WO2007034627A1

WO2007034627A1 - 動物用飼料添加剤

Info

Publication number: WO2007034627A1
Application number: PCT/JP2006/315211
Authority: WO
Inventors: Akihiko Kadota; Shinji Ito; Yasuaki Sugimoto; Masami Mochizuki; Motoshi Suzuki
Original assignee: Idemitsu Kosan Co., Ltd.; Suzuki, Kuniko
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2006-08-01
Publication date: 2007-03-29
Also published as: BRPI0616153A2; EP1935253A4; TW200806190A; US20090155417A1; EP1935253A1; KR20080050506A

Abstract

動物の消化活動を補助し、飼料効率を高めたり、炎症性腸管障害などの動物の腸内感染症を予防・改善するために、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリゼーから選ばれる少なくとも一種の菌とこれらの菌が産生する酸性酵素を組み合わせて動物に摂取させる。

Description

明細書

動物用飼料添加剤

技術分野

[0001] 本発明は、酸性酵素を産生する能力を有するァスペルギルス属菌を含有する動物用飼料添加剤に関する。

背景技術

[0002] 家畜やペット（以下、動物と!/、う。）などの飼料は、粉砕などの加工は行われるものの、一般的に加熱処理等は行われないため、消化吸収率が低くなり、飼料効率が悪いという問題がある。また、最近ではヒトの病気として知られる潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸管障害が動物にも報告されており、下痢などの症状を引き起こすという問題がある。また、このような炎症性腸管障害は、飼料の吸収低下や健全肥育を妨げることも知られている。動物の腸内感染症を引き起こす病原菌としては、病原性大腸菌、サルモネラ属細菌、クロストリジゥム属細菌、カンピロバクター属細菌などが知られている。このような病原菌は、異常増殖すると毒素（ェンテロトキシン、サイトトキシン)を産生し、腸管粘膜に障害を起こし、軟便や激しい下痢等を引き起こすことが知られている。また、コクシジゥムは、鶏、豚、牛などの腸管内に寄生する原虫であり、感染すると下痢、食欲不振などを引き起こす。このような炎症性腸管障害を予防 · 治療するために抗生物質を用いることが行われているが、薬剤耐性菌の出現などの問題がある。

[0003] 近年、腸内フローラのバランスを改善し、腸内の病原菌の増殖を抑制するために、プロバイオテイクスを用いる技術が注目されてヽる（特許文献 1、特許文献 2)。しかしながら、乳酸菌やビフィズス菌は、 0. 3%デォキシコール酸の濃度で死滅するものや pH4以下で死滅するものが多ぐ大腸菌群と総称される細菌以外は、胆汁酸のうち微生物に対して強!、抗菌性を持つデォキシコール酸の存在下で生存できな、菌種が多い。そこで、動物の消化管内でも死滅せず、宿主に有利な効果をもたらす菌種が探し求められている。

[0004] 一方、動物用の飼料をその加工段階で酵素や酵素生産菌で処理して、ある程度分解しておくことにより動物の胃腸の負担を軽減する技術などが、消化器系の疾病の予防や改善に有用であることが報告されている (特許文献 3)。また、麹菌を用いて魚粉を低水分で発酵させて、プロテアーゼ、リパーゼ等を高濃度に含有する魚用の魚粉発酵飼料を得る方法が知られている (特許文献 4)。しかしながら、このような技術においては、飼料中の水分含量を高め飼料の成分分解を行った後、乾燥して製品化するという煩雑な工程が必要であるという問題があった。さらに、成分分解のために水分の含量を高めた飼料は、腐敗菌ゃカビなどが発生しやすぐ品質の維持が困難であるなどの問題もあった。

また、麹菌の胞子を動物に経口投与することにより動物の糞を改質する方法が報告されているが、動物の腸内で炎症等を引き起こす有毒な細菌の増殖を抑制したり、体重増加を促進したりするという用途については検討されておらず、麹菌に酸性酵素を産生させた形態で動物に投与することも知られて、なヽ (特許文献 5)。

また、甲殻類の甲殻粉砕物に発酵栄養源を加えて混合し、これにァスペルギルス属菌を接種してキチンまたはキトサンを分解させて発酵物を得て、動物に与えることが記載されている（特許文献 6)。この方法による動物の成長促進効果は一部認められているが、動物腸内の病原菌の増殖を抑制し、腸内感染症を予防'治療することにつ、ては検討されておらず、そのような効果も認められて、な、。

一方で、ァスペルギルス ·ソーャ、ァスペルギルス ·タマリ、ァスペルギルス ·オリゼーは麹酸を産生することが報告されている（非特許文献 1)。また、麹酸は Aerobacter、 Alcaligenes、 Bacillus ^ Brucella^ ChromoDactenum、し lostndium、 Corynebactenum、 Diplococcus、 Eberthella、 Escherichia ^ Klebsiella^ Leptospira^ Micrococcus、 Neisseri a、 Pasteurella、 Proteus ^ Pseudomonas、 Salmonella^ Sarcina、 Shigella^ Serratia、 Spirill um、 Staphylococcus、 Streptococcus、 Vibrioに対して抗菌活'性を有すること力 S報告されている（非特許文献 2)。し力しながら、麹酸を投与したマウスで肝細胞腫瘍の発生が認められ、ラットにおいても麹酸の肝発ガン性の可能性が示唆されている。また、遺伝毒性の有無については明らかにはなっていないが、遺伝毒性を有する可能性についても否定はできない。すなわち、飼料において麹酸を含有させることについては注意が必要である。 [0006] 特許文献 1：特表 2005— 507670号公報

特許文献 2：特表 2004— 523241号公報

特許文献 3：特開 2004— 141147号公報

特許文献 4：特表平 6 - 319464号公報

特許文献 5：特開平 11— 171674号公報

特許文献 6：特開 2002— 238466号公報

特干文献 1： George A. Burdock, Madhusudan G. Soni, and Ioana G.し arabin (200 1) Regulatory Toxicology and Pharmacology 33, 80-101

非特許文献 2： Harry E. Morton, Walter Kocholaty, Renate Junowicz- Kocholaty, and Albert Kelner (1945) J. Bacteriol 50, 579—584

発明の開示

[0007] 本発明は、動物の消化活動を補助し、飼料効率を高めるための安全かつ簡便な手段を提供することを課題とする。具体的には、動物の消化器官内において増殖が可能な菌を利用して、動物の腸内の病原菌ゃコクシジゥムの増殖を抑えることにより感染症を予防'治療し、動物の体重増加を実現する手段を提供することを課題とする。

[0008] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ァスペルギルス ·ソーャ、ァスペルギルス'タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、ァスペルギルス' -ガ一及びァスペルギルス 'ォリゼ一が酸性酵素、とりわけ酸性アミラーゼの産生能力に優れること、これらの菌が、腸内感染症を引き起こす病原菌に対する抗菌活性及びコクシジゥムに対する殺原虫活性を有すること、及びこれらがプロバイオテイクスとして機能することを見出した。また、これらの菌の酸性酵素産生能は、玄米を栄養源として培養した場合に極めて優れることを見出した。そして、これらの菌体と菌体により産生された酸性酵素を組み合わせて飼料と共に動物に摂取させることにより、消化を促進し、腸内感染症を予防'改善し、動物の体重増加に寄与することを知見し、本発明を完成するに至った。

[0009] すなわち、本発明は、以下の通りである。

(1)ァスペルギルス'ソーャ（Aspergillus sojae)、ァスペルギルス'タマリ（Aspergillus t amarii)、ァスペルギルス'フォエティダス（Aspergillus foetidus)、ァスペルギルス ·二ガ一 (Aspergillus niger)及びァスぺノレギノレス ·オリゼー (Aspergillus oryzae)から選ばれる少なくとも一種の菌、並びにこれらの菌が産生する酸性酵素を含む培養物を含む、動物用飼料添加剤。

(2)前記菌が、ァスペルギルス'ソーャ及び Z又はァスペルギルス 'ォリゼ一である、 ( 1)に記載の動物用飼料添加剤。

(3)前記ァスペルギルス'オリゼ一が、ァスペルギルス'オリゼー IK—05074株（FE RM BP— 10622)又はこれと同じ酸性酵素を産生する能力を有する該菌株の変異株である（1)又は（2)に記載の動物用飼料添加剤。

(4)前記酸性酵素が、酸性アミラーゼである、（1)〜（3)の何れか一に記載の動物用飼料添加剤。

(5)前記菌が、動物の腸内感染症を引き起こす病原菌に対する抗菌活性及び Z又はコクシジゥムに対する殺原虫活性を有することを特徴とする、 (1)〜 (4)の何れか一に記載の動物用飼料添加剤。

(6)前記培養物が、植物性栄養源を含む（1)〜（5)の何れか一に記載の動物用飼料添加剤。

(7)前記植物性栄養源力玄米である（6)に記載の動物用飼料添加剤。

(8) (1)〜（7)の何れか一に記載の動物用飼料添加剤を含む飼料。

(9)菌の増殖のための栄養源を含む固体培地で、ァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス'タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、ァスペルギルス '二ガー及びァスぺルギルス ·ォリゼ一力選ばれる少なくとも一種の菌を培養し、得られた培養物^!司料に含有させることを特徴とする、飼料の製造方法。

発明を実施するための最良の形態

本発明の動物用飼料添加剤に含有するァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス- タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、ァスペルギルス' -ガー及びァスペルギルス -ォリゼ一は、当該技術分野において、麹菌の種の同定に一般的に用いられる方法により分類した場合に、それぞれ上記の種に分類される菌である。菌種の同定には、例ば、「H. Murakami, The Journal of General and Applied Microbiology, 17, p.281 -309, (1971)」、「村上英也，日本醸造協会誌，第 74卷，第 12号， p.849_853, (1979) 」、「Nikkuni, S., et al, The Journal of General and Applied Microbiology, 44, p.225- 230, (1998)」なども参照することができる。

[0011] ァスペルギルス'ソーャは、土壌、麹などに見出される糸状不完全菌類の一種で醤油、味噌の醸造に用いられる菌である。本発明の動物用飼料添加剤においては、以下に詳述する酸性酵素のうち少なくとも一種、好ましくは酸性アミラーゼを産生する能力を有しているものであって、動物に摂食させる上で安全なものであれば、特に制限なく用いることができる。本発明の動物用飼料添加剤においては、市販されている菌株を用いてもよぐこのような菌として、ァスペルギルス'ソーャ AOK 210株 (株式会社秋田今野商店)を好ましく用いることができる。

[0012] ァスペルギルス ·タマリは、土壌、麹、食品などに見出される糸状不完全菌類の一種で醤油、味噌の醸造に用いられる菌である。本発明の動物用飼料添加剤においては、以下に詳述する酸性酵素のうち少なくとも一種、好ましくは、酸性アミラーゼを産生する能力を有しているものであって、動物に摂食させる上で安全なものであれば、特に制限なく用いることができる。本発明の動物用飼料添加剤においては、市販されている菌株を用いてもよぐこのような菌として、ァスペルギルス'タマリ AOK 43株 (株式会社秋田今野商店)を好ましく用いることができる。

[0013] ァスペルギルス'フォエティダスは、土壌、麹、穀物かすなどに見出される糸状不完全菌類の一種で酒、味噌、醤油の醸造に用いられる菌である。本発明の動物用飼料添加剤においては、以下に詳述する酸性酵素のうち少なくとも一種、好ましくは、酸性アミラーゼを産生する能力を有しているものであって、動物に摂食させる上で安全なものであれば、特に制限なく用いることができる。本発明の動物用飼料添加剤においては、市販されている菌株を用いてもよぐこのような菌として、ァスペルギルス 'フォエティダス AOK N4586株 (株式会社秋田今野商店）を好ましく用いることができる。

[0014] ァスペルギルス '二ガーは、土壌、麹、穀物かすなどに見出される糸状不完全菌類の一種で酒類の製造、食品加工、糖の製造や医薬の製造などさまざまな場面で用いられる菌である。本発明の動物用飼料添加剤においては、以下に詳述する酸性酵素のうち少なくとも一種、好ましくは、酸性アミラーゼを産生する能力を有しているものであって、動物に摂食させる上で安全なものであれば、特に制限なく用いることができる。本発明の動物用飼料添加剤においては、市販されている菌株を用いてもよぐこのような菌として、ァスペルギルス ·-ガー AOK B650株 (株式会社秋田今野商店）を好ましく用いることができる。

[0015] また、 AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株又は AOK B650株の変異株を用いることもできる。変異株は、これらの菌株を自然変異させたり、化学的変異剤や紫外線等で変異処理して得られた菌株から、それぞれ AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株又は AOK B650株と同じ酸性酵素を産生する能力を有する菌株を選抜して得ることができる。また、酸性酵素を産生する能力に加え、上記菌株と同じ抗菌活性、殺原虫活性、胆汁酸耐性、耐酸性の少なくとも一つをさらに有する上記菌株の変異株を用いることも好ましい。また、さらに上記以外の菌学的性質も AOK 2 10株、 AOK 43株、 AOK N4586株又は AOK B650株と同様である変異株を用、ることも好まし、。

[0016] ァスペルギルス 'ォリゼ一は、土壌、麹などに見出される糸状不完全菌類の一種で醤油、味噌の醸造に用いられる菌である。本発明の動物用飼料添加剤においては、下記に詳述する酸性酵素のうち少なくとも一種、好ましくは酸性アミラーゼを産生する能力を有していて、動物に摂食させる上で安全なものであれば、特に制限なく用いることができる。本発明の動物用飼料添加剤においては、市販されている菌株を用いてもよく、このような菌としてァスペルギルス'オリゼー IK— 05074株を好ましく用いることができる。 IK— 05074株は、各種発酵食品から分離された株で、平成 18年 2月 1 5日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番号 FERM P— 20798として寄託され、平成 18年 6月 20日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FER M BP— 10622が付与されている。

[0017] IK— 05074株の菌学的性質は以下のとおりである。

(1)コロニーの性状（Czapek— Dox寒天培地（25°Cで 7日間培養））

大きさは直径 50〜60mm、色は黄から緑、時間の経過により褐色がかった色に変化する。菌糸体は目立たず、裏面は無色である。 (2)形態

分生子柄:薄壁〜厚壁、滑面〜わずかに粗面であり、直径は 20 /z m以下、長さは

2mm以下、頂のうは直径 40〜50 m、 m以下の球形。

基底梗子：大きな分生子柄のほとんどにおいて存在し、長さは 12 m以下。フィアライド：アンプル型、長さは 8〜12 μ m、短い頸部を有する。

分生子：直径 5〜6 /ζ πιの球形、色は黄力緑、表面は滑面〜微細な粗面。

[0018] 以上より、 ΙΚ 05074株は、ァスペルギルス'オリゼー（Aspergillus oryzae)に帰属すると推定された。

[0019] また、本発明の動物用飼料添加剤においては、 IK— 05074株の変異株を用いることもできる。 IK— 05074株の変異株は、 IK— 05074株を自然変異させたり、化学的変異剤や紫外線等で変異処理したりして得られた菌株カも IK— 05074株と同じ酸性酵素を産生する能力を有する菌株を選抜して得ることができる。また、酸性酵素を産生する能力に加え、 IK— 05074株と同じ抗菌活性、殺原虫活性、胆汁酸耐性、耐酸性の少なくとも一つをさらに有する IK— 05074株の変異株を用いることも好ましい。また、さらに上記以外の菌学的性質も IK— 05074株と同様である変異株を用いることも好まし、。

[0020] また、本発明の動物用飼料添加剤においては、例えば土壌、麹、食品、穀物かすなどから単離したァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス'タマリ、ァスペルギルス' フォエティダス、ァスペルギルス '二ガー、ァスペルギルス'オリゼーのうち、酸性酵素を産生する能力を有して、る菌株を単離して用いてもょ、。

[0021] 酸性酵素を産生する能力とは、菌体を培養して得られた培養物中に、酸性酵素活性を検出することができる程度に酸性酵素を産生することをいう。培養物の酸性酵素活性の検出は、常法に従って行うことができる。例えば、国税庁所定分析法 (改正第 3回税庁訓令第 1号)の固体こうじの分析法のダルコアミラーゼ活性測定法、 oc アミラーゼ活性測定法、耐酸性 α アミラーゼ活性測定法、酸性プロテアーゼ活性測定法及び酸性カルボキシぺプチダーゼ活性測定法に準拠して測定することができる。

[0022] また、本発明に用いるァスペルギルス ·ソーャ、ァスペルギルス ·タマリ、ァスペルギルス'フォェティダス、ァスペルギルス' -ガー、ァスペルギルス'オリゼ一は、動物の腸内感染症を引き起こす病原菌に対して抗菌活性を有していることが好ましい。上記病原菌は、通常腸内細菌科に属する。グラム陰性細菌に属する病原菌としては、病原性大腸菌（Escherichia coli)、サルモネラ属 (Salmonella)、カンピロバクタ一属（Campylobacter)に属する細菌が挙げられる。グラム陽性細菌に属する病原菌としてはクロストリジゥム属（Clostridium)、バチルス属（Bacillus)、リステリア属（Listeria)、スタフイロコッカス属 (Staphylococcus)、ストレプトコッカス属 (Streptococcus)に属する細菌が挙げられる。

病原性大腸菌としては、例えば、腸管侵入性大腸菌（Enteroinvasive E. coli: EIEC )、腸管毒素原性大腸菌 (Enterotoxigenic E. coli: ETEC)、腸管病原性大腸菌 (Ente ropathogenic E. con: EPEし)、

toxin producing E. coli ： STEC)、腸管凝集接着性大腸菌（Enteroaggregative E. coli: EAEC)などが挙げられる。サルモネラ属に属する細菌としては、 S. pullorum、 S. gallinarum、 S. typhi, S. ty phimurium、 S. enteritidis、 S. choleraesuis、 S. derby ^ S. dublinなど力举げられる。力ンピロパクター属に属する細菌としては、 C. jejuni, C. coli, C. fetus, C. fetus subsp. intestinalisなどが挙げられる。

クロストリジゥム属に属する細菌としては、 C. perfringens、 C. botulinum、 C. difficile などが挙げられる。バチルス属に属する細菌としては、 B. cereusなどが挙げられる。リステリア属に属する細菌としては、 L. monocytogenesなどが挙げられる。スタフイロコッカス属に属する細菌としては、黄色ブドウ球菌（S. aureus)などが挙げられる。ストレプトコッカス属に属する細菌としては、 S. suis、 S. pyogenesなどが挙げられる。本発明の動物用飼料添加剤に含まれる前記ァスペルギルス属菌は特にサルモネラ属細菌、中でも S. enteritidis及びクロストリジゥム属細菌、中でも C. perfringens,浮腫病菌などの大腸菌、黄色ブドウ球菌に対して高い抗菌活性を有する。

病原菌に対して抗菌活性を有するとは、病原菌と同一の培地に接種した場合に、病原菌の増殖を抑制する能力を有して、ることを、う。抗菌活性を有するァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス'タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、ァスぺノレギノレス.二ガー及びァスペルギルス.ォリゼ一は、例えば、土壌、麹などの分離源を Salmon ella ententiais (¾E 、 Clostridium perfringens (CP)、 Escnenchia coli (Eし)、 Staphylo coccus aureus (S A)などの病原菌を接種した寒天培地に添カ卩し、培養を行った後、阻止円を形成した菌体を分離することにより得ることができる。このようにして得た菌は、上述した病原菌の増殖を抑制する能力を有しているため、動物に投与することにより、動物の腸内感染症を予防 ·治療することができる。

また、動物の腸内感染症を引き起こす病原菌の増殖が抑制されていることは、例えば動物の盲腸内容物や糞中の病原菌の菌体濃度 (生菌数)を測定することなどにより確認することがでさる。

[0024] また、本発明に用いるァスペルギルス ·ソーャ、ァスペルギルス ·タマリ、ァスペルギルス'フォェティダス、ァスペルギルス' -ガー、ァスペルギルス'オリゼ一は、動物の腸内感染症を引き起こすコクシジゥムに対して殺原虫活性を有していることが好ましい。

コクシジゥムとは、胞子虫類（Sporozoasida亜綱）に属する原虫をいう。具体的には E lmeria属、 Isospora属、 ToxoplasmaJ¾、し ryptosporidium属なと; Ο²»^げられる。 Eimena 厲に J禹する原虫としては、 E. tenella、 E. necatrix、 E. acervulina、 E. maxima ^ E. mitis 、 E. zuernii、 E. bovisなどが挙げられる。 Isospora属に属する原虫としては、 I. suis、 I. belli, I. hominisなどが挙げられる。 Toxoplasma属に属する原虫としては、 T. gondiiなどが挙げられる。 Cryptosporidium属に属する原虫としては、 C. parvumなどが挙げられる。本発明の動物用飼料添加剤は、特に、 E. tenella, E. zuerniiによる感染症に対して好適に用いることができる。

[0025] コクシジゥムに対して殺原虫活性を有するとは、コクシジゥムのォーシストと菌の培養物を共存させた場合に、ォーシストの発芽 ·増殖を抑制し、好ましくはォーシストを減少させる能力を有していることをいう。具体的には、ォーシストの細胞壁を変形、溶解し、ォーシストを崩壊させる能力を有していることをいう。ォーシストの崩壊や細胞壁の状態は、顕微鏡を用いて観察すればよい。

コクシジゥムに対する殺原虫活性を有するァスペルギルス ·ソーャ、ァスペルギルス 'タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、ァスペルギルス '二ガー及びァスペルギルス 'オリゼ一は、例えば、以下の方法により得ることができる。土壌、麹などの分離源を E. tenellaや E. zuerniiのォーシストを懸濁させた滅菌水を入れたシャーレに加え、 37 °Cで培養を行い、 1〜7日間観察を行う。ォーシストの変形もしくは溶解が認められたシャーレから菌体を分離し、これを再度、 E. tenellaや E. zuerniiのォーシストを懸濁させた滅菌水を入れたシャーレに加え、 37°Cで培養を行い、ォーシストの変形もしくは溶解を確認する。このようにしてシャーレに含まれる菌を培養し、それぞれァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス'タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、ァスぺノレギノレス. -ガー、ァスペルギルス 'ォリゼ一の菌学的性質を有する菌を選ぶことにより、本発明に用いるァスペルギルス属菌を得ることができる。このようにして得た菌を動物に投与することにより、動物の腸内コクシジゥム感染症を予防 ·治療することができる。

[0026] また、上述したァスペルギルス属菌を投与することにより、コクシジゥムの増殖が抑制されているかについては、例えば動物の盲腸内容物や糞中のコクシジゥムのォーシストを顕微鏡下で観察することなどにより確認することができる。

[0027] 本発明の動物用飼料添加剤に含まれるァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス- タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、ァスペルギルス' -ガー、ァスペルギルス'ォリゼ一は、胃酸や胆汁酸に対する耐性を有しているものが好ましい。これにより、動物の腸内でも菌体が有用な酸性酵素を産生し、酸性酵素による消化補助の機能が持続すると考えられる。また、これらのァスペルギルス属菌が上述したような病原菌に対する抗菌活性を有している場合には、動物の腸内感染症を引き起こす病原菌の増殖を抑制し、腸内フローラのバランス改善にも寄与する。胃酸や胆汁酸に対して耐性を有するとは、通常の消ィ匕器官内の条件において菌が死滅することなぐ腸まで到達することをいう。通常、ヒトゃ動物の胃内部は空腹時には pH2あるいはそれ以下に達することがある力食物を摂取した状態では、胃内部の pHは 3. 5〜6の範囲で空腹時よりも高い。従って、本発明の飼料添加剤に用いることができる耐酸性を有する菌株は、例えば、分離源を pH3. 5で 2時間程度処理した場合に、生存する能力を有する菌株を選抜することで得ることができる。さら〖こ、このようにして選抜した菌をデォキシコール酸濃度 lOgZlの存在下で 24時間程度処理して、生存する能力を有する菌株を選抜することにより、本発明の飼料添加剤に用いるのに適した胃酸や胆汁酸に対する耐性を有している菌株を得ることができる。また、菌が死滅せず腸まで到達していることは、例えば、動物の排泄物中の菌体の濃度を測定するなどにより確認することができる。

[0028] 本発明の動物用飼料添加剤は、上述した菌種のうち、一種の菌株を単独で含有することもできるし、二種以上の菌株を組み合わせて含有することもできる。この中でも、ァスペルギルス ·ソーャ及びァスペルギルス ·ォリゼ一の少なくとも一種を含有することが好ましい。

[0029] 本発明の動物用飼料添加剤に含有するァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス- タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、ァスペルギルス' -ガー及びァスペルギルス -ォリゼ一の菌体濃度は、飼料添加剤を動物に投与した際に、菌体が消化器官内で死滅しない範囲であればよぐ通常は、酸性酵素活性を有する飼料添加剤を製造するために適当な濃度の菌体を培養し、飼料添加剤中の酸性酵素活性を適宜調節すればよい。

[0030] 本発明の動物用飼料添加剤に含まれる酸性酵素は、上記菌が産生する消化酵素であることが好ましぐ胃腸内の酸性条件下において失活せずに活性を有するものであれば特に制限されないが、中でも最適 pHを 2. 5〜5. 5に有するものが好ましい。例えば、酸性の a アミラーゼ、ダルコアミラーゼ、タカジ了スターゼ、プロテアーゼ、セノレラーゼ、リボヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ、キシラナーゼ、ぺクチナーゼ、リノーゼなどを挙げることができ、本発明の動物用飼料添加剤は、これらのうち一種又は二種以上を含有する。この中でも特に、家畜の飼料成分のうち主な成分の一つであるデンプンを分解する酸性のアミラーゼを含むことが好まし、。本発明の動物用飼料添加剤に含まれる酸性アミラーゼは、デンプンを加水分解する酸性酵素であれば特に制限されず、例えば、アミラーゼ、 13 アミラーゼ、ダルコアミラーゼなどが挙げられる。この中でも最適 pHを 3付近に有する耐酸性 α アミラーゼを好ましく挙げることがでさる。

本発明の動物用飼料添加剤は、ァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス'タマリ、ァスペルギルス'フォェティダス、ァスペルギルス ·二ガー、ァスペルギルス'オリゼーが産生する酸性酵素のうち少なくとも一種を含んでいればよいが、さらに他の菌種ゃ他の生物種由来の酵素を含んで!/、てもよ!/、。

[0031] 本発明の動物用飼料添加剤における酸性酵素の含有量は、動物の種類、体重などに応じて適宜調節することができる。通常は、国税庁所定分析法 (改正第 3回税庁訓令第 1号)の固体こうじの分析法に準拠して酸性酵素の活性を測定した場合、動物用飼料添加剤 lg当たりの酸性酵素活性の総和力 12, OOOU以上であることが好ましぐ 20, OOOU以上であることがさらに好ましい。特に、動物用飼料添加剤 lg当たりの酸性アミラーゼ活性が、 100U以上であることが好ましぐ 300U以上であることがさらに好ましい。また、酸性プロテアーゼ活性と酸性カルボキシぺプチダーゼ活性の総和が、 10, OOOU以上であることが好ましぐ 15, 000U以上であることがさらに好ましい。

[0032] 本発明の動物用飼料添加剤は、上述したァスペルギルス ·ソーャ、ァスペルギルス

'タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、ァスペルギルス '二ガー及びァスペルギルス 'オリゼ一のうち少なくとも一種の菌を培養し、酸性酵素を産生させることによって得ることができる。本発明の動物用飼料添加剤に用いるァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス'タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、ァスペルギルス '二ガー及びァスペルギルス 'ォリゼ一は、通常の培養条件で培養することにより酸性酵素を産生する。例えば、培養温度は 25°C〜40°Cで行うことができる力通常は 28〜32°Cで培養することが好ましい。また、培養方法は、往復動式振とう培養、ジャーフアーメンタ一培養などによる液体培養法や固体培養法を用いることができるが、上記菌体が有する酸性酵素産生遺伝子の中には、固体培地にお!ヽてのみ発現する遺伝子も存在するため、本発明にお、ては固体培養法を用いることが好ま U、。

[0033] 培養に用いる培地成分は、動物性又は植物性の何れを用いてもよいが、植物性の栄養源を含有することが好ましぐ例えば、玄米、フスマ、コメヌ力、大豆、大麦などを含有することが好ましい。この中でも、特に玄米を栄養源とすることが好ましい。これにより、酸性アミラーゼなどの酸性酵素の産生効率を高めることができる。

また、その他の炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜などの糖類、また窒素源としてアンモニア、硫酸アンモ-ゥム、塩化アンモ-ゥム、硝酸アンモ-ゥムなどのァンモ-ゥム塩や硝酸塩等を添加することもできる。

[0034] 本発明の動物用飼料添加剤にぉ、ては、このようにして得た培養物をそのまま動物用飼料添加剤とすることもできるし、得られた培養物から、菌体及び酸性酵素を含む一部を分離して、動物用飼料添加剤に含有させることもできる。例えば、固体培地を用いて菌体の培養を行う場合は、菌体を培地と共に粉砕したものを動物用飼料添加剤に含有させることが簡便性の面力好ましい。さらに、培養物を乾燥させたり、保存性を高めるための任意成分をさらに添加したりするなどの加工をして、製品の品質安定性を高めることも好まし、。

[0035] 乾燥方法は、特に制限されるものではなぐ例えば、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などにより行うことができる力この中でも通風乾燥が好ましく用いられる。また、凍結乾燥を用いることもできるが、その際には、保護剤を添加してもよい。保護剤の種類は、特に制限されないが、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム及び糖類力も一種又は二種以上を選択して用いるのが好ましい。また、糖類を用いる場合にその種類は特に制限されないが、グルコースやトレハロースを用いるのが好ましい。さらに、乾燥後は、得られた乾燥物に、脱酸素剤、脱水剤を加えて、ガスバリアー性のアルミ袋に入れて密封し、室温力低温で貯蔵することが好ましい。これにより、菌体を長期間生きたままで保存することが可能となる。

[0036] また、本発明の動物用飼料添加剤は、麹酸の含有濃度が低いことが好ましい。通常は、麹酸の含有濃度が 0. lmgZl以下であることが好ましぐ 0. OlmgZl以下であることがさらに好ましい。

[0037] また、本発明の動物用飼料添加剤は、通常用いられている動物用飼料の成分と混合して、動物の成長促進のための飼料とすることができる。また、上述したァスペルギルス属菌がさらに動物の腸内感染症を引き起こす病原菌に対する抗菌活性及び Z 又はコクシジゥムに対する殺原虫活性を有している場合には、病原菌及び Z又はコクシジゥムによる動物の腸内感染症を予防 '治療するための飼料とすることができる。飼料の種類や成分は、本発明の動物用飼料添加剤に含まれる菌体が死滅せず、かつ酸性酵素が失活しない限りにおいて特に制限されず、通常、家畜の飼料ゃぺットフード、動物用サプリメントなど、動物の飼料として用いられているものに添加することがでさる。

[0038] 本発明の飼料は、本発明の動物用飼料添加剤を飼料の成分に添加することにより製造することができる。本発明の飼料に含まれる動物用飼料添加剤の含有量は、与える動物の種類、体重、年齢、性別、使用目的、健康状態、飼料の成分などにより適宜調節することができ特に制限されないが、通常は飼料全量に対して、乾燥状態で 1 0〜5000ppm、好ましく ίま 50〜： LOOOppmとするの力よ!ヽ。

[0039] また、本発明の動物用飼料添加剤は、そのまま飼料成分に添加し、混合してもよヽ力粉末状、固形状の動物用飼料添加剤を添加、混合する場合は、飼料への混合を容易にするために液状又はゲル状の形態にして使用することもできる。この場合は、水、大豆油、菜種油、コーン油などの植物油、液体動物油、ポリビュルアルコールやポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物を液体担体として用いることができる。また、飼料中における菌体濃度の均一性を保っために、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、カゼインナトリウム、アラビアゴム、グァ一ガム、タマリンド種子多糖類などの水溶性多糖類を配合することも好ましい。また、雑菌の繁殖を防ぐために有機酸を配合し、液体生菌剤を酸性にすることもできる。

[0040] 本発明の飼料を摂取させる動物の種類は、特に制限されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などが挙げられる。この中でも、特に家禽、家畜に対して好適に用いることができる。動物に摂取させる飼料の量は、動物の種類、体重、年齢、性別、使用目的、健康状態、飼料の成分などにより適宜調節することができる。実施例

[0041] (1 - 1)耐酸性、胆汁酸耐性ァスペルギルス属菌の選抜

ポテトデキストロース寒天培地の pHを 5に調整し、 121°Cで 15分間殺菌した。この寒天培地の温度が 60°Cまで低下したところでデォキシコール酸ナトリウムを培地 1L 当たり 10gの濃度で添加し、株式会社秋田今野商店（日本国秋田県大仙巿刈和野 2 48)に保存されているァスペルギルス属菌を接種したところ、ァスペルギルス'ソーャ (Aspergillus sojae)、ァスペルギルス'タマリ（Aspergillus tamarii)、ァスペルギルス'フォエティダス (Aspergillus foetidus)及びァスぺノレギノレス ·二ガー (Aspergillus niger)が培地に良好に生育した。その中でも、ァスペルギルス'ソーャ AOK 210株、ァスぺルギルス'タマリ AOK 43株、ァスペルギルス'フォエティダス AOK N4586株、及びァスペルギルス ·二ガー AOK B650株が特に良好に生育した。

[0042] (1 - 2)耐酸性、胆汁酸耐性ァスペルギルス属菌の選抜上記と同様にデォキシコール酸ナトリウムを含有する培地に、各種発酵食品を分離源として多くのァスペルギルス属菌を接種し、培地に生育してきた菌株のうち、最も生育の良好な株を選抜した。この株を、ァスペルギルス'オリゼー IK— 05074株とし、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。

IK— 05074株の菌学的性質は、上述したとおりである。

[0043] (2— 1)菌種の比較実験

(a)菌体の培養及び酸性酵素活性の測定

玄米を固体培地として、（1— 1)で選抜した AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4 586株及び AOK B650株の培養を行った。すなわち、玄米 100gを一昼夜水に浸けて膨潤させた後、蓋に無菌フィルターの付いた直径 14センチ、深さ 10センチのポリカーボネート製容器に 2センチの厚さとなるように入れ、オートクレープにて 121°C で 15分間殺菌した。この容器に上記の各菌体を接種して 28°Cで 5日間培養し、種菌を製造した。

次いで、上記と同様に膨潤させた玄米を 30 X 40 X 10センチのステンレスバットに 1 . 5センチの厚さとなるように積層し、 20 X 25センチのフィルターで覆った通気口を有する蓋をかけ、大型オートクレープに入れて 121°Cで 25分間殺菌した。このバットを冷却した後、あらかじめ培養しておいた上記種菌を全量接種した。このバットを 28°C の孵卵器に入れ、 7日間培養した。

培養後、 35°Cで通風乾燥し、ジェットミルで粉砕し、それぞれの菌種について固体培養物を得た。また、ァスペルギルス'カヮチ（Aspergillus kawachii) AOK 1006s株 (株式会社秋田今野商店）についても上記と同様にして固体培養物を得た。

[0044] それぞれの固体培養物 lg当たりの耐酸性 a アミラーゼ活性、及び酸性プロテアーゼ活性と酸性カルボキぺプチダーゼ活性の総和を測定した。結果を表 1に示す。なお、上記酸性酵素の測定は、国税庁所定分析法 (改正第 3回税庁訓令第 1号)の固体こうじの分析法の耐酸性ひ—アミラーゼ活性測定法、酸性プロテアーゼ活性測定法及び酸性カルボキシぺプチダーゼ活性測定法に準拠して行った。

[0045] (b)投与試験

上記で得た菌株の鶏ヒナへの投与試験を行った。上記で得た AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650株の固体培養物を、飼料（SDブロイラー前後期用、日本配合飼料株式会社製)全質量に対して、 100ppm、 150ppmの濃度で飼料に混合し、実施例 1〜8とした。また、 AOK 1006s株の固体培養物を同様に飼料に混合したものを比較例 1及び 2とした。また、オートクレープ殺菌をして菌を添加せずに乾燥した玄米を 150ppmの濃度で飼料に混合し、対照区とした。投与試験は 10羽を一群として、孵化後 1週間目の鶏ヒナに上記飼料を 28日間自由に摂取させて肥育した。孵化後 35日目の各群の鶏ヒナの平均体重を表 1に示す。

[0046] [表 1]

[0047] AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650株の固体培養物の耐酸性ひ—アミラーゼ活性は、 AOK1006S株を培養して得られた培養物の耐酸性 a—アミラーゼ活性の 4倍以上であった。また、酸性プロテアーゼ活性及び酸性カルボキシぺプチダーゼ活性の総和も約 2. 5倍〜 6倍であった。これより、上記 4種の菌は、酸性アミラーゼ、酸性プロテアーゼ及び酸性カルボキシぺプチダーゼの産生能力に優れていることが分かる。この中でも、特に、 AOK 210株は、酸性アミラーゼ、酸性プロテアーゼ及び酸性カルボキシぺプチダーゼの全ての産生能力に優れて!/ヽることが分力ゝる。

[0048] 本発明の動物用飼料添加剤を含む飼料を投与した実施例 1〜8の群の鶏ヒナの体重は、比較例 1及び 2の群の鶏ヒナの体重に比してより増加していた。これにより、本発明の動物用飼料添加剤を含む飼料は、動物の成長を促進する効果に優れることが分かる。特に、 AOK 210株を用いて製造した動物用飼料添加剤を含む飼料は、動物の体重の増加を促進する効果に優れることが分かる。 [0049] (2— 2)菌種の比較実験

(a)菌体の培養及び酸性酵素活性の測定

玄米を固体培地として、（1— 2)で選抜した IK—05074株の培養を行った。培養は、 10日間培養して種菌を製造したこと、及びこの種菌を全量接種して 10日間培養したことを除いては、上記と同様にして行った。また、ァスペルギルス'カヮチ AOK 10 06s株の培養も同様に行った。培養後、上記と同様にしてこれらの固体培養物を得た。

[0050] 次に、ポテトデキストロース液体培地を 121°C、 15分殺菌した後、 60°Cまで低下したところでデォキシコール酸ナトリウムを培地 1L当たり 5gの濃度で添加した培地に、 I K— 05074株を接種し、 28°Cで 6日間培養した。この培養物を 0. 4 μ mのフィルターでろ過し、菌体を集めた。集めた菌体に培養前の培地を流して 3回洗浄し、菌体外酵素を除去した。次いで、菌体に培地成分を添加し、 36°Cで 24時間通風乾燥し、酸性酵素を含まな、IK 05074株の固体培養物を得た。

[0051] それぞれの固体培養物 lg当たりの耐酸性 a アミラーゼ活性、及び酸性プロテアーゼ活性と酸性カルボキぺプチダーゼ活性の総和を、 (2 - 1) (a)と同様の方法で測定した。結果を表 2に示す。

[0052] (b)投与試験

IK— 05074株の鶏ヒナへの投与試験を（2—1) (b)と同様の方法で行った。上記で得た IK— 05074株の固体培養物を 100ppm、 150ppmの濃度で飼料に混合したものをそれぞれ実施例 9及び 10とした。また、ァスペルギルス'力ヮチの固体培養物を同様に飼料に混合したものを比較例 3及び 4とし、酸性酵素を除去した IK— 0507 4株の固体培養物を 150ppmの濃度で飼料に混合したものを比較例 5とした。また、オートクレープ殺菌をして菌を添加せずに乾燥した玄米を 150ppmの濃度で飼料に混合し、対照区とした。投与試験は 10羽を一群として、孵化後 1週間目の鶏ヒナに上記飼料を 48日間自由に摂取させて肥育した。孵化後 55日目の各群の鶏ヒナの平均体重を表 2に示す。

[0053] [表 2] 耐酸性 α—ァ酸性プロテア -セ'

添加量 55日目の菌株ミラ-セ'活性酸性カルホ 'キジへ。プチダーセ'

(U) の活性総和（U) (ppm) 平均体重 (g) 実施例 9 A. oryzaelK— 05074 100 5430 実施例 1 0 A. oryzaelK— 05074 4208 51280 150 6120 比較例 3 A. kawachii AOK 1006s 100 5120 比較例 4 A. kawachii AOK 1006s 74 8316 150 5340 比較例 5 A. oryzaelK— 05074(酸性酵素除去）ぐ 10 <2000 150 5390 対照区一 ― ― 150 4960

[0054] ァスペルギルス 'ォリゼ一 IK— 05074株を培養して得られた培養物の耐酸性 α— アミラーゼ活性は、ァスペルギルス'力ヮチを培養して得られた培養物の耐酸性ひ— アミラーゼ活性の約 57倍であった。また、酸性プロテアーゼ活性及び酸性カルボキシぺプチダーゼ活性の総和も約 6倍であった。これより、 ΙΚ— 05074株は、酸性アミラーゼ、酸性プロテアーゼ及び酸性カルボキシぺプチダーゼの産生能力に優れており、特に酸性アミラーゼの産生能力に優れて、ることが分かる。

[0055] 本発明の動物用飼料添加剤を含む飼料を投与した実施例 9及び 10の鶏ヒナの体重は、比較例 3〜5の群の鶏ヒナの体重に比して増加していた。これにより、本発明のァスペルギルス 'ォリゼ一及びこれが産生する酸性酵素を含有する動物用飼料添カロ剤を含む飼料は、動物の成長を促進する効果を有することが分かる。

[0056] (3)固体培地の比較実験

(a)菌体の培養及び耐酸性 α—アミラーゼ活性の測定

玄米、大麦及び破砕大豆を固体培地として、 ΑΟΚ 210株の培養を行った。すなわち、玄米、大麦及び破砕大豆それぞれ lOOgを一晩水に浸けて膨潤させた後、それぞれ 30 X 40 X 5センチのステンレスバットに厚さ 2. 0センチに積層し、表面をろ紙で覆った後、さらにステンレスの蓋をかけ、大型オートクレーブに入れて 121°C30分間殺菌した。このバットを冷却した後、（2—1) (a)で培養しておいた種菌全量を分けて各培地に接種した。このバットを 28°Cの孵卵器に入れ、 5日間培養した。

培養後、 35°Cで通風乾燥し、ジェットミルで粉砕し、固体培養物を得た。それぞれの固体培養物の耐酸性 α—アミラーゼ活性を測定した。結果を表 3に示す。なお、耐酸性 α—アミラーゼ活性の測定は、上記と同様である。

[0057] (b)投与試験

上記で得られた乾燥固体培養物の鶏ヒナへの投与試験を行った。上記固体培養物を、飼料 (SDブロイラー前後期用、日本配合飼料株式会社製)全質量に対して 50 ppm、 lOOppmの濃度で飼料に混合し、実施例 11〜16とした。また、オートクレーブ殺菌をして菌を添加せずに乾燥した玄米を lOOppmの濃度で飼料に混合し、対照区とした。投与試験は 10羽を一群として、孵化後 1週間目の鶏ヒナに上記飼料を 35 日間自由に摂取させて肥育した。孵化後 42日目の各群の鶏ヒナの平均体重を表 3 に示す。

[0058] [表 3]

[0059] 玄米を固体培地成分として得た培養物の耐酸性 a アミラーゼ活性は、大豆、大麦を固体培地成分として得た培養物の耐酸性 α—アミラーゼ活性に比して約 1. 5倍であり、明らかに高力つた。これより、玄米を固体培地成分として用いた場合に、特に酸性アミラーゼの産生能力が増大することが分かる。

[0060] 本発明の動物用飼料添加剤を含む飼料を投与した実施例 11〜16の群の鶏ヒナの体重は、何れも対照区の鶏ヒナの体重に比してより増加していた。特に、玄米を固体培地成分として製造した動物用飼料添加剤を含む本発明の飼料は、体重の増加を促進する効果に優れてヽることが分かる。

[0061] (4 1)ァスペルギルス属菌の培養物の抗菌活性の測定

ΑΟΚ 210株、 ΑΟΚ 43株、 ΑΟΚ Ν4586株及び ΑΟΚ Β650株と病原菌を共培養することによってこれらの菌の病原菌に対する抗菌活性を試験した。

[0062] Salmonella enteritidis (SE)については、標準寒天培地にて 37°C、 24時間好気培養を行った。平板上に発育したコロニーをかきとり滅菌生理食塩水に浮遊させた。 1L 容の三角フラスコにブレインハートインフュージョンブイヨン「日水」 500mlを作製し、オートクレーブ殺菌後、 SEの最終濃度が約 1. 0 X 10⁴〜1. 0 X 10⁵CFU/mlとなるよう無菌的に投入した。三角フラスコに、 (2- 1) (a)で得た AOK 210株、 AOK 43 株、 AOK N4586株及び AOK B650株の粉砕固体培養物を、おのおの 5gずつ無菌的に投入し、実施例 17〜20とした。 AOK 1006s株の粉砕固体培養物 5gを無菌的に投入した三角フラスコを比較例 6とし、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。おのおのの三角フラスコを 37°Cの恒温器で、好気条件下で緩攪拌培養した。

[0063] Clostridium perfringens (CP)につ!/、ては、ァネロパックケンキ（三菱ガス化学 (株）製)を用い、卵黄加 CW寒天培地（日水製薬 (株)製）にて 37°C、 24時間嫌気培養を行った。平板上に発育したコロニーを力きとり滅菌生理食塩水に浮遊させた。 1L容の三角フラスコにブレインハートインフュージョンブイヨン「日水」 500mlを作製し、ォ一トクレーブ殺菌後、 CPの最終濃度が約 1. O X 10⁴〜1. 0 X 10⁵ CFUZmlとなるよう無菌的に投入した。三角フラスコに、 (2- 1) (a)で得た AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650株の粉砕固体培養物を、おのおの 5gずつ無菌的に投入し、実施例 21〜24とした。 AOK 1006s株の粉砕固体培養物 5gを無菌的に投入した三角フラスコを比較例 7とし、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。おのおのの三角フラスコを 37°Cの恒温器で、ァネロパックケンキを用いて嫌気条件下で緩攪拌培養した。

[0064] 試験開始後、 0日、 3日、 7日目にお、て SEおよび CPの生菌数測定を実施した。 S Eの生菌数測定方法は、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で 10倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の 0. 1mlを X— SAL寒天培地「日水」に塗布し、 37°C、 24 時間好気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。 CPの生菌数測定方法は、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で 10倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の 0. 1mlを卵黄加 CW寒天培地（日水製薬 (株)製）に塗布し、ァネロパックケンキを用いて 37°C、 24時間嫌気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。

[0065] また、同時に麹酸濃度を定量するため、培養液を 8, OOOrpmで 10分間遠心分離し、その上清をセルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター（孔径 0. 45 ^ m, アドバンテック東洋（株）製）で濾過した。 HPLC装置は、 Waters600(Multisolvent Del lvery system)及び waters 490E(Programmable multiwavelength Detector)を用ヽ 7こ。カラムは、 YMC-Pack ODS-AM 6.0mm X 150mm (ヮイエムシイネ土製）を用いた。移動相は 0. ImolZlリン酸二水素ナトリウム溶液 (PH3. 0)—メタノール（97 : 3)、流速は 1. Oml/min,カラム温度は 40°C、測定波長は 270nmで麹酸の検出を行った。検量線は麹酸 (試薬特級、和光純薬工業 (株)製品)を用いて作製した。

表 4に SEの生菌数を、表 5に SEの共培養試験の培養物の麹酸濃度を、表 6に CP の生菌数を、表 7に CPの共培養試験の培養物の麹酸濃度を示す。

[0066] [表 4]

[0067] [表 5]

[0068] [表 6] CP生菌数（CFUZml)

試験 0曰目試験 3曰目試験 7曰目実施例 21 CP +ァスへ。ルキ *ルス-ソ一ャ AOK 210 9. 6 <1. O 実施例 22 CP +ァスへ Ίレキ'ルス-タマリ AOK 43 9. 10⁴ 3. 9 10⁴ 7. 2x 10³ 実施例 23 CP +ァスへ Ίレキ 'ルス'フ才ェ亍イタ 'ス AOK N4586 9. 6 10⁴ 6. 2 10⁴ 5. 実施例 24 CP +ァスへ。ルキ Ίレス ·二力'一 AOK B650 9. 10⁴ 4. 10⁴ 5. Ox 10³ 比較例 7 CP +ァスへ。ルキ 'ルス -カヮチ AOK 1006s 9. 6x 10⁴ 3. 5. 2x 10⁴ 対照区 CPのみ 9. 6 10⁴ 4. 8 10⁵ 1. O 10⁶

[0069] [表 7]

[0070] 実施例 17〜20に示すように、 AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び A OK B650株の固体培養物は、比較例 6に示す AOK 1006s株の固体培養物に比ベ明らかに高い SEに対する抗菌活性を示した。特に AOK 210株と共培養した場合は SEの生菌数が試験 3日目以降から検出限界以下となり、最も高い抗菌活性が認められた。また、 AOK 43株についても、試験 7日目には SEの生菌数が検出限界以下となった。なお、対照区においては試験 7日目まで菌数の上昇が認められ、 7日目に 2.8X10⁸CFUZmlを示した。

また、何れの懸濁液においても麹酸含量は検出限界以下であった。

[0071] 実施例 21〜24に示すように、 AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び A OK B650株の固体培養物は、比較例 7に示す AOK 1006s株の固体培養物に比ベ明らかに高い CPに対する抗菌活性を示した。特に AOK 210株と共培養した場合は CPの生菌数が試験 3日目以降から検出限界以下となり、最も高い抗菌活性が認められた。対照区については試験 7日目まで菌数の上昇が認められ、 7日目に 1. 0 X 10⁶CFU/mlを示した。

[0072] Escherichia coli(EC)につ、ては、標準寒天培地（日水製薬 (株)製）にて 37°Cで 24 時間好気培養した。平板上に発育したコロニーをカゝき取り、滅菌生理食塩水に浮遊させた。 1L容の三角フラスコにブレインハートインフュージョンブイヨン「-ッスィ」（日水製薬 (株)製) 500mlを作製し、オートクレープ殺菌後、 ECの最終濃度が約 1. 0 X 10⁵〜1. 0 X 10⁶CFU/mlとなるよう無菌的に投入した。三角フラスコに、（2—1) (a )で得た AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650株の粉砕固体培養物を、おのおの 5gずつ無菌的に投入し、実施例 25〜28とした。 AOK 1006 s株の粉砕固体培養物 5gを無菌的に投入した三角フラスコを比較例 8とし、麹菌培養物をカ卩えない三角フラスコを対照区とした。おのおのの三角フラスコを 37°Cの恒温器で、好気条件下で緩攪拌培養した。

[0073] Staphylococcus aureus (SA)につ!/、ては、標準寒天培地にて 37°Cで 24時間好気培養した。平板上に発育したコロニーをカゝき取り、滅菌生理食塩水に浮遊させた。 1L 容の三角フラスコにブレインハートインフュージョンブイヨン「-ッスィ」（日水製薬 (株）製） 500mlを作製し、オートクレープ殺菌後、 SAの最終濃度が約 1. 0 X 10⁵〜1. 0 X 10⁶CFUZmlとなるよう無菌的に投入した。三角フラスコに、 (2- 1) (a)で得た A OK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650株の粉砕固体培養物を、おのおの 5gずつ無菌的に投入し、実施例 29〜32とした。 AOK 1006s株の粉砕固体培養物 5gを無菌的に投入した三角フラスコを比較例 9とし、麹菌培養物をカロえない三角フラスコを対照区とした。おのおのの三角フラスコを 37°Cの恒温器で、好気条件下で緩攪拌培養した。

[0074] 試験開始後、 0日、 3日、 7日目にお、て ECおよび SAの生菌数測定を実施した。 E Cの生菌数測定方法は、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で 10倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の 0. 1mlをクロモカルトコリフォームァガー「Merck」 (Merck 製）に塗布後、 37°C、 24時間好気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。 SAの生菌数測定方法は、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で 10倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の 0. 1mlを卵黄加マンニット食塩培地「栄研」（栄研器材 (株)製）に塗布後、 37°C、 48時間好気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。

表 8に ECの生菌数を、表 9に SAの生菌数を示す。

[表 8]

実施例 25〜28に示すように、 AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び A OK B650株の固体培養物は、比較例 8に示す AOK 1006s株の固体培養物に比ベ明らかに高い ECに対する抗菌活性を示した。特に、 AOK 210株と共培養した場合は ECの生菌数が試験 3日目以降から検出限界以下となり、最も高い抗菌活性が認められた。また、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650株についても、試験 7日目には ECの生菌数が検出限界以下となった。なお、対照区においては試験 7 日目まで菌数の上昇が認められ、 7日目に 1. O X 10⁷CFUZmlを示した。 [0078] 実施例 29〜32に示すように、 AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び A OK B650株の固体培養物は、比較例 9に示す AOK 1006s株に比べ明らかに高い SAに対する抗菌活性を示した。特に、 AOK 210株と共培養した場合は SAの生菌数が試験 3日目以降から検出限界以下となり、最も高い抗菌活性が認められた。また、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650株【こつ!ヽても、試験 7曰目【こ ίま SA の生菌数が検出限界以下となった。対照区については試験 7日目まで菌数の上昇が認められ、 7日目に 7. 2 Χ 10⁷CFUZmlを示した。

[0079] (4 2)ァスペルギルス ·ォリゼ一の培養物の抗菌活性の測定

IK 05074株と病原菌を共培養することによって、 IK 05074株の病原菌に対する抗菌活性を (4 1)と同様の方法で試験した。

[0080] Salmonella enteritidis (SE)と、（2— 2) (a)で得た IK— 05074株の粉砕固体培養物をカ卩えた三角フラスコを実施例 33、 SEと AOK 1006s株の粉砕固体培養物を加えた三角フラスコを比較例 10、麹菌培養物を加えな!/、三角フラスコを対照区とした。

[0081] Clostridium 61"1¾¾6^ (じ？）と（2— 2) (a)で得た IK— 05074株の粉砕固体培養物をカ卩えた三角フラスコを実施例 34、 CPと AOK 1006s株の粉砕固体培養物をカロえた三角フラスコを比較例 11、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。

[0082] 試験開始後、 0日、 3日、 7日目にお、て SEおよび CPの生菌数測定を実施した。また、同時に麹酸濃度を定量した。

表 10に SEの生菌数を、表 11に SEの共培養試験の培養物の麹酸濃度を、表 12に CPの生菌数を、表 13に CPの共培養試験の培養物の麹酸濃度を示す。

[0083] [表 10]

[0084] [表 11] 麴酸含量（mgZL)

試験 0曰目試験 3日目試験 7曰目実施例 33 SE +ァスルキ ·ルス-才リセ-一 IK-05074 <0. 1 <0. 1 <0. 1 比較例 10 SE +ァスへ'ルキ'ルス-力ヮチ AOK 1006s <0. 1 <0. <0.

対照区 SEのみ表 12]

CP生菌数（CFU ml) 試験 0曰目試験 3曰目試験 7曰目実施例 34 CP +ァスへ'ルキ'ルス'才リセ'一 IK-05074 5. 0 0⁴ <1. 0 10² <1. 10² 比較例 1 CP +ァスベ'ルキ'ルス-力ヮチ AOK 1006s 5 3. 対照区 CPのみ 5. O 10" 6. 1 X 10⁶ 1. 3 10⁶ 表 13]

麹酸含 S(mg/L) 試験 0曰目試験 3日目試験 7曰目実施例 34 CP +ァスへ'ルキ Ίレス-オリセ IK-05074 <0. 1 <0. 1 <0. 1 比較例 11 CP +ァスへ'ルキ 'ルス-力ヮチ AOK 1006s <0. 1 <0. 1 <0. 1 対照区 CPのみ 1 1

[0087] 実施例 33に示すように、 IK— 05074株と共培養した場合には、 SEの生菌数が試験 3日目以降から検出限界以下となり、比較例 10に示す AOK 1006s株の固体培養物に比べ明らかに高い SEに対する抗菌活性を示した。なお、対照区においては試験後、菌数の上昇が認められ、 3日目に 3.3X 10⁸CFUZmlを示した。

[0088] 実施例 34に示すように、 IK— 05074株と共培養した場合には、 CPの生菌数が試験 3日目以降から検出限界以下となり、比較例 11に示す AOK 1006s株の固体培養物に比べ明らかに高い CPに対する抗菌活性を示した。対照区については試験 7 日目まで菌数の上昇が認められ、 7日目に 1.3X10⁶CFUZmlを示した。

[0089] Escherichia coli(EC)と（2— 2) (a)で得た IK— 05074株の粉砕固体培養物をカロえた三角フラスコを実施例 35、 ECと AOK 1006s株の粉砕固体培養物を加えた三角フラスコを比較例 12、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。

[0090] Staphylococcus aureus (SA)と（2— 2) (a)で得た IK 05074株の粉砕固体培養物をカ卩えた三角フラスコを実施例 36、 CPと AOK 1006s株の粉砕固体培養物をカロえた三角フラスコを比較例 13、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。

[0091] 試験開始後、 0日、 3日、 7日目にお、て ECおよび SAの生菌数測定を実施した。

表 14に ECの生菌数を、表 15に SAの生菌数を示す。

[0092] [表 14]

[0094] 実施例 35に示すように、 IK— 05074株と共培養した場合は ECの生菌数が試験 3 日目以降から検出限界以下となり、比較例 12に示す AOK 1006s株の固体培養物に比べ明らかに高い ECに対する抗菌活性を示した。なお、対照区においては試験後菌数の上昇が認められ、 3日目に 4. O X 10⁸CFUZmlを示した。

[0095] 実施例 36に示すように、 IK— 05074株と共培養した場合は SAの生菌数が試験 3 日目以降から検出限界以下となり、比較例 13に示す AOK 1006s株の固体培養物に比べ明らかに高い SAに対する抗菌活性を示した。対照区については試験後菌数の上昇が認められ、 3日目に 3. 7 X 10⁸CFUZmlを示した。

[0096] (5— 1)鶏ヒナに対する Salmonella enteritidis攻撃試験鶏ヒナの飼料 (SDブロイラー前期用、日本配合飼料 (株)製、抗菌性物質無添加飼料）全質量に対して、（2— l) (a)で得た AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586 株及び AOK B650株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した飼料を、おのおの実施例 37〜40とした。ブロイラー種鶏 (銘柄:チャンキー)由来の種卵より孵化した鶏ヒナ 12羽を一群として、実施例 37〜40の飼料を、 14日間与えた。一方、 A OK 1006s株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した飼料を、比較例 14 とした。麹菌培養物の代わりに乳糖を lOOppm混合した飼料を対照区とし、同様に試験を行った。 7日齢で 1羽当たり 1. 8 X 10⁵CFUの Salmonella enteritidis(SE)を経口投与した。 SEは、群馬県の養鶏業者の農場で死亡した鶏の盲腸内容物より分離した菌株を用いた。 14日齢で盲腸内容物と、総排泄腔を綿棒で拭うことにより糞を採取した。

盲腸内容物の SE生菌数を以下の方法により測定し、感染指数及び防御指数を算出した。

盲腸内容物 lgを滅菌リン酸緩衝生理食塩水を加えて 10倍に希釈し、十分混合して試料原液とした。ついで、試料原液を滅菌生理食塩水を用いて 10倍で段階希釈し、段階希釈液とした。試料原液及び段階希釈液をそれぞれ SS寒天平板培地「-ッスィ」（日水製薬 (株)製）およびブリリアントグリーン寒天平板培地 (Difco Laboratories 製)〖こ 0. 1mlずつ塗沫し、 37°Cで 24時間培養し、各平板培地に生育した典型的な S Eのコロニー数を測定した。さらに、コロニーより釣菌してリジン脱炭酸試験用、 SIM 寒天培地「-ッスィ」 (日水製薬 (株)製)および TSI寒天培地「-ッスィ」 (日水製薬 (株) 製）に接種して 37°Cで 24時間培養して性状の確認を行った。

この中から SEと認められたコロニー数に希釈液の希釈倍率を乗じて盲腸内容物 lg 当たりの SE生菌数を算出した。この結果を元に、以下のようにして感染指数及び防御指数を算出した。感染指数とは、病原菌の感染率の高さを示す値であり、防御指数とは、麹菌を含まな、飼料を投与した場合と比較した場合のそれぞれの飼料が病原菌の感染を防御する能力を示す値である。

感染指数：各個体の盲腸内容物中の SE生菌数の対数の平均値 (log CFUZgの平均値）防御指数：対照区の感染指数 Z各試験区の感染指数

[0098] 総排泄腔より採取した糞に関しては、以下の方法により個体別に定性培養を行うことにより SEの性状を確認した。すなわち、綿棒に付着した糞を 10mlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、試料原液とした後、これを SS寒天平板培地およびプリリアントグリーン寒天平板培地に 0. 1mlずつ塗沫し、 37°Cで 24時間培養し、各平板培地に生育した典型的な SEのコロニー形成の有無を判定した。さらに、コロニーより釣菌して LIM寒天培地「-ッスィ」（日水製薬 (株)製）、 SIM寒天培地および TSI寒天培地に接種して 37°Cで 24時間培養して性状の確認を行った。

結果を表 16に示す。

[0099] [表 16]

[0100] 実施例 37〜40の AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650 株を含む飼料を投与した鶏ヒナは、盲腸内容物の SEの菌体濃度が極めて低ぐ SE の感染指数はきわめて低力つた。特に実施例 37では高い防御指数が得られた。比較例 14の AOK 1006s株を含む飼料を投与したヒナは、対照区と比較して SEの生菌数に変化がなかった。これより、本発明のァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス 'タマリ、ァスペルギルス'フォェティダス、及びァスペルギルス '二ガーが産生する酸性酵素を含む培養物には SEによる感染症を予防する効果がある事が示された。

[0101] (5— 2)鶏ヒナに対する Salmonella enteritidis攻撃試験

(2- 2) (a)で得た IK— 05074株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した鶏ヒナの飼料を実施例 41とし、 AOK 1006s株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した飼料を比較例 15とし、麹菌培養物の代わりに乳糖を lOOppm混合した飼料を対照区とし、これらの飼料を用いて鶏ヒナを飼育し、 SE攻撃試験を行った。試験方法は、 2. O X 10⁵CFUの SEを経口投与したこと以外は、上記と同様である結果を表 17に示す。

[0102] [表 17]

[0103] 実施例 41の IK— 05074株を含む飼料を投与した鶏ヒナは、盲腸内容物の SEの菌体濃度が極めて低ぐ SEの感染指数はきわめて低力つた。比較例 15の AOK 10 06s株を含む飼料を投与したヒナは、対照区と比較して SEの生菌数にほとんど変化がなかった。これより、本発明のァスペルギルス'ォリゼ一が産生する酸性酵素を含む培養物には SEによる感染症を予防する効果がある事が示された。

[0104] (6— 1)鶏ヒナに対する Clostridium perfringens攻撃試験

鶏ヒナの飼料 (SDブロイラー前期用、日本配合飼料 (株)製、抗菌性物質無添加飼料）全質量に対して、（2— l) (a)で得た AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586 株及び AOK B650株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した飼料を、おのおの実施例 42〜45とした。ブロイラー種鶏 (銘柄:チャンキー)由来の種卵より孵化した鶏ヒナ 12羽を一群として、実施例 42〜45の飼料を、 14日間与えた。一方、 A OK 1006s株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した飼料を、比較例 16 とした。麹菌培養物の代わりに乳糖を lOOppm混合した飼料を対照区とし、同様に試験を行った。 7日齢で 1羽当たり 1. 1 X 10⁹CFUの Clostridium perfringens (CP)を経口投与した。 CPは、群馬県の養鶏業者の農場で死亡した鶏の盲腸内容物より分離した菌株を用いた。 14日齢で盲腸内容物と、総排泄腔を綿棒で拭うことにより糞を採取した。

[0105] 盲腸内容物の CP生菌数を以下の方法により測定し、感染指数及び防御指数を算出した。

盲腸内容物 lgを滅菌リン酸緩衝生理食塩水を加えて 10倍に希釈し、十分混合して試料原液とした。ついで、試料原液を滅菌生理食塩水を用いて 10倍で段階希釈し、段階希釈液とした。試料原液および段階希釈液をそれぞれクロストリジァ測定用培地（日水製薬 (株)製）に 0. 1mlずつ塗沫し、ァネロパックケンキを用いて 35°Cで 24 時間嫌気培養し、各平板培地に生育した黒色集落数を測定した。さらに、コロニーより釣菌して卵黄加 CW寒天培地（日水製薬 (株)製）に接種して、 35°Cで 24〜48時間好気および嫌気培養しで性状の確認を行った。

この中から CPと認められたコロニー数に希釈液の希釈倍率を乗じて盲腸内容物 lg 当たりの CP生菌数を算出した。この結果を元に、上記と同様にして感染指数及び防御指数を算出した。

[0106] 総排泄腔より採取した糞に関しては、以下の方法により個体別に定性培養を行うことにより CPの性状を確認した。すなわち、綿棒に付着した糞を 10mlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、試料原液とした後、これをクロストリジァ測定用培地（日水製薬 (株)製）に 0. 1mlずつ塗沫し、ァネロパックケンキを用いて 35°Cで 24時間嫌気培養し、各平板培地に生育した黒色集落形成の有無を判定した。さらに、コロニーより釣菌して卵黄加 CW寒天培地（日水製薬 (株)製）に接種して、 35°Cで 24〜48時間好気および嫌気培養しで性状の確認を行った。結果を表 18に示す。

[0107] [表 18]

[0108] 実施例 42〜45の AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650 株を含む飼料を投与した鶏ヒナは、盲腸内容物の CPの菌体濃度が極めて低ぐ CP の感染指数はきわめて低力つた。特に実施例 42では高い防御指数が得られた。比較例 16の AOK 1006s株を含む飼料を投与したヒナは、対照区と比較して CPの生菌数は変化しなカゝつた。これより、本発明のァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス' タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、及びァスペルギルス '二ガーが産生する酸性酵素を含む培養物には CPによる感染症を予防する効果がある事が示された。

[0109] (6— 2)鶏ヒナに対する Clostridium perfringens攻撃試験

(2- 2) (a)で得た IK— 05074株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した鶏ヒナの飼料を実施例 46とし、 AOK 1006s株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した飼料を比較例 17とし、麹菌培養物の代わりに乳糖を lOOppm混合した飼料を対照区とし、これらの飼料を用いて鶏ヒナを飼育し、 CP攻撃試験を行った。試験方法は、 1. 5 X 10⁹CFUの CPを経口投与したこと以外は、上記と同様である結果を表 19に示す。

[0110] [表 19]

[0111] 実施例 46の IK— 05074株を含む飼料を投与した鶏ヒナは、盲腸内容物の CPの菌体濃度が極めて低ぐ CPの感染指数はきわめて低力つた。比較例 17の AOK 10 06s株を含む飼料を投与したヒナは、対照区と比較して CPの生菌数はほとんど変化しなカゝつた。これより、本発明のァスペルギルス 'ォリゼ一が産生する酸性酵素を含む培養物には CPによる感染症を予防する効果がある事が示された。

[0112] (7— 1)子牛に対する Escherichia coli攻撃試験

生後 1週齢の雄子牛 (ホルスタイン種)を 8頭を一群として飼育した。子牛用混合飼料 (ミラクルメイト (株)科学飼料研究所製)全質量に対し (2—1) (a)で得た AOK 21 0株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650株の粉砕固体培養物を ΙΟΟρ pmとなるように混合した飼料を、おのおの実施例 47〜50とした。これらの子牛用混合飼料を 4週齢まで給餌した。一方、 AOK1006s株の粉砕固体培養物を lOOppm 混合した飼料を比較例 18とした。麹菌培養物の代わりに乳糖を lOOppm混合した飼料を対照区とし、同様に試験を行った。 2週齢で 1頭当たり 1. 2 X 10⁶CFUの Escheri chia coli (EC)を全頭に経口投与した。 4週齢まで飼育し、各群の子牛の死亡率を算出した。

[0113] また、小腸内容物を採取し、小腸内容物の ECの生菌数を以下の方法で測定した。小腸内容物 lgを滅菌リン酸緩衝生理食塩水を加えて 10倍に希釈し、充分混合して試料原液とした。ついで、試料原液を滅菌生理食塩水を用いて 10倍で段階希釈し、段階希釈液とした。試料原液および段階希釈液をそれぞれクロモカルトコリフォームァガー「Merk」に 0. 1mlずつ塗沫し、 37°Cで 24時間培養し、各平板培地に生育した典型的な ECのコロニー数を測定した。 ECと認められたコロニー数に希釈液の希釈倍率を乗じて小腸内容物 lg当たりの EC生菌数を算出した。この結果を元に、上記と同様にして感染指数及び防御指数を算出した。

結果を表 20に示す。

[0114] [表 20]

[0115] 実施例 47〜50の AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650 株を含む飼料を投与した子牛は、死亡率は 0%であった。また、小腸内容物の ECの感染指数は低かった。特に実施例 47では高い防御指数が得られた。比較例 18の A OK 1006s株を含む飼料を投与した子牛は、死亡率が 13%であった。また、対照区と比較して ECの生菌数は変化しなかった。これより、本発明のァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス'タマリ、ァスペルギルス'フォェティダス、及びァスペルギルス' - ガーが産生する酸性酵素を含む培養物には ECによる感染症を予防する効果がある事が示された。

[0116] (7— 2)子牛に対する Escherichia coli攻撃試験

IK— 05074株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した子牛用混合飼料を実施例 51とし、 AOK 1006s株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した飼料を比較例 19とし、麹菌培養物の代わりに乳糖を lOOppm混合した飼料を対照区とし、これらの飼料を用いて子牛を飼育し、 EC攻撃試験を行った。試験方法は、 1. 5 X 10⁶CFUの ECを経口投与したこと以外は、上記 EC攻撃試験と同様である。結果を表 21に示す。

[0117] [表 21]

[0118] 実施例 51の IK— 05074株を含む飼料を投与した子牛は、死亡率は 0%であった。また、小腸内容物の ECの感染指数は低力つた。比較例 19の AOK 1006s株を含む飼料を投与した子牛は、死亡率が 13%であった。また、対照区と比較して ECの生菌数はあまり変化しな力つた。これより、本発明のァスペルギルス 'ォリゼ一が産生する酸性酵素を含む培養物には ECによる感染症を予防する効果がある事が示された

[0119] (8— 1)子豚に対する浮腫病菌攻撃試験

子豚用飼料 (SD子豚人工乳前期用、日本配合飼料 (株)製、抗菌性物質無添カロ飼料）全質量に対し（2—1) (a)で得た AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した飼料を、おのおの実施例 52〜55とした。 35日齢の子豚（大ヨークシャー種） 30頭を一群として 19 日間給餌した。一方、 AOK1006s株の粉砕固体培養物を lOOppm混合した飼料を、比較例 20とした。麹菌培養物の代わりに乳糖を lOOppm混合した飼料を対照区とし、同様に試験を行った。 40日齢で 1頭当たり 2. 3 X 10⁵CFUの浮腫病菌（Escheric hia coli)を経口的に感染させた。 54日齢まで飼育し、各群の子豚の死亡率を算出した。

また、上記と同様にして、小腸内容物を採取し、小腸内容物の ECの生菌数を測定し、感染指数及び防御指数を算出した。

結果を表 22に示す。

[0120] [表 22]

[0121] 実施例 52〜55の AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650 株を含む飼料を投与した子豚は、死亡率は約 20〜30%程度であり、比較例 20の飼料を投与した群の死亡率に比較して小さ力つた。また、小腸内容物の ECの感染指数は低ぐ特に実施例 52では高い防御指数が得られた。また、対照区と比較して浮腫病菌の生菌数はほとんど変化しなカゝつた。これより、本発明のァスペルギルス'ソーャ、ァスペルギルス'タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、及びァスペルギルス' - ガーが産生する酸性酵素を含む培養物には浮腫病を予防する効果がある事が示された。

[0122] (8— 2)子豚に対する浮腫病菌攻撃試験

(2- 2) (a)で得た IK— 05074株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した子豚用飼料を実施例 56とし、 AOK 1006s株の粉砕固体培養物を lOOppmとなるように混合した飼料を比較例 21とし、麹菌培養物の代わりに乳糖を lOOppm混合した飼料を対照区とし、これらの飼料を用いて子豚を飼育し、浮腫病菌攻撃試験を行つた。試験方法は、 1. 8 X 10⁵CFUの浮腫病菌を経口投与したこと以外は、上記浮腫病菌攻撃試験と同様である。

結果を表 23に示す。

[0123] [表 23]

[0124] 実施例 56の IK— 05074株を含む飼料を投与した子豚は、死亡率は約 20%程度であり、比較例 21の飼料を投与した群の死亡率に比較して小さ力つた。また、小腸内容物の ECの感染指数は低力つた。また、対照区と比較して浮腫病菌の生菌数はほとんど変化しな力つた。これより、本発明のァスペルギルス'オリゼ一が産生する酸性酵素を含む培養物には浮腫病を予防する効果がある事が示された。

[0125] (9 1)コクシジゥム防除試験

(a) Eimeria tenella防除試験

Eimeria tenellaに自然感染した鶏の糞を集め、ォーシストを実体顕微鏡下で分離し、生理食塩水で洗浄した。直径 9cmのシャーレに生理食塩水 5mlをカ卩え、洗浄したォーシストを約 4000個 Zmlとなるように投入した。（2—1) (a)で得た AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650株の粉砕固体培養物を、シャーレ当たり 50mgずつ投入し、おのおの実施例 57〜60とした。 AOK1006s株の粉砕固体培養物 50mgを投入したシャーレを比較例 22とし、麹菌培養物を加えな!/ヽシヤーレを対照区とした。おのおののシャーレを 37°Cにおいて振とう（150rpm)した。 7日後に、実体顕微鏡下で、ォーシストの個数の測定、細胞壁の変形や溶解の状態の観察を行、、ォーシストの減少率及び溶解変性率を算出した。

結果を表 24に示す。

[表 24]

1 ) 7曰目に残ったォ一シスト中の割合実施例 57〜60に示すように、 AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び A OK B650株の固体培養物は、比較例 22に示す AOK 1006s株の固体培養物に比ベ、明ら力に E. tenellaのォーシスト数が減少しており、さらに高いォーシスト溶解変性活性を示した。特に AOK 210株で E. tenellaのォーシストを処理することにより、極めて高いォーシストの減少率及び溶解変性率が得られた。 [0128] (b) Eimeria zuernii防除試験

Eimeria zuerniiに自然感染した牛下痢便を集め、ォーシストを実体顕微鏡下で分離し、生理食塩水で洗浄した。直径 9cmのシャーレに生理食塩水 5mlをカ卩え、洗浄したォーシストを約 2000個 Zmlとなるように投入した。（2—1) (a)で得た AOK 210 株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び AOK B650株の粉砕固体培養物を、シヤーレ当たり 50mgずつ投入し、おのおの実施例 61〜64とした。 AOK1006s株の粉砕固体培養物 50mgを投入したシャーレを比較例 23とし、麹菌培養物を加えな!/ヽシャーレを対照区とした。おのおののシャーレを 37°Cにおいて振とう（150rpm)した。 7 日後に、実体顕微鏡下で、ォーシストの個数の測定、細胞壁の変形や溶解の状態の観察を行い、ォーシストの減少率及び溶解変性率を算出した。

結果を表 25に示す。

[0129] [表 25]

1 ) 7曰目に残ったォーシスト中の割合

[0130] 実施例 61〜64に示すように、 AOK 210株、 AOK 43株、 AOK N4586株及び A OK B650株の固体培養物は、比較例 23に示す AOK 1006s株の固体培養物に比ベ、明ら力に E. zuerniiのォーシスト数が減少しており、さらに高いォーシスト溶解変性活性を示した。特に、 AOK 210株で E. zuerniiのォーシストを処理することにより、極めて高いォーシストの減少率及び溶解変性率が得られた。

[0131] (9一 2)コクシジゥム防除試験

(a) Eimeria tenella防除試験

(2- 2) (a)で得た IK— 05074株の粉砕固体培養物を投入したシャーレを実施例 65とし、上記と同様の方法で Eimeria tenella防除試験を行った。また、 AOK 1006s 株の固体培養物を投入したシャーレを比較例 24とし、同様に試験を行った。

結果を表 26に示す。

[0132] [表 26]

1 ) 7曰目に残ったォーシスト中の割合

[0133] 実施例 65に示すように、 IK— 05074株の固体培養物は、比較例 24に示す AOK 1006s株の固体培養物に比べ、明らかに E. tenellaのォーシスト数を減少させ、また高!/ヽォーシスト溶解変性活性を示した。

[0134] (b) Eimeria zuernii防除試験

(2- 2) (a)で得た IK— 05074株の粉砕固体培養物を投入したシャーレを実施例 66とし、上記と同様の方法で Eimeria zuernii防除試験を行った。また、 AOK 1006s 株の固体培養物を投入したシャーレを比較例 25とし、同様に試験を行った。

結果を表 27に示す。 [0135] [表 27]

1 ) 7曰目に残ったォーシスト中の割合

[0136] 実施例 66に示すように、 ΙΚ 05074株の固体培養物は、比較例 25に示す ΑΟΚ 1006s株の固体培養物に比べ、明らかに E. zuerniiのォーシスト数を減少させ、また高レヽォーシスト溶解変性活性を示した。

産業上の利用の可能性

[0137] 本発明のァスペルギルス属菌及び該菌が産生する酸性酵素を含む培養物を含む動物用飼料添加剤を飼料に混合し、動物に摂取させることにより、栄養吸収が促進され、飼料効率が上がる。また、動物の腸内においてァスペルギルス属菌の菌体濃度が増加することにより、腸内フローラのバランスが改善される。さらに、病原菌ゃコクシジゥムの増殖を抑制し、動物の腸内感染症を予防 '改善する。本発明の飼料は、鶏、豚、牛などの家畜の飼育に好適に用いることができる。

Claims

請求の範囲

[1] ァスペルギルス ·ソーャ（Aspergillus sojae)、ァスペルギルス ·タマリ（Aspergillus tam arii)、ァスペルギルス'フォエティダス（Aspergillus foetidus)、ァスペルギルス · -ガー (Aspergillus niger)及びァスぺノレギノレス ·オリゼー (Aspergillus oryzae)から選ばれる少なくとも一種の菌、並びにこれらの菌が産生する酸性酵素を含む培養物を含む、動物用飼料添加剤。

[2] 前記菌が、ァスペルギルス'ソーャ及び Z又はァスペルギルス'オリゼーである、請求項 1に記載の動物用飼料添加剤。

[3] 前記ァスペルギルス'オリゼ一が、ァスペルギルス'オリゼー IK 05074株 (FER

M BP— 10622)又はこれと同じ酸性酵素を産生する能力を有する該菌株の変異株である請求項 1又は 2に記載の動物用飼料添加剤。

[4] 前記酸性酵素が、酸性アミラーゼである、請求項 1〜3の何れか一項に記載の動物用飼料添加剤。

[5] 前記菌が、動物の腸内感染症を引き起こす病原菌に対する抗菌活性及び Z又はコクシジゥムに対する殺原虫活性を有することを特徴とする、請求項 1〜4の何れか一項に記載の動物用飼料添加剤。

[6] 前記培養物が、植物性栄養源を含む請求項 1〜5の何れか一項に記載の動物用飼料添加剤。

[7] 前記植物性栄養源が、玄米である請求項 6に記載の動物用飼料添加剤。

[8] 請求項 1〜7の何れか一項に記載の動物用飼料添加剤を含む飼料。

[9] 菌の増殖のための栄養源を含む固体培地で、ァスペルギルス ·ソーャ、ァスペルギルス'タマリ、ァスペルギルス'フォエティダス、ァスペルギルス' -ガー及びァスペルギルス 'ォリゼ一力ゝら選ばれる少なくとも一種の菌を培養し、得られた培養物^!司料に含有させることを特徴とする、飼料の製造方法。