食道ガン及び食道ガン転移診断のための組成物及び方法 技術分野
[0001] 本発明は、食道ガン及び食道ガン転移の診断 (すなわち、検出、判定又は予測)の ための糸且成物、該組成物を利用した食道ガンの存在又は転移を検出、判定又は予 測する方法、並びに該組成物を利用した食道ガン及び食道ガン転移診断用キット〖こ 関する。
背景技術
[0002] 食道は咽頭と胃の間をつなぐ管腔状の臓器であり、大部分は胸腔、一部は頸部と 腹腔に存在する。胸腔の上部では気管と脊椎の間にあり、下部では心臓、大動脈と 肺に囲まれて 、る。食道は口力 食べた食物を胃に送る働きをする。
[0003] 日本人の 2001年のガンによる死亡率は 10万人中 238. 8人である。死亡原因の中 で食道ガンが占める割合は年々増加しており、 2001年度には男性では全ガン死亡 例の 5. 0%、女性では 1. 4%が食道ガンであった。食道ガンの発症年齢のピークは 60〜70歳代にあり、男性に発症が多い。また喫煙、飲酒、熱い嗜好物などの環境要 因が発生に密接に関連する。さらに食道壁内部や周辺は血管やリンパ管が豊富であ るため、発生したガンの転移が多!ヽことが知られて ヽる。
[0004] 食道ガンの治療は進行度(日本食道疾患研究会編 臨床'病理 食道ガン取り扱 い規約 1999年)や転移、全身状態を考慮して決定する。食道ガンの標準的な治療 法は日本食道疾患研究会編「食道ガン治療ガイドライン」(2002年)に示されている 。現在最も一般的な療法は手術療法であり、ガンを含めた食道とリンパ節を含む周囲 の組織を切除 (リンパ節郭清)した上で、胃など他の臓器を用いて食道を再建する。 ただし手術療法、特に広範囲のリンパ節郭清は患者に大きな負担を与え、手術後の QOL低下への配慮も必要である。粘膜内にとどまる早期のガンの場合には内視鏡 的粘膜切除術が可能である場合がある。また根治療法、対症療法の両面から放射線 照射が行われる場合がある。さらに手術療法や放射線療法と組み合わせて化学療 法が行われる。化学療法では現在、 5— fluorouracilと cisplatinの併用療法が最も
有効であると考えられて 、る。
[0005] 食道ガンは嚥下時の違和感、嚥下困難、胸骨後部痛や胸部違和感と 、つた自覚 症状を覚えた患者の受診によって発見されることが多 、。し力しながらこれらの症状 が発現するのは食道内でガンが成長した結果であり、自己所見による受診時に発見 されるガンはすでに食道壁外進展や転移が起こっており予後不良であることが多い。 したがって手術時には食道周辺のリンパ節拡清を行うことが多いが、この時転移の有 無が予見できていれば、拡清の範囲を術前に正確に決定することや、拡清の範囲を 限定し術後の患者の QOLに貢献することが可能である。
[0006] 食道ガンは食道造影検査及び内視鏡検査と生検組織検査にて診断が確定される
。生検標本は内視鏡検査時や手術時に採取され、病理標本を作製した上で病理組 織学的分類によって診断される。この時、内視鏡検査で得られた細胞の性質から食 道外への転移の有無が予測できる、迅速で簡便な診断法の開発が求められている。
[0007] 現在までに、食道ガン組織に特異的に含まれるマーカーを用いた分子生物学的診 断方法が提案されている。この方法は迅速で客観的な結果をもたらし、迅速な診断 の助けとなる。
[0008] これまでに食道ガンの臨床検査用マーカーとして血清中のタンパク質マーカーで ある SCC、 CYFRA21— 1、 CEAなどが活用されているほか、特許文献 1、 2に記載 のタンパク質などが報告されている。し力しこれらのマーカーは感度、特異度が乏しく 、もっとも感度が高いとされている CYFRA21— 1についても、その感度は 33. 9% ( 非特許文献 1)力 43. 9% (非特許文献 2)程度である。したがってこれらの血清中 マーカー及びその組み合わせの検出によって食道ガン細胞の存在の有無が確定さ れると 、う段階には至って 、な 、し、これらを用いて食道ガンの転移を診断することも できていない。
[0009] 一方、被験者より採取された生検試料に食道ガン細胞が含まれて!/ヽるカゝ否カゝを特 異的に判断するための遺伝子を利用したマーカーとしては、染色体異常 (例えば特 許文献 3, 4参照)や遺伝子の後成的配列(例えば特許文献 5)が開示されて 、るほ 、 DNAチップによる網羅的遺伝子発現解析の結果が複数報告されている (例えば 非特許文献 3〜8参照)。さらに単独の遺伝子発現を指標としたマーカーとしては、特
許文献 6、非特許文献 9、 10に示される SPRR3遺伝子(Small proline— rich pro tein 3)、非特許文献 11に示される fgf 3遺伝子、特許文献 6、非特許文献 12に示さ れる CSTB遺伝子(cystatin B、 liver thiol proteinase inhibitor)、特許文献 7 に示される UCP2遺伝子(mitochondrial uncoupling protein 2)、特許文献 6に 示される UPK1A遺伝子(uroplakin 1A)、非特許文献 13に示される HSPA1B遺 伝子(Heat Shock 70kDa Protein 1)などが報告されている。
特許文献 1:特開 2003-259872号公報
特許文献 2:特表 2000- 511536号公報
特許文献 3 :特開 2001- 17200号公報
特許文献 4:特開 2002- 272497号公報
特許文献 5:特表 2004- 505612号公報
特許文献 6 :国際公開第 2003/042661号パンフレット
特許文献 7:国際公開第 2003/076594号パンフレット
非特許文献 l :Nakamura, T.ら、 1998、 Diseases of the Esophagus、第 11 卷、 p. 35- 39
非特許文献 2 :Kawaguchi, Hら、 2000、 Cancer,第 89卷、 p. 1413- 1417 非特許文献 3 :Luo, A.ら、 2004年、 Oncogene,第 23卷、 p.1291-1299 非特許文献 4:Zhi, H.ら、 2003年、 International Journal of Cancer,第 106卷 、 p.327-333
非特許文献 5 :Lu, J.ら、 2001年、 International Journal of Cancerゝ第 91卷、 p. 288-294
非特許文献 6 :Kazemi- Noureini, S.ら、 2004年、 World Journal of Gastroent erology、第 10卷、 p.1716 - 1721
非特許文献 7 :Xu, S. H.ら、 2003年、 World Journal of Gastroenterology、第 9卷、 p.417-422
非特許文献 8 : Su, H.ら、 2003年、 Cancer Research,第 63卷、 p.3872- 3876 非特許文献 9 : Chen, B.S.ら、 2000年、 Carcinogenesis,第 21卷、 p.2147- 215 0
非特許文献 10 : Abraham, J.M.ら、 1996年、 Cell Growth & Differentiation, 第 7卷、 p.855-860.
非特許文献 ll :Kitagawa, Y.ら、 1991年、 Cancer Research,第 51卷、 p.1504 -1508
非特許文献 12 : Shiraishi,T.ら、 1998年、 International Journal of Cancer,第 79卷、 p.175-178
非特許文献 13 :Kawanishi, K.ら、 1999年、 Cancer,第 85卷、 p.1649- 1657 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] し力しながら、上記の既存の指標は特異性及び Z又は感受性に乏しいことや、生 体試料からのその効率的な検出方法が確立していないことから一般に臨床上の利用 は行われておらず、また患者の予後を決定する大きな要因である食道ガン転移の有 無を診断マーカーを用いて検出することは、現在不可能と考えられる。そこで特異性 及び感受性が高 、食道ガン転移のマーカーが切望されて 、る。
[0011] 本発明は、食道ガンの診断、食道ガン転移の診断、及び食道ガンの治療に有用な 疾患判定用組成物、キット又は DNAチップを提供することを目的とする。
[0012] 本発明はまた、上記組成物、キット又は DNAチップを用いて食道ガンの存在又は 転移を検出、判定又予測するための方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0013] マーカー探索の方法としては、食道ガン細胞と非ガン細胞における遺伝子発現や タンパク質発現、又は細胞の代謝産物などの量を何らかの手段によって比較する方 法や食道ガン患者と非ガン患者の体液中に含まれる遺伝子、タンパク質、代謝産物 などの量を測定する方法、食道ガン細胞のうち、手術時にリンパ節転移があった患者 由来の食道ガン細胞と手術時にリンパ節転移がな力つた患者由来の食道ガン細胞 における遺伝子発現やタンパク質発現、又は細胞の代謝産物などの量を何らかの手 段によって比較する方法や転移性食道ガン患者と非転移性食道ガン患者の体液中 に含まれる遺伝子、タンパク質、代謝産物などの量を測定する方法などが挙げられる
[0014] DNAアレイを用いた発現遺伝子量解析は、近年、このようなマーカー探索の手法 として特に汎用されている。 DNAアレイには数百カゝら数万種の遺伝子に対応した塩 基配列を利用したプローブが固定されている。被検試料を DNAアレイに添加するこ とによって試料中の遺伝子がプローブと結合し、この結合量を何らかの手段によって 測定することにより、被検試料中の遺伝子量を知ることができる。 DNAアレイ上に固 定ィ匕するプローブに対応した遺伝子の選択は自由であり、また被検試料に手術時に リンパ節転移があった患者由来の食道ガン細胞と手術時にリンパ節転移がな力つた 患者由来の食道ガン細胞を用いて、試料中の発現遺伝子量を比較することによって 食道転移ガンマーカーとなりうる遺伝子群を推定することが可能である。
[0015] 上記の課題を解決するために、本発明者らは、食道ガン組織及び非ガン組織の遺 伝子発現を DNAアレイによって解析し、食道ガンの検出マーカーに使用可能な遺 伝子を見出し、さらにそれらの遺伝子の発現量力 非ガン組織と比較して食道ガン組 織にぉ 、て有意に変化して 、ること、食道ガン患者と健常人の血漿にぉ 、て食道ガ ン患者に特異的に検出されるタンパク質マーカーが存在すること、さらにまた、手術 時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織と手術時にリンパ節転移がなか つた患者由来の食道ガン組織の遺伝子発現を DNAアレイによって解析し、食道ガ ン転移の検出マーカーとして使用可能な遺伝子を見出し、それらの遺伝子の発現量 力 手術時にリンパ節転移がな力つた患者由来の食道ガン細胞に比較して手術時に リンパ節転移があった患者由来の食道ガン細胞にお 、て有意に変化して 、ること、を 見出し、本発明を完成させた。
1.発明の概要
本発明は、以下の特徴を有する。
[0016] (1)下記の I群、 II群及び/又は III群:
I群:
(a)配列番号 1〜46で表される塩基配列力 なるポリヌクレオチド、その変異体、ま たは 15以上の連続した塩基を含むその断片、
(b)配列番号 1〜46で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(c)配列番号 1〜46で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオ
チド、その変異体、または 15以上の連続した塩基を含むその断片、
(d)配列番号 1〜46で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオ チド、及び
(e)前記(a)〜(d)の!、ずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブ リダィズするポリヌクレオチド、または 15以上の連続した塩基を含むその断片、 力もなるポリヌクレオチド、
Π群:
(f)配列番号 142〜155、 157〜161で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチド 、その変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むその断片、
(g)配列番号 142〜 155、 157〜 161で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(h)配列番号 142〜155、 157〜161で表される塩基配列に相補的な塩基配列か らなるポリヌクレオチド、その変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むその断片、
( 配列番号 142〜 155、 157〜 161で表される塩基配列に相補的な塩基配列を 含むポリヌクレオチド、及び
(j)前記 (f)〜 (i)の 、ずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノヽイブリ ダイズするポリヌクレオチド、又は 15以上の連続した塩基を含むその断片、 力もなるポリヌクレオチド、
III群:
(k)配列番号 1〜46で表される塩基配列によってコードされるポリペプチド、又は配 列番号 95〜 140で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、それらの変異体、或 いはそれらの断片の少なくとも 1つと特異的に結合する抗体、その断片或いはその化 学修飾誘導体、
(1)配列番号 142〜155、 157〜161で表される塩基配列によってコードされるポリ ペプチド、或いは配列番号 182〜195、 197〜201で表されるアミノ酸配列を有する ポリペプチド、それらの変異体、或いはそれらの断片の少なくとも 1つと特異的に結合 する抗体、その断片或いはその化学修飾誘導体、及び
(m)配列番号 202〜232で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、それらの変 異体、或いはそれらの断片の少なくとも 1つと特異的に結合する抗体、その断片或い
はその化学修飾誘導体、
力 なる抗体、その断片或いはその化学修飾誘導体、
力も選択される 1又は 2以上のプローブを含んでなる、被験者における食道ガンの存 在又は転移をインビトロで検出、判定又は予測するための組成物。
[0017] (2)前記 I群及び ΠΙ群 (k)の各プローブによって食道ガンの存在又は転移を検出、 判定又は予測することができる、 (1)に記載の組成物。
[0018] (3)前記 II群及び ΠΙ群 (1)、(m)の各プローブによって食道ガンの存在を検出、判 定又は予測することができる、 (1)に記載の組成物。
[0019] (4)前記ポリヌクレオチドが DNA又は RNAである、(1)に記載の組成物。
[0020] (5)前記 I群及び Π群における断片が、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオ チドである、(1)に記載の組成物。
[0021] (6)前記 I群及び Π群における断片が、配列番号 1〜46、 142〜155、 157〜161 のいずれかで表される塩基配列において、それぞれ配列番号 48〜93、 162-175 、 177〜181のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌク レオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、 (1)に記載の組 成物。
[0022] (7)前記 I群及び Π群における断片が、配列番号 48〜93、 162〜175、 177〜181 の!、ずれかで表される塩基配列、又はこれらに相補的な塩基配列を含むポリヌクレ ォチドである、(1)に記載の組成物。
[0023] (8)前記 I群のプローブにカ卩えて、配列番号 47で表される塩基配列からなるポリヌク レオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリ ンジ ントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオ チドの 15以上の連続した塩基を含む断片をプローブとしてさらに含む、(1)に記載の 組成物。
[0024] (9)前記断片が、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドである、 (8)に記 載の組成物。
[0025] (10)前記断片が、配列番号 47で表される塩基配列にぉ 、て、配列番号 94で表さ れる塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩
基配列を含むポリヌクレオチドである、 (8)に記載の組成物。
[0026] (11)前記断片が、配列番号 94で表される塩基配列、又はこれに相補的な塩基配 列を含むポリヌクレオチドである、 (8)に記載の組成物。
[0027] (12)前記 II群のプローブにカ卩えて、配列番号 156で表される塩基配列からなるポリ ヌクレオチド、その相補的配列力もなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとス トリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレ ォチドの 15以上の連続した塩基を含む断片をプローブとしてさらに含む、請求項 1に 記載の組成物。
[0028] (13)前記断片が、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドである、(12)に 記載の組成物。
[0029] (14)前記断片が、配列番号 156で表される塩基配列において、配列番号 176で 表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な 塩基配列を含むポリヌクレオチドである、 (12)に記載の組成物。
[0030] (15)前記断片が、配列番号 176で表される塩基配列、又はこれに相補的な塩基 配列を含むポリヌクレオチドである、 (12)に記載の組成物。
[0031] (16)前記 III群 (m)のプローブに加えて、配列番号 233で表されるポリペプチド、そ の変異体又はその断片の少なくとも 1つと特異的に結合する抗体、その断片又はそ の化学修飾誘導体をさらに含む、 (1)に記載の組成物。
[0032] (17)前記ポリペプチド又は変異体の断片力 少なくとも 7個のアミノ酸力 なるェピ トープを含む、(1)に記載の組成物。
[0033] (18)前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、合成抗体、組換え抗 体、多重特異性抗体又は単鎖抗体である、(1)に記載の組成物。
[0034] (19)前記 I群及び/又は II群、或いは III群、力も選択される 2以上のプローブを、単 独で又は組み合わせて含む、(1)に記載の組成物。
[0035] (20)請求項 1に定義される I群、 II群及び/又は III群力 選択される 1又は 2以上の プローブを含む、被験者における食道ガンの存在又は転移をインビトロで検出、判定 又は予測するためのキット。
[0036] (21)配列番号 47で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相補的配列
力もなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、ィ ブリダィズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの 15以上の連続した 塩基を含む断片をプローブとしてさらに含む、(20)に記載のキット。
[0037] (22)配列番号 156で表される塩基配列力 なるポリヌクレオチド、その相補的配列 力もなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、ィ ブリダィズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの 15以上の連続した 塩基を含む断片をプローブとしてさらに含む、(20)に記載のキット。
[0038] (23)前記ポリヌクレオチド力 配列番号 1〜46、 47のいずれかで表される塩基配 列からなるポリヌクレオチド、その相補的配列力もなるポリヌクレオチド、それらのポリ ヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、または それらの 15以上の連続した塩基を含む断片である、 (20)に記載のキット。
[0039] (24)前記ポリヌクレオチドが、配列番号 142〜155、 156、 157〜161のいずれ力 で表される塩基配列力 なるポリヌクレオチド、その相補的配列力 なるポリヌクレオ チド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件下でノ、イブリダィズするポリヌク レオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの 15以上の連続した塩基を含む断片である 、 (20)に記載のキット。
[0040] (25)前記 I群及び Π群における断片が、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオ チドである、 (20)に記載のキット。
[0041] (26)前記 I群における断片力 配列番号 1〜46、 47のいずれかで表される塩基配 列にお!/、て、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド中にそれぞれ配列番号 48〜93、 94のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌク レオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、 (20)に記載のキ ッ卜。
[0042] (27)前記 II群における断片が、配列番号 142〜155、 156、 157〜161のいずれ かで表される塩基配列において、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド中 にそれぞれ配列番号 162〜175、 176、 177〜 181のいずれかで表される塩基配列 を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含む ポリヌクレオチドである、 (20)に記載のキット。
[0043] (28)前記 I群又は II群における断片力 配列番号 48〜93、 94、 162〜175、 176
、 177〜181のいずれかで表される塩基配列、またはこれらに相補的な塩基配列を 含むポリヌクレオチドである、 (20)に記載のキット。
[0044] (29)前記 I群又は II群における断片力 配列番号 48〜93、 94、 162〜175、 176
、 177〜181のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、 (20) に記載のキット。
[0045] (30)配列番号 48〜93、 94で表される塩基配列またはその相補的配列を含むポリ ヌクレオチドの 2以上から全部を含む、 (20)に記載のキット。
[0046] (31)配列番号 162〜175、 176、 177〜181で表される塩基配列又はその相補的 配列を含むポリヌクレオチドの 2以上力 全部を含む、(20)に記載のキット。
[0047] (32)前記プローブ力 単独でまたは組み合わせて異なる容器に包装されている、 (
20)に記載のキット。
[0048] (33)請求項 1に定義される I群及び/又は II群力 選択される 1又は 2以上のプロ一 ブを含む、被験者における食道ガンの存在又は転移の 、ずれかをインビトロで検出
、判定又は予測するための DNAチップ。
[0049] (34)配列番号 47で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体および
/またはその断片をさらに含む、(33)に記載の DNAチップ。
[0050] (35)配列番号 156で表される塩基配列力 なるポリヌクレオチド、その変異体およ び/またはその断片をさらに含む、(33)に記載の DNAチップ。
[0051] (36)配列番号 48〜93、 94で表される塩基配列またはその相補的配列を含むポリ ヌクレオチドの 2以上〜全部を含む、 (33)に記載の DNAチップ。
[0052] (37)配列番号 162〜175、 176、 177〜181で表される塩基配列又はその相補的 配列を含むポリヌクレオチドの 2以上〜全部を含む、 (33)に記載の DNAチップ。
[0053] (38)被験者由来の生体試料中の 1又は複数の食道ガン関連標的核酸の存在又 は存在量若しくは発現量を、請求項 1に定義される I群、 II群及び/又は III群から選 択されるプローブを用いてインビトロで測定することを含む、食道ガンの存在又は転 移をインビトロで検出、判定又は予測する方法。
[0054] (39)前記測定を DNAチップを用いて行う、 (38)に記載の方法。
[0055] (40)前記食道ガンの存在又は転移の検出、判定又は予測を、対照試料からの変 化を指標にして決定する、(38)に記載の方法。
[0056] (41)前記測定を免疫学的方法によって行う、(38)に記載の方法。
[0057] (42)前記免疫学的方法による測定が、前記 ΠΙ群の抗体、その断片、又はその化 学修飾誘導体を用いて行われる、(41)に記載の方法。
[0058] (43)前記抗体、その断片、又はその化学修飾誘導体が標識されている、 (42)に 記載の方法。
[0059] (44)前記生体試料が食道由来の組織又は細胞、血液、血漿、血清、或いは尿で ある、 (38)に記載の方法。
[0060] (45)被験者由来の生体試料中の 1又は複数の食道ガン関連標的核酸の存在又 は量若しくは発現量を、(1)〜(19)のいずれかに記載の組成物、(20)〜(32)のい ずれかに記載のキット、又は(33)〜(37)の!、ずれかに記載の DNAチップを用いて インビトロで測定することを含む、食道ガンの存在又は転移をインビトロで検出、判定 又は予測する方法。
[0061] (46) (1)に定義される I群力 選択されるプローブ、或いは、該プローブを含む、 (1 ;)〜(19)のいずれかに記載の組成物、(20)〜(32)のいずれかに記載のキット、又 は(33)〜(37)のいずれか〖こ記載の DNAチップを用いて、転移を伴う(すなわち、 転移性)食道ガン又は転移を伴わな!/ヽ (すなわち、非転移性)食道ガン細胞を含む 組織であることが既知の複数の生体試料中の食道ガン関連標的核酸の発現量をィ ンビトロで測定する第 1の工程、該第 1の工程で得られた該標的核酸の発現量の測 定値を教師とした判別式 (サポートベクターマシーン)を作成する第 2の工程、被験者 の食道由来の生体試料中の該標的核酸の発現量を第 1の工程と同様にインビトロで 測定する第 3の工程、該第 2の工程で得られた判別式に第 3の工程で得られた該標 的核酸の発現量の測定値を代入し、該判別式力 得られた結果に基づいて、生体 試料中に転移を伴うガン細胞が含まれな 、こと及び Z又は転移を伴わな 、ガン細胞 が含まれることを判定する第 4の工程を含む、食道ガンの転移を検出、判定又は予 測する方法。
[0062] (47) (1)に定義される II群力 選択されるプローブ、或いは、該プローブを含む、 (
1)〜(19)のいずれかに記載の組成物、(20)〜(32)のいずれかに記載のキット、又 は(33)〜(37)の 、ずれか〖こ記載の DNAチップを用いて、食道ガン細胞を含む組 織又は正常組織であることが既知の複数の生体試料中の標的核酸の発現量をイン ビトロで測定する第 1の工程、該第 1の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定 値を教師とした判別式 (サポートベクターマシーン)を作成する第 2の工程、被験者の 食道由来の生体試料中の該標的核酸の発現量を第 1の工程と同様にインビトロで測 定する第 3の工程、該第 2の工程で得られた判別式に第 3の工程で得られた該標的 酢酸の発現量の測定値を代入し、該判別式力 得られた結果に基づいて、生体試 料中にガン細胞が含まれること又はガン細胞が含まれな 、ことを判定する第 4の工程 を含む、食道ガンを検出する方法。
[0063] (48) (1)に定義される I群、 II群及び/又は III群力 選択されるプローブ、或いは、 該プローブを含む、(1)〜(19)のいずれかに記載の組成物、(20)〜(32)のいずれ かに記載のキット、又は(33)〜(37)のいずれかに記載の DNAチップの、被験者由 来の生体試料中の食道ガンの存在又は転移をインビトロで検出、判定又は予測する ための使用方法。
2.錢
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
[0064] 本明細書において「プローブ」とは、食道ガンの存在又は転移を検出、判定又は予 測するための、食道ガン関連マーカーである特定の遺伝子類又はそれらをコードす るポリペプチド類と結合可能な核酸、抗体又はそれらの均等物を指す。
[0065] 本明細書中で特に断らない限り、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド 、ポリペプチド、タンパク質など用語の意味及びそれらの略号による表示は、当技術 分野における慣用の意味及び表示に従うものとする。
[0066] 本明細書にぉ 、て「ポリヌクレオチド」とは、 RNA及び DNAの!、ずれも包含する核 酸として用いられる。なお、上記 DNAには、 cDNA、ゲノム DNA、及び合成 DNAの いずれもが含まれる。また上記 RNAには、 totalRNA、 mRNA、 rRNA、及び合成 R NAのいずれもが含まれる。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に 使用される。
[0067] 本明細書にぉ 、て「cDNA」とは、遺伝子の発現によって生じた RNAに相補的な 配列の DNA鎖全長、及びその部分配列からなる DNA断片、を包含する。 cDNAは 、 RNAを铸型にして、ポリ Tプライマーを用いる RT—PCR (逆転写酵素一ポリメラー ゼ連鎖反応)によって合成されうる。
[0068] 本明細書にぉ 、て「遺伝子」とは、 2本鎖 DNAのみならず、それを構成する正鎖( 又はセンス鎖)又は相補鎖 (又はアンチセンス鎖)などの各 1本鎖 DNAを包含するこ とを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って 、本明細書において「遺伝子」は、特に断らない限り、ヒトゲノム DNAを含む 2本鎖 D NA、 cDNAを含む 1本鎖 DNA (正鎖)、該正鎖と相補的な配列を有する 1本鎖 DN A (相補鎖)、及びこれらの断片のいずれも含む。また該「遺伝子」は特定の塩基配列 (又は配列番号)で示される「遺伝子」だけではなぐこれらによってコードされるタン パク質と生物学的機能が同等であるタンパク質、例えば同族体 (すなわち、ホモログ) 、スプライスノリアントなどの変異体、及び誘導体をコードする「遺伝子」が包含される 。力かる同族体、変異体又は誘導体をコードする「遺伝子」としては、具体的には、後 に記載したストリンジェントな条件下で、上記の配列番号 1〜47、 142〜161などで 示されるいずれかの特定の塩基配列と相補的な配列とハイブリダィズする塩基配列 を有する「遺伝子」を挙げることができる。
[0069] 例えばヒト由来のタンパク質の同族体 (すなわち、ホモログ)又はそれをコードする 遺伝子としては、当該タンパク質又はそれをコードするヒト遺伝子に対応する他生物 種のタンパク質又は遺伝子が例示でき、これらのタンパク質又は遺伝子ホモログは、 HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homoloGene/)により同定す ことができる。具体的には特定のヒトアミノ酸又は塩基配列を BLASTプログラム (Kar lm, ¾.ら、 Proceedings of the National Academic sciences U.S.A.、 1993 年、第 90卷、 p.5873—5877、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)に力 けて一致する(Scoreが最も高ぐ E— valueが 0でかつ Identifyが 100%を示す)配 列の登録番号(accession number)を取得することができる。 BLASTプログラムと しては、 BLASTN (遺伝子)、 BLASTX (タンパク質)などが知られている。例えば、 遺伝子検索の場合、上記 BLAST検索からの登録番号を UniGene (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)に入力して得られた UniGeneClusterID (Hs.で 示す番号)を HomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト 遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト 遺伝子に対応する遺伝子ホモログとして、他生物種の遺伝子を選抜することができる 。またこの方法において、 BLASTプログラムの代わりに FASTAプログラム(http:〃 www.ddbj. nig. ac. jpz searcn/ fasta— e. html)を用 ヽ飞もよ ヽ。
[0070] なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなぐ例えば発現制御領域、コー ド領域、ェキソン又はイントロンを含むことができる。
[0071] 本明細書において「転写産物」とは、遺伝子の DNA配列を铸型にして合成された メッセンジャー RNA (mRNA)のことを!、う。 RNAポリメラーゼが遺伝子の上流にある プロモーターと呼ばれる部位に結合し、 DNAの塩基配列に相補的になるように 3'末 端にリボヌクレオチドを結合させて 、く形でメッセンジャー RNAが合成される。このメ ッセンジャー RNAには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、ェ キソン又はイントロンをはじめとする転写開始点力 ポリ A配列の末端にいたるまでの 全配列が含まれる。
[0072] 本明細書において「翻訳産物」とは、転写によって合成されたメッセンジャー RNA 力 Sスプライシングなどの修飾を受ける/受けないにかかわらず、その情報を元に合成 されたタンパク質を示す。メッセンジャー RNAの翻訳過程においては、まずリボソ一 ムとメッセンジャー RNAが結合し、次にメッセンジャー RNAの塩基配列に従ってアミ ノ酸がつながっていき、タンパク質が合成される。
[0073] 本明細書にぉ 、て「プライマー」とは、遺伝子の発現によって生じた RNA又はそれ に由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し、増幅する、連続するポリヌクレオチド 及び Z又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
[0074] ここで相補的なポリヌクレオチド (相補鎖、逆鎖)とは、配列番号によって定義される 塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列、(ここでは便宜上 、これを正鎖と呼ぶ)に対して A:T(U)、 G : Cといった塩基対合に基づいて、塩基的 に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、力かる相補鎖は、対象と する正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖と
ストリンジェントな条件下でハイブリダィズできる程度の相補関係を有するものであつ てもよい。
[0075] 本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、プローブが他の配列に対するより も、検出可能により大きな程度 (例えば、バックグラウンドよりも少なくとも 2倍)で、その 標的配列に対してハイブリダィズする条件を 、う。ストリンジヱントな条件は配列依存 性であり、ハイブリダィゼーシヨンが行われる環境によって異なる。ハイブリダィゼーシ ヨン及び Z又は洗浄条件のストリンジエンシーを制御することにより、プローブに対し て 100%相補的である標的配列が同定され得る。
[0076] 本明細書にぉ 、て「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異、転写時の選択 的スプライシングなどに起因した天然の変異体、ある 、は遺伝暗号の縮重に基づく 変異体、あるいは配列番号 1〜47、 142〜161などで表される塩基配列又はその部 分配列において 1以上、好ましくは 1もしくは数個、の塩基の欠失、置換、付加又は挿 入を含む変異体、あるいは該塩基配列又はその部分配列と約 80%以上、約 85%以 上、約 90%以上、約 95%以上、約 97%以上、約 98%以上、約 99%以上の%同一 性を示す変異体、あるいは該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又 はオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でノ、イブリダィズする核酸を 意味し、一方、タンパク質又はペプチドの場合、配列番号 95〜141、 182〜201、 2 02〜233などで表されるアミノ酸配列又はその部分配列おいて 1以上、好ましくは 1 もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは該アミ ノ酸配列又はその部分配列と約 80%以上、約 85%以上、約 90%以上、約 95%以 上、約 97%以上、約 98%以上、約 99%以上の%同一性を示す変異体を意味する。
[0077] 本明細書において「数個」とは、約 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3又は 2個の整数を意味 する。
[0078] 本明細書において「%同一性」は、上記の BLASTや FASTAによるタンパク質又 は遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して又は導入しないで、決定する ことができる (Karlin, S.ら、 1993年、 Proceedings of the National Academic Sciences U. S. A.、第 90卷、 p.5873- 5877 ;Altschul, S. F.ら、 1990年、 Jou rnal of Molecular Biology,第 215卷、 p. 403— 410 ; Pearson, W. R.ら、 1
988年、 Proceedings of the National Academic Sciences U. S. A.、第 85卷 、 p.2444 - 2448)。
[0079] 本明細書において「誘導体」とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベルイ匕誘導体 、修飾ヌクレオチド (例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキ シ、チォ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチドおよび塩基の再構成、二重 結合の飽和、脱ァミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドな ど)を含む誘導体など、一方、タンパク質の場合、酵素、蛍光団、放射性同位元素な どのラベルによるラベル化誘導体、或いはァセチル化、ァシル化、アルキル化、リン 酸化、硫酸化、グリコシル化誘導体、などの化学修飾誘導体を意味する。
[0080] 本明細書において、「診断用組成物」や「疾患判定用組成物」などの用語は、食道 ガンの罹患や転移 (もしくは転移の可能性)の有無、罹患の程度もしくは改善の有無 や改善の程度を診断、検出、判定又は予測するために、或いは食道ガンの予防、改 善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用 されるものをいう。これには食道ガンの罹患や転移に関連して生体内、特に食道組織 において発現が変化又は変動する遺伝子を特異的に認識し、また結合することので きるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、および該遺伝子の翻訳産 物であるタンパク質を検出することができる抗体などが包含される。これらのヌクレオ チド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組 織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、又は生体 内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することが できる。
[0081] 本明細書において検出'診断対象となる「生体組織」とは、食道ガンの発生にともな い本発明の遺伝子が発現変化する組織を指す。具体的には食道組織及びその周辺 のリンパ節、また転移が疑われる他臓器などを指す。
[0082] 本明細書において検出 ·診断対象となる「生体試料」とは、食道ガンの発生にともな い出現する標的ポリペプチドを含有する、あるいはその含有が疑われる、生体から採 取された試料をいう。
[0083] 本明細書において「特異的に結合する」とは、抗体またはその断片が、本発明の標
的ポリペプチド、その変異体またはその断片とのみ抗原-抗体複合体を形成し、他の ペプチド性またはポリペプチド性物質とは該複合体を実質的に形成しないことを意味 する。ここで、「実質的」とは、程度は小さいが非特異的な複合体形成が起こり得るこ とを意味する。
[0084] 本明細書にぉ 、て「ェピトープ」とは、本発明の標的ポリペプチド、その変異体また はその断片において、抗原性または免疫原性を有する部分アミノ酸領域 (抗原決定 基)を指す。ェピトープは通常、少なくとも 5アミノ酸、好ましくは少なくとも 7アミノ酸、よ り好ましくは少なくとも 10アミノ酸カゝらなる。
[0085] 本明細書で使用される「AXL遺伝子」又は「AXL」と 、う用語は、配列番号で指定 しない限り、特定塩基配列(配列番号 1)で示される AXL receptor Tyrosine Kina se遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA )を包含する。具体的には、配列番号 1に記載の AXL遺伝子(GenBank Accessio n No. NM_021913)やその他生物種ホモログなどが包含される。 AXL遺伝子は O ' Bryan, J.P.ら、 1991年、 Molecular Cellar Biology,第 11卷、 p.5016— 503 1に記載される方法によって得ることができる。
[0086] 本明細書で使用される「C6orf54遺伝子」又は「C6orf54」という用語は、配列番 号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 2)で示される Chromosome 6 ope n reading frame 54遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコード する遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 2に記載の C6orf54遺伝子 (GenBank Accession No. NM— 014354)やその他生物種ホモログなどが包 含される。 C6orf54遺伝子は、 Minaguchi, T.ら、 1999年、 DNA Research.第 6 卷、 p.131— 136に記載される方法によって得ることができる。
[0087] 本明細書で使用される「ZBTB11遺伝子」又は「ZBTB11」という用語は、配列番 号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 3)で示される zinc finger and BTB Domain Containing 11遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコ ードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 3に記載の ZBTB11遺 伝子(GenBank Accession No. NM_014415)やその他生物種ホモログなどが 包含される。 ZBTB11遺伝子は Tang, C.M.らによって 1996年にクローユングされ
ている。
[0088] 本明細書で使用される「TNFRSF14遺伝子」又は「TNFRSF14」 t ヽぅ用語は、 配列番号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 4)で示される tumor necrosi s Factor receptor superfamily, member 14遺伝子 (DNA)、その |PJ族体、変異 体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 4 に記載の TNFRSF14遺伝子(GenBank Accession No. NM— 003820)やその 他生物種ホモログなどが包含される。 TNFRSF14遺伝子は Montgomery, R丄ら、 1996年、 Cell,第 87卷、 p.427— 436に記載される方法によって得ることができる。
[0089] 本明細書で使用される「NSUN5遺伝子」又は「NSUN5」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 5)で示される NOLl/NOP2/Sun Do main family, member 5遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などを コードする遺伝子(DNA)を包含する。具体的には、配列番号 5に記載の NSUN5 遺伝子(GenBank Accession No. NM_018044)やその他生物種ホモログなど が包含される。 NSUN5遺伝子は Doll, A.ら、 2001年、 Cytogenetics and Cell g enetics、第 95卷、 p.20— 27に記載される方法によって得ることができる。
[0090] 本明細書で使用される「SPEN遺伝子」又は「SPEN」 t 、う用語は、配列番号で指 定しない限り、特定塩基配列(配列番号 6)で示される spen homolog, transcriptio nal regulator遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺 伝子(DNA)を包含する。具体的には、配列番号 6に記載の SPEN遺伝子(GenBa nk Accession No. NM_015001)やその他生物種ホモログなどが包含される。 S PEN遺伝子は Newberry, E.P.ら、 1999年、 Biochemistry,第 38卷、 p.10678 一 10690に記載される方法によって得ることができる。
[0091] 本明細書で使用される「LTBP3遺伝子」又は「LTBP3」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 7)で示される latent transforming grow th Factor Beta binding Protein 3遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘 導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 7に記載の LTBP3遺伝子(GenBank Accession No. NM— 021070)やその他生物種ホモ ログなどが包含される。 SPEN遺伝子は Yin, W.ら、 1995年、 Journal of Biologi
cal Chemistry,第 270卷、 p.10147— 10160に記載される方法によって得ること ができる。
[0092] 本明細書で使用される「SYNGR1遺伝子」又は「SYNGR1」という用語は、配列番 号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 8)で示される synaptogyrin 1遺伝 子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含 する。具体的には、配列番号 8に記載の SYNGR1遺伝子(GenBank Accession No. NM_004711)やその他生物種ホモログなどが包含される。 SYNGR1遺伝子 は Kedra, D.ら、 1998年、 Human Geneticsゝ第 103卷、 p.131— 141に記載さ れる方法によって得ることができる。
[0093] 本明細書で使用される「ARL3遺伝子」又は「ARL3」 t 、う用語は、配列番号で指 定しない限り、特定塩基配列(配列番号 9)で示される ADP— ribosylation Factorlike 3遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (D NA)を包含する。具体的には、配列番号 9に記載の ARL3遺伝子(GenBank Acc ession No. NM_004311)やその他生物種ホモログなどが包含される。 SYNGR1 遺伝子は Cavenagh, M. M.ら、 1994年、 Journal of Biological Chemistry^ 第 269卷、 p.18937— 18942に記載される方法によって得ることができる。
[0094] 本明細書で使用される「SLC13A1遺伝子」又は「SLC13A1」という用語は、配列 番号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 10)で示される solute carrier fa miiy 丄 3 (.sodium/ sulfate symporters , member 丄; ナ (DNA)、その ι ί本 、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列 番号 10に記載の SLC13A1遺伝子(GenBank Accession No. NM— 022444) やその他生物種ホモログなどが包含される。 SLC13A1遺伝子は Lee, A.ら、 2000 年、 Genomics、第 70卷、 p.354— 363に記載される方法によって得ることができる。
[0095] 本明細書で使用される「RALGDS遺伝子」又は「RALGDS」という用語は、配列 番号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 11)で示される ral guanine nucle otide dissociation stimulator遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体 などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 11に記載の RA LGDS遺伝子 (GenBank Accession No. NM_006266やその他生物種ホモログ
などが包含される。 RALGDS遺伝子は Albright, C. F.ら、 1993年、 EMBO Jour nal、第 12卷、 p.339— 347に記載される方法によって得ることができる。
[0096] 本明細書で使用される「ADD3遺伝子」又は「ADD3」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 12)で示される adducin 3 (gamma)遺伝 子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含 する。具体的には、配列番号 12に記載の ADD3遺伝子(GenBank Accession No . NM_019903)やその他生物種ホモログなどが包含される。 RADD3遺伝子は Ka tagiri, T.ら、 1996年、 Cytogenetics and Cell genetics,第 74卷、 p.90— 95に 記載される方法によって得ることができる。
[0097] 本明細書で使用される「MAP3K12遺伝子」又は「MAP3K12」という用語は、配 列番号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 13)で示される mitogen— activ ated Protein kinase kinase kinase 12遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及 び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 13〖こ 記載の MAP3K12遺伝子(GenBank Accession No. NM— 006301)やその他 生物種ホモログなどが包含される。 MAP3K12遺伝子は Reddy, U. R.ら、 1994年 、 Biochemical Biophysical Research Communications、弟 202卷、 p.613 — 620に記載される方法によって得ることができる。
本明細書で使用される「AVPI1遺伝子」又は「AVPI1」 t 、う用語は、配列番号で指 定しない限り、特定塩基配列(配列番号 14)で示される arginine vasopressin— ind uced 1遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子( DNA)を包含する。具体的には、配列番号 14に記載の AVPI1遺伝子(GenBank Accession No. NM_021732)やその他生物種ホモログなどが包含される。 AVPI 1遺伝子は Nicod, M.ら、 2002年、 EMBO Journal,第 21卷、 p. 5109—5117 に記載される方法によって得ることができる。
[0098] 本明細書で使用される「GIMAP6遺伝子」又は「GIMAP6」という用語は、配列番 号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 15)で示される GTPase, IMAP fam ily member 6遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺 伝子(DNA)を包含する。具体的には、配列番号 15に記載の GIMAP6遺伝子(Ge
nBank Accession No. NM— 024711)やその他生物種ホモログなどが包含され る。 GIMAP6遺伝子は Stamm, O.ら、 2002年、 Gene,第 282卷、 pl59— 167に 記載される方法によって得ることができる。
[0099] 本明細書で使用される「FIJ11259遺伝子」又は「FLJ11259」という用語は、配列 番号で指定しない限り、特定塩基配列 (配列番号 16)で示される FIJI 1259遺伝子 ( DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含す る。具体的には、配列番号 16に記載の FLJ11259遺伝子(GenBank Accession No. NM_018370)やその他生物種ホモログなどが包含される。 FLJ11259遺伝子 は Ota, T.ら、 2002年、 Nature Genetics,第 36卷、 p. 40— 45に記載される方 法によって得ることができる。
[0100] 本明細書で使用される「C3AR1遺伝子」又は「C3AR1」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 17)で示される complement Compon ent 3R receptor 1遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコード する遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号: 17に記載の C3AR1遺伝 子(GenBank Accession No. NM.004054)やその他生物種ホモログなどが包 含される。 C3AR1遺伝子は Ames, R. S.ら、 1996年、 Journal of Biological Chemistry,第 271卷、 p. 20231— 20234に記載される方法によって得ることがで きる。
[0101] 本明細書で使用される「PCGF2遺伝子」又は「PCGF2」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 18)で示される polycomb group ring finger 2遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子( DNA)を包含する。具体的には、配列番号 18に記載の PCGF2遺伝子(GenBank Accession No. NM_007144)やその他生物種ホモログなどが包含される。 PCG F2遺伝子は Tagawa, M.ら、 1990年、 Journal of Biological Chemistry、第 265卷、 p. 20021— 20026に記載される方法によって得ること力できる。
[0102] 本明細書で使用される「PDE6D遺伝子」又は「PDE6D」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 19)で示される phosphodiesterase 6 D, cGMP— Specific, rod, delta遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導
体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 19に記載の PDE6D遺伝子(GenBank Accession No. NM— 002601)やその他生物種ホ モログなどが包含される。 PDE6D遺伝子は Florio, S. K.ら、 1996年、 Journal o f Biological Chemistry、第 271卷、 p. 24036— 24047に記載される方法によ つて得ることがでさる。
[0103] 本明細書で使用される「PLCG2遺伝子」又は「PLCG2」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 20)で示される phospholipase C, gam ma 2遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (D NA)を包含する。具体的には、配列番号 20に記載の PLCG2遺伝子(GenBank A ccession No. NM— 002661)やその他生物種ホモログなどが包含される。 PLCG 2遺伝子は Kang, J. S.ら、 1996年、 FEBBS Letters,第 399卷、 p. 14— 20に 記載される方法によって得ることができる。
[0104] 本明細書で使用される「GPR148遺伝子」又は「GPR148」という用語は、配列番 号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 21)で示される g Protein— coupled receptor 148遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする 遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 21に記載の GPR148遺伝子 (G enBank Accession No. NM— 207364)やその他生物種ホモログなどが包含さ れる。 GPR148遺伝子は Vassilatis, D. K.ら、 2003年、 Proceedings of the Na tional Academy of Sciences of the United states of America.、弟 100卷、 p. 4903— 4908に記載される方法によって得ることができる。
[0105] 本明細書で使用される「ARF6遺伝子」又は「ARF6」 t 、う用語は、配列番号で指 定しない限り、特定塩基配列(配列番号 22)で示される ADP— ribosylation Facto r 6遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA )を包含する。具体的には、配列番号 22に記載の ARF6遺伝子(GenBank Access ion No. NM— 001663)やその他生物種ホモログなどが包含される。 ARF6遺伝 子は Cavenagh, M. M.ら、 1996年、 Journal of Biological Chemistry、第 2 71卷、 p. 21767— 21774に記載される方法によって得ることができる。
[0106] 本明細書で使用される「NISCH遺伝子」又は「NISCH」という用語は、配列番号で
指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 23)で示される nischarin遺伝子 (DNA) 、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体 的には、配列番号 23に記載の NISCH遺伝子 (GenBank Accession No. NM_ 007184)やその他生物種ホモログなどが包含される。 NISCH遺伝子は Ivanov, T . R.ら、 1998年、 Journal of the Autonomic Nervous System、第 72卷、 p. 9 8— 110に記載される方法によって得ることができる。
[0107] 本明細書で使用される「GLYAT遺伝子」又は「GLYAT」 t ヽぅ用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 24)で示される glycine— N— acyltran sf erase遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子( DNA)を包含する。具体的には、配列番号 24に記載の GLYAT遺伝子(GenBank Accession No. NM— 005838)やその他生物種ホモログなどが包含される。 GL YAT遺伝子は Schachter, D.ら、 1976年、 Journal of Biological Chemistry 、第 251卷、 p. 3352— 3358に記載される方法によって得ること力 Sできる。
[0108] 本明細書で使用される「IGHM遺伝子」又は「IGHM」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 25)で示される Immunoglobulin heavy constant mu遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺 伝子(DNA)を包含する。具体的には、配列番号 25に記載の IGHM遺伝子(GenB ank Accession No. NG— 001019)やその他生物種ホモログなどが包含される。 IGHM遺伝子は Ravetch, J. V.ら、 1981年、 Cell,第 27卷、 p. 583— 591に記載 される方法〖こよって得ることができる。
[0109] 本明細書で使用される「FBX038遺伝子」又は「FBX038」という用語は、配列番 号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 26)で示される F— box Protein 38 遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を 包含する。具体的には、配列番号 26に記載の FBX038遺伝子(GenBank Access ion No. NM— 205836)やその他生物種ホモログなどが包含される。 FBX038遺 伝子は Smaldone, S.ら、 2004年、 Molecular and cellular Biology,第 24卷、 p . 1058— 1069に記載される方法によって得ることができる。
[0110] 本明細書で使用される「SLC12A1遺伝子」又は「SLC12A1」という用語は、配列
番号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 27)で示される solute carrier fa miiy 12、sodium/ potassium/ chloride transporters), member 1遺 子 (DN A)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。 具体的には、配列番号 27に記載の SLC12A1遺伝子(GenBank Accession No. NM— 000338)やその他生物種ホモログなどが包含される。 SLC12A1遺伝子は Simon, D. B.ら、 1996年、 Nature Genetics、第 13卷、 p. 183— 188に記載さ れる方法によって得ることができる。
[0111] 本明細書で使用される「PGDS遺伝子」又は「PGDS」という用語は、配列番号で指 定しない限り、特定塩基配列(配列番号 28)で示される prostaglandin D2 synthas e, hematopoietic遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードす る遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 28に記載の PGDS遺伝子 (G enBank Accession No. NM— 014485)やその他生物種ホモログなどが包含さ れる。 PGDS遺伝子は Kanaoka, Y.ら、 1997年、 Cell,第 90卷、 p. 1085— 1095 に記載される方法によって得ることができる。
[0112] 本明細書で使用される「CD48遺伝子」又は「CD48」という用語は、配列番号で指 定しない限り、特定塩基配列(配列番号 29)で示される CD48 antigen遺伝子(DN A)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。 具体的には、配列番号 29に記載の CD48遺伝子(GenBank Accession No. N M— 001778)やその他生物種ホモログなどが包含される。 CD48遺伝子は Staunt on, D. E.ら、 1987年、 EMBO Journal,第 6卷、 p. 3695— 3701に記載される 方法によって得ることができる。
[0113] 本明細書で使用される「IMPA2遺伝子」又は「IMPA2」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 30)で示される inositol(myo)— l(or 4)— monophosphatase 2遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコー ドする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 30に記載の IMPA2遺伝 子(GenBank Accession No. NM— 014214)やその他生物種ホモログなどが包 含される。 IMPA2遺伝子は Yoshikawa, T.ら、 1997年、 Molecular psychiatry 、第 2卷、 p. 393— 397に記載される方法によって得ることができる。
[0114] 本明細書で使用される「HSPA6遺伝子」又は「HSPA6」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 31)で示される heat shock 70kDa Pr otein 6 (HSP70B')遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコード する遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 31に記載の HSPA6遺伝子 (GenBank Accession No. NM— 002155)やその他生物種ホモログなどが包含 される。 HSPA6遺伝子は Voellmy, R.ら、 1985年、 Proceedings of the Nation al Academy of Sciences of the United States of America.、弟 82卷、 p. 49 49— 4953に記載される方法によって得ることができる。
[0115] 本明細書で使用される「EIF3S9遺伝子」又は「EIF3S9」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 32)で示されるEukaryotic Translati on initiation Factor 3, Subunit 9 eta, 116kDa遺伝子(DNA)、その同族体、 変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列 番号 32に記載の EIF3S9遺伝子(GenBank Accession No. NM— 003751)や その他生物種ホモログなどが包含される。 EIF3S9遺伝子は Methot, N.ら、 1997 年、 Journal of Biological Chemistry、第 272卷、 p. 1110— 1116に記載され る方法〖こよって得ることができる。
[0116] 本明細書で使用される「ZNF659遺伝子」又は「ZNF659」という用語は、配列番 号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 33)で示される zinc finger Protein 659遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DN A)を包含する。具体的には、配列番号 33に記載の ZNF659遺伝子(GenBank Ac cession No. NM— 024697)やその他生物種ホモログなどが包含される。 ZNF65 9遺伝子は 2000年に、 Sugano, S.らによってクローユングされている。
[0117] 本明細書で使用される「RAB6C遺伝子」又は「RAB6C」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 34)で示される RAB6C, member RA S oncogene family遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコード する遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 34に記載の RAB6C遺伝子 (GenBank Accession No. NM— 032144)やその他生物種ホモログなどが包含 される。 RAB6C遺伝子は Fitzgerald, M. L.ら、 1999年、 Biochemical Journal
、第 342卷、 p. 353— 360に記載される方法によって得ることができる。
[0118] 本明細書で使用される「NOLl遺伝子」又は「NOLl」という用語は、配列番号で指 定しない限り、特定塩基配列(配列番号 35)で示される nucleolar Protein 1, 120k Da遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA )を包含する。具体的には、配列番号 35に記載の NDL1遺伝子(GenBank Acces sion No. NM— 006170)やその他生物種ホモログなどが包含される。 NOLI遺伝 子は Freeman, J. W.ら、 1988年、 Cancer Research,第 48卷、 p. 1244—125 1に記載される方法によって得ることができる。
[0119] 本明細書で使用される「DAB2遺伝子」又は「DAB2」という用語は、配列番号で指 定しない限り、特定塩基配列(配列番号 36)で示される disabled homolog 2, mito gen― responsive Phosphoprotein遺伝子 (DNA)、その |PJ族体、変異体及び衡 導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 36に記載 の DAB2遺伝子(GenBank Accession No. NM— 001343)やその他生物種ホ モログなどが包含される。 DAB2遺伝子は Mok, S. C.ら、 1994年、 Gynecologic oncology,第 52卷、 p. 247— 252に記載される方法によって得ることができる。
[0120] 本明細書で使用される「EBI3遺伝子」又は「EBI3」という用語は、配列番号で指定 しない限り、特定塩基配列(配列番号 37)で示される Epstein— Barr virus induce d Gene 3遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 37に記載の EBI3遺伝子(GenBank A ccession No. NM— 005755)やその他生物種ホモログなどが包含される。 EBI3 遺伝子は Devergne, O.ら、 1996年、 Journal of virology、第 70卷、 p. 1143—1 153に記載される方法によって得ることができる。
[0121] 本明細書で使用される「PRSS3遺伝子」又は「PRSS3」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 38)で示される protease, Serine, 3 (me sotrypsin)遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝 子(DNA)を包含する。具体的には、配列番号 38に記載の PRSS3遺伝子(GenBa nk Accession No. NM— 002771)やその他生物種ホモログなどが包含される。 PRSS3遺伝子は Robinson, M. A.ら、 1993年、 Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America^第 90卷、 p. 2433 — 2437に記載される方法によって得ることができる。
[0122] 本明細書で使用される「GLB1遺伝子」又は「GLB1」という用語は、配列番号で指 定しない限り、特定塩基配列(配列番号 39)で示される galactosidase, Beta 1遺伝 子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含 する。具体的には、配列番号 39に記載の GLB1遺伝子(GenBank Accession No . NM— 000404やその他生物種ホモログなどが包含される。 GLB1遺伝子は Sho ws, T. B.ら、 1979年、 Somatic Cell Genetics,第 5卷、 p. 147— 158に記載さ れる方法によって得ることができる。
[0123] 本明細書で使用される「SAMSN1遺伝子」又は「SAMSN1」という用語は、配列 番号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 40)で示される SAM Domain, S H3 Domain and nuclear localisation signals, 子 (DNA)、ての同族体、 変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列 番号 40に記載の SAMSN1遺伝子(GenBank Accession No. NM— 022136) やその他生物種ホモログなどが包含される。 SAMSN1遺伝子は Claudio, J. O.ら 、 2001年、 Oncogene,第 20卷、 p. 5373— 5377【こ記載される方法【こよって得るこ とがでさる。
[0124] 本明細書で使用される「AQP3遺伝子」又は「AQP3」という用語は、配列番号で指 定しない限り、特定塩基配列(配列番号 41)で示される aquaporin 3遺伝子(DNA) 、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体 的には、配列番号 41に記載の AQP3遺伝子 (GenBank Accession No. NM— 0 04925)やその他生物種ホモログなどが包含される。 AQP3遺伝子は Ishibashi,K. ら、 1994年、 Proceedings of the National Academy oi Sciences oi the Uni ted States of America,第 91卷、 p. 6269—6273【こ記載される方法【こよって得 ることがでさる。
[0125] 本明細書で使用される「CAPZA2遺伝子」又は「CAPZA2」という用語は、配列番 号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 42)で示される capping Protein (ac tin filament) muscle Z— line, alpha 2遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び
誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 42に記 載の CAPZA2遺伝子(GenBank Accession No. NM— 006136)やその他生物 種ホモログなどが包含される。 CAPZA2遺伝子は Barron— Casella,E.A.ら、 1995 年、 Journal of Biological Chemistry、第 270卷、 p. 21472— 21479に記載さ れる方法によって得ることができる。
[0126] 本明細書で使用される「B4GALT2遺伝子」又は「B4GALT2」 t ヽぅ用語は、配列 番号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 43)で示される UDP— Gal:betaG lcNAc Beta 1,4― galactosyltransf erase, Polypeptide 2遺 1zs子 (DNA)、その 同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的に は、配列番号 43に記載の B4GALT2遺伝子(GenBank Accession No. NM— 0 03780)やその他生物種ホモログなどが包含される。 B4GALT2遺伝子は Almeida ,R.ら、 1997年、 Journal of Biological Chemistry、第 272卷、 p. 31979—319 91に記載される方法によって得ることができる。
[0127] 本明細書で使用される「ARHGEF3遺伝子」又は「ARHGEF3」という用語は、配 列番号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 44)で示される Rho guanine n ucleotide exchange Factor (GEF)遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘 導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 44に記載 の ARHGEF3遺伝子(GenBank Accession No. NM— 019555)やその他生物 種ホモログなどが包含される。 ARHGEF3遺伝子は Thiesen,S.ら、 2000年、 Bioch emical and Diophysical research communications、第 273卷、 p. do4― d69 に記載される方法によって得ることができる。
[0128] 本明細書で使用される「POGK遺伝子」又は「POGK」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 45)で示される pogo transposable elem ent with KRAB Domain遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などを コードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 45に記載の POGK遺 伝子(GenBank Accession No. AB040946)やその他生物種ホモログなどが包 含される。 POGK遺伝子 Greenhalf,W.ら、 1999年、 Yeast,第 15卷、 p. 1307— 1 321に記載される方法によって得ることができる。
[0129] 本明細書で使用される「PRAF1遺伝子」又は「PRAF1」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 46)で示される polymerase (RNA) I a ssociated Factor 1遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコード する遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 46に記載の PRAF1遺伝子 (GenBank Accession No. NM— 022490)やその他生物種ホモログなどが包含 される。 POGK遺伝子は Hanada,K.ら、 1996年、 EMBO Journal,第 15卷、 p. 2 217— 2226に記載される方法によって得ることができる。
[0130] 本明細書で使用される「HPGD遺伝子」又は「HPGD」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 47)で示される hydroxyprostaglandin d ehydrogenase 15— (NAD)遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体など をコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 47に記載の HPGD 遺伝子(GenBank Accession No. NM— 000860)やその他生物種ホモログなど が包含される。 HPGD遺伝子は Pichaud, F.ら、 1997年、 Human genetics,第 99 卷、 p. 279— 281に記載される方法によって得ることができる。 HPGD遺伝子は食 道ガン株化細胞の転移性亜株で発現が増加していること力 Kawamata,H.ら、 200 3年、 Cancer Science,第 94卷、 p.699—— 706【こ示されて!/ヽる。
[0131] 本明細書で使用される「GALNS遺伝子」又は「GALNS」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 142)で示される galactosamine (N-a cetyl) -6-sulfate sulfatase遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体など をコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 142に記載の GAL NS遺伝子 (GenBank Accession No. NM_000512)やその他生物種ホモログな どが包含される。
[0132] 本明細書で使用される「fgf3遺伝子」又は「fgf」 t 、う用語は、配列番号で指定しな い限り、特定塩基配列(配列番号 143)で示される fibroblast growth factor 3遺伝 子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含 する。具体的には、配列番号 143に記載の fgf3遺伝子(GenBank Accession N o. NM— 005247)やその他生物種ホモログなどが包含される。
[0133] 本明細書で使用される「CMK2B遺伝子」又は「CMK2B」という用語は、配列番号
で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 144)で示される calcium/calmodulin -dependent protein kinase (CAM kinase) II beta遺伝子 (DNA)、その同族 体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配 列番号 144に記載の CMK2B遺伝子(GenBank Accession No. NM_001220) やその他生物種ホモログなどが包含される。
[0134] 本明細書で使用される「CAMKIINalpha遺伝子」又は「CAMKIINalpha」と!、う 用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列 (配列番号 145)で示される calc ium/ calmodulin- dependent protein kinase I丄遺 1ZS子 (DNA)、その同族体、変 異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番 号 145に記載の CAMKIIalpha遺伝子(GenBank Accession No. NM— 018584 )やその他生物種ホモログなどが包含される。
[0135] 本明細書で使用される「PSARL遺伝子」又は「PSARL」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 146)で示される Presenilin— associat ed rhomboid -like protein遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体な どをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 146に記載の PS ARL遺伝子 (GenBank Accession No. NM— 018622)やその他生物種ホモログ などが包含される。
[0136] 本明細書で使用される「XRCC3遺伝子」又は「XRCC3」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 147)で示される X— ray repair com piementing defective repair in chmese hamster cell d遺 is子 (DNA)、 その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体 的には、配列番号 147に記載の XRCC3遺伝子 (GenBank Accession No. NM— 005432)やその他生物種ホモログなどが包含される。
本明細書で使用される「CAPG遺伝子」又は「CAPG」 t ヽぅ用語は、配列番号で指 定しない限り、特定塩基配列(配列番号 148)で示される capping protein (actin fi lament) gelsolin- like (CAPG)遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体 などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 148に記載の C APG遺伝子 (GenBank Accession No. NM— 001747)やその他生物種ホモ口
グなどが包含される。 本明細書で使用される「GRHPR遺伝子」又は「GRHPR」と いう用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列 (配列番号 149)で示される glyoxylate reductase/hydroxypyruvate reductase遺 fc+ (DNA)、その |Ρ]族 体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配 列番号 149に記載の GRHPR遺伝子(GenBank Accession No. NM.012203) やその他生物種ホモログなどが包含される。
[0137] 本明細書で使用される「TROAP遺伝子」又は「TROAP」と ヽぅ用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 150)で示される trophinin associated protein (tastin)遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードす る遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 150に記載の TROAP遺伝子 (GenBank Accession No. NM.005480)やその他生物種ホモログなどが包含さ れる。
[0138] 本明細書で使用される「RRM2遺伝子」又は「RRM2」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 151)で示される ribonucleotide reduct ase M2遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子( DNA)を包含する。具体的には、配列番号 151に記載の RRM2遺伝子(GenBank Accession No. NM_001034)やその他生物種ホモログなどが包含される。
[0139] 本明細書で使用される「SATB2遺伝子」又は「SATB2」という用語は、配列番号 で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 152)で示される SATB family memb er 2遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DN A)を包含する。具体的には、配列番号 152に記載の SATB2遺伝子(GenBank A ccession No. NM_015265)やその他生物種ホモログなどが包含される。
[0140] 本明細書で使用される「C14orfl62遺伝子」又は「C14orfl62」という用語は、配 列番号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 153)で示される chromoseme 14 open reading frame 162遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導 体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 153に記載 の C14orf 162遺伝子(GenBank Accession No. NM— 020181)やその他生物 種ホモログなどが包含される。
[0141] 本明細書で使用される「SEPT6遺伝子」又は「SEPT6」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 154)で示される septin 6遺伝子 (DNA) 、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体 的には、配列番号 154に記載の SEPT6遺伝子(GenBank Accession No. NM— 145799)やその他生物種ホモログなどが包含される。
[0142] 本明細書で使用される「M6PR遺伝子」又は「M6PR」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 155)で示される small mannose 6—p hosphate receptor遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコード する遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 155に記載の M6PR遺伝子 (GenBank Accession No. NM.002355)やその他生物種ホモログなどが包含さ れる。
[0143] 本明細書で使用される「SPRR3遺伝子」又は「SPRR3」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 156)で示される small proline-rich pro tein 3遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (D NA)を包含する。具体的には、配列番号 156に記載の SPRR3遺伝子(GenBank Accession No. NM_005416)やその他生物種ホモログなどが包含される。
[0144] 本明細書で使用される「EML1遺伝子」又は「EML1」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 157)で示されるEchinoderm microtu bule - associated protein -like 1遺伝子(DNA)、その同族体、変異体及び誘 導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、配列番号 157に記 載の EML1遺伝子 (GenBank Accession No. NM— 004434)やその他生物種ホ モログなどが包含される。
[0145] 本明細書で使用される「YPEL5遺伝子」又は「YPEL5」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 158)で示される yippee— like 5 (Droso phila)遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (D NA)を包含する。具体的には、配列番号 158に記載の YPEL5遺伝子(GenBank Accession No. NM_016061)やその他生物種ホモログなどが包含される。
[0146] 本明細書で使用される「EIF4EBP2遺伝子」又は「EIF4EBP2」という用語は、配
列番号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 159)で示される Eukaryotic tr anslation initiation factor 4E— binding protein 2遺伝子 (DNA、その同 族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的には、 配列番号 159に記載の EIF4EBP2遺伝子(GenBank Accession No. NM— 004 096)やその他生物種ホモログなどが包含される。
[0147] 本明細書で使用される「SLC2A14遺伝子」又は「SLC2A14」という用語は、配列 番号で指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 160)で示される Solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter) , member 14遺 is子 (DN/ 、 の同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子 (DNA)を包含する。具体的 には、配列番号 160に記載の SLC2A14遺伝子(GenBank Accession No. BC0 60766)やその他生物種ホモログなどが包含される。
[0148] 本明細書で使用される「SLIT2遺伝子」又は「SLIT2」という用語は、配列番号で 指定しない限り、特定塩基配列(配列番号 161)で示される SLIT, Drosophila, ho molog, of 2遺伝子 (DNA)、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺 伝子(DNA)を包含する。具体的には、配列番号 161に記載の SLIT2遺伝子(Gen Bank Accession No. NM— 004787)やその他生物種ホモログなどが包含される 発明の効果
[0149] 本発明は、食道ガンや食道ガン転移の診断、検出、判定又は予測、及び食道ガン の治療に有用な疾患判定用組成物、並びに、該組成物を用いた食道ガン及び食道 ガン転移を診断、検出、判定又は予測するための方法を提供するものであり、これに よって、食道ガンや食道ガン転移に対して特異的かつ高予測率の、及び迅速でかつ 簡便な、検出、判定又は予測方法を提供するという格別の作用効果を有する。
[0150] また、本発明の食道ガンマーカーのなかには、食道ガン患者の血液などの生体試 料中にも見出されるものもある力 それは健常人にはほとんどまたは全く見出されな いため、単に上記マーカーの存在または量を指標にすることによって、例えば血液に ぉ 、て、容易に食道ガンを検出することができると 、う作用効果をも有する。
図面の簡単な説明
[0151] [図 1]表 2に記載の遺伝子に対応する配列番号 48〜94のポリヌクレオチドを組み合 わせて用いた場合の転移がある(すなわち、転移性)食道ガン細胞の存在検出率を 示す。縦軸は、検体中の転移がある食道ガン組織の存在を検出できる確率、横軸は 、表に記載の配列番号において、順に増やした、転移がある食道ガン検出に必要な 遺伝子の合計数をそれぞれ示す。
[図 2]非ガン糸且織部の発現遺伝子についての発現量一発現強度連関図(M— Aプロ ット、白菱形印:食道ガン検出用遺伝子、黒丸印:対照遺伝子)を示す。縦軸に示し た M、すなわち Minusは各遺伝子の対照と検体における測定値のログ値の差、横軸 に示した A、すなわち Addはそれぞれの測定値のログ値の和を示す。
[図 3]食道ガン糸且織部の発現遺伝子についての発現量一発現強度連関図(M— Aプ ロット、白菱形印:食道ガン検出用遺伝子、黒丸印:対照遺伝子)を示す。縦軸に示 した M、すなわち Minusは各遺伝子の対照と検体における測定値のログ値の差、横 軸に示した A、すなわち Addはそれぞれの測定値のログ値の和を示す。
[図 4]表 3に記載の遺伝子に対応する配列番号 162〜181のポリヌクレオチドを組み 合わせて用いた場合の食道ガン細胞の存在検出率を示す。縦軸は、検体中の食道 ガン組織の存在を検出できる確率、横軸は、表 3に記載の配列番号順に増やした食 道ガン検出に必要な遺伝子の合計数をそれぞれ示す。
[図 5]RT— PCR法による、食道ガン組織における CAMKIIalphaおよび YPEL5遺 伝子の発現量の減少を示す。 GAPDH:定常発現遺伝子ダリセルアルデヒド 3— ホスフエ ~~トァごトログナ ~~セ (glyceraldehyde― 3— phosphate denyarogenase ) ,—RT:Taqポリメラーゼ不添カ卩による反応。
発明を実施するための最良の形態
[0152] 以下に本発明をさらに具体的に説明する
1·食道ガン閗逋マーカー
1. 1 首ガン斷車
本発明の組成物、キット又は DNAチップを使用して食道ガンの存在及び転移を検 出、判定又は予測するための食道ガン転移関連マーカーとしての標的核酸には、例 えば、配列番号 1〜47で表される塩基配列を含むヒト遺伝子 (すなわち、それぞれ、
AXL、 C6orf54、 ZBTB11、 TNFRSF14、 NSUN5、 SPEN、 LTBP3、 SYNGR 1、 ARL3、 SLC13A1、 RALGDS、 ADD3、 MAP3K12、 AVPI1、 GIMAP6、 F LJ11259, C3AR1、 PCGF2、 PDE6D、 PLCG2、 GPR148、 ARF6、 NISCH、 G LYAT、 IGHM、 FBX038、 SLC12A1、 PGDS、 CD48、 IMPA2、 HSPA6、 EI F3S9、 ZNF659、 RAB6C、 NOLI, DAB2、 EBI3、 PRSS3、 GLB1、 SAMSN1 、 AQP3、 CAPZA2、 B4GALT2、 ARHGEF3、 POGK、 PRAF1および HPGD) 、それらの同族体、それらの転写産物又は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘 導体が含まれる。ここで、遺伝子、同族体、転写産物、 cDNA、変異体及び誘導体は 、上記定義のとおりである。好ましい標的核酸は、配列番号 1〜47で表される塩基配 列を含むヒト遺伝子、それらの転写産物又は cDNA、より好ましくは該転写産物又は cDNAである。
[0153] 本発明にお 、て食道ガン転移の標的となる上記遺伝子は 、ずれも、手術時にリン パ節転移があった患者由来の食道ガン組織に比較して、手術時にリンパ節転移がな 力つた患者由来の食道ガン組織において発現レベルが有意に変化 (すなわち、増加 又は低下)して 、るものである。
[0154] 第 1の標的核酸は、 AXL遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDNA
、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに AXL遺伝子又はその転写 産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうると 、う報告は知られて 、な 、。
[0155] 第 2の標的核酸は、 C6orf54遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD
NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに C6orf54遺伝子又は その転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られて いない。
[0156] 第 3の標的核酸は、 ZBTB11遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに ZBTB 11遺伝子又は その転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られて いない。
[0157] 第 4の標的核酸は、 TNFRSF14遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又 は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに TNFRSF14遺
伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は 知られていない。
[0158] 第 5の標的核酸は、 NSUN5遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに NSUN5遺伝子又はそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0159] 第 6の標的核酸は、 SPEN遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDN A、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに SPEN遺伝子又はその 転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていな い。
[0160] 第 7の標的核酸は、 LTBP3遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに LTBP3遺伝子又はそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0161] 第 8の標的核酸は、 SYNGR1遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに SYNGR1遺伝子又 はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られ ていない。
[0162] 第 9の標的核酸は、 ARL3遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDN A、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに ARL3遺伝子又はその 転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていな い。
[0163] 第 10の標的核酸は、 SLC13A1遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに RRM2遺伝子及び その転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られて いない。
[0164] 第 11の標的核酸は、 RALGDS遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに RALGDS遺伝子
及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知ら れていない。
[0165] 第 12の標的核酸は、 ADD3遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに ADD3遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0166] 第 13の標的核酸は、 MAP3K12遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又 は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに MAP3K12遺伝 子及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知 られていない。
[0167] 第 14の標的核酸は、 AVPI1遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに AVPI1遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0168] 第 15の標的核酸は、 GIMAP6遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに GIMAP6遺伝子及 びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られ ていない。
[0169] 第 16の標的核酸は、 FLJ11259遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに FLJ11259遺伝子 及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知ら れていない。
[0170] 第 17の標的核酸は、 C3AR1遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに C3AR1遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0171] 第 18の標的核酸は、 PCGF2遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに PCGF2遺伝子及びそ
の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0172] 第 19の標的核酸は、 PDE6D遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに PDE6D遺伝子及び その転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られて いない。
[0173] 第 20の標的核酸は、 PLCG2遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに PLCG2遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0174] 第 21の標的核酸は、 GPR148遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに GPR148遺伝子及 びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られ ていない。
[0175] 第 22の標的核酸は、 ARF6遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに ARF6遺伝子及びその 転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていな い。
[0176] 第 23の標的核酸は、 NISCH遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに NISCH遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0177] 第 24の標的核酸は、 GLYAT遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに GLYAT遺伝子及び その転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られて いない。
[0178] 第 25の標的核酸は、 IGHM遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに IGHM遺伝子及びそ
の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0179] 第 26の標的核酸は、 FBOX38遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに FBOX38遺伝子及 びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られ ていない。
[0180] 第 27の標的核酸は、 SLC12A1遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに SLC12A1遺伝子 及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知ら れていない。
[0181] 第 28の標的核酸は、 PGDS遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに PGDS遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0182] 第 29の標的核酸は、 CD48遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに CD48遺伝子及びその 転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていな い。
[0183] 第 30の標的核酸は、 IMPA2遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに IMPA2遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0184] 第 31の標的核酸は、 HSPA6遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに HSPA6遺伝子及び その転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られて いない。
[0185] 第 32の標的核酸は、 EIF3S9遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに EIF3S9遺伝子及び
その転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られて いない。
[0186] 第 33の標的核酸は、 ZNF659遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに ZNF659遺伝子及 びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られ ていない。
[0187] 第 34の標的核酸は、 RAB6C遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに RAB6C遺伝子及び その転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られて いない。
[0188] 第 35の標的核酸は、 NOLI遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに NOLI遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0189] 第 36の標的核酸は、 DAB2遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに DAB2遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0190] 第 37の標的核酸は、 EBI3遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDN A、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに EBI3遺伝子及びその転 写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうると 、う報告は知られて 、な 、。
[0191] 第 38の標的核酸は、 PRSS3遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに PRSS3遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0192] 第 39の標的核酸は、 GLB1遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに GLB1遺伝子及びその 転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていな
い。
[0193] 第 40の標的核酸は、 SAMSN1遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに SAMSN1遺伝子 及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知ら れていない。
[0194] 第 41の標的核酸は、 APQ3遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに APQ 3遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0195] 第 42の標的核酸は、 CAPZA2遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに CAPZA2遺伝子及 びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られ ていない。
[0196] 第 43の標的核酸は、 B4GALT2遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又 は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに B4GALT2遺伝 子及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知 られていない。
[0197] 第 44の標的核酸は、 ARHGEF3遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又 は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに ARHGEF3遺伝 子及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知 られていない。
[0198] 第 45の標的核酸は、 POGK遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに POGK2遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい ない。
[0199] 第 46の標的核酸は、 PRAF1遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに PRAF1遺伝子及びそ の転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られてい
ない。
[0200] 第 47の標的核酸は、 HPGD遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。 HPGD遺伝子は食道ガン株化細 胞の転移性亜株で発現が増加していること力 Kawamata,H.ら、 2003年、 Cancer
Science,第 94卷、 p.699—— 706【こ示されて!/ヽる。
1. 2食道ガン,車標的核酸 (2)
本発明の組成物、キット又は DNAチップを使用して食道ガン又は食道ガン細胞の 存在を検出、判定又は予測するための食道ガン関連マーカーとしての標的核酸の 別の例には、例えば、配列番号 142〜161で表される塩基配列を含むヒト遺伝子 (す なわち、それぞれ、 GALNS, fgf3, CAMK2B, CaMKIINalpha, PSARL , XRCC3, CAPG, GRHPR, TROAP, RRM2, SATB2, C14orfl6 2, SEPT6, M6PR, SPRR3, EML1, YPEL5, EIF4EBP2, SLC2A 14及び SLIT2)、それらの同族体、それらの転写産物又は cDNA、あるいはそれら の変異体又は誘導体が含まれる。ここで、遺伝子、同族体、転写産物、 cDNA、変異 体及び誘導体は、上記定義のとおりである。好ましい標的核酸は、配列番号 142〜1 61で表される塩基配列を含むヒト遺伝子、それらの転写産物又は cDNA、より好まし くは該転写産物又は cDN Aである。
[0201] 本発明にお 、て食道ガンの標的となる上記遺伝子は 、ずれも、非ガン組織に比べ て食道ガン組織にぉ ヽて該遺伝子の発現レベルが有意に低下して ヽるものである。
[0202] 第 1の標的核酸は、 GALNS遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0203] GALNS遺伝子は、 N ァセチルガラタトサミン 6 硫酸スルファターゼの遺伝子 で fcO (Tomatsu, s.ら、 199丄年、 Biochemical Biophysical Research Com munication、第 181卷、 p. 677-683)。この遺伝子の翻訳産物はライソゾーム内で グリコサミノダリカン、硫酸ケラタン、コンドロイチン 6—硫酸などの代謝に関与しており 、この遺伝子の欠損、欠失、変異は遺伝性ムコ多糖類症であるモルキォ A症候群を 引き起こすことが知られている(Fukuda, S.ら、 1992年、 Journal of Clinical Inve stigation、 第 90卷、 p.1049- 1053など)。モルキォ A症候群は、角膜混濁、大動
脈弁閉鎖不全、硫酸ケラタンの尿中排泄や骨病変を主な症状とする。しかしながら、 これまでに GALNS遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカー になりうると 、う報告は知られて ヽな 、。
[0204] 第 2の標的核酸は、 fgf 3遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDNA 、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0205] fgf3遺伝子は、線維芽細胞成長因子ファミリーに属する遺伝子である(Brookes, S.ら、 1989年、 Oncogene,第 4卷、 p. 429-436)。この遺伝子の翻訳産物は耳の 形成に寄与して 、ることが示唆されて 、るほ力、プロトオンコジーンとしてヒト食道ガン 細胞を含む多くの種のヒト及びマウスのガン組織で増幅して 、ることが見出されて ヽ ¾ (Kitagawa, Yら、 1991年、 Cancer Research,第 51卷、 p.1504- 1508)。し力 しながら、これまでに fgf3遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマー カーになりうると ヽぅ報告は知られて ヽな ヽ。
[0206] 第 3の標的核酸は、 CAMK2B遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は c DNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0207] CAMK2B遺伝子は、カルシウム Zカルモジュリン依存性プロテインキナーゼ Π β の遺伝子である(Tombes, r. M.ら、 1997年、 Biochimica et Biophysica Acta 、第 1355卷、 p. 281-292)。この遺伝子の翻訳産物は様様な基質のセリン 'スレオ ニン残基をリン酸ィ匕し、細胞周期の調節や中枢神経系の形成に寄与していることが 示唆されて 、る。肺小細胞ガン細胞にぉ 、て CAMK2Bの活性ィ匕が細胞周期の促 進を起こすことが示唆されているが(Williams, C. L.ら、 1996年、 Biochemical Pharmacologyゝ第 51卷、 p. 707— 715)、し力しな力ら、これまでに cMAK2B遺伝 子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知 られていない。
[0208] 第 4の標的核酸は、 CaMKIINalpha遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物 又は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0209] CAMKIINalpha遺伝子は、 Calcium/calmodulin— Dependent protein ki nase IIの遺伝子である(Strausberg, R. L.ら、 2002年、 Proceedings of the N ational Academic Sciences U. S. A.、第 99卷、 p. 16899-16903)。 CaM—
kinase II inhibitor alpha (rat LOC287005)に強!/、ネ目同'性力あり、 LOC287 005は月 ¾に特異的な Calcium/ calmodulin― Dependent protein kinase II の阻害タンパク質であることが知られている(Chang. B. H.ら、 2001年、 Neurosci ence、第 102卷、 p. 767-777)。しかしながら、これまでに CaMKIINalpha遺伝子 又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知ら れていない。
[0210] 第 5の標的核酸は、 PSARL遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0211」 PSARL遺 is子は、 Presenilin- associated Rhomboid― like proteinの遺伝 子である(Pellegrini, Lら、 2001年、 Journal of Alzheimer' s Disease、第 3卷 、 p. 181— 190)。 S. cerevisiaeの PSARLホモログである Rbdlの翻訳産物は、ミト コンドリア内膜に存在し、欠損によって呼吸不全を引き起こすことが知られている(M acQuibban, Gら、 2003年、 Natureゝ第 423卷、 p. 537—541)。しかしながらこれ までに PSARL遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーにな りうると ヽぅ報告は知られて ヽな ヽ。
[0212] 第 6の標的核酸は、 XRCC3遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0213] XRCCd遺 子は、 X— ray repair complementing defective repair in c hinese hamster cell 3の遺伝子である(Tebbes, R. S.ら、 1995年、 Proceedi ngs of the National Academic Sciences U. S. A.、第 92卷、 p. 6354-6358 ) o XRCC3遺伝子の翻訳産物は遺伝子障害の修復に関与し、 XRCC3遺伝子の変 異カ S?L癌(Kuschel, B.ら、 2002年、 Human molecular genetics,第 11卷、 ρ . 1399— 1407)及びメラノーマ(Winsey, L.ら、 2000年、 Cancer Research,第 60卷、 p. 5612— 5616)にお!/、て有意に高!ヽと!ヽぅ報告力ある。し力しな力 ^らこれま でに XRCC3遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりう ると 、う報告は知られて 、な 、。
[0214] 第 7の標的核酸は、 CAPG遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDN A、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0215] CAPG遺伝子は、ゲルゾリン Zビリンファミリーに属するァクチンキヤッビングタンパ ク質の遺伝子である(Dabiri, G. A.ら、 1992年、 Journal of Biological Chemist ry、第 267卷、 p. 16545-16552)。この遺伝子の翻訳産物は、ァクチン線維の矢 尻端に結合するが、ァクチン線維の切断能はないとされる。マクロファージで最初に 見出され、マクロファージ機能に関与している可能性が示唆されている力 これまで に CAPG遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうると いう報告は知られていない。
[0216] 第 8の標的核酸は、 GRHPR遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0217] GRHPR遺 ナは、 Glyoxylate reductase- hydroxypyruvate reductaseの 遺伝子である(Rumsby, Gら, 1999年、 Biochimica et Biophysica Acta、第 14 46卷、 p. 383-388)。この遺伝子の翻訳産物はダリオキシレートをグリコレートに代 謝するほか、ヒドロキシピルべートを D—グリセレートに可逆的に分解する。原発性 2 型高シユウ酸尿症の原因遺伝子であることが示唆されている(Cramer, S. D.ら、 1 999年、 Human Molecular Genetics、第 8卷、 p.2063— 2069)。し力しな力 Sら、 これまでに GRHPR遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカー になりうると 、う報告は知られて ヽな 、。
[0218] 第 9の標的核酸は、 TROAP遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0219] TROAP遺伝子は、 Trophinin— associated protein (TASTIN)の遺伝子であ る(Fukuda, M. N.ら、 1995年、 Genes and Development,第 9卷、 p. 1199-1 210)。この遺伝子の翻訳産物は Trophininと共同で働き、子宫内膜細胞への胚の 着床時に、細胞接着に寄与していることが示唆されている(Fukuda, Mら、上記)。し 力しながら、これまでに TROAP遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガン のマーカーになりうると 、う報告は知られて!/ヽな!、。
[0220] 第 10の標的核酸は、 RRM2遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0221] RRM2遺伝子は、 ribonucleotide— diphosphate reductase M2 chainの遺
伝子である(Yang- Feng, T. L.ら、 1987年、 Genomics,第 1卷、 p. 77-86)。こ の遺伝子の翻訳産物は、リボヌクレオチドからデォキシリボヌクレオチドを産生する酵 素のサブユニットであり、 DNA合成の律速酵素となっている。浸潤性の乳癌などで発 現が亢進していることが示されており(Jensen, R. A.ら、 1994年、 Proceedings o f the national Academy of Sciences, USA、第 91卷、 p. 9527- 9261な ど)、ヒドロキシゥレアの抗ガン作用のターゲット分子としても知られている(Yen, Y. ら、 1994年、 Cancer Research,第 54卷、 p. 3686-3691)。またガン細胞株の抗 ガン剤ゲムシタビンに対する耐性の発現に伴って発現量が増えていることが知られて いる(Goan, Y. G.ら、 1999年、 Cancer Research,第 59卷、 p. 4204- 4207な ど)。し力しながら、これまでに RRM2遺伝子及びその転写産物の発現の減少が食 道ガンのマーカーになりうると 、う報告は知られて!/ヽな 、。
[0222] 第 11の標的核酸は、 SATB2遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0223] SATB2遺伝子は、 DNA配列結合タンパク質の遺伝子である(Kikuno. R.ら、 19 99年、 DNA Research、第 6卷、 p. 197— 205)。この遺伝子の翻訳産物は、プレ B糸田胞のィムノグロブリン遺伝子 nuclear matrix attachment regionsへの結合 と発現調節が知られているが(Dobreva, G. 2003年、 Genes & Development 、第 17卷、 p. 3048-3061)、しかしながら、これまでに SATB2遺伝子及びその転 写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうると 、う報告は知られて 、な 、。
[0224] 第 12の標的核酸は、 C14orfl62遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又 は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[022 」 C14orf 162¾fc子は、 chromoseme 14 open reading frame 162の ¾izs 子である(Mao, Y.ら、 2000年 Genbank Direct submission)。 C14orf 162 遺伝子の機能は知られておらず、これまでに C14orfl62遺伝子及びその転写産物 の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうると 、う報告は知られて ヽな 、。
[0226] 第 13の標的核酸は、 SEPT6遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0227] SEPT6遺伝子は、 septinファミリーに属する遺伝子である(Ono, R.ら、 2002年
、 Cancer Research,第 62卷、 p. 333-337)。この遺伝子の翻訳産物は、 ATP— GTP結合部位と核内移行を示唆する配列をもつ。また数種の変異体が存在して!/ヽる ことが知られて 、る。 Septin6遺伝子は染色体転移によって急性骨髄性白血病患者 において MLL遺伝子と融合することが知られている(Ono, R.ら、上記)。しかしなが ら、これまでに SEPTIN6遺伝子及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマー カーになりうると ヽぅ報告は知られて ヽな ヽ。
[0228] 第 14の標的核酸は、 M6PR遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0229」 M6PR遺 is子は、 small mannose 6— phosphate receptorの ¾fe子である、 Pohlmann, R.ら、 1987年、 Proceedings of the National Academic Scienc es U. S. A.、第 84卷、 p. 5575— 5579)。この遺伝子の翻訳産物は、 IGF— IIの 受容体として働き、絨毛ガン細胞でその発現を抑制することにより細胞増殖能が抑制 されることが示されている(0'Gorman,D. B.ら、 1999年、 Cancer Research, 59 卷、 p. 5692— 5694)。しかしながら、これまでに M6PR遺伝子及びその転写産物 の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうると 、う報告は知られて ヽな 、。
[0230] 第 15の標的核酸は、 SPRR3遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0231] SPRR3遺伝子は前述したように、食道ガンのマーカーとなることが知られている( 国際公開第 2003/042661ノ ンフレット、 Chen, B.S.ら、 2000年、 Carcinogenes isゝ第 21卷、 p.2147— 2150、 Abraham, J.M.ら、 1996年、 Cell Growth & Diff erentiation,第 7卷、 p.855- 860)。
[0232] 第 16の標的核酸は、 EML1遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0233] EML1遺 子は、 Echinoderm microtubule― associated protein— like 1 の遺伝子である(Eudy, J. D.ら、 1997年、 Genomics,第 43卷、 p. 104— 106) 。 EML1遺伝子の配列にはカルシウム結合モチーフやヒスチジン酸フォスファターゼ 活性領域を推測させる配列が存在するが、これまでに EML1遺伝子及びその転写 産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうると 、う報告は知られて 、な 、。
[0234] 第 17の標的核酸は、 YPEL5遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
YPEL5¾fe子 ίま、 yippee— like 5 (Drosophila)の遺伝子でめる (Roxstrom— L indquist, K.ら、 2001年、 Insect molecular biology,第 10卷、 p. 77— 86)。 YPEL5の翻訳産物は、 zinc— bindingタンパク質ファミリーに属している力 これま でに YPEL5遺伝子及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりう るという報告は知られていない。 第 18の標的核酸は、 EIF4EBP2遺伝子、それら の同族体、それらの転写産物又は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体であ る。
[023」 EIF4EBP2遺伝子は、 Eukaryotic translation initiation factor 4E— bin ding protein 2の遺伝子である(Pause, A.ら、 1994年、 Nature,第 371卷、 p. 762— 767)。 EIF4EBP2の翻訳産物は、遺伝子発現の開始制御タンパク質であり 、遺伝子変異が 、くつかのガンにお!、て見出されて!/、るが(Tsukiyama—Kohara, K.ら、 1996年、 Genomics,第 38卷、 p. 353— 363)、これまでに EIF4EBP2遺 伝子及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は 知られていない。
[0236] 第 19の標的核酸は、 SLC2A14遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cDNA、ある ヽはそれらの変異体又は誘導体である。
[0237] SLし 2A丄 4遺 fc+は、; solute carrier family 2 (facilitated glucose trans porter) , member 14の遺伝子である(Strausberg, R. L.ら、 2002年、 Proceed ings of the National Academic Sciences U. S. A.、第 99卷、 p. 16899-16 903)。 SLC2A14の翻訳産物は、精巣に特異的に発現しているグルコーストランス ポーターである力 S (Wu, Xら、上記)、これまでに SLC2A14遺伝子及びその転写産 物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうると 、う報告は知られて ヽな 、。
[0238] 第 20の標的核酸は、 SLIT2遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又は cD NA、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。
[0239] SLIT2遺伝子は、 SLIT, Drosophila, homolog of 2の遺伝子である(Itoh, A.ら、 1998年、 Molecular Brain Research,第 62卷、 p. 175-186)。この遺
伝子の翻訳産物は、分泌タンパク質であり、神経線維の伸長や白血球遊走を阻害す ること力 S知られて ヽる(Wu, W.ら、 1999年、 Nature,第 400卷、 p. 331—336)。 しかしながら、これまでに SLIT2遺伝子及びその転写産物の発現の減少が食道ガン のマーカーになりうると 、う報告は知られて!/ヽな!、。
1. 3食 i首ガン斷車標的ポリペプチド (1)
本発明の組成物又はキットを使用して食道ガンの存在及び転移を検出、判定又は 予測するための食道ガン転移関連マーカーとしての標的ポリペプチドには、例えば、 配列番号 1〜47で表される塩基配列を含む上記ヒト遺伝子、すなわち、それぞれ、 A XL、 C6orf54、 ZBTB11、 TNFRSF14、 NSUN5、 SPEN、 LTBP3、 SYNGR1、 ARL3、 SLC13A1、 RALGDS、 ADD3、 MAP3K12、 AVPI1、 GIMAP6、 FLJ1 1259、 C3AR1、 PCGF2、 PDE6D、 PLCG2、 GPR148、 ARF6、 NISCH、 GLY AT、 IGHM、 FBX038、 SLC12A1、 PGDS、 CD48、 IMPA2、 HSPA6、 EIF3S 9、 ZNF659、 RAB6C、 NOLI, DAB2、 EBI3、 PRSS3、 GLB1、 SAMSN1、 A QP3、 CAPZA2、 B4GALT2、 ARHGEF3、 POGK、 PRAF1及び HPGD遺伝子 、によってコードされるポリペプチド、例えば、配列番号 95〜141で表されるアミノ酸 配列を含むヒトポリペプチド、それらの同族体、あるいはそれらの変異体又は誘導体 が含まれる。ここで、ポリペプチド、同族体、変異体及び誘導体は、上記定義のとおり である。好ましい標的ポリペプチドは、配列番号 95〜141で表されるアミノ酸配列を 含むヒトポリペプチドである。
本発明にお 、て食道ガン転移の標的となる上記ポリペプチドは 、ずれも、対応する 遺伝子及びその転写産物の発現量と同様に、手術時にリンパ節転移がな力つた患 者由来の食道ガン組織に比較して、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食 道ガン組織において発現レベルが有意に変化 (すなわち、増加又は低下)しているも のであること、或いは血液中の該ポリペプチドのレベルが手術時にリンパ節転移がな 力つた被験者と比べて手術時にリンパ節転移があった被験者において有意に変化( すなわち、増加又は低下)すること〖こよって特徴付けられる。
1. 4食道ガンの標的ポリペプチド(2)
本発明の組成物又はキットを使用して食道ガン又は食道ガン細胞の存在を検出、
判定又は予測するための食道ガン関連マーカーとしての標的ポリペプチドには、上 記 GALNS, fgf3, CAMK2B, CaMKIINalpha, PSARL, XRCC3, C APG, GRHPR, TROAP, RRM2, SATB2, C14orfl62, SEPT6, M6PR, SPRR3, EML1, YPEL5, EIF4EBP2, SLC2A14及び SLIT2 遺伝子によってコードされるポリペプチド、例えば、配列番号 182〜201で表される アミノ酸配列を含むヒトポリペプチド、それらの同族体、あるいはそれらの変異体又は 誘導体が含まれる。ここで、ポリペプチド、同族体、変異体及び誘導体は、上記定義 のとおりである。好ましい標的ポリペプチドは、配列番号 182〜201で表されるァミノ 酸配列を含むヒトポリペプチドである。
[0241] 本発明にお 、て食道ガンの標的となる上記ポリペプチドは 、ずれも、対応する遺伝 子及びその転写産物の発現量と同様に、非ガン組織に比べて食道ガン組織にぉ ヽ てその発現量が有意に低下すること、或いは血液中の該ポリペプチドのレベルが健 常な被験者と比べて食道ガンに罹患した被験者において有意に低下することによつ て特徴付けられる。
1. 5 首ガン斷車 ポリペプチド' (3)
本発明の組成物又はキットを使用して食道ガンをインビトロで検出するための別の 食道ガンマーカーは、配列番号 202〜233で表されるアミノ酸配列を有すポリべプチ ド、その変異体またはその断片である。
[0242] 本発明の配列番号 202〜233のポリペプチドを、その遺伝子名およびタンパク質 番号 (ジーンバンク登録名および登録番号)、ならびにそれらの特性とともに下記の 表 1に示す。これらのポリペプチドは、例えば食道ガン患者血漿中に特異的に検出さ れ、健常者の血漿には検出されないか、または検出できるレベルにない。
[0243] [表 1]
列 番 遗 fe子名 タ ンパク質番 特性
202 SMAR A 1 P28370 S I-SNF関連マ トリクス
203 ITGA1 P56199 インテグリ ンサブュニッ ト Q 1
204 GM632 Q9S M6 E つの ¾亜鉛フィ ンガ一
ドメィンを含むタンパク
205 RREB1 Q92766 Kas反応性ェレメント結合タン
パク
206 DH 37 Q8IY37 ヘリ力一ゼのメンバ一
207 IGし C2 P01842
208 TBC1D8 095759 血管 Rab GAP-TBC r有タンパク
209 ATP8B2 P98198 アミノホスフオリ ピッ ド ATPァ
ーゼ トランスポーターと髙度 に鎮似性をもつタンパク
210 PYGL P06737 肝グリ コーゲンホスフォ リ ラ
—ゼ
21 1 CDKL5 076039 サイクリン依存 キナーゼ搽 5
212 SNX2 060749 ソ一ティングネキシン 2
213 TTC7A Q9Uし TC 7つのテ卜ラ ト リコべプチドリ
ピート含有タンパク
21 - ADSL P30566 ァデ /レスクシネー ト リ ァー
ゼ
215 USP 19 094966 ュビキチン力ノレボキシル末端
ノ、ィ ドロ ラ一ゼフア ミ リ 一の メン/ —
216 A CC4 015439 ATP結合カセッ トサブフアミ リ
—C (CFTR/ RP)メンバ一 4
217 GNPAT 015228 ジヒ ドロキシァセ トン-ホスフ
エー 卜 -ァシノレ 卜ランスフェラ —ゼ
218 MYBPC2 Q14324 ヒ ト と高度に類似性を
もつタンバク
219 BMP2K QyNSY l bmp 2 誘導性キナー (マウス
Bmp2k) と ¾い類似性をもつタ ンノ ク
220 0XCT1 P55809 3 -才キソ酸 CoA トランスフェラ
ーゼ 1
221 ITGA9 Q13797 インテグリ ン tt 9サブュニツ ト
222 SPATA7 Q9P0W8 機能未知のタンパク
223 ZN 624 Q9P2J8 KRAB ボックスファ ミ リ—のメ
ンパ一
224 USP20 Q9Y2K6 ュビキチン特異的ブロテア
ゼ 20 一
225 ACAD8 Q9UKU7 ァシル コェンザィム A デヒ ド
口ゲナ一ゼフア ミ リ 一メ ンバ
- 8
226 Q06481 アミ ィ ド i3前駆体様プ テ
イン 2
227 HN P 043390 不均一性核リ ボヌク レオプロ
ティン K
228 CD59 抗原(プロテクチン)
229 DDX1S Q9NVPI DEA ボックスプロティン 18
230 SEC63 Q9UGP8 SEC63プロテイン
231 TMEM16C Q9BYT9 機能未知の、 プロティン
のメ ンバー
232 TEKT2 Q9U1F3 テクテン 2
233 BUB1 043683 バティ ングアンイ ンヒ ビティ
ドペンズィミダゾール 1ホモ口 グ 本発明にお 、て食道ガン検出のための上記標的ポリペプチドは 、ずれも、食道ガ ン患者において、血液などの生体試料中の該ポリペプチドのレベル力 健常人と比 ベて食道ガンに罹患した被験者にぉ 、て有意にまたは格別に高 、ことによって特徴 付けられる。
2.食 i首ガン診断用プローブ
本発明によれば、食道ガンの存在及び/又は転移を検出、判定又は予測するため の、或いは被験者の術後の予後を予測するための、プローブは、下記の I群、 II群及 び/又は III群:
I群:
(a)配列番号 1〜46で表される塩基配列力 なるポリヌクレオチド、その変異体、ま たは 15以上の連続した塩基を含むその断片、
(b)配列番号 1〜46で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(c)配列番号 1〜46で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオ チド、その変異体、または 15以上の連続した塩基を含むその断片、
(d)配列番号 1〜46で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオ チド、及び
(e)前記(a)〜(d)の!、ずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブ リダィズするポリヌクレオチド、または 15以上の連続した塩基を含むその断片、 力もなるポリヌクレオチド、
Π群:
(f)配列番号 142〜155、 157〜161で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチド 、その変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むその断片、
(g)配列番号 142〜 155、 157〜 161で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(h)配列番号 142〜155、 157〜161で表される塩基配列に相補的な塩基配列か らなるポリヌクレオチド、その変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むその断片、
( 配列番号 142〜 155、 157〜 161で表される塩基配列に相補的な塩基配列を 含むポリヌクレオチド、及び
(j)前記 (f)〜 (i)の 、ずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノヽイブリ ダイズするポリヌクレオチド、又は 15以上の連続した塩基を含むその断片、 力もなるポリヌクレオチド、
III群:
(k)配列番号 1〜46で表される塩基配列によってコードされるポリペプチド、又は配
列番号 95〜 140で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、それらの変異体、或 いはそれらの断片の少なくとも 1つと特異的に結合する抗体、その断片或いはその化 学修飾誘導体、
(1)配列番号 142〜155、 157〜161で表される塩基配列によってコードされるポリ ペプチド、或いは配列番号 182〜195、 197〜201で表されるアミノ酸配列を有する ポリペプチド、それらの変異体、或いはそれらの断片の少なくとも 1つと特異的に結合 する抗体、その断片或いはその化学修飾誘導体、及び
(m)配列番号 202〜232で表されるポリペプチド、それらの変異体、或いはそれら の断片の少なくとも 1つと特異的に結合する抗体、その断片或いはその化学修飾誘 導体、
力 なる抗体、その断片或いはその化学修飾誘導体、
から選択される。
[0244] 上記のプローブは、いずれも上記 1. 1節から 1. 5節に記載された食道ガン関連マ 一力一のいずれかと結合可能なものであり、食道ガンの存在又は転移を検出、判定 又は予測するために使用可能である。例えば、上記 I群及び ΠΙ群 (k)の各プローブ によって食道ガンの存在又は転移を検出、判定又は予測することができる。また、上 記 II群及び ΠΙ群 (1)、(m)の各プローブによって食道ガンの存在を検出、判定又は 予柳』することができる。
[0245] 本発明にお!/、て、核酸プローブは DNA又は RNAを含み、一方、抗体プローブは ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの抗体断片、合成抗体、組換え抗 体、多重特異的抗体、単鎖抗体などを含む。
[0246] 本発明者らは、今回、上記 I群力 III群に示したプローブが食道ガンの存在及び/ 又は転移の検出、判定又は予測に使用できることを初めて見出した。
3. * ガン診 ) ¾糸且
3. i mm tiii
本発明において、食道ガンの存在及び/又は転移を検出、判定又は予測するため の核酸組成物は、上記 2節の I群に記載した 1又は 2以上のプローブを含み、食道ガ ン転移関連の標的核酸としての、ヒト由来の AXL、 C6orf54、 ZBTB11、 TNFRSF
14、 NSUN5、 SPEN、 LTBP3、 SYNGR1、 ARL3、 SLC13A1、 RALGDS、 AD D3、 MAP3K12、 AVPI1、 GIMAP6、 FLJ11259、 C3AR1、 PCGF2、 PDE6D、 PLCG2、 GPR148、 ARF6、 NISCH、 GLYAT、 IGHM、 FBX038、 SLC12A1 、 PGDS、 CD48、 IMPA2、 HSPA6、 EIF3S9、 ZNF659、 RAB6C、 NOLI, DA B2、 EBI3、 PRSS3、 GLB1、 SAMSN1、 AQP3、 CAPZA2、 B4GALT2、 ARH GEF3、 POGK、 PRAF1及び HPGD遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物 又は cDNA、或いはそれらの変異体又は誘導体の存在、発現量又は存在量を定性 的及び/又は定量的に測定することを可能にする。
[0247] 上記の標的核酸は、手術時にリンパ節転移がな力つた患者由来の食道ガン組織に 比較して、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織においてその発 現レベルが有意に変化 (すなわち、増加又は低下)する。それゆえ、本発明の組成物 は、手術時にリンパ節転移がなカゝつた患者由来の食道ガン組織と手術時にリンパ節 転移があった患者由来の食道ガン組織について標的核酸の発現レベルを測定し、 それらを比較するために有効に使用することができる。
[0248] 本発明で使用可能な組成物は、食道ガンに罹患した患者の生体組織にお!、て配 列番号 1〜47で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌク レオチド群、該塩基配列に相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジ ントな条件 下でそれぞれノヽイブリダィズするポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド 群、ならびにそれらのポリヌクレオチド群の塩基配列において 15以上の連続した塩 基を含むポリヌクレオチド群力 選ばれた 1又は複数のポリヌクレオチドの組み合わせ を含む。
[0249] 具体的には、本発明の組成物は、以下の 1又は複数のポリヌクレオチド又はその断 片を含むことができる。
(1)配列番号 1〜46、 47で表される塩基配列力 なるポリヌクレオチド群、それらの 変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(2)配列番号 1〜46、 47で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
(3)配列番号 1〜46で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異 体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(4)配列番号 1〜46で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
(5)配列番号 1〜46で表される塩基配列に相補的な塩基配列力 なるポリヌクレオ チド群、それらの変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(6)配列番号 1〜46で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチ ド群。
(7)配列番号 1〜46で表される塩基配列の各々と相補的な塩基配列力 なる DNA とストリンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド群、又は 15以上の連続 した塩基を含むそれらの断片。
(8)配列番号 1〜46で表される塩基配列の各々力 なる DNAとストリンジ ントな条 件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド群、又は 15以上の連続した塩基を含むそれ らの断片。
(9)配列番号 47で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、または 1 5以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(10)配列番号 47で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
( 11 )配列番号 47で表される塩基配列に相補的な塩基配列力 なるポリヌクレオチド 、その変異体、または 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(12)配列番号 47で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド 群。
( 13)配列番号 47で表される塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジ ェントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、または 15以上の連続した塩基を 含むそれらの断片。
(14)配列番号 47で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でハイブ リダィズするポリヌクレオチド、または 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。 上記(1)〜(14)のポリヌクレオチドの断片は、各ポリヌクレオチドの塩基配列におい て、例えば、連続する 15〜配列の全塩基数、 15〜5000塩基、 15〜4500塩基、 15 〜4000塩基、 15〜3500塩基、 15〜3000塩基、 15〜2500塩基、 15〜2000塩 基、 15〜1500塩基、 15〜: LOOO塩基、 15〜900塩基、 15〜800塩基、 15〜700 塩基、 15〜600塩基、 15〜500塩基、 15〜400塩基、 15〜300塩基、 15〜250塩
基、 15〜200塩基、 15〜150塩基、 15〜140塩基、 15〜130塩基、 15〜120塩基 、 15〜: L 10塩基、 15〜: LOO塩基、 15〜90塩基、 15〜80塩基、 15〜70塩基、 15〜 60塩基、 15〜50塩基、 15〜40塩基、 15〜30塩基又は 15〜25塩基; 25〜配列の 全塩基数、 25〜: L000塩基、 25〜900塩基、 25〜800塩基、 25〜700塩基、 25〜 600塩基、 25〜500塩基、 25〜400塩基、 25〜300塩基、 25〜250塩基、 25〜2 00塩基、 25〜150塩基、 25〜140塩基、 25〜130塩基、 25〜120塩基、 25~11 0塩基、 25〜: L00塩基、 25〜90塩基、 25〜80塩基、 25〜70塩基、 25〜60塩基、 25〜50塩基又は 25〜40塩基; 50〜配列の全塩基数、 50〜: L000塩基、 50〜900 塩基、 50〜800塩基、 50〜700塩基、 50〜600塩基、 50〜500塩基、 50〜400塩 基、 50〜300塩基、 50〜250塩基、 50〜200塩基、 50〜150塩基、 50〜140塩基 、 50〜130塩基、 50〜120塩基、 50〜: L 10塩基、 50〜: L00塩基、 50〜90塩基、 5 0〜80塩基、 50〜70塩基又は 50〜60塩基; 60〜配列の全塩基数、 60〜: L000塩 基、 60〜900塩基、 60〜800塩基、 60〜700塩基、 60〜600塩基、 60〜500塩基 、 60〜400塩基、 60〜300塩基、 60〜250塩基、 60〜200塩基、 60〜150塩基、 60〜140塩基、 60〜130塩基、 60〜120塩基、 60〜: L 10塩基、 60〜: L00塩基、 6 0〜90塩基、 60〜80塩基又は 60〜70塩基などの範囲の塩基数を含むことができる 1S これらに限定されないものとする。
本発明の実施形態により、配列番号 1〜47で表される塩基配列を含むポリヌクレオ チドの断片はそれぞれ、配列番号 48〜94で表される塩基配列又はその相補的配列 、あるいはそれらの連続する 15塩基以上の部分配列、を含むことが好ましい。
本発明の組成物には、例えば以下のポリヌクレオチドが包含される。
(1)配列番号 1〜46で表される塩基配列またはその相補的配列の各々において、 15 以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(2)配列番号 1〜46で表される塩基配列またはその相補的配列の各々において、 60 以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(3)配列番号 47で表される塩基配列またはその相補的配列にぉ 、て、 15以上の連 続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(4)配列番号 47で表される塩基配列またはその相補的配列にぉ 、て、 60以上の連
続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(5)配列番号 1〜46で表される塩基配列にお!、て、それぞれ配列番号 48〜93で表 される塩基配列を含み、かつ 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(6)配列番号 1〜46で表される塩基配列に相補的な配列において、それぞれ配列番 号 48〜93で表される塩基配列に相補的な配列を含み、かつ 60以上の連続した塩 基を含むポリヌクレオチド。
(7)配列番号 47で表される塩基配列において、配列番号 94で表される塩基配列を 含み、かつ 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(8)配列番号 47で表される塩基配列に相補的な配列にお 、て、配列番号 94で表さ れる塩基配列に相補的な配列を含み、かつ 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレ ォチド。
[0252] 本発明で使用される上記ポリヌクレオチド類又はその断片類は 、ずれも DNAでも よ!ヽし RNAでもよ!/ゝ
[0253] 本発明の組成物としてのポリヌクレオチドは、 DNA組換え技術、 PCR法、 DNAZ RNA自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。
[0254] DNA組換え技術及び PCR法は、例えば Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, US (1993); Sambrookら , Molecular Cloning A Laboratory Manual, じ old Spring Harbor Laboratory Press, US (1989)などに記載される技術を使用することができる
[0255] ヒト由来の、 AXL、 C6orf54、 ZBTB11、 TNFRSF14、 NSUN5、 SPEN、 LTBP 3、 SYNGR1、 ARL3、 SLC13A1、 RALGDS、 ADD3、 MAP3K12、 AVPI1、 G IMAP6、 FLJ11259, C3AR1、 PCGF2、 PDE6D、 PLCG2, GPR148、 ARF6、 NISCH、 GLYAT、 IGHM、 FBX038、 SLC12A1、 PGDS、 CD48、 IMPA2、 H SPA6、 EIF3S9、 ZNF659、 RAB6C、 NOLI, DAB2、 EBI3、 PRSS3、 GLB1、 SAMSN1、 AQP3、 CAPZA2、 B4GALT2、 ARHGEF3、 POGK、 PRAF1およ び HPGD遺伝子は公知であり、前述のようにその取得方法も知られている。このため 、これらの遺伝子をクローユングすることによって、本発明の組成物としてのポリヌクレ
ォチドを作製することができる。
[0256] 本発明の組成物を構成するポリヌクレオチドは、 DNA自動合成装置を用いて化学 的に合成することができる。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この 方法によって約 100塩基までの一本鎖 DNAを自動合成することができる。 DNA自 動合成装置は、例えば Polygen社、 ABI社、 Applied BioSystems社などから巿販 されている。
[0257] あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、 cDNAクローユング法によって作製すること もできる。本発明にお 、て標的である上記遺伝子が発現される食道組織などの生体 組織力 抽出した total RNAをオリゴ dTセルロースカラムで処理して得られるポリ A ( + )RNAから RT— PCR法によって cDNAライブラリーを作製し、このライブラリーか らハイブリダィゼーシヨンスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニングなど のスクリーニングによって目的の cDNAクローンを得ることができる。必要に応じて、 c DNAクローンを PCR法によって増幅することもできる。プローブ又はプライマーは、 配列番号 1〜47に示される塩基配列に基づいて 15〜: L00塩基の連続する配列の中 力 選択し、合成しうる。 cDNAクローユング技術は、例えば Sambrook, J. & Russe 1, D. 著、 Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001年 1月 15日発行、の第 1卷 7. 42〜7. 45、第 2 卷 8. 9〜8. 17に記載されており、ポリヌクレオチドの作製のために利用しうる。
3. 2 (2
本発明において、食道ガン又は食道ガン細胞の存在を検出、判定又は予測するた めの核酸組成物の別の例は、上記 2節の II群に記載した 1又は 2以上のプローブを 含み、食道ガン関連の標的核酸としての、ヒト由来の GALNS, fgf3, CAMK2B , CaMKIINalpha, PSARL, XRCC3, CAPG, GRHPR, TROAP, RRM2, SATB2, C14orfl62, SEPT6, M6PR, SPRR3, EML1, Y PEL5, EIF4EBP2, SLC2A14及び SLIT2遺伝子、それらの同族体、それらの 転写産物又は cDNA、あるいはそれらの変異体又は誘導体の存在、発現量又は存 在量を定性的及び/又は定量的に測定することを可能にする。
[0258] 上記の標的核酸は、非ガン組織に比べて食道ガン組織においてその発現レベル
が有意に低下する。それゆえ、本発明の組成物は、非ガン組織と食道ガン組織につ V、て標的核酸の発現レベルを測定し、それらを比較するために有効に使用すること ができる。
[0259] 本発明で使用可能な組成物は、食道ガンに罹患した患者の生体組織にお!、て配 列番号 142〜161で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群及びその相補的ポ リヌクレオチド群、該塩基配列に相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな 条件でそれぞれノヽイブリダィズするポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチ ド群、ならびにそれらのポリヌクレオチド群の塩基配列において 15以上の連続した塩 基を含むポリヌクレオチド群力 選ばれた 1又は複数のポリヌクレオチドの組み合わせ を含む。
[0260] 具体的には、本発明の組成物は、以下の 1又は複数のポリヌクレオチド又はその断 片を含むことができる。
[0261] (1)配列番号 142〜161で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチド群、それらの 変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0262] (2)配列番号 142〜161で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
[0263] (3)配列番号 142〜155で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチド群、それらの 変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0264] (4)配列番号 142〜 155で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
[0265] (5)配列番号 142〜 155で表される塩基配列に相補的な塩基配列力もなるポリヌク レオチド群、それらの変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0266] (6)配列番号 142〜 155で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌク レオチド群。
[0267] (7)配列番号 142〜 155で表される塩基配列の各々と相補的な塩基配列からなる
DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド群、又は 15以上 の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0268] (8)配列番号 142〜 155で表される塩基配列の各々力もなる DNAとストリンジ ン トな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド群、又は 15以上の連続した塩基を含 むそれらの断片。
[0269] (9)配列番号 157〜161で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチド群、それらの 変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0270] (10)配列番号 157〜161で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
[0271] (11)配列番号 157〜161で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌ クレオチド群、それらの変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0272] ( 12)配列番号 157〜 161で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌク レオチド群。
[0273] (13)配列番号 157〜161で表される塩基配列の各々と相補的な塩基配列からな る DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド群、又は 15以上 の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0274] (14)配列番号 157〜161で表される塩基配列の各々力もなる DNAとストリンジ ン トな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド群、又は 15以上の連続した塩基を含 むそれらの断片。
[0275] (15)配列番号 156で表される塩基配列力 なるポリヌクレオチド、その変異体、又 は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0276] (16)配列番号 156で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
[0277] (17)配列番号 156で表される塩基配列に相補的な塩基配列力 なるポリヌクレオ チド、その変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0278] (18)配列番号 156で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチ ド、。
[0279] (19)配列番号 156で表される塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリ ンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、又は 15以上の連続した塩基 を含むそれらの断片。
[0280] (20)配列番号 156で表される塩基配列からなる DNAとストリンジ ントな条件でハ イブリダィズするポリヌクレオチド、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0281] 上記(1)〜(14)のポリヌクレオチドの断片は、各ポリヌクレオチドの塩基配列におい て、例えば、連続する 15〜配列の全塩基数、 15〜5000塩基、 15〜4500塩基、 15 〜4000塩基、 15〜3500塩基、 15〜3000塩基、 15〜2500塩基、 15〜2000塩
基、 15〜1500塩基、 15〜: L000塩基、 15〜900塩基、 15〜800塩基、 15〜700 塩基、 15〜600塩基、 15〜500塩基、 15〜400塩基、 15〜300塩基、 15〜250塩 基、 15〜200塩基、 15〜150塩基、 15〜140塩基、 15〜130塩基、 15〜120塩基 、 15〜: L 10塩基、 15〜: L00塩基、 15〜90塩基、 15〜80塩基、 15〜70塩基、 15〜 60塩基、 15〜50塩基、 15〜40塩基、 15〜30塩基又は 15〜25塩基; 25〜配列の 全塩基数、 25〜: L000塩基、 25〜900塩基、 25〜800塩基、 25〜700塩基、 25〜 600塩基、 25〜500塩基、 25〜400塩基、 25〜300塩基、 25〜250塩基、 25〜2 00塩基、 25〜150塩基、 25〜140塩基、 25〜130塩基、 25〜120塩基、 25~11 0塩基、 25〜: L00塩基、 25〜90塩基、 25〜80塩基、 25〜70塩基、 25〜60塩基、 25〜50塩基又は 25〜40塩基; 50〜配列の全塩基数、 50〜: L000塩基、 50〜900 塩基、 50〜800塩基、 50〜700塩基、 50〜600塩基、 50〜500塩基、 50〜400塩 基、 50〜300塩基、 50〜250塩基、 50〜200塩基、 50〜150塩基、 50〜140塩基 、 50〜130塩基、 50〜120塩基、 50〜: L 10塩基、 50〜: L00塩基、 50〜90塩基、 5 0〜80塩基、 50〜70塩基又は 50〜60塩基; 60〜配列の全塩基数、 60〜: L000塩 基、 60〜900塩基、 60〜800塩基、 60〜700塩基、 60〜600塩基、 60〜500塩基 、 60〜400塩基、 60〜300塩基、 60〜250塩基、 60〜200塩基、 60〜150塩基、 60〜140塩基、 60〜130塩基、 60〜120塩基、 60〜: L 10塩基、 60〜: L00塩基、 6 0〜90塩基、 60〜80塩基又は 60〜70塩基などの範囲の塩基数を含むことができる 1S これらに限定されないものとする。
[0282] 本発明の実施形態により、配列番号 142〜161で表される塩基配列を含むポリヌク レオチドの断片はそれぞれ、配列番号 162〜181で表される塩基配列又はその相補 的配列、あるいはそれらの連続する 15塩基以上の部分配列、を含むことが好ましい
[0283] 本発明の糸且成物には、例えば以下のポリヌクレオチドが包含される。
[0284] (1)配列番号 142〜 155で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において
、 15以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0285] (2)配列番号 142〜 155で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において
、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0286] (3)配列番号 157〜161で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において
、 15以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0287] (4)配列番号 157〜161で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において
、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0288] (5)配列番号 142〜 155で表される塩基配列において、 60以上の連続した塩基を 含むポリヌクレオチド中にそれぞれ配列番号 162〜 175で表される塩基配列を含む ポリヌクレオチド。
[0289] (6)配列番号 142〜 155で表される塩基配列に相補的な配列にお 、て、 60以上の 連続した塩基を含むポリヌクレオチド中にそれぞれ配列番号 162〜 175で表される 塩基配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド。
[0290] (7)配列番号 157〜161で表される塩基配列において、 60以上の連続した塩基を 含むポリヌクレオチド中にそれぞれ配列番号 177〜 181で表される塩基配列を含む ポリヌクレオチド。
[0291] (8)配列番号 157〜 161で表される塩基配列に相補的な配列にお 、て、 60以上の 連続した塩基を含むポリヌクレオチド中にそれぞれ配列番号 177〜 181で表される 塩基配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド。
[0292] (9)配列番号 156で表される塩基配列又はその相補的配列において、 15以上の連 続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0293] (10)配列番号 156で表される塩基配列又はその相補的配列において、 60以上の 連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0294] (11)配列番号 156で表される塩基配列において、 60以上の連続した塩基を含む ポリヌクレオチド中に配列番号 176で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
[0295] (12)配列番号 156で表される塩基配列に相補的な配列において、 60以上の連続 した塩基を含むポリヌクレオチド中に配列番号 176で表される塩基配列に相補的な 配列を含むポリヌクレオチド。
[0296] 本発明で使用される上記ポリヌクレオチド類又はその断片類は 、ずれも DNAでも よ!ヽし RNAでもよ!/ゝ
[0297] 本発明の組成物としてのポリヌクレオチドは、 DNA組換え技術、 PCR法、 DNAZ
RNA自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。
[0298] DNA組換え技術及び PCR法は、例えば Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, US (1993); Sambrookら , Molecular Cloning A Laboratory Manual, じ old Spring Harbor Laboratory Press, US (1989)などに記載される技術を使用することができる
[0299] GALNS, fgf3, CAMK2B, CaMKIINalpha, PSARL, XRCC3, C APG, GRHPR, TROAP, RRM2, SATB2, C14orfl62, SEPT6, M6PR, SPRR3, EML1, YPEL5, EIF4EBP2, SLC2A14及び SLIT2 遺伝子は公知であり、その取得方法も知られている。このため、これらの遺伝子をクロ 一-ングすることによって、本発明の組成物としてのポリヌクレオチドを作製することが できる。
[0300] GALNS遺伝子は、例えば Tomatsu, S.ら、 1991年、 Biochemical Biophysi cal Research Communication,第 181卷、 p. 677— 683【こ記載される方法【こよ つて得ることがでさる。
[0301] fgf3遺伝子は、例えば Brookes, S.ら、 1989年、 Oncogene,第 4卷、 p. 429-43
6に記載される方法によって得ることができる。
[0302] CMK2B遺伝子は、例えば Tombes, R. M.ら、 1997年、 Biochimica et Bioph ysica Acta,第 1355卷、 p. 281- 292に記載される方法によって得ることができる。
[0303] CAMKIINalpha遺伝子は、例えば Strausberg, R. L.ら、 2002年、 Proceedin gs of the National Academic Sciences U. S. A.、第 99卷、 p. 16899-1690
3に記載される方法によって得ることができる。
[0304] PSARL遺伝子は、例えば Pellegrini, L.ら、 2001年、 Journal of Alzheimer' s Disease、第 3卷、 p. 181— 190に記載される方法によって得ることができる。
[0305] XRCC3遺伝子は、例えば Tebbes, R. S.ら、 1995年、 Proceedings of the Na tional Academic Sciences U. S. A.、第 92卷、 p. 6354- 6358に記載される方 法によって得ることができる。
CAPG遺伝子は、例えば Dabiri, G. A.ら、 1992年、 Journal of Biological Che
mistry、第 267卷、 p. 16545-16552に記載される方法によって得ることができる。 GRHPR遺伝子は、例えば Rumsby, G.ら, 1999年、 Biochimica et Biophysic a Acta、第 1446卷、 p. 383-388に記載される方法によって得ることができる。
[0306] TROAP遺伝子は、例えば Fukuda, M. N.ら、 1995年、 Genes and Develop ment、第 9卷、 p. 1199-1210に記載される方法によって得ることができる。
[0307] RRM2遺伝子は、例えば Yang- Feng, T. L.ら、 1987年、 Genomics,第 1卷、 ρ
. 77-86に記載される方法によって得ることができる。
[0308] SATB2遺伝子は、例えば Kikuno. R.ら、 1999年、 DNA Research,第 6卷、 p
. 197- 205に記載される方法によって得ることができる。
[0309] C14orfl62は、例えば Mao, Y.ら、 2000年にクローニングを報告している。
[0310] SEPT6遺伝子は、例えば Ono, R.ら、 2002年、 Cancer Research,第 62卷、 p
. 333-337に記載される方法によって得ることができる。
[0311] M6PR遺伝子は、例えば Pohlmann, R.ら、 1987年、 Proceedings of the Nati onal Academic Sciences U. S. A.、第 84卷、 p. 5575— 5579に記載される方 法によって得ることができる。
[0312] SPRR3遺伝子は、例えば Gibbs, S.ら、 1993年、 Genomics,第 16卷、 p. 630
— 637に記載される方法によって得ることができる。
[0313] EML1遺伝子は、例えば Eudy, J. D.ら、 1997年、 Genomics,第 43卷、 p. 10
4— 106に記載される方法によって得ることができる。
[0314] YPEL5遺伝子は、例えば Roxstrom— Lindquist, K.ら、 2001年、 Insect mole cular biology、第 10卷、 p. 77— 86に記載される方法によって得ることができる。
[0315] EIF4EBP2遺伝子は、例えば Pause, A.ら、 1994年、 Nature,第 371卷、 p. 76
2— 767に記載される方法によって得ることができる。
[0316] SLC2A14遺伝子は、例えば Strausberg, R. L.ら、 2002年、 Proceedings of t he National Academic Sciences U. S. A.、第 99卷、 p. 16899- 16903に記 載される方法〖こよって得ることができる。
[0317] SLIT2遺伝子は、例えば Itoh, A.ら、 1998年、 Molecular Brain Research
、第 62卷、 p. 175-186に記載される方法によって得ることができる。
[0318] 本発明の組成物を構成するポリヌクレオチドは、 DNA自動合成装置を用いて化学 的に合成することができる。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この 方法によって約 100塩基までの一本鎖 DNAを自動合成することができる。 DNA自 動合成装置は、例えば Polygen社、 ABI社、 Applied BioSystems社などから巿販 されている。
[0319] あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、 cDNAクローユング法によって作製すること もできる。本発明にお 、て標的である上記遺伝子が発現される食道組織などの生体 組織力 抽出した total RNAをオリゴ dTセルロースカラムで処理して得られるポリ A ( + )RNAから RT— PCR法によって cDNAライブラリーを作製し、このライブラリーか らハイブリダィゼーシヨンスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニングなど のスクリーニングによって目的の cDNAクローンを得ることができる。必要に応じて、 c DNAクローンを PCR法によって増幅することもできる。プローブ又はプライマーは、 配列番号 142〜 161に示される塩基配列に基づ!/ヽて 15〜: L00塩基の連続する配列 の中力も選択し、合成しうる。 cDNAクローユング技術は、例えば Sambrook, J. & R ussel, D. 著、 Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Sp ring Harbor Laboratory Press, 2001年 1月 15日発行、の第 1卷 7. 42〜7. 45 、第 2卷 8. 9〜8. 17に記載されており、ポリヌクレオチドの作製のために利用しうる。
3. 3 ^
本発明の組成物は、食道ガン診断用プローブとして、上記 2節の III群に記載される 抗体、その断片又は化学修飾誘導体を含むことができる。このような組成物は、食道 ガンをもつ被験者における食道ガンの存在及び/又は転移をインビトロで検出、判定 又は予測するために有用である。ここで、転移の予測は、被験者の術後の予後の良 、不良の予測に導くことができる。
[0320] (A)本発明の抗体組成物の第 1の例は、上記 ΠΙ群 (k)に記載される配列番号 95〜 140で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変異体又はその断片に対す る 1または複数の抗体、その断片、またはそれらの化学修飾誘導体を含む組成物で ある。
[0321] 本発明の糸且成物には、配列番号 141で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
、その変異体又はその断片に対する抗体、その断片またはそれらの化学修飾誘導 体をさらに含むことができる。これらの抗体の併用によって、予後予測のための精度 を高めることができる。
[0322] すなわち、本発明により、食道ガン転移マーカーとしての、上記 AXL、 C6orf54、 Z BTB11、 TNFRSF14、 NSUN5、 SPEN、 LTBP3、 SYNGR1、 ARL3、 SLC13 Al、 RALGDS、 ADD3、 MAP3K12、 AVPI1、 GIMAP6、 FLJ11259、 C3AR1 、 PCGF2、 PDE6Dゝ PLCG2、 GPR148、 ARF6、 NISCH、 GLYAT、 IGHM、 F BX038、 SLC12A1, PGDS、 CD48、 IMPA2、 HSPA6、 EIF3S9、 ZNF659、 RAB6C、 NOLI, DAB2、 EBI3、 PRSS3、 GLB1、 SAMSN1、 AQP3、 CAPZA 2、 B4GALT2、 ARHGEF3、 POGK、 PRAF1および HPGD遺伝子によってコー ドされるポリペプチド、それらの同族体、あるいはそれらの変異体又は誘導体を検出 するために、これらのポリペプチド、その変異体又はその断片に対する抗体を 1又は 複数組み合わせて含む、食道ガンの存在及び/又は転移を検出、判定又は予測す るための組成物を提供する。
[0323] (B)本発明の抗体組成物の第 2の例は、上記 III群 (1)に記載される配列番号 182 〜195、 197〜201で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変異体又は その断片に対する 1または複数の抗体、その断片、またはそれらの化学修飾誘導体 を含む組成物である。
[0324] 本発明の糸且成物には、配列番号 196で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド 、その変異体又はその断片に対する抗体、その断片またはそれらの化学修飾誘導 体をさらに含むことができる。
[0325] すなわち、本発明により、食道ガンマーカーとしての、上記 GALNS, fgf3, CA MK2B, CaMKIINalpha, PSARL, XRCC3, CAPG, GRHPR, TRO AP, RRM2, SATB2, C14orfl62, SEPT6, M6PR, SPRR3, EML 1, YPEL5, EIF4EBP2, SLC2A14及び SLIT2遺伝子によってコードされる ポリペプチド、それらの同族体、あるいはそれらの変異体又は誘導体を検出するため に、これらのポリペプチド、その変異体又はその断片に対する抗体を 1又は複数組み 合わせて含む、食道ガンの存在を検出、判定又は予測するための組成物を提供す
る。
[0326] (C)本発明の抗体組成物の第 3の例は、上記 ΠΙ群 (m)に記載される配列番号 202 〜232で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変異体又はその断片に対 する 1または複数の抗体、その断片、またはそれらの化学修飾誘導体を含む、食道 ガンをもつ被験者における食道ガンの存在をインビトロで検出、判定又は予測するた めの組成物である。
[0327] 本発明の組成物には、配列番号 233で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド 、その変異体又はその断片の少なくとも 1つと特異的に結合する抗体、その断片また はそれらの化学修飾誘導体をさらに含むことができる。
[0328] 上記のポリペプチドは、上記の表 1に記載の遺伝子によってコードされている。
[0329] これらのポリペプチドは、 DNA組換え技術によって得ることができる。例えば、上記 のようにして得られた cDNAクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによつ て形質転換又はトランスフエクシヨンされた原核又は真核宿主細胞を培養すること〖こ よって該細胞又は培養上清力も得ることができる。ベクター及び発現系は Novagen 社、宝酒造、第一化学薬品、 Qiagen社、 Stratagene社、 Promega社、 Roche Di agnositics千土、 Invitrogen社、 Genetics Institute社、 Amersham Bioscience 社など力 入手可能である。
[0330] 宿主細胞としては、細菌などの原核細胞 (例えば大腸菌、枯草菌)、酵母 (例えばサ ッカロマイセス.セレビシァェ)、昆虫細胞 (例えば SUB胞)、哺乳動物細胞 (例えば C OS、 CHO、 BHK)などを用いることができる。
[0331] ベクターには、該ポリペプチドをコードする DNAの他に、調節エレメント、例えばプ 口モーター、ェンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、複製開始 点、ターミネータ一、選択マーカーなどを含むことができる。
[0332] またポリペプチドの精製を容易にするために標識ペプチドをポリペプチドの C末端 または N末端につけた融合ポリペプチドとしてもよい。代表的な標識ペプチドには、 6 〜10残基のヒスチジンリピート、 FLAG, mycペプチド、 GFPポリペプチドなどが挙 げられる力 標識ペプチドはこれらにかぎられるものではない。また DNA組換え技術 については、 Sambrook, J. & Russel, D. (上記)に記載されている。
[0333] 標識ペプチドを付けずに本発明に係るポリペプチドを生産した場合には、その精製 法として例えばイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。またこ れにカ卩えて、ゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組 み合わせる方法でもよい。一方、当該タンパクにヒスチジンリピート、 FLAG, myc、 G FPといった標識ペプチドを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれの標識 ペプチドに適したァフィユティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。 単離 '精製が容易となるような発現ベクターを構築するとよい。特にポリペプチドと標 識ペプチドとの融合ポリペプチドの形態で発現するように発現ベクターを構築し、遺 伝子工学的に当該ポリペプチドを調製すれば、単離 '精製も容易である。
[0334] 本発明における上記ポリペプチドの変異体は、上記定義のとおり、配列番号 95〜1 41、 182〜201、 202〜233で表されるアミノ酸配列又はその部分配列おいて 1以 上、好ましくは 1もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体 、あるいは該アミノ酸配列又はその部分配列と約 80%以上、約 85%以上、好ましく は約 90%以上、より好ましくは約 95%以上、約 97%以上、約 98%以上、約 99%以 上の%同一性を示す変異体である。このような変異体には、例えば、ヒトと異なる哺乳 動物種のホモログ、ヒトの多型性変異ゃスプライス変異に基づく変異体などの天然変 異体が含まれる。
[0335] 本発明における上記ポリペプチド又は変異体の断片は、該ポリペプチドのアミノ酸 配列の少なくとも 5個、少なくとも 7個、少なくとも 10個、少なくとも 15個、好ましくは少 なくとも 20個、少なくとも 25個、より好ましくは少なくとも 30個、少なくとも 40個、少なく とも 50個の連続するアミノ酸残基力もなり、 1個または複数のェピトープを保持する。 このような断片は、本発明の抗体またはその断片と免疫特異的に結合することができ るものである。上記ポリペプチドは、生体内に存在するプロテア一ゼゃぺプチダーゼ などの酵素によって切断され断片化されて存在することも予想される。
[0336] このようにして得られたポリペプチドを認識する抗体は、抗体の抗原結合部位を介 して、該ポリペプチドに特異的に結合し得る。具体的には、配列番号 95〜141、 182 〜201、 202〜233のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその断片、その変異体 ポリペプチド又は融合ポリペプチドなどを、それぞれに免疫反応性である抗体を産生
するための免疫原として使用することが可能である。
[0337] より具体的には、ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチドなどは、抗体形成 を引き出す抗原決定基またはェピトープを含むが、これら抗原決定基またはェピトー プは、直鎖でもよいし、より高次構造 (断続的)でもよい。なお、該抗原決定基または ェピトープは、当該技術分野に知られるあらゆるェピトープ解析法、例えばファージ ジスプレイ法、リバースィムノジェネティックス法など、によって同定できる。
[0338] 本発明のポリペプチドによってあらゆる態様の抗体が誘導される。該ポリペプチドの 全部若しくは一部又はェピトープが単離されて 、れば、慣用的技術を用いてポリクロ ーナル抗体およびモノクローナル抗体の 、ずれも調製可能である。方法には例えば 、 Kennetり (監修) , Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dim ension in Biological Analyses, Pie num Press, New York, 1980に挙げ られた方法がある。
[0339] ポリクローナル抗体は、鳥類 (例えば、 -ヮトリなど)、哺乳動物 (例えば、ゥサギ、ャギ 、ゥマ、ヒッジ、ネズミなど)などの動物に本発明に係るポリペプチドを免疫することに よって作製することができる。目的の抗体は、免疫された動物の血液から、硫安分画 、イオン交換クロマとグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィーなどの手法を適宜組 み合わせて精製することができる。
[0340] モノクローナル抗体は、各ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生する ノ、イブリドーマ細胞株を、慣用技術によってマウスにおいて産生することを含む手法 によって得ることができる。こうしたノヽイブリドーマ細胞株を産生するための 1つの方法 は、動物を本発明の酵素ポリペプチドで免疫し、免疫された動物カゝら脾臓細胞を採 取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイプリドーマ細胞を生成 し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞株を 同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用技術によって回収可能である。
[0341] 本発明の抗体としては、本発明の標的ポリペプチドまたはその断片と特異的に結合 するものであれば特に限定されず、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも 使用することができる力 モノクローナル抗体を使用するのが好ましい。別の抗体に は、組換え抗体、合成酵素、多重特異的抗体 (例えば二重特異的抗体)、単鎖抗体
、抗体断片などが含まれる。そのような抗体の例は、 Fab、 F (ab' ) 、 scFv、 Fv、 dsF
2
Vなどである。また、本発明の抗体のグロブリンタイプ及びクラスは、上記特徴を有す るものである限り特に限定されるものではなぐ IgG、 IgM、 IgA、 IgE、 IgD、 IgG、 Ig G、 IgG、 IgG、 IgA、 IgAなどのいずれでもよい。
2 3 4 1 2
<モノクローナル抗体の作製 >
(1)免疫及び抗体産生細胞の採取
標的ポリペプチドからなる免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス (例えば近交 系マウスの BalbZc)、ゥサギなどに投与する。免疫原の 1回の投与量は、免疫動物 の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物 1匹当たり約 50〜20 O /z gとされる。免疫は主として皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。 また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましく は 1〜4週間間隔で、 2〜: L0回、好ましくは 3〜4回追加免疫を行う。初回免疫の後、 免疫動物の血清中の抗体価の測定を ELIS A (Enzyme— Linked Immuno Sor bent Assay)法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原 を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から 2〜5 日後、好ましくは 3日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓 細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節 細胞が好ましい。
(2)細胞融合
各標的ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞 株を作製する。こうしたハイプリドーマは、慣用的技術によって産生し、そして同定す ることが可能である。こうしたノ、イブリドーマ細胞株を産生するための 1つの方法は、 動物を本発明のタンパク質で免疫し、免疫された動物カゝら脾臓細胞を採取し、該脾 臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイプリドーマ細胞を生成し、そして 該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞株を同定するこ とを含む。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウスなどの動物の一 般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選 択性を有し、未融合の状態では HAT選択培地 (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有 するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが 好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、 BALBZcマウス由来のヒポキサンチン' グァニン 'ホスホリボシル 'トランスフェラーゼ(HGPRT)欠損細胞株である P3X63— Ag. 8株 (ATCC TIB9)などが挙げられる。
[0342] 次に、上記骨髄腫細胞株と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清 を含まない DMEM、 RPMI— 1640培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産 生細胞と骨髄腫細胞株とを約 1 : 1〜 20 : 1の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在 下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量 1500〜4000ダルトン のポリエチレングリコール等を約 10〜80%の濃度で使用することができる。また場合 によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用し てもよい。さらに、電気刺激 (例えばエレクト口ポレーシヨン)を利用した市販の細胞融 合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる。
(3)ハイプリドーマの選別及びクローユング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選別する。その方法として 、細胞懸濁液を、例えばゥシ胎児血清含有 RPMI— 1640培地などで適当に希釈後 、マイクロタイタープレート上に 200万個/ゥエル程度まき、各ゥエルに選択培地をカロ え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、 20〜40°C、好ましく は約 37°Cである。ミエローマ細胞が HGPRT欠損株またはチミジンキナーゼ欠損株 のものである場合には、ヒポキサンチン'アミノプテリン'チミジンを含む選択培地 (HA T培地)を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイプリドー マのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始 後、約 14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
[0343] 次に、増殖してきたハイプリドーマの培養上清中に、 目的とする抗体が存在するか 否かをスクリーニングする。ハイプリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えば よぐ特に限定されない。例えば、ノ、イブリドーマとして生育したゥエルに含まれる培 養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法 (EIA: Enzyme Immuno Assay、及び ELISA)、放射免疫測定法 (RIA:Radio Immuno Assay)等によって行うことが
できる。融合細胞のクローユングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクロ一 ナル抗体産生細胞であるハイプリドーマを榭立する。本発明のハイプリドーマは、後 述するように、 RPMI— 1640、 DMEM等の基本培地中での培養において安定であ り、標的ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するもの である。
(4)抗体の回収
モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち榭立したノ、 イブリドーマ力もモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法また は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイプリドーマを 10%ゥシ胎児血清含有 RPMI— 1640培地、 MEM培地または無血清培地等の動 物細胞培養培地中で、通常の培養条件 (例えば 37°C、 5%CO濃度)で 2〜10日間
2
培養し、その培養上清力 抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞 由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイプリドーマを約 1000万個投与し、ノヽ イブリドーマを大量に増殖させる。そして、 1〜2週間後に腹水または血清を採取する 上記抗体の採取方法にお!ヽて、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、 イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィ 一などの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより、精 製されたモノクローナル抗体を得ることができる。
<ポリクローナル抗体の作製 >
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様にゥサギ等の動物を免疫し、最 終の免疫日から 6〜60日後に、酵素免疫測定法 (EIA及び ELISA)、放射免疫測定 法 (RIA)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。 その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性を ELISA法などで測定する。 <化学修飾誘導体 >
本発明の抗体又はその断片は、化学修飾された誘導体であってもよい。例えば、 酵素、蛍光団、放射性同位元素などのラベルによる標識ィ匕誘導体、或いはァセチル ィ匕、ァシル化、アルキル化、リン酸化、硫酸化、グリコシルイ匕誘導体、などの化学修飾
誘導体を挙げることができる。
[0345] 標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、ペルォキシダーゼ (POD)、アル カリホスファターゼ、 13 ガラクトシダーゼ、ゥレアーゼ、カタラーゼ、グノレコースォキ シダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミーゼまたはピオチン アビジン複合体等の酵素を 、蛍光免疫測定法の場合には、フルォレセインイソチオシァネート、テトラメチルロー ダミンイソチオシァネート、置換ローダミンイソチオシァネート、ジクロロトリアジンイソチ オシァネート、 Alexaまたは AlexaFluoro等の蛍光性物質もしくは蛍光団を、そして 放射免疫測定法の場合にはトリチウム、ヨウ素 (131ι, 125ι, 123ι, 121ι)、リン (32P)、ィォ ゥ (3 )、金属類 (例えば68 Ga, 6?Ga, 68Ge, 54Mn, "Mo, "TC, 133Xeなど)等の放 射性同位元素を用いることができる。また、発光免疫測定法は、 NADH—、 FMNH 2—、ルシフェラーゼ系、ルミノール 過酸化水素 POD系、アタリジ-ゥムエステル 系またはジォキセタンィ匕合物系等の発光性分子、発光物質、生物発光物質を用いる ことができる。
[0346] また、必要に応じて、アビジン一ピオチン系またはストレプトアビジン一ピオチン系を 利用することも可能であり、この場合、本発明の抗体またはその断片に例えばビォチ ンを結合することもできる。標識物質と抗体との結合法は、酵素免疫測定法の場合に はダルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフイド法または過ヨウ素酸法等 の公知の方法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミン T法、ボルトンノヽンター法等 の公知の方法を用いることができる。
4.食 i首ガン診断用キット
4. 1核酸キット
本発明はまた、上記 2節の I群及び Π群に記載されるポリヌクレオチド、上記 3. 1及 び 3. 2節に記載されるポリヌクレオチド、それらの変異体及び/又はそれらの断片のう ち 1つ又は複数を含む食道ガンの存在又は転移をインビトロで検出、判定又は予測 するためのキットを提供する。
[0347] 本発明のキットには、以下に記載するような I群及び Π群からの核酸プローブを含有 させることができる。これらのプローブの各々は単独で又は組み合わせて適当な容器 に収納されうる。
< I群の核酸プローブ >
本発明によれば、本発明のキットに含有する I群の核酸プローブは、食道ガンの存 在及び/又は転移の検出、判定又は予測のために使用されうる。
[0348] 本発明のキットは、配列番号 1〜46で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、そ の相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条 件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの断片を少な くとも 1つ含むことができる。
[0349] 本発明のキットは、さらに配列番号 47で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、 その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな 条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの断片を少 なくとも 1つ含むことができる。
[0350] 本発明のキットに含むことができるポリヌクレオチド断片は、例えば下記の(1)〜(5) 力 なる群より選択される 1以上の DNAである:
(1)配列番号 1〜46、 47で表される塩基配列又はその相補的配列において、 15以 上の連続した塩基を含む DNA。
(2)配列番号 1〜46、 47で表される塩基配列又はその相補的配列において、 60以 上の連続した塩基を含む DNA。
(3)配列番号 1〜46、 47で表される塩基配列又はその相補的配列において、それ ぞれ配列番号 48〜93、 94で表される塩基配列又はその相補的配列を含み、かつ 6 0以上の連続した塩基を含む DNA。
(4)配列番号 48〜93、 94で表される塩基配列力 なる DNA。
(5)配列番号 48〜93、 94で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含む DNA。
[0351] 好ま 、実施形態では、前記ポリヌクレオチド力 配列番号 1〜46の 、ずれかで表 される塩基配列力 なるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、 それらのポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド 、又はそれらの 15以上の連続した塩基を含む断片である。
[0352] 別の好ましい実施形態では、本発明のキットは、上記のポリヌクレオチドにカ卩えて、 配列番号 47で表される塩基配列力 なるポリヌクレオチド、その相補的配列力 なる
ポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でノ、イブリダィズす るポリヌクレオチド、又はそれらの 15以上の連続した塩基を含む断片をさらに含むこ とがでさる。
[0353] 好ましい実施形態では、前記断片は、 15以上、好ましくは 60以上の連続した塩基 を含むポリヌクレオチドであることができる。
[0354] 別の好ま 、実施形態では、前記断片が、配列番号 1〜46、 47の 、ずれかで表さ れる塩基配列において、それぞれ配列番号 48〜93、 94のいずれかで表される塩基 配列を含み、かつ 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレ ォチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
[0355] 別の好ま 、実施形態では、前記断片が、配列番号 48〜93、 94の 、ずれかで表 される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
[0356] 別の好ま 、実施形態では、前記断片が、配列番号 48〜93、 94の 、ずれかで表 される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
[0357] 別の好ま 、実施形態では、前記断片が、配列番号 48〜93、 94の 、ずれかで表 される塩基配列力もなるポリヌクレオチドである。
[0358] 上記の組み合わせの具体例は、配列番号 1および 2の塩基配列又はその相補的 配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、イブ リダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 1〜3の塩基配列又は その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな 条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 1〜4の 塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列 番号 1〜5の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌク レオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はそ の断片、配列番号 1〜6の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、そ れらのポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、 及び/又はその断片、配列番号 1〜7の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌ クレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でノ、イブリダィズするポリ
ヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 1〜8の塩基配列又はその相補的配列 を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でノ、イブリダィ ズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 1〜9の塩基配列又はその相 補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件で ハイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 1〜: LOの塩基配 列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ ェントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、又はその断片、配列番号 1〜11 の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配 列番号 1〜12の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリ ヌクレオチドとストリンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又は その断片、配列番号 1〜13の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド 、それらのポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチ ド、及び/又はその断片、配列番号 1〜14の塩基配列又はその相補的配列を含むポ リヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズする ポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 1〜15の塩基配列又はその相補的 配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、ィ ブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 1〜16の塩基配列又 はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェント な条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 1〜17 の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド及び/又はその断片、配列 番号 1〜18の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌ クレオチドとストリンジヱントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又は その断片、配列番号 1〜19の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド 、それらのポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチ ド、及び/又はその断片、配列番号 1〜20の塩基配列又はその相補的配列を含むポ リヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズする ポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 1〜21の塩基配列またはその相補
的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、 イブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片配列番号 1〜22の塩基配 列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリン ジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列 番号 1〜23の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリ ヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、および/ま たはその断片、配列番号 1〜24の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレ ォチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、イブリダィズするポリヌク レオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜25の塩基配列またはその相補的 配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、ィ ブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜26の塩基配 列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリン ジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列 番号 1〜27の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリ ヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、および/ま たはその断片、配列番号 1〜28の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレ ォチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、イブリダィズするポリヌク レオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜29の塩基配列またはその相補的 配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、ィ ブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜30の塩基配 列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリン ジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列 番号 1〜31の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリ ヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、および/ま たはその断片、配列番号 1〜32の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレ ォチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、イブリダィズするポリヌク レオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜33の塩基配列またはその相補的 配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、ィ
ブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜34の塩基配 列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリン ジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列 番号 1〜35の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリ ヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、および/ま たはその断片、配列番号 1〜36の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレ ォチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、イブリダィズするポリヌク レオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜37の塩基配列またはその相補的 配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、ィ ブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜38の塩基配 列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリン ジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列 番号 1〜39の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリ ヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、および/ま たはその断片、配列番号 1〜40の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレ ォチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、イブリダィズするポリヌク レオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜41の塩基配列またはその相補的 配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、ィ ブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜42の塩基配 列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリン ジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列 番号 1〜43の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリ ヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、および/ま たはその断片、配列番号 1〜44の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレ ォチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、イブリダィズするポリヌク レオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜45の塩基配列またはその相補的 配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、ィ ブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列番号 1〜46の塩基配
列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリン ジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、および/またはその断片、配列 番号 1〜47の塩基配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリ ヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、および/ま たはその断片である。
[0359] 別のより好ましい実施形態によれば、本発明のキットは、配列番号 48〜93、 94で 表される塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの 2以上〜全部を含 むことができる。
< II群の核酸プローブ >
本発明によれば、本発明のキットに含有する II群の核酸プローブは、食道ガンの存 在の検出、判定又は予測のために使用されうる。
[0360] 本発明のキットは、配列番号 142〜155、 157〜161で表される塩基配列を含むポ リヌクレオチド、その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとス トリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオ チドの断片を少なくとも 1つ含むことができる。
[0361] 本発明のキットは、さらに配列番号 156で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
、その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェント な条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの断片を 少なくとも 1つ含むことができる。
[0362] 本発明のキットに含むことができるポリヌクレオチド断片は、例えば下記の(1)〜(5) 力 なる群より選択される 1以上の DNAである:
(1)配列番号 142〜 161で表される塩基配列又はその相補的配列にお 、て、 15 以上の連続した塩基を含む DNA。
[0363] (2)配列番号 142〜161で表される塩基配列又はその相補的配列において、 60 以上の連続した塩基を含む DNA。
[0364] (3)配列番号 142〜161で表される塩基配列又はその相補的配列において、 60 以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド中にそれぞれ配列番号 162〜181で表 される塩基配列又はその相補的配列を含む DNA。
[0365] (4)配列番号 162〜181で表される塩基配列力もなる DNA。
[0366] (5)配列番号 162〜181で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含む DNA。
[0367] 好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチド力 配列番号 142〜155、 157-16 1の 、ずれかで表される塩基配列力 なるポリヌクレオチド、その相補的配列力 なる ポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でノ、イブリダィズす るポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの 15以上の連続した塩基を含む断 片である。
[0368] 別の好ましい実施形態では、本発明のキットは、上記のポリヌクレオチドにカ卩えて、 配列番号 156で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からな るポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でハイブリダィズ するポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの 15以上の連続した塩基を含む 断片をさらに含むことができる。
[0369] 好ましい実施形態では、前記断片は、 15以上、好ましくは 60以上の連続した塩基 を含むポリヌクレオチドであることができる。
[0370] 別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号 142〜161のいずれかで表さ れる塩基配列にぉ 、て、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド中にそれぞ れ配列番号 162〜181のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又 は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
[0371] 別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号 162〜181のいずれかで表さ れる塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
[0372] 別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号 162〜181のいずれかで表さ れる塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
[0373] 別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号 162〜181のいずれかで表さ れる塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
[0374] 好ましい実施形態によれば、本発明のキットは、配列番号 142〜155で表される塩 基配列を含むポリヌクレオチド、その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポ リヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、又はそれ らのポリヌクレオチドの 15以上の連続した塩基を含む断片力 選択される 1又は複数
のポリヌクレオチドを含む。
[0375] 前記ポリヌクレオチドは、限定されないが、例えば、配列番号 142〜155のいずれ かで表される塩基配列において、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド中 にそれぞれ配列番号 162〜 175のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオ チド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドであ ることがでさる。
[0376] 好ましい別の実施形態によれば、本発明のキットは、配列番号 157〜161で表され る塩基配列を含むポリヌクレオチド、その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それら のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、又は それらのポリヌクレオチドの 15以上の連続した塩基を含む断片力も選択される 1又は 複数のポリヌクレオチドを含む。
[0377] 前記ポリヌクレオチドは、限定されないが、例えば、配列番号 157〜161のいずれ かで表される塩基配列において、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド中 にそれぞれ配列番号 177〜181のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオ チド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドであ る。
[0378] 本発明のキットは、上記の 2種類以上のポリヌクレオチドの任意の組み合わせを含 むことができる。
[0379] そのような組み合わせの具体例は、配列番号 142および 143の塩基配列又はその 相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件で ハイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 142〜144の塩 基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリ ンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番 号 142〜 145の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリ ヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又は その断片、配列番号 142〜 146の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオ チド、それらのポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレ ォチド、及び/又はその断片、配列番号 142〜 147の塩基配列又はその相補的配列
を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ ントな条件でノ、イブリ ダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 142〜 148の塩基配列 又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 14 2〜 149の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオ チドとストリンジヱントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断 片、配列番号 142〜 150の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、 それらのポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド 、及び/又はその断片、配列番号 142〜151の塩基配列又はその相補的配列を含 むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ ントな条件でノ、イブリダィズ するポリヌクレオチド、又はその断片、配列番号 142〜152の塩基配列又はその相 補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件で ハイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 142〜153の塩 基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリ ンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番 号 142〜 154の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリ ヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又は その断片、配列番号 142〜 155の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオ チド、それらのポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレ ォチド、及び/又はその断片、配列番号 142〜 156の塩基配列又はその相補的配列 を含むポリヌクレオチド及び/又はその断片、配列番号 142〜157の塩基配列又はそ の相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条 件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 142〜158 の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配 列番号 142〜 159の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それら のポリヌクレオチドとストリンジ ントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド、及び /又はその断片、配列番号 142〜160の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌ
クレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でノ、イブリダィズするポリ ヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号 142〜161の塩基配列又はその相補 的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、 イブリダィズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片である。
[0380] 別のより好ましい実施形態によれば、本発明のキットは、配列番号 162〜181で表 される塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの 2以上〜全部を含むこ とがでさる。
[0381] 別の組み合わせの具体例は、配列番号 162〜165、 167、 171、 173、 174及び 1 76の塩基配列又はその相補的配列を含む (又は、力もなる)ポリヌクレオド及び/又は その断片である。
[0382] さらに別の組み合わせの具体例は、配列番号 162〜166、 168〜172及び 175の 塩基配列又はその相補的配列を含む (又は、力 なる)ポリヌクレオド及び/又はその 断片である。
[0383] 本発明にお 、て、上記の I群、 II群のポリヌクレオチドの断片のサイズは、各ポリヌク レオチドの塩基配列において、例えば、連続する 15〜配列の全塩基数、 15〜5000 塩基、 15〜4500塩基、 15〜4000塩基、 15〜3500塩基、 15〜3000塩基、 15〜 2500塩基、 15〜2000塩基、 15〜1500塩基、 15〜: LOOO塩基、 15〜900塩基、 1 5〜800塩基、 15〜700塩基、 15〜600塩基、 15〜500塩基、 15〜400塩基、 15 〜300塩基、 15〜250塩基、 15〜200塩基、 15〜150塩基、 15〜140塩基、 15〜 130塩基、 15〜120塩基、 15〜: L 10塩基、 15〜: LOO塩基、 15〜90塩基、 15〜80 塩基、 15〜70塩基、 15〜60塩基、 15〜50塩基、 15〜40塩基、 15〜30塩基又は 15〜25塩基; 25〜配列の全塩基数、 25〜: LOOO塩基、 25〜900塩基、 25〜800 塩基、 25〜700塩基、 25〜600塩基、 25〜500塩基、 25〜400塩基、 25〜300塩 基、 25〜250塩基、 25〜200塩基、 25〜150塩基、 25〜140塩基、 25〜130塩基 、 25〜120塩基、 25〜: L 10塩基、 25〜: LOO塩基、 25〜90塩基、 25〜80塩基、 25 〜70塩基、 25〜60塩基、 25〜50塩基又は 25〜40塩基; 50〜配列の全塩基数、 50〜: LOOO塩基、 50〜900塩基、 50〜800塩基、 50〜700塩基、 50〜600塩基、 50〜500塩基、 50〜400塩基、 50〜300塩基、 50〜250塩基、 50〜200塩基、 5
0〜150塩基、 50〜140塩基、 50〜130塩基、 50〜120塩基、 50〜: L 10塩基、 50 〜100塩基、 50〜90塩基、 50〜80塩基、 50〜70塩基又は 50〜60塩基; 60〜配 列の全塩基数、 60〜: L000塩基、 60〜900塩基、 60〜800塩基、 60〜700塩基、 6 0〜600塩基、 60〜500塩基、 60〜400塩基、 60〜300塩基、 60〜250塩基、 60 〜200塩基、 60〜150塩基、 60〜140塩基、 60〜130塩基、 60〜120塩基、 60〜 110塩基、 60〜: L00塩基、 60〜90塩基、 60〜80塩基又は 60〜70塩基などの範 囲の塩基数である。
[0384] 本発明のキットを構成する上記の組み合わせは、あくまでも例示であり、他の種々 の可能な組み合わせのすべてが本発明に包含されるものとする。
[0385] 本発明のキットには、上で説明した本発明におけるポリヌクレオチド、その変異体又 はその断片に加えて、食道ガンの検出を可能とする既知の又は将来見出されるポリ ヌクレ才チドも包含させることができる。
4. 2杭体キット
本発明はまた、上記 2節の III群に記載される抗体、その断片又はその化学修飾誘 導体、上記 3. 3節に記載される抗体、その断片又はその化学修飾誘導体のうち 1つ 又は複数を含む食道ガンの存在又は転移をインビトロで検出、判定又は予測するた めのキットを提供する。
[0386] 本発明のキットには、以下に記載するような III群 (k)、(1)及び (m)からの抗体、そ の断片又はその化学修飾誘導体プローブを含有させることができる。これらのプロ一 ブの各々は単独で又は組み合わせて適当な容器に収納されうる。
[0387] プローブの組み合わせの例は以下のとおりである。
[0388] 第 1の例は、食道ガン転移マーカーとしての、上記 AXL、 C6orf54、 ZBTB11、 T NFRSF14、 NSUN5、 SPEN、 LTBP3、 SYNGR1、 ARL3、 SLC13A1、 RALG DS、 ADD3、 MAP3K12、 AVPI1、 GIMAP6、 FLJ11259、 C3AR1、 PCGF2、 PDE6Dゝ PLCG2、 GPR148、 ARF6、 NISCH、 GLYAT、 IGHM、 FBX038、 S LC12A1、 PGDS、 CD48、 IMPA2、 HSPA6、 EIF3S9、 ZNF659、 RAB6C、 N OLl、 DAB2、 EBI3、 PRSS3、 GLB1、 SAMSN1、 AQP3、 CAPZA2、 B4GAL T2、 ARHGEF3、 POGK、 PRAF1および HPGD遺伝子によってコードされるポリ
ペプチド、それらの同族体、あるいはそれらの変異体又は誘導体を検出するために、 これらのポリペプチド、その変異体又はその断片に対する抗体を 1又は複数組み合 わせて含む。これらのプローブは、食道ガンの存在及び/又は転移の検出、判定又 は予測のために使用しうる。特に、転移の予測は、食道ガン患者の術後予後の予測 に導くことができる。
[0389] 具体的には、キットに含まれるプローブは、配列番号 95〜140で表されるアミノ酸 配列を有するポリペプチド、それらの変異体、或いはそれらの断片の少なくとも 1つと 特異的に結合する 1または複数の抗体、その断片、またはそれらの化学修飾誘導体 である。
[0390] このキットには、さらに配列番号 141で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに 対する抗体、その断片またはそれらの化学修飾誘導体を含ませることができる。併用 により、転移の予測又は術後予後の予測のための精度を高めることができる。
[0391] 第 2の例は、食道ガンマーカーとしての、上記 GALNS, fgf3, CAMK2B, CaM KIINalpha, PSARL, XRCC3, CAPG, GRHPR, TROAP, RRM2, SATB2, C14orfl62, SEPT6, M6PR, SPRR3, EML1, YPEL5, EIF4EBP2, SLC2A 14及び SLIT2遺伝子によってコードされるポリペプチド、それらの同族体、あるいは それらの変異体又は誘導体を検出するために、これらのポリペプチド、その変異体又 はその断片に対する抗体を 1又は複数組み合わせて含む。これらのプローブは、食 道ガンの存在の検出、判定又は予測のために使用しうる。
[0392] 具体的には、キットに含まれるプローブは、配列番号 182〜195、 197〜201で表 されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、それらの変異体、或いはそれらの断片の少 なくとも 1つと特異的に結合する 1または複数の抗体、その断片又はそれらの化学修 飾誘導体である。
[0393] このキットにはさらに、配列番号 196で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに 対する抗体、その断片又はそれらの化学修飾誘導体を含ませることができる。
[0394] 第 3の例は、配列番号 202〜232で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そ れらの変異体、或 、はそれらの断片の少なくとも 1つと特異的に結合する 1または複 数の抗体、その断片又はその化学修飾誘導体である。
[0395] このキットにはさらに、配列番号 233で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに 対する抗体、その断片又はそれらの化学修飾誘導体を含ませることができる。
[0396] 本発明のキットに含まれる抗体は、個別にまたは混合物の形態で存在し得るし、あ るいは固相担体に結合されて 、てもよ 、しまたは遊離の形態でもよ 、。さらに本発明 のキットは、標識二次抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停 止液、精製された標準物質としてのマーカー (標的)ポリペプチド、使用説明書、等を 含むことができる。
5. DNAチップ
本発明はさらに、上記の 3節及び/又は 4節に記載されるような、本発明の組成物及 び/又はキットに含まれるものと同じポリヌクレオチド、変異体又は断片を単独で又は 組み合わせて、好ましくは組み合わせて、食道ガンの存在又は転移をインビトロで検 出、判定又は予測するための DNAチップを提供する。
[0397] DNAチップの基板としては、 DNAを固相化できるものであれば特に制限はなぐ スライドガラス、シリコン製チップ、ポリマー製チップ及びナイロンメンブレンなどを例 示することができる。またこれらの基板にはポリ Lリジンコートゃァミノ基、カルボキシル 基などの官能基導入などの表面処理がされて 、てもよ 、。
[0398] また固相化法については一般に用いられる方法であれば特に制限はなぐスポッタ 一又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いて DNAをスポットする方法や、ノ ズルより微少な液滴を圧電素子などにより噴射する装置 (インクジェット)を用いて DN Aを基板に吹き付ける方法、又は基板上で順次ヌクレオチド合成を行う方法を例示 することができる。高密度分注機を用いる場合には、例えば多数のゥエルを持つプレ ートのおのおののゥエルに異なった遺伝子溶液を入れておき、この溶液をピン (針) で取り上げて基板上に順番にスポットすることによる。インクジェット法では、ノズルより 遺伝子を噴射し,基板上に高速度で遺伝子を整列配置することによる。基板上での DNA合成は、基板上に結合した塩基を光によって脱離する官能基で保護し、マスク を用いることにより特定部位の塩基だけに光を当て、官能基を脱離させる。その後、 塩基を反応液に加えて、基板上の塩基とカップリングさせる工程を繰り返すことによつ て行われる。
[0399] 固相化されるポリヌクレオチドは、上記で説明した本発明のポリヌクレオチドである。
[0400] 例えば、そのようなポリヌクレオチドは、以下の 1又は複数のポリヌクレオチド又はそ の断片を含むことができる。
(1)配列番号 1〜46、 47で表される塩基配列力 なるポリヌクレオチド群、それらの 変異体、または 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(2)配列番号 1〜46、 47で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
(3)配列番号 1〜46で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異 体、または 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(4)配列番号 1〜46で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群、それらの変異体 、または 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(5)配列番号 1〜46で表される塩基配列に相補的な塩基配列力 なるポリヌクレオ チド群、それらの変異体、または 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(6)配列番号 1〜46で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチ ド群。
(7)配列番号 1〜46で表される塩基配列の各々と相補的な塩基配列力 なる DNA とストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド群、または 15以上の連 続した塩基を含むそれらの断片。
(8)配列番号 1〜46で表される塩基配列の各々力 なる DNAとストリンジ ントな条 件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド群、または 15以上の連続した塩基を含むそ れらの断片。
(9)配列番号 47で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、または 1 5以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(10)配列番号 47で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、その変異体、または 1 5以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
( 11 )配列番号 47で表される塩基配列に相補的な塩基配列力 なるポリヌクレオチド 、その変異体、または 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(12)配列番号 47で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド 群。
( 13)配列番号 47で表される塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジ ェントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、または 15以上の連続した塩基を 含むそれらの断片。
(14)配列番号 47で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でハイブ リダィズするポリヌクレオチド、または 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(15)配列番号 1〜46で表される塩基配列またはその相補的配列の各々において、 1 5以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(16)配列番号 1〜46で表される塩基配列またはその相補的配列の各々において、 6 0以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(17)配列番号 47で表される塩基配列またはその相補的配列にぉ 、て、 15以上の連 続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(18)配列番号 47で表される塩基配列またはその相補的配列にぉ 、て、 60以上の連 続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(19)配列番号 1〜46で表される塩基配列にお!、て、それぞれ配列番号 48〜93で表 される塩基配列を含み、かつ 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(20)配列番号 1〜46で表される塩基配列に相補的な配列において、それぞれ配列 番号 48〜93で表される塩基配列に相補的な配列を含み、かつ 60以上の連続した 塩基を含むポリヌクレオチド。
(21)配列番号 47で表される塩基配列にぉ 、て、それぞれ配列番号 94で表される塩 基配列を含み、かつ 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(22)配列番号 47で表される塩基配列に相補的な配列において、それぞれ配列番号 94で表される塩基配列に相補的な配列を含み、かつ 60以上の連続した塩基を含む ポリヌクレオチド。
[0401] 好ま 、実施形態によれば、本発明の DNAチップは、配列番号 48〜94で表され る塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの 2以上力 全部を含むこと ができる。
[0402] さらに別の例において、 DNAチップに結合しうるポリヌクレオチドは、以下の 1又は 複数のポリヌクレオチド又はその断片を含むことができる。
[0403] (1)配列番号 142〜161で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチド群、それらの 変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0404] (2)配列番号 142〜161で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
[0405] (3)配列番号 142〜155で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチド群、それらの 変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0406] (4)配列番号 142〜 155で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群、それらの 変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0407] (5)配列番号 142〜 155で表される塩基配列に相補的な塩基配列力もなるポリヌク レオチド群、それらの変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0408] (6)配列番号 142〜 155で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌク レオチド群。
[0409] (7)配列番号 142〜 155で表される塩基配列の各々と相補的な塩基配列からなる
DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド群、又は 15以上 の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0410] (8)配列番号 142〜 155で表される塩基配列の各々力もなる DNAとストリンジ ン トな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド群、又は 15以上の連続した塩基を含 むそれらの断片。
[0411] (9)配列番号 157〜161で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチド群、それらの 変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0412] (10)配列番号 157〜161で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群、それらの 変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0413] (11)配列番号 157〜 161で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌ クレオチド群、それらの変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0414] ( 12)配列番号 157〜 161で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌク レオチド群。
[0415] (13)配列番号 157〜161で表される塩基配列の各々と相補的な塩基配列からな る DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド群、又は 15以上 の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0416] (14)配列番号 157〜161で表される塩基配列の各々力もなる DNAとストリンジ ントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド群、又は 15以上の連続した塩基を含 むそれらの断片。
[0417] (15)配列番号 142〜155で表される塩基配列又はその相補的配列の各々におい て、 15以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0418] (16)配列番号 142〜155で表される塩基配列又はその相補的配列の各々におい て、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0419] (17)配列番号 157〜161で表される塩基配列又はその相補的配列の各々におい て、 15以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0420] (18)配列番号 157〜161で表される塩基配列又はその相補的配列の各々におい て、 60以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0421] (19)配列番号 142〜155で表される塩基配列において、 60以上の連続した塩基 を含むポリヌクレオチド中にそれぞれ配列番号 162〜 175で表される塩基配列を含 むポリヌクレオチド。
[0422] (20)配列番号 142〜 155で表される塩基配列に相補的な配列において、 60以上 の連続した塩基を含むポリヌクレオチド中にそれぞれ配列番号 162〜 175で表され る塩基配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド。
[0423] (21)配列番号 157〜161で表される塩基配列において、 60以上の連続した塩基 を含むポリヌクレオチド中にそれぞれ配列番号 177〜 181で表される塩基配列を含 むポリヌクレオチド。
[0424] (22)配列番号 157〜161で表される塩基配列に相補的な配列において、 60以上 の連続した塩基を含むポリヌクレオチド中にそれぞれ配列番号 177〜181で表され る塩基配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド。
[0425] (23)配列番号 156で表される塩基配列力 なるポリヌクレオチド、その変異体、又 は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0426] (24)配列番号 156で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、その変異体、又は
15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0427] (25)配列番号 156で表される塩基配列に相補的な塩基配列力 なるポリヌクレオ
チド、その変異体、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0428] (26)配列番号 156で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチ ド、。
[0429] (27)配列番号 156で表される塩基配列に相補的な塩基配列力もなる DNAとストリ ンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、又は 15以上の連続した塩基 を含むそれらの断片。
[0430] (28)配列番号 156で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジ ントな条件でハ イブリダィズするポリヌクレオチド、又は 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0431] (29)配列番号 156で表される塩基配列又はその相補的配列において、 15以上の 連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0432] (30)配列番号 156で表される塩基配列又はその相補的配列において、 60以上の 連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
[0433] (31)配列番号 156で表される塩基配列において、 60以上の連続した塩基を含む ポリヌクレオチド中に配列番号 176で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
[0434] (32)配列番号 156で表される塩基配列に相補的な配列にぉ 、て、 60以上の連続 した塩基を含むポリヌクレオチド中に配列番号 176で表される塩基配列に相補的な 配列を含むポリヌクレオチド。
[0435] 好ましい実施形態によれば、本発明の DNAチップは、配列番号 162〜181で表さ れる塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの 2以上〜全部を含むこと ができる。
[0436] 本発明にお 、て、固相化されるポリヌクレオチドは、ゲノム DNA、 cDNA、 RNA (例 えば mRNA、 cRNA、 aRNA)、合成 DNA、合成 RNAのいずれでもよいし、あるい は一本鎖でもよ 、し又は二本鎖でもよ 、。
[0437] 標的遺伝子、 RNA又は cDNAの発現レベルを検出、測定することができる DNA チップの例としては、 Affymetrix社の Gene Chip Human Genome U133 Plus 2. 0 Array ^ Agilent社の Whole human genome oligo microarray、タカフノィ ォ社の IntelliGene(R) HS Human Expression CHIP,凹凸構造を持つポリメチ ルメタタリレート製 DNAチップ基板 (日本国特開 2004— 264289)などを挙げること
ができる。
[0438] DNAマイクロアレイの作製について、例えば予め調製したプローブを固相表面に 固定ィ匕する方法を使用することができる。予め調製したポリヌクレオチドプローブを固 相表面に固定ィ匕する方法では、官能基を導入したポリヌクレオチドを合成し、表面処 理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを点着し、共有結合 させる(例えば、 J. B. Lamtureら、 Nucleic. Acids. Research, 1994年、第 22卷 、 p. 2121— 2125、 Z. Guoら、 Nucleic. Acids. Research, 1994年、第 22卷、 p . 5456— 5465)。ポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスぺ ーサ-やクロスリンカ一を介して共有結合される。ガラス表面にポリアクリルアミドゲル の微小片を整列させ、そこに合成ポリヌクレオチドを共有結合させる方法も知られて いる ( Yersnovb、 Proceedings of the J ational Academic sciences u . S . A.、 1996年、第 94卷、 p. 4913)。また、シリカマイクロアレイ上に微 /J、電極のァレ ィを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むァガロースの浸透層を設けて反応 部位とし、この部位をプラスに荷電させることでピオチンィ匕ポリクレオチドを固定し、部 位の荷電を制御することで、高速で厳密なノ、イブリダィゼーシヨンを可能にする方法 も知られている (R. G. Sosnowskiら、 Proceedings of the National Academic Sciences U. S. A.、 1997年、第 94卷、 p. 1119—1123)。
6.食道ガンの存 は転移の檢出、半 II定 は予沏 I法
本発明は、被験者由来の生体試料中の 1又は複数の食道ガン関連標的核酸の存 在又は存在量若しくは発現量を、上で定義した I群、 II群及び/又は III群から選択さ れる 1又は複数のプローブ、或いは本発明の組成物、キット、 DNAチップ又はそれら の組み合わせを用いて測定することを含む、食道ガンの存在及び/又は転移をインビ トロで検出、判定又は予測する方法を提供する。
[0439] 上記 I群のポリヌクレオチド、並びに III群 (k)の抗体、その断片又はその化学修飾 誘導体は、食道ガンの存在及び/又は転移の検出、判定又は予測のために使用す ることがでさる。
[0440] 上記 II群のポリヌクレオチド、並びに III群 (1)、 (m)の抗体、その断片又はその化学 修飾誘導体は、食道ガンの存在の検出、判定又は予測のために使用することができ
る。
[0441] 本発明の方法においては、食道ガンの存在又は転移の検出、判定又は予測は、 対照試料からの変化を指標にして決定することができる。
[0442] 例えば、被験者由来の生体試料中に食道ガン細胞又は転移性食道ガン細胞が含 まれるかどうかをインビトロで判定するために、それぞれ正常もしくは非ガンの食道組 織又は術後転移がな力つた患者由来の食道ガン組織に対して、生体試料中の細胞 の標的核酸の発現量が変化 (すなわち、増加又は低下)している場合、生体試料中 に食道ガン細胞又は転移性食道ガン細胞が存在すると判定することができる。
[0443] 本発明はまた、上で定義した I群、 II群及び/又は III群から選択される 1又は複数の プローブの、或いは本発明の組成物、キット又は DNAチップの、被験者由来の生体 試料中の食道ガンの存在又は転移をインビトロで検出、判定又は予測するための使 用方法も提供する。
[0444] 本発明の食道ガンの存在又は転移の検出、判定、予測又は(遺伝子)診断にお!ヽ て、本発明の組成物、キット又は DNAチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異 体又はその断片からなる食道ガン診断用プローブは、プライマーとして又は検出プロ ーブ (探索子)として用いることができる。プライマーとして用いる場合には、通常 15 〜50塩基、好ましくは 15〜30塩基、より好ましくは 18〜25塩基の塩基長を有するも のが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、例えば 15塩基〜全配列 の塩基数、好ましくは 25〜: LOOO塩基、より好ましくは 25〜: LOO塩基の塩基長を有す るものが例示できる力 この範囲に限定されない。
[0445] 本発明の組成物又はキットに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片 は、ノーザンブロット法、サザンブロット法、 RT—PCR法、 in situハイブリダィゼー シヨン法、サザンハイブリダィゼーシヨン法などの、特定遺伝子を特異的に検出する 公知の方法において、定法に従ってプライマー又はプローブとして利用することがで きる。測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の食道組 織又は食道ガン細胞の存在が疑われる生体組織の一部又は全部をバイオプシーな どで採取する力 もしくは手術によって摘出した生体組織から回収する。さらにそこか ら常法に従って調製した total RNAを用いてもよいし、さらに該 RN Aをもとにして調
製される、 cDNA、ポリ A ( + )RNAを含む各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
[0446] あるいは、生体組織における本発明の遺伝子、 RNA、 cDNAなどの核酸の発現量 は、 DNAチップ(DNAマクロアレイを含む)を用いて検出ある!/、は定量することがで きる。この場合、本発明の組成物又はキットは DNAアレイのプローブとして使用する ことができる(例えば、ァフィメトリックス社の Human Genome U133 Plus 2. 0 Arrayでは 25塩基の長さのポリヌクレオチドプローブが用いられる)。かかる DNAァ レイを生体組織力ゝら採取した RNAをもとに調製される標識 DNA又は RNAとハイプリ ダイズさせ、該ハイブリダィズによって形成された上記プローブと標識 DNA又は RN Aとの複合体を、該標識 DNA又は RNAの標識を指標として検出することにより、生 体組織中での食道ガン関連遺伝子又は食道ガン転移関連遺伝子の発現の有無又 は発現レベル (発現量)を評価することができる。本発明の方法では、 DNAチップを 好ましく使用できる力 これは、ひとつの生体試料について同時に複数遺伝子の発 現の有無又は発現レベルの評価が可能である。
[0447] 本発明の組成物、キット又は DNAチップは、食道ガンの存在又は転移の診断、す なわち検出、判定又は予測(例えば、罹患の有無や罹患の程度の診断)、のために 有用である。具体的には、該組成物、キット又は DNAチップを使用した食道ガンの 存在又は転移の診断は、被験者の食道ガン細胞の存在する生体組織と、手術時にリ ンパ節転移がなカゝつた患者由来の食道ガン組織及び Z又は手術時にリンパ節転移 があった患者由来の食道ガン組織との比較、或いは手術時にリンパ節転移がなかつ た患者及び Z又は手術時にリンパ節転移があった患者由来の生体組織との比較を 行い、該診断用組成物で検出される遺伝子の発現レベルの違い(又は、差)を判定 することによって行うことができる。この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現の 有無だけではなぐ食道ガン細胞の存在する生体組織と正常組織の両者、或いは転 移性食道ガン細胞の存在する生体組織と非転移性食道ガン細胞の存在する生体組 織の両者、ともに発現がある場合でも、両者間の発現量を比較した時の差が検定上 有意 (P値く 0. 05)である場合が含まれる。例えば SPRR3遺伝子は食道ガンで発 現の誘導 Z減少を示すので、被験者の食道ガン組織では発現 Z減少しており、該 発現量と正常組織の発現量と比べて検定を行った時に、その差が有意であれば、被
験者について食道ガンの罹患が疑われる。また、例えば HPGD遺伝子は転移性食 道ガンで発現誘導 Z減少を示すので、被験者の食道ガン組織では発現 Z減少して おり、該発現量と非転移性食道ガン細胞の存在する生体組織の発現量と比べて検 定を行った時に、その差が有意であれば、被験者について食道ガンの転移が疑われ る。
[0448] 本発明の組成物、キット又は DNAチップを利用した食道ガン (細胞)又は転移性食 道ガン (細胞)の検出方法は、被験者の生体組織の一部又は全部をバイオプシーな どで採取するカゝ、もしくは手術によって摘出した生体組織から回収し、そこに含まれる 遺伝子を、本発明のポリヌクレオチドプローブ群カゝら選ばれた単数又は複数のポリヌ クレオチド、その変異体又はその断片を用いて検出し、その遺伝子発現量を測定す ることにより、食道ガンの罹患の有無又はその程度、或いは食道ガンの転移の有無 又はその程度、を診断することを含む。また本発明の食道ガン又は食道ガン転移の 検出方法は、例えば食道ガン患者において、該疾患の改善のために治療薬を投与 した場合における該疾患の改善の有無又はその程度を検出、判定又は予測すること ちでさる。
[0449] 本発明の方法は、例えば以下の(a)、(b)及び (c)の工程:
(a)被験者由来の生体試料を、本発明の組成物、キット又は DNAチップのポリヌクレ ォチドと接触させる工程、
(b)生体試料中の標的核酸の発現レベルを、上記ポリヌクレオチドをプローブとして 用いて測定する工程、
(c) (b)の結果をもとに、該生体試料中の食道ガン (細胞)又は転移性食道ガン (細 胞)の存在又は不存在を判定する工程、
を含むことができる。
[0450] 本発明方法で用いられる生体試料としては、被験者の生体組織、例えば食道組織 及びその周辺組織、食道ガンの転移が疑われる組織など、カゝら調製される試料を挙 げることができる。具体的には該組織力ゝら調製される RNA含有試料、或いはそれか らさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料は、被験者の生体組織の一部又は全 部をバイオプシーなどで採取する力 もしくは手術によって摘出した生体組織から回
収し、そこから常法に従って調製することができる。
[0451] ここで被験者とは、哺乳動物、例えば非限定的にヒト、サル、マウス、ラットなどを指 し、好ましくはヒトである。
[0452] 本発明の方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて工程を変更する ことができる。
[0453] 例えば、測定対象物として RNAを利用する場合、食道ガン (細胞)又は転移性食 道ガン (細胞)の検出は、例えば下記の工程 (a)、(b)及び (c):
(a)被験者の生体試料カゝら調製された RNA又はそれから転写された相補的ポリヌク レオチド(cDNA)を、本発明の糸且成物、キット又は DNAチップのポリヌクレオチドと 結合させる工程、
(b)該ポリヌクレオチドに結合した生体試料由来の RNA又は該 RNAから転写され た相補的ポリヌクレオチドを、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定する 工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づ!、て、食道ガン (細胞)又は転移性食道ガン (細胞) の存在又は不存在を判定する工程、
を含むことができる。
[0454] 本発明によって食道ガン (細胞)又は転移性食道ガン (細胞)を検出、判定又は診 断するために、例えば種々のハイブリダィゼーシヨン法を使用することができる。かよ うなハイブリダィゼーシヨン法には、例えばノーザンブロット法、サザンブロット法、 RT — PCR法、 DNAチップ解析法、 in situノヽイブリダィゼーシヨン法、サザンハイブリダ ィゼーシヨン法などを使用することができる。
[0455] ノーザンプロット法を利用する場合は、本発明の組成物をプローブとして用いること によって、 RNA中の各遺伝子発現の有無やその発現レベルを検出、測定することが できる。具体的には、本発明の診断用組成物湘補鎖)を放射性同位元素 (32P、 33P 、 35sなど)や蛍光物質などで標識し、それを常法にしたがってナイロンメンブレンなど にトランスファーした被検者の生体組織由来の RNAとハイブリダィズさせたのち、形 成された診断用組成物(DNA)と RNAとの二重鎖を診断用組成物の標識物 (放射 性同位元素又は蛍光物質)に由来するシグナルを放射線検出器 (BAS-1800II、富
士写真フィルム株式会社、などを例示できる)又は蛍光検出器 (例えば、 STORM86 0、 Amersham Bioscience社など)で検出、測定する方法を例示することができる。
[0456] 定量 RT— PCR法を利用する場合には、本発明の上記診断用組成物をプライマー として用いることによって、 RNA中の遺伝子発現の有無やその発現レベルを検出、 測定することができる。具体的には、被検者の生体組織由来の RNAから常法にした 力 て cDNAを調製して、これを铸型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるよう に、本発明の組成物力 調製した 1対のプライマー(上記 cDNAに結合する正鎖と逆 鎖力もなる)を cDNAとハイブリダィズさせて常法により PCR法を行い、得られた二本 鎖 DNAを検出する方法を例示することができる。なお、二本鎖 DNAの検出法として は、上記 PCRをあら力じめ放射性同位元素又は蛍光物質で標識してぉ 、たプライマ 一を用いて行う方法、 PCR産物をァガロースゲルで電気泳動し、ェチジゥムブ口マイ ドなどで二本鎖 DNAを染色して検出する方法、産生された二本鎖 DNAを常法にし たがってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせて標識した診断用組成物をプロ ーブとしてこれとハイブリダィズさせて検出することを含む方法をとることができる。
[0457] DNAアレイ解析を利用する場合は、本発明の上記診断用組成物を DNAプローブ
(一本鎖又は二本鎖)として基板に貼り付けた DNAチップを用いる。遺伝子群を基 板に固相化したものには、一般に DNAチップ及び DNAアレイという名称があり、 D NAアレイには DNAマクロアレイと DNAマイクロアレイが包含される力 本明細書で は DNAチップと!/、つた場合、該 DN Aアレイを含むものとする。
[0458] ハイブリダィゼーシヨン条件は、限定されな!、が、例えば 30°C〜50°Cで、 3〜4 X S SC、 0. 1〜0. 5% SDS中で 1〜24時間のハイブリダィゼーシヨン、より好ましくは 4 0°C〜45°Cで、 3. 4 X SSC、 0. 3%SDS中で 1〜24時間のハイブリダィゼーシヨン 、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、 2 33じと0. 1%SDSを 含む溶液、及び 1 X SSC溶液、 0. 2 X SSC溶液による室温での連続した洗浄などの 条件を挙げることができる。ここで、 1 X SSCは、 150mM塩化ナトリウムおよび 15m Mクェン酸ナトリウムを含む水溶液 (pH7. 2)である。相補鎖は力かる条件で洗浄し ても対象とする正鎖とハイブリダィズ状態を維持するものであることが望まし、。具体 的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にあ
る塩基配列力もなる鎖、並びに該鎖と少なくとも 80%、少なくとも 85%、少なくとも 90 %、少なくとも 95%、少なくとも 98%の同一性を有する塩基配列力もなる鎖を例示す ることがでさる。
[0459] 本発明の組成物又はキットからのポリヌクレオチド断片をプライマーとして PCRを実 施する際のストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件の例としては、例えば 10m MTris-HCL (pH8. 3)、 50mMKCL、 l〜2mM MgClなどの組成の PCRバッ
2
ファーを用い、当該プライマーの配列から計算された Tm+ 5〜10°Cにおいて 15秒 力 1分程度処理することなどが挙げられる。力かる Tmの計算方法として Tm= 2 X ( アデニン残基数 +チミン残基数) +4 X (グァニン残基数 +シトシン残基数)などが挙げら れる。
[0460] これらのハイブリダィゼーシヨンにおける「ストリンジェントな条件」の他の例について は、例えば Sambrook, J. & Russel, D. 著、 Molecular Cloning, A LABOR ATORY MANUALゝ Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001年 1月 15 日発行、の第 1卷 7. 42〜7. 45、第 2卷 8. 9〜8. 17などに記載されており、本発明 において利用できる。
[0461] 本発明はまた、上記 I群、 II群及び/又は III群の 1又は複数のプローブ、或いは本 発明の組成物、キット、 DNAチップ又はそれらの組み合わせ、を用いて、被験者由 来の生体試料中の標的核酸又は遺伝子の発現量を測定し、食道ガン組織と正常組 織、或いは転移性食道ガン組織と非転移性食道ガン組織、の遺伝子発現量を教師( 訓練サンプル)としたサポートベクターマシーン (SVM)を判別式として、生体試料中 に食道ガン細胞或いは転移性食道ガン細胞が含まれな 、こと及び Z又は含まれるこ とを判定する方法を提供する。
[0462] すなわち、本発明はさらに、上に定義された I群力 選択されるプローブ、或いは、 該プローブを含む、本発明の組成物、キット又は DNAチップを用いて、転移を伴う食 道ガン又は転移を伴わない食道ガン細胞を含む組織であることが既知の複数の生 体試料中の食道ガン関連標的核酸の発現量をインビトロで測定する第 1の工程、該 第 1の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を教師とした判別式 (サポート ベクターマシーン)を作成する第 2の工程、被験者の食道由来の生体試料中の該標
的核酸の発現量を第 1の工程と同様にインビトロで測定する第 3の工程、該第 2のェ 程で得られた判別式に第 3の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を代入 し、該判別式力 得られた結果に基づいて、生体試料中に転移を伴うガン細胞が含 まれな 、こと及び/又は転移を伴わな 、ガン細胞が含まれることを判定する第 4のェ 程を含む、食道ガンの転移を検出、判定又は予測する方法を提供する。
[0463] 本発明はまた、上に定義される II群力 選択されるプローブ、或いは、該プローブを 含む、本発明の組成物、キット又は DNAチップを用いて、食道ガン細胞を含む組織 又は正常組織であることが既知の複数の生体試料中の標的核酸の発現量をインビト 口で測定する第 1の工程、該第 1の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を 教師とした判別式 (サポートベクターマシーン)を作成する第 2の工程、被験者の食道 由来の生体試料中の該標的核酸の発現量を第 1の工程と同様にインビトロで測定す る第 3の工程、該第 2の工程で得られた判別式に第 3の工程で得られた該標的酢酸 の発現量の測定値を代入し、該判別式力 得られた結果に基づいて、生体試料中 にガン細胞が含まれること又はガン細胞が含まれないことを判定する第 4の工程を含 む、食道ガンを検出する方法を提供する。
[0464] 或いは、本発明の方法は、例えば下記の工程 (a)、(b)及び (c):
(a)食道ガン細胞を含む組織又は正常組織であることが既知の生体試料、或!、は転 移がある患者由来の食道ガン細胞を含む組織又は転移がない患者由来の食道ガン 細胞組織であることが既知の生体試料、中の標的遺伝子の発現量を、本発明による 組成物、キット又は DNAチップを用いて測定する工程、
(b) (a)で測定された発現量の測定値を、下記の数 1〜数 5の式に代入して、 SVMと 呼ばれる判別式を作成する工程、
(c)被験者由来の生体試料中の該標的遺伝子の発現量を、本発明の組成物、キット 又は DNAチップを用いて測定し、(b)で作成した判別式にそれらを代入して、得ら れた結果に基づ!/、て該生体試料中に食道ガン細胞又は転移性食道ガン細胞が含ま れるかどうかを判定する工程、
を含むことができる。
[0465] SVMとは 2クラスの分類問題を解くためにつくられた 1995年に AT&Tの V. Vapn
ik (The Nature of Statistical Leaning Theory ^ Springer ^ 1995年発行) によって統計的学習理論の枠組みで提案された学習機械である。 SVMは線形の識 別器である力 後述するカーネルを組み合わせることによって非線形問題を扱うこと ができる。異なるクラスの訓練サンプルについて、それらを識別する多数の超平面の うち、その超平面と訓練サンプルとの最小距離が最大となる超平面を識別面とするこ とにより、新たに与えられるテストサンプルがどのクラスに属するかを最も正確に識別 することができる。
[0466] SVMでは線形問題のみしか扱うことができな 、が、本質的に非線形な問題に対応 するための方法として、特徴ベクトルを高次元へ非線形変換し、その空間で線形の 識別を行う方法が知られている。こうすれば、元の空間で非線形モデルを用いている のと等価となる。し力 高次元への写像を行うと膨大な計算量が必要となり、汎化能 力も減少する。 SVMでは識別関数が入力パターンの内積のみに依存した形になつ ており、内積が計算できれば最適な識別関数を構成することが可能である。非線形 に写像した空間での二つの要素の内積がそれぞれのもとの空間での入力のみで表 現されるような式のことをカーネルと呼び、高次元に写像しながら、実際には写像され た空間での特徴の計算を避けてカーネルの計算のみで最適な識別関数、すなわち 判別式を構成することができる(例えば、麻生英榭ら著、統計科学のフロンティア 6「 パターン認識と学習の統計学 新しい概念と手法」、岩波書店、東京、日本 (2004年 ) )。
[0467] 本発明の方法で使用可能な判別式の算出例を以下に示す。
SVMを決めるためには食道ガン細胞を含む組織または正常組織であることが既知 の生体試料中の標的遺伝子の発現量を教師(訓練サンプル)として用意し、以下の 手順によって識別関数の定数を決定することができる。
訓練サンプル Xは( + 1、—1)でクラス分けされる、食道ガン細胞を含む組織群、また は正常組織群のいずれかに属しているとする。これらの訓練サンプルが超平面によ つて線形分離できるとき、識別関数は例えば次式となる。
[0468] [数 1]
(ここで、 Wは重み係数、 bはバイアス定数、 Xはサンプルの変数を表す。 ) ただし、この関数には制約条件:
[0469] [数 2] ( ÷ )≥1-ξ!
(ここで、 Τは内積、 yはサンプルのクラス、 ζはスラック変数を表す。 )
があるため、 Lagurangeの未定乗数法を用いることにより Lagurange乗数 αを用い た以下の最適化問題に帰着する。
[0471] [数 4]
Q≤ai < C,fjaiyi =Q
!=λ
(ここで、 Cは実験により決定される制限条件パラメーターを表す。 )
この問題を解くと最終的に、
[0472] [数 5]
が得られ、識別関数を一義的に得ることができる。この関数に新たに与えられる生体 試料 (食道ガン細胞を含む力^うか不明である組織の発現遺伝子量)につ 、ての Xを 代入することによって、 f(x)をクラス分け (すなわち、 +1又は一 1)することができ、生
体試料がどちらのクラス (すなわち、食道ガン細胞を含む組織群又は正常組織、或い は転移がある患者由来の食道ガン細胞を含む組織群又は転移がない患者由来の食 道ガン組織)に属するかを識別する。
[0473] 以上に示すように、未知試料のクラス分けを行うための SVMによる判定式の作成 には 2群の教師(訓練サンプル)が必要となる。この訓練サンプルは例えば本発明の 場合、「転移のある食道ガン患者の食道ガン組織から得られた発現遺伝子 (遺伝子
X , X . . . X , . . . X;)」の各患者に対応したセット、および「転移のない食道ガン患 者の食道ガン組織から得られた発現遺伝子 (遺伝子 X , X , . . X , . . . X )」の各 患者に対応したセット、の 2群である。これらのセットについてそれぞれ測定される発 現遺伝子数 (n)は実験のデザインによって様々ではある力 個々の遺伝子について は、どのような実験においても 2群間で大きく差がある場合と、比較的差が少ない、あ るいは差がない場合が観察される。 SVMによる判別式の精度を上げるためには、訓 練サンプルとなる 2群に、明確な差があることが条件となるため、遺伝子セットの中か ら 2群間で発現量に差がある遺伝子のみを抽出して利用することが必要である。
[0474] このように、 2群間で差がある遺伝子を抽出する方法としては、平均値の差を検出 するパラメトリック解析である t—検定、ノンパラメトリック解析である Mann— Whitney の U検定などを利用できる
本発明の方法において、例えば、上に記載したような配列番号 1〜46、 47に基づく 1又は複数の上記ポリヌクレオチド、並びに/或いは、上に記載したような 1〜46、 47 に基づく 1又は複数のポリヌクレオチド、力 の任意の組み合わせを用いて、かつ上 記の 47種の標的遺伝子の発現量がすべて有意に転移がある患者由来の食道ガン 組織と転移がな 、患者由来の食道ガン組織間で異なり、転移がある患者由来の食 道ガン組織にぉ 、て発現が増加 Z減少して 、ることを指標にして、これら 47種の遺 伝子について発現量を測定することにより、食道ガンの転移を 70%以上、 80%以上 、好ましくは 84%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 86%以上の確率 で見分けることができる(図 1)。
[0475] さらにまた、例えば、上に記載したような配列番号 142〜156及び 162〜176に基 づく 1又は複数の上記ポリヌクレオチド、並びに/或いは、上に記載したような配列番
号 157〜 161及び 177〜 181に基づく 1又は複数のポリヌクレオチド、からの任意の 組み合わせを用いて、かつ上記の 20種の標的遺伝子の発現量がすべて有意に食 道ガン組織と非ガン組織間で異なり食道ガン組織にぉ 、て発現が減少して 、ること を指標にして、これら 20種の遺伝子について発現量を測定することにより、食道ガン 組織を 89%以上、 90%以上、好ましくは 92%以上、より好ましくは 93%以上、さらに 好ましくは 94%以上の確率で見分けることができる(図 4)。
[0476] 本発明はさらに、上記 47種の遺伝子 (例えば、配列番号 1〜47に相当する)又は その断片(例えば、配列番号 48〜94に相当する)によってコードされるポリペプチド 、例えば配列番号 95〜141で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、に対する 1 又は複数の抗体又はその断片を用いて、転移がある患者由来の食道ガン組織と転 移がな!、患者由来の食道ガン組織間での該ポリペプチドの発現量、或いは血液中 の該ポリペプチドのレベル (又は存在量)、をインビトロで測定することを含む、食道ガ ンの転移を検出、判定又は予測する方法を提供する。
[0477] 本発明はまた、上記 20種の遺伝子 (例えば、配列番号 142〜161に相当する)又 はその断片(例えば、配列番号 162〜181に相当する)によってコードされるポリぺプ チド、例えば配列番号 182〜201で表されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド、に対 する 1又は複数の抗体又はその断片を用いて、食道ガン組織と非ガン組織間での該 ポリペプチドの発現量、或いは血液中の該ポリペプチドのレベル (又は存在量)、をィ ンビトロで測定することを含む、食道ガンの検出、判定又は予測する方法を提供する
[0478] 具体的には、上記の測定は、免疫学的方法によって行うことができる。
[0479] 免疫学的測定法として例えば、酵素免疫測定法 (ELISA、 EIA)、蛍光免疫測定 法、放射免疫測定法 (RIA)、発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラ テックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応またはウェスタンプロット法が挙げ られる。
[0480] 上記の方法において、標識を用いた免疫測定法により実施する場合には、本発明 の抗体を固相化するか、または試料中の成分を固相化して、それらの免疫学的反応 を行うことができる。
[0481] 固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビュルトルエン、ポリプロピ レン、ポリエチレン、ポリ塩化ビュル、ナイロン、ポリメタタリレート、ラテックス、ゼラチン 、ァガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックスまたは磁性体等の 材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティックまたは試験片等の形状の不 溶性担体を用いることができる。
[0482] 固相化は、固相担体と本発明の抗体または試料成分とを物理的吸着法、化学的結 合法またはこれらの併用等の公知の方法に従って結合させることにより行うことができ る。
[0483] さらにまた、本発明においては、本発明の抗体と、試料中の標的ポリペプチドとの 反応を容易に検出するために、本発明の抗体を標識することにより該反応を直接検 出する力、または標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の検出 方法においては、感度の点で、後者の間接的検出(例えばサンドイッチ法など)を利 用することが好ましい。
[0484] 標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、ペルォキシダーゼ (POD)、アル カリホスファターゼ、 13 ガラクトシダーゼ、ゥレアーゼ、カタラーゼ、グノレコースォキ シダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼまたはピオチン アビジン複合体等の酵素を 、蛍光免疫測定法の場合には、フルォレセインイソチオシァネート、テトラメチルロー ダミンイソチオシァネート、置換ローダミンイソチオシァネート、ジクロロトリアジンイソチ オシァネート、 Alexaまたは AlexaFluoro等の蛍光性物質もしくは蛍光団を、そして 放射免疫測定法の場合にはトリチウム、ヨウ素 (131ι, 125ι, 123ι, 121ι)、リン (32P)、ィォ ゥ (3 )、金属類 (例えば68 Ga, 67Ga, 68Ge, 54Mn, "Mo, "TC, 133Xeなど)等の放 射性同位元素を用いることができる。また、発光免疫測定法は、 NADH—、 FMNH 2—、ルシフェラーゼ系、ルミノール 過酸化水素 POD系、アタリジ-ゥムエステル 系またはジォキセタンィ匕合物系等の発光性分子、発光物質、生物発光物質を用いる ことができる。
[0485] また、必要に応じて、アビジン ピオチン系またはストレプトアビジン ピオチン系を 利用することも可能であり、この場合、本発明の抗体またはその断片に例えばビォチ ンを結合することもできる。
[0486] 標識物質と抗体との結合法は、酵素免疫測定法の場合にはダルタルアルデヒド法 、マレイミド法、ピリジルジスルフイド法または過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射 免疫測定法の場合にはクロラミン T法、ボルトンノヽンター法等の公知の方法を用いる ことができる。測定の操作法は、公知の方法(Current protocols in Protein S ciences、 1995年、 John Wiley & Sons Inc.、 Current protocols in Im munology、 2001年、 John Wiley & Sons Inc. )により行うことができる。例え ば、本発明の抗体を直接標識する場合には、試料中の成分を固相化し、標識した本 発明の抗体と接触させて、マーカーポリペプチドと本発明の抗体との複合体を形成さ せる。そして未結合の標識抗体を洗浄分離して、結合標識抗体量または未結合標識 抗体量より試料中の標的ポリペプチドの量を測定することができる。
[0487] また、例えば標識二次抗体を用いる場合には、本発明の抗体と試料とを反応させ( 一次反応)、さらに標識二次抗体を反応させる(二次反応)。一次反応と二次反応は 逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、または時間をずらして行ってもよ い。一次反応及び二次反応により、固相化した標的ポリペプチド一本発明の抗体 標識二次抗体の複合体、または固相化した本発明の抗体 標的ポリペプチドー標 識二次抗体の複合体が形成する。そして未結合の標識二次抗体を洗浄分離して、 結合標識二次抗体量または未結合標識二次抗体量より試料中の標的ポリペプチド の量を測定することができる。
[0488] 具体的には、酵素免疫測定法の場合は標識酵素にその至適条件下で基質を反応 させ、その反応生成物の量を光学的方法等により測定する。蛍光免疫測定法の場合 には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫定法の場合には放射性物質標識に よる放射能量を測定する。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測 定する。
[0489] 本発明の方法では、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球 凝集反応または粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散 乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施する場合には、溶 媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液またはグッド緩衝液等を用いるこ とができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を反
応系に含ませてもよい。
[0490] 上記抗体又は断片は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、合成抗体 、組換え抗体、多重特異性抗体 (二重特異性抗体を含む)、単鎖抗体、 Fab断片、 F (ab' ) 断片などを含む。ポリクローナル抗体は、精製ポリペプチドを結合した親和性
2
カラムに結合させることを含む、いわゆる吸収法によって、特異的抗体として調製する ことができる。
[0491] 測定は、慣用の酵素又は蛍光団で標識した抗体又は断片と、組織切片又はホモゲ ナイズした組織とを接触させる工程、抗原 抗体複合体を定性的に又は定量的に測 定する工程を含むことができる。検出は、例えば免疫電顕により標的ポリペプチドの 存在とレベルを測定する方法、 ELISAや蛍光抗体法などの慣用法によって標的ポリ ペプチドのレベルを測定する方法などによって行 、、転移がな 、患者由来の食道ガ ン組織と比べて転移がある患者由来の食道ガン組織において標的ポリペプチドの発 現量が増加又は低下 (もしくは、減少)している場合、或いは血液中の該ポリペプチド のレベルが、転移がな 、食道ガン患者と比べて転移がある食道ガン患者にぉ 、て有 意に増加又は低下している場合、食道ガン転移があると決定する。言い換えれば、 前記ポリペプチドの発現量又はレベルが、転移のな 、患者由来の値と比較して有意 に増加又は低下している場合、食道ガン転移があると決定する。或いは、上記の方 法によって、非ガン糸且織と比べて食道ガン糸且織にぉ 、て標的ポリペプチドの発現量 が減少して 、る場合、又は血液中の該ポリペプチドのレベルが健常な被験者と比べ て食道ガンに罹患した被験者にぉ 、て有意に低下して 、る場合、食道ガンであると 決定する。言い換えれば、前記ポリペプチドの発現量又はレベルが、正常値と比較し て有意に低下している場合、食道ガンであると決定する。ここで、有意にとは、統計学 的に有意であることを意味する。
[0492] 本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は 、これらの実施例によって制限されないものとする。
実施例
[0493] <実施例 1 >
1.実験者の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た 119名の食道ガン患者から、食道ガン摘出手術時 又は食道生検実施時に食道の摘出組織を得た。摘出された組織片につ ヽて肉眼的 及び Z又は病理組織学的に食道ガン組織を判断し、食道ガン病変部と正常組織部 を分けてただちに凍結し、液体窒素中で保存した。別途、周辺の所属リンパ節の採 取を行 、、食道ガン細胞の転移の有無を病理学的に診断した。
2. totalRNA抽出と cDNAの調製
試料として食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織を用いた。お のおのの組織から、 Trizol reagent (Invitrogen社)を用いて、同社推奨のプロトコ ールにより totalRNAを調製した。
上述の方法で得られた totalRNA 1 μ gについて、 oligo (dT)プライマー及びランダ ムノナマーを併用し、 CyScribe First-Strand cDNA Labeling Kit (GEヘルスケ ァ社)を用いてメーカー推奨のプロトコールで逆転写反応を行った。食道ガン組織由 来の totalRNAには Cy3— dUTP (GEヘルスケア社)を、リファレンス totalRNA (St ratagene社)には Cy5— dUTP (GEヘルスケア社)を添カ卩して、メーカー推奨のプロ トコールで逆転写反応時に cDNAの標識を行った。標識された cDNAは QIA quick PCR purification Kit (QIAGEN社)で精製してからハイブリダィズに用いた。
3.才リゴ DNAマイクロアレイの作製
オリゴ DNAマイクロアレイとしては Affymetrix社 GeneChip™ (Human Genome U 133 A)及び本明細書中で述べる方法に従つて作製した DN Aチップを使用した
[0494] DNAチップの作製方法を以下に示す。最初に搭載するオリゴ DNAの種類を決定 するために、 Affymetrix社 GeneChip™を用いて遺伝子の絞込みを行った。 Gene Chip™の操作については、 Complete GeneChip™ Instrument Systemなどの 同社の定める手順に基づいて実施した。 Complete GeneChip™を用いた解析の 結果、食道ガンによって発現変動が起こる可能性がある遺伝子及び実験対照となりう る遺伝子を計 8961種抽出した。
[0495] 抽出した 8961種の遺伝子について、配列の重複をおこさないように配列特異性が 高!、部位の配列 60 - 70残基をそれぞれ選択して合成した。 4倍に希釈した Solutio
n I (タカラバイオ社)に 30 microMとなるように溶解した、配列番号 21— 40のオリゴ DNAを含む、 8961種の 60又は 70merからなる合成オリゴ DNAを、 MATSUNA MI 'DNAマイクロアレイ用コートグラス DMSO対応 Typelァミノ修飾オリゴ DNA固 定コート(松浪硝子工業株式会社)上にスポッター(GMS417arrayer, Affymetrix 社)を用いて湿度環境 50— 60%でスポットした。
4.ハイブリダィゼーシヨン
標識した cDNA 1 μ gをアンチセンスオリゴカクテル(QIAGEN)に溶解し、 Gap力 バーグラス (松浪硝子工業)を載せた DNAチップにアプライし、 42°Cで 16時間ハイ ブリダィズを行った。ハイブリダィズ終了後、 DNAチップを 2xSSCZ0. 1%SDS、 1 xSSC、 0. 2xSSCで順次洗浄した。
5.遺伝子発現量の測定
上述の方法によりハイブリダィゼーシヨンを行った DNAチップを Agilentマイクロア レイスキャナー (Agilent社)を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値ィ匕 し 。統言十学的処理は Speed T.著「Statistical analysis of gene expression m icroarray dataj Chapman & Hall/CRC、及び Causton H. C.ら著「A beginne r' s guide Micro array gene expression data analysisj BlackweU publisnmg を参考にして行った。すなわちハイブリダィズ後の画像解析力 得られたデータにつ いて、それぞれの対数値をとり、 global normalizationをと LOWES S (locally wei ghted scatterplot smoother)による平滑化を行い、 MADによるスケーリング処 理によってノーマライゼーシヨン補正を行った。その結果、転移がある食道ガン病変 部における発現量が、転移がない食道ガン病変部よりも多い z少ない遺伝子を見出 すことができた。これらの遺伝子を食道ガン転移検出用遺伝子として利用することが できると考えられる。
6.予測スコアリングシステム
50例の患者力も得た検体を教師として、 Genomic Profiler (三井情報開発)に搭 載した SVMを用いる判別式を作成した。この判別式によって、ノーマライゼーシヨン を行った全 119例のデータについて、データの予測を行った。なおカーネルは、 line ar kernelを用いた。また遺伝子は二群間(転移がある食道ガン病変部と転移がな
V、食道ガン病変部)での t検定の p値をもとに選別した。
[0496] すべての検体を対象として解析を行!、、転移がある食道ガン病変部と転移がな ヽ 食道ガン病変部の比較で P値が小さ 、順の一覧 (転移がある食道ガン病変部と転移 力 、食道ガン病変部での遺伝子転写産物の発現量比較と統計値)を得、この一覧 力 上位力 47種の遺伝子を選んだ (表 2)。
[0497] [表 2] 配列番号 cfSeq番号 遣伝子名
1 Mil_021913 AXL
2 KM_0I4354 C6orfS4
3 — 014415 ZBTB11
'1 匿一 003820 TNF SF14
S NM_018044 NSUN5
6 匪 _015001 SPEN
7 匪 _021070 LTBP3
8 NM_0047丄丄 SY GR1
9 NM_004311 ARL3
10 N _022444 SLC13A1
11 ΝΗ^003266 RALGDS
12 匪— 019903 ADD 3
13 Ν _006301 MAP3K12
14 ΝΜ_021732 AVPIl
15 ΝΜ_024711 G1 AF6
16 NM_01S370 FLJ112S9
17 N1L004054 C3AR1
18 ΝΜ_007Η4 PCGFE
19 Nil 002B01 6D
20 ΝΜ_002661 PLCG2
21 層— 207364 GfR148
22 ΝΜ_001663 ARF6
23 丽— 007184 ISCH
24 而— 005838 Γ,Ι,ΥΑΤ
25 NG_001019 IGHM
26 NM_205B36 ' FBX038
27 NM_00D338 SLC12A1
28 NM_01448S PGDS
29 NIL001778 CD48
30 N _014214 IMPA2
31 Nil 0021E5 HSPA6
32 NM_003751 EIF3S9
33 NM_024697 ZNF659
34 NM_032144 AB6C
35 l 006170 K01.1
36 崖— 001343 腿 2
37 NM_O0R755 EBI3
38 NM_002T7l PRSS3
39 NM_000404 GLB1
4ϋ 丽— 022136 SAMSNi
■11 丽_004925 AQP3
42 丽』 06136 CAPZA2
43 NM_003780 R40ALT2
44 履— 019555 ARHGEF3
45 删 40946 POGK
46 — 022490 PRAFl
17 MM 000860 HPGD
選ばれた 47種の遺伝子にっ 、て、食道ガン組織を識別するための SVMによる判 別マシーンを作成し、プローブとして配列番号 48〜94のポリヌクレオチドを用いて測 定した遺伝子発現を検討することにより、転移がある(すなわち、転移性)食道ガン病 変部と転移がな 、 (すなわち、非転移性)食道ガン病変部の判別式を作成したところ 、用いる遺伝子の数に依存して確率が変動し、 86%以上の確率で転移がある食道 ガン病変部と転移がな 、食道ガン病変部を判別することができた(図 1)。
<実施例 2>
• 実験者の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た 119名の食道ガン患者から、食道ガン摘出手術時又 は食道生検実施時に食道の摘出組織を得た。摘出された組織片につ ヽて肉眼的及 び Z又は病理組織学的に食道ガン組織を判断し、食道ガン病変部と正常組織部を 分けてただちに凍結し、液体窒素中で保存した。
[0498] · totalRNA抽出と cDNAの調製
試料として食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織、及び同一食 道組織における非ガン組織 (正常組織)を用いた。おのおのの組織から、 Trizol rea gent (Invitrogen社)を用いて、同社推奨のプロトコールにより totalRNAを調製し た。
[0499] 上述の方法で得られた totalRNA 1マイクログラム (micro g)につ!/、て、 oligo (dT )プライマー及びランダムノナマーを併用し、 CyScribe First-Strand CDNA Lab eling Kit (GEヘルスケア社)を用いてメーカー推奨のプロトコールで逆転写反応を 行った。正常組織由来又は食道ガン組織由来の totalRNAには Cy3— dUTP (GE ヘルスケア社)を、リファレンス totalRNA (Stratagene社)には Cy5— dUTP (GEへ ルスケア社)を添カ卩して、メーカー推奨のプロトコールで逆転写反応時に cDNAの標 識を行った。標識された cDNAは QIA quick PCR purification Kit (QIAGEN社 )で精製してからハイブリダィズに用いた。
3.才リゴ DNAマイクロアレイの作製
オリゴ DNAマイクロアレイとしては Affymetrix社 GeneChip™ (Human Genome U133 A)及び本明細書中で述べる方法に従って作製した DNAチップを使用した。
[0500] DNAチップの作製方法を以下に示す。最初に搭載するオリゴ DNAの種類を決定 するために、 Affymetrix社 GeneChip™を用いて遺伝子の絞込みを行った。 Gene Chip™の操作については、 Complete GeneChip™ Instrument Systemなどの 同社の定める手順に基づいて実施した。 Complete GeneChip™を用いた解析の 結果、食道ガンによって発現変動が起こる可能性がある遺伝子及び実験対照となりう る遺伝子を計 8961種抽出した。
[0501] 抽出した 8961種の遺伝子について、配列の重複をおこさないように配列特異性が 高!、部位の配列 60 - 70残基をそれぞれ選択して合成した。 4倍に希釈した Solutio n I (タカラバイオ社)に 30 microMとなるように溶解した、配列番号 162〜181のォ リゴ DNAを含む、 8961種の 60又は 70merからなる合成オリゴ DNAを、 MATSUNA MI DNAマイクロアレイ用コートグラス DMSO対応 Typelァミノ修飾オリゴ DNA固定 コート(松浪硝子工業株式会社)上にスポッター(GMS417arrayer, Affymetrix社 )を用いて湿度環境 50— 60%でスポットした。
[0502] · ハイブリダィゼーシヨン
標識した cDNA 1 μ gをアンチセンスオリゴカクテル(QIAGEN)に溶解し、 Gapカバ 一グラス (松浪硝子工業)を載せた DNAチップにアプライし、 42°Cで 16時間ノ、イブリ ダイズを行った。ハイブリダィズ終了後、 DNAチップを 2xSSCZ0. 1%SDS、 lxS SC、 0. 2xSSCで順次洗浄した。
[0503] 5.遺伝子発現量の測定
上述の方法によりハイブリダィゼーシヨンを行った DNAチップを Agilentマイクロアレ ィスキャナー (Agilent社)を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値ィ匕し た。統 3十'子的処理は Speed T.著「Statistical analysis of gene expression mic roarray dataj Chapman & Hall/CRC,及び Causton H. C.ら著「A beginner' s guide Microarray gene expression data analysis」Blackwell publishingを 参考にして行った。すなわちハイブリダィズ後の画像解析力も得られたデータにつ!ヽ て、それぞれの対数値をとり、 global normalizationをと LOWESS (locally weigh ted scatterplot smoother)による平滑化を行い、 MADによるスケーリング処理に よってノーマライゼーシヨン補正を行った。その結果、非ガン組織部(図 2)、食道ガン
病変部(図 3)に示すような M— Aプロットを得ることができた。この結果、食道ガン病 変部における発現量が、非ガン組織部よりも少ない遺伝子を見出すことができた。こ れらの遺伝子を食道ガン検出用遺伝子として利用することができると考えられる。 6.予測スコアリングシステム
50例の患者力も得た検体を教師として、 Genomic Profiler (三井情報開発)に搭 載した SVMを用いる判別式を作成した。この判別式によって、ノーマライゼーシヨン を行った全 119例のデータについて、データの予測を行った。なおカーネルは、 line ar kernelを用いた。また遺伝子は二群間(食道ガン病変部と正常組織部)での t検 定の p値をもとに選別した。
[0504] すべての検体を対象として解析を行!、、食道ガン病変部と非ガン組織部の比較で p値が小さ!/、順の一覧 (食道ガン病変部と非ガン組織部での遺伝子転写産物の発現 量比較と統計値)を得、この一覧カゝら上位から 20種の遺伝子を選んだ (表 3)。
[0505] [表 3]
選ばれた 20種の遺伝子(図 2及び図 3では白菱形印で示される)について、食道ガ
ン組織を識別するための SVMによる判別マシーンを作成し、プローブとして配列番 号 162〜181のポリヌクレオチドを用 Vヽて測定した遺伝子発現を検討することにより、 食道ガン組織、非ガン組織の判別式を作成したところ、用いる遺伝子の数に依存し て確率が変動し、 89%以上の確率で食道ガン病変部と非ガン組織部を判別すること ができた(図 4)。
[0506] 教師となる検体として、手術切片及び生検試料から得た食道ガン病変部、手術切 片のみカゝら得た非ガン組織部を用いて解析を行 ヽ、食道ガン病変部と非ガン組織部 での発現量差につ!ヽて p値の小さ!/、順に遺伝子を選別し、非ガン組織を識別するた めの SVMによる判別マシーンを作成したところ、最適な組み合わせのプローブとして 酉己歹 IJ番号 162〜165、 167, 171、 173、 174および 176のポジヌクレ才チドを用!ヽて 測定した遺伝子発現を検討することにより、 93%の確率で非ガン組織を識別した。
[0507] 教師となる検体として、手術切片のみから得た食道ガン病変部、手術切片及び生 検試料から得た非ガン組織部を用いて解析を行!ゝ、食道ガン病変部と非ガン組織部 での発現量差につ!、て p値の小さ!/、順に遺伝子を選別し、食道ガン組織を識別する ための SVMによる判別マシーンを作成したところ、最適な組み合わせのプローブと して配列番号 162〜166、 168〜172、 175のポリヌクレオチドを用いて測定した遺 伝子発現を検討することにより、 96%の確率で食道ガン組織を識別した。
[0508] これらの 2つの非ガン組織部を識別する SVMと食道ガン病変部を識別する SVM を同時に 1つの被検組織の遺伝子発現量に対してあてはめ、解析を行うことができた その結果、ある被検組織にっ ヽて 2つの識別式が同時に非ガン組織部であると ヽぅ 結果をもたらした場合、又は 2つの識別式が同時に食道ガン病変部であるという結果 をもたらした場合、それぞれの診断の確度は従来の 1つの識別式によって診断する 方法よりも有意に高いという結果を得た。
<実施例 3 >
1. RT— PCRによる検出
試料として食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織、及び同一食 道組織における非ガン組織(正常組織)を用い、おのおのの組織から、 Trizol reage
nt (インビトロジェン社)を用いて、同社推奨のプロトコールにより totalRNAを調製し た。 TotalRNAから、 Superscript III™ FIRST- STRAND SUPER MIXを 用いて cDNAを合成し、 totalRNA20ng相当の cDNAについて TaKaRa Taq™ ( タカラバィォ社、京都、日本)を用いて増幅反応を行った。上記 II群に属する CaMKI INalphaおよび YPEL5遺伝子を検出するために、各遺伝子配列(配列番号 145お よび 158)に対応する 20塩基力もなるプライマー (タカラバイオ株式会社)を増幅反応 に用いた。反応溶液の組成は提供されたプロトコールに従って調製した。反応条件と して、最初に 95°C1分間処理した後、 95°C15秒、 55°C30秒、 72°C30秒の組み合 わせ条件処理を 23 (GAPDH)〜26 (CaMKIINalphaおよび YPEL5)サイクル行 い、最後に 72°Cで 7分間処理した。反応後の反応液を 2% agarose gelで泳動し、各 遺伝子の発現を確認した(図 5)。
図 5から明らかなように、 CaMKIINalphaおよび YPEL5は食道ガン病変部組織に お!、て正常組織より発現が減少して 、ることが示された。
2.定量的 RT—PCR法による検出
試料として、 1. RT— PCRにおける検出、と同様に作製した cDNAを用いた。定量 的 RT— PCR法は、タカラバィォ社 (京都、日本)の webページより提供される情報 (h ttp : z / www. takara— bio. co. jpZ prt/ guide, htm)に づ ヽて 施し 7こ。 光検出には SYBR premix ExTaq (タカラバイオ社)および ABI PRISM 7000 を用い、反応液の組成は SYBR premix ExTaq のプロトコールに、反応条件は ABI PRISM 7000のプロトコールに準拠して、 45サイクルの増幅反応を行った。 CaMKIINalpha (配列番号 145)および GAPDH遺伝子を検出するために、各遺伝 子配列に対応する 20塩基力もなるプライマー (タカラバイオ社)を増幅反応に用いた 。定量 PCRのための検量線を作成するにあたっては、 CaMKIINalphaについては 食道組織より調製した PCR断片を、定常発現遺伝子の一種である GAPDH (ここで、 定常発現遺伝子とは、ほとんどのヒト細胞 ·糸且織において発現量がほぼ一定である遺 伝子であって、ハウスキーピングジーンとも呼ばれるものである。 )については human reference RNA(Stratagene社)より合成した cDNAを、それぞれ任意の濃度に 希釈して用いた。 Total RNAlOng相当の cDNAについて CaMKIINalphaと GAP
DHにつ!/、て各組織で定量的 PCR法を実施し、 CaMKIINalpha発現量の GAPD H発現量に対する比を算定した。
[0510] その結果、食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織の CaMKIIN alphaZGAPDH発現比は 0. 41、正常組織のそれは 3. 16となり、食道ガン病変部 にお!/、て、 CaMKIINalpha発現量が低下して!/、ることが示された。
3.結果
RT— PCRによって、食道ガン組織における CaMKIINalpha及び YPEL5の mRN Aの発現量を確認したところ、正常食道組織に比べ減少して 、る傾向が示された。
[0511] また、定量的 RT— PCRによって、 CaMKIINalphaの mRNAは食道ガン組織にお V、て正常食道組織に比べ約 1Z7. 7に減少して ヽることが示された。
4.半定量的 RT— PCR
半定量的 RT— PCRはライトサイクラ一(ロシュ'ダイァグノスティックス)を用いて行 つた。試料として食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織、及び同 一食道組織における非ガン組織 (正常組織)を用い、おのおのの組織力ゝら抽出した t otalRNAから、 first strand synthesis kit (GEヘルスケア社)を用いて cDN Aを 合成した。上記 II群に属する XRCC3および RRM2、また内因性コントロールとして G APDHに対するプライマーについては、 primer3 (http : //frodo. wi. mit. edu /cgi - bin/primer3/primer 3_www. cgi)を用いて配列を決定した(XRCC3 について 5, - ACTGTGCCCCACAAAACTTC - 3 ' (配列番号 234)、 5,— GA CCCTCCTTCCTCTCAACC - 3 ' (配列番号 235)、 RRM2について 5,— GGC TGGCTGTGACTTACCAT- 3 ' (配列番号 236)、 5, - AATCTGCGTTG AA GCAGTGA— 3,(配列番号 237)、 GAPDHについて 5, - TGGTATCGTGG A AGGACTCATGC - 3 ' (配列番号 238)、 5, - ATGCC AGTG AGCTTCCCGT TCAGC- 3' (配列番号 239) )とした。得られた 2 Lの cDNAテンプレートについ てプライマーを各 50pmol、 3mM MgClを 2. 4 L
2 、 LightCycler DNA MAS
TER SYBR Greenl, lOx cone (ロシュ'ダイァグノスティックス株式会社) 2 と 混合し、ライトサイクラ一を用いて PCR反応を行った。反応条件として、最初に 95°C で反応溶液を処理した後、 94°C1秒、ァニール温度 (XRCC3 58°C、RRM2 53.
1°C) 5秒、 72°C 18秒の組み合わせ条件処理を 45サイクル行い、最後に 0. 2°CZ秒 の割合で 95°Cまでカ卩温して melting curveを確認した。すべての実験において試 料を希釈することによって GAPDHの発現量定量曲線を作成し、食道ガン病変部組 織と正常組織において RRM2および XRCC3の発現量を半定量した。
[0512] その結果、 RRM2についてはその発現量力 正常組織:食道ガン病変部の比が 1:
0. 06、XRCC3【こつ!/ヽて 1 : 0. 1 Uこ減少して!/ヽた。
<実施例 4>
1.健常人および食道ガン患者血漿のタンパク質同定
50〜70歳代の食道ガン患者 11名、および年齢を対応させた健常人 8名より、 ED TA添加の血漿成分をそれぞれ得た。健常人にっ 、てはランダムに 4名分のプール 血漿を作製し、解析に用いた。食道ガン患者の血漿は 1例ずつ解析を行った。
[0513] 血漿をポアサイズ 0. 22 μ mのフィルターでろ過して夾雑物質を取り除き、タンパク 質濃度 50mgZmLとなるように調整した。この血漿をさらに 25mM重炭酸アンモ-ゥ ム溶液 (pH8. 0) 12. 5mgZmLに希釈し、中空糸フィルター(東レ)によって分子量 分画を行った。分画後の血漿サンプル(全量 1. 8mL、最大 250 gのタンパク質を 含む)を ProteomeLab (登録商標) PF2D System (Beckman Coulter社)逆相ク 口マトグラフィ一で 7分画に分離し、凍結乾燥後、 100 しの25111\1重炭酸ァンモ-ゥ ム溶液(pH8. 0)に再溶解した。このサンプルをタンパク質の 50分の 1量のトリプシン で 37°C、 2〜3時間消化し、ペプチドィ匕した。各分画のペプチドをさらにイオン交換力 ラム (KYAテクノロジーズ)によって 4分画ィ匕した。
[0514] その各々の分画を、逆相カラム (KYAテクノロジーズ)でさらに分画し、溶出されて きたペプチドについて、オンラインで連結された質量分析計 Q— TOF Ultima (Mic romass社)を用いて、サーベイスキャンモードで測定した。その測定データを、タン パク質同定ソフトウェアである MASCOT (Matrix Science)を用いて解析すること により、網羅的にタンパク質同定を行った。その結果、健常人、食道ガン患者いずれ の血漿成分からも、 MASCOTスコア 40以上(同定ペプチド数 2個以上)の約 3500 種類のタンパク質が同定された。
2.健常人および食道ガン患者血漿のタンパク質発現比較
上記 1で同定された血漿タンパク質について、健常人と食道ガン患者間で比較を 行った。健常人で発現が検出されず、食道ガン患者において発現が検出されたタン ノ ク質を見出した。これらのタンパク質は、上記表 1に示した配列番号 202 233で 表されるポリペプチドであり、所謂食道ガンマーカーとして食道ガンの検出において 有用であることが判明した。各患者においての発現頻度を表 4に示した。健常人 4人 を 1群とした群については 2群ともで検出されておらず(一で示す)、食道ガン患者で は発現( +で示す)が 11名中 10名以上で検出された。
[表 4]
したがって、上記のポリペプチドの少なくとも 1つを、例えばその特異抗体を用いて
、該ポリペプチドの存在または量について、測定することによって、食道ガンを検出 することができる。
産業上の利用可能性
[0516] 本発明により、少なくともフェーズ Iの食道ガンや、少なくともリンパ節への食道ガン 転移の検出、判定又は予測が可能となり、特異性、感受性に優れた食道ガン診断用 組成物を提供することができるため、特に製薬及び医薬産業において有用である。 配列表フリーテキスト
[0517] 配列番号 234 人工配列の説明:プライマー
配列番号 235 人工配列の説明:プライマー
配列番号 236 人工配列の説明:プライマー
配列番号 237 人工配列の説明:プライマー
配列番号 238 人工配列の説明:プライマー
配列番号 239 人工配列の説明:プライマー