CN1618985A - 一个新的食管癌标志基因rpl14及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种食管癌诊断标志基因RPL14(如GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp序列所示或者如SEQ ID NO：1所示)用于检测食管癌的用途。具体的，基因RPL14的缺失可以作为食管癌早期诊断标志；作为食管癌预警的标志；作为食管癌预后判断的标志以及作为食管癌治疗监测的标志，其中测试样品中含有该基因缺失的细胞数量的减少指示良好的治疗效果。
Description
发明领域
本发明涉及一种食管癌诊断标志基因RPL14(如GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp序列所示或者如SEQ ID NO：1所示)用于检测食管癌的用途。具体的，基因RPL14的缺失可以作为食管癌早期诊断标志；作为食管癌预警的标志；作为食管癌预后判断的标志以及作为食管癌治疗监测的标志，其中测试样品中含有该基因缺失的细胞数量的减少指示良好的治疗效果。
发明背景
利用分子生物学技术，能够有效地进行分子水平检测和/或诊断疾病，进而为早期治疗这些疾病提供便利。
食管癌是最常见的消化道肿瘤之一，其死亡率位于我国十大恶性肿瘤的第四位。肿瘤的发生发展是涉及癌基因激活与抑癌基因失活的多步骤过程。在乳腺癌(Chen et al.，1994)、子宫和卵巢癌(Ehlen et al.，1990)、睾丸肿瘤(Lothe et al.，1989)、肾癌(Morita et al.，1991)、口腔癌(Wu et al.，1994)、肺癌(Shriver et al.，1998)、女性生殖道肿瘤(Jones et al.，1992)、头颈鳞癌(Califano et al.，1999)和食管鳞癌(Huet al.，2000；Ko et al.，2001)等许多种肿瘤中，3号染色体短臂经常发生缺失，提示该区域可能存在一个或多个肿瘤相关的抑癌基因。
将3号染色体、3p以及3p21区域的一个2Mb或者80kb的染色体片段分别导入人肺腺癌(Satoh et al.，1993)、肾癌和口腔癌细胞系(Shimizu et al.，1990；Uzawa et al.，1995)以及鼠的纤维肉瘤细胞系(Todd et al.，1996)，均显示具有抑制肿瘤形成的能力。
人核糖体蛋白基因RPL14(ribosomal protein L14)定位于3p21.3。该基因由6个外显子和5个内含子组成，其蛋白产物是60S核糖体大亚基的一个组成成分，属于核糖体蛋白的L14E家族。RPL14基因含有一个高度多态的CTG三核苷酸重复序列，位于RPL14基因的第6外显子中，编码一个多聚丙氨酸结构域。这种CTG重复序列存在于一些发育过程中发挥重要作用的基因中，而且与基因的转录调控有关(Han et al.，1993)。有研究者在肺癌和头颈鳞癌观察到RPL14的基因内多态性标志出现较高的杂合性丢失频率(Shriver et al.，1998)。然而，尚未见报道RPL14的变化与食管癌之间的关系。
本发明人运用RPL14基因内多态性标志在基因组DNA水平和转录水平对我国食管鳞癌进行了研究，出人意料的发现，所述基因在基因组DNA水平有很高的杂合性丢失率，即一个等位基因缺失。在转录水平有更高频率的一个等位基因表达下调。特别重要的是，在食管原位癌和不典型增生的食管组织也发现RPL14的杂合性丢失。因此，该基因的缺失可以作为一个很好的食管癌诊断标志。
发明内容
本发明的一个方面涉及新的食管癌诊断标志，RPL14，基因或其片段用于检测食管癌的用途。具体的，基因RPL14的缺失可以作为食管癌早期诊断标志。另一方面，基因RPL14的缺失还可以作为食管癌预警的标志。食管上皮不典型增生被公认为食管癌前病变。然而不典型增生是一种可逆状态，一部分患者在数月至数年后又恢复正常，而另一部分患者数月至数年后发展为癌。在不典型增生食管上皮检测发现该基因的缺失时，指示将可能发生食管癌，有利于受试者采取适当的预防措施。再一方面，基因RPL14的缺失还可以作为食管癌预后判断的标志：该基因的缺失指示某种特定临床表型。此外，基因RPL14的缺失可以作为食管癌治疗监测的标志，其中测试样品中含有该基因缺失的细胞数量的减少指示良好的治疗效果。
本发明所述食管癌诊断标志RPL14，包括所述基因的全长DNA序列(GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp序列所示)和cDNA序列(如SEQ ID NO：1所示)及其片段，和与所述基因或其片段有高度序列相似性的功能性类似物。
在本发明中，所述基因序列的片段长度选自GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp序列所示序列和SEQ ID NO：1所示序列的至少20个连续碱基，优选至少30个碱基，更优选为50个碱基。
在本发明中，所述具有高度序列相似性的功能性类似物是指与GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp序列或者SEQ IDNO：1所述序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，特别优选至少90％，甚至最优选至少95％，甚至最特别优选至少98％序列相似性的那些类似物。
利用所述RPL14基因或其片段或其类似物可以用于鉴定相应于全长转录物的cDNA克隆或具有完整基因，包括调节和启动子区域、外显子及内含子的基因组克隆，用于筛选受试者待测样品，以确定其中是否存在能够与之杂交的成分，从而作为检测与RPL14相关的食管癌疾病或对食管癌的易感性的判定标志。
本发明也涉及用于检测各种组织中RPL14基因的mRNA的诊断方法。在本发明所述方法中，测定样品中RPL14基因在DNA和/或mRNA水平的变化可用选自PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、Southern印迹、Northern印迹、点杂交以及DNA或RNA原位杂交等方法进行检测。这些方法对于本领域的技术人员也为常规操作。
本发明另一方面涉及利用所述食管癌诊断标志RPL14或其片段检测食管癌的方法。
在本发明的一个具体实施方案中，采用PCR方法检测待测样品中是否存在RPL14基因缺失，包括如下步骤；
1)常规方法提取患者外周血和待查组织DNA；
2)利用根据RPL14基因序列设计的引物进行PCR扩增；
3)取2微升PCR产物进行7％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
4)分析电泳结果：如果某个体外周血RPL14基因内多态性标志的一对等位片段的PCR产物长度不同，在变性聚丙烯酰胺凝胶上呈现两条带，该个体即为信息个体。当待测组织的一个等位条带减弱50％或50％以上，表明此组织发生了一个RPL14等位基因的缺失。
附图说明
图1.RPL14在食管癌患者外周血(N)及肿瘤组织(T)分析的部分电泳结果
本发明将在下面的实施例中进一步描述。但是本发明并不局限于这些实施例。
实施例一：检测RPL14基因缺失的方法
1)常规方法提取受试者外周血和待查组织DNA[分子克隆实验指南(第二版)，J.萨姆布鲁克，等人，冷泉港实验室出版社，1989]；
2)采用引物R1和R2按以下条件进行PCR扩增：
R1：5’AAG CAC CTG GTA CTA AGG GTA 3’ (SEQ ID NO：2)
R2：5’TCG CGG CGG TGA TCT TTT TTG 3’ (SEQ ID NO：3)
PCR反应体系
基因组DNA 1.0μl(40ng)
10×PCR缓冲液[100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl] 2.0μl
25mM MgCl2 1.2μl
2.5mM dNTP 1.0μl
上游引物(10μM) 1.0μl
下游引物(10μM) 1.0μl
去离子甲酰胺 0.5μl
Taq酶(10u/μl) 0.2μl
双蒸水 12.1μl
总反应体积 20.0μl
PCR反应程序
步骤1 94℃5分钟
步骤2 94℃30秒
步骤3 52℃30秒
步骤4 72℃30秒
步骤5 72℃5分钟
步骤6 4℃
其中从步骤2至步骤4持续35个循环。
3)取2微升PCR产物进行7％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
4)对电泳结果进行分析
如果某个体外周血RPL14基因内多态性标志的一对等位片段的PCR产物长度不同，在变性聚丙烯酰胺凝胶上呈现两条带，该个体即为信息个体。当待测组织的一个等位条带减弱50％或50％以上，表明此组织发生了一个RPL14等位基因的缺失。
上述实验结果显示，获自患有食管癌患者的外周血与肿瘤组织中的样品经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，肿瘤组织中存在一个明显减弱甚至完全丢失的RPL14基因条带(参见图1)。
参考文献
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本工作受国家高技术研究发展计划基金(2001AA221151)、国家科技攻关计划基金(2002BA711A06)、国家杰出青年科学基金(30125026)和国家重点基础研究发展规划基金(G1998051205)资助。
序列表
<110> 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所
<120> 一个新的食管癌标志基因RPL14及其用途
<130> IDC030073
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<170> PatentIn version 3.1
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<211> 823
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Claims (4)
1.食管癌诊断标志基因RPL14或其片段或与之具有高度序列相似性的功能类似物用于诊断食管癌的用途。
2.权利要求1所述的用途，其中所述RPL14基因的片段是指长度选自GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp所示序列和SEQ ID NO：1所示序列的至少20个连续碱基，优选至少30个碱基，更优选为50个碱基的序列片段；所述高度序列相似性的功能类似物是指与GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp所示序列和SEQ ID NO：1所述序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，特别优选至少90％，甚至最优选至少95％，甚至最特别优选至少98％序列相似性的那些类似物。
3.权利要求1所述的用途，其中基因RPL14的缺失可以作为食管癌早期诊断标志，食管癌预警的标志，食管癌预后判断的标志以及食管癌治疗监测的标志。
4.一种测定待测样品中RPL14基因在DNA和/或mRNA水平的变化的方法，包括如下步骤；
1)提取受试者正常组织如外周血和待查样品的DNA或mRNA；
2)根据选自PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、Southern印迹、Northern印迹、点杂交以及DNA或RNA原位杂交的方法设计引物；
3)采用2)所述方法检测待测样品；
4)当与正常组织相比，判定待测样品中RPL14等位基因的变化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200310115361 CN1618985A (zh) | 2003-11-21 | 2003-11-21 | 一个新的食管癌标志基因rpl14及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN 200310115361 CN1618985A (zh) | 2003-11-21 | 2003-11-21 | 一个新的食管癌标志基因rpl14及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1618985A true CN1618985A (zh) | 2005-05-25 |
Family
ID=34760412
Family Applications (1)
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| CN 200310115361 Pending CN1618985A (zh) | 2003-11-21 | 2003-11-21 | 一个新的食管癌标志基因rpl14及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1618985A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102191320A (zh) * | 2005-05-02 | 2011-09-21 | 东丽株式会社 | 用于诊断食管癌的组合物及方法 |
| CN102676650A (zh) * | 2011-03-09 | 2012-09-19 | 中国医学科学院肿瘤研究所 | Cpt1a基因或蛋白的定量检测在食管鳞癌预后判断中的应用 |
| CN102089428B (zh) * | 2008-05-21 | 2013-11-13 | 东丽株式会社 | 食道癌确定用组合物及方法 |
-
2003
- 2003-11-21 CN CN 200310115361 patent/CN1618985A/zh active Pending
Cited By (4)
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| CN102676650B (zh) * | 2011-03-09 | 2015-08-05 | 中国医学科学院肿瘤研究所 | Cpt1a基因或蛋白的定量检测在食管鳞癌预后判断中的应用 |
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