JP7317358B2

JP7317358B2 - 造血幹細胞の分化促進剤

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Publication number: JP7317358B2
Application number: JP2019130929A
Authority: JP
Inventors: 悠一郎大形; 克真宮地; 貴亮山田; 紘介深田; 勉坂井田
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2023-07-31
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: JP2021013357A

Description

本発明は、造血幹細胞の血液細胞への分化促進剤に関する。

血液は血球細胞や血漿から構成されており、酸素運搬、老廃物の除去、免疫機能などの生体の恒常性維持に重要な働きを有している。ところが、高齢者では、加齢によって血液中の血球細胞の減少や機能低下が起こるため、感染症に対する免疫力が低下し、貧血、好中球低下症、血小板低下症など様々な造血系疾患に罹患しやすく、QOLの低下を招くことが報告されている（非特許文献１－４等）。このような血球細胞の減少や機能低下は、それらをつくる造血幹細胞の老化が原因の一つとして考えられている（非特許文献５）。

造血幹細胞は骨髄においてわずかに存在し、すべての血球細胞に分化する多分化能と自己複製能を有する細胞で、個体の一生にわたり血球細胞を供給し続ける。よって、造血幹細胞を移植することで、血球細胞が全くない状態から、全血球細胞を再構築することが可能である。そのため、血液疾患や免疫不全症等の治療手段として、自己又は同種の造血幹細胞の移植が行われている。しかしながら、造血幹細胞は加齢とともに増殖能、分化能が低下することが報告されており（非特許文献６）、造血幹細胞を移植しても血球系の再構築ができないという事態もある。

従って、加齢に伴う血球系の再構築の不全がもたらすQOLの低下の防止や改善のためには、造血幹細胞の機能回復が重要であると考えられる。これまで、造血幹細胞の分化促進に関与する因子としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）やトロンボポエチン(TPO)などの因子が知られている（非特許文献７、８）。また、トランスフォーミング増殖因子－β（TGF－β）阻害剤からなる、多能性幹細胞から造血幹細胞および／または造血前駆細胞への分化誘導促進剤（特許文献１）、コフィリンを有効成分とする、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化誘導剤（特許文献２）なども報告されている。しかしながら、これらは、生体内での制御や日常的に継続して使用が困難であるといったような種々の問題があり、これらに代わる新たな因子の解明が望まれている。

特開2012-70731号公報 WO2003/057241号公報

Disordered hematopoiesis and myelodysplasia in the elderly. J. Am. Geriatr. Soc. 2003 Mar;51(3 Suppl):S22-6 Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population. Immunology. 2007 Apr;120(4):435-46. Epub 2007 Feb 15. Aging of the Innate Immune System: An Update.Curr Immunol. Rev. 2011 Feb 1;7(1):104-115. Unexplained anemia in the elderly. Semin Hematol. 2008 Oct;45(4):250-4. The ageing haematopoietic stem cell compartment. Nat. Rev. Immunol. 2013 May;13(5):376-89. Age-associated characteristics of murine hematopoietic stem cells. J. Exp. Med. 2000 Nov 6;192(9):1273-80. The molecular control of cell division, differentiation commitment and maturation in haemopoietic cells. Nature. 1989 May 4;339(6219):27-30. The effect of thrombopoietin on the proliferation and differentiation of murine hematopoietic stem cells. Blood. 1996 Jun 15;87(12):4998-5005.

本発明の目的は、上記実情に鑑み、造血幹細胞の血液細胞への分化を促進する新規な物質を見出し、造血幹細胞の分化促進剤として提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、マンネンタケの溶媒抽出物、マンネンタケの亜臨界水処理物、又はマンネンタケの亜臨界水処理物の溶媒抽出物が、造血幹細胞の血液細胞への分化について優れた促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）マンネンタケの溶媒抽出物、マンネンタケの亜臨界水処理物、又はマンネンタケの亜臨界水処理物の溶媒抽出物を有効成分として含有する、造血幹細胞の血液細胞への分化促進剤。
（２）前記マンネンタケの亜臨界水処理物が、温度が１００～３００℃、かつ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水による処理物である、（１）に記載の造血幹細胞の血液細胞への分化促進剤。
（３）造血幹細胞を、（１）又は（２）に記載の剤を含有する培地で培養する工程を含む、造血幹細胞の血液細胞への分化促進方法。
（４）造血幹細胞を、（１）又は（２）に記載の剤を含有する培地で培養する工程を含む、血液細胞の製造方法。
（５）（１）又は（２）に記載の剤を含有する、造血幹細胞の血液細胞への分化促進用組成物。

本発明の造血幹細胞の血液細胞への分化促進剤は、造血幹細胞の分化を促進して血液細胞を効率的に誘導することができるので、造血幹細胞の分化機能低下又は不全に関連する血液又は造血器の疾患又は病態の治療、改善、及び予防に有効である。

以下、本発明を詳細に説明する。
１．造血幹細胞の血液細胞への分化促進剤
本発明に係る造血幹細胞の血液細胞への分化促進剤（以下、「造血幹細胞の分化促進剤」と記載する場合がある）は、マンネンタケの溶媒抽出物、マンネンタケの亜臨界水処理物、又はマンネンタケの亜臨界水処理物の溶媒抽出物を有効成分として含有する。

本発明において、「造血幹細胞」とは、骨髄球系前駆細胞を経て骨髄球系細胞[赤血球、血小板、顆粒球（好酸球、好塩基球、好中球)、単球等]、ならびにリンパ球系前駆細胞を経てリンパ球系細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞等）への分化が可能な細胞をいう。造血幹細胞は、ＣＤ３４抗原が陽性で、かつ、ＣＤ３８抗原が陰性である（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－）ことにより特徴づけられる。

本発明において、「造血幹細胞の分化」とは、造血幹細胞から造血前駆細胞（骨髄球系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞）に、また、造血前駆細胞から成熟血液細胞に分化増殖することをいう。本発明において、「造血幹細胞の血液細胞への分化促進」とは、本発明の薬剤を投与又は摂取する前と比較して、造血幹細胞の血液細胞への分化が活性化することをいい、具体的には、造血幹細胞から分化した血液細胞（骨髄球系細胞、リンパ球系細胞）又はその前駆細胞のいずれかの細胞数、好ましくはリンパ球系細胞の細胞数、より好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞の細胞数が増加することをいう。

ここで、「血液細胞」とは、造血幹細胞から、造血前駆細胞（多能性造血前駆細胞、単能性造血前駆細胞を含む）を経て、最終的に機能する血液細胞に至る段階のすべての細胞をいう。例えば、造血幹細胞から分化した赤血球、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、単球、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、血小板、マクロファージ、樹状細胞、それらの前段階にある骨髄球系前駆細胞（赤芽球、骨髄芽球、前骨髄球、巨核球等）、リンパ球系前駆細胞（単芽球、リンパ芽球等）などが含まれる。

マンネンタケは、マンネンタケ科（Ganodermataceae）マンネンタケ属（Ganoderma）に属する担子菌で、生薬「霊芝」に用いられる。霊芝は、中国の薬学古書である「本草綱目」や「神農本草経」によると、赤霊芝（赤芝）、黒霊芝（黒芝）、紫霊芝（紫芝）、青霊芝（青芝）、黄霊芝（黄芝）及び白霊芝（白芝）が存在すると記載されている。また、赤霊芝の一種として、鹿角霊芝も知られている。本発明に用いられる「マンネンタケ」は、上記マンネンタケ科マンネンタケ属の霊芝であれば特に限定はされないが、赤霊芝（Ganoderma lucidum）、黒霊芝（Ganoderma sinense、Ganoderma japonicum、Ganoderma atrum）が好ましい。これらは広く中国や日本市場等で流通しているものを用いることができるし、自生品や栽培品を用いても良い。また、マンネンタケは種類の異なるもの、例えば赤霊芝と黒霊芝を組み合わせて用いてもよい。

（マンネンタケの溶媒抽出物）
本発明において抽出原料として使用するマンネンタケの部位は、子実体、菌糸体、胞子のいずれでもよいが、子実体が好ましい。また、それらの培養物であってもよい。さらに、子実体、菌糸体、胞子は乾燥や粉砕したものを用いることができ、あるいは、生のまま用いることもできる。

マンネンタケの溶媒抽出物を得るための抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出方法であっても良いし、常温や冷温抽出方法であっても良い。抽出に使用する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）等が挙げられる。これらの溶媒のなかでも、水、低級アルコール、液状多価アルコール等が好ましい。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合して用いてもよい。また、上記抽出溶媒に酸やアルカリを添加して、ｐＨ調整した溶媒を使用することもできる。

抽出溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えば抽出原料（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であればよいが、抽出後に濃縮を行ったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、使用する溶媒の種類によるが、例えば、１０～１００℃、好ましくは３０～９０℃で、３０分～２４時間、好ましくは１～１０時間を例示することができる。

（マンネンタケの亜臨界水処理物）
本発明に用いられる亜臨界水処理とは、所定温度及び圧力の条件下で亜臨界状態にした水と処理対象（本発明ではマンネンタケ）とを接触させることをいう。例えば、水は、圧力２２．１２ＭＰａ、温度３７４．１５℃まで上げると液体でも気体でもない状態を示す。この点を水の臨界点といい、臨界点より低い温度及び圧力の熱水を亜臨界水という。この亜臨界水は、誘電率低下とイオン積の向上により、優れた成分抽出作用と加水分解作用を有する。なお、亜臨界水処理に供給する水は、液体状態でも気体状態でも利用することができる。即ち、亜臨界水処理の処理槽へは、水蒸気を供給してもよく、水を供給してもよく、あるいはその両者を供給してもよい。亜臨界水処理時の反応場は、気体状態よりも液体状態の方が反応は進みやすいので、密閉容器で強制的に液体の状態にした水を使用することが好ましい。より具体的には、金属やセラミックス等の耐圧容器に処理対象であるマンネンタケと処理剤である水を入れて、密閉状態にし、水の亜臨界状態（温度：１００℃以上、圧力：飽和蒸気圧以上）で、両者の接触を一定時間以上行う。

本発明におけるマンネンタケの亜臨界水処理物とは、マンネンタケを上記の亜臨界水処理に供することによって得られる処理物をいう。また、マンネンタケの亜臨界水処理物には、亜臨界水処理後のマンネンタケと水溶物（水溶液等）との混合物若しくはその乾燥物、また、前記の混合物をろ過したろ液若しくはその乾燥物を含む。

マンネンタケの亜臨界水処理温度は、マンネンタケの亜臨界水処理物又は後述のマンネンタケの亜臨界水処理物の溶媒抽出物中に含まれる有効成分が効率的に得られやすくなるという理由から１００～３００℃の間が好ましく、１３０～２００℃の間がより好ましく、１４０～１８０℃の間がさらに好ましく、１６０～１８０℃の間が最も好ましい。１００℃未満の場合は、有効成分の量が少なくなる傾向にある。また、亜臨界水処理の温度が３００℃を超える場合は、有効成分の過分解を引き起こしやすくなる。

マンネンタケの亜臨界水処理圧力は、各温度での飽和蒸気圧以上であれば良く、例えば、圧力０．１～３．０ＭＰａの間が好ましく、０．２～１．５ＭＰａの間がより好ましく、０．３７～１．０１ＭＰａの間がさらに好ましく、０．６３～１．０１ＭＰａの間が最も好ましい。圧力０．１ＭＰａ未満の場合は、有効成分の量が少なくなる傾向にある。また、亜臨界水処理の圧力が、飽和蒸気圧を大きく上回るような過度の加圧には、別途加圧装置の追加及び設備の耐圧向上が必要となり、抽出の経済性が悪化する。

マンネンタケの亜臨界水処理時間は、５～９０分の間で行うことが好ましく、１０～３０分の間で行うことがより好ましい。５分未満の場合は、有効成分の量が少なくなる傾向にある。また、亜臨界水処理の時間が９０分を超える場合は、有効成分の過分解を引き起こしやすくなる。

すなわち、マンネンタケの亜臨界水処理条件としては、温度は１００～３００℃、圧力は０．１～３．０ＭＰａ、時間は５～９０分で行うことが好ましい。この条件で行うことにより、マンネンタケの亜臨界水処理物の有効成分を向上させることができる。

（マンネンタケの亜臨界水処理物の溶媒抽出物）
本発明に用いられるマンネンタケの亜臨界水処理物の溶媒抽出物とは、前記の亜臨界水処理物に溶媒を加えて抽出した抽出液又はその乾燥物をいう。

マンネンタケの亜臨界水処理物の溶媒抽出物を得るための抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出方法であっても良いし、常温や冷温抽出方法であっても良い。抽出に使用する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）等が挙げられる。これらの溶媒のなかでも、水、低級アルコール、液状多価アルコール等が好ましい。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合して用いてもよい。また、上記抽出溶媒に酸やアルカリを添加して、ｐＨ調整した溶媒を使用することもできる。また、抽出方法としては、連続抽出、浸漬抽出、超臨界抽出、亜臨界抽出等が挙げられる。ここで、亜臨界抽出としては、亜臨界水抽出が好ましく、亜臨界水抽出は上記の亜臨界水処理と同一の条件で行ってもよく、別条件で行ってもよい。

溶媒に対するマンネンタケの亜臨界水処理物の割合は、固形分に換算して、例えば１～５０重量％、好ましくは５～２５重量％が挙げられる。例えば、マンネンタケの亜臨界水処理物の乾燥物に水を加え、９５～１００℃における熱水抽出を行うことで、マンネンタケの亜臨界水処理物の溶媒抽出物を得ることができる。あるいは、マンネンタケの亜臨界水処理物の乾燥物に低級アルコール（例えば、エタノール等）又は液状多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール等）を添加し、常温（例えば５～３５℃）で抽出を行うことで、マンネンタケの亜臨界水処理物の溶媒抽出物を得ることができる。

上記のマンネンタケの溶媒抽出物、マンネンタケの亜臨界水処理物、マンネンタケの亜臨界水処理物の溶媒抽出物は、得られた溶液自体又は溶媒相自体をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、その効果に影響のない範囲で、得られた溶液自体又は溶媒相を、濃縮（減圧濃縮、膜濃縮等による濃縮）、希釈、濾過、乾燥（濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等）等の処理、活性炭等による脱色、脱臭処理、エタノール沈殿等に供して、得られた生成物を用いてもよい。特に、前記乾燥処理による乾燥物の形態で使用することが好ましい。

上記のマンネンタケの溶媒抽出物、マンネンタケの亜臨界水処理物、又はマンネンタケの亜臨界水処理物の溶媒抽出物（以下、これらを総称して「マンネンタケ抽出物」という）は、生体レベル（生体内）でも又は培養レベル（生体外）でも造血幹細胞の分化を促進する作用を有するので、本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、ヒトを含む哺乳動物に対して投与することによって造血幹細胞の分化を促進するための薬剤として、また、造血幹細胞の分化を促進し、血液細胞を製造するための幹細胞培養用培地添加剤、研究用試薬、医療用試薬としても使用することができる。

本発明に係る造血幹細胞の分化促進剤は、有効成分である上記マンネンタケ抽出物が、造血幹細胞の血液細胞への分化促進作用を有するので、造血幹細胞の分化機能低下又は不全により、正常に血液細胞が形成されないことに起因する血液及び造血器の疾患又は病態を治療、改善、及び予防するのに有効である。造血幹細胞の分化機能低下又は不全は、例えば、造血幹細胞の分化が十分でないために、幼若な血球が造られるものの、質的異常のために十分に成熟できないまま骨髄内で壊れてしまう「無効造血」や、造られた血球細胞の形状が異常になる「異形成」をもたらす。よって、造血幹細胞の分化機能低下又は不全に関連する血液及び造血器の疾患又は病態としては、例えば、再生不良性貧血（汎血球減少症）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、サラセミア、鉄芽球性貧血、鉄欠乏性貧血、巨赤芽球性貧血、溶血性貧血、赤芽球癆、先天性貧血（例えば鎌状赤血球血症）、発作性夜間色素尿症、二次性貧血（感染症、悪性腫瘍、慢性疾患、腎疾患、肝疾患、内分泌性疾患等に伴う貧血）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患（真性多血症・本態性血小板血症・骨髄線維症等）、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、血小板無力症、自己免疫性溶血性貧血のほか、一般的な貧血状態（動悸、息切れ、眩暈、立ち眩み、異嗜症、易疲労感、倦怠感、食欲不振、悪心、頭痛、顔面蒼白、肌のクスミやクマ、耳鳴り、肩こり、口角炎等）、アレルギー性疾患（花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎（鼻水、鼻づまり、くしゃみ）、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、食物アレルギー、蕁麻疹、膠原病、血清病、ウイルス性肝炎、接触性皮膚炎等）、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病等）、自己免疫疾患（多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、悪性貧血等）、感染症（インフルエンザウイルス、ノロウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイルスによる感染症、腸管出血性大腸菌感染症等）などが挙げられる。また、「造血幹細胞の分化機能低下又は不全」は、上記の疾患によるものだけではなく、抗癌剤や免疫抑制剤の投与、癌の放射線治療によるものを含む。

本発明に係る造血幹細胞の分化促進剤におけるマンネンタケ抽出物の含有量は、特に限定されないが、抽出物の性状（抽出液、濃縮物、又は乾燥物）により、例えば、当該薬剤全量に対して、０．００００１～１０重量％であることが好ましく、０．０００１～１重量％であることがより好ましい。

２．造血幹細胞の分化促進方法、血液細胞の製造方法
本発明はまた、造血幹細胞を、上記造血幹細胞の分化促進剤を含有する培地で培養する工程を含む、造血幹細胞の分化促進方法、ならびに、造血幹細胞を、上記造血幹細胞の分化促進剤を含有する培地で培養する工程を含む、血液細胞の製造方法に関する。本発明に係る方法において造血幹細胞から分化誘導して製造された血液細胞は、得られたままの状態で、又は遠心分離、分離フィルター等の分離手段により目的とする血液細胞を分離し、患者に輸注可能な製剤に調製してもよい。

本発明に係る方法において用いる培地は、上記造血幹細胞の分化促進剤を添加する以外は、特に限定はされず、造血幹細胞の培養及び分化のために一般的に使用されている培地及び添加剤を用いればよい。

具体的には、造血幹細胞を培養する培地には、幹細胞の生存及び増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ' ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ（Ｄ－ＭＥＭ）、ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ－１２（Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２）、ＧｌａｓｇｏｗＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ）等が用いられるが、Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２が好ましい。また、上記培地には、細胞の増殖速度を増大させるために、及び／又は、血液細胞への分化誘導の補助のために、必要に応じて、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血球遊走因子（ＬＩＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ステムセルファクター（ＳＣＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１等）、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７－サプリメント、Ｎ２－サプリメント、ＩＴＳ－サプリメント等を添加してもよく、また、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）等を添加してもよい。培地の各成分は、各々適する方法で滅菌して使用する。上記各成分を基本培地に適宜添加した市販品の培地を使用することもできる。

また、上記以外には、１～２０％の含有率で血清（例えば、１０％ＦＢＳ）が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。

上記の本発明に係る造血幹細胞の分化促進剤あるいは本発明に係る方法に準じて、上記のマンネンタケ抽出物を、単独で、あるいは培地と別々に又は培地と混合し、造血幹細胞の分化促進のための試薬キットとして提供することもできる。当該キットは、必要に応じて取扱い説明書等を含むことができる。あるいは、上記のマンネンタケ抽出物を培地と混合し、造血幹細胞の分化促進用培地として提供することもできる。

造血幹細胞の培養に用いる培養器は、造血幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、プレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バッグ、ローラーボトルなどが挙げられる。培養器は、細胞非接着性であっても細胞接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質などで処理したものを用いてもよい。細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。

幹細胞培養に使用される培地に対するマンネンタケ抽出物の添加濃度は、上述の本発明に係る造血幹細胞の分化促進剤におけるマンネンタケ抽出物の含有量に準じて適宜決定することができるが、マンネンタケ抽出物の乾燥物に換算して、例えば１０～１００００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００～５０００μｇ／ｍＬの濃度が挙げられる。また、幹細胞の培養期間中、これらの抽出物を定期的に培地に添加してもよい。

幹細胞の培養条件は、幹細胞の培養に用いられる通常の条件に従えばよく、特別な制御は必要ではない。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０～４０℃、好ましくは約３６～３７℃である。ＣＯ_２ガス濃度は、例えば約１～１０％、好ましくは約２～５％である。なお、培地の交換は２～３日に１回行うことが好ましく、毎日行うことがより好ましい。前記培養条件は、幹細胞が生存及び増殖可能な範囲で適宜変動させて設定することもできる。

造血幹細胞の血液細胞への分化が促進されたか否かのin vitroでの判定は、当業者が通常行う方法によって行うことが可能であり、例えば、本発明に係る造血幹細胞の分化促進剤の非存在下で培養した幹細胞と比較して、本発明に係る造血幹細胞の分化促進剤の存在下で培養した該幹細胞において血液細胞マーカー遺伝子の発現レベルがmRNAレベル又はタンパク質レベルで有意に高いか否かで評価することができる。血液細胞マーカー遺伝子としては、例えば、Ｂ細胞マーカー遺伝子としてＣＤ４５Ｒ（Ｐｔｐｒｃ）、Ｔ細胞マーカー遺伝子として２Ｌｙ１、ＣＤ２、ＣＤ３ｅ、単球・マクロファージ系細胞マーカー遺伝子としてＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８(Ｍａｃ－１)、Ｆ４／８０、ＮＫ細胞マーカー遺伝子としてＩｄ３、ＮＫｐ４６、赤血球マーカー遺伝子としてＨｂｂ１、Ｂｍａｊ、Ｔｅｒ１１９、顆粒球マーカー遺伝子としてＧｒ－１、Ｆｃｇｒ３などが挙げられるが、これらに限定はされない。

３．造血幹細胞の血液細胞への分化促進用組成物
本発明に係る造血幹細胞の分化促進剤を生体内に投与する場合は、そのまま投与することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物とともに医薬品（医薬部外品を含む）、飲食品等の各種組成物に配合して提供できる。

本発明に係る造血幹細胞の分化促進剤を医薬品に配合する場合は、薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、患部に適用するのに適した製剤形態の各種製剤に製剤化することができる。薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、その剤形、用途に応じて、適宜選択した製剤用基材や担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、増量剤、分散剤、湿潤化剤、緩衝剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、噴射剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、香料等を適宜添加し、公知の種々の方法にて経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる各種製剤形態に調製すればよい。本発明の医薬品を上記の各形態で提供する場合、通常当業者に用いられる製法、たとえば日本薬局方の製剤総則［２］製剤各条に示された製法等により製造することができる。

本発明の医薬品の形態としては、特に制限されるものではないが、例えば錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、トローチ剤、顆粒剤、散剤、液剤、丸剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤などの経口剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、座剤、軟膏剤、ローション剤、噴霧剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤などの非経口剤などが挙げられる。また、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよく、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。

本発明の医薬品は、経口又は非経口的に投与することができるが、好ましくは経口投与である。本発明の医薬品を経口投与する場合は、錠剤（糖衣錠を含む）、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、丸剤、内用水剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤などに製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬品を非経口投与する場合は、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、坐剤などに製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。

経口投与用製剤には、例えば、デンプン、ブドウ糖、ショ糖、果糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、結晶セルロース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸カルシウム、又はデキストリン等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプン、又はヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール、又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤などを用いることができるが、これらに限定はされない。

非経口投与用製剤には、蒸留水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ミョウバン水、植物油等の溶剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ－マンニトール等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤などを用いることができるが、これらに限定はされない。

また、製剤化に当たっては、本発明の造血幹細胞の分化促進剤の有効成分であるマンネンタケ抽出物以外の１種以上の有効成分を併用してもよい。併用に適した有効成分としては、例えば、塩化鉄、硫酸鉄、及びリン酸鉄等の鉄の無機酸塩、クエン酸鉄、グルコン酸鉄、乳酸鉄等の鉄の有機酸塩、ヘム鉄及びフェリチン等の鉄とタンパク質の結合物、ならびに酸化鉄等を挙げることができる。鉄化合物は、医薬品又は食品に用いることができるものが好ましく、例えば、クエン酸鉄、クエン酸第１鉄ナトリウム、グルコン酸第１鉄、乳酸鉄、フマル酸第１鉄、ピロリン酸第１鉄、ピロリン酸第２鉄、及び硫酸第１鉄などが挙げられる。鉄化合物は市販品を用いればよく、１種又は２種以上を適宜選択して使用することができる。

本発明の医薬品は、上記血液関連疾患の発症を抑制する予防薬として、及び／又は、正常な状態に改善する治療薬として機能する。本発明の医薬品の有効成分は、天然物由来であるため、非常に安全性が高く副作用がないため、前述の疾患の治療、改善、及び予防用医薬として用いる場合、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して広い範囲の投与量で経口的に又は非経口的に投与することができる。

本発明の医薬品における造血幹細胞の分化促進剤の含有量は特に限定されないが、製剤（組成物）全重量に対して、上記のマンネンタケ抽出物の乾燥物に換算して、０．００１～３０重量％が好ましく、０．０１～１０重量％がより好ましい。上記の量はあくまで例示であって、組成物の種類や形態、一般的な使用量、効能・効果などを考慮して適宜設定・調整すればよい。また、製剤化における有効成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加してもよく、作業性を考えて適宜選択すればよい。

本発明の医薬品の投与量は、疾患の種類、投与対象の年齢、性別、体重、症状の程度などに応じて適宜決定することができる。例えば、成人に経口投与する場合には、一日の投与量は、マンネンタケ抽出物として０．１～１０００ｍｇ、好ましくは１～５００ｍｇ、より好ましくは５～３００ｍｇである。

また、本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、飲食品にも配合できる。本発明において、飲食品とは、一般的な飲食品のほか、医薬品以外で健康の維持や増進を目的として摂取できる食品、例えば、健康食品、機能性食品、保健機能食品、又は特別用途食品を含む意味で用いられる。健康食品には、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等の名称で提供される食品を含む。保健機能食品は食品衛生法又は食品増進法により定義され、特定の保健の効果や栄養成分の機能、疾病リスクの低減などを表示できる、特定保健用食品及び栄養機能食品、ならびに科学的根拠に基づいた機能性について消費者庁長官に届け出た内容を表示できる機能性表示食品が含まれる。また特別用途食品には、特定の対象者や特定の疾患を有する患者に適する旨を表示する病者用食品、高齢者用食品、乳児用食品、妊産婦用食品等が含まれる。本発明の造血幹細胞の分化促進剤は、特に高齢者、妊産婦、月経や出血傾向を伴う疾病（胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃腸のポリープや癌、痔等）時における貧血や貧血に伴う諸症状、免疫力低下の改善及び予防のために長期にわたって服用が必要となる場合に、日常的に継続して摂取できる点で上記の健康食品等に好適に用いることができる。ここで、飲食品に付される特定の保健の効果や栄養成分の機能等の表示は、製品の容器、包装、説明書、添付文書などの表示物、製品のチラシやパンフレット、新聞や雑誌等の製品の広告などにすることができる。

さらに、本発明の飲食品をヒト以外の哺乳動物を対象として使用する場合には、ペットフード、飼料を含む意味で用いることができる。

飲食品の形態は、食用に適した形態、例えば、固形状、液状、顆粒状、粒状、粉末状、カプセル状、クリーム状、ペースト状のいずれであってもよい。特に、上記の健康食品等の場合の形状としては、例えば、タブレット状、丸状、カプセル状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状（シロップ状、乳状、懸濁状を含む）等が好ましい。

飲食品の種類としては、パン類、麺類、菓子類、乳製品、水産・畜産加工食品、油脂及び油脂加工食品、調味料、各種飲料（清涼飲料、炭酸飲料、美容ドリンク、栄養飲料、果実飲料、乳飲料など）及び該飲料の濃縮原液及び調整用粉末等が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明の飲食品は、その種類に応じて通常使用される添加物を適宜配合してもよい。添加物としては、食品衛生法上許容されうる添加物であればいずれも使用できるが、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、異性化液糖、アスパルテーム、ステビア等の甘味料；クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸味料；デキストリン、デンプン等の賦形剤；結合剤、希釈剤、香料、着色料、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、安定剤、保存剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。

本発明の飲食品が一般的な飲食品の場合は、その飲食品の通常の製造工程においてマンネンタケ抽出物を添加する工程を含めることによって製造することができる。また健康食品の場合は、前記の医薬品の製造方法に準じればよく、例えば、タブレット状のサプリメントでは、マンネンタケ抽出物に、賦形剤等の添加物を添加、混合し、打錠機等で圧力をかけて成形することにより製造することができる。カプセル状のサプリメントでは、マンネンタケ抽出物を含有する液状、懸濁状、ペースト状、粉末状、又は顆粒状の食品組成物をカプセルに充填するか、又はカプセル基剤で被包成形して製造することができる。また、必要に応じてその他の材料（例えば、鉄、カリウム等のミネラル類、ビタミンＣ、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_６、ビタミンＢ_１２、葉酸等のビタミン類、食物繊維等）を添加することもできる。

本発明の飲食品におけるマンネンタケ抽出物の配合量は、造血幹細胞の分化促進作用が発揮できる量であればよいが、対象飲食品の一般的な摂取量、飲食品の形態、効能・効果、呈味性、嗜好性及びコストなどを考慮して適宜設定すればよい。

本発明の飲食品の摂取量は、前述の疾患又は病態の予防や改善を目的として摂取する場合、摂取させる対象の状態、摂取形態、摂食量等により異なるが、マンネンタケ抽出物として、成人１日につき、５００～１００００ｍｇ、好ましくは１０００～８０００ｍｇ、より好ましくは２０００～４０００ｍｇである。前記の量は１回で摂取させてもよいが、数回（２～４回）に分けて摂取してもよい。本発明の飲食品は、摂取量の目安とするため１回に摂取するべき量の飲食品が、１個の袋やビン等の容器に包装又は充填されていることが好ましい。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。

[実施例１]
（製造例１）赤霊芝の熱水抽出物の製造
赤霊芝（子実体）１００ｇに、精製水２Ｌを加え、９５～１００℃で２時間抽出した。濾過した後、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して赤霊芝の熱水抽出物４．４ｇを得た。

（製造例２）黒霊芝の熱水抽出物の製造
黒霊芝（子実体）１００ｇに、精製水２Ｌを加え、９５～１００℃で２時間抽出した。濾過した後、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝の熱水抽出物４．２ｇを得た。

（製造例３）赤霊芝の亜臨界水処理物（処理条件１）の熱水抽出物の製造
亜臨界水処理缶に、マンネンタケ原料として赤霊芝（子実体）４５ｇを入れ、処理条件１（処理温度：１４０℃、処理圧力：０．３７ＭＰａ、処理時間：３０分間）で亜臨界水処理を行った。亜臨界水処理の終了後、処理缶内の処理物を凍結乾燥させることで赤霊芝の亜臨界水処理物を得た。得られた赤霊芝の亜臨界水処理物１０ｇに、精製水２００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した。濾過した後、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して赤霊芝の亜臨界水処理物の熱水抽出物を０．６ｇ得た。

（製造例４）赤霊芝の亜臨界水処理物（処理条件２）の熱水抽出物の製造
亜臨界水処理缶に、マンネンタケ原料として赤霊芝（子実体）４５ｇを入れ、処理条件２（処理温度：１６０℃、処理圧力：０．６３ＭＰａ、処理時間：２０分間）で亜臨界水処理を行った。亜臨界水処理の終了後、処理缶内の処理物を凍結乾燥させることで赤霊芝の亜臨界水処理物を得た。得られた赤霊芝の亜臨界水処理物１０ｇに、精製水２００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した。濾過した後、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して赤霊芝の亜臨界水処理物の熱水抽出物を０．８ｇ得た。

（製造例５）赤霊芝の亜臨界水処理物（処理条件３）の熱水抽出物の製造
亜臨界水処理缶に、マンネンタケ原料として赤霊芝（子実体）４５ｇを入れ、処理条件３（処理温度：１８０℃、処理圧力：１．０１ＭＰａ、処理時間：３０分間）で亜臨界水処理を行った。亜臨界水処理の終了後、処理缶内の処理物を凍結乾燥させることで赤霊芝亜臨界水処理物を得た。得られた赤霊芝の亜臨界水処理物１０ｇに、精製水２００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した。濾過した後、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して赤霊芝の亜臨界水処理物の熱水抽出物を２．６ｇ得た。

（製造例６）黒霊芝の亜臨界水処理物（処理条件１）の熱水抽出物の製造
亜臨界水処理缶に、マンネンタケ原料として黒霊芝（子実体）４５ｇを入れ、処理条件１（処理温度：１４０℃、処理圧力：０．３７ＭＰａ、処理時間：３０分間）で亜臨界水処理を行った。亜臨界水処理の終了後、処理缶内の処理物を凍結乾燥させることで黒霊芝の亜臨界水処理物を得た。得られた黒霊芝の亜臨界水処理物１０ｇに、精製水２００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した。濾過した後、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝の亜臨界水処理物の熱水抽出物を０．６ｇ得た。

（製造例７）黒霊芝亜臨界水処理物（処理条件２）の熱水抽出物の製造
亜臨界水処理缶に、マンネンタケ原料として黒霊芝（子実体）４５ｇを入れ、処理条件２（処理温度：１６０℃、処理圧力：０．６３ＭＰａ、処理時間：２０分間）で亜臨界水処理を行った。亜臨界水処理の終了後、処理缶内の処理物を凍結乾燥させることで黒霊芝亜臨界水処理物を得た。得られた黒霊芝の亜臨界水処理物１０ｇに、精製水２００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した。濾過した後、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝の亜臨界水処理物の熱水抽出物を１．０ｇ得た。

（製造例８）黒霊芝亜臨界水処理物（処理条件３）の熱水抽出物の製造
亜臨界水処理缶に、マンネンタケ原料として黒霊芝（子実体）４５ｇを入れ、処理条件３（処理温度：１８０℃、処理圧力：１．０１ＭＰａ、処理時間：３０分間）で亜臨界水処理を行った。亜臨界水処理の終了後、処理缶内の処理物を凍結乾燥させることで黒霊芝亜臨界水処理物を得た。得られた黒霊芝の亜臨界水処理物１０ｇに、精製水２００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した。濾過した後、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝の亜臨界水処理物の熱水抽出物を２．４ｇ得た。

[実施例２]造血幹細胞の分化促進効果の評価
実施例１で製造した抽出物（製造例１～８)、及び当該抽出物の混合物（製造例９、１０）の造血幹細胞に対する分化促進効果の評価実験を次のとおり行った。

造血幹細胞として、A6細胞（RIKEN BRC Cell Bank)を用いた。20%FBS DMEM/F12 (10μg/mL bovine insulin, 10μg/mL bovine Transferrin, 10ng/mL bFGF)培地（Gibco社製）で維持した上記造血幹細胞を、細胞数が7.5×10⁵個となるように12ウェルプレート（Falcon社製）に播種した。次に、上記培地を分化培地である20%FBS DMEM/F12 (10μg/mL bovine insulin, 10μg/mL bovine Transferrin, 10ng/mL G-CSF, 10ng/mL IL-3, 10ng/mL IL-6, 15ng/mL EPO, 100ng/mL SCF, 10ng/mL IL-7, 10ng/mL FLT-3L)培地（Gibco社製）に置き換え、被験物質（製造例１～１０の各抽出物）を最終濃度が100μg/mLとなるように添加し、96時間培養した。抽出物の混合物の場合は各抽出物の比率が同じになるように添加し、抽出物の総和が上記の濃度となるようにした。

培養96時間後に細胞を回収し、PBS(-)にて2回洗浄し、Trizol Reagent(Invitrogen社製)によって細胞からRNAを抽出した。2-STEPリアルタイムPCRキット(Applied Biosystems社製)を用いて、抽出したRNAをcDNAに逆転写した後、ABI7300(Applied Biosystems社製)により、下記のプライマーセットを用いてリアルタイムPCR(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を実施し、Ｂ細胞マーカーであるPtprc（Protein-tyrosine phosphatase, receptor-type c）、Ｔ細胞マーカーであるCd3e（CD3-epsilon polypeptide)、ＮＫ細胞マーカーであるId3（Inhibitor of DNA binding 3）の遺伝子発現を確認した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。

（Ptprc用プライマーセット）
5'-ACCTGCTCGCACCACTGAA-3' (配列番号１)
5'-CCTGGATGATATGTGGTCTCTGAAG-3' (配列番号２)
（Cd3eプライマーセット）
5'-TCCTGTGCCTCAGCCTCCTA-3' (配列番号３)
5'-ATTCAATGTTCTCGGCATCGT-3' (配列番号４)
（Id3プライマーセット）
5'-TCCGGAACTTGTGATCTCCAA-3' (配列番号５)
5'-CAGGACGACCGGGTCAGT-3' (配列番号６)
（18srRNA(内部標準)用プライマーセット）
5'-CCGAGCCGCCTGGATAC-3' (配列番号７）
5'-CAGTTCCGAAAACCAACAAAATAGA-3'(配列番号８）

造血幹細胞の分化促進効果は、抽出物を添加していない細胞におけるPtprc、Cd3e、Id3のmRNAの発現量を内部標準である18s ribosomal RNA（18srRNA）の発現量に対する割合として算出したPtprc、Cd3e、Id3の各遺伝子相対発現量(Ptprc、Cd3e、Id3の各遺伝子発現量/18srRNA遺伝子発現量)の値を1とし、これに対し、抽出物を添加して培養した細胞におけるPtprc、Cd3e、Id3の各遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。これらの試験結果を以下の表１に示す。

表１に示すように、マンネンタケ（赤霊芝、黒霊芝）の抽出物に優れた造血幹細胞の分化促進効果が認められた(製造例１～８）。特に、亜臨界水処理物の溶媒抽出物は、造血幹細胞の分化促進効果が顕著であり（製造例３～８）、赤霊芝の抽出物と黒霊芝の抽出物を混合すると、相乗効果が認められた（製造例１０）。

本発明の造血幹細胞の血液細胞への分化促進剤は、生体内で又は生体外で、造血幹細胞を効率的に血液細胞に分化誘導させることができる。よって、本発明は、造血幹細胞の分化機能低下又は不全に関連する血液又は造血器の疾患又は病態を治療、改善、及び予防するための医薬品やサプリメントなどの製造分野、移植材料の製造分野において利用できる。

Claims

マンネンタケの亜臨界水処理物の熱水抽出物を有効成分として含有する、造血幹細胞の血液細胞への分化促進剤。
前記マンネンタケの亜臨界水処理物が、温度が１００～３００℃、かつ圧力が飽和蒸気圧以上の亜臨界状態にある水による処理物である、請求項１に記載の造血幹細胞の血液細胞への分化促進剤。
造血幹細胞を、請求項１又は２に記載の剤を含有する培地で培養する工程を含む、造血幹細胞の血液細胞への分化促進方法。
造血幹細胞を、請求項１又は２に記載の剤を含有する培地で培養する工程を含む、血液細胞の製造方法。
請求項１又は２に記載の剤を含有する、造血幹細胞の血液細胞への分化促進用組成物。