WO2007111282A1

WO2007111282A1 - グリコヘモグロビン濃度測定方法および濃度測定装置

Info

Publication number: WO2007111282A1
Application number: PCT/JP2007/056110
Authority: WO
Inventors: Koji Sugiyama; Toshikatsu Sakai
Original assignee: Arkray, Inc.
Priority date: 2006-03-24
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2007-10-04
Also published as: JPWO2007111282A1; JP5279485B2; US20100291691A1; CN101484792B; EP2012111A1; EP2012111B1; CN101484792A; EP2012111A4; US8268625B2

Abstract

　グリコヘモグロビン濃度を測定する場合に、測定波長として４００～４５０ｎｍの波長範囲から複数の波長を選択する。好ましくは、液体クロマトグラフィを利用して、少なくとも４１５～４３０ｎｍの波長範囲における異なるピーク波長の光を連続的または間欠的を受光して、波長と溶離時間と検出量とを変数とする３次元クロマトグラムを得、この３次元クロマトグラムに基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算する。

Description

明細書

グリコヘモグロビン濃度測定方法および濃度測定装置

技術分野

[0001] 本発明は、血液などの試料に含まれるグリコヘモグロビンの濃度を測定する技術に関する。

背景技術

[0002] 血液などの生体試料を用いて生体成分を分離分析する場合には、高速液体クロマトグラフィ (HPLC)を利用した高速液体クロマトグラフィ装置 (HPLC装置）が広く用 V、られて、る（たとえば特許文献 1参照)。

[0003] 図 13に示したように、一般的な HPLC装置 9は、試料調製ユニット 90において生体成分を含んだ試料を調製した後にその試料を分析カラム 91に導入させ、生体成分を分析カラム 91の充填剤に吸着させるように構成されてヽる。試料として全血を用いてダルコヘモグロビンを測定する場合には、分析カラム 91に対しては、全血から採取した赤血球を溶血させた後に、溶血液を希釈した状態の生体試料が導入される。その一方で、充填剤に吸着させた生体成分は、送液ポンプ 92によって溶離液ボトル 93 力分析カラム 91に溶離液を供給することによって溶離させられる。分析カラム 91からの生体成分を含む溶離液は、測光機構 94に導入され、この測光機構 94において生体成分を含む溶離液の吸光度を連続的に測定することにより、生体成分の分析が行なわれる。

[0004] 図 14に示したように、測光機構 94は、生体成分を含む溶離液が測光セル 95の流路 96を流通する間に、光源 97からの光を照射し、そのときの透過光を受光部 98において受光するものである。受光部 98において受光させる光の波長は、干渉フィルタ 99において選択される一方で、受光部 98からは受光量に応じた出力レベルの信号が出力される。測光機構 94における溶離液の測光は連続的に行なわれるため、溶離時間と受光量（吸光度）との関係は、図 15に示したようなクロマトグラムとして得られる。

[0005] HPLC装置 9ではさらに、吸光度の経時的変化であるクロマトグラムに基づいて、へモグロビン総量を演算するとともに、このヘモグロビン総量におけるグリコへモグロビンが占める割合（図 15においてクロスハッチングで示した部分）としてグリコへモグロビン濃度が演算される。

[0006] し力しながら、溶離液への酸素などの気体の溶解量は、溶離液の温度によって異なるため、装置外部の温度 (環境温度）が変動した場合、あるいは環境温度が異なる状態で生体成分の分析を行なった場合には、溶離液中の溶存気体の状態 (溶解量) が異なったものとなる。そのため、溶離液中の溶存酸素濃度が環境温度の変動などに伴って変動した場合には、ヘモグロビン中のォキシヘモグロビンとデォキシへモグロビンとの比率が変動する。また、分析カラム 91に導入される生体試料においても、各回の測定ごとにヘモグロビン中のォキシヘモグロビンとデォキシヘモグロビンとの比率が変動しうる。

[0007] その一方で、分析カラム 91に導入する生体試料として、溶血液を希釈して酸素が比較的多い状態のものを使用することから、測光機構 94においては、ォキシへモグロビンの最大吸収波長である 415nmを測定波長として採用している。そのため、環境温度の変化が大きな環境下などででは、ォキシヘモグロビンとデォキシへモグロビンとの比率が異なったものとなるため、それらを同一の波長において測定する場合には正確な測定が困難となる。

[0008] 特許文献 1 :特開平 7— 120447号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明は、ォキシヘモグロビンとデォキシヘモグロビンとの比率が異なる場合であつても、クリコヘモグロビンの濃度を適切に測定できるようにすることを課題としている課題を解決するための手段

[0010] 本発明の第 1の側面において提供されるグリコヘモグロビン濃度測定方法は、試料に対して光を照射したときに試料力進行してくる光に基づいてグリコヘモグロビン濃度を測定する方法であって、 400〜450nmの波長範囲にピーク波長を有する複数の測定波長の光に基づいてグリコヘモグロビンの濃度を測定することを特徴としている。

[0011] 好ましくは、試料から進行してくる光のうち、少なくとも 415〜430nmの波長範囲における異なるピーク波長の光を連続的または間欠的を受光してグリコヘモグロビン濃度を測定する。

[0012] 本発明は、液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定方法に適用することができる。その場合、グリコヘモグロビン濃度は、たとえば測定波長、溶離時間および検出量を変数とする 3次元クロマトグラムに基づいて演算される。より具体的には、たとえば、グリコヘモグロビン濃度は、上記 3次元クロマトグラムでのへモグロビン総量に対応する体積または積算値おけるグリコヘモグロビンに対応する体積または積算値が占める割合として演算される。グリコヘモグロビン濃度は、各測定波長における溶離時間と検出量とを変数とするクロマトグラム力ダルコヘモグロビンの割合を演算するとともに、各測定波長におけるダルコヘモグロビンの割合を平均することにより演算してもよい。

[0013] グリコヘモグロビン濃度は、各測定波長におけるヘモグロビンの検出量のピーク値と、溶離時間と、の 2次元クロマトグラムにおいて、ヘモグロビン総量に対応する面積おけるグリコヘモグロビンに対応する面積が占める割合として演算さすることもできる

[0014] グリコヘモグロビン濃度は、試料力も進行してくる 400〜420nmの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第 1光量と、試料力進行してくる 420〜440nmの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第 2光量と、に基づいて測定することもできる。この場合、グリコヘモグロビン濃度は、上記第 1光量に基づいてォキシへモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出する一方で、上記第 2光量に基づいてデォキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出し、かつ、ォキシへモグロビン濃度とデォキシヘモグロビン濃度とを合算し、あるいはォキシヘモグロビン濃度に相関する値とデォキシヘモグロビン濃度に相関する値とを合算することで演算することができる。

[0015] 本発明のグリコヘモグロビン濃度方法が液体クロマトグラフィを利用したものである場合において、上記第 1光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すォキシヘモグロビンに対応した第 1クロマトグラムと、第 2光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すデォキシヘモグロビンに対応した第 2クロマトグラムと、を重ね合わせたクロマトグラムに基づいて、クリコヘモグロビン濃度を演算するようにしてちよい。

[0016] 上記試料は、たとえば血球を溶血させものである。

[0017] 本発明の第 2の側面では、光源からの光を試料に照射し、そのときに試料力も進行してくる光を受光部において受光する測光機構を備えたグリコヘモグロビン濃度測定装置であって、上記測光機構は、 400〜450nmの波長範囲にピーク波長を有する複数の波長の光を区別して、受光部において受光させることができるように構成されて、ることを特徴とする、グリコヘモグロビン濃度測定装置が提供される。

[0018] 好ましくは、受光部は、少なくとも 415〜430nmの波長範囲における異なるピーク波長の光を連続的または間欠的を受光できるように構成される。

[0019] 本発明は、液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定装置に適用することができる。この場合のグリコヘモグロビン濃度測定装置は、波長と溶離時間と検出量とを変数とする 3次元クロマトグラムに基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算するように構成された演算部をさらに備えたものとされる。

[0020] 演算部は、たとえば上記 3次元クロマトグラムでのヘモグロビン総量に対応する体積または積算値おけるグリコヘモグロビンに対応する体積または積算値が占める割合としてグリコヘモグロビン濃度を演算するように構成されている。より具体的には、演算部は、たとえば上記 3次元クロマトグラムに基づいて得られる溶離時間と検出量のピーク値とを変数とする 2次元クロマトグラムにおいて、ヘモグロビン総量に対応する面積おけるグリコヘモグロビンに対応する面積が占める割合としてグリコヘモグロビン濃度を演算するように構成される。演算部はまた、各ピーク波長における溶離時間と検出量とを変数とするクロマトグラム力もダルコヘモグロビンの割合を演算するとともに、各ピーク波長におけるダルコヘモグロビンの割合を平均することによりグリコへモグロビン濃度を演算するように構成してもよぐ各ピーク波長におけるヘモグロビンの検出量のピーク値と、溶離時間と、の 2次元クロマトグラムにおいて、ヘモグロビン総量に対応する面積おけるグリコヘモグロビンに対応する面積が占める割合として演算するように構成することちできる。

[0021] 本発明のグリコヘモグロビン濃度測定装置は、試料力ら進行してくる 400〜420nm の波長範囲にピーク波長を有する光の量である第 1光量と、試料から進行してくる 42 0〜440nmの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第 2光量と、に基づ、て、グリコヘモグロビン濃度を演算する演算部を備えたものとすることもできる。演算部は、たとえば上記第 1光量に基づいてォキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出する一方で、上記第 2光量に基づいてデォキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出し、かつ、上記ォキシヘモグロビン濃度と上記デォキシヘモグロビン濃度とを合算し、あるいは上記ォキシヘモグロビン濃度に相関する値と上記デォキシヘモグロビン濃度に相関する値とを合算してヘモグロビン濃度を演算するように構成される。

[0022] 本発明のグリコヘモグロビン濃度装置が液体クロマトグラフィを利用したものである場合において、演算部は、上記第 1光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すォキシヘモグロビンに対応した第 1クロマトグラムと、上記第 2光量に基づ V、て得られる溶離時間と検出量との関係を示すデォキシヘモグロビンに対応した第 2 クロマトグラムと、を重ね合わせたクロマトグラムに基づいて、クリコヘモグロビン濃度を演算するように構成してもよ、。

[0023] 上記試料は、たとえば血球を溶血させものである。

図面の簡単な説明

[0024] [図 1]本発明の第 1の実施の形態に係るグリコヘモグロビン測定装置の一例である H PLC装置を示す概略構成図である。

[図 2]図 1に示した HPLC装置における測光機構を説明するための断面図である。

[図 3]図 1に示した HPLC装置の要部を示すブロック図である。

[図 4]図 1に示した HPLC装置の動作を説明するためのフローチャートである。

[図 5]図 1に示した HPLC装置における演算回路での濃度測定処理を説明するためのフローチャートである。

[図 6]演算回路において得られる 3次元クロマトグラムの一例である。

[図 7]本発明の第 2の実施の形態における演算回路での濃度測定処理を説明するためのフローチャートである。

[図 8]図 8Aは特定時間における測定波長と吸光度との関係を示すグラフであり、図 8 Bは特定時間における最大吸光度により作成した 2次元クロマトグラムである。

[図 9]本発明の第 3の実施の形態における演算回路での濃度測定処理を説明するためのフローチャートである。

[図 10]測定波長が 415nmの場合（1点鎖線、）、測定波長が 430nmの場合 (鎖線）、および測定波長が 415nmのときの吸光度と 430nmのときの吸光度とを合算した場合 (実線)の 2次元クロマトグラムである。

[図 11]実施例 1における環境温度とグリコヘモグロビン濃度と関係を示すグラフである

[図 12]比較例 1における環境温度とグリコヘモグロビン濃度と関係を示すグラフである

[図 13]従来のグリコヘモグロビン測定装置の一例である HPLC装置を示す概略構成図である。

[図 14]図 13に示した HPLC装置における測光機構を説明するための断面図である。

[図 15]図 13に示した HPLC装置にお!/、て得られるクロマトグラムの一例である。符号の説明

[0025] X HPLC装置（ダルコヘモグロビン測定装置）

5 測光機構

51 (測光機構の)光源

53B (測光機構の)受光素子 (受光部）

61 演算部

発明を実施するための最良の形態

[0026] 以下においては、本発明の第 1ないし第 3の実施の形態について、図面を参照して具体的に説明する。

[0027] まず、本発明の第 1の実施の形態について、図 1ないし図 6を参照して説明する。

[0028] 図 1に示した HPLC装置 Xは、本発明のグリコヘモグロビン濃度測定装置の一例に相当するものであり、全血を用いてグリコヘモグロビン濃度を測定するように構成されたものである。この HPLC装置 Xは、複数の溶離液ボトル 10, 11, 12 (図面上は 3つ )、脱気装置 2、試料調製ユニット 3、分析ユニット 4、測光機構 5および演算回路 6を備えている。

[0029] 各溶離液ボトル 10, 11, 12は、後述する分析カラム 40に供給すべき溶離液を保持したものである。溶離液としては、たとえば pHや塩濃度の異なるノッファが使用される。

[0030] 脱気装置 2は、分析ユニット 4 (分析カラム 40)に溶離液を供給する前に、溶離液から溶存気体を除去するためのものであり、配管 70A, 70B, 70Cを介して溶離液ボトノレ 10, 11, 12【こ、酉己管 71A, 71B, 71Cを介して分析ユニット 4のマユホーノレド 41【こ連結されている。

[0031] 図 1に示したように、試料調製ユニット 3は、採血管 13から採取した血球成分から、分析カラム 40に導入する試料を調製するためのものである。この試料調製ユニット 3 は、サンプリングノズル 30、調製液タンク 31および希釈槽 32を有している。

[0032] サンプリングノズル 30は、採血管 13の血液試料 14をはじめとする各種の液体を採取するためのものであり、液体の吸引'吐出が可能であるとともに、上下方向および水平方向に移動可能とされている。このサンプリングノズル 30の動作は、図外の制御手段によって制御されている。

[0033] 調製液タンク 31は、血液試料 14をもとに、分析カラム 40に導入する導入用試料を調製するための調製液を保持したものである。この調製液タンク 31には、調製液として、赤血球の溶血させるための溶血液、溶血液を希釈するための希釈液などが保持されている。

[0034] 希釈槽 32は、血液試料 14中の赤血球を溶血させ、かつ溶血液を希釈して導入用試料を調製する場を提供するためのものである。この希釈槽 32は、後述する分析ュニット 4におけるインジェクションバルブ 43に配管 72を介して接続されており、希釈槽 32において調製された導入用試料力 Sインジェクションバルブ 43を介して分析カラム 4 0に導入できるように構成されている。

[0035] 分析ユニット 4は、分析カラム 40の充填剤に対する生体成分の吸着'溶離をコント口ールし、各種の生体成分を測光機構 5に供するためのものであり、図外の温調機構により温度コントロールされている。分析ユニット 4における設定温度は、たとえば 40 °C程度とされる。分析カラム 40は、試料中のヘモグロビンを選択的に吸着させるための充填剤を保持させたものである。充填剤としては、たとえばメタクリル酸エステル共重合体が使用される。

[0036] 分析ユニット 4は、分析カラム 40の他に、マ-ホールド 41、送液ポンプ 42、およびィンジェクシヨンバルブ 43を有して!/、る。

[0037] マ-ホールド 41は、複数の溶離液ボトル 10, 11, 12のうちの特定の溶離液ボトル 1 0, 11, 12から、インジェクションバルブ 43に対して選択的に溶離液を供給させるためのものである。このマ-ホールド 41は、配管 71A, 71B, 71Cを介して脱気装置 2 に接続され、配管 73を介してインジェクションバルブ 43に接続されている。

[0038] 送液ポンプ 42は、インジェクションバルブ 43を介して溶離液を分析カラム 40に移動させるための動力を付与するためのものであり、配管 73の途中に設けられている。送液ポンプ 42は、たとえば溶離液の流量が 1. 0〜2. OmlZminとなるように動作させられる。

[0039] インジェクションバルブ 43は、一定量の導入用試料を採取するとともに、その導入用試料を分析カラム 40に導入可能とするものであり、複数の導入ポートおよび排出ポート（図示略）を備えている。このインジェクションバルブ 43には、インジェクションループ 44が接続されている。このインジェクションループ 44は、一定量（たとえば数 /z L )の液体を保持可能なものであり、インジェクションバルブ 43を適宜切り替えることにより、インジェクションループ 44が希釈槽 32と連通して希釈槽 32からインジェクションループ 44に導入用試料が供給される状態、インジェクションループ 44が配管 74を介して分析カラム 40と連通してインジェクションループ 44から導入用試料が分析カラム 40に導入される状態、あるいはインジェクションループ 44に図外の洗浄槽カも洗浄液が供給される状態を選択することができる。このようなインジェクションバルブ 43としては、たとえば六方ノレブを使用することができる。

[0040] 図 2に示したように、測光機構 5は、分析カラム 40からの溶離液に含まれるへモグロビンを光学的に検出するためのものであり、測光セル 50、光源 51、ビームスプリッタ 5 2、測定用受光系 53および参照用受光系 54を有している。 [0041] 測光セル 50は、測光エリアを規定するためのものである。この測光セル 50は、導入流路 50A、測光流路 50Bおよび排出流路 50Cを有しており、これらの流路 50A, 50 B, 50Cがー連に連通している。導入流路 50Aは、分析カラム 40 (図 1参照）からの溶離液を測光流路 50Bに導入するためのものであり、分析カラム 40に配管 75を介して接続されている。測光流路 50Bは、測光対象となる溶離液を流通させ、かつ溶離液を測光するための場を提供するものであり、直線状に形成されている。この測光流路 50Bは、両端が開放しているとともに、両端部が透明カバー 55により塞がれている。排出流路 50Cは、測光流路 50Bの溶離液を排出するためのものであり、配管 76を介して廃液槽 15に接続されて!ヽる (図 1参照)。

[0042] 光源 51は、測光流路 50Bを流通する溶離液に光を照射するためのものである。この光源 51は、光軸 Lが測光流路 50Bの中心を通過するように、測光流路 50Bの端面 50Ba (透明カバー 55)に対面した状態で配置されている。光源 51は、後述する演算部 61 (図 3参照）における濃度演算手法に応じて出射可能な波長範囲が選択されるものであってもよいが、通常は、 400〜500nmの波長範囲の光を出射可能なもの、たとえばノヽロゲンランプが使用されている。もちろん、光源 51としては、ハロゲンランプ以外のもの、たとえば 1または複数の LED素子を備えたものを使用することもできる。

[0043] ビームスプリッタ 52は、光源 51から出射された光のうち、測光流路 50Bを透過した光を分割して測定用受光系 53および参照用受光系 54に入射させるためのものであり、光軸 L上において、 45度傾斜した状態で配置されている。ビームスプリッタ 52としては、ハーフミラーなどの公知の種々のものを使用することができる。

[0044] 測定用受光系 53は、ビームスプリッタ 52を透過した光のうち、目的とする波長の光を選択的に受光するものであり、光軸 L上に配置されている。この測定用受光系 53 は、波長選択部 53Aと、この波長選択部 53Aを透過した光を受光するための受光素子 53Bと、を備えている。波長選択部 53Aは、後述する演算部 61 (図 3参照）における濃度演算手法に応じて透過させるべき光の波長を選択するものである。この波長選択部 53Aとしては、干渉フィルタ、シャープカットフィルタおよびクレーデイングなどの公知の分光手段を採用することができる。受光素子 53Bとしては、フォトダイオードを使用することができる。

[0045] 参照用受光系 54は、分析カラム 40 (図 1参照)からの溶離液の濁度や散乱の影響を抑制するためのデータを取得するためのものであり、ビームスプリッタ 52において反射して光路が変えられた光のうち、参照波長である 500nmの光を選択的に受光するものである。この測定用受光系 74は、 500nmの光を選択的に透過させる干渉フィルタ 54Aと、干渉フィルタ 54Aを透過した光を受光するための受光素子 54Bと、を備えている。受光素子 54Bとしては、フォトダイオードを使用することができる。

[0046] 図 3に示したように、演算回路 6は、制御部 60および演算部 61を備えている。

[0047] 制御部 60は、各部の動作を制御するためのものである。より具体的には、制御部 6 0は、光源 51の点灯 ·消灯を制御し、波長選択部 53Aを制御して受光素子 53Bにお V、て受光させる光の波長を選択し、ある!/、は演算部 61における濃度演算処理を制御する。

[0048] 演算部 61は、受光素子 53B, 54Bでの受光結果に基づいて、全血中のグリコへモグロビン濃度を演算するためのものである。この演算部 61は、演算に必要なプロダラムを記憶したものであり、その動作は制御部 60によって制御される。

[0049] 次に、 HPLC装置 Xの動作について、図 1ないし図 3に加えて、図 4に示したフローチャートを参照しつつ説明する。

[0050] HPLC装置 Xにおいては、測定開始の指示が確認された場合には（S1)、分析カラム 40に対して溶離液を供給する（S2)。溶離液は、送液ポンプ 42の動力により、溶離液ボトル 10, 11, 12から脱気装置 2、マ-ホールド 41を介してインジェクションバルブ 43に供給され、また複数の溶離液ボトル 10, 11, 12のうちのいずれの溶離液ボトル 10, 11, 12の溶離液を供給するかは、マ-ホールド 41を制御することによって選択される。インジェクションバルブ 43に供給された溶離液は、配管 74を介して分析力ラム 40に供給される。

[0051] HPLC装置 Xにおいてはさらに、分析カラム 40に導入すべき導入用試料を調製する（S3)。導入用試料の調製に当たっては、まず採血管 13から血液試料 14を採取する。採血管 13からの血液試料 14の採取は、サンプリングノズル 30を動作させることにより行なわれる。サンプリングノズル 30によって採取された血液試料 14は、サンプリングノズル 30を動作させることによって希釈槽 32に供給される。希釈槽 32にはさらに、調製液タンク 31から溶血剤および希釈液が順次供給され、サンプリングノズル 30を利用したピペッティング操作によって希釈槽 32内の液体を混合することによって導入用試料が調製される。

[0052] 導入用試料は、分析カラム 40に導入される（S4)。分析カラム 40に対する導入用試料の導入は、インジェクションバルブ 43の切替操作を行うことにより、インジェクションループ 44の導入用試料が溶離液とともに分析カラム 40に導入される。分析カラム 40においては、導入用試料が導入されることにより、充填剤にグリコヘモグロビンが吸着する。充填剤にグリコヘモグロビンを吸着させた後においては、マ-ホールド 41 によって、分析カラム 40に供給する溶離液の種類を適宜切り替え、充填剤に吸着したグリコヘモグロビンを溶離させる。

[0053] 一方、導入用試料の導入開始から一定時間経過した場合には、インジェクションバルブ 43の切替操作を行うことにより、分析カラム 40に対して引き続き溶離液を供給するとともに、インジェクションループ 44の洗浄を行なう（S5)。一方、インジェクションループ 44の洗浄と同時的に、先に説明したのと同様にして、先とは異なる採血管 13の血液試料 14から導入用試料を調製し (S3)、インジェクションループ 44の洗浄後においては、再び導入用試料をインジェクションループ 44に導入する（S4)。このような導入用試料の調製 (S3)、導入 (S4)、洗浄 (S5)は、インジェクションバルブ 43を適宜切り替えつつ、測定対象となる採血管 13 (血液試料 14)の数に応じて繰り返し行なわれる。

[0054] 分析カラム 40から排出されるグリコヘモグロビンを含む溶離液は、配管 76を介して測光機構 5の測光セル 50に供給され、測光される（S6)。測光セル 50に対しては、配管 75および導入流路 50Aを介して溶離液が導入され、この溶離液は測光流路 50 Bおよび排出流路 50Cを通過した後に、配管 76を介して廃液槽 15に導かれる。

[0055] 測光機構 5においては、分析カラム 40からの溶離液が測光流路 50Bを通過する際に、光源 51によって溶離液に対して連続的に光が照射される。その一方で、測光流路 50Bを透過した光は、ビームスプリッタ 52において分割された後、測定用受光系 5 3および参照用受光系 54において受光される。測定用受光系 53では、波長選択部 53Aを透過した特定波長の光が受光素子 53Bにおいて選択的に受光される。一方

、参照用受光系 54では、干渉フィルタ 54Aを透過した参照波長である 500nmの光が受光素子 54Bにおいて選択的に受光される。

[0056] 受光素子 53B, 54Bでの受光結果は、演算回路 6に出力され、この演算回路 6にお、てグリコヘモグロビンの濃度が演算される（S7)。

[0057] 演算回路 6における濃度演算処理は、図 5に示したフローチャートの手順にしたがつて行なわれる。

[0058] まず、 400〜450nm、好ましくは 415〜430nmの波長範囲から選択された複数の波長について、各波長ごとに特定時間ごとに測光を行なう（S10)。より具体的には、光源 51から連続的に光を出射する一方で、制御部 60によって波長選択部 53Aを制御し、受光素子 53Bにおいて受光される光の波長を、上記波長範囲において経時的に変化させる。すなわち、受光素子 53Bにおいて受光される光の波長は、連続的または間欠的に変化させられる。なお、上記波長範囲で波長変化させた測光は繰り返し行なわれる。

[0059] 図 6には、波長を間欠的に変化させた場合の例を示した力上記時間範囲を同一時間として取り扱った場合には、各測定波長ごとに 2次元クロマトグラムが得られ、測定波長をも変数すれば、溶離時間、吸光度および測定波長を変数とする 3次元クロマトグラムが得られる。なお、図 6では、測定波長の間隔を比較的に大きく設定している力実際には、測定波長の間隔は、極めて小さく（たとえば 0. l〜2nm)、波長を変数のとする場合のプロット点は離散的ではなぐもっと連続的なものとなる。

[0060] 次いで、同一時間における各波長でのヘモグロビンに相当する吸光度を積算する

(Sl l) oすなわち、図 6の 3次元クロマトグラムにおけるヘモグロビンに相当する部分の体積を、各測定波長での 2次元クロマトグラムにおけるヘモグロビンに相当する部分の面積の積算値として演算する。

[0061] 次いで、同一時間における各波長でのグリコヘモグロビンに相当する吸光度を積算する（S12)。すなわち、図 6の 3次元クロマトグラムにおけるグリコヘモグロビンに相当する部分の体積を、各測定波長での 2次元クロマトグラムにおけるヘモグロビンに相当する部分の面積の積算値として演算する。 [0062] 次いで、ヘモグロビン総量に対するグリコヘモグロビンの比率を演算する（S13)。すなわち、図 6における 3次元ヘモグロビン総量に相当する体積 (積算値)のうち、グリコヘモグロビンに相当する体積 (積算値)の割合を演算し、それをグリコへモグロビン濃度 (％)とする。

[0063] S13における演算が終了した場合には、図 4における S7に戻る（S14)。すなわち、演算回路 6での演算結果は、図外の表示パネルに表示され、また自動的あるいは使用者のボタン操作によってプリントアウトされる（S8)。

[0064] 本実施の形態では、ォキシヘモグロビンの最大吸収波長である 415nmおよびデォキシヘモグロビンの最大吸収波長である 430nmを含む波長範囲にぉ、て、連続的または間欠的に波長を変化させたときの吸光度変化に基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算している。すなわち、本発明は、ォキシヘモグロビンに主体的に着目してグリコヘモグロビン濃度を演算するのではなく、デォキシヘモグロビンの影響をも勘案してグリコヘモグロビンの濃度を演算している。そのため、溶離液中の溶存気体の状態が変動してヘモグロビン中のォキシヘモグロビンとデォキシヘモグロビンとの比率が変動し、あるいは分析カラム 40に導入する導入用試料におけるォキシへモグロビンとデォキシヘモグロビンとの比率が変動した場合であっても、その影響を受けることもない。その結果、本実施の形態では、 HPLC装置 Xの外部の温度 (環境温度）が変動する環境下や環境温度が異なる状態でグリコヘモグロビン濃度を測定する場合、あるいは分析カラムに導入する試料における酸素濃度のバラツキが生じる場合であつても、溶離液におけるォキシヘモグロビンとデォキシヘモグロビンとの比率に関係なぐ安定したグリコヘモグロビン濃度の測定が可能となる。

[0065] なお、グリコヘモグロビン濃度の算出は、たとえば各測定波長での 2次元クロマトグラムに基づ、てヘモグロビン総量におけるグリコヘモグロビンが占める割合をそれぞれ演算するとともに、各測定波長でのグリコヘモグロビンの割合の平均値を算出し、その平均値をグリコヘモグロビン濃度としてもよ、。

[0066] 次に、本発明の第 2の実施の形態について、図 3、図 7および図 8を参照して説明する。

[0067] 本実施の形態は、図 7に示したように、演算回路 6における濃度演算処理の手法が、先の実施の形態とは異なっている。

[0068] まず、 400〜450nm、好ましくは 415〜430nmの波長範囲から選択された複数の波長において、特定時間ごとに測光を行なう（S20)。この点については、第 1の実施に形態における S10 (図 5参照）と同様である。測定波長を連続的あるいは間欠的に変化させた場合には、図 8Aに示したように各時間ごとに測定波長と吸光度との関係を示すグラフが得られる。

[0069] 次いで、同一時間における最大吸光度 (max)を選択し、図 8Bに示すような溶離時間と最大吸光度との関係を示す 2次元クロマトグラムを得る（S21)。

[0070] 次いで、図 8Bに示した 2次元クロマトグラムから、ヘモグロビン総量に相当する面積に対するグリコヘモグロビン量に対応する面積としてグリコヘモグロビン濃度（％)を演算する（S22)。

[0071] S22における処理が終了した場合には、図 4における S7に戻り（S23)、演算回路 6 での演算結果力図外の表示パネルなどに出力される（S8)。

[0072] 本実施の形態では、測定波長として、ォキシヘモグロビンの最大吸収波長である 4 15nmおよびデォキシヘモグロビンの最大吸収波長である 430nmを含む波長範囲を利用しているとともに、それらの波長範囲において測定される最大吸光度によってグリコヘモグロビン濃度を演算している。そのため、本発明の第 1の実施の形態の場合と同様に、分析カラム 40からの溶離液におけるォキシヘモグロビンとデォキシへモグロビンとの比率に関係なぐ安定したグリコヘモグロビン濃度の測定が可能となる。

[0073] 次に、本発明の第 3の実施の形態について、図 3、図 9および図 10を参照して説明する。

[0074] 本実施の形態は、図 9に示したように、演算回路 6における濃度演算処理の手法が、先の実施の形態とは異なっている。

[0075] まず、 415nmおよび 430nmにおいて特定時間ごとに測光を行なう（S30)。より具体的には、光源 51から連続的に光を出射する一方で、制御部 60によって波長選択部 53Aを制御し、受光素子 53Bにおいて受光される光の波長を、 415nmと 430nm との間で交互に切り替える。このような測定波長の切り替えは、繰り返し行なわれる。その結果、図 10に示したように、測定波長を 415nmとしたときのォキシヘモグロビン基準の 2次元クロマトグラム（図 10の一点鎖線）と、測定波長を 430nmとしたときのデォキシヘモグロビン基準の 2次元クロマトグラム（図 10の鎖線）力溶離時間と吸光度との関係として得られる。

[0076] 次いで、測定波長を 415nmとしたときのォキシヘモグロビン基準の 2次元クロマトグラム（図 10の一点鎖線)からグリコヘモグロビン濃度を演算する（S31)。

[0077] 次いで、測定波長を 430nmとしたときのデォキシヘモグロビン基準の 2次元クロマトグラム（図 10の鎖線)力グリコヘモグロビン濃度を演算する（S32)。

[0078] 次いで、測定波長を 415nmとしたときの濃度演算結果と測定波長を 430nmとしたときの濃度演算結果とを合算し、それをグリコヘモグロビン濃度とする（S33)。

[0079] S33における処理が終了した場合には、図 4における S7に戻り（S34)、演算回路 6 での演算結果力図外の表示パネルなどに出力される（S8)。

[0080] 本実施の形態では、測定波長として、ォキシヘモグロビンの最大吸収波長である 4 15nmの測定結果とデォキシヘモグロビンの最大吸収波長と 430nmの測定結果を合算してグリコヘモグロビン濃度を演算している。そのため、本発明の第 1の実施の形態の場合と同様に、分析カラム 40からの溶離液におけるォキシヘモグロビンとデォキシヘモグロビンとの比率に関係なぐ安定したグリコヘモグロビン濃度の測定が可能となる。

[0081] 本実施の形態では、グリコヘモグロビン濃度は、測定波長が 415nmのときのクロマトグラムと 430nmのときのクロマトグラムとを合算して得られるクロマトグラム（図 10の実線）に基づいて演算してもよい。

[0082] また、ォキシヘモグロビン基準のクロマトグラムを得るときの測定波長は、 415nmに限らず、 400〜420nmの波長範囲力選択すればよぐデォキシヘモグロビン基準のクロマトグラムを得るときの測定波長は、 430nmに限らず、 420〜440nmの範囲力も選択すればよい。

[0083] 本発明は、先に説明した実施の形態には限定されず、種々に変更可能である。たとえば、先に説明した濃度演算処理においては、ヘモグロビン量が吸光度として取得されていた力ヘモグロビン量は、必ずしも吸光度として取得する必要はなぐ透過率として、あるいは単に受光量として取得してもよい。 [0084] また、測光機構 5において複数の測定波長の光を区別して認識する方法としては、 1つの受光素子 53Bによって行なう場合の他、測定波長の数に応じた受光素子を設け、あるいは受光エリアを有する発光素子を用いる方法であってもよ、。

[0085] 測光機構 5における測定用受光系 53の受光素子 53Bに受光させる光の波長（測定波長）を選択する方法としては、測定用受光系 53において波長選択部 53Aを設ける構成を採用してヽたが、波長選択部を光源 51と測光セル 50との間に配置した構成を採用することもできる。

[0086] 本発明はさらに、血液中のグリコヘモグロビン濃度を測定するための HPLC装置に限らず、血液以外の検体を用いる場合、あるいは HPLC装置以外の液体クロマトダラフィ装置その他のグリコヘモグロビン濃度測定装置に対しても適用することができる。実施例

[0087] (実施例 1)

本実施例では、測定波長を変化させてグリコヘモグロビン濃度を測定した場合に、環境温度が測定値に与える影響にっ、て検討した。

[0088] グリコヘモグロビンの濃度は、環境温度を 10°C、 20°Cおよび 30°Cとした場合について、グリコヘモグロビン測定装置（「ADAMS Ale HA— 8160」；アークレイ株式会社製）において、受光素子としてフォトダイオードアレイ（「紫外可視多波長検出器

MD- 910J；日本分光株式会社製)を採用したものを用いて行った。グリコへモグロビン濃度は、 415〜430nmの波長範囲において、 lnm毎にヘモグロビン総量およびグリコヘモグロビン量をそれぞれ測定した上で、先の波長範囲におけるへモグロビン総量の積算値に対するグリコヘモグロビンの積算値が占める割合として演算した。

[0089] 検体としては、健常人から採取した血液 (健常人検体)および糖尿病患者から採取した血液 (糖尿患者血液)を用いた。グリコヘモグロビンの測定結果にっ、ては下記表 1および図 11に示した。

[0090] [表 1] グリコヘモグロビン測定値

1 0。C 20°C 30°C

健常人検体 4.41 % 4.47% 4.40%

糖尿病患者検体 8.40% 8.43% 8.33% [0091] (比較例 1)

本比較例では、測定波長をォキシヘモグロビンの最大吸収波長である 415nmに固定してグリコヘモグロビン濃度を測定した場合に、環境温度が測定値に与える影響について検討した。

[0092] グリコヘモグロビンの濃度は、測定波長を固定した以外は基本的には実施例 1と同様な条件にお!、て測定し、グリコヘモグロビン総量におけるグリコヘモグロビン量が占める割合として演算した。グリコヘモグロビンの測定結果にっ、ては下記表 2および図 12に示した。

[0093] [表 2]

[0094] 比較例 1のように、測定波長をォキシヘモグロビンの最大吸収波長である 415nm に固定してグリコヘモグロビンを測定した場合には、表 2および図 12から分力るように、環境温度が高くなるほど測定値が大きくなり、測定値が環境温度の影響を大きく受けていた。

[0095] これに対して、実施例 1のように、測定波長をォキシヘモグロビンの最大吸収波長（ 415nm)力デォキシヘモグロビンの最大吸収波長（430nm)の間で変化させたときの積算値によりグリコヘモグロビン濃度を演算した場合には、表 1および図 11から分かるように、環境温度が 10〜30°Cの範囲で変化したとしても、測定値が環境温度の影響をさほど受けておらず、略一定値となった。

[0096] このこと力、測定波長をォキシヘモグロビンの最大吸収波長（415nm)からデォキシヘモグロビンの最大吸収波長 (430nm)の間で変化させたときの積算値によりダリコヘモグロビン濃度を演算した場合には、環境温度 (溶離液の溶存酸素濃度)や試料の溶存酸素濃度の影響を受けることなく、正確かつ安定したグリコヘモグロビン濃度の測定が可能であることが分かる。

Claims

請求の範囲

[1] 試料に対して光を照射したときに試料力も進行してくる光に基づいてグリコへモグロビン濃度を測定する方法であって、

400〜450nmの波長範囲にピーク波長を有する複数の測定波長の光に基づいてグリコヘモグロビンの濃度を測定する、グリコヘモグロビン濃度測定方法。

[2] 試料力も進行してくる光のうち、少なくとも 415〜430nmの波長範囲における異なるピーク波長の光を連続的または間欠的に受光してグリコヘモグロビン濃度を測定する、請求項 1に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。

[3] 液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定方法にぉ、て、測定波長、溶離時間、および検出量を変数とする 3次元クロマトグラムに基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算する、請求項 1に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。

[4] グリコヘモグロビン濃度は、上記 3次元クロマトグラムでのヘモグロビン総量に対応する体積または積算値おけるグリコヘモグロビンに対応する体積または積算値が占める割合として演算される、請求項 3に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。

[5] グリコヘモグロビン濃度は、各測定波長における溶離時間と検出量とを変数とするクロマトグラム力もダルコヘモグロビンの割合を演算するとともに、各測定波長におけるダルコヘモグロビンの割合を平均することにより演算される、請求項 3に記載のダリコヘモグロビン濃度測定方法。

[6] グリコヘモグロビン濃度は、各測定波長におけるヘモグロビンの検出量のピーク値と、溶離時間と、の 2次元クロマトグラムにおいて、ヘモグロビン総量に対応する面積おけるグリコヘモグロビンに対応する面積が占める割合として演算される、請求項 3に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。

[7] 試料力も進行してくる 400〜420nmの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第 1光量と、試料力進行してくる 420〜440nmの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第 2光量と、に基づいて、グリコヘモグロビン濃度を測定する、請求項 1 に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。

[8] 上記第 1光量に基づ、てォキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出する一方で、上記第 2光量に基づ、てデォキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出し、かつ、

上記ォキシヘモグロビン濃度と上記デォキシヘモグロビン濃度とを合算し、あるヽは上記ォキシヘモグロビン濃度に相関する値と上記デォキシヘモグロビン濃度に相関する値とを合算して演算される値をヘモグロビン濃度とする、請求項 7に記載のダリコヘモグロビン濃度測定方法。

[9] 液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定方法にぉ、て、

上記第 1光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すォキシへモグロビンに対応した第 1クロマトグラムと、上記第 2光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すデォキシヘモグロビンに対応した第 2クロマトグラムと、を重ね合わせたクロマトグラムに基づいて、クリコヘモグロビン濃度を演算する、請求項 7に記載のクリコヘモグロビン濃度測定方法。

[10] 上記試料は、血球を溶血させものである、請求項 1に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。

[11] 光源力もの光を試料に照射し、そのときに試料力も進行してくる光を受光部において受光する測光機構を備えたグリコヘモグロビン濃度測定装置であって、

上記測光機構は、 400〜450nmの波長範囲にピーク波長を有する複数の測定波長の光を区別して、受光部において受光させることができるように構成されている、グリコヘモグロビン濃度測定装置。

[12] 上記受光部は、少なくとも 415〜430nmの波長範囲における異なるピーク波長の光を連続的または間欠的を受光できるように構成されている、請求項 11に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。

[13] 液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定装置にお、て、

測定波長、溶離時間および検出量を変数とする 3次元クロマトグラムに基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算するように構成された演算部をさらに備えている、請求項 11に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。

[14] 上記演算部は、上記 3次元クロマトグラムでのヘモグロビン総量に対応する体積または積算値おけるグリコヘモグロビンに対応する体積または積算値が占める割合としてグリコヘモグロビン濃度を演算するように構成されている、請求項 13に記載のダリコヘモグロビン濃度測定装置。

[15] 上記演算部は、各測定波長における溶離時間と検出量とを変数とするクロマトダラムカもダルコヘモグロビンの割合を演算するとともに、各測定波長におけるダルコへモグロビンの割合を平均することによりグリコヘモグロビン濃度を演算するように構成されている、請求項 13に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。

[16] 上記演算部は、各ピーク波長におけるヘモグロビンの検出量のピーク値と、溶離時間と、の 2次元クロマトグラムにおいて、ヘモグロビン総量に対応する面積おけるダリコヘモグロビンに対応する面積が占める割合として演算するように構成されて、る、請求項 13に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。

[17] 試料力進行してくる 400〜420nmの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第 1光量と、試料力進行してくる 420〜440nmの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第 2光量と、に基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算する演算部をさらに備えて!/、る、請求項 11に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。

[18] 上記演算部は、上記第 1光量に基づいてォキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出する一方で、上記第 2光量に基づ、てデォキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出し、かつ、上記ォキシヘモグロビン濃度と上記デォキシヘモグロビン濃度とを合算し、あるいは上記ォキシヘモグロビン濃度に相関する値と上記デォキシヘモグロビン濃度に相関する値とを合算してヘモグロビン濃度を演算するように構成されている、請求項 17に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。

[19] 液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定装置にお、て、上記演算部は、上記第 1光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すォキシヘモグロビンに対応した第 1クロマトグラムと、上記第 2光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すデォキシヘモグロビンに対応した第 2クロマトグラムと、を重ね合わせたクロマトグラムに基づいて、クリコヘモグロビン濃度を演算する、請求項 17に記載のクリコヘモグロビン濃度測定装置。

[20] 上記試料は、血球を溶血させものである、請求項 11に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。