JP4270121B2

JP4270121B2 - 光学的測定装置

Info

Publication number: JP4270121B2
Application number: JP2004351336A
Authority: JP
Inventors: 幸久和田
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2004-12-03
Filing date: 2004-12-03
Publication date: 2009-05-27
Anticipated expiration: 2024-12-03
Also published as: JP2006162332A

Description

本発明は、液体中に粒子が存在する試料を光学的に測定する光学的測定装置に関する。本発明の光学的測定装置は、例えば、粒子の有無の確認、さらには粒径の測定に適用することができる。

近年、液体中の粒子を計測することは、例えば蛋白質などの生体高分子に関する情報を計測する手段のひとつとして注目されている。
生体高分子を粒子としてみたときの生体高分子の移動しやすさ、すなわち拡散しやすさは、生体高分子の大きさ、形状、結合状態等に依存して変化するので、拡散しやすさを評価することにより、生体高分子に関する種々の情報、例えば粒径や、粒形、結合状態等を知ることができる。

液体中の粒子の拡散しやすさを計測する手法としては例えば顕微蛍光相関分光法がある（特許文献１参照）。
顕微蛍光分光法によれば、計測対象となる粒子（生体高分子）を蛍光分子で標識処理し、顕微鏡視野下でこれを励起照明し、蛍光を発する計測対象粒子のブラウン運動に伴う蛍光強度変化を計測（蛍光粒子の数をカウントする）して、計測対象粒子の拡散係数を求めるものである。

また、出願人は先行特許出願において、標識化を行うことなく粒子（溶解したもの又は分散したもの）の拡散しやすさを計測するための光学的測定装置として、液体中の粒子に誘電泳動を生じさせて粒子を移動することにより、粒子集中領域を形成し、その後、誘電泳動を停止して粒子集中領域から粒子を拡散させたときの屈折率変化から、粒子の拡散に関する評価を行う装置を提案している（特願２００４−２０４０２４号）。この光学的測定装置では、２本の平行に並ぶ電極を通じて被測定溶液に電圧を印加して誘電泳動を引き起こすことにより、溶液の局所的な屈折率変化を発生させている。

また、出願人は他の先行特許出願において、基本回折光パターンを生じさせる一定周期の回折格子に、交流電圧を印加して粒子に誘電泳動を起こさせることにより、粒子集中領域を形成して局所的な屈折率変化を発生させ、基本回折光パターンとは異なる変形回折光パターンを発生させ、変形回折光パターンに基づいて液体中の粒子の有無など、粒子に関する情報を計測することを提案している（特願２００４−２４１９０７号）。
特表平１１−５０２６０８号公報

上述した特許文献１に開示された顕微蛍光相関分光法による粒子の光学的測定では、試料を標識化する必要があり、そのための煩わしい前処理作業を行わなければならない。
また、顕微蛍光相関分光法により測定すれば、粒子に標識化処理を施してしまうので、粒子を完全な自然状態で測定することはできない。
これに対し、上述した一定周期の回折格子に、所定の交流電圧を印加して粒子に誘電泳動を起こさせることにより、誘電泳動による変形回折光パターンに基づいて液体中の粒子の光学的測定を行う方法では、標識化処理の必要がないので、前処理の煩わしさがなく、また、粒子を完全な自然状態で測定することができる。

本発明は、上記誘電泳動を利用した光学的測定装置の発明をさらに改良し、粒子の光学的測定を、さらに簡便に行うことができるようにした光学的測定装置を提供することを目的とする。
例えば、簡便な測定のひとつとして、同じ材料で粒径が異なる粒子が存在する場合に、試料液体中にどの程度の粒径の粒子が存在するかを、迅速かつ簡単に判別することができる光学的測定装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するためになされた本発明の光学的測定装置は、光源と、交流電源と、液体試料を保持する容器と、容器内の液体試料と接する位置に形成され、光源から光が照射されることによりそれぞれが基本回折光パターンを生じる複数の格子周期を有する回折格子群と、回折格子群の各回折格子の少なくとも一部を構成するとともに、交流電源から交流電圧を印加することが可能な電極対と、各回折格子による回折光を検出する光検出器とを備え、電極対に交流電圧を印加して液体試料の屈折率分布を変化することにより、回折格子群による基本回折光パターンとは異なる変形回折光パターンを発生させ、変形回折光パターンに基づいて液体試料に関する情報を計測するようにしている。

この発明によれば、容器内に液体試料を入れて保持した状態で、複数の異なる格子周期を有する回折格子群を構成する電極対に向けて光源から光を照射する。このとき、格子周期が異なるそれぞれの回折格子により光が回折され、それぞれの回折格子が基本回折光パターンを生じる。
そして、交流電源から電極対に交流電圧を印加する。電圧が印加される電極対は、複数の異なる格子周期で間隔を隔てた配置を有している。すなわち、電極間隔が異なる複数の電極対が存在する。
電極間隔（格子周期）が異なる複数の一定周期電極対（回折格子）に交流電圧を印加すると、電極間の電圧勾配はそれぞれ異なり、電極間隔が短いものほど電圧勾配が大きくなる。

ここで、電圧勾配と粒子の移動について説明する。誘電泳動中に粒子に働く力はブラウン運動による等方的な拡散力と誘電泳動力の和と考えることができるが、ブラウン運動による拡散力は電圧勾配に依存せず、一定である。一方、粒子を引き寄せる誘電泳動力に注目すると、その力は、分極による双極子モーメントと電界勾配（電圧勾配）に比例する。つまり誘電泳動力は印加電圧の２乗に比例することになる。また、一般に、同じ材料では、粒径が大きい粒子ほど双極子モーメントが大きく、印加電圧が小さくても誘電泳動による移動が生じやすい。

誘電泳動力を生じさせるための交流電圧を電極対に印加した場合に、電極対に印加する電圧勾配が小さすぎる領域では、電界勾配に起因して生じる誘電泳動力よりも拡散力が勝って、実質的に誘電泳動により粒子を移動させることができない。
一方、電界勾配（電圧勾配）が大きい領域では、誘電泳動力が拡散力を超えるようになり、誘電泳動により粒子を移動させて集中領域を形成することができる。
このことから、電極間隔（格子周期）が異なる複数の一定周期電極対（回折格子）に交流電圧を同時に印加した場合に、電極間隔が短い電極間の電圧勾配は大きくなり、電極間隔が長い電極間の電圧勾配はそれより小さくなるので、１回の電圧印加によって、複数の異なる電圧勾配領域を発生させることができる。したがって、電圧を印加することにより、それぞれの場所での電圧勾配に応じて、粒子に生じる誘電泳動力が異なり、場所によっては誘電泳動力が拡散力に勝って粒子が集中したり、誘電泳動力が拡散力より劣って粒子が移動しなかったりすることになる。

すなわち、複数の電圧勾配領域のうち、いずれの電圧勾配領域にて粒子が集中するかを変形回折光パターンから検出することにより、その粒子の誘電泳動力の大きさ、ひいては双極子モーメントの大きさを見積もり、双極子モーメントの大きさから粒径を見積もるようにする。

本発明によれば、同じ材料で粒径が異なる粒子が存在する場合に、試料液体中にどの粒径の粒子が存在するかを、簡単に判別することができる。

（その他の課題を解決するための手段および効果）
上記発明において、電極対は、交流電圧が印加されたときに正の電極と負の電極とが隣接する部分が、回折格子の格子周期の２倍以上の整数倍の周期で繰り返すように配置されるようにしてもよい。
この発明によれば、変形回折光パターンにおいて、新たに追加された回折光は、基本回折光パターンでは回折光が存在していなかった中間付近の暗い位置（暗部分）に発生するので、明暗のコントラストがはっきりする位置で回折強度を検出することができる。

以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。なお、本発明は、以下に説明するような実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の態様が含まれることはいうまでもない。

図１は、本発明の一実施形態である光学的測定装置の構成を示す概略断面図、図２はその上面図である。
この実施形態の光学的測定装置は、誘電泳動を行いながら、光学的測定を行うものであり、液体試料を保持する容器１１、容器１１の底面となる底板１２aに形成され、回折格子を形成する一対の電極１３、１４と、電極１３、１４に交流電圧を印加する交流電源１５と、光源１６と、光源光を収束するレンズ光学系１７と、回折光を検出する光検出器１８とからなる。

容器１１は、底板１２ａの上に、側壁となる枠体１２ｂを貼り付けることにより形成してある。この容器１１は、ガラス等の光透過性の材料が用いられ、底板１２ａを通して、入射光が電極１３、１４に照射できるようにしてある。

電極１３は、２本の平行な直線状電極片１３ａ、１３ｂが短い間隔ｄを隔てて隣接する複数の第一直線状電極片偏在領域１３ｃと、２本の平行な直線状電極片１３ｄ、１３eが広い間隔３ｄを隔てて隣接する複数の第二直線状電極片偏在領域１３f（紙面の都合上電極片１３ｄは２本、１３ｅは１本しか図示していない）と、隣り合う２つの第一直線状電極片偏在領域１３ｃの間にあって、直線状電極片が形成されていない直線状電極片不在領域１３ｇと、隣り合う２つの第二直線状電極片偏在領域１３ｆの間にあって、直線状電極片が形成されていない直線状電極片不在領域１３ｈと、すべての直線状電極片１３ａ、１３ｂ、１３ｄ、１３ｅを電気的に接続する接続部１３ｉとが形成された櫛型電極構造としてある。

同様に、電極１４は、２本の平行な直線状電極片１４ａ、１４ｂが短い間隔ｄを隔てて隣接する複数の第一直線状電極片偏在領域１４ｃと、２本の平行な直線状電極片１４ｄ、１４eが広い間隔３ｄを隔てて隣接する複数の第二直線状電極片偏在領域１４f（紙面の都合上電極片１４ｄは１本、１４ｅは１本しか図示していない）と、隣り合う２つの第一直線状電極片偏在領域１４ｃの間にあって、直線状電極片が形成されていない直線状電極片不在領域１４ｇと、隣り合う２つの第二直線状電極片偏在領域１４ｆの間にあって（紙面の都合上第二直線状電極片偏在領域１４ｆは１つしか図示していない）、直線状電極片が形成されていない直線状電極片不在領域１４ｈと、すべての直線状電極片１４ａ、１４ｂ、１４ｄ、１４ｅを電気的に接続する接続部１４ｉとが形成された櫛型電極構造としてある。

そして、電極１３の直線状電極片不在領域１３ｇの位置に、電極１４の直線状電極片偏在領域１４ｃがくるように配置して、電極１３の直線状電極片１３ａ、１３ｂと、電極１４の直線状電極片１４ａ、１４ｂとが、等間隔で連続的に並ぶようにして、直線状電極片１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂにより電極間隔がｄとなる第一の回折格子が形成されるようにしてある。また、電極１３の直線状電極片不在領域１３ｈの位置に、電極１４の直線状電極片偏在領域１４ｆがくるように配置して、電極１３の直線状電極片１３ｄ、１３ｅと、電極１４の直線状電極片１４ｄ、１４ｅとが、等間隔で連続的に並ぶようにして、直線状電極片１３ｄ、１３ｅ、１４ｄ、１４ｅにより電極間隔が３ｄとなる第二の回折格子が形成されるようにしてある。

ここで第一回折格子の電極間隔の寸法ｄは、０．５μｍ〜２０μｍ程度にするのが好ましいが、回折光を発生させることができるものであれば、形状や寸法は、特に限定されない。回折格子を構成する電極幅ｄ１についても電極間隔ｄと同じにするのが好ましいが、電極幅ｄ１と電極間隔ｄとが異なる寸法になるようにしてもよいし、回折格子形状が直線状電極片で構成されなくてもよい。本実施形態では、第一回折格子の格子周期（格子間隔）Ｌは、ｄ＋ｄ１となる。具体的には、電極幅ｄ１が１０μｍ、電極間隔ｄが１０μｍ、したがって格子周期Ｌが２０μｍとしている。
第二回折格子については、電極間隔は３ｄ、電極幅３ｄ１とし、格子周期が３Ｌ＝３ｄ＋３ｄ１としている。

交流電源１５には、誘電泳動を引き起こすことができる電圧、周波数の交流電源が用いられる。具体的には、電圧値が１〜１００Ｖ、周波数が１０ＫＨｚ〜１０ＭＨｚ程度の交流電圧が印加できる交流電源を使用する。なお、一般的には、高周波電源を用いるのが好ましい。

光源１６は、測定対象となる液体試料に応じて種類を選択すればよいが、例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源（波長６３３ｎｍ）や、その他のレーザ光源を用いるのが好ましい。
レンズ光学系１７は、光源光を収束して、電極１３、１４（回折格子）に照射できるように構成してある。なお、光源光の入射角度を調整できるようにして、測定対象、測定目的に応じて、透過回折光、反射回折光のいずれでも、取得できるようにするのが好ましい。
透過回折光を測定する場合、入射角は、容器底面と液体試料との界面で全反射が生じない条件であればよく、例えば、入射角０度で入射させてもよい。
また、入射光は第一回折格子と第二回折格子とを同時に照射して測定してもよいし、別々に照射してもよい。前者の場合は第一回折格子による回折光と第二回折格子による回折光回折光の角度が異なるものを選び、第一回折格子による回折光と第二回折格子による回折光とを分離する。

光検出器１８は、透過回折光を検出するときは、液体試料の上部側に配置する。光検出器１８には、回折角を測定するための角度調整機構が設けられており、回折光の強度とともに回折角が検出できるようにしてある。この光検出器１８には、フォトダイオードやＣＣＤが用いられる。なお、角度調整機構を設ける代わりに、複数の素子を並べたアレイセンサを用いて、回折角が計測できるようにしてもよい。

次に、上記装置の計測動作について説明する。ここでは、液体試料中に、粒子Ｓ１が存在しているものとする。まず、電極１３、１４に、電圧を印加しない状態で、光源１６から入射光を照射する。液体試料は、粒子Ｓ１が拡散し、全体がほぼ均一な状態になっている。このとき、入射光は、直線状電極片１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂにより形成される第一回折格子、直線状電極片１３ｄ、１３ｅ、１４ｄ、１４ｅにより形成される第二回折格子の影響を受け、図３において実線で示すように、第一回折格子では周期Ｌの回折条件を満たす角度位置に、−１次、０次、１次、・・・の透過回折光による回折光パターン（基本回折光パターンという）が発生する。また、第二回折格子では周期３Ｌの回折条件を満たす角度位置に、−１次、０次、１次、・・・の透過回折光による回折光パターン
（基本回折光パターンという）が発生する。

次に、交流電源１５により、電極１３、電極１４間に交流電圧を印加する。液体試料中に粒子Ｓ１が存在すると、粒子Ｓ１が十分に大きく、かつ、交流電圧が十分に高い場合には、粒子Ｓ１の拡散力よりも電極対間に働く電圧勾配に依存して定まる誘電泳動力が勝ることにより、誘電泳動作用が働き、粒子Ｓ１は電気力線が集中する領域に移動する。
図４、図５は、交流電圧を印加したときの粒子の状態を説明する概略断面図および上面図である。
図に示すように、正極と負極とが隣接することにより電気力線が集中する領域、すなわち直線状電極片１４ｂと直線状電極片１３ａとの間、あるいは、直線状電極片１３ｂと直線状電極片１４ａとの間に、粒子Ｓ１が集中するようになる。また、直線状電極片１４ｅと直線状電極片１３ｄとの間、あるいは、直線状電極片１３ｅと直線状電極片１４ｄとの間に、粒子Ｓ１が集中するようになる。そして屈折率が高い粒子集中領域Ｐ１（第一回折格子側）、Ｐ２（第二回折格子側）が形成される。粒子集中領域Ｐ１は、格子間隔Ｌの２倍の周期（２Ｌ）で発生しており、粒子集中領域Ｐ２は格子間隔３Ｌの２倍の周期（６Ｌ）で発生している。
入射光は、電極１３、１４による第一回折格子（周期Ｌ）、第二回折格子（周期３Ｌ）の影響を受けて、基本回折光パターンを発生する。さらに、粒子集中領域Ｐ１により形成された回折格子（周期２Ｌ）、粒子集中領域Ｐ２により形成された回折格子（周期６Ｌ）の影響を受けて、図３に破線で示すように、周期２Ｌ、６Ｌの回折条件を満たす角度位置に、−１次、１次、・・・の透過回折光による回折光パターンを形成する。これにより基本回折光パターンに新たに回折光パターンが追加された、変形回折光パターンを発生する。（ただし、０次透過回折光は、基本回折光パターンにおける０次の回折光と重なる）。

もし、液体中に含まれる粒子が粒子Ｓ１より粒径が小さい粒子Ｓ２であった場合で、粒子Ｓ２に働く誘電泳動力が、第一回折格子では電極間の電圧勾配が十分に大きく拡散力よりも勝るが、第二回折格子では電極間の電圧勾配が十分でなく、拡散力に劣る場合には、粒子Ｓ２は第一回折格子でのみ誘電泳動作用による移動が生じ、粒子集中領域が生じる。
この場合は、周期２Ｌの回折条件を満たす角度位置には追加の回折光パターンが形成されるが、周期６Ｌの回折条件を満たす角度位置には回折光パターンが追加されない。

さらに、液体中に含まれる粒子が粒子Ｓ２より粒径が小さい粒子Ｓ３であった場合で、粒子Ｓ３に働く誘電泳動力が、第一回折格子、第二回折格子のいずれでも十分ではなく、拡散力よりも劣る場合は、第一回折格子、第二回折格子ともに誘電泳動作用による移動が生じないので、粒子Ｓ３は粒子集中領域を生じない。
この場合は、周期２Ｌ、６Ｌの回折条件を満たす角度位置には追加の回折光パターンが形成されない。

したがって、第一回折格子、第二回折格子のいずれも変形回折光パターンが生じる場合、第一回折格子にだけ変形回折光パターンが生じる場合、いずれにも変形回折光パターンが生じない場合とを判別することにより、粒子Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３のいずれであるか、換言すれば、粒子の径が、閾値より大きいか、小さいかを判定することができる。

上記実施形態では、格子周期が異なる回折格子を２つ用いて説明したが、さらに格子周期が異なる回折格子の数を増やすことにより、粒子径の判定範囲をより細分化することができ、粒径の精度を高めることができる。
また、印加電圧の設定値を変更すれば、粒子径を判定する閾値を変更することができる。

本発明は、粒子が存在する液体試料について測定する光学的測定装置に利用することができる。

本発明の一実施形態である光学的測定装置の構成を示す概略断面図。図１の光学的測定装置の上面図。図１の光学的測定装置による回折光パターンを説明する図。交流電圧を印加したときの状態を説明する図（上面図）。交流電圧を印加したときの状態を説明する図（概略断面図）。

符号の説明

１１：容器
１３、１４：電極
１３ａ、１３ｂ、１３ｄ、１３ｅ、１４ａ、１４ｂ、１４ｄ、１４ｅ：直線状電極片
１３ｃ、１３ｆ、１４ｃ、１４ｆ：電極片偏在領域
１３ｇ、１３ｈ、１４ｇ、１４ｈ：電極片不在領域
１５：交流電源
１６：光源
１８：光検出器

Claims

光源と、交流電源と、液体試料を保持する容器と、容器内の液体試料と接する位置に形成され、光源から光が照射されることによりそれぞれが基本回折光パターンを生じる複数の異なる格子周期を有する回折格子群と、回折格子群の各回折格子の少なくとも一部を構成するとともに、交流電源から交流電圧を印加することが可能な電極対と、各回折格子による回折光を検出する光検出器とを備え、
電極対に交流電圧を印加して液体試料の屈折率分布を変化することにより、回折格子群による基本回折光パターンとは異なる変形回折光パターンを発生させ、変形回折光パターンに基づいて液体試料に関する情報を計測することを特徴とする光学的測定装置。
電極対は、交流電圧が印加されたときに正の電極と負の電極とが隣接する部分が、回折格子の格子周期の２倍以上の整数倍の周期で繰り返すように配置されることを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。