WO2006025158A1 - 光学的測定装置および方法並びにナノ粒子測定方法および装置 - Google Patents

Abstract

　プローブ光の調整のみで過渡回折格子法を用いた測定ができる光学的測定装置と、同様の原理を用いたナノ粒子測定装置を提供する。電源１５と、試料を保持する容器１１、電気力線密度が高い領域と電気力線密度が低い領域とが規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる電極対１３，１４と、電極対１３，１４への電圧の印加による試料中の粒子の誘電泳動を利用した過渡回折格子の発生と電圧印加の変化に伴う試料中の粒子の拡散による過渡回折格子の変化を制御する誘電泳動制御部１９と、過渡回折格子に向けて光を照射する光源１６と、過渡回折格子による回折光を検出する光検出器１８を備え、過渡回折格子によって生じる回折光の強度変化から粒子に関する評価を行う。また、これと同じ原理でナノ粒子の粒子径等を測定することにより、動的散乱法に比して信号強度が強く、感度およびＳ／Ｎの向上を可能とする。

Description

明 細 書

光学的測定装置および方法並びにナノ粒子測定方法および装置 技術分野

[0001] 本発明は、液体中に存在する粒子 (例えば淡白などの生体分子、各種の微粒子な ど）の拡散に関する情報を、粒子により生じる過渡回折格子による回折光を利用して 計測する光学的装置および方法と、同等の原理を用いて直径が lOOnm以下のいわ ゆるナノ粒子の粒子径を測定する方法および装置に関する。

本発明の方法、装置は、例えば創薬、バイオテクノロジー、食品などの分野での分 子の調査、研究に適用することができる。また、拡散係数の計測により、粒子の粒径 を計測する粒子計測分野に適用することができる。

背景技術

[0002] 粒子の拡散を測定する手法のひとつに過渡回折格子法がある。例えば、過渡回折 格子法を用いて拡散定数を計測し、拡散定数変化による蛋白質の会合検出を行うこ とが開示されている（日本特開 2004— 85528号参照）。

従来の過渡回折法では、図 6に示すように、 2つの同一波長のパルス励起光を、互 いに交差するようにして試料に照射し、干渉縞を形成する。パルス励起光による干渉 縞の明部分に存在する試料中の分子 (粒子）は、局所的に光励起されるのに対し、 干渉縞の暗部分に存在する試料中の分子 (粒子）は、光励起されないことから、干渉 縞領域では、励起分子と非励起分子とが交互に規則的に並ぶように存在し、一時的 に回折格子 (過渡回折格子という）が形成される。

[0003] この過渡回折格子が形成された領域に、別途にプローブ光を照射すると、プローブ 光は過渡回折格子によって回折されることになる。そして、ノ ルス励起光照射によつ て励起分子、非励起分子による過渡回折格子が形成された後、時間経過とともに励 起分子、非励起分子が拡散することによって混ざり合い、過渡回折格子が崩れてくる と、過渡回折格子によるプローブ光の回折光強度が減衰することになる。このときの 回折光強度の減衰曲線は、試料中の分子の拡散定数 (拡散係数)を現わしているこ とから、減衰曲線を測定することにより、試料中の分子の拡散係数を計算することが でき、さらには、拡散係数から、試料中の粒子の大きさ (粒径)や形状、溶媒との相互 作用に関する情報を取得することができる。

[0004] また、粒子径が lOOnm以下の粒子は、一般にナノ粒子と称され、同じ材質であつ ても通常のバルタ物質とは異なる性質を表すことから、さまざまな分野で利用され始 めている。粒子径を測定する方法としては、レーザ回折 ·散乱式をはじめとして種々 のものが知られている力 粒子径が lOOnm以下のナノ粒子については、主として動 的散乱法 (光子相関法)と称される測定方法に基づく方法が用いられている (例えば 、米国特許第 5, 094, 532号および日本特開 2001— 159595号を参照。；)。

[0005] 動的散乱法は、粒子のブラウン運動を利用したものであり、媒体中でブラウン運動 をしている粒子に光ビームを照射し、粒子による散乱光の強度を所定の位置で測定 して、粒子のブラウン運動に起因する散乱光強度の揺らぎ、つまり散乱光の経時的 変化を捕らえ、各粒子がその粒径に応じた激しさでブラウン運動をすることを利用し て被測定粒子群の粒度分布を算出する。

特許文献 1 :特開 2004— 85528号公報

特許文献 2 :米国特許第 5, 094, 532号明細書

特許文献 3：特開 2001— 159595号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 前述した従来の過渡回折格子法では、同一波長の 2本の励起光を交差させて干渉 縞を形成するために、光路長をほぼ揃えた 2本の励起光を測定領域に導くととともに 、発生した干渉縞に基づいて形成される回折格子に対し、特定の入射角を持ったプ ローブ光を入射させている。そのため、 2本の励起光と 1本のプローブ光とを、測定し ようとする 1点で交差させる必要があり、励起光、プローブ光の 3本の光軸調整が必要 になり、調整作業が困難である。

[0007] また、蛋白質などの分子 (粒子)を試料とする場合に用いる励起光には、波長が短 いエキシマレーザなどの大型のレーザが必要となるため、装置が大型化してしまう。 また、蛋白質などの分子 (粒子)を試料とする場合には、通常、蛋白質分子 (粒子） 自体のみでは、励起光によって屈折率、吸収係数、拡散係数が変化することはない ので、光励起される試薬 (蛍光試薬など）により試料物質をラベルイ匕する必要がある。 し力しながら、試料に対しラベルイ匕処理を施すことにより、測定対象の蛋白質分子（ 粒子）の性質、特性が変化してしまうおそれがある。

また、一般に、ラベル化処理は、不可逆反応であるため、ラベル化処理により、試 料中の分子 (粒子）自体が破壊されてしまい、同一試料を用いた再測定ができず、ま た、回収して他の目的で再利用することもできない。さらに、過渡回折格子を形成す るための光励起反応についても一般には不可逆反応であり、励起光が照射され一度 測定された試料力もは、それ以後は、弱い信号しか発生しなくなるので、再測定する ことができない。

[0008] また、蛋白質などのラベル化処理が容易な分子以外を試料とする場合では、物質 によってはラベルィヒ処理ができず、励起光による粒子の光励起自体が困難であって

、上述した過渡回折格子法による測定が困難なこともある。

[0009] そこで、本発明の第 1の課題は、励起光が不要であり、また、 2本の励起光、プロ一 ブ光間の光軸調整を行うことなく過渡回折格子法を用いた測定が可能な光学的測定 装置を提供することを目的とする。

同時に本発明は、試料のラベル化処理を行うことなぐ過渡回折格子を用いて、試 料の拡散に関する特性を測定することができる光学的測定装置を提供することを目 的とする。

[0010] 一方、ナノ粒子の測定に関し、粒子力 の散乱光の揺らぎを測定する動的散乱法（ 光子相関法）においては、大きな散乱光中の小さな揺らぎを測定する必要があること 、換言すれば明るい視野中での光強度の変動を計測する必要があることから、その 原理上、測定感度が低いとともに、 SZNが悪いといった問題は避けられない。

[0011] そこで、本発明の第 2の課題は、従来の動的散乱法に比して、ナノ粒子の粒子径を 、高 、感度で良好な SZNのもとに測定することのできる方法および装置を提供する ことにある。

課題を解決するための手段

[0012] 前記した第 1の課題を解決するためになされた本発明の光学的測定装置は、電源 と、液体試料またはゲル試料を保持する容器と、電圧を印加することにより容器内の 一部に電気力線密度が高 ヽ領域と電気力線密度の低 ヽ領域とが規則的に並ぶ電 気力線分布を発生させる電極対と、電極対への電圧の印加による液体試料中の粒 子の誘電泳動を利用した過渡回折格子の発生と電圧印加の変化に伴う液体試料中 の粒子の拡散による過渡回折格子の消滅を制御する誘電泳動制御部と、過渡回折 格子に向けて光を照射する光源と、過渡回折格子による回折光を検出する光検出器 とを備え、過渡回折格子によって生じる回折光の強度変化力 粒子に関する評価を 行うようにしている。

[0013] 本発明の光学的測定装置によれば、電極対に対して、電源から電圧を印加するこ とにより、容器内の一部に、電気力線密度が高い領域と電気力線密度が低い領域と が規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる。容器内の液体試料またはゲル試料中 に含まれる粒子には、この電気力線分布によって誘電泳動作用が生じ、粒子の移動 が生じる。すなわち、容器内には、電極対の配置によって規則的に並ぶ電気力線分 布が発生して 、ることから、液体試料中の粒子またゲル試料中の粒子が誘電泳動作 用によって電気力線密度が高い領域に集中することによって、粒子の密な領域と疎 な領域とが規則的に並ぶようになり、過渡回折格子が形成される。

この過渡回折格子に対して、光源力もプローブ光を照射すれば、過渡回折格子に より、特定方向に回折光が発生することになる。回折光は、誘電泳動作用によって、 過渡回折格子が安定して発生しているときには強い回折光が生じている。電圧印加 によって過渡回折格子が安定して発生している状態で、電圧印加を変化、例えば停 止させると、電気力線が変化ないしは消滅し、誘電泳動が変化もしくは停止する。そ のため、容器内の粒子には、拡散による移動が生じるようになり、過渡回折格子が崩 れてぼやけるようになる。その結果、過渡回折格子によって生じる回折光の強度が、 時間経過とともに減衰するようになる力 このときの減衰曲線は、拡散係数を現わして いるので、回折光強度を光検出器により測定し、回折光強度の減衰曲線を得ること で、粒子の拡散係数、さらには、粒子の形状、粒子径、溶媒との相互作用の情報を 得るよう〖こする。

[0014] また、別の観点力もなされた本発明の光学的測定方法は、電圧印加により液体試 料中に電気力線密度が高い領域と電気力線密度の低い領域とが規則的に並ぶ電 気力線分布を発生させる電極対を用い、電極対に電圧を印加して液体試料中の粒 子に誘電泳動を引き起こして粒子による過渡回折格子を形成し、続いて電圧印加を 変化させて過渡回折格子を形成する液体試料中の粒子を拡散させ、このときの過渡 回折格子による回折光の強度変化を検出することにより、粒子に関する評価を行うよ うにする。

[0015] この発明の光学的測定方法によれば、電極対に電圧を印加して液体試料中の粒 子に誘電泳動を引き起こし、試料液体中の粒子を電気力線密度が高い領域に集中 させて、粒子による過渡回折格子を形成する。続いて、電圧印加を変化させて液体 試料中の過渡回折格子を形成する粒子を拡散させ、過渡回折格子を時間経過ととも に崩していく。このときの過渡回折格子の変化に伴う回折光の強度変化を検出するこ とにより、粒子に関する評価を行うようにする。

[0016] また、前記した第 2の課題を解決するため、本発明のナノ粒子測定方法は、媒体中 に移動可能に分散させた粒子群、もしくは粒子が分散してなるゲル状の試料に対し、 空間周期を有する電界を印加することにより当該粒子群に空間周期的な濃度変化を 持たせて疑似的な回折格子を生成させ、その状態で粒子群に対して光を照射して得 られる回折光を検出し、上記電界を変化させた時点からの回折光の時間変化から、 粒子群の拡散係数および粒子径を算出することによって特徴づけられる。

[0017] また、本発明のナノ粒子測定装置は、請求項 1に係る発明方法を用いた測定装置 であって、被測定粒子群を媒体中に移動可能に分散させた試料、もしくは被測定粒 子群が分散してなるゲル状の試料を保持する試料保持手段と、その試料保持手段 内の試料に対して空間周期を有する電界を印加する電極およびその電源と、試料保 持手段内の試料に光を照射する光源と、その光が試料を透過することにより生じる回 折光を検出する検出光学系と、その検出光学系の出力を取込み、上記電界の印加 により被測定粒子群に空間周期的な濃度変化を生成させた状態で電界の印加を変 ィ匕させた時点からの回折光の時間的変化力 被測定粒子群の拡散係数および粒子 径を算出するデータ処理手段を備えていることをによって特徴づけられる。

[0018] ここで、本発明のナノ粒子測定装置にお!/ヽては、上記試料保持手段が試料を収容 する透明なセルであり、上記電極が、当該試料セルに対して装着され、所定の間隔 で互いに平行に伸びる部分を含む透明電極である構成を好適に採用することができ る。

[0019] 本発明のナノ粒子測定方法および装置は、媒体中で拡散状態の粒子群に電界を 印加することによって、粒子群の空間的な濃度変化による擬似的な回折格子を生成 し、その回折格子による回折光を検出しつつ、電界の印加を変化させて粒子群が再 び拡散状態となる間の回折光の変化から、粒子群の拡散係数と粒子径を算出するこ とにより、課題を解決するものである。

[0020] すなわち、媒体中に拡散して!/、る粒子群はゼータ電位を有して 、るため、その粒子 群に対して空間周期を有する電界を印加することにより、粒子群はその電界に応じて 媒体中を移動し、これによつて粒子群に空間周期的な濃度変化が生じ、粒子群によ る回折格子が生成される。その状態で電界の印加を変化、例えば停止すると、粒子 群は濃度が均一となるように再び拡散状態に戻り、回折格子は消失する。粒子が小 さければ回折光ははやく消失し、粒子が大きければ回折光はゆっくりと消失する。粒 子群による回折格子の生成状態力 その回折格子が消失する間、粒子群に光を照 射して回折光を検出すれば、回折光の消失に要する時間を知ることができ、この時 間から後述する（2) , (3)式を用いて粒子群の拡散係数と粒径を求めることができる

[0021] 粒子群による疑似回折格子に光を照射することによって発生する回折光は、粒子 群を透過する光に対して、光の波長、回折格子の間隔に応じた角度で進行し、かつ 、動的散乱法で得られる個々の粒子による散乱光に比して強いため、測定する信号 が強ぐ動的散乱法に比して SZNおよび感度が大幅に改善される。

[0022] 本発明のナノ粒子測定装置においては、媒体中に被測定粒子群を移動可能に分 散させた試料を保持する試料保持手段として透明なセルを用い、この試料に対して 電界を印加するための電極として、透明セルに装着され、所定の間隔で互いに平行 に伸びる部分を含む透明電極とし、特に、その屈折率を透明セルの構成材料の屈折 率と近似させることにより、電極が回折光に及ぼす影響を少なくすることができて好適 である。

図面の簡単な説明 [0023] [図 1]本発明の光学的測定装置の実施の形態の構成を示す斜視図である。

[図 2]図 1の光学的測定装置の電極部分の形状を示す平面図である。

[図 3]電極に交流電圧を印カロしたときに形成される過渡回折格子を説明する図である 圆 4]過渡回折格子を形成後に電圧を停止して粒子を拡散させたときの状態を説明 する図である。

[図 5]本発明の光学的測定装置による印加電圧波形 (A)と回折光強度 (B)のタイム チャートを示す図である。

[図 6]本発明のナノ粒子測定装置の実施の形態の構成図であり、光学的構成を表す 模式図と、電気的構成を表すブロック図と併記して示す図である。

[図 7]図 6における試料セル 1の構造説明図であり、 (A)はレーザ光の照射方向から 見た模式的正面図で、 (B)はその B— B線で切断した模式的拡大断面図である。

[図 8]本発明のナノ粒子測定装置の実施の形態の作用説明図である。

[図 9]本発明のナノ粒子測定装置の実施の形態における透明電極 13に対する電圧 の ONZOFFのタイミングと、回折光強度の関係の例をグラフである。

[図 10]本発明のナノ粒子測定装置の他の実施の形態における試料セルの電極構成 の例の説明図である。

[図 11]本発明のナノ粒子測定装置の更に他の実施の形態における試料セルの電極 構成の例の説明図である。

[図 12]従来力もの過渡回折格子法を説明する図である。

符号の説明

[0024] 11 容器

12a 底板

12b 枠体

13, 14 電極

13a〜13d, 14a〜14d 直線状電極片

13e, 14e 接続部

15 交流電源 16 光源

17 レンズ系

18 光検出器

19 誘電泳動制御部

21 試料セル

31 透明ガラス

33 透明電極

33a 指部

22 電極電源

23 レーザ光源

24 検出光学系

24a ピンホーノレ

24b フォトダイオード

25 ビームストッパ

26 装置制御およびデータ取込み ·処理装置

P 粒子

W 試料

発明を実施するための最良の形態

[0025] 以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。なお、本発明は、以下 に説明するような実施形態に限定されるものではなぐ本発明の趣旨を逸脱しない範 囲で種々の態様が含まれることは 、うまでもな 、。

[0026] 図 1は、本発明の一実施形態である光学的測定装置の構成を示す斜視図であり、 図 2はその電極部分の構成を示す平面図である。この光学的測定装置は、誘電泳動 作用を利用しつつ光学的測定を行うものであり、粒子を含む液体試料を保持する容 器 11、容器 11の底面となる底板 12aに形成される一対の電極 13, 14と、電極 13お よび電極 14に交流電圧を印加する交流電源 15と、光源 16と、光源光を収束するレ ンズ光学系 17と、回折光を検出する光検出器 18と、交流電源 15から電極 13, 14へ の電圧印加を制御する誘電泳動制御部 19とからなる。 [0027] 容器 11は、底板 12aの上に、側壁となる枠体 12bを貼り付けることにより形成してあ る。この容器 11は、ガラス等の光透過性の材料が用いられ、底板 12aを通して、入射 光が電極 13, 14の間の間隙部分に照射できるようにしてある。なお、入射光が照射 される部分以外の容器部分は、光透過性材料以外のものを用いてあるいは遮光部 材を設けて、不要な光の入射を遮断し、検出感度を高めるようにしてもよい。

[0028] 電極 13, 14は、マスクパターユング手法を用いて，底板 12a上に形成される。なお 、本実施形態では、底板 12aに電極 13, 14を形成しているが、容器 11が十分に深 い場合には、底板 12aに代えて、側壁となる枠体 12bに電極 13, 14を形成してもよ い。

電極 13は、平行な直線状の電極片 13a, 13b, 13c, 13dが一定間隔を空けて平 行に並べられるとともに、これらの直線状電極片の片側端どうしを電気的に接続する 接続部 13eが設けられ、 、わゆる櫛型電極を形成して！/、る。

電極 14についても同様であり、平行な直線状の電極片 14a, 14b, 14c, 14dがー 定間隔を空けて平行に並べられるとともに、これらの直線状電極片の片側端どうしを 電気的に接続する接続部 14eが設けられ、 、わゆる櫛型電極を形成して！/、る。 そして、電極 13と電極 14とは、直線状電極片 13a, 14aの片側端どうし、直線状電 極片 13b, 14bの片側端どうし、直線状電極片 13c, 14cの片側端どうし、直線状電 極片 13d, 14dの片側端どうしが、それぞれ、間隙 Sを空けて対向配置するようにして ある。

[0029] 電極 13, 14の寸法は、直線状電極片の電極幅 dl、直線状電極片間の間隔 d2の いずれについても、 0. 5 m〜20 m程度でそれぞれ一定寸法にするのが好まし いが、一定間隔ごとに各間隙 Sが配置され、電圧を印カロしたときに各間隙 Sの部分に 電気力線密度が高い領域が発生し、その隣に電気力線密度が低い領域が発生する ものであれば、形状や寸法は、特に限定されない。例えば、電極幅 dlと電極間隔 d2 とが異なる寸法になるようにしてもょ 、し、電極片の形状が直線状でなくてもよ 、。

[0030] 交流電源 15には、液体中の粒子に誘電泳動を引き起こすことができる電圧、周波 数の交流電源が用いられる。具体的には、 1〜： LOOV, 10KHz〜10MHz程度の交 流電圧が印加できる交流電源を使用する。なお、一般的には、高周波電源を用いる のが好ましい。

[0031] プローブ光を照射するための光源 16は、測定対象となる液体試料に応じて種類を 選択すればよいが、例えば、 He— Neレーザ光源（波長 633nm)や、その他のレー ザ光源を用いるのが好まし 、。

レンズ光学系 17は、光源光を収束し、電極 13, 14の間の間隙 Sを含む過渡回折 格子が形成される領域 Aに、光源光が照射できるように光軸が調整される。なお、光 源光の入射角度が調整できるようにして、測定対象、測定目的に応じて、透過回折 光、反射回折光のいずれでも、取得できるようにするのが好ましい。例えば、透過回 折光による測定を行う場合は、入射角は、容器底面と液体試料との界面で全反射が 生じない条件に設定される。

[0032] 光検出器 18は、透過回折光を検出する場合は、液体試料の上部側に配置する。

光検出器 18には、回折角を測定するための角度調整機構が設けられており、回折 光の強度とともに回折角が検出できるようにしてある。この光検出器 18には、フォトダ ィオードや CCDが用いられる。なお、角度調整機構を設ける代わりに、複数の素子 を並べたアレイセンサを用いて、回折角が計測できるようにしてもよ!、。

[0033] 誘電泳動制御部 19は、いわゆる CPU, ROM, RAMなどからなるコンピュータによ り構成され、予め記憶されたプログラムにより、交流電源 15から電極 13, 14に対して 、過渡回折格子を形成するために必要な交流電圧を、必要な時間だけ印加し、その 後、電圧印加を停止して粒子の拡散を引き起こす制御を行う。

[0034] 次に、上記装置の計測動作について説明する。予め、光源 16から領域 Aに入射光 が照射できるように光学系を調整しておく。

まず、誘電泳動制御部 19の制御により、交流電源 15から電極 13、電極 14間に交 流電圧 Vを印加する。液体試料中に粒子 (例えば蛋白質など）が存在すると、交流

0

電圧による誘電泳動作用が働き、粒子は電気力線が集中する領域に移動する。図 3 は、交流電圧を印加したときの粒子の状態を説明する図である。図に示すように、電 気力線が集中する間隙 S部分に粒子が移動することにより、粒子が密な領域 Bと疎な 領域 Cとが交互に並び、粒子による過渡回折格子が形成される。

このとき、領域 Aに入射した光源 16からの入射光は、過渡回折格子によって回折さ れ、特定方向に回折光を生じる。交流電圧が継続して印加されているときは、過渡回 折格子は、安定して存在しているので、過渡回折格子による強い強度の回折光が光 検出器 18により検出される。これを基準値として計測しておく。

[0035] 続いて、誘電泳動制御部 19の制御により、電極 13, 14への交流電圧の印加を停 止する。これにより、誘電泳動作用が停止することになり、間隙 Sに集中していた粒子 は、拡散により、しだいに広がっていく。その結果、過渡回折格子が崩れて、しだいに 薄くぼやけるようになり、やがて図 4に示すように、過渡回折格子が消滅する。過渡回 折格子が薄くなつていく課程で、回折光の強度が弱くなるので、回折光強度の強度 変化を光検出器 18で測定する。

[0036] 以上の計測動作により得られる回折光の強度変化のタイムチャートを、印加電圧の 波形とともに図 5に示す。誘電泳動を停止した後の減衰曲線は、拡散係数に依存す るので、減衰曲線力も拡散係数を求めることで、粒子の拡散に関する情報を得ること ができる。

[0037] (他の実施形態）

上記実施形態では、透過回折光を検出したが、反射回折光を検出してもよい。反 射回折光を利用すれば、光吸収性のある液体試料についても、回折光の検出を容 易に行うことができる。

なお、反射回折光を測定する光学的測定装置の場合は、図 1に示した装置構成に おいて、光検出器 18の位置を、底板 12aの下部側に配置するようにする。

反射回折光測定の場合、好ましくは、光源 16から照射される入射光の入射角を、 全反射が生じる条件にして、反射する回折光の光量をできるだけ増やすようにする。 例えば、容器 11が、ガラス製であり、液体試料として水系試料が保持されている場合 、入射角を 46度前後にするのが好ましい。

[0038] また、上記実施形態では、電極 13, 14はそれぞれの直線状の電極片の片側端どう しが対向するようにし、電極間の間隙部分に過渡回折格子を形成するようにしたが、 電極の形状パターンはこれに限られず、要するに、電圧を印加したときに、電気力線 密度が高い領域と電気力線密度が低い領域とが交互に規則的に並ぶ形状であれば 、誘電泳動による過渡回折格子を形成することができるので、本発明を実施すること ができる。

[0039] 更に、以上の実施の形態にお!ヽては、粒子を分散させた液体試料を測定した例を 示したが、粒子が分散しているゲル試料についても測定可能である。そして、交流電 圧の印加に代えて直流電圧を印加しても上記と同様な測定が可能であり、また、過 渡回折格子を形成してカゝら電圧の印加を停止して粒子を拡散させた例を示したが、 電圧の印加を停止することに代えて、印加電圧を変化させてもよぐこの場合、交流 電圧を用いる場合にはその周期や振幅を変化させることによって粒子を拡散させて ちょい。

[0040] 次に、本発明のナノ粒子測定装置についての実施の形態を説明する。

図 6は本発明のナノ粒子測定装置の実施の形態の構成図であり、光学的構成を表 す模式図と、電気的構成を表すブロック図とを併記して示す図である。また、図 7は図 6における試料セル 21の構造説明図であり、 (A)はレーザ光の照射方向から見た模 式的正面図で、（B)はその B— B線で切断した模式的拡大断面図である。

[0041] 試料セル 21は、互いに微小な隙間を開けて対向する平行な透明ガラス 31, 32を その周壁の一部として含んでおり、使用状態ではこれらの透明ガラス 31, 32が鉛直 方向に沿うように配置される。各透明ガラス 31, 32には、互いに対向する位置にそれ ぞれ上下方向に一定の間隔 Δを開けて水平に伸びる多数の指部 33aを備えた櫛形 の透明電極 33が装着されている。この透明電極 33には、電極電源 22から +もしくは 一の直流電圧が選択的に供給される。透明電極 33への電圧の供給により、試料セ ル 21内の試料には指部 33aのパターンに応じた空間周期を有する電界が印加され ることになる。なお、透明電極 33の材料としては、例えば ITOを採用することができる 。この ITOは屈折率が約 2. 0程度であり、試料セル 21の透明ガラス 31として、屈折 率 2. 0程度の高屈折率ガラス (例えばオハラ社製商品名 S—LAH79 ;屈折率 2. 0) を用いることにより、後述するレーザ光の照射時に透明電極 33による回折光が実質 的に生じることがなぐ好適である。

[0042] 試料セノレ 21には、その一方の透明ガラス 31側からレーザ光源 23からのレーザ光 がほぼ水平に照射される。試料セル 21を挟んでレーザ光源 23の反対側には、後述 するように試料セル 21を通過するレーザ光の回折光を検出するための検出光学系 2 4が配置されている。この検出光学系 24は、レーザ光源 23からのレーザ光の光軸 L に対して後述する角度 Θの位置に配置されており、ピンホール 24aとフォトダイオード 24bによって構成されている。また、レーザ光軸 L上には、試料セル 21を通過したレ 一ザ光が検出光学系 24や外部などに漏れることを防止するためのビームストッパ 25 が配置されている。

[0043] フォトダイオード 24bにより検出された回折光は、装置制御およびデータ取込み'処 理装置 26に取り込まれ、後述する演算によって被測定粒子群の拡散係数と粒子径 の算出に供される。なお、この装置制御及びデータ取込み'処理装置 26は、以上の データ処理のほか、装置全体の制御を行うものであって、例えばパーソナルコンビュ ータとその周辺機器によって構成することができる。

[0044] 次に、以上の構成力もなる本発明の実施の形態による測定動作を、その原理ととも に述べる。

試料セル 21内には、被測定粒子群であるナノ粒子群を水などの媒体中に分散させ た状態の試料が充填される。通常、液中に分散しているナノ粒子の表面は、 +もしく は—の表面電位 (ゼータ電位)を持っている。つまり帯電している。前記した透明電極 33には、粒子が持つ荷電と同じ極性の電圧が印加される。例えば粒子が +の電荷 を持っている場合には、透明電極 33には +の電圧が印加される。ここで、粒子のゼ ータ電位が小さい場合には、分散剤 (界面活性剤)や、媒液の PHを変化させるなど の方法で表面電位を調整することができる。

[0045] 図 8 (A)に示すように、試料 W中の被測定粒子 Pが +の電荷をもっている場合には 、電極 33に +の電位を印加する。これにより、各粒子 Pはクーロン力により電極 33の 各指部 33aに対して反発し、図 8 (B)に示すように、電極 33の各指部 33aの間に移 動し (電気泳動）、多数の粒子 Pによって指部 33aのパターンに応じた空間周期を有 する擬似的な回折格子が生成される。この状態で試料セル 1に対して照射されるレ 一ザ光は、この多数の粒子 Pによる回折格子により回折する。電極 33の指部 33a間 の距離を上記のように Δ、レーザ光の波長 λ、回折角を Θ、次数を mとすると、 m l = A - sin 0 · · (1)

の関係が成立する。例えばえ =0. 6328 μ m、指部 33a間の距離 Δを 3 μ mとしたと き、 1次の回折光は Θ ^ 12° の角度に現れる。前記した検出光学系 24はレーザ光 の光軸 Lに対してこの角度 Θの位置に配置されており、この回折光の強度を検出す る。

[0046] 図 8 (B)のように試料に対して電圧により擬似的な回折格子が生成されている状態 から、透明電極 33への電圧の印加を停止して電界を消失させると、図 8 (C)に示すよ うに、各粒子 Pは再び拡散状態に戻る。粒子 Pの拡散により擬似的な回折格子は消 滅し、回折光も消失する。電界の消失時点力 回折光が消失する時間は、粒子の拡 散時間に依存するので、回折光の消失時間を計測することにより、以下に示すように 粒子の拡散係数 Dを算出することができる。また、この拡散係数 Dから粒子径を算出 することができる。

[0047] 図 9に透明電極 33に対する電圧の ONZOFFのタイミングと、回折光強度の関係 の例をグラフで示す。粒子 Pの径が大きい場合には、電界の消失時点から粒子 Pが 拡散して回折格子が消失するまでに要する時間が長ぐ逆に粒子 Pの径カ 、さい場 合にはその時間は短くなる。

[0048] 拡散による粒子 Pの濃度変化は以下の拡散方程式で表される。

[0049] [数 1] d u ( x， t )

=div [ D glad { u ( x , t ) } ] · · ( 2 )

d t

[0050] ここで、 u (x, t)は粒子濃度であり、 xは指電極 33aの間隔 d方向への空間座標で、 t は時間である。

[0051] 粒子濃度の変化に対する回折光強度の変化をあらかじめ求めておくことにより、回 折光強度の経時的変化を検出することで、（2)式を用いて粒子 Pの拡散係数 Dを算 出することができる。

[0052] また、拡散係数 Dと粒子径 dの関係は、ボルツマン定数 kと絶対温度 T、および媒液 の粘性率 を用いて、以下の Einstein— Stokesの関係式で表される。

0

[0053] [数 2] k T

D = ( 3 )

3 7c 。 d

[0054] 装置制御及びデータ取込み'処理装置 26は、電極 33に印加する電圧を ON 'OF Fするタイミングと、回折光強度をサンプリングするタイミングを同期させることにより、 回折光の消失時間を正確に測定することができ、その測定結果を用いて（2)式を計 算することによって拡散係数 Dを求めることができ、その拡散係数 Dを用いて（3)式を 計算することによって被測定粒子 Pの粒子径 dを算出することができる。

[0055] 以上の実施の形態にお!、て特に注目すべき点は、拡散係数 Dおよび粒子径 dを求 めるための信号が、従来の動的散乱法のように個々の粒子力 の散乱光の揺らぎの 測定信号ではなぐ多数の粒子群により形成された擬似的な回折格子による回折光 の測定信号である点であり、これにより、動的散乱法に比して感度並びに SZNが大 幅に向上する。

[0056] ここで、以上の実施の形態において、試料セル 21の透明ガラス 31, 32と透明電極 33の屈折率差により回折光が発生する場合があり、この場合、その回折光強度が検 出光学系 24によって検出されることになる力 この回折光は時間的に変化しないた め、測定後に全体の回折光強度から変化しない回折光強度分を減じることにより、測 定への影響はない。

[0057] また、以上の実施の形態においては、試料セル 21の互いに対向する透明ガラス 31 , 32に透明電極 33を対向して装着した例を示した力 図 10に示すように、互いに対 向する 2枚の透明ガラス 31, 32のうちの一方にのみ、先の例と同等の指部 33aを有 する透明電極を装着してもよぐこの場合においても粒子 Pは各指部 33aに電圧を印 加することによって先の例と同等の擬似的な回折格子を形成する。

[0058] 更に、本発明においては、図 11に示すように、透明ガラス 31および Zまたは 32に 、先の例と同等の指部 33aを備えた透明電極と、これとは逆極性の電圧が印加される 指部 34aを備えた透明電極を装着し、各指電極 33a, 34aを交互に配置した電極構 成を採用することもできる。この場合、例えば +に帯電している粒子 Pは—電圧が印 加されて!、る指電極 34aに沿うように移動して擬似的な回折格子を形成し、この粒子 群による回折格子の間隔は、指電極 33a, 34aによる回折格子の間隔の 2倍となり、 粒子群による回折光と、電極による回折光とは互いに異なる回折角を持っため、電 極による回折光の影響をより少なくし得るという利点がある。

[0059] また、以上の実施の形態にお!、ては、被測定粒子群を媒液中に分散させた例を示 したが、媒体としては液体のほか気体としてもよぐ更には、粒子の種類によっては固 体中に移動可能に分散しているものもあり、この場合には固体を媒体とすることもでき る。更に、粒子が分散したゲル状の試料であっても同様に測定可能である。

[0060] 更に、以上の実施の形態では粒子による回折格子に対してレーザ光を照射してそ の回折光を測定したが、レーザ光以外の光であってもよい。また、粒子により疑似回 折格子を形成した後、電極に対する電圧の印加を停止することに代えて、印加電圧 を例えば小さくして粒子を拡散させてもよい。

産業上の利用可能性

[0061] 本発明の光学的測定装置によれば、蛋白などの生体分子や各種微粒子の光学的 測定を、励起光を用いることなく過渡回折格子を形成することができ、プローブ光だ けを測定位置に光軸調整すればよぐ容易に過渡回折格子を用いた測定を行うこと ができる。また、本発明の光学的測定装置および方法を用いると、試料のラベル化処 理を行う必要がなぐかつ、光励起することなぐ過渡回折格子を用いて試料の拡散 のしやすさなどの特性を測定することができることから、試料の再測定が可能であり、 試料自体の再利用が可能である。

[0062] また、本発明の光学的測定装置にお!/ヽて、電極対を構成するそれぞれの電極が一 定間隔を空けて並ぶ複数の電極片とこの電極片どうしを電気的に接続する接続部と からなり、一方の電極における各電極片の片側端力 間隙を空けて他方の電極にお ける各電極片の片側端に対向するように配置されるようにすれば、電気力線密度の 高い領域は、各電極片の片側端どうしが対向する間隙の位置に集中し、その隣接領 域に電気力線密度の低い領域が集中することにより、各電極片の片側端どうしが対 向する間隙の位置に沿って、過渡回折格子が生じるので、電極対が存在しない領域 (対向する電極の間の間隙部分）に過渡回折格子が発生することになり、電極対によ る影響を受けることなぐ過渡回折格子のみによる回折光強度の変化を測定すること ができる。

[0063] 本発明のナノ粒子測定方法および装置では、比較的簡単な装置構成のもとにナノ 粒子の測定が可能となるとともに、従来の動的散乱法に比して、検出すべき信号の 強度が格段に強くなることから、 SZNの向上と感度の向上を達成することができる。

[0064] また、媒体に被測定粒子群を分散させた試料を透明セルに収容し、その透明セル に装着した透明電極によって空間周期的な電界を付与す構成を採用することにより 、電極が回折光に及ぼす影響を少なくすることができる。

Claims

請求の範囲

[1] 電源と、液体試料またはゲル試料を保持する容器と、電圧を印加することにより容 器内の一部に電気力線密度が高い領域と電気力線密度の低い領域とが規則的に 並ぶ電気力線分布を発生させる電極対と、電極対への電圧の印加による試料中の 粒子の誘電泳動を利用した過渡回折格子の発生と印加電圧の変化に伴う試料中の 粒子の拡散による過渡回折格子の変化を制御する誘電泳動制御部と、過渡回折格 子に向けて光を照射する光源と、過渡回折格子による回折光を検出する光検出器と を備え、

過渡回折格子によって生じる回折光の強度変化力 粒子に関する評価を行うことを 特徴とする光学的測定装置。

[2] 上記電源が交流電源であることを特徴とする請求項 1に記載の光学的測定装置。

[3] 上記過渡回折格子の発生後に行う印加電圧の変化が、電圧供給の停止であること を特徴とする請求項 1に記載の光学的測定装置。

[4] 電極対を構成するそれぞれの電極は、一定間隔を空けて並ぶ複数の電極片とこの 電極片どうしを電気的に接続する接続部とからなり、

一方の電極における各電極片の片側端力 間隔を空けて他方の電極における各 電極片の片側端に対向するように配置されて 、ることを特徴とする請求項 1に記載の 光学的測定装置。

[5] 少なくとも容器の一部が光源光を透過する材料で形成されるとともに、この光源光 を透過する容器部分に電極対が形成されており、過渡回折格子に向けて光源光を 透過する容器部分から光源光を入射させ、光検出器は試料を透過した回折光また は試料で反射した回折光を検出することを特徴とする請求項 1に記載の光学的測定 装置。

[6] 電圧印加により試料中に電気力線密度が高!ヽ領域と電気力線密度の低 ヽ領域と が規則的に並ぶ電気力線分布を発生させる電極対を用い、電極対に電圧を印加し て試料中の粒子に誘電泳動を引き起こして粒子による過渡回折格子を形成し、 続いて印加電圧を変化させて過渡回折格子を形成する試料中の粒子を拡散させ、 このときの過渡回折格子による回折光の強度変化を検出することにより、粒子に関 する評価を行うことを特徴とする光学的測定方法。

[7] 過渡回折格子の形成に続く印加電圧の変化が、印加電圧の停止であることを特徴 とする請求項 6に記載の光学的測定方法。

[8] 媒体中に移動可能に分散させた粒子群、もしくは粒子が分散してなるゲル状の試 料に対し、空間周期を有する電界を印加することにより当該粒子群に空間周期的な 濃度変化を持たせて疑似的な回折格子を生成させ、その状態で粒子群に対して光 を照射して得られる回折光を検出し、上記電界の印加を変化させた時点からの回折 光の時間変化から、粒子群の拡散係数および粒子径を算出することを特徴とするナ ノ粒子測定方法。

[9] 上記光をレーザ光とすることを特徴とする請求項 8に記載のナノ粒子測定方法。

[10] 上記擬似的な回折格子を生成させた後の電界の印加の変化を、電界の停止とする ことを特徴とする請求項 8に記載のナノ粒子測定方法。

[11] 被測定粒子群を媒体中に移動可能に分散させた試料、もしくは被測定粒子群が分 散してなるゲル状の試料を保持する試料保持手段と、その試料保持手段内の試料 に対して空間周期を有する電界を印加する電極およびその電源と、試料保持手段内 の試料に光を照射する光源と、その光が試料を透過することにより生じる回折光を検 出する検出光学系と、その検出光学系の出力を取り込み、上記電界の印加により被 測定粒子群に空間周期的な濃度変化を生成させた状態で電界の印加を変化させた 時点からの回折光の時間的変化から被測定粒子群の拡散係数および粒子径を算出 するデータ処理手段を備えていることを特徴とするナノ粒子測定装置。

[12] 上記光源がレーザ光源であることを特徴とする請求項 11に記載のナノ粒子測定装 置。

[13] 上記被測定粒子群に空間周期的な濃度変化を生成させた後の電界の変化が、電 界の印加停止であることを特徴とする請求項 11に記載のナノ粒子測定装置。

[14] 上記試料保持手段が試料を収容する透明なセルであり、上記電極が、当該試料セ ルに対して装着され、所定の間隔で互いに平行に伸びる部分を含む透明電極であ ることを特徴とする請求項 11に記載のナノ粒子測定装置。