WO2008032535A1 - Microparticule semi-conductrice fluorescente, procédé de production de cette microparticule, agent de marquage fluorescent pour substances biologiques comportant cette microparticule, et procédé de bio-imagerie faisant intervenir cette microparticule - Google Patents

Microparticule semi-conductrice fluorescente, procédé de production de cette microparticule, agent de marquage fluorescent pour substances biologiques comportant cette microparticule, et procédé de bio-imagerie faisant intervenir cette microparticule Download PDF

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Kazuya Tsukada
Kazuyoshi Goan
Naoko Furusawa
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Definitions

  • Fluorescent semiconductor fine particles method for producing the same, fluorescent labeling agent for biological material using the same, and bioimaging method using the same
  • the present invention relates to a fluorescent semiconductor fine particle, a production method thereof, a biological substance fluorescent labeling agent using the same, and a bioimaging method using the same.
  • the present invention relates to fluorescent semiconductor fine particles that are stable in dispersion and have a good particle size distribution, and a method for producing the same. Furthermore, the present invention relates to a biological material fluorescent labeling agent effective for kinetic imaging in the field of biological analysis and immunological analysis for analyzing cell dynamics and a bioimaging method using the same.
  • a large amount of dispersant is attached to improve dispersion, and the shell and particles are enlarged to hinder the dynamics of target molecules, and when precipitated and aggregated, coarse particles increase and the particle size distribution deteriorates. It has been pointed out that there is a problem in that the accuracy is not uniform and the accuracy is greatly reduced.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-329686
  • Patent Document 2 JP-A-2005-172429
  • Patent Document 3 Japanese Translation of Special Publication 2003-524147
  • the present invention has been made in view of the above problems, and the problem to be solved is a fluorescent semiconductor fine particle that realizes dynamic imaging properties with high detection accuracy, a method for producing the same, and a fluorescent substance fluorescent label using the same And providing a bioimaging method.
  • Fluorescent semiconductor fine particles having a core / shell structure composed of core particles composed of semiconductor fine particles and a shell layer covering the core particles, wherein the chemical composition of the core particles and the shell layer is the same.
  • the average particle size of the core particles is 1 to 15 nm
  • the specific gravity is 1.0 to 3.0
  • the specific gravity of the fluorescent semiconductor fine particles having the core / shell structure is 0.8 to 3.2.
  • Fluorescent semiconductor fine particles characterized in that.
  • the specific gravity of the shell layer is adjusted by the volume ratio of the core particle to the shell layer so that the specific gravity of the fluorescent semiconductor fine particles having the core / shell structure is 0.8 to 3.2. 2.
  • Fluorescent semiconductor fine particles characterized by being 15 nm.
  • a surface-modified compound having a functional group that binds to a biological substance and a functional group that binds to the surface of the fluorescent semiconductor fine particles on the surface of the fluorescent semiconductor fine particles according to any one of 1 to 4 above A biological material fluorescent labeling agent characterized by comprising:
  • a bioimaging method characterized by performing fluorescence dynamic imaging using the biological material fluorescent labeling agent according to any one of 6 to 8.
  • fluorescent semiconductor fine particles that achieve stable kinetic imaging with stable dispersion, good particle size distribution, and high detection accuracy, a method for producing the same, a biological material using the same, a fluorescent labeling agent, and a bio An imaging method can be provided.
  • the present invention can provide a highly sensitive and accurate measurement method particularly in the field of single-molecule imaging research.
  • the fluorescent semiconductor fine particles of the present invention are fluorescent semiconductor fine particles having a core / shell structure composed of core particles made of semiconductor fine particles and a shell layer covering the core particles, and the chemical composition of the core particles and the shell layer is Unlikely, the average particle diameter of the core particles is 1 to 15 nm, the specific gravity is 1.0 to 3.0, and the specific gravity of the fluorescent semiconductor particles having the core / shell structure is 0.8 to 3 It is characterized by two. In addition, the specific gravity of the shell layer is adjusted by the volume ratio of the core particles and the shell layer so that the specific gravity of the fluorescent semiconductor fine particles having the core / shell structure is 0.8 to 3.2. To do.
  • the “specific gravity” refers to a mass ratio with respect to water at 4 ° C. in the same volume that is generally expressed.
  • the specific gravity of the core particles according to the present invention needs to be 1.0 to 3.0 as described above, and is preferably 1.0 to 2.5.
  • the average particle diameter of the fluorescent semiconductor fine particles of the present invention is 3 to 15 nm, more preferably 3 to! Onm.
  • the particle size of the biomarker to be described later is preferably 1 to 20 nm in order to achieve the effect of the shell. Therefore, the average particle size of the fluorescent semiconductor fine particles of the present invention is 1 to; Is particularly preferred.
  • the "average particle diameter” is the cumulative 50% volume particle diameter measured by the laser scattering method!
  • the thickness of the shell layer or the detection method of the core / shell structure fluorescent semiconductor fine particles can also be obtained by observing TEM (transmission microscope) and comparing the core particles with the core / shell structure particles. However, it can also be determined by measuring each particle size.
  • the core particle according to the present invention is a component that forms the core part of the fluorescent semiconductor fine particle having the core / shell structure of the present invention, and is composed of a semiconductor material that can satisfy the above specific gravity condition. Cost. If necessary, dope materials such as Ga A trace amount may be contained.
  • various semiconductor materials can be used in the usage method satisfying the specific gravity condition according to the present invention.
  • Specific examples include, for example, MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, GaAs, GaP, GaSb, InGaAs
  • Examples include InP, InN, InSb, InAs, AlAs, A1P, AlSb, A1S, PbS, PbSe, Ge, Si, or a mixture thereof.
  • a particularly preferable semiconductor material is Si.
  • the average particle size of the core according to the present invention needs to be 1 to 15 nm in order to achieve the effect of the invention.
  • the average particle size by setting the average particle size to !! to lOnm, it is possible to label and detect biomolecules with a small particle size. Furthermore, if it is from! It becomes. Therefore, 1 to 10 nm is more preferable, and particularly preferable is! To 5 nm.
  • the "average particle diameter" of the core according to the present invention is an accumulated value measured by a laser scattering method.
  • the shell layer according to the present invention is a layer that covers the core particles in the fluorescent semiconductor fine particles of the present invention, and is a constituent layer for forming a core / shell structure. It needs to be composed of materials.
  • the shell layer according to the present invention may not completely cover the entire surface of the core particle as long as the core particle is not partially exposed to cause a harmful effect.
  • the semiconductor material used for the shell various semiconductor materials can be used in the usage method satisfying the specific gravity condition according to the present invention.
  • Specific examples include, for example, ZnO, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdO, CdS, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, GaS, GaN, GaP, GaAs, GaSb, In As, InN, InP, InSb, AlAs, A1N A1P, AlSb, or a mixture thereof.
  • the preferred material for the shell includes a semiconducting material having a band gap energy higher than that of the semiconducting nanocrystal core.
  • a suitable material for the shell should have good conductivity and valence band offset for the core semiconducting nanocrystal It is.
  • the conduction band is desirably higher than the conduction band of the core semiconducting nanocrystal and the valence band is desirably lower than the valence band of the core semiconducting nanocrystal.
  • Materials with band gap energy in the ultraviolet region for semiconducting nanocrystal cores that emit energy in the visible (eg Si, Ge, GaP) or in the near infrared (eg InP, InN, PbS, PbSe) Can be used. Specific examples include, for example, ZnS, GaN, and magnesium chalcogenide (for example, MgS, MgSe, and MgTe).
  • Materials that are visible and have bandgap energy can also be used for semiconducting nanocrystal cores that emit in the near infrared.
  • the present invention is particularly preferred! /, And semiconductor materials are SiO and ZnS.
  • the production method of the liquid phase method includes a precipitation method such as a coprecipitation method, a sol-gel method, a uniform precipitation method, and a reduction method.
  • a precipitation method such as a coprecipitation method, a sol-gel method, a uniform precipitation method, and a reduction method.
  • the reverse Michel method, the supercritical hydrothermal synthesis method, and the like are also excellent methods for producing nanoparticles (for example, JP-A-2002-322468, JP-A-2005-239775, JP-A-10-310770). No., JP 2000-104058, etc.).
  • the manufacturing method of the vapor phase method includes (1) a second high temperature generated by electrodeless discharge in a reduced-pressure atmosphere by evaporating the opposing raw material semiconductor by the first high-temperature plasma generated between the electrodes.
  • the laser abrasion method for example, see JP-A-2004-356163.
  • a method of synthesizing a powder containing particles by reacting a raw material gas in a gas phase in a low pressure state is also preferably used. It is.
  • a production method by a liquid phase method is particularly preferable. That is, in the present invention, since it is necessary to select a composition in which the core and shell of the fluorescent semiconductor fine particles have the above specific gravity, in the case of the liquid phase method, there is almost no particle sedimentation in the dispersion after particle formation. This is because the particle size distribution is narrow due to the good dispersion, which makes it easy to form particles along the target particle size.
  • the fluorescent semiconductor fine particles of the present invention As a labeling agent for living organisms, it is necessary to modify the surface of the fluorescent semiconductor fine particles with a surface modifying compound.
  • the surface modifying compound is preferably a compound having at least one functional group and at least one group bonded to the fluorescent semiconductor fine particles.
  • the latter is a group that can be adsorbed to hydrophobic fluorescent semiconductor particles, and the other is a functional group that has affinity for biological substances and binds to biomolecules.
  • the surface modification compounds of each other may use various linkers that connect each other.
  • the group bonded to the fluorescent semiconductor fine particles may be a functional group bonded to the semiconductor material for forming the shell layer or the core particle. Therefore, it is preferable to select a functional group according to the composition of the shell layer or the core particle.
  • the functional group is particularly preferably a thiol group.
  • Examples of the functional group that binds affinity to a biological substance include a carboxyl group, an amino group, a phosphonic acid group, and a sulfonic acid group.
  • biological material refers to cells, DNA, RNA, oligonucleotides, proteins, antibodies, antigens, endoplasmic reticulums, nuclei, Golgi bodies, and the like.
  • the shell can be formed by bonding mercapto groups to the particles by adjusting the pH to be suitable for surface modification.
  • Each of the other ends is introduced with an aldehyde group, an amino group, or a carboxyl group, and can bond a peptide to the amino group or carboxyl group of a living body.
  • an amino group, an aldehyde group, or a carboxyl group is introduced into DNA, oligonucleotide, etc., the same bonded shell can be formed.
  • the fluorescent semiconductor fine particles of the present invention can be applied to a biological material fluorescent labeling agent based on the reasons described below.
  • the biological material fluorescent labeling agent according to the present invention by adding the biological material fluorescent labeling agent according to the present invention to a living cell or living body having a target (tracking) substance, it binds or adsorbs to the target substance, and excitation light having a predetermined wavelength is emitted to the conjugate or adsorbent.
  • excitation light having a predetermined wavelength is emitted to the conjugate or adsorbent.
  • detecting fluorescence of a predetermined wavelength generated from the fluorescent semiconductor fine particles in accordance with the excitation light it is possible to perform fluorescence dynamic imaging of the target (tracking) substance. That is, the biological material fluorescent labeling agent according to the present invention can be used for bioimaging methods (technical means for visualizing biomolecules constituting biological materials and their dynamic phenomena).
  • the surface-modified fluorescent semiconductor fine particles according to the present invention (hereinafter also referred to as "surface-modified semiconductor fine particles") become a friendly molecule that acts as the first member of the binding pair by the functional group of the surface-modifying compound. Can be combined.
  • ionizable groups present in the hydrophilic structural portion of the surface modifying compound can provide a means for binding to an affinity molecule.
  • a “conjugate” with such surface-modified semiconductor microparticles by affinity molecules is the presence and / or amount of biological materials and biological compounds, biological systems, biological processes. It can be used to detect interactions in, changes in biological processes or changes in the structure of biological compounds. That is, when bound to a surface-modified semiconductor microparticle, the affinity molecule interacts with a biological target that acts as the second member of the binding pair to detect a biological process or response, or biological It can change the molecule or process.
  • the interaction between the affinity molecule and the biological target involves specific binding and is a covalent, non-covalent, hydrophobic, hydrophilic, van der Waals or magnetic interaction. Can be accompanied by action.
  • affinity molecules can physically interact with biological targets.
  • Affinity molecules that bind to surface-modified semiconductor microparticles can be naturally occurring or chemically synthesized and may have the desired physical, chemical or biological properties. Can be selected.
  • Such properties include proteins, nucleic acids, signaling molecules, prokaryotic or eukaryotic cells, viruses, intracellular organelles, and any other biological compounds and covalent bonds. However, it is not limited to these.
  • Other properties of such molecules include biological processes (eg, cell cycle, blood coagulation, cell death, transcription, translation, signal transduction, DNA damage or DNA cleavage, radical generation, radical removal, etc. ) And the ability to affect the structure of biological compounds (eg, cross-linking, proteolytic cleavage, radical damage, etc.), but not limited to these.
  • biological processes eg, cell cycle, blood coagulation, cell death, transcription, translation, signal transduction, DNA damage or DNA cleavage, radical generation, radical removal, etc.
  • the ability to affect the structure of biological compounds eg, cross-linking, proteolytic cleavage, radical damage, etc.
  • the surface-modified semiconductor particle conjugate comprises semiconductor particles that emit light at a tunable wavelength and are bound to a nucleic acid.
  • the binding can be direct or indirect.
  • the nucleic acid can be any ribonucleic acid, deoxyribonucleic acid, dideoxy ribonucleic acid or any derivative and combinations thereof.
  • the nucleic acid can also be an oligonucleotide of any length. This oligonucleotide is a single-stranded, double-stranded, triple-stranded or higher configuration (eg, holiday binding, circular single-stranded DNA, circular double-stranded DNA, DNA cube (Seeman (1998) Ann. Rev Biophys. Biomol. Struct. 27: 225248))).
  • a particularly preferred use mode of the semiconductor fine particle conjugate according to the present invention is detection and / or quantification of nucleic acid as follows: (a) viral nucleic acid; (b) bacterial nucleic acid; and (c) Many human sequences (eg single-stranded nucleotide polymorphisms).
  • the fluorescent semiconductor particulate conjugate is a fluorescent that binds to individual nucleotides, deoxynucleotides, dideoxynucleotides or any derivative and combinations thereof. It can contain photosemiconductor microparticles and is used in DNA polymerization reactions (eg, DNA sequencing, reverse transcription of RNA into DNA and polymerase chain reaction (PCR)).
  • Nucleotides also include monophosphates, diphosphates and triphosphates and cyclic derivatives such as cyclic adenine monophosphate (cAMP).
  • cAMP cyclic adenine monophosphate
  • fluorescent semiconductor fine particles bonded to nucleic acid includes fluorescent in situ hybridization (FISH).
  • FISH fluorescent in situ hybridization
  • the fluorescent semiconductor microparticles are bound to an oligonucleotide designed to hybridize to a specific sequence in vivo.
  • fluorescent semiconductor particulate tags are used to visualize the location of desired DNA sequences in cells. For example, the subcellular localization of a gene whose DNA sequence is partially or completely known can be determined using FISH.
  • RNA Any DNA or RNA whose sequence is partially or fully known can be visually labeled using FISH.
  • FISH fluorescent in situ hybridization
  • messenger RNA mRNA
  • DNA telomers other highly repetitive DNA sequences and other encoded! /, NA! /, DNA sequences are targeted by FISH Can be done.
  • Fluorescent semiconductor particulate conjugates also include biological compounds (eg, enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, intracellular organelles, lipids, phospholipids, fatty acids, sterols, cell membranes, signaling molecules, receptors and ions. Including surface-modified fluorescent semiconductor microparticles as provided herein in combination with molecules or reagents for the detection of (channel).
  • biological compounds eg, enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, intracellular organelles, lipids, phospholipids, fatty acids, sterols, cell membranes, signaling molecules, receptors and ions.
  • the conjugate also has cell morphology and fluid flow; cell viability, proliferation and function; endocytosis and exocytosis (Betz et al. (1996) Curr. Opin. Neurobiol. 6 (3): 365-71); and reactive oxygen species (eg, superoxide, nitrogen monoxide, hydroxy radicals, oxygen radicals). Furthermore, the conjugate can be used to detect hydrophobic or hydrophilic regions of biological systems.
  • Bio material fluorescent labeling agents also find utility in many other biological and non-biological applications, where luminescent markers, particularly fluorescent markers, have been identified. Typically used. For example, Haugland, RP Handbook of Fl uorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, OR. No. 6 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 996; Website, www. probes, com.)
  • Examples of useful areas of the biological material fluorescent labeling agent according to the present invention include fluorescent immunocytochemistry, fluorescence microscopy, DNA sequence analysis, fluorescence in situ hybridization (FISH), fluorescence resonance energy Forces include, but are not limited to, transfer (FRET), flow cytometry (fluorescence activated shell sorter; FACS) and diagnostic assays for biological systems.
  • the application range of the present invention includes immunostaining using fixed cells, cell observation, real-time tracking of receptor-ligand (low molecule, drug) interaction, single molecule fluorescence imaging, and the like. Can be mentioned.
  • Si fluorescent semiconductor fine particles hereinafter also referred to as “Si semiconductor fine particles” or “Si core particles”
  • Si semiconductor fine particles Si core particles
  • plasma CVD is used.
  • SiO 2 (x-1.999) deposited on a silicon wafer is annealed for 1 hour at 1 100 ° C in an inert gas atmosphere.
  • Si semiconductor particles (crystals) are precipitated in the SiO film.
  • this silicon wafer is treated with a 1% hydrofluoric acid aqueous solution at room temperature to remove the SiO film, and several nanometer-sized Si semiconductor fine particles aggregated on the liquid surface are collected.
  • a hydrofluoric acid treatment dangling bonds (unbonded bonds) of Si atoms on the surface of the semiconductor fine particles (crystal) are terminated with hydrogen, and the Si crystal is stabilized.
  • the surface of the collected Si semiconductor fine particles is naturally oxidized in an oxygen atmosphere, or heated to thermally oxidize it.
  • the Ranaru core Around the Ranaru core to form a shell layer composed of Si_ ⁇ 2.
  • the ratio of hydrofluoric acid (46%), methanol (100%) and hydrogen peroxide (30%) is 1: 2: 2.
  • a p-type silicon wafer and platinum are used as counter electrodes and current is applied at 320 mA / cm 2 for about 1 hour to deposit Si semiconductor particles (crystals).
  • the surface of the Si semiconductor fine particles thus obtained is naturally oxidized in an oxygen atmosphere or thermally oxidized by heating to form a shell layer made of SiO around the core made of Si crystals.
  • Si core particles obtained above are dispersed in pyridine and kept at 100 ° C. Separately, Zn (C H
  • the core / shell structure thus obtained is irradiated with monochromatic light (560 nm) in a photodissolving solution to apply size selective light etching to cadmium selenide (CdSe) semiconductor fine particles inside the core / shell structure.
  • CdSe cadmium selenide
  • the mixture was kept at 8.5) at 25 ° C and stirred slowly for 30 minutes. This was centrifuged and the settled particles were collected. Elemental analysis of the obtained particles revealed InP and ZnS, and XPS analysis revealed that ZnS was coated on the surface of CdSe.
  • a carboxyl group is introduced into the fluorescent semiconductor fine particles by utilizing a bond between mercapto groups (SH groups).
  • the Si core particles described above were dispersed in 30% hydrogen peroxide water for 10 minutes to form a hydroxylated shell on the crystal surface.
  • the solvent was replaced with toluene, and mercaptopropyltriethoxysilane. 2% of toluene is added, and the SiO on the outermost surface of the Si core particles is silanized and a mercapto group is introduced over about 2 hours.
  • the solvent was replaced with pure water, a buffer salt was added, and an appropriate amount of 11 mercaptodecanoic acid having a mercapto group introduced at one end was added and stirred for 3 hours, so that Si core particles and 11 mercapto were mixed.
  • Shell combined with undecanoic acid. This is an example in which a modifying group capable of affinity binding to a living body is introduced in the present invention. This is labeled A.
  • the Si / ZnS ⁇ core / shell particles obtained above were dispersed in a buffer salt solution, an appropriate amount of 11-mercaptodecanoic acid was added, and the mixture was stirred at an appropriate temperature for 2 hours to bond mercapto groups to the particle surface. This introduces carboxyl groups on the surface. This is labeled B.
  • the fluorescence intensity of each label was evaluated using a fluorescence spectrometer FP-6500 (Nippon Spectroscopy) with 405 nm light as excitation light.
  • Label A is expressed as a relative value with reference 100, and is shown in Table 1.
  • the label obtained above was mixed with sheep serum albumin (SSA) at an equal concentration in advance and individually incorporated into Vero cells. After culturing at 37 ° C. for 2 hours, trypsinization was performed, 5% FBS-added DME M was resuspended and seeded on the same glass bottom dish. Cells cultured at 37 ° C were fixed with 4% formalin, nuclei were stained with DAPI, and fluorescence was observed with a confocal laser scanning microscope (excitation 405 nm).
  • SSA sheep serum albumin
  • the core / shell particles prepared in Example 1 were modified with avidin.
  • Si / SiO 2 core / shell particles are reacted in a 3: 1 mixture of concentrated sulfuric acid and hydrogen peroxide for about 10 minutes to form a hydroxylated shell on the crystal particle surface.
  • aminopropyltriethoxysilane is reacted with the hydroxyl group on the outermost surface of the particles in a 1: 1 mixture of water and ethanol to introduce amino groups into the particles.
  • an avidin-bound label B-2 was obtained in the same manner as Label A-2.
  • GTP-degrading enzyme Pan which is responsible for nuclear pore transport
  • GTP-degrading enzyme Pan and label were mixed and incorporated into Vero cells. After incubation at 37 ° C for 2 hours, fluorescence observation was performed with a confocal laser scanning microscope (excitation 405 nm). The state of nuclear staining was evaluated and listed in Table 2. If the observed fluorescence intensity is high and the area is large, the transfer efficiency of the labeled conjugate is high, which represents the feature of the label of the present invention. If almost no staining is observed, the specific gravity is too high, indicating that the force cannot be moved due to sedimentation or sedimentation.
  • the label according to the present invention is effective for imaging involving kinetics. That is, it can be seen that the descriptiveness of dynamic imaging of biological materials can be greatly improved.

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Description

明 細 書
蛍光半導体微粒子、その製造方法、それを用いた生体物質蛍光標識剤 及びそれを用いたバイオイメージング法
技術分野
[0001] 本発明は、蛍光半導体微粒子、その製造方法、それを用いた生体物質蛍光標識 剤及びそれを用いたバイオイメージング法に関する。
[0002] より詳しくは、分散安定であり、粒径分布の良好な蛍光半導体微粒子とその製造方 法に関する。更には、細胞の動態解析を行う生物学や免疫解析分野における動態ィ メージングに有効な生体物質蛍光標識剤及びそれを用いたバイオイメージング法に 関する。
背景技術
[0003] 近年、粒径により蛍光波長を制御可能である半導体ナノ粒子の研究が盛んに行わ れている。半導体ナノ粒子は蛍光波長の制御性、高退光性、表面修飾の自由度の 高さを有することから生体内外の蛍光マーカーとして応用され、研究されてレ、る。
[0004] 特に最近、バルタの生体認識で定性的なアツセィから、より分子レベルで動態を解 析することにより生細胞内生体分子の反応機構を掴む基礎医学的研究や、疾病の 原因となるウィルス ·細菌の生態作用、薬の生体作用を解明しょうとするバイオィメー ジングの研究が盛んであり、特に分子イメージングに代表されるように蛍光標識剤 1 分子又は数分子に対し標識される生体物質 (細胞内の核、小胞体、ゴルジ体、蛋白
、抗体、 DNA、 RNA、 ) 1分子が結合し、所定の励起光を照射することによる発光を 検知することで、これまで得られな力、つた生体情報（DNA転写 mRNA*蛋白形成に 至る動態や細胞アポトーシス動態等）が得られようになっている。この場合、標的とな る生体分子の生体内での本来の動態を追跡することが重要であり、そのため標的分 子に吸着もしくは結合する標識物質は標的の動きを阻害しないものであることが望ま れていた。また 1分子の動態追跡であるがために、従来から 1検体当りの検知する発 光量が乏しく精度に乏しいことが指摘されており、更なる精度向上も望まれていた (例 えば、特許文献；!〜 3参照）。 [0005] 更に従来生体標識に使われてきた有機色素、蛍光タンパクにおいては発光量が乏 しいことから検出性を上げる工夫 (例えば、励起光強度の増大化、焦点を絞ることに よる励起量の増加等の工夫）をしょうとした場合に速やかな退色が生じ、検出性と耐 久性のバランスがとれずにイメージングの精度が低!/、ことが指摘され、特に分子ィメ 一ジングにおレ、ては難題となって!/、た。
[0006] 一方、生体適用の標識剤とするためには水溶液に分散安定であることが必要であ り、粒径分布の良い粒子が分散したまま生体に供与されることが検出性に重要である 。従来使用されてきた半導体微粒子（CdSe、 CdTeなど）はその比重などの性質上、 溶液中に良好に分散するには多くの分散剤 (活性剤類)を表面に付着させておく必 要があり、またすぐに沈降してしまう問題があり分散液状態での合成供給に課題があ つた。分散を良好にするために分散剤を多く付着さシェルと粒子は大粒径化して標 的分子の動態を阻害し、沈降し凝集体形成すると粗大粒子が増え粒径分布も劣化 するために検出が一様でなくなり精度を著しくおとすこととなるという問題が指摘され ていた。
特許文献 1 :特開 2003— 329686号公報
特許文献 2：特開 2005— 172429号公報
特許文献 3：特表 2003— 524147号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、検出精度の 高い動態イメージング性を実現する蛍光半導体微粒子、その製造方法、それを用い た生体物質蛍光標識剤及びバイオイメージング法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明に係る上記課題は下記の手段により解決される。
[0009] 1.半導体微粒子からなるコア粒子と該コア粒子を被覆するシェル層とで構成される コア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子であって、該コア粒子とシェル層の化 学組成が相異し、該コア粒子の平均粒径が l〜15nmであり、比重が 1. 0〜3. 0で あり、かつ該コア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子の比重が 0. 8〜3. 2であ ることを特徴とする蛍光半導体微粒子。
[0010] 2.前記シェル層の比重が、前記コア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子の 比重が 0. 8〜3. 2になるように、コア粒子とシェル層の体積比により調整されることを 特徴とする前記 1に記載の蛍光半導体微粒子。
[0011] 3.前記 1又は 2に記載の蛍光半導体微粒子であって、前記コア粒子の平均粒径が
；!〜 1 Onmであり、かつコア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子の平均粒径が 3
〜； 15nmであることを特徴とする蛍光半導体微粒子。
[0012] 4.前記;!〜 3のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子であって、前記コア粒子 の平均粒径が;!〜 5nmであり、かつコア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子の 平均粒径が 3〜10nmであることを特徴とする蛍光半導体微粒子。
[0013] 5.前記;!〜 4のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子の製造方法であって、 液相法によりコア粒子又はシェル層を形成することを特徴とする蛍光半導体微粒子 の製造方法。
[0014] 6.前記 1〜4のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子の表面上に生体物質に 結合する官能基と該蛍光半導体微粒子の表面に結合する官能基をもつ表面修飾化 合物を有することを特徴とする生体物質蛍光標識剤。
[0015] 7.前記 6に記載の生体物質蛍光標識剤であって、その平均粒径が;!〜 20nmであ ることを特徴とする生体物質蛍光標識剤。
[0016] 8.前記 6又は 7に記載の生体物質蛍光標識剤であって、その平均粒径が 1〜； 10η mであることを特徴とする生体物質蛍光標識剤。
[0017] 9.前記 6〜 8のいずれか一項に記載の生体物質蛍光標識剤を用いて蛍光動態ィ メージングを行うことを特徴とするバイオイメージング法。
発明の効果
[0018] 本発明の上記手段により、分散安定で粒径分布が良好で、検出精度の高い動態ィ メージング性を実現する蛍光半導体微粒子、その製造方法、それを用いた生体物質 蛍光標識剤及びバイオイメージング法を提供することができる。
[0019] なお、本発明により、特に 1分子イメージングの研究分野において高感度高精度測 定法を提供することができる。 発明を実施するための最良の形態
[0020] 以下、本発明とその構成要素等について詳細な説明をする。
[0021] (蛍光半導体微粒子）
本発明の蛍光半導体微粒子は半導体微粒子からなるコア粒子と該コア粒子を被覆 するシェル層とで構成されるコア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子であって、 該コア粒子とシェル層の化学組成が相異し、該コア粒子の平均粒径が l〜15nmで あり、比重が 1. 0〜3. 0であり、かつ該コア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒 子の比重が 0. 8〜3. 2であることを特徴とする。また、前記シェル層の比重力 前記 コア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子の比重が 0. 8〜3. 2になるように、コ ァ粒子とシェル層の体積比により調整されることを特徴とする。
[0022] ここで、「比重」とは、一般的に表現される同じ体積での 4°Cの水に対する質量比を いう。
[0023] 本発明に係るコア粒子の比重は、上記のように 1. 0〜3. 0であることが必要であり、 好ましくは 1. 0〜2· 5である。
[0024] 本発明の本発明の蛍光半導体微粒子の平均粒径は、 3〜； 15nmが好ましぐ更に 好ましくは 3〜； !Onmである。
[0025] 後述する生体標識剤の粒径は、その効果を発現さシェルために l〜20nmであるこ とが好ましい、そのため本発明の蛍光半導体微粒子の平均粒径は 1〜； !Onmである ことが特に好ましい。
[0026] ここで、「平均粒径」とは、レーザー散乱法により測定される累積 50%体積粒径を!/ヽ
5。
[0027] なお、シェル層の厚みもしくはコア/シェル構造蛍光半導体微粒子の検出法として は TEM (透過型顕微鏡）を観察し、コア粒子とコア/シェル構造粒子を比較すること によっても求めることができるし、各々の粒径測定によっても求めることができる。
[0028] 〈コア粒子〉
本発明に係るコア粒子は、本発明のコア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子 のコア部分を形成する構成要素であるが、上記比重の条件を満たすことができる半 導体材料により構成されることを要する。なお、必要があれば Gaなどのドープ材料を 極微量含んでもよい。
[0029] コアに用いられる半導体材料としては、本発明に係る上記比重条件を満たす使用 方法において、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、 MgS、 MgSe、 MgTe、 CaS、 CaSe、 CaTe、 SrS、 SrSe、 SrTe、 BaS、 BaTe、 Zn S、 ZnSe、 ZnTe、 CdS、 CdSe、 CdTe、 GaAs、 GaP、 GaSb、 InGaAs, InP、 InN 、 InSb、 InAs、 AlAs, A1P、 AlSb、 A1S、 PbS、 PbSe、 Ge、 Si、又はこれらの混合 物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい半導体材料は、 Siである。
[0030] なお、上記の半導体材料等を用いて本発明に係る半導体ナノ粒子を形成する際に は、上記の比重につ!/、ての条件を満たすよう混合比率等を調整することが必要であ
[0031] 本発明に係るコアの平均粒径に関しては、発明の効果発現のために、 1〜； 15nmで あることを要する。なお、平均粒径を;!〜 lOnmとすることにより小粒径の生体分子の 標識及び検知が可能となり、更に、；!〜 5nmであれば、十分に生体 1分子に対する 標識並びに動態イメージングが可能となる。従って、より好ましいのは l〜10nm、特 に好ましいのは；!〜 5nmである。
[0032] なお、本発明に係るコアの「平均粒径」とは、レーザー散乱法により測定される累積
50%体積粒径をいう。
[0033] 〈シェル層〉
本発明に係るシェル層は、本発明の蛍光半導体微粒子において、上記コア粒子を 被覆する層であり、コア/シェル構造を形成するための構成層である力 上記比重の 条件を満たすことができる半導体材料により構成されることを要する。
[0034] なお、本発明に係るシェル層は、コア粒子が部分的に露出して弊害を生じない限り 、コア粒子の全表面を完全に被覆するものでなくてもよい。
[0035] シェルに用いられる半導体材料としては、本発明に係る上記比重条件を満たす使 用方法において、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば 、 ZnO、 ZnS、 ZnSe、 ZnTe、 CdO、 CdS、 CdSe、 CdTe、 MgS、 MgSe、 GaS、 Ga N、 GaP、 GaAs、 GaSb、 In As, InN, InP、 InSb、 AlAs、 A1N、 A1P、 AlSb、又は これらの混合物等が挙げられる。 [0036] なお、好まし!/、シェルの材料としては、半導性ナノ結晶コアより高!/、バンドギャップ エネルギーを有する半導性材料が挙げられる。
[0037] 半導性微粒子結晶コアより高いバンドギャップエネルギーを有することに加えて、シ エルに適切な材料は、コア半導性ナノ結晶に関して、良好な伝導性および原子価バ ンドオフセットを有するべきである。従って、伝導性バンドは、コア半導性ナノ結晶の 伝導性バンドよりも望ましくは高ぐそして原子価バンドは、コア半導性ナノ結晶の原 子価バンドよりも望ましくは低い。可視で (例えば、 Si、 Ge、 GaP、）または近赤外で（ 例えば、 InP、 InN、 PbS、 PbSe)エネルギーを放出する半導性ナノ結晶コアについ て、紫外線領域でバンドギャップエネルギーを有する材料が使用され得る。具体例と しては、例えば、 ZnS、 GaNおよびマグネシウムカルコゲニド（例えば、 MgS、 MgSe および MgTe)が挙げられる。
[0038] 近赤外で放出する半導性ナノ結晶コアにつ!/、て、可視でバンドギャップエネルギー を有する材料もまた使用され得る。
[0039] 本発明にお!/、て、特に好まし!/、半導体材料は、 SiO、 ZnSである。
[0040] 〈蛍光半導体微粒子の製造方法〉
本発明の蛍光半導体微粒子の製造については、従来公知の種々の方法を用いる こと力 Sでさる。
[0041] 液相法の製造方法としては、沈殿法である、共沈法、ゾルーゲル法、均一沈殿法、 還元法などがある。そのほかに、逆ミシェル法、超臨界水熱合成法、などもナノ粒子 を作製する上で優れた方法である（例えば、特開 2002— 322468号、特開 2005— 239775号、特開平 10— 310770号、特開 2000— 104058号公報等を参照。）。
[0042] 気相法の製造方法としては、（1)対向する原料半導体を電極間で発生させた第一 の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた 第二の高温プラズマ中に通過さシェル方法 (例えば特開平 6— 279015号公報参照 。）、（2)電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分 離-除去する方法（例えば特表 2003— 515459号公報参照。）、レーザーアブレ一 シヨン法 (例えば特開 2004— 356163号参照。）などが用いられる。また、原料ガス を低圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いら れる。
[0043] 本発明の蛍光半導体微粒子の製造方法としては、特に液相法による製造方法が 好ましい。すなわち、本発明においては、蛍光半導体微粒子のコア及びシェルが上 記比重になる組成を選択する必要があるため、液相法による場合には、粒子形成後 の分散液中の粒子沈降がほとんど無く良好に分散していることにより、粒径分布も狭 Vヽ目的粒径に沿う粒子を形成しやすレ、からである。
[0044] 〈蛍光半導体微粒子の表面修飾〉
本発明の蛍光半導体微粒子を生体適用の標識剤とするためには、当該蛍光半導 体微粒子の表面を表面修飾化合物を用いて修飾することを要する。
[0045] 表面修飾化合物としては、少なくとも 1つの官能基と少なくとも 1つの蛍光半導体微 粒子に結合する基を有する化合物であることが好ましい。後者は疎水性の蛍光半導 体微粒子に吸着できる基であり、他方は生体物質に親和性があり生体分子に結合す る官能基である。互いの表面修飾化合物は互いをつなぐ各種のリンカ一を使用して あよい。
[0046] 蛍光半導体微粒子に結合する基としては、前記のシェル層若しくはコア粒子を形 成するための半導体材料に結合する官能基であれば良い。従って、シェル層若しく はコア粒子の組成に応じて好ましレ、官能基を選択することが好ましレ、。本発明におレヽ ては、当該官能基として、特にチオール基が好ましい。
[0047] 生体物質に親和的に結合する官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、フォスフ オン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。
[0048] なお、ここで、「生体物質」とは、細胞、 DNA、 RNA、オリゴヌクレオチド、蛋白質、 抗体、抗原、小胞体、核、ゴルジ体等を指す。
[0049] 又、蛍光半導体微粒子に結合さシェル方法としては、表面修飾に適する pHに調整 することによりメルカプト基を粒子に結合さシェルことができる。それぞれ他端にはァ ルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基が導入され、生体のアミノ基、カルボキシル基と ペプチド結合することができる。また、 DNA、オリゴヌクレオチドなどにアミノ基、アル デヒド基、カルボキシル基を導入しても同様に結合さシェルことができる。
[0050] 蛍光半導体微粒子の表面修飾のための具体的調製は、例えば、 Dabbousiら（19 97)J. Phys. Chem. B101 : 9463、 Hinesら（1996)J. Phys. Chem. 100 : 468 — 471、 Pengら（1997)J. Am. Chem. Soc. 119 : 7019— 7029、及び Kunoら（1 997)J. Phys. Chem. 106 : 9869に記載されている方法に準拠して fiうことカでき
[0051] (生体物質蛍光標識剤とそれを用いるバイオイメージング法）
本発明の蛍光半導体微粒子は、以下に説明する事由に基づき、生体物質蛍光標 識剤に適応することができる。また、標的（追跡)物質を有する生細胞もしくは生体に 本発明に係る生体物質蛍光標識剤を添加することで、標的物質と結合もしくは吸着 し、該結合体もしくは吸着体に所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて 蛍光半導体微粒子から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、上記標的 (追跡)物質の蛍光動態イメージングを行うことができる。すなわち、本発明に係る生 体物質蛍光標識剤は、バイオイメージング法（生体物質を構成する生体分子やその 動的現象を可視化する技術手段）に利用することができる。
[0052] 以下、生体物質蛍光標識剤及び関連技術等について詳しく説明する。
[0053] 本発明に係る表面修飾した蛍光半導体微粒子（以下「表面修飾半導体微粒子」と もいう。）は、表面修飾化合物の官能基により、結合対の第 1のメンバーとして働く親 和性分子に結合させ得る。例えば、表面修飾化合物の親水性構造部分内に存在す るイオン化可能基は、親和性分子への結合手段を提供し得る。
[0054] なお、親和性分子に分子および分子セグメントを結合する適切な方法については、 例えば、 Hermanson、 Bioconjugate Techniques (Academic Press, NY, 19 96)に記載されている。
[0055] 親和性分子によるこのような表面修飾半導体微粒子との「結合体」は、生体物質す なわち生物学的化合物および化学的化合物の存在および/または量、生物系、生 物学的プロセスにおける相互作用、生物学的プロセスの変更あるいは生物学的化合 物の構造における変化を検出するために使用され得る。すなわち、表面修飾半導体 微粒子に結合した場合、親和性分子は、結合対の第 2のメンバーとして働く生物学 的標的と相互作用し、生物学的プロセスまたは応答を検出する力、、あるいは生物学 的分子またはプロセスを変化させ得る。 [0056] 好ましい態様としては、親和性分子および生物学的標的の相互作用は、特異的結 合を伴い、そして共有結合、非共有結合、疎水性、親水性、ファンデルワールスまた は磁性の相互作用を伴い得る。更に、親和性分子は生物学的標的と物理的に相互 作用させ得る。
[0057] 表面修飾半導体微粒子に結合する親和性分子は、天然に存在し得る力、または化 学的に合成され得、そして所望の物理学的、化学的または生物学的特性を有するこ とが選択され得る。
[0058] このような特性としては、タンパク質、核酸、シグナル伝達分子、原核生物細胞また は真核生物細胞、ウィルス、細胞内オルガネラおよび他の任意の生物学的化合物と の共有結合および非共有結合等が挙げられるが、これらに制限されない。
[0059] このような分子の他の特性としては、生物学的プロセス（例えば、細胞周期、血液凝 固、細胞死、転写、翻訳、シグナル伝達、 DNA損傷または DNA切断、ラジカル生成 、ラジカル除去など）に影響を与える能力、および生物学的化合物の構造 (例えば、 架橋、タンパク質分解切断、ラジカル損傷など)を変化さシェル能力等挙げられるが、 これらに制限されない。
[0060] 好ましい実施形態において、表面修飾半導体微粒子結合体は、調整可能な波長 で光を放射する半導体微粒子を含み、そして核酸に結合される。当該結合は、直接 的または間接的であり得る。核酸は、任意のリボ核酸、デォキシリボ核酸、ジデォキシ リボ核酸または任意の誘導体およびその組み合わせであり得る。核酸はまた、任意 の長さのオリゴヌクレオチドであり得る。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、 三本鎖またはより高位の立体配置 (例えば、ホリデー結合、環状一本鎖 DNA、環状 二本鎖 DNA、 DNA立方体（Seeman (1998)Ann. Rev. Biophys. Biomol. Str uct. 27 : 225248を参照のこと））であり得る。
[0061] 本発明に係る半導体微粒子結合体のとりわけ好ましい使用態様は、以下のような 核酸の検出および/または定量である：（a)ウィルス核酸；（b)細菌核酸；および (c) 目的の多くのヒトの配列（例えば、単鎖ヌクレオチド多型)。本発明の範囲を制限する ことなしに、蛍光半導体微粒子結合体は、個々のヌクレオチド、デォキシヌクレオチド 、ジデォキシヌクレオチドまたは任意の誘導体およびその組み合わせに結合する蛍 光半導体微粒子を含み得、そして DNA重合反応（例えば、 DNA配列決定、 DNA への RNAの逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR) )において使用される。
[0062] ヌクレオチドとしてはまた、一リン酸塩、二リン酸塩および三リン酸塩ならびに環状誘 導体 (例えば、環状アデニン一リン酸 (cAMP) )が挙げられる。
[0063] 核酸に結合した蛍光半導体微粒子の他の使用態様としては、蛍光インサイチュハ イブリダィゼーシヨン (FISH)が含まれる。この好ましい実施形態において、蛍光半導 体微粒子はインビボで特異的な配列にハイブリダィズするように設計されたオリゴヌク レオチドに結合される。ハイブリダィゼーシヨンに関して、蛍光半導体微粒子タグは、 細胞において所望の DNA配列の位置を可視化するために使用される。例えば、そ の DNA配列が部分的または完全に既知である遺伝子の細胞内局在は、 FISHを用 いて決定され得る。
[0064] その配列が部分的または完全に既知である任意の DNAまたは RNAは、 FISHを 用いて視覚的に標識され得る。例えば、本発明の範囲を制限することなしに、メッセ ンジャー RNA(mRNA)、 DNAテロメァ、他の高反復 DNA配列および他のコードさ れて!/、な!/、DNA配列が FISHにより標的化され得る。
[0065] 蛍光半導体微粒子結合体はまた、生物学的化合物（例えば、酵素、酵素基質、酵 素インヒビター、細胞内オルガネラ、脂質、リン脂質、脂肪酸、ステロール、細胞膜、 シグナル伝達に関する分子、レセプターおよびイオンチャネル）の検出のための分子 または試薬と結合して、本明細書中で提供されるような表面修飾蛍光半導体微粒子 を含む。
[0066] 当該結合体はまた、細胞形態および流体の流れ；細胞生存能力、増殖および機能 ；エンドサイト一シスおよびェキソサイト一シス（Betzら（1996) Curr. Opin. Neurob iol. 6 (3) : 365- 71)；および反応性酸素種 (例えば、スーパーォキシド、一酸化窒 素、ヒドロキシラジカル、酸素ラジカル)を検出するために使用され得る。さらに、結合 体は、生物系の疎水性領域または親水性領域を検出するために使用され得る。
[0067] 生体物質蛍光標識剤 (蛍光半導体微粒子結合体）はまた、他の多くの生物学的お よび非生物学的な用途における有用性を見い出し、ここで、発光マーカー、特に蛍 光マーカーが代表的に使用される。例えば、 Haugland, R. P. Handbook of Fl uorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes、 Eug ene、 OR.第 6}¾丄 996 ; Website, www. probes, com. )力《参考になる。
[0068] 本発明に係る生体物質蛍光標識剤が有用である領域の例としては、蛍光免疫細胞 化学、蛍光顕微鏡法、 DNA配列分析、蛍光インサイチュハイブリダィゼーシヨン (FI SH)、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET)、フローサイトメトリー（蛍光活性化シェルソ 一ター； FACS)および生物系についての診断アツセィ等が挙げられる力 これらに 制限されない。
[0069] 上記の領域におけるナノ結晶結合体の有用性に関するさらなる議論については、 Bawendiらに対する国際特許公開 WO 00/17642力 S参考になる。
[0070] 以上、上述のように、本発明の応用範囲は固定細胞を用いた免疫染色、細胞観察 やレセプター'リガンド (低分子、薬物）相互作用のリアルタイムトラッキング、 1分子蛍 光イメージングでなどが挙げられる。
実施例
[0071] 以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるも のではない。
[0072] 実施例 1
(Siコア粒子及び Si/SIO 'コア/シェル粒子の調製）
く HFエッチング法〉
熱処理した SiO (x- 1. 999)のフッ酸中溶解により Siの蛍光半導体微粒子（以下 において「Si半導体微粒子」又は「Siコア粒子」ともいう。）を製造する場合、先ず、プ ラズマ CVDによりシリコンウェハー上に成膜した SiO (x- 1. 999)を不活性ガス雰 囲気中で 1 100°C、 1時間程度ァニールを行う。これにより、 SiO膜中に Si半導体微 粒子 (結晶）が析出する。
[0073] 次に、このシリコンウェハーを室温で 1 %程度のフッ酸水溶液で処理することにより SiO膜を除去し、液面に凝集した数 nmサイズの Si半導体微粒子を回収する。なお、 このフッ酸処理により、半導体微粒子（結晶）表面の Si原子のダングリングボンド (未 結合手）が水素終端され、 Si結晶が安定化する。その後、回収した Si半導体微粒子 の表面を酸素雰囲気中で自然酸化し、又は加熱して熱酸化し、 Si半導体微粒子か らなるコアの周囲に s i〇2からなるシェル層を形成する。
[0074] 〈陽極酸化法〉
また、 p型シリコンウェハーの陽極化成により Si半導体微粒子を製造する場合、先 ず、フッ酸（46%)、メタノール（100%)及び過酸化水素水（30%)を 1 : 2 : 2の割合 で混合した溶液中で、 p型シリコンウェハー及び白金を対向電極として 320mA/cm 2で約 1時間通電し、 Si半導体微粒子（結晶）を析出さシェル。このようにして得られた Si半導体微粒子の表面を酸素雰囲気中で自然酸化し、又は加熱して熱酸化し、 Si 結晶からなるコアの周囲に SiOからなるシェル層を形成する。
[0075] (Si/ZnS .コア/シェル粒子の調製）
上記で得られた Siコア粒子をピリジン中に分散させ 100°Cに保温。別途、 Zn (C H
2 5
) と（（CH ) Si) S、P (C H )をアルゴンガス雰囲気下、超音波をかけながら pHを
2 3 3 2 4 9 3
制御しながらゆっくり混合した。
[0076] これをピリジン分散液に滴下して添加。添加後、温度を適正に制御し、 pHを一定（
25°Cにおいて 8. 5)に保ちゆっくり 30分攪拌した。これの遠心分離を行い沈降した 粒子を捕集した。得た粒子の元素分析を行ってみたところ Siと ZnSが確認され、 XP
S分析により ZnSが Siの表面に被覆していることがわかった。
[0077] (比較粒子形成 1： CdSe/SiO 'コア/シェル粒子の調製） スコに入れ、アルゴンで系内を満たした後、所定の温度（150〜250°C)まで加熱し た。この溶液に、 25mg/cm3の濃度となるようにセレンを溶解させたトリ n—オタチル フォスフィン溶液 1. 44cm3を、激しく撹拌しながら素早く注入し、さらに 1時間撹拌す ることにより TOPO安定化 CdSe (以下、「TOPO/CdSe」と呼ぶ。）を得た。 200°C 及び 150°Cで TOPO/CdSeを合成した場合、 CdSe半導体微粒子の吸収スぺタト ルの立ち上がり波長は、それぞれ、 650nmと 610nmであり、その平均粒径は、それ ぞれ 5. 5nmと 4. 5nmであった。この TOPO/CdSe粉末を用いて、 3—メノレカプト プロピルトリメトキシシランで CdSe半導体微粒子表面を修飾しさらに加水分解するこ とにより粒子表面にシリカ薄膜を形成させ CdSe 'コア/シリカ ·シェル構造体（以下、 「CdSe/SiO」と呼ぶ。）を得た。 [0078] 得られたコア/シェル構造体を光溶解液中で単色光（560nm)を照射することで、 コア/シェル構造体内部のセレン化カドミウム（CdSe)半導体微粒子にサイズ選択光 エッチングを適用し、セレン化カドミウム（CdSe)半導体微粒子の粒径を約 3. 5nmに まで減少させた、コア/シェル構造体からなる蛍光半導体微粒子を得た。
[0079] (比較粒子形成 2： CdSe/ZnS 'コア/シェル粒子の調製） スコに入れ、アルゴンで系内を満たした後、所定の温度（150〜250°C)まで加熱し た。この溶液に、 25mg/cm3の濃度となるようにセレンを溶解させたトリ n—オタチル フォスフィン溶液 1. 44cm3を、激しく撹拌しながら素早く注入し、さらに 1時間撹拌す ることにより TOPO安定化 CdSe (以下、「TOPO/CdSe」と呼ぶ。）を得た。
[0080] 上記で得られた CdSeコア粒子をピリジン中に分散させ 100°Cに保温。別途、 Zn (C
H )と（（CH ) Si) S、 P (C H )をアルゴンガス雰囲気下、ゆっくり混合した。
[0081] これをピリジン分散液に滴下して添加。添加後、温度を適正に制御し、 pHを一定（
25°Cにおいて 8. 5)に保ちゆっくり 30分攪拌した。これの遠心分離を行い沈降した 粒子を捕集した。得た粒子の元素分析を行ってみたところ InPと ZnSが確認され、 X PS分析により ZnSが CdSeの表面に被覆していることがわかった。
[0082] 以上のように製造されたコア及びコアシェル粒子の粒径をシスメッタス社製：ゼータ サイザ一 ZSで測定し、比重をメトラー社製： SGM— 6で測定し、結果を表 1に示した
〇
[0083] (修飾官能基の導入）
上記蛍光半導体微粒子により生体物質を標識する場合、当該粒子と生体物質のど ちらかもしくは双方に、互いに結合する官能基等を導入する必要があるが、下記のよ うに fiつた。
[0084] く Si/SiO 'コア/シェル粒子への修飾官能基の導入〉
メルカプト基（SH基）同士の結合を利用して蛍光半導体微粒子にカルボキシル基 を導入する。
[0085] 先ず、上記の Siコア粒子を 30%過酸化水素水中に 10分間分散させ、結晶表面を 水酸化さシェル。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシラ ンをトルエンの 2%加えて、 2時間程度かけて Siコア粒子の最表面の SiOをシラン化 すると共にメルカプト基を導入する。続いて、溶剤を純水に置換してバッファ塩を添 加し、さらに一端にメルカプト基の導入された 11 メルカプトゥンデカン酸を適量カロ えて 3時間攪拌することで、 Siコア粒子と 11 メルカプトゥンデカン酸とを結合さシェ ル。これは、本発明においては生体に対し親和結合する修飾基を導入した例である 。これを標識 Aとする。
[0086] く Si/ZnS ·コアシェル粒子への修飾官能基の導入〉
上記で得た Si/ZnS ·コア/シェル粒子をバッファ塩溶液に分散して、 11—メルカ プトゥンデカン酸を適量加えて適温で 2時間攪拌し、粒子表面にメルカプト基を結合 させた。これにより表面にカルボキシル基が導入される。これを標識 Bとする。
[0087] (CdSe/SiO 'コア/シェル粒子への修飾官能基の導入〉
標識 Aと同様な方法で 11 メルカプトゥンデカン酸を表面に結合し、カルボキシル 基を導入した。標識 Cとする。
[0088] く CdSe/ZnSコアシェル粒子への修飾官能基の導入〉
標識 Bと同様な方法で 11 メルカプトゥンデカン酸を表面に結合し、カルボキシノレ 基を導入した。標識 Dとする。
[0089] <蛍光強度解析〉
各標識について 405nmの光を励起光とし、蛍光スぺクトロメーター FP— 6500 (日 本分光）にて蛍光強度を評価した。標識 Aを基準 100として相対値で表し、表 1に示 した。
[0090] <細胞への取り込み染色解析〉
上記で得た標識を事前に羊血清アルブミン（SSA)と等濃度で混和し、個別に Ver o細胞へ取り込ませた。 37°C2時間培養した後、トリプシン処理して 5%FBS加 DME M再浮遊させ、同一ガラスボトムディッシュに播種した。 37°Cでー晚培養した細胞は 4%ホルマリンで固定し DAPIで核を染色して、共焦点レーザースキャン顕微鏡 (励 起 405nm)で蛍光観察を行った。
[0091] 本標識の細胞質のエンドソームへの集積状態を蛍光強度に依存する濃度および 分散状態で評価した。即ち本標識が細胞へ取り込まれてエンドソームへ移動集積の 移動効率が高い場合はエンドソームでの蛍光強度が高ぐその分布面積も広い。一 方、粒経および比重などの影響で取り込み、移動率が低い場合には蛍光強度は低く 、面積も小さい。この観察の様子を表 1に記した。
[0092] またテキサスレッドで標識して染色した結果も表 1に併せて記した。
[0093] 表 1に示した結果からわかるように本発明に係る標識 A、 Bは細胞への取り込み移 動度が良く細胞イメージング観察に適していることがわかる。また色素に比べても蛍 光強度が高ぐ耐久性も多角よりイメージングに最適であることも理解できる。
[0094] [表 1]
Figure imgf000017_0001
[0095] 実施例 2
実施例 1で調製したコア/シェル粒子を用レ、てアビジン修飾を行った。
[0096] Si/SiO 'コア/シェル粒子を濃硫酸と過酸化水素水との 3： 1混合液中で 10分程 反応させ、結晶粒子表面を水酸化さシェル。水洗後、水とエタノールの 1： 1混合溶液 中でアミノプロピルトリエトキシシランを当該粒子の最表面の水酸基と反応させ、粒子 にアミノ基を導入する。反応後水洗し、溶媒をアセトンに置換して lmol/1の濃度に なるようにマレイン酸を加え、 30 45分程度、沸点近くまで加熱'還流することで、ァ ミノプロピルエトキシシランのァミノ基とマレイン酸のカルボキシル基を結合さシェル。 反応後水洗し、 869mMの N ヒドロキシスクシンイミド水溶液と、 522mMの N—（3 ージメチルァミノプロピル）一 N， 一ェチルカルポジイミトーヒドロクロライド水溶液の 1： 1混合液に分散させ 10分程度反応さシェル。反応後水洗し、室温 ·水溶液中で 2. 2 1〃Mのアビジンと 2時間反応させた後、 ImMのエタノールアミンを加え、室温で 10 分間攪拌する。これにより粒子にアビジンが結合される。これを標識 A— 2とする。
[0097] く Si/ZnS 'コア/シェル粒子へのアビジンの導入〉
3—メルカプト 1ーァミノプロパンを用いてメルカプト基で粒子に結合さえて表面にァ ミノ基を導入した後、上記標識 A— 2と同様に行い、アビジン結合標識 B— 2を得た。
[0098] (CdSe/SiO 'コア/シェル粒子へのアビジンの導入〉
上記標識 A— 2と同様にしてアビジン結合標識 C 2を得た。
[0099] く CdSe/ZnS ·コア/シェル粒子へのアビジンの導入〉
上記標識 B— 2と同様にしてアビジン結合標識 D— 2を得た。
[0100] <免疫染色〉
核膜孔輸送を担う GTP分解酵素 Panを上記各標識で染色を試みた。 GTP分解酵 素 Panと標識とを混和し Vero細胞に取り込ませた。 37°C2時間培養した後共焦点レ 一ザ一スキャン顕微鏡 (励起 405nm)で蛍光観察を行った。核の染色の状態を評価 し表 2に記した。観察された蛍光強度が高ぐ面積が大きければ標識コンジュゲート の移動効率は高ぐ本発明標識の特長を表すものである。染色がほとんど観察され ない場合は比重が高すぎるために沈降 ·沈降するなどの理由で移動できな力、つたこ とが示す。
[0101] [表 2]
Figure imgf000019_0001
表 2に示すように本発明に基づく標識は動態を伴うイメージングに有効であることが 分かる。すなわち、生体物質の動態イメージングの描写性を大きく向上できることが 分かる。

Claims

請求の範囲
[1] 半導体微粒子からなるコア粒子と該コア粒子を被覆するシェル層とで構成されるコア
/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子であって、該コア粒子とシェル層の化学組 成が相異し、該コア粒子の平均粒径が l〜15nmであり、比重が 1. 0〜3. 0であり、 かつ該コア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子の比重が 0. 8〜3. 2であること を特徴とする蛍光半導体微粒子。
[2] 前記シェル層の比重力 前記コア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子の比重 が 0. 8〜3. 2になるように、コア粒子とシェル層の体積比により調整されることを特徴 とする請求の範囲第 1項に記載の蛍光半導体微粒子。
[3] 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の蛍光半導体微粒子であって、前記コア粒子の 平均粒径が 1〜 1 Onmであり、かつコア/シェル構造を有する蛍光半導体微粒子の 平均粒径が 3〜15nmであることを特徴とする蛍光半導体微粒子。
[4] 請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子であって
、前記コア粒子の平均粒径が l〜5nmであり、かつコア/シェル構造を有する蛍光 半導体微粒子の平均粒径が 3〜10nmであることを特徴とする蛍光半導体微粒子。
[5] 請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子の製造方 法であって、液相法によりコア粒子又はシェル層を形成することを特徴とする蛍光半 導体微粒子の製造方法。
[6] 請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子の表面上 に生体物質に結合する官能基と該蛍光半導体微粒子の表面に結合する官能基をも つ表面修飾化合物を有することを特徴とする生体物質蛍光標識剤。
[7] 請求の範囲第 6項に記載の生体物質蛍光標識剤であって、その平均粒径が;!〜 20 nmであることを特徴とする生体物質蛍光標識剤。
[8] 請求の範囲第 6項又は第 7項に記載の生体物質蛍光標識剤であって、その平均粒 径が 1〜 1 Onmであることを特徴とする生体物質蛍光標識剤。
[9] 請求の範囲第 6項乃至第 8項のいずれか一項に記載の生体物質蛍光標識剤を用い て蛍光動態イメージングを行うことを特徴とするバイオイメージング法。
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