加阿魏酸至终浓度为 45克 /升。
( 5 ) 香兰素浓度检测： 转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安 3380气相色 谱仪检测香兰素浓度， 最终香兰素浓度达到 19.2克 /升， 摩尔转化率为 54.5 %。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 种子培养使用的液体种子培 养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化 钠 5克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 °C条件下灭菌 20分钟。 固体斜面培养基配方为在液体种 子培养基基础上添加质量体积比 1.6%的琼脂。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素 使用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯 化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 °C条件下灭菌 20分钟。 实施例 11:
链霉菌 Streptomyces sp. V-l菌体在种子培养 24小时后以体积百分比 6 %接种量接入 GY转化培养基中，菌体培养 24小时后加入 10克 /升阿魏酸,在 3(TC条件下 120转 /分钟振 荡培养 12小时后补加 10% (湿重 /体积）大孔吸附树脂 DM11,当阿魏酸浓度低于 2克 /升 时以每次 5克 /升的速率补加阿魏酸至终浓度为 45克 /升。 55小时后取样测定香兰素浓度。 本实施例的链霉菌
Figure imgf000011_0001
sp. V-l转化阿魏酸生产香兰素， 其涉及的详细步骤如下：
( 1 )斜面培养： 将链霉菌 Streptomyces sp. V-l接种固体斜面培养基上， 在 30°C条件 下， 静置培养 24小时；
(2 )制备种子培养液： 用步骤（1 )所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 30Ό条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液；
(3 )转化细胞培养： 使用步骤（2 )所得的种子培养液， 按体积百分比 6 %的接种量 接入 GY转化培养基中， 在 30°C条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时；
(4) 转化： 使用步骤 （3 )所得的转化细胞培养液， 加入 10克 /升的阿魏酸， 30°C 条件下， 120转 /分钟振荡培养 12小时后补加 10% (湿重 /体积）大孔吸附树脂 DM11 , 当阿魏酸浓度低于 2克 /升时以每次 5克 /升的速率补加阿魏酸至终浓度为 45克 /升。
( 5 ) 香兰素浓度检测： 转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安 3380气相色 谱仪检测香兰素浓度， 最终香兰素浓度达到 17.5克 /升， 摩尔转化率为 49.6%。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 种子培养使用的液体种子培 养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽汁 10克 /升， 氯化 钠 5克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 °C条件下灭菌 20分钟。 固体斜面培养基配方为在液体种 子培养基基础上添加质量体积比 1.6%的琼脂。
在上述利用该链霉菌转化阿魏酸生产香兰素的方法中， 菌株转化阿魏酸生产香兰素 使用的 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 /升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯 化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。 115°C条件下灭菌 20分钟。 申请人或代理人档案号 PCNAP070852
国际申请号 PCT/C 2007 / 0 0 1 9 7 6 关于微生物保藏的说明
(细则 13之二）
A.对说明书第 一页 ， 第 ^rliL行所述的已保藏的微生物或其他生物材料的说明
B.保藏事项 更多的保藏在附加页说明 □ 保藏单位名称 中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址
(包括邮政编码和国名）
中国 武汉武汉大学 中国典型培养物保藏中心
邮编： 430072 保藏日期 2006年 7月 12日 保藏号 CCTCC NO: M 206065
C.补充说明 （必要时） · 更多信息在附加页中 □
D.本说明是为下列指定国作的 （如果说明不是为所有指定国而作的)
E.补充说明 （必要时)
下列说明将随后向国际局提供 （写出说明的类别， 例如： "保藏的编号")
Figure imgf000012_0001

Claims

权 利 要 求 书
1. 一株链霉菌 iStreptomyces sp. V-l ), 该菌株名为 S/re tow^ces sp. V-l， 于 2006年 7月 12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 206065， 其特征是： 气 生菌丝亮黄色、基内菌丝浅黄色，基内菌丝无横隔、不断裂，孢子椭圆形、表面光滑， 可利用葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖， 不能液化明胶， 不产硫化氢， 该菌株的 16S rDNA 序列与多株链霉菌的 16S rDNA序列相似性达到 97〜98 %。
2. 如权利要求 1所述的链霉菌 Streptomyces sp. V-l， 其培养步骤为：
( 1 )斜面培养： 将
Figure imgf000013_0001
sp. V-l接种固体斜面培养基上或使用液体种子培养 基， 在 30°C条件下，，静置培养 24小时；
(2 )制备种子培养液： 用步骤（1 ) 所得的斜面培养物， 接种到液体种子培养基中， 在 30°C条件下， 120转 /分钟振荡培养 24小时， 制得种子培养液。
3. 如权利要求 2所述的链霉菌 S/r^tcw^c sp. V-l , 其特征在于所述种子培养使用的 液体种子培养基配方为： 葡萄糖 10克 /升， 酵母粉 5克 /升， 蛋白胨 10克 /升， 麦芽 汁 10'克 /升， 氯化钠 5克 /升， 调节 pH至 7.2。 115 Ό条件下灭菌 20分钟， 固体斜面 培养基配方为在液体种子培养基基础上添加质量体积比 1.6 %的琼脂。
4. 利用如权利要求 1或 2所述的链霉菌 Streptomyces sp. V-l生物转化阿魏酸生产香兰 素的方法， 其特征在于： 用所述 &repto _y ^ sp. V-l菌株以 GY转化培养基生产香 兰素， 其步骤为：
( 1 )转化细胞培养： 使用上述权利要求 2的步骤所得的种子培养液，按体积百分比 6%的接种量接入 GY转化培养基中， 在 30Ό条件下， 120转 /分钟振荡培养 10〜30 小时；
(2 )转化： 使用上步所得的转化细胞培养液， 加入 5〜15克 /升的阿魏酸， 30°C条件 下， 120转 /分钟振荡培养 12〜24小时，
5. 如权利要求 4所述的利用链霉菌 Streptomyces sp. V-l生物转化阿魏酸生产香兰素的 方法， 其特征在于： 其中步骤（2 )在补加高浓度阿魏酸连续培养过程中， 振荡培养 12小时后加入 2 %〜12 % (湿重 /体积）大孔吸附树脂 DM11。
6. 如权利要求 4所述的利用链霉菌 Streptomyces sp. V-l生物转化阿魏酸生产香兰素的 方法， 其特征在于： 其中步骤（2 ) 当所加入的阿魏酸浓度低于 2克 /升时以每次 5 克 /升的速率补加阿魏酸至终浓度为 45克 /升， 120转 /分钟振荡培养至 55小时。
7. 如权利要求 4所述的利用链霉菌 Streptomyces sp. V-l生物转化阿魏酸生产香兰素的 方法， 其特征在于： 所述 GY转化培养基配方为： 葡萄糖 15克 /升， 酵母粉 8克 / 升， 硫酸镁 0.8克 /升， 氯化钠 2克 /升， 调节 pH至 7.2。
8. 如权利要求 4所述的利用链霉菌 Streptomyces sp. V-l生物转化阿魏酸生产香兰素的 方法 其特征 于： 用所述
Figure imgf000013_0002
sp. V-l 5菌株以 GY转化培养基生产香兰 素， 在补加高浓度阿魏酸连续培养过程中加入 5〜10% (湿重 /体积）大孔吸附树脂 DMU 'P
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