JP2018050551A

JP2018050551A - 造血幹細胞の分化促進剤

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Publication number: JP2018050551A
Application number: JP2016191642A
Authority: JP
Inventors: 悠一郎大形; Yuichiro Ogata; 悠井上; Yu Inoue; 靖司長谷川; Yasushi Hasegawa
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2016-09-29
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2018-04-05
Anticipated expiration: 2036-09-29
Also published as: JP6851060B2

Abstract

【課題】造血幹細胞の分化を促進する新規な因子を提供すること。【解決手段】グルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸を有効成分として含有する造血幹細胞の分化促進剤。【選択図】なし

Description

本発明は、グルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸を有効成分として含有する造血幹細胞の分化促進剤に関する。

血液は血球細胞や血漿から構成されており、酸素運搬、老廃物の除去、免疫機能などの生体の恒常性維持に重要な働きを有している。ところが、高齢者では、加齢によって血液中の血球細胞の減少や機能低下が起こるため、感染症に対する免疫力が低下し、貧血、好中球低下症、血小板低下症など様々な造血系疾患に罹患しやすく、QOLの低下を招くことが報告されている（非特許文献１−４等）。このような血球細胞の減少や機能低下は、それらをつくる造血幹細胞の老化が原因の一つとして考えられている（非特許文献５）。

造血幹細胞は骨髄においてわずかに存在し、すべての血球細胞に分化する多分化能と自己複製能を有する細胞で、個体の一生にわたり血球細胞を供給し続ける。よって、造血幹細胞を移植することで、血球細胞が全くない状態から、全血球細胞を再構築することが可能である。そのため、血液疾患や免疫不全症等の治療手段として、自己又は同種の造血幹細胞の移植が行われている。しかしながら、造血幹細胞は加齢とともに増殖能、分化能が低下することが報告されており（非特許文献６）、造血幹細胞を移植しても血球系の再構築ができないという事態もある。

従って、加齢に伴う血球系の再構築の不全がもたらすQOLの低下の防止や改善のためには、造血幹細胞の機能回復が重要であると考えられる。これまで、造血幹細胞の分化促進に関与する因子としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）やトロンボポエチン(TPO)などの因子が知られているが（非特許文献７、８）、いずれも十分な効果があるとはいえず、また、生体内での制御や日常的に継続して使用が困難であるといったような種々の問題があり、これらに代わる新たな因子の解明が望まれている。

Disordered hematopoiesis and myelodysplasia in the elderly. J. Am. Geriatr Soc. 2003 Mar;51(3 Suppl):S22-6 Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population. Immunology. 2007 Apr;120(4):435-46. Epub 2007 Feb 15. Aging of the Innate Immune System: An Update.Curr Immunol. Rev. 2011 Feb 1;7(1):104-115. Unexplained anemia in the elderly. Semin Hematol. 2008 Oct;45(4):250-4. doi: 10.1053/j.seminhematol.2008.06.003. The ageing haematopoietic stem cell compartment. Nat. Rev. Immunol. 2013 May;13(5):376-89. doi: 10.1038/nri3433. Epub 2013 Apr 15. Age-associated characteristics of murine hematopoietic stem cells. J. Exp. Med. 2000 Nov 6;192(9):1273-80. The molecular control of cell division, differentiation commitment and maturation in haemopoietic cells. Nature. 1989 May 4;339(6219):27-30. The effect of thrombopoietin on the proliferation and differentiation of murine hematopoietic stem cells. Blood. 1996 Jun 15;87(12):4998-5005.

本発明の目的は、上記実情に鑑み、造血幹細胞の分化を促進する新規な因子を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸が、優れた造血幹細胞の分化促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）グルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸を有効成分として含有する造血幹細胞の分化促進剤。
（２）（１）に記載の造血幹細胞の分化促進剤の存在下で造血幹細胞を培養することを特徴とする、造血幹細胞の分化促進方法。
（３）（１）に記載の造血幹細胞の分化促進剤の存在下で造血幹細胞を培養する工程を含む、血液細胞の製造方法。

本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、造血幹細胞の分化を促進して血液細胞を誘導することができるので、造血幹細胞の機能低下又は不全に起因する血液及び造血器の疾患を治療、改善、及び予防することができる。また本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、アミノ酸を有効成分とすることから、日常的に使用しても副作用がなく安全性が高い。よって、医薬品や健康食品などの飲食品に安心して使用できる。さらに本発明の造血幹細胞の分化促進剤を添加した培地にて造血幹細胞を培養することによって製造された血液細胞は血液製剤として使用することができる。

以下に、本発明について詳細に述べる。
本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、グルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸を有効成分とする。

本発明の造血幹細胞の分化促進剤の有効成分であるグルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンは、それぞれ、Ｌ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体のいずれであってもよいが、Ｌ−体が好ましい。また、グルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンは、それぞれ、遊離体であっても、生理学的に許容される塩の形態であってもよい。塩の形態としては、有機酸（酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸等）、無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸等）、有機塩基（エチレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等）、又は無機塩基（ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物又は炭酸化物、又はアンモニア等）との間で形成される塩が挙げられる。また、グルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンは、化学合成法、発酵法、遺伝子組み換え法によって調製されたもの、これらのアミノ酸を含有する動植物等から抽出し精製したもの、市販品のいずれを使用してもよい。

有効成分であるグルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンは、いずれか１種を用いてもよいが、２種以上を組み合わせて用いることが好ましく、５種全部を用いることがより好ましい。２種以上を組み合わせて用いる場合、グルタミン酸、グリシンのいずれか一方又は両方を含んでいることが好ましい。

本発明において「造血幹細胞」とは、骨髄球系前駆細胞を経て骨髄球系細胞（赤血球、血小板、顆粒球（好酸球、好塩基球、好中球)、単球等）、ならびにリンパ球系前駆細胞を経てリンパ球系細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞等）への分化が可能な細胞をいう。造血幹細胞は、ＣＤ３４抗原が陽性で、かつ、ＣＤ３８抗原が陰性である（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）ことにより特徴づけられる。

本発明において、「造血幹細胞の分化」とは、造血幹細胞から造血前駆細胞（骨髄球系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞）に、また、造血前駆細胞から成熟血液細胞に分裂増殖することをいう。

本発明において「造血幹細胞の分化促進」とは、本発明の薬剤を投与又は摂取する前と比較して、造血幹細胞の分化が活性化することをいう。造血幹細胞の分化が活性化したか否かのin vitroでの判定は、当業者が通常行う方法によって行うことが可能であり、例えば、本発明の造血幹細胞の分化促進剤の非存在下で培養した幹細胞と比較して、本発明の造血幹細胞の分化促進剤の存在下で培養した該幹細胞において血液細胞マーカー遺伝子の発現レベルがｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで有意に高いか否かで評価することができる。血液細胞マーカー遺伝子としては、例えば、赤血球マーカーとしてＢｍａｊ、Ｔｅｒ１１９、顆粒球マーカーとしてＧｒ−１、Ｆｃｇｒ３、単球・マクロファージ系細胞マーカーとしてＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８(Ｍａｃ−１)、Ｆ４／８０、Ｂ細胞マーカーとしてＣＤ４５Ｒ（Ｐｔｐｒｃ）、Ｔ細胞マーカーとしてＬｙ１、ＣＤ２などが挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、医薬や食品の形態で生体内における造血幹細胞の分化促進に使用することができるほか、造血幹細胞の分化を促進するための細胞培養用添加剤、研究用試薬として生体外における造血幹細胞の分化促進にも使用することができる。よって、本発明によれば、上記の特定のアミノ酸を含む造血幹細胞の分化促進剤の存在下で造血幹細胞を培養することを特徴とする、造血幹細胞の分化促進方法、ならびに、上記の特定のアミノ酸を含む造血幹細胞の分化促進剤の存在下で造血幹細胞を培養する工程を含む、血液細胞の製造方法が提供される。

ここで、「血液細胞」とは、造血幹細胞から、造血前駆細胞（多能性造血前駆細胞、単能性造血前駆細胞を含む）を経て、最終的に機能する血液細胞に至る段階のすべての細胞（造血幹細胞を除く）をいう。具体的には、造血幹細胞から分化誘導された骨髄球系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、赤芽球、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、巨核球、血小板、前駆Ｂ細胞、前駆Ｔ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単芽球、単球、マクロファージ、樹状細胞などが挙げられる。また、本発明の血液細胞の製造方法により得られる血液細胞は、得られたままの状態で、又は遠心分離、分離フィルター等の分離手段により目的とする血液細胞を分離し、患者に輸注可能な製剤に調製してもよい。

本発明の上記方法に用いる培地は、幹細胞の培養に一般に用いられる培地を基礎培地とし、本発明の造血幹細胞の分化促進剤を添加することにより調製することができる。例えば、基礎培地としては、幹細胞の生存及び増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、具体的には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）、ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）、ＧｌａｓｇｏｗＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ）、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）等が挙げられるが、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２が好ましい。また、培地に、増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び／又は白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）を添加してもよい。さらに、必要に応じて、培地は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質等を含有してもよい。

本発明の造血幹細胞の分化促進剤の培地中の含有量は、使用するグルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンの種類や数、組み合わせより適宜変更できるが、例えば、グルタミン酸を７．５ｍＭ以上、好ましくは１５ｍＭ以上、より好ましくは３０ｍＭ以上、ロイシンを１．５ｍＭ以上、好ましくは３ｍＭ以上、より好ましくは６ｍＭ以上、バリンを１．５ｍＭ以上、好ましくは３ｍＭ以上、より好ましくは６ｍＭ以上、スレオニンを１．５ｍＭ以上、好ましくは３．０ｍＭ以上、より好ましくは６．０ｍＭ以上、グリシンを０．９ｍＭ以上、好ましくは１．８ｍＭ以上、より好ましくは３．６ｍＭ以上となるように培地を調製すればよい。また、上限については限定はされないが、効果と経済性の観点からいずれのアミノ酸も５０ｍＭ以下、好ましく３５ｍＭ以下である。

造血幹細胞の培養に用いる培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、プレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バッグ、ローラーボトルなどが挙げられる。

培養器は、細胞非接着性であっても接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質などで処理したものを用いてもよい。細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。

造血幹細胞の培養条件は、造血幹細胞の培養に用いられる通常の条件に従えばよく、特別な制御は必要ではない。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは３６〜３７℃である。ＣＯ_２ガス濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。培養時間は、例えば約１日〜１４日、好ましくは４〜６日間である。なお、培地の交換は２〜３日に１回行うことが好ましく、毎日行うことがより好ましい。前記培養条件は、造血幹細胞が生存及び増殖し、かつ分化促進が可能な範囲で適宜変動させて設定することもできる。

本発明の造血幹細胞の分化促進剤を生体内に投与する場合は、そのまま投与することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物とともに医薬品や飲食品などの組成物に配合することができる。なお、本発明の医薬品には、動物に用いる薬剤、即ち獣医薬も包含されるものとする。

本発明の造血幹細胞の分化促進剤を医薬品として提供する場合は、グルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸（以下、「造血幹細胞分化促進用アミノ酸」という）に、医薬上許容され、かつ剤型に応じて適宜選択した製剤用基材や担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、増量剤、分散剤、湿潤化剤、緩衝剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、噴射剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、香料等を適宜添加して、公知の種々の方法にて経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる各種製剤形態に調製すればよい。本発明の医薬品を上記の各形態で提供する場合、通常当業者に用いられる製法、たとえば日本薬局方の製剤総則［２］製剤各条に示された製法等により製造することができる。

本発明の医薬品は、経口又は非経口的に投与することができるが、好ましくは経口投与である。本発明の医薬品を経口投与する場合は、錠剤（糖衣錠を含む）、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、丸剤、内用水剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤などに製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬品を非経口投与する場合は、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、坐剤などに製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。

経口投与用製剤には、例えば、デンプン、ブドウ糖、ショ糖、果糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、結晶セルロース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸カルシウム、又はデキストリン等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプン、又はヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール、又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤などを用いることができるが、これらに限定はされない。

非経口投与用製剤には、蒸留水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ミョウバン水、植物油等の溶剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤などを用いることができるが、これらに限定はされない。

また、製剤化に当たっては、本発明の造血幹細胞の分化促進剤の有効成分である造血幹細胞分化促進用アミノ酸以外の１種以上の有効成分を併用してもよい。併用に適した有効成分としては、例えば、塩化鉄、硫酸鉄、及びリン酸鉄等の鉄の無機酸塩、クエン酸鉄、グルコン酸鉄、乳酸鉄等の鉄の有機酸塩、ヘム鉄及びフェリチン等の鉄とタンパク質の結合物、ならびに酸化鉄等を挙げることができる。鉄化合物は、医薬品又は食品に用いることができるものが好ましく、例えば、クエン酸鉄、クエン酸第１鉄ナトリウム、グルコン酸第１鉄、乳酸鉄、フマル酸第１鉄、ピロリン酸第１鉄、ピロリン酸第２鉄、及び硫酸第１鉄などが挙げられる。鉄化合物は市販品を用いればよく、１種又は２種以上を適宜選択して使用することができる。

上記製剤中の造血幹細胞分化促進用アミノ酸の含有量は特に限定されないが、製剤全量に対して０．１重量％以上、好ましくは１．０重量％以上であり、かつ３０重量％以下、好ましくは１０重量％以下である。又、製剤化における有効成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加してもよく、作業性を考えて適宜選択すればよい。

本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、有効成分である造血幹細胞分化促進用アミノ酸が造血幹細胞の分化促進作用を有するので、造血幹細胞の機能低下又は不全に起因する血液及び造血器の疾患又は病態を治療、改善、及び予防するための医薬品として有効である。造血幹細胞の機能低下又は不全は、例えば、造血幹細胞の分化が十分でないために、幼若な血球が造られるものの、質的異常のために十分に成熟できないまま骨髄内で壊れてしまう「無効造血」や、造られた血球細胞の形状が異常になる「異形成」をもたらす。よって、造血幹細胞の機能低下又は不全に起因する血液及び造血器の疾患又は病態としては、例えば、再生不良性貧血（汎血球減少症）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、サラセミア、鉄芽球性貧血、鉄欠乏性貧血、巨赤芽球性貧血、溶血性貧血、赤芽球癆、先天性貧血（例えば鎌状赤血球血症）、発作性夜間色素尿症、二次性貧血（感染症、悪性腫瘍、慢性疾患、腎疾患、肝疾患、内分泌性疾患等に伴う貧血）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患（真性多血症・本態性血小板血症・骨髄線維症など）、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、血小板無力症、自己免疫性溶血性貧血のほか、一般的な貧血状態（動悸、息切れ、眩暈、立ち眩み、異嗜症、易疲労感、倦怠感、食欲不振、悪心、頭痛、顔面蒼白、肌のクスミやクマ、耳鳴り、肩こり、口角炎等）などが挙げられる。また、「造血幹細胞の機能低下又は不全」は、上記の疾患によるものだけではなく、抗癌剤や免疫抑制剤の投与、癌の放射線治療によるものを含む。

本発明の医薬品は、上記疾患又は病態発症を抑制する予防薬として、及び／又は、正常な状態に改善する治療薬として機能する。

本発明の医薬品の有効成分は、非常に安全性が高く副作用がないため、前述の疾患の治療、改善、及び予防用医薬として用いる場合、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して広い範囲の投与量で経口的に又は非経口的に投与することができる。

本発明の医薬品の投与量は、疾患の種類、投与対象の年齢、性別、体重、症状の程度などに応じて適宜決定することができる。例えば、成人（体重６０ｋｇ）に経口投与する場合には、造血幹細胞分化促進用アミノ酸の合計量が１日あたり１０ｍｇ〜５０ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇ程度である。

また、本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、飲食品にも配合できる。本発明において、飲食品とは、一般的な飲食品のほか、医薬品以外で健康の維持や増進を目的として摂取できる食品、例えば、健康食品、機能性食品、保健機能食品、又は特別用途食品を含む意味で用いられる。健康食品には、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等の名称で提供される食品を含む。保健機能食品は食品衛生法又は食品増進法により定義され、特定の保健の効果や栄養成分の機能、疾病リスクの低減などを表示できる、特定保健用食品及び栄養機能食品、ならびに科学的根拠に基づいた機能性について消費者庁長官に届け出た内容を表示できる機能性表示食品が含まれる。また特別用途食品には、特定の対象者や特定の疾患を有する患者に適する旨を表示する病者用食品、高齢者用食品、乳児用食品、妊産婦用食品等が含まれる。本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、特に高齢者、妊産婦、月経や出血傾向を伴う疾病（胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃腸のポリープや癌、痔など）時における貧血や貧血に伴う諸症状の改善及び予防のために長期にわたって服用が必要となる場合に、日常的に継続して摂取できる点で上記の健康食品等に好適に用いることができる。ここで、飲食品に付される特定の保健の効果や栄養成分の機能等の表示は、製品の容器、包装、説明書、添付文書などの表示物、製品のチラシやパンフレット、新聞や雑誌等の製品の広告などにすることができる。

さらに、本発明の飲食品をヒト以外の哺乳動物を対象として使用する場合には、ペットフード、飼料を含む意味で用いることができる。

飲食品の形態は、食用に適した形態、例えば、固形状、液状、顆粒状、粒状、粉末状、カプセル状、クリーム状、ペースト状のいずれであってもよい。特に、上記の健康食品等の場合の形状としては、例えば、タブレット状、丸状、カプセル状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状（シロップ状、乳状、懸濁状を含む）等が好ましい。

飲食品の種類としては、パン類、麺類、菓子類、乳製品、水産・畜産加工食品、油脂及び油脂加工食品、調味料、各種飲料（清涼飲料、炭酸飲料、美容ドリンク、栄養飲料、果実飲料、乳飲料など）及び該飲料の濃縮原液及び調整用粉末等が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明の飲食品は、その種類に応じて通常使用される添加物を適宜配合してもよい。添加物としては、食品衛生法上許容されうる添加物であればいずれも使用できるが、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、異性化液糖、アスパルテーム、ステビア等の甘味料；クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸味料；デキストリン、デンプン等の賦形剤；結合剤、希釈剤、香料、着色料、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、安定剤、保存剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。

本発明の飲食品が一般的な飲食品の場合は、その飲食品の通常の製造工程において造血幹細胞分化促進用アミノ酸を添加する工程を含めることによって製造することができる。また健康食品の場合は、前記の医薬品の製造方法に準じればよく、例えば、タブレット状のサプリメントでは、造血幹細胞分化促進用アミノ酸に、賦形剤等の添加物を添加、混合し、打錠機等で圧力をかけて成形することにより製造することができる。カプセル状のサプリメントでは、造血幹細胞分化促進用アミノ酸を含有する液状、懸濁状、ペースト状、粉末状、又は顆粒状の食品組成物をカプセルに充填するか、又はカプセル基剤で被包成形して製造することができる。また、必要に応じてその他の材料（例えば、鉄、カリウム等のミネラル類、ビタミンＣ、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_６、ビタミンＢ_１２等のビタミン類、葉酸、食物繊維等）を添加することもできる。

本発明の飲食品における造血幹細胞分化促進用アミノ酸の配合量は、造血幹細胞の分化促進作用が発揮できる量であればよいが、対象飲食品の一般的な摂取量、飲食品の形態、効能・効果、呈味性、嗜好性及びコストなどを考慮して適宜設定すればよい。

本発明の飲食品の摂取量は、前述の疾患又は病態の予防や改善を目的として摂取する場合、摂取させる対象の状態、摂取形態、摂食量等により異なるが、例えば、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、造血幹細胞分化促進用アミノ酸の合計量が１０ｍｇ〜５０ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇ程度である。前記の量は１回で摂取させてもよいが、数回（２〜４回）に分けて摂取してもよい。本発明の飲食品は、摂取量の目安とするため１回に摂取するべき量の飲食品が、１個の袋やビン等の容器に包装又は充填されていることが好ましい。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。

［実施例１]造血幹細胞分化促進効果の測定
未分化状態で培養したA-6細胞(マウス造血幹細胞)（理化学研究所）を用いて、グルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン、グリシンの造血幹細胞に対する分化促進効果の評価試験を行った。細胞培養用培地には細胞の増殖や生存のために、元々一定量の各種アミノ酸が配合されている。例えば、本試験においてA-6細胞の培養の基礎培地として用いたDMEM/F12（Gibco社製）には、グルタミン酸（0.05mM）、ロイシン（0.45mM）、バリン（0.45mM）、スレオニン（0.45mM）、グリシン（0.25mM）が含まれている。そこで、本試験では、表１に示すように、基礎培地（条件1）における上記5種のアミノ酸のうちの１種のアミノ酸の濃度を変化させた培地（条件2〜16）、ならびに上記5種のアミノ酸の濃度をすべて同時に増加させた培地（条件17）を調製し、造血幹細胞の分化に及ぼす影響を解析した。なお、各条件の培地には、ウシ胎児血清(20%；Sigma社製)、G-CSF(10ng/mL；Pepro Tech社製)、IL-3(10ng/mL；Pepro Tech社製)、IL-6(100ng/mL；Pepro Tech社製)、SCF(100ng/mL；Pepro Tech社製)、EPO(25U/mL；Pepro Tech社製)、Insulin(10ng/mL；SIGMA社製)、Transferrin(10ng/mL；SIGMA社製)、2-メルカプトエタノール(100μM；Gibco社製)を添加した。

A-6細胞を、各条件の培地を添加した12well plateに１x10⁶個ずつ播種し、4日間培養した。培養4日後に細胞を回収し、PBS(-)にて2回洗浄し、Trizol Reagent(Invitrogen社製)によって細胞からRNAを抽出した。2-STEPリアルタイムPCRキット(Applied Biosystems社製)を用いて、抽出したRNAをcDNAに逆転写した後、ABI7300(Applied Biosystems社製)により、リアルタイムPCR(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40サイクル)を実施し、Ptprc（B細胞マーカー：The decline in B lymphopoiesis in aged mice reflects loss of very early B-lineage precursors. J Immunol. 2003 Sep 1;171(5):2326-30.）の遺伝子発現を確認した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。

各遺伝子の増幅に用いたプライマーセットを以下に示す。

[Ptprc (B細胞マーカー)遺伝子用プライマーセット]
フォワードプライマー：5'-ACCTGCTCGCACCACTGAA-3'（配列番号１）
リバースプライマー：5'-CCTGGATGATATGTGGTCTCTGAAG-3'（配列番号２）

[内部標準グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（Gapdh）遺伝子用のプライマーセット]
フォワードプライマー：5'-CCGTGTTCCTACCCCCAAT-3'（配列番号３）
リバースプライマー：5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'（配列番号４）

細胞分化促進効果は、基礎培地（条件1)で培養4日後のA-6細胞におけるPtprc（分化マーカー）の発現量を内部標準であるGapdh mRNAの発現量に対する割合として算出した分化マーカーの遺伝子相対発現量(Ptprc遺伝子発現量/Gapdh遺伝子発現量)の値を100％とし、これに対し、アミノ酸添加量を変化させた培地（条件2〜17）で培養4日後のA-6細胞における各分化マーカーの遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。これらの試験結果を表1に合わせて示す。

表１に示されるように、基礎培地におけるグルタミン酸の濃度（条件2-4）、ロイシンの濃度（条件5-7）、バリンの濃度（条件8-10）、スレオニンの濃度（条件11-13）、グリシンの濃度（条件14-16）を増加させることにより造血幹細胞の分化が促進されることが分かった。さらに、これら5種のアミノ酸の濃度をすべて同時に増加させると（条件17）、その分化促進効果はさらに顕著になった。以上より、グルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン、グリシンに顕著な造血幹細胞の分化促進効果が認められた。なお、本実験例で用いた細胞以外にも、市販のヒト造血幹細胞についても同様な試験を行ったところ、同様に顕著な造血幹細胞の分化促進効果が認められた。

本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、造血幹細胞を効率的に血液細胞に分化誘導させることができる。よって、本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、造血幹細胞の機能低下や不全に起因する血液及び造血器の疾患又は病態の治療、改善、及び予防するための医薬品などの製造分野において利用できる。

Claims

グルタミン酸、ロイシン、バリン、スレオニン及びグリシンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸を有効成分として含有する造血幹細胞の分化促進剤。
請求項１に記載の造血幹細胞の分化促進剤の存在下で造血幹細胞を培養することを特徴とする、造血幹細胞の分化促進方法。
請求項１に記載の造血幹細胞の分化促進剤の存在下で造血幹細胞を培養する工程を含む、血液細胞の製造方法。