WO2007029730A1

WO2007029730A1 - 老人性貧血を防止又は治療するためのアミノ酸組成物

Info

Publication number: WO2007029730A1
Application number: PCT/JP2006/317636
Authority: WO
Inventors: Yukio Asami
Original assignee: Meiji Dairies Corporation
Priority date: 2005-09-06
Filing date: 2006-09-06
Publication date: 2007-03-15
Also published as: JP5220415B2; JPWO2007029730A1

Abstract

　老化に伴い、頻繁に貧血が見られることから、老人性の貧血防止に有効な治療剤を開発することを第１の課題とする。　更に、今後は更に老齢化が進むことから、副作用が低く安価で効果的なアンチエイジング剤を提供することを第２の課題とする。　本願発明者は、アスパラギン酸（Asp）、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、イソロイシン（Ile）、グリシン（Gly）、グルタミン酸（Glu）、セリン（Ser）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）、スレオニン（Thr）、バリン（Val）、ヒスチジン（His）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、メチオニン（Met）、リジン（Lys）及びロイシン（Leu）からなるアミノ酸組成物など、Ile、Trp、Thr、Val、His、Phe、Met、Lys及びLeuを少なくとも含むアミノ酸組成物を有効成分として含む剤に、老人性貧血を改善回復する能力などがあることを初めて見出し、老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤及び筋肉異化抑制剤を提供できた。

Description

明細書

老人性貧血を防止又は治療するためのアミノ酸組成物

技術分野

[0001] 本願発明は、老化防止の技術分野に関する。本願発明は、特に赤血球の増殖における老化防止の技術に関する。

背景技術

[0002] 老化、加齢により、皮膚のしわ、頭髪の減少'白髪などの身体の表面に現れる変化だけでなぐ身体の機能は徐々に低下し、様々な症状が現れる。例えば、高血圧、心筋梗塞、狭心症などの疾患、インスリン生産の低下による糖尿病リスクの増大、骨粗しょう症、老人性白内障、老人性貧血などが挙げられる。

[0003] これら老化対策として、民間療法も含め、種々の健康食品、治療薬が開発されてきた。

[0004] 例えば、メラトニンは老化に伴い減少することから、老化により生じる神経変性疾患へのメラトニン投与が検討され、近年ではメラトニン又はその類縁物質 (特許文献 1 : 米国特許第 5403851号）に老化防止作用があるといわれている。更に、このメラトニンの作用は HGHを介するものとして、成長ホルモンを老化防止剤として用いることもなされている（Annu Rev Med. 2003;54:513-33. Epub 2001 Dec 3)。

[0005] また、体内で生じる活性酸素は細胞や DNAの損傷、脂質の過酸化などを引き起こし、多くの疾患に関与することによる種々の影響があるとして、活性酸素を封じ込めるための抗酸化剤の利用が検討され、例えば、ビタミン C、ビタミン Eなどが利用され、 oc トコフエロールの利用及びその類縁体の利用など (特開平 8— 277282号）、更には、ラジカルスカベンジャーが開発されてきた (特開平 9— 241637号)。

[0006] また更に、老化に伴う諸症状のうち、貧血との関係では、体内で発生する「活性酸素」が貧血や免疫不全を誘発するとの報告もある（非特許文献 2)。

[0007] 老人性貧血用につ、ては、漢方薬として、例えば、人参 (ニンジン）、蒼朮 (ソウジュッ)又は白朮 (ビヤクジュッ）、茯苓 (ブタリヨウ）、甘草 (カンゾゥ）、生姜 (ショウキヨウ）、大棗 (タイソゥ)、酸棗仁 (サンソゥニン)、竜眼 (リュウガン)、遠志 (オンジ)、当帰 (トウキ）、黄耆 (ォウギ)、木香 (モッコゥ）、柴胡 (サイコ)及び梔子 (シシ)力もなる加味帰脾湯が知られている。

特許文献 1 :米国特許第 5403851号

特許文献 2：特開平⁸ - 277282号

特許文献 3 :特開平 9 241637号

非特許文献 l :Annu Rev Med. 2003, 54 , 513-33. Epub 2001 Dec 3

非特許文献 2 :Nature 431, 997-1002

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 老化に伴い、頻繁に貧血が見られることから、老人性の貧血防止に有効な治療剤を開発することを第 1の課題とする。

[0009] 更に、今後は更に老齢ィ匕が進むことから、副作用が低く安価で効果的なアンチエイジング剤を提供することを第 2の課題とする。

課題を解決するための手段

[0010] 本願発明者は、偶然にも、特定の組成を有するアミノ酸組成物が老人性貧血の改善に効果的であることを見出した。具体的には、本願発明者は、アミノ酸組成物であつて、ァスパラギン酸 (Asp)、ァラニン (Ala)、ァノレギニン (Arg)、イソロイシン（lie)、グリシン（Gly)、グルタミン酸（Glu)、セリン（Ser)、チロシン（Tyr)、トリプトファン（Trp)、スレオ-ン（Thr)、ノリン（Val)、ヒスチジン（His)、フエ-ルァラニン（Phe)、プロリン（Pro )、メチォニン (Met)、リジン (Lys)及びロイシン (Leu)を有効成分として含むアミノ酸組成物に、老人性貧血を改善回復する能力があることを初めて見出したものである。

[0011] 更に、本願発明者は、上記組成のアミノ酸組成物が老化に伴い発現が低下する遺伝子の発現を回復させることを見出し、アミノ酸組成物について検討を重ねて、本願発明を完成させた。

発明の効果

[0012] 本願発明のアミノ酸組成物を有効成分とする老人性貧血防止剤又は老人性貧血治療剤により、今後も増大すると予想される老人性貧血に対し、安全で安価な処置が可能となる。更に、本願発明のアミノ酸組成物により、老化に伴う細胞の機能低下を防止でき、老化現象に対する全般的な抑制効果がある。

[0013] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-257764号の明細書及び Z又は図面に記載される内容を包含する。

図面の簡単な説明

[0014] [図 1]図 1は、表 3記載の遺伝子のうち、赤血球分化関連マーカー遺伝子以外の発現量の平均値を示している。発現量は 1.5ヶ月齢の若齢マウスの発現量を基準として D NAマイクロアレイ解析結果をマイクロアレイスイート 5.0 (MAS 5.0) (ァフィメトリタス社）を用いて標準化し、各遺伝子の相対発現量をもとに算出した。エラーバーは標準偏差である。

[図 2]図 2は、表 3記載の遺伝子のうち、赤血球分化関連マーカー遺伝子の発現量を示している。

[図 3]図 3は、アミノ酸投与開始直前の各群マウス末梢血のヘモグロビン量を示している。

[図 4]図 4は、アミノ酸投与後の各群マウス末梢血のヘモグロビン量を示している。

[図 5]図 5は、若齢マウスにおけるアミノ酸投与後の血中ヘモグロビン量を示している。 ICRマウス 5週齢は 5ヶ月間、アミノ酸添加あるいは未添カ卩の飼料で飼育した後に、腹部大静脈より採血して、ヘモグロビン量を測定した。若齢マウス各群の血中へモグロビン量はヘモグロビン B-テスト'ヮコーにて測定した。アミノ酸非投与コントロール群は n=6、アミノ酸混合 1投与群は n=7である。図中 AAM1は、アミノ酸混合 1投与群を示す。

[図 6]図 6は、老齢マウスの骨格筋の減少に対するアミノ酸混合物の摂取の効果を示している。アミノ酸混合 2を投与したマウス群は AAM2で、アミノ酸混合 3を投与したマウス群は AAM3で、アミノ酸混合 4を投与したマウス群は AVMで、それぞれ示されている。図中で異なるアルファベット間は、一元配置分散分析 (ANOVA)の後に、最小有意差法 (LSD法）により pく 0.05で有意差が認められた。

[図 7]図 7は、アミノ酸の摂取が若齢マウスの筋同化作用に及ぼす効果を示している。アミノ酸混合 2を投与したマウス群は AAM2で、アミノ酸混合 3を投与したマウス群は A AM3で、アミノ酸混合 4を投与したマウス群は AVMで、それぞれ示されている。図中で異なるアルファベット間は、一元配置分散分析 (ANOVA)の後に、 Newman-keuls の多重比較法により Pく 0.05で有意差が認められた。

[図 8]図 8は、若齢マウスの血中ヘモグロビン量を示している。アミノ酸混合 2を投与したマウス群は AAM2で、アミノ酸混合 3を投与したマウス群は AAM3、アミノ酸混合 4を投与したマウス群は AVMで、それぞれ示されている。

[図 9]図 9は、若齢マウスのへマトクリット値を示している。アミノ酸混合 2を投与したマウス群は AAM2で、アミノ酸混合 3を投与したマウス群は AAM3で、アミノ酸混合 4を投与したマウス群は AVMで、それぞれ示されている。

発明を実施するための最良の形態

[0015] 1.はじめに

貧血は単に症状を示すもので、直接的には、赤血球の産生低下、ヘモグロビンの合成低下、赤血球の破壊の亢進などにより生じ、原因はそれぞれ異なっている。

[0016] 例えば、赤血球の産生低下では、（ィ）腎不全などによるエリスロポイエチンの産生低下、（口)再生不良性貧血などに見られる造血幹細胞の異常、（ハ）白血病や癌の骨髄などが原因として挙げられている。また、ヘモグロビンの合成低下では、鉄の不足が原因として挙げられており、それぞれの原因に応じた処置が必要となっている。

[0017] 1 1.老人性貧血

若年性の貧血は鉄欠乏が原因であることが多い。老化による貧血の発生原因は完全には解明されていないが、若年性貧血とは対照的に、骨髄の老化に伴う造血幹細胞の減少、産生される赤血球の寿命の短縮、胃の粘膜の萎縮に伴う栄養の吸収量の減少などが原因として挙げられてきている。

[0018] そこで、まず、本願発明者は、脾臓における遺伝子発現を解析したところ、赤血球の細胞骨格を形成する主要な糖蛋白質であるアンキリン、更には、鉄の取り込み、へム合成に関わる酵素群などで、老化による発現量の低下が起こることを見出した。更に、本願発明者は、遺伝子発現を解析した結果、その原因の一つとして、赤血球の産生低下、赤血球への分ィ匕抑制があることを突き止めた。

[0019] 1 - 2.血球の発生分化と老化赤血球は造血幹細胞から、赤芽球バースト形成細胞（BFU— E: burst-forming-unit -erythroid) ,赤芽球コロニー开成細胞（CFU: colony- forming- unit- erythroid)、前赤芽球、赤芽球、網状赤血球、赤血球と分ィヒして生産されると考えられている。最近では、転写因子 GATA-1及び GATA-2の発現量が赤血球の分ィヒ段階で異なっており、 GATA-1は赤芽球、前赤芽球で発現が見られ、 GATA-2は造血幹細胞、骨髄幹細胞などの未分ィ匕な細胞で発現が見られることが明らかになつている。赤芽球バースト形成細胞では、 GATA-2の発現が GATA-1の発現を上回り、赤芽球コロニー形成細胞では、 GATA-1の発現が GATA-2の発現を上回っていると報告されている（実験医学 2004年， Vol22, No.3, 361-366)。

[0020] 本願発明者の研究により、老化に伴い、 GATA-1の発現が低下する一方、 GATA-2

の発現が約 2倍にも増大することを見出した。更に、 CFU-E以降の分化段階で発現量が増すトランスフェリン受容体遺伝子 (CD71)及び EPO受容体遺伝子の発現量も加齢で減少しており、老化に伴い、赤血球への分ィ匕が抑制されていることが分力つた

[0021] 2.アミノ酸組成物と老人性貧血、細胞老化抑制、筋肉同化促進及び筋肉異化抑制本願発明者は、特定の組成を有するアミノ酸組成物が老人性貧血の改善に効果的であることを実験的に見出し、更に、これらの改善が老化による赤血球への分ィ匕抑制を防止することに起因していることを、関連する遺伝子の発現状況から明らかにした。

[0022] また、特定組成のアミノ酸組成物の投与により、老化により低下する細胞の増殖維持に関連する遺伝子の発現量が回復することから、本特定組成のアミノ酸組成物を老化に伴う細胞機能の低下抑制のための剤、言いかえれば、細胞老化防止剤として用いることが可能であることを見出した。

[0023] 更に、同様な栄養量 (カロリー）の摂取と同様な運動条件下において、特定組成のァミノ酸組成物の投与により、筋重量の増加が観察されたことから、前記のアミノ酸組成物が筋肉の同化を促進できることを見出した。また、特定組成のアミノ酸組成物の投与により、老齢マウスの筋重量の減少の抑制が認められたことから、前記のアミノ酸組成物が加齢に伴う筋肉の異化を抑制できることを見出した。したがって、前記のァミノ酸組成物は、老人、栄養障害や病中の人間などで、筋肉の減少を抑制し、筋重量を維持するのに有効と考えられる。

[0024] そして、前記のアミノ酸糸且成物は、成長期の人間やアスリートなどが積極的に筋肉量を増加させたい場合にも有効である。更に、肥満や生活習慣病者又はその予備軍に対して、前記のアミノ酸組成物を使用すれば、筋肉の増加による基礎代謝量の効率的な上昇が見込まれ、肥満や生活習慣病の予防 '改善などにも効果が見込まれる。

[0025] 3.アミノ酸の組成（以下、アミノ酸は 3文字コードで示すことがある。 )

本願発明で用いるアミノ酸組成物として、必須アミノ酸 Ile、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe 、 Met, Lys及び Leuを含むアミノ酸組成物を有効成分として含有する老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤を包含する。

[0026] また、本願発明は、 Ile、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Met, Lys及び Leuに加えて、 Arg、 Glu及び Proからなる群力も選ばれる 1以上のアミノ酸が添加されたアミノ酸組成物を有効成分として含有する老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤を包含する。更に、本願発明は、 Ile、 Trp、 T hr、 Val、 His, Phe、 Met, Lys及び Leuに加えて、 Arg、 Glu及び Proからなる群から選ばれる 1以上のアミノ酸、並びに更に、 Asp、 Ala、 Gly、 Ser及び Tyrからなる群から選ばれる 1以上のアミノ酸が添加されたアミノ酸組成物を有効成分として含有する老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤を包含する。

[0027] 好適には、 Arg、 Ile、 Glu、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Pro, Met, Lys及び Leuを含むァミノ酸組成物を有効成分として含有する老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤、並びに前記アミノ酸組成物に任意の添加成分として、 Asp、 Ala、 Gly、 Ser及び/又は Tyrを更に含むアミノ酸組成物を有効成分として含有する老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤を包含する。

[0028] 具体的には、アミノ酸組成物が Asp、 Ala、 Arg、 Ile、 Gly、 Glu、 Ser、 Tyr, Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Pro, Met, Lys及び Leuからなるアミノ酸組成物を有効成分として含有する老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤を包含する。

[0029] 本願発明のアミノ酸組成物を構成する各アミノ酸は、遊離のアミノ酸でもよぐまた、薬学上又は食品上、許容される塩でもよい。例えば、各アミノ酸は、塩酸塩、乳酸塩などであってもよい。

[0030] 本願アミノ組成物としては次のものを挙げることができる。

[0031] 3 - 1. Ile、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Met, Lys及び Leuからなるアミノ酸組成物を有効成分とする老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤。

[0032] 本願発明には、有効成分として Ile、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Met, Lys及び Leuからなるアミノ酸組成物を、重量％で、 lieを 5- 20%、 Trpを 13- 25%、 Thrを 5- 15%、 Valを 5- 15 %、 Hisを 1-8%、 Pheを 10- 20%、 Metを 0.5- 5%、 Lysを 8- 18%及び Leuを 5- 17%で含むことを特徴とする老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤が包含される。

[0033] 具体的には、重量⁰ /₀で、 lieが 11.9%、 Trpが 18.5%、 Thrが 10.8%、 Valが 10.6 %、 Hisが 4.2%、 Pheが 15.0%、 Metが 3.7%、 Lysが 13.3%、 Leu力 ^ 1.9%であるアミノ酸組成物を有効成分とする老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤が挙げられる。

[0034] 3 - 2. Ile、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Met, Lys及び Leuに加えて、 Arg、 Glu及び Proからなる群力も選ばれる 1以上のアミノ酸が添加されたアミノ酸組成物を有効成分として含有する老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤。

[0035] 本願発明には、重量⁰ /₀で、 Argを 10- 20%、 lieを 5- 20%、 Gluを 10- 25%、 Trpを 1-10%、 Thrを 5- 15%、 Valを 5- 15%、 Hisを 1-8%、 Pheを 1-10%、 Proを 1-10%、 Metを 0.5- 5%、 Lys を 1-10%及び Leuを 10-20%で含むアミノ酸組成物を有効成分とする老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤が包含される。

[0036] より具体的には、重量％で、 Argが 16.0%、 lieが 11.5%、 Gluが 17%、 Trpが 3.8%、 Thrが 9.

4%、 Val力 ¾.5%、 Hisが 3.8%、 Pheが 3.8%、 Proが 5.0%、 Met力 ¾.5%、 Lysが 3.8%及び Leuが 14%であるアミノ酸組成物を有効成分とする老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤が包含される。

[0037] 3 - 3. Asp、 Alaゝ Argゝ lieゝ Gly、 Gluゝ Ser、 Tyr、 Trp、 Thr、 Val、 Hisゝ Pheゝ Pro, Metゝ L ys及び Leuからなるアミノ酸組成物を有効成分として含有する老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤。

[0038] 更に、本願発明には、重量％で、 Asp力 1-5%、 Alaが 1-10%、 Argが 1-10%、 lieが 1-1 0%、 Glyが 5- 15%、 Gluが 1-10%、 Serが 1-5%、 Tyrが 3- 15%、 Trpが 1-10%、 Thrが 1-12%、 Valが 1-10%、 Hisが 1-8%、 Pheが 1-10%、 Proが 10-20%、 Met力 0.1- 5%、 Lysが 8- 18%及び Leuが 1-10%の範囲にあるアミノ酸組成物を有効成分として含有する老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤が包含される。

[0039] より具体的には、重量％で、 Aspが 0.2%、 Alaが 4.3%、 Argが 4.9%、 lieが 4.7%、 Glyが 11.4 %、 Gluが 3.7%、 Serが 2.1%、 Tyrが 8.6%、 Trpが 3.6%、 Thrが 6.8%、 Valが 5.5%、 Hisが 3.2% 、 Pheが 5.0%、 Proが 16.5%、 Metが 0.6%、 Lysが 12.5%及び Leuが 6.4%であるアミノ酸組成物を有効成分とする老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、細胞老化防止剤、筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤が包含される。

[0040] 4.本願発明の組成物の使用の形態

本願発明のアミノ酸組成物の使用形態は特に限定されないが、飲食用、栄養補助飲食用としても、医療用としても用いることができる。食用とする場合には、本願ァミノ酸組成物は、そのまま食用できるが、各種食品への添加物とすることもできる。また、本願発明の組成物は水に溶解して飲料とすることもでき、その場合には、他の栄養成分、例えば、水溶液ビタミン類、タウリンなどを更に添加することもできる。また、嗜好性の改善のために、塩ィ匕ナトリウムなどの塩類、クェン酸等の酸類及び/又は他の適当な風味をカ卩えて飲料とすることもできる。安定性のために、 pH調整剤、キレート剤を更に添加することもできる。

[0041] 医療用とする場合にも、経口投与、直腸投与、注射，輸液による投与などの一般的投与径路により使用することができる。経口投与としては、上記組成物自体あるいは薬学上、許容される担体、賦形剤、希釈剤などとともに混合し、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤などとすることもできる。また、注射剤としては、適当な緩衝剤、等張剤などを添加し、滅菌蒸留水に溶解したものを用いればよい。

[0042] 本願発明の組成物は極めて安全であるので、その投与量は非常に広範に設定でき、更に、投与方法、使用目的により異なるが、通常 1回に 0.5〜5g、 1日の投与量として l〜20g、好ましくは 5〜10gである。これらの溶液剤とする場合には、 1回の投与量として 0.5〜10wt%溶液を 10〜1000ml、好ましくは l〜4wt%溶液を 100〜400mlとすればよい。そして、本願発明の糸且成物は、鉄、葉酸、ビタミン B12などと併用して、その効果を更に高めることを期待できる。

実施例

[0043] [実施例 1]

( 1)老齢マウスの作製及び投与

ICR雄性マウスは 20ヶ月齢まで自由飲水、 MF飼料 (オリエンタル酵母）の自由摂取条件で飼育し、体重により群分けした。 20ヶ月齢以降の 28ヶ月齢に達するまでの 8ケ月間には試験飼料を投与した。投与では表 1に示すように、 AIN-93M精製飼料 (カゼイン含量 14%)を基本飼料とし、 14%含まれるカゼインの 2%相当分をアミノ酸組成物に置換した飼料を与えた。期間中に飼料は自由摂取とした。投与群では、 16種類のァミノ酸を混合したアミノ酸混合 1投与群と必須アミノ酸を中心としたアミノ酸混合 2投与群の 2群とした（表 2)。コントロール飼料は AIN- 93Mとし、 5週齢の同系統のマウスに同期間 (8ヶ月）で与えた群 (9ヶ月齢)と、 2週間で与えた群（1.5ヶ月齢)の 2群とした。

[表 1]

表 1 飼料組成

祖成 +アミノ酸試料

カゼイン 14 0000% 12,0000%

L-シスチン 0.1300% 同左

コーンスターチ 46.5692% 同左

は化コーンスターチ 15.5000% 同左

シュ一クロース 10.0000% 同左

大豆油 4.0000% 同左

セノレロースゥグ一 5.0000% 同左

AI3SK)3Mミネラル混合 3.5000% 同左

ΑΙΝ-93ビ夕ミン混合 1.0000% 同左

重酒石酸コリン 0.2500% 同左

第三ブチルヒドロキノン o.oooa¾ 同左

アミノ酸混合物ひ. 0000% 2. 0000K [表 2] 表 2 アミノ酸混合物組成

[0044] (2)脾臓における遺伝子の発現量の網羅的解析

投与終了後に脾臓を摘出して遺伝子の発現量を解析した。

[0045] 各群解剖時に特別な臓器の異変が認められなカゝつた個体 4匹について解析した。

摘出した脾臓は 10倍体積の RNAlater(Ambion社)試薬に浸し、 4°Cで一夜、インキュベーシヨンした後に取り出して、 RNAを抽出するまで一 80°Cで保存した。脾臓からのト一タル RNAの抽出には RNeasyキット（Qiagen社）を用い、添付の手順書に従った。各マウスのトータル RNAを同量ずつ混合した試料から DNAマイクロアレイ解析用の試料を調製した。調製後の試料は、 GeneChip、 MG74Av2アレイ (ァフィメトリタス社)を用いた解析に供した。取得したシグナルデータは、 MAS 5.0により数値ィ匕および標準化を行い、各群間を比較検討した。

[0046] 若齢マウス (9ヶ月齢)を基準として各群を解析した場合に、アミノ酸組成物を投与しない老齢マウスとの比較において、発現量を示すシグナルログ比で 1.5倍以上に増加する変化、又は 0.6倍以下に減少する変化を示した遺伝子の数は 666個であった。この 666個の遺伝子のうち、アミノ酸混合 1投与で 34%の 229個力更に、必須アミノ酸を中心とするアミノ酸混合 2投与で 72%の 477個が若齢と同様の発現レベルになつており、アミノ酸の摂取による抗加齢効果が示唆された。更に、これら変化が認められた遺伝子には、赤血球に関連する遺伝子が多く含まれており、その大部分で加齢により発現量が低下していた。 1.5ヶ月齢を基準として、上記の実施例 1と同様の餌を摂取させた 28ヶ月齢の老齢マウスにおいて、発現量を示すシグナルログ比で 1.5倍以上に増加する変化、又は 0.6倍以下に減少する変化を認めた赤血球関連の遺伝子を表 3 に示す。

[表 3] 表赤血球関逮遣伝子の努比較

ヶ月齚ヶ月齚ヶ月齢ヶ月齢ヶ月齢

赤分化関迪マーカー追子

1 1

1

ヘム合成関連 iSfe子

1 1.1

orphyri 1

1

1 1

.5

1

赤血球構造パク K

1, ia 0.9

；アミノ酸泥合；アミノ酸合表中のはヶ月齢マウスのをとした時の各条件での相対量を示す。

[0047] (2— 1)赤血球関連遺伝の発現量

表 3で、減少が認められた遺伝子は赤血球の細胞骨格を形成する主要な糖タンパク質であるスぺクトリンやアンキリン、鉄の取り込みやヘム合成に関わる酵素群、酸素交換に関わる酵素などであった。特にヘムの生合成に関わる 8つの酵素の全ての遺伝子の発現が若齢マウスに比べて、およそ 1/2に減少しており、赤血球造血における機能の低下が推測された。

[0048] これに対して、老齢マウスで低下した赤血球関連の遺伝子に関して、アミノ酸組成物を投与した老齢マウスの同遺伝子群の発現量は、非投与群に比べて高いレベルを維持しており、特にアミノ酸組成物 2投与群では、若齢マウス群と、ほぼ等しい発現ノターンを示した（図 1)。

[0049] (2— 2)赤血球分化の程度

更に、赤血球系の転写因子で造血幹細胞力の分ィ匕誘導に重要である GATA-1 及び GATA-2の発現を検討した。結果を図 2に示す。加齢により GATA-1は半減し、 GATA-2は 2倍に増加して!/、た（図 2)。

[0050] GATA-1及び GATA-2の発現パターンでは、造血幹細胞から赤芽球バースト形成細胞（BFU-E: burst forming unit- erythroid)にかけての未分化若しくは分化初期の細胞では、 GATA-2優位な発現パターンが認められ、分ィ匕後半の赤芽球コロニー形成細胞（CFU- E： colony forming unit- erythroid)から赤芽球にお!、ては、 GATA- 1 優位な発現パターンを示す。したがって、老齢マウスでは未分ィ匕な状態の細胞の割合が多ぐ赤血球への分ィ匕が抑制されていることが推定された。

[0051] これに対して、アミノ酸を摂取させた場合には、 GATA-1及び GATA-2の発現量は若齢と同様なパターンに回復しており、アミノ酸摂取による赤血球分ィ匕能の維持効果が認められた。

[0052] また、赤血球の分化に伴、発現する細胞表面タンパク質の遺伝子にっ、ても、発現量を計測した。結果を合わせて図 2に示す。骨髄幹細胞力も CFU-Eにまで発現している c-kitの発現量は、どの群でも変化がな力つた力 CFU-E以降の分ィ匕段階で発現量が増すトランスフェリン受容体 (CD71)やエリスロポエチン受容体の発現量は加齢で減少し、更に、アミノ酸摂取で抑制された。したがって、これらの結果より、赤血球造血にお!、て加齢により BFU-E以降の分ィ匕は抑制されて、ることが示唆され、アミノ酸摂取により細胞分ィ匕が若齢並みに回復していることが推定できる。

[0053] (2— 3)加齢により発現が変化する遺伝子とアミノ酸組成物の摂取の影響

また更に、加齢により変化が認められた全遺伝子を、パスウェイ解析ソフト (インジェヌィティ社)を用いて解析した。パスウェイ解析により赤血球細胞に関連した遺伝子の動き以外に、老齢マウスでは細胞周期と染色体複製の低下が強く示唆され、細胞増殖の点でも血液細胞数の低下が予想された。更に、赤血球の分化成熟過程において骨髄性幹細胞力も分ィ匕した前赤芽球は、これ以降に 3〜5回の細胞分裂を行い、 8 〜32個の赤血球が生じる。したがって、細胞周期と染色体複製の低下は、間接的に赤血球の分ィ匕の抑制を示していると考えられる。この点に関しても、アミノ酸の摂取により回復が認められることから、アミノ酸の摂取、特に必須アミノ酸の摂取が加齢による造血機能の低下の抑制には有効である可能性が強いと考えられた。なお、上記解祈により、脾臓において老化により低下すると判断された細胞周期及び染色体複製関連の遺伝子を下記の表 4に挙げる。

[表 4] 表 4 脾朧において老化により低下する細胞周期および染色体祓製関連遺伝子

anillirij actin binding protein {scraps homolog, Drosap i iia;

activator of S pliase kinase

bac loviral LAP repeat-containing 5 (aurvivin)

breast cancer 1， e rly onset

barren homolog (Drosophila)

caspase 3, apoptosis related cysteine protease

c clin Λ2

cyclin Bl

cyclin E2

cyclin

cyclin F

CD38 antigen Cp45)

cell division cycle 2, Gl to S and G2 to M

CDC6 cell division cycle 6 omolog (S. cerevisiae)

CDC20 cell division cycle 20 homolog (S cerevisiae)

CHK2 checl point homolog (S. pombe)

CDC2S protein kinase regulatory suburdt 2

cullin 4A

epithelial cell transforming sequence 2 oncogene

vets erythroblastosis virus E26 oncogene homolo 1 (avian)

flap structure-specific endonucleaae 1

growth arrest and D N A- dam age -in ducib le, alpha

growth factor independent IB (potential regulator of CD N1A,

translocated in C U

geminin^ DNA replication inhibitor

insulin-like growth factor binding protein 3

kinesin family member 11

kinesin family member 22

Kr ppel-like factor 1 (erythroid)

MAD2 mitotic arrest deficient- lite 1 (yeast)

mitogen-activated protein kinase 1

MCM2 mini chromosome maintenance deficient 2， mitotin (S. cerevisiae)

MOM 3 minichromosome maintenance deficient 3 (S. cerevisiae)

MC 7 minichromosomc maintenance deficient 7 (S. cerevisiae)

antigen identified by monoclonal antibody Ki-67

vrayb myeloblastosis viial oncogene homolog (avian)

origin recognition complex, subunit Hike (yeast)

origin recognition complex, subunit 4^_like (yeast)

origin recogrjition complex, subunit G homolog-like (yeast)

proliferating cell n c!ear antigen

polymerase (DNA directed), alp a

protein regulator of cytokinesis 1

pituitary tumor-transforming 1

retinoblastoma-like 1《pl07)

replication factor C (activator 1) , 37kDa

response gene to complement 32

Src-like^adaptor

SMC2 structural maintenance of chromosomes 2-like L (yeast) [0054]

SMC4 structural maintenance of chromosomes -like 1 (yeast)

transcription factor Dp-1.

thymopoietin

topoisnmevase (DNA) II alpha 170kDa

ubiquitin like, containing PHD and RING finger domains, 1

centromere protein A, 17kDa

deoxyribonuclease I -like 3

enhancer of aeate homolog 2 (Droso hila)

guanylate cyclase 1, soluble, beta 3

interferon stimulated gene 20kDa

ruppeMike factor 1 (erythroid)

RAD 23 homolog A (S- cerevisiae)

s nuclein, alpha (nonA4 component of amyloid precursor)

tissue inhibitor of metalloproteiuase 2

zinc finger prqtein^ subfamily 1A， 1 (Ikaros)

[0055] [実施例 2]

アミノ酸摂取によるヘモグロビン値の増加

老齢マウス及び若齢マウス各群の尾静脈より採血して、末梢血のヘモグロビン量をヘモグロビン B-テスト'ヮコーにて測定した。若齢マウスは 5週齢、老齢マウスは各群とも 20ヶ月齢であった。若齢マウスは n=9、老齢マウスは各群とも n=15である。統計解析には Student-t-テストを用い、若齢マウスに対する有意差検定を行った。結果を図 3 に示す。図 3中、老齢マウスのカツコ内の AAM1は、アミノ酸混合 1を投与する予定の群、 AAM2はアミノ酸混合 2を投与する予定の群を示す。

[0056] 若齢マウスに比べて老齢マウスでは、有意にヘモグロビン量の低下が認められ、造血機能の低下が示唆された。

[0057] この後に、同一のマウスに、実施例 1の表 1に示したアミノ酸混合 1又はアミノ酸混合 2を、それぞれ 2ヶ月間、実施例 1に示した条件で飼料に置換させて摂取させ、尾静脈より採血して、末梢血中のヘモグロビンを同様にして測定した。この時にも、若齢マウスは n=9、老齢マウスは各群とも n=15である。結果を図 4に示す。図 4中、カツコ内の AAM1はアミノ酸混合 1を投与した群、 AAM2はアミノ酸混合 2を投与した群を示す。統計解析には Student-t-テストを用い、カゼインのみ投与の老齢マウスに対する有意差検定を行った。

[0058] その結果、アミノ酸を摂取しな力つた老齢マウスでは、ヘモグロビン量の回復は認められな力つた力アミノ酸を摂取した老齢マウスでは、末梢血ヘモグロビン量が若齢マウスと同レベルにまで回復した（図 4)。この結果は、脾臓の遺伝子発現の変化と非常によく相関しており、アミノ酸が老化による赤血球造血器官の機能低下を抑制することが示された。

[0059] [実施例 3]

アミノ酸摂取による筋肉同化の維持促進効果

5週齢及び 23ヶ月齢の雄性 ICRマウスに対して、 3種類のアミノ酸混合物を 4ヶ月間、投与した。投与したアミノ酸混合物は、表 5に示す通りであり、前出のアミノ酸混合 2 ( AAM2)、必須アミノ酸のみからなるアミノ酸混合 3 (AAM3)及び Val、 Leu、 Ile、 Arg、 Gl nの 5種類のアミノ酸の混合物であるアミノ酸混合 4 (AVM)である。投与を終了した後に、各マウスより腓腹筋を採取して、重量を測定した。

[0060] 老齢マウスにアミノ酸混合物を与えた場合には、必須アミノ酸混合 3で老化による骨格筋重量の減少が有意に抑制された（図 6)。更に、若齢マウスにおいて同様に検討した場合には、アミノ酸混合 2やアミノ酸混合 3を摂取させると、カゼイン食のみに比ベて、骨格筋の重量が有意に増加し、筋肉同化が促進されていることが示唆された（図 7)。

[0061] 上記の結果力判るように、老齢マウスと若齢マウスでは、本発明の効果の認められるアミノ酸の組成は若干異なる力基本として必須アミノ酸が含まれて、ることが必要条件であると考えられる。これは老化による弊害としての筋減少症 (Sarcopenia)のメカニズムと、その抑制が若齢期の筋肉の同化を促進することと異なることを反映しているためと推定される。し力しながら、アミノ酸混合物を有効に活用することで、老人の筋減少症を効果的に予防するための食品や医薬品、更にアスリートの筋肉の増強を補助するための食品を提供することが可能であると考えられる。

[表 5] 表 δ アミノ酸混合物組成

[0062] 比較実験 1 若齢マウスに対するアミノ酸組成物の投与がヘモグロビン量に与える影響

5週齢の雌性 ICRマウスに実施例 2と同様の飼料を 5ヶ月間、摂取させた後に、腹部大静脈より採血して、ヘモグロビン B-テスト'ヮコ一により、ヘモグロビン量を測定した (図 5)。

[0063] 両群間のヘモグロビン量において有意差は認められず、老齢マウスの赤血球の造血機能を上昇させるという知見は得られな力つた。このため、老齢マウスに対するアミノ酸の投与の効果は、老化によって生じる造血機能の低下を、それぞれのアミノ酸の有する生理作用で相補又は回復させることが主原因であり、その結果として、血中へモグロビン量が若齢レベルに復帰すると考えられる。

[0064] 比較実験 2 若齢マウスに対するアミノ酸の投与の効果

5週齢の雄性 ICRマウスに対して、 3種類のアミノ酸混合物を 4ヶ月間、投与した。投与したアミノ酸混合物は、実施例 3と同じく表 5に示す通りであり、前出のアミノ酸混合 2 (AAM2)、必須アミノ酸のみからなるアミノ酸混合 3 (AAM3)および Val、 Leu、 Ile、 Ar g、 Ginの 5種類のアミノ酸の混合物であるアミノ酸混合 4 (AVM)である。

[0065] アミノ酸を投与した後に、腹部大静脈より採血して、ヘモグロビン B-テスト'ヮコーにより、ヘモグロビン量を測定した。また、同様の試料のへマトクリット値も測定した。さらに脾臓を採取して、 DNAマイクロアレイ法による遺伝子発現の網羅的解析を行った。摘出した脾臓は 10倍体積の RNAlater(Ambion社)試薬に浸し、 4°Cで一夜、インキュベーシヨンした後に取り出して、 RNAを抽出するまで一 80°Cで保存した。

[0066] 脾臓からのトータル RNAの抽出には、 RNeasyキット（Qiagen社）を用い、添付の手順書に従った。各マウスのトータル RNAを同量ずつ混合した試料から DNAマイクロアレィ解析用の試料を調製した。このとき、ァフィメトリタス社が推奨するテク-カルマ-ュアルに従って試料を調製した。調製後の試料は、 Gene Chip, MOE 430Aアレイ（ァフィメトリタス社)を用いた解析に供した。取得したシグナルデータは、 MAS 5.0により数値化および標準化を行い、各群間を比較検討した。

[0067] アミノ酸を投与して、な、コントロール群と比較して、アミノ酸を投与した各群のへモグロビン量およびへマトクリット値の両項目における有意な上昇は認められな力つた。したがって、老齢動物におけるアミノ酸混合物の摂取の効果は、主に加齢に伴う造血機能の低下を回復させることだと考えられる（図 8、図 9)。

[0068] 更に、老齢マウスで変動が認められた赤血球関連の遺伝子について動きを、 DNA マイクロアレイ解析データ力抽出した (表 6)。必須アミノ酸が含まれるアミノ酸混合 2 (AAM2)とアミノ酸混合 3 (AAM3)は、 24個の関連遺伝子のうち、それぞれ 13個と 15 個に上昇が認められた。特にヘム合成と赤血球の構造を維持する主要なタンパク質への影響が強いと思われる。これに対して、必須アミノ酸の一部し力含まれていないアミノ酸混合 4 (AVM)は、 24個中の 3個の遺伝子にしか上昇が認められな力つた。すなわち、ヘモグロビン量の上昇は起きないまでも、若齢マウスでもアミノ酸、特に必須アミノ酸の摂取により、赤血球に関連する遺伝子の発現が影響を受けることが示唆された。

[0069] これは摂取するアミノ酸の組成により、脾臓で遺伝子の発現に影響を受ける細胞の種類、あるいは遺伝子の種類に違いがあることを示唆している。そして、この違いが加齢により赤血球造血機能が低下した場合に、それを相補する形で効果が現れたものと推定される。逆に、加齢による身体機能の低下の原因となるような遺伝子の発現の変化に対して、特異的に効果のないアミノ酸組成物では、加齢による機能低下を抑制する確立が低、と、える。

[0070] この意味において必須アミノ酸混合物は、加齢による赤血球造血機能の低下を効果的に抑制するということができる。更に、同様なメカニズムが関連する若齢者での貧血や病態にも効果があることが推定される。

[表 6]

Λ 6 若齢マウスにおける赤血球圑連逮 15子の発現量比校

アミノ酸非投与 AAM2 AA 3 AVM

赤血球分化瞧マ一カー

GATA-1 1.0 1.0 1.0 1.D

QATA.-2 1.0 1.0 1 0 c-kit 1.0 1.0 1'0 1.0

Transfeirin receptor 1.0 1.0 1.5 1.0

EPO receptor ^: 1.0 1.4 1.7 1.0

ヘム合成系職

AmmnlevuEinjc acid synthase 2 1.0 1.4 1.0 1.2

Ooproporphyrintigan oxidase 1.0 1.0 1.6 1 -0

UroporphyrinoEen decarboxylase 1 ,0 1.5 1 ,9 1.0

UroporphyrinoEen ΠΙ synthase 1.0 1.0 1 ,4 1.0

Delta-aminQlevulinate dehydratase 1.0 1.3 1.5 1.0

Protoporphyrinogen oxidase 1.0 1.4 1.5 1.0

Ferrot to 2.0 1.9 1.0

Hydrpxyms hylbilane syrrthase 1.0 - 1,9 1.0

赤球稱造タンパク質

Ankyrin 1, erythroid 1.0 1.5 2.6 1.0

Erythroid alpha— spectrin 1 ,0 1.6 1.6 1.0

Erythrocyte nnemhrara protein R 50 1.0 1.4 1.0 1.0

Etythrocyte protein band 4.Ϊ 1,0 1.4 1.0 1.4

Carbonic anhydra$e It 1,0 1.4 1.6 1.0

2,3-B mutase 1.0 1.0 1.D 1.3

赤 β特異的核タンパク質

1.0 1.0 2 D 1.0

HucJaarfaotor, erythroid derived 2 1.0 1.0 \S) 1.0

Erythroid dEReftntiatipn regulator f.0 1.0 1 1.0

Friend of GATA-1 1 0 1.0 2 1.0

Erythraid Kruppel-lika factor 1.0 1.4 2.6 1.0

表中の数値は、アミノ酸を投与していない群の癸現量を 1.0とした時の各群の相対発量を示す。産業上の利用可能性

[0071] 本願発明は、老人性貧血防止剤及び老人性貧血治療剤を提供するものであり、医薬品製造業又は食品製造業で利用可能である。

[0072] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として、本明細書に取り入れるものとする。

Claims

請求の範囲

[I] Ile、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Met, Lys及び Leuからなるアミノ酸組成物を有効成分とする老人性貧血防止剤又は老人性貧血治療剤。

[2] アミノ酸組成物が更に、 Arg、 Glu及び Proカゝらなる群カゝら選ばれる 1以上のアミノ酸を含む請求項 1記載の老人性貧血防止剤又は老人性貧血治療剤。

[3] アミノ酸組成物が Arg、 Ile、 Glu、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Pro, Met, Lys及び Leuからなる請求項 2記載の老人性貧血防止剤又は老人性貧血治療剤。

[4] アミノ酸組成物が更に、 Asp、 Ala, Gly、 Ser及び Tyrからなる群カゝら選ばれる 1以上のアミノ酸を含む請求項 2又は 3記載の老人性貧血防止剤又は老人性貧血治療剤。

[5] アミノ酸組成物が Asp、 Alaゝ Argゝ Ile、 Gly、 Gluゝ Serゝ Tyr、 Trp、 Thr、 Val、 Hisゝ Pheゝ

Pro, Met, Lys及び Leuからなる請求項 4記載の老人性貧血防止剤又は老人性貧血治療剤。

[6] 請求項 1から 5のいずれか 1項記載の老人性貧血防止剤又は老人性貧血治療剤を含有する飲食品。

[7] Ile、 Trpゝ Thr、 Val、 Hisゝ Pheゝ Met, Lys及び Leuからなるアミノ酸組成物を有効成分とする細胞老化防止剤。

[8] アミノ酸組成物が更に、 Arg, Glu及び Proカゝらなる群カゝら選ばれる 1以上のアミノ酸を含む請求項 7記載の細胞老化防止剤。

[9] アミノ酸組成物が Arg、 Ile、 Glu、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Pro, Met, Lys及び Leuからなる請求項 8記載の細胞老化防止剤。

[10] アミノ酸組成物が更に、 Asp、 Ala, Gly、 Ser及び Tyrからなる群カゝら選ばれる 1以上のアミノ酸を含む請求項 8又は 9記載の細胞老化防止剤。

[II] アミノ酸組成物が Asp、 Ala、 Arg、 Ile、 Gly、 Glu、 Ser、 Tyr, Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Pro, Met, Lys及び Leu力もなる請求項 10記載の細胞老化防止剤。

[12] 請求項 7から 11のいずれ力 1項記載の細胞老化防止剤を含有する飲食品。

[13] アミノ酸組成物が Ile、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Met, Lys及び Leuからなるアミノ酸組成物を有効成分とする筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤。

[14] アミノ酸組成物が更に、 Arg, Glu及び Proカゝらなる群カゝら選ばれる 1以上のアミノ酸を含む請求項 13記載の筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤。

[15] アミノ酸組成物が Arg、 Ile、 Glu、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、 Pro, Met, Lys及び Leuからなる請求項 14記載の筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤。

[16] アミノ酸組成物が更に、 Asp、 Ala, Gly、 Ser及び Tyrからなる群カゝら選ばれる 1以上のアミノ酸を含む請求項 14又は 15記載の筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤。

[17] アミノ酸組成物が Asp、 Ala、 Arg、 Ile、 Gly、 Glu、 Ser、 Tyr、 Trp、 Thr、 Val、 His, Phe、

Pro, Met, Lys及び Leu力もなる請求項 16記載の筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤。

[18] 請求項 13から 17のいずれか 1項記載の筋肉同化促進剤又は筋肉異化抑制剤を含有する飲食品。