WO2006090882A1

WO2006090882A1 - 血管内皮前駆細胞の生体外増幅方法

Info

Publication number: WO2006090882A1
Application number: PCT/JP2006/303812
Authority: WO
Inventors: Takayuki Asahara; Haruchika Masuda
Original assignee: Foundation For Biomedical Research And Innovation; Tokai University Educational System
Priority date: 2005-02-23
Filing date: 2006-02-22
Publication date: 2006-08-31
Also published as: US8492148B2; EP1860180A4; EP1860180A1; US20080166327A1; JP4964121B2; JPWO2006090882A1

Abstract

本発明は、血管内皮前駆細胞の生体外増幅方法を提供する。より詳細には、本発明は、幹細胞増殖因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３及びトロンボポエチンからなる群より選ばれる１又は２以上の因子を含有する無血清培地で血液血管芽細胞をインキュベートすることを含む、血液血管芽細胞の培養方法、及び当該方法により得られる血管内皮細胞；並びに幹細胞増殖因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３及びトロンボポエチンからなる群より選ばれる１又は２以上の因子を含有する無血清培地、及び当該無血清培地の作製用キットなどを提供する。

Description

明細書

血管内皮前駆細胞の生体外増幅方法技術分野

本発明は、血液血管芽細胞の培養方法、及び当該方法により得られる血管内皮前駆細胞などに関する。背景技術

近年、虚血性心疾患を対象として、骨髄単核球移植療法や末梢血幹細胞採取による血管内皮前駆細胞（Endothelial progenitor cell；以下、 E P Cとも略する）を用いた細胞移植療法が行われるようになった。しかしながら、下記の如きいくつかの問題点が明らかとなっている。

1) 現行のいずれの治療法も、全身麻酔、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyt e colony stimulating factor ; G - C S F ) 投与、ァフェレ一シス等の患者の身体的負担を伴う。

2) 繰り返し移植療法を行うことが困難である。

3) 移植に必要な質 ·量ともに十分な細胞の確保が時として困難であるため、十分な治療効果を得にくい。発明の開示

本発明は、生体外において機能的な未分化血管内皮前駆細胞を増幅させる方法及び当該方法によつて得られる細胞移植用の血管内皮前駆細胞の提供を目的とする。

本発明者らは、上記課題に鑑み、生体外において未分化血管内皮前駆細胞が分ィ匕 ·増幅し得る培養条件を検討した。結果、（1) 幹細胞因子（Stem cell facto r； S CF)ヽ（2) インターロイキン 6 (Interleukin-6； I L_ 6)、 (3) FM S様チロシンキナーゼ 3 (FMS-like tyrosine kinase 3 ; F l t— 3)、（4) トロンボポェチン（thrombopoietin； T P O ) からなる群より選ばれる因子を含む無血清培地において血液血管芽細胞を培養することにより、 E P Cを生体外で効率良く増幅できること、ならびに、この培地にさらに（5 ) 血管内皮細胞増殖因子（Vascular endothelial growth factor； V E G F )、及び /又は（6 ) トランスフォーミング増殖因子 /3 (transforming growth factor β ； Τ G F - j3 ) 阻害剤を添加することで、 E P Cをより一層効率良く増幅させることなどに成功して本発明を完成するに至った。 _ 即ち、本発明は下記の通りである：

〔1〕幹細胞因子、インターロイキン 6、 F M S様チロシンキナーゼ 3及びトロンボポェチンを含有する無血清培地において血液血管芽細胞をィンキュベートすることを含む、血液血管芽細胞の培養方法；

〔2〕血液血管芽細胞のインキュベートにより血管内皮前駆細胞が増幅される血管内皮前駆細胞の増幅方法である、上記〔1〕の方法；

〔3〕血液血管芽細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、上記〔1〕の方法；

〔4〕血液血管芽細胞が単核球である、上記〔1〕の方法；

〔 5〕血液血管芽細胞が、 C D 3 4陽性および/または C D 1 3 3陽性である、上記〔 1〕の方法；

〔6〕血液血管芽細胞、および無血清培地に添加される各種因子が、同種動物に由来する、上記〔1〕の方法；

〔7〕血液血管芽細胞がヒト由来である、上記〔1〕の方法；

〔8〕無血清培地が、血管内皮細胞増殖因子及び/又はトランスフォーミング増殖因子 /3阻害剤をさらに含有する、上記〔1〕の方法；

〔9〕上記〔2〕の方法により得られる、血管内皮前駆細胞；

〔1 0〕上記〔2〕の方法により得られる血管内皮前駆細胞を含み、且つ血管内皮前駆細胞の由来する動物に対して異種の動物由来の生体成分を実質的に含有しない、組成物；〔1 1〕同種移植用である、上記〔1 0〕の組成物；

〔1 2〕血管内皮前駆細胞がヒト由来である、上記〔1 1〕の組成物；〔1 3〕虚血性疾患の予防■治療剤である、上記〔1 2〕の組成物；

〔14〕幹細胞因子、インターロイキン 6、 FMS様チロシンキナーゼ 3及びトロンボポェチンを含有する無血清培地；

〔15〕幹細胞因子、インターロイキン 6、 FMS様チロシンキナーゼ 3、トロンポポェチンおょぴ無血清培地（幹細胞因子、インターロイキン 6、 FMS様チ口シンキナーゼ 3およびトロンポポェチンのうち少なくとも 1つの因子は、無血清培地中に添加されていない）を含む、幹細胞因子、インターロイキン 6、 FM S様チロシンキナーゼ 3およびト口ンボポェチンを含有する無血清培地の作製用キット。

本発明の方法により増幅された細胞を移植することにより虚血性心疾患の心機能（収縮能 ·拡張能）が改善された。すなわち、本発明の方法は、内皮系細胞を質 -量ともに産生する上で有用と考えられ、虚血性心疾患等の血管障害を対象とした細胞移植療法の有用な方法となり得る。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の無血清培地（TGF— ]3阻害剤は 1 μΜ) 中で臍帯血由来の CD 1 3 3陽性細胞を 14日間培養した状態を示す。

図 2は、本発明の無血清培地中で臍帯血由来の CD 1 3 3陽性細胞を培養した場合の細胞数の増幅の様子を示す。培養開始時、培養 7日後、培養 14日後の細胞数を示す。 T G F— 阻害剤の濃度を変えて 4種類の無血清培地を用いて実験を行った。

図 3は、本発明の方法によって増幅した細胞についてメチルセルロース培地を用いた質的評価を行う為の具体的手順を示す。本発明の無血清培地中での培養開始時、 1週間培養後、 2週間培養後の細胞それぞれについて血液系コロニーアツセィと E P Cコ口ニーアッセィを行う。図 4は、メチルセルロース培地を用いた血液細胞コロニーアツセィにより形成される臍帯血由来 CD 1 33陽性細胞由来の血液細胞コロニーの像の一例を示す。図 5は、生理活性物質を含有するメチルセルロース培地を用いた E P Cコロェ一アツセィにより形成される臍帯血由来 CD 1 3 3陽性細胞由来の E P Cコ口- 一の像の一例を示す。培養 14〜 1 8日において細胞サイズの異なる 2種類の E PCコロニーが出現する。

図 6は、臍帯血 CD 1 33陽性細胞由来の E P Cコロニーを a c LD L— D i I及び UEA— 1レクチン一 F I TCで二重染色した結果を示す。 a、 c、 eは大細胞コロニーを、 b、 d、 f は小細胞コロニーを、 a及び bは位相差像、 c及び dは a c LD L_D i Iによる染色像を、 e及び f は U E A— 1レクチン一 F I TCによる染色像を示す。両コロニーともに a c LDL— D i I及び UEA— 1レクチン一 F I TCに染色され、 EPCとしての特徴を示した。

図 7は、本発明の無血清培地による増幅培養に伴う血液系コロニー及び E P C コロニーの出現頻度を経時的に測定した結果を示す。なお、 TGF— 阻害剤の濃度を変えて 4種類の無血清培地を用いて実験を行った。本発明の方法を用いた培養では、血液コロニーの頻度が減少し E PCコロニーの出現頻度が上昇した。図 8は、本発明の無血清培地による増幅培養に伴う小細胞 EP Cコロニー及び大細胞 E P Cコロニーの形成能の推移を測定した結果を示す。なお、 TGF— 阻害剤の濃度を変えて 4種類の無血清培地を用いて実験を行った。小細胞 E P C コロニーは、各濃度の TGF— ]3阻害剤にて漸減する傾向にあった。大細胞 Ε Ρ Cコロニーは、逆に 1週間後に最高で 2週間後にはやや減少する傾向にあった。図 9は、本発明の無血清培地による増幅培養に伴う E P Cコロニー形成能の推移を測定した結果を示す。各濃度の TGF— 阻害剤を含有する無血清培地を用いて培養したところ、 2週間培養後、 D i s h当たりの E P Cコロニー数、総 E PCコロニー数は 1 の TGF— ]3阻害剤を含有している場合にもっとも多かつた。

図 1 0は、増幅しなかった CD 1 33陽性細胞を移植した場合の虚血性心疾患に対する細胞移植療法の有効性を検討した結果を示す。 *は、コントロール（P B S単独投与群）に対する有意差（P< 0. 05%) を示す。

図 1 1は、本発明の無血清培地中で培養することにより生体外増幅した E P C を移植した場合の虚血性心疾患に対する細胞移植療法の有効性を検討した結果を示す。 *.は、コントロール（PB S単独投与群）に対する有意差（P< 0. 05%) を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明は、血液血管芽細胞の新規培養方法を提供する。本発明の培養方法は、 SCF、 I L— 6、 F 1 t— 3及び TPOからなる群より選ばれる 1又は 2以上の因子、好ましくは 3以上の因子、より好ましくは全ての因子を含有する無血清培地において血液血管芽細胞をインキュベートすることを含む。従って、本発明の培養方法で用いられる無血清培地は、例えば、 a) S CF、 b) I L一 6、 c) F i t— 3、 d) TPO、 e ) SCFと I L— 6との組合せ、 f ) S C Fと F 1 t _ 3との組合せ、 g) SCFと TP〇との組合せ、 h) I L— 6と F l t— 3 との組合せ、 i ) I L一 6と TPOとの組合せ、 j ) F 1 t— 3と TPOとの糸且合せ、 k) S C F、 I L— 6及び F 1 t - 3の組合せ、 1 ) S C F、 I L— 6及ぴ TPOの組合せ、 m) SCF、 F 1 t一 3及ぴ T P Oの組合せ、 n) I L— 6、 F 1 t一 3及ぴ T P Oの組合せ、あるいは。） SCF、 I L— 6、 F i t— 3及び T P Oの組合せを含むものであり得る。

本発明で用いられる「血液血管芽細胞」とは、血液系細胞及び血管内皮細胞の両方の前駆細胞であって、血液幹細胞、血液前駆細胞を経て血液系細胞（例えば、赤血球、 T一リンパ球、 B—リンパ球、単球 Zマクロファージ、顆粒球、巨核球）になり得、また、 E P Cを経て血管内皮細胞になり得る未分化な細胞であれば特に限定されない。血液血管芽細胞としては、被検対象の骨髄、臍帯血又は末梢血由来の細胞を使用できる。血液血管芽細胞はまた、単核球であり得る。

血液血管芽細胞はさらに、 CD 34及びノ又は CD 1 3 3陽性であり得る。従つて、血液血管芽細胞として、 C D 3 4陽性及び Z又は C D 1 3 3陽性細胞のみ予め選別して用いることもまた好ましい。 C D 3 4陽性及び/又は C D 1 3 3陽性細胞の選別は、当分野で通常行われている細胞選別の手法が用いられ、具体的には C D 3 4抗原及び/又は C D 1 3 3抗原に特異的な親和性を有する物質を用いた磁気細胞分離法（MA C S )、蛍光細胞分離法（F A C S ) 等が挙げられる。

C D 3 4抗原あるいは C D 1 3 3抗原に特異的な親和性を有する物質としては例えばこれらの蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原 ·抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやゥサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待つた後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイプリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローユングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。

本発明で用いられる細胞が由来する動物種は、虚血性心疾患等の疾患に対する細胞移植療法が適用されるヒトを含む哺乳動物一般を意味するが、臨床応用という本発明の目的に鑑みれば、好ましくはヒトである。

本発明で用いられる「無血清培地」は、当分野で通常用いられている培地を利用することができ、例えば造血幹細胞の増殖用培地として知られている無血清培地を用いることができる。無血清培地として用いられる基礎培地としては、例えば、 DMEM、 MEM、 I MDM等が挙げられる。

本発明で用いられる幹細胞因子（SCF) は、 248個のアミノ酸からなる分子量約 30， 000の糖タンパク質である。選択的スプライシングにより可溶型と膜結合型が存在するが、本発明で用いる SCFは血液血管芽細胞の培養に有用である限りいずれのタイプの S CFでもよい。好ましくは可溶型である。 S CF の由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中の SCFの濃度は、用いる SCFの種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換え S CFの場合であれば、例えば 10〜； L 000 n g/mL、好ましくは 50〜 500 n g/m L、より好ましくは約 1 00 n g/mLである。

本発明で用いられるインターロイキン 6 ( I L- 6) は、 B細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導する因子として単離された分子量 2 1万の糖タンパク質であり、免疫応答、造血系や神経系細胞の増殖分化、急性期反応等に関与することが知られている。本発明で用いる I L一 6は適宜選択されるが、ヒト血液血管芽細胞の培養に用いる場合には、ヒト I L— 6が好ましく、安定した供給が見込まれる組換え体が特に好ましい。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中の I L一 6の濃度は、用いる I L— 6の種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換え I L一 6の場合であれば、例えば 1〜500 n gZmL、好ましくは 5〜： L 00 n gZmL、より好ましくは約 20 n g /m Lである。

本発明で用いられる FMS様チロシンキナーゼ 3 (F 1 t一 3) は、初期造血制御において重要な役目を担う受容体型チ口シンキナーゼとして知られている。いくつかの選択的スプライシングによる産物が知られているが、造血系幹細胞の増殖を刺激するという報告がある。本発明で用いる F l t— 3は、血液血管芽細胞の培養に有用である限り、いずれのタイプの F l t— 3であってもよい。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中の F 1 t— 3の濃度は、用いる F 1 t一 3の種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換え F 1 t— 3リガンドの場合であれば、例えば 1 0〜1 000 n g/mL 好ましくは 50〜 500 n g/mL、より好ましくは約 1 00 n g/mLである。

本発明で用いられるトロンボポェチン（TPO) は、造血系サイト力インの一種であり、造血幹細胞から巨核球が作られる過程に特異的に作用し、巨核球の産生を促進することが知られている。本発明で用いる TP Oの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中の TP Oの濃度は、用いる T POの種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換え T P Oの場合であれば、例えば 1 〜500 n g/mL、好ましくは 5〜： L 00 n g Zm L、より好ましくは約 20 n g / mLである。

本発明で用いられる無血清培地は、血液血管芽細胞の培養により有用である（例えば、 E P Cをより効率的に増幅させる、あるいは増幅総細胞数をより増加させる）という観点から、上記 S CF、 I L一 6、 F 1 t一 3及び T POからなる群より選ばれる 1又は 2以上の因子に加え、 VE GF及び/又は TGF ]3阻害剤をさらに含有することもできる。

本発明で用いられ得る血管内皮細胞増殖因子（VEGF) は、 E PCに特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。選択的スプライシングによってサイズの異なる数種の V EGFタンパク質が産生されるが、本発明で用いる VEGFは E P Cのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプの VEG Fでもよい。好ましくは VEG F ₆₅である。 VEG Fの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中の VEG Fの濃度は、用いる VEGFの種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換え VEG F₁₆₅の場合であれば、例えば約 5〜 5 00 n g/mL、好ましくは約 20〜 1 ◦ O n g/mL、より好ましくは約 50 n gZmLである。

本発明ではまた、 TGF— ]3阻害剤が用いられ得る。 TGF— ]3は 2 5 kD a の二量体構造をもつタンパク質で、哺乳動物では構造の類似した 3種類のアイソフォーム（TGF— j3 1、 ]3 2、 β 3) が存在することが知られている。多くの細胞の増殖抑制因子として知られている。本発明で用いる TGF— i3阻害剤は、 E P Cの生体外増幅を可能にする限りいずれのアイソフォームを阻害するものであってもよいが、好ましくは SB— 43 1 542が用いられ得る。 S B— 43 1 542は、 4— (5—べンゾ [1. 3] ジォキソール一 5—ィル一 4一ピリジン一 2—ィル— 1 H—イミダゾール— 2—ィル) 一べンズァミドとしても知られる (Molecular Pharmacology 62(1) :65-74(2002)参照）。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中の TGF— j3阻害剤の濃度は、用いる TGF— ]3阻害剤の種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、 S B— 43 1 542の場合であれば、例えば約 0. 1〜1 0 μΜ、好ましくは約 0. 5〜5 μΜ、より好ましくは約 1 /ζΜである。

本発明の無血清培地に添加される各種因子はまた、血液血管芽細胞が由来する動物と同種の動物に由来する因子で統一することが好ましい。このように血液血管芽細胞及び各種因子の由来を統一することで、同種異系移植等の同種移植に好適な細胞培養物が得られる。また、細胞移植が意図される個体由来の血液血管芽細胞を用いることで、同種同系移植に好適な細胞培養物を得ることも可能である。このように異種動物由来の成分を一切含有しない環境で血液血管芽細胞の培養が可能であるため、得られる細胞培養物は、移植等に際して感染リスク '拒絶反応を回避できるという利点を有する。

本発明において特に好ましい無血清培地は、約 50 n gZmLの VEGF、約 100 n g/mLの S C F、約 20 n gZmLの I L一 6、 l O O n gZmLの F 1 t一 3、約 20 η _§ 1111^の丁？〇及び約1 0 μ Μの T G F— ]3阻害剤を含有する無血清培地である。上記した各成分は無血清培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各成分の濃縮液 (ストック溶液) を調製し、無血清培地で所定の濃度に希釈することによって本発明の、 E P Cを生体外増幅させる為の無血清培地を調製することができる。例えば市販の無血清培地に必要な成分を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌する力 \ あるいは濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の無血清培地に添加、希釈することによって本発明の無血清培を調製することができる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば 0 . 2 2 μ mや 0 . 4 5 μ mのミリポアフィルター等を用いて行う。

上述した因子を含有する無血清培地での血液血管芽細胞の培養は、血液血管芽細胞を含有する細胞懸濁液を、上述の因子を含有する無血清培地に添加することにより行われる。細胞懸濁液としてはまた、血液血管芽細胞を含有する体液自体 (例えば、骨髄液、臍帯血、末梢血）を用いることもできる。血液血管芽細胞の培養条件は特に限定されず、通常当分野で実施される条件で実施することができる。例えば、 5 % C〇₂雰囲気下、 3 7 °Cで 7 日間以上（例えば 1 0日間以上）培養される。血液血管芽細胞の無血清培地中の濃度は、血液血管芽細胞の培養を可能とする限り特に限定されないが、例えば約 0 . 5〜 1 0 X 1 0 ⁵細胞/ m 1、より好ましくは約 1〜5 X 1 0 ⁵細胞/ m 1、最も好ましくは約 3〜4 X 1 0 ⁵細胞 /m 1である。

一実施形態では、本発明の培養方法は、血液血管芽細胞又は E P Cの増幅方法であり得る。細胞の「増幅」とは、細胞の未分化状態をできる限り維持しつつ、その細胞数を増加させることを意味する。血液血管芽細胞又は E P Cの増幅は、上述の因子を例えば上述の濃度で用いて血液血管芽細胞を培養することにより達成できる。本発明の増幅方法によれば、血液血管芽細胞数の増加、及び血液血管芽細胞由来の E P C数の増加が可能となる。

別の実施形態では、本発明の培養方法は、血液血管芽細胞の血管系細胞（例えば、 E P C ) への分化促進、あるいは血液血管芽細胞の血液系細胞への分化抑制を可能とする。本発明の培養方法によれば、血液血管芽細胞が血管系細胞へとより運命付けられ得る。血液血管芽細胞の血管系細胞への分化促進、あるいは血液血管芽細胞の血液系細胞への分化抑制は、上述の因子を例えば上述の濃度で用いて血液血管芽細胞を培養することにより達成できる。

本発明の方法による血液系細胞の減少及び E P Cの増加は、例えば、得られる細胞懸濁液の血液系細胞コロニー形成能及び E P Cコロニー形成能を測定することによって確認できる。

血液系細胞コロニー形成能の測定は、通常当分野で実施されている方法により行うことができる。具体的にはステムセルテクノロジ一社等から入手可能なメチルセルロースをベースとした造血前駆細胞コロニー測定用の培地（例えばメソカルト）を用いた造血幹細胞のコロニーアツセィによって実施することができる。血液系細胞コロニー形成能の測定用キットとしては、例えばステムセルテクノ口ジ一社製のキット（カタログ No. H43 35) が市販されている。

E P Cコロニー形成能の測定は、生理活性物質、具体的には血管内皮細胞増殖因子（VEGF) 及び塩基性線維芽細胞増殖因子（b FGF) を含有する、好ましくは上記因子に加え、さらに幹細胞因子（SCF)、インターロイキン 3 ( I L — 3)、インスリン成長因子（ I GF) および上皮細胞増殖因子（EGF) からなる群より選択される 1又は 2以上、好ましくは 3以上、より好ましくは全ての因子、並びにさらに必要に応じて血清および/またはへパリンを含有するメチルセルロース培地を用いて実施することができる。特に好ましくは、約 30%の血清、約 50 n g /-Ώ Lの VEGF、約 l O O n g /m Lの S CF、約 20 n g /m L の I L— 3、約 2 U/mLのへパリン、約 50 n g/mLの b— F GF、約 50 n g/mLの EGF及び約 50 n g Zm Lの I G Fを含有するメチルセルロース培地で、 5 % C O ₂雰囲気下、 3 7 °Cで通常 10 S以上、例えば 14〜 1 8日間又はそれ以上培養して E PCコロニーを形成させる。コロニーの形成は目視で確認することができるが、得られるコロニーが本当に E P Cで構成されているか否かは、ァセチル化 LDL (a c LDL) の取り込み能や U E A— 1レクチンとの結合能、 VE—カドヘリン、 KDR、 vWFの発現（例えば、 RT— PCRにより、あるいは蛍光免疫組織化学的方法により）等を確認することによって行う。例えば D i Iで標識したァセチル化 LDL (a c LD L-D i I ) 及び F I TC 標識した UE A— 1レクチン (UEA— 1レクチン F I TC) でコロニーを二重染色した場合に、 E PCであれば共に染色される。

また、 E P Cの分化の程度を知る為には、直径 20〜50 μπιの細胞を主に含む内皮細胞様大細胞コロニー（CFU— L a r g e c e l l l i k e EC、大細胞コロニーともいう）及び直径 20 μ m以下の細胞を主に含む内皮細胞様小細胞コロニー（CFU— sma l l c e l l l i k e EC、小細胞コロニ一ともいう）の大きさの異なる 2種類のコロニーを区別して測定する。早い段階で出現する内皮細胞様小細胞コロニーは早期分化段階の E P Cコロニーと言え、また遅い段階で出現する内皮細胞様大細胞コロニーは晚期分化段階の E P Cコロニーであると言える。ここで「主に」とはコロニーを構成する細胞集団の約 30%、好ましくは約 50 %、特に好ましくは約 70 %力直径 20〜 50 μ mの細胞（大細胞コロニーの場合）あるいは直径 20 μπι以下の細胞（小細胞コロニーの場合）であることを意味する。

E PCコロニー形成能の測定はまた、市販のキットを使用して行うこともできる。このようなキットとしては、例えばステムセルテクノロジ一社製のキット（力タログ No. H4236) が市販されている。このキットの培地に上述した各因子を添加したものを用いることで、 E PCコロニー形成能の簡便な測定が可能となる。

本発明はさらに、本発明の培養方法により得られた E P Cを血管内皮細胞に分化させることを含む、血管内皮細胞の調製方法を提供する。 E PCの血管内皮細胞への分化は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、 EBM— 2、 E GM2 V S i n g l e Q u o t s ( C 1 o n e t i c s社）、自己血清等を用いる方法が挙げられる。

本発明の方法により得られる血液血管芽細胞、 E PC、血管内皮細胞等の細胞は、適宜単離及び/又は精製できる。例えば血液血管芽細胞の細胞表面マーカーとして CD 34、 CD 1 3 3、 E P Cの細胞表面マーカーとして KDR、血管内皮細胞の表面マーカーとして KDR、血管内皮カドヘリン（Vascular endotheli al cadherin)が公知であるので、これらの細胞表面マーカーに対して親和性を有する物質（例えば、抗体）を用いて細胞分離法に付すことで、所望の細胞が分離できる。このような細胞分離法としては、例えば、磁気細胞分離法（MAC S)、蛍光細胞分離法（FAC S) が挙げられる。

本発明はまた、本発明の方法により得られる細胞を提供する。本発明の方法により得られる細胞としては、例えば、血液血管芽細胞、 E PC、血管内皮細胞が挙げられる。本発明の方法で用いられる血液血管芽細胞及び各種因子の由来を統一することで、異種動物由来の生体成分を実質的に含有しない組成物（細胞培養物）が得られる。ここで、異種動物由来の生体成分を「実質的に」含有しない組成物とは、異種動物由来の生体成分を用いずに細胞を培養することで達成可能となった程度の品質を意味するものとする。また、細胞移植が意図される個体由来の血液血管芽細胞を用いることで、同種同系移植に好適な組成物を得ることも可能である。従って、本発明の細胞は、移植等に際して感染リスク ·拒絶反応を回避できるという利点を有する。

本発明の方法により得られる EPC、血管内皮細胞は、細胞移植により血管障害の治療に用いることができる。このような血管障害としては、例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症等の下肢虚血、バージャ一（B u r g e r ) 病）、血管損傷が挙げられる。また、皮膚潰瘍等の創傷を治癒するため、あるいは人工血管の作製に使用できる。細胞移植後の効果は、自体公知の方法により確認できる。例えば、血管障害が虚血性心疾患である場合には、移植後の心機能を、例えば収縮能と拡張能とを調べることによって評価することができる。心臓の収縮能や拡張能の測定は当分野で実施されている種々の方法によって行うことができる。例えば収縮能の測定は僧帽弁逆流波形から算出される + d pZd t値（収縮能が低下するにつれて値が下がる）や左室駆出率（％EF、収縮能が低下するにつれて値が下がる）等を、拡張能の測定であれば同様に僧帽弁逆流波形から算出される一 d p/d t値（拡張能が低下するにつれて値が上がる）や拡張末期内径（ED d) 等を測定することなどによつて行うことができる（例えば、 FASEB Journal, 18: 1392-1394 (2004)参照）。本発明はさらに、上述した因子を含有する無血清培地、及びこの無血清培地を含む血液血管芽細胞の培養用試薬を提供する。

本発明はまた、 SCF、 I L—6、 F 1 t一 3、 T P Oおよび無血清培地を含むキットを提供する。本発明のキットは、 S CF、 I L一 6、 F i t— 3、 T P Oのうち少なくとも 1つの因子が、無血清培地から隔離された形態（例えば、異なる容器中に格納された形態）で提供される。また、 SCF、 I L— 6、 F 1 t 一 3、 TPOに加え、 VEGF及び Ζ又は TGF 阻害剤が、無血清培地から隔離された形態で、又は無血清培地中に添加された形態で提供されてもよい。本発明のキットは、例えば本発明の無血清培地の作製に有用であり得る。

本発明のキットはさらに、血液血管芽細胞又はその分化細胞（例えば、 E P C、血管内皮細胞）の細胞表面マーカーに特異的な親和性を有する物質（例えば、抗体）、並びにノあるいは血液血管芽細胞又はその分化細胞の分化誘導因子（例えば、 E P Cから血管内皮細胞への分化の誘導因子）を含んでいてもよい。かかるキットは、本発明の培養方法に好適に用いられる。

以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。実施例

実施例 1 ：臍帯血 C D 1 3 3陽性細胞からの増幅

(1) 本発明の無血清培地の調製

無血清培地（S T EMS P AN, S t e m C e l l 丁 6 ）を用ぃて表1 に示す組成に基づいて本発明の無血清培地を作成した。即ち、表 1に示す各成分を所定の濃度となるように無血清培地に無菌的に添加した。表 1

表 1中、「h」はヒト由来であることを示す。「r」は組換え体であることを示す。それ以外の各略語は上述の通りである。上記無血清培地にさらに TGF— 3阻害剤を 0 μ Μ、 0. 1 μ Μ、 1 /χΜあるいは 1 0 /χ Μそれぞれ添加した無血清培地を調製した。 TG F— ]3としては、キリンビールより供与された S B— 4 3 1 5 4 2 (TGF β 1型レセプターキナーゼ活性阻害剤）を用いた。

( 2) E P Cの生体外増幅

血液血管芽細胞を含有する細胞懸濁液としては臍帯血由来の単核球を含有する細胞懸濁液を用いた。先ず、採血した血液を H i s t o p a q u e— 1 0 7 7上に重層し、密度勾配遠心分離法にて単核球を分離した。分離した単核球を P B S — EDTAで洗浄し、血小板除去後の単核球を採取し、緩衝液中に懸濁して細胞懸濁液を調製した。

次いで、細胞懸濁液を抗 CD 1 3 3抗体を用いた MAC Sに付して CD 1 3 3 陽性細胞を回収した。詳細には、 CD 1 3 3陽性細胞単離キット（M i 1 i t e n y i B i o t e c社製、カタ口グ N o . 1 3 0— 0 5 0— 8 0 1 )を用いて、添付文書のプロトコルに準じて行った。

得られた CD 1 3 3陽性細胞（CD 1 3 3 +細胞ともいう）を上記（1 ) で作成した本発明の無血清培地 1. 5 mLあたり 5 X 1 0⁴個の濃度で 3 5 mm径の P r i m a r i a 丄、 i s s u e C u l t u r e d i s h ( B D F a l c o n) に播種し、 3 7°C、 5%C0₂存在下にて 1 4日間培養した。途中、 7日後に培地を交換した。 1 μ Mの T G F— 阻害剤を添加して調製した無血清培地中で 14日間培養した細胞の様子を図 1に示す。さらに 0、 0. 1、 1及び 1 0 /^Μの TGF— ]3阻害剤を添加して調製した無血清培地中でそれぞれ 7 間、 1 4日間培養した後の細胞の数を図 2に示す。 1ゥエルあたりの細胞数及ぴ培養開始時（D a y O) に対する増幅倍数で示した。

いずれも顕著な細胞増幅が観察された。実施例 2 ：臍帯血 CD 133陽性細胞由来 E PCの生体外分化■増幅及びその評価

実施例 1で調製した種々の濃度で TGF— 阻害剤を含有する本発明の無血清培地を用いて臍帯血 CD 1 3 3陽性細胞由来 E PCを生体外増幅させ、且つ分化させた。増幅の程度はコロニー数を計測することにより、分化の程度は血液系細胞のコロニー数と E P Cコロニー数とを区別して計測することにより評価した。また E P Cコロニーについては E P C総コロニー数を計測するとともに大細胞コロニーと小細胞コロニーとを区別して計測した。具体的な手順を図 3に示す。臍帯血由来単核球の採取及ぴ無血清培地中での培養は実施例 1と同様にして行つた。無血清培地中での培養開始時点、 1週間培養後、さらにもう 1週間培養後 (計 14日間）の細胞を用いて血液系細胞のコロニー形成能を測定するためのァッセィ（以下単に血液系コロニーアツセィ）と EP Cのコロエー形成能を測定するためのアツセィ（以下単に E PCコロニーアツセィ）を行った。無血清培地での培養は、まず MAC Sカラムにて単離した CD 1 3 3陽性細胞を本発明の無血清培地 1. 5mLあたり 5 X 1 0⁴個の濃度で 35 mm径の P r i m a r i a T i s s u e Cu l t u r e d i s h (BD F a l c o n) に播種し、 3 7°C、 5%C0₂存在下にて 1週間培養し、さらに得られた増幅細胞を回収し、本発明の無血清培地 1. 5〜2. OmLあたり 1. 25 X 1 0⁵個の濃度で 3 5 mm径の P r i ma r i a T i s s u e Cu l t u r e d i s h (,Β D F a l c o n) に再度播種し、 3 7 °C、 5 % C O ₂存在下にてさらに 1週間培養した。

(血液系コロニーァッセィ）

各経過時点での細胞を 1 mLあたり 500個の濃度で 3 5 mm径の P e t r i d i s h (BD F a l c o n) に播種し、 3 7°C、 5 %C0₂存在下にて 1 2 S間培養した。 1 ²日後に d i s h上に観察されるコロニー数をカウントした。赤芽球コロニー（BFU— E)、顆粒球■マクロファージ系コロニー（CFU— G M)、マク口ファージコロニー（CFU—M)及び混合コロニー（CFU— GEM) 等の数種類のコロニーが混在していた。 B FU— Eコロニー、 CFU— GMコロニー、 C FU— GEMコロニーの 3種についてのコロニー像を図 4に示す。

(E P Cコロニーアツセィ）

まずァッセィに用いる生理活性物質含有メチルセルロース培地を調製した。メチルセルロース培地（H4236， S t em C e l l T e c.) を用いて表 2 に示す組成に基づいて生理活性物質含有メチルセルロース培地を作成した。即ち、表 2に示す各成分を所定の濃度となるようにメチルセルロース培地に無菌的に添加した。表 2

表 2中、「h」はヒト由来であることを、「_r」は遺伝子工学的に製造された組換え体であることを示す。それ以外の各略語は上述の通りである。次に、本発明の無血清培地で培養した、各経過時点での細胞を 1 8日間、上記した生理活性物質含有メチルセルロース培地で培養した。その後メチルセルロース培地を除去し、非付着性の細胞を P B Sで洗い流した。培養皿に付着した細胞のコロニーを観察したところ個々の細胞サイズの異なる 2種類の E P Cコロニーが出現していた。小さい細胞のコロニーを内皮細胞様小細胞コロニー（CFU— s ma l l c e l l l i k e EC) と、大きい細胞のコロニーを内皮細胞様大細胞コロニー（CFU— l a r g e c e l l l i k e EC) と便宜上称する。図 5は各コロニーの位相差顕微鏡による観察像である。これらのコ口- 一を a c LDL— D i I及び UEA— 1レクチン一 F I TCで二重染色した。詳細には、メチルセルロース除去後、 EGM— MV添加 EBM— 2 (5%FCS培地）（C I o n e t i c s社， S i n g l e q u o t sキット）を lm lカロえた。次いで、 a c LDL— D i lを Ι Ο μ Ι加え、 3時間培養した。 PB Sにて 2回洗浄後、上記培地及び F I丁〇標識ー11£ 1レクチン（S i gma社製）を 0. 2 μ gZm 1の濃度になるように培地に加え、 3時間培養した。 2回洗浄後、培地を交換し、蛍光顕微鏡で観察した。

結果を図 6に示す。両コロニーともに、 a c LD L_D i I及び UEA— 1レクチン一 F I TCに染色され、 E P Cとしての特徴を示した。

E P Cコロニーと確認されたコロニーの数を測定した。総コロニー数、小細胞コロニー数、及ぴ大細胞コロニー数を区別して測定した。

(結果）

血液系コロニーとして、赤芽球コロニー（B FU— E)、顆粒球'マクロファージ系コロニー（CFU— GM)、マクロファージコロニー（CFU— M) 及び混合コロニー（CFU— GEM) の 4種類のコロニーのコロニー数を合計しその出現頻度を経時的に調べた。 EPCコロニーとして、小細胞コロエー及び大細胞コロニーのコロニー数を合計して出現頻度を経時的に調べた。また総コロニー数として、 CFU— GM、 CFU— M、小細胞コロニー、大細胞コロニーのコロニー数を合計した。血液系コロニーは、無血清培地中での培養開始時の臍帯血由来の C D 1 3 3陽性単核球から形成されるコロニー数に対する、培養開始 7日後、あるいは 1 4日後の細胞から形成されるコロニー数の割合を％で表示した。 E P Cコロニーは、無血清培地中での培養開始時、培養開始 7日後、培養開始 1 4 3後の各時点での総コロニー数に対する E P Cコロニー数の割合を％で示した。結果を図 7に示す。

本発明の方法を用いた培養方法によれば血液系コロニーの頻度が減少する一方、 E P Cコロニーの出現頻度が上昇する。

さらに E P Cコロニーについて、小細胞 E P Cコロニーと大細胞 E P Cコロニ一のコロエー数をそれぞれ計測した。結果を図 8に示す。小細胞 E P Cコロエーは、無血清培地中での培養とともに漸減する傾向にあつたが大細胞 E P Cコロニ一は、培養 1週間後にピークとなり 2週間後にはやや減少する傾向にあった。また、各無血清培地中に添加される T G F— 阻害剤の濃度によって E P Cコ口エー数に影響があるかどうか調べた。結果を図 9に示す。アツセィに用いた培養皿あたりの E P Cコロニーの数、総増幅細胞から形成される総 E P Cコロニーの数で示した。本発明の無血清培地中で 2週間培養した後、 D i s h当たりの E P Cコロニー数においても、総 E P Cコロニー数においても 1 μ Μの T G F— β 阻害剤を含有する無血清培地で培養した場合が最も多くの E P Cコロニーを形成した。実施例 3 ：細胞移植療法における有効性の検討

増幅 ·分化誘導を行わない C D 1 3 3陽性細胞及び本発明の方法により増幅 - 分化誘導を行った E P C細胞をそれぞれ虚血性心疾患に対する細胞移植療法に用い、その有効性について調べた。有効性の検討は収縮能と拡張能を調べることによって行った。

( 1 ) 増幅 .分化誘導を行わなかった C D 1 3 3陽性細胞を用いた細胞移植実施例 1 ( 2 ) と同様の手順により、 C D 1 3 3陽性細胞を回収した。次いで、虚血心筋モデルラットを用意した。詳細には、ヌードラットをネンブタール麻酔下に、左第 3又は第 4肋間開胸後、心外膜を剥離した。引き続き、露出した心臓の左前下行枝環状動脈の左心耳直下部を結紮することにより得られたヌードラットを虚血心筋モデルとして使用した。上述の通り得られた CD 1 3 3陽性細胞を 1 X 1 0⁵細胞/ 1 0 0 μ L P B SZ匹、あるいは 5 X 1 0⁵細胞/ 1 00 μ L P B SZ匹の用量でこのヌードラットの梗塞辺縁部 3箇所に移植し、移植 4週間後に心機能を評価した。

(2) 増幅 ·分化誘導を行った E P C細胞を用いた細胞移植

上記（1)と同様にして単離した CD 1 3 3陽性細胞を本発明の無血清培地 1. 5 m Lあたり 5 X 1 0⁴個の濃度で 3 5 mm径の P r i m a r i a T i s s u e C u l t u r e d i s h (BD F a l c o n) に播種し、 3 7°C、 5 % C0₂存在下にて 1週間培養し、さらに得られた増幅細胞を本発明の無血清培地 1. 5〜2. OmLあたり 1. 2 5 X 1 0⁵個の濃度で 3 5 mm径の P r i m a r i a T i s s u e C u l t u r e d i s h {ΒΌ F a l c o n) に冉度播種し、 3 7°C、 5 %C0₂存在下にてさらに 1週間培養した。

無血清培地は、実施例 1で調製した各種濃度の TGF— ]3阻害剤を含有する本発明の無血清培地を用いた。

得られた生体外増幅 ·分化させた E P C細胞を 1 X 1 0⁵細胞/ 0 0 μ L P B S/匹、あるいは 5 X 1 0⁵細胞 Z 1 0 0 μ L P B S/匹の用量でヌードラット（上述と同様）の梗塞辺縁部 3箇所に移植し、移植 4週間後に心機能を評価した。

(3) 結果

増幅 ·分化誘導を行わない CD 1 3 3陽性細胞を移植した場合の結果を図 1 0 に、増幅 '分化誘導を行った EP C細胞を移植した場合の結果を図 1 1に示す。本発明の方法により増幅された細胞を用いた細胞移植は虚血性心疾患の心機能、特に収縮能を改善した。産業上の利用可能性本発明の方法により増幅された細胞を移植することにより虚血性心疾患の心機能（収縮能 ·拡張能）が改善された。すなわち、本発明の方法は、内皮系細胞を質 ·量ともに産生する上で有用と考えられ、虚血性心疾患等の血管障害を対象とした細胞移植療法の有用な方法となり得る。本出願は、日本で出願された特願 2 0 0 5— 0 4 7 8 1 6 (出願日： 2 0 0 5 年 2月 2 3日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1. 幹細胞因子、インターロイキン 6、 FMS様チロシンキナーゼ 3及ぴトロンボポェチンを含有する無血清培地において血液血管芽細胞をィンキュベートすることを含む、血液血管芽細胞の培養方法。

2. 血液血管芽細胞のインキュベートにより血管内皮前駆細胞が増幅される血管内皮前駆細胞の増幅方法である、請求項 1記載の方法。

3. 血液血管芽細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、請求項 1記載の方法。

4. 血液血管芽細胞が単核球である、請求項 1記載の方法。

5. 血液血管芽細胞が、 CD 34陽性および/または CD 1 33陽性である、請求項 1記載の方法。

6. 血液血管芽細胞、および無血清培地に添加される各種因子が、同種動物に由来する、請求項 1記載の方法。

7. 血液血管芽細胞がヒト由来である、請求項 1記載の方法。

8. 無血清培地が、血管内皮細胞増殖因子及び/又はトランスフォーミング増殖因子阻害剤をさらに含有する、請求項 1記載の方法。

9. 請求項 2記載の方法により得られる、血管内皮前駆細胞。

10. 請求項 2記載の方法により得られる血管内皮前駆細胞を含み、且つ血管内皮前駆細胞の由来する動物に対して異種の動物由来の生体成分を実質的に含有しない、組成物。

1 1. 同種移植用である、請求項 1 0記載の組成物。

12. 血管内皮前駆細胞がヒト由来である、請求項 1 1記載の組成物。

1 3. 虚血性疾患の予防 '治療剤である、請求項 1 2記載の組成物。 -

14. 幹細胞因子、インターロイキン 6、 FMS様チロシンキナーゼ 3及びトロンボポェチンを含有する無血清培地。

15. 幹細胞因子、インターロイキン 6、 FMS様チロシンキナーゼ 3、トロンボポェチンおよび無血清培地（幹細胞因子、インターロイキン 6、 FMS様チロシンキナーゼ 3およびトロンボポェチンのうち少なくとも 1つの因子は、無血清培地中に添加されていない）を含む、幹細胞因子、インターロイキン 6、 FMS 様チロシンキナーゼ 3およびトロンボポェチンを含有する無血清培地の作製用キッ卜。