WO2006016582A1 - カバノアナタケの液体培養方法 - Google Patents

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wzv
potassium
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Seihou Shinya
Hiroyuki Kondo
Hideto Uemura
Hiroaki Matsushima
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Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Fujiwara Techno Art Co Ltd
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Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Fujiwara Techno Art Co Ltd
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Definitions

  • the present invention relates to a liquid culture method for birch moth (Scientific name: Fuscoporia obliqua or Inonotus obliquus), a culture obtained by the liquid culture method, and an invention related thereto.
  • the birch is a mushroom that belongs to the genus Coleoptera, and is a carcinogenic fungus that parasitizes mature birch in cold regions such as Hokkaido and Russia. It has been confirmed that it takes more than 10 years to grow to a size of ⁇ 20cm. This birch is traditionally used to maintain health in Russia as a healthy tea for cold prevention and hangover, and in Japan, the Ainu people decoction and drink as healthy tea. It has been reported that there are effects and antiviral effects.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3008292
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 52-44613
  • Patent Document 3 JP-A-10-191783
  • the cultivated oyster mushroom obtained by the above known culturing method The liquid culture was sufficiently high in tumor cell growth inhibitory activity, antiviral activity, superoxide scavenging activity, and the like.
  • the present inventors conducted extensive research focusing on superoxide-erasing activity among these physiological activities, and identified a weight ratio of potassium and sodium in a medium that has not been focused on conventionally.
  • the superoxide scavenging activity of the culture is remarkably increased, and in particular, the ratio of superoxide scavenging activity to the mycelium weight (specific activity) is remarkably high. I found out for the first time.
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • an object of the present invention is to provide a birch liquid for obtaining a culture of birch moss having a physiological activity such as superoxide scavenging activity at a low cost, safely, and on an industrial scale. It is an object of the present invention to provide a culture method and a culture of cynomolgus mushroom having high physiological activity obtained by using the liquid culture method.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a fungus which is characterized in that it has a step of culturing mycelium of birch fungus in an aqueous medium, and the weight ratio of potassium to sodium (potassium Z sodium) in the aqueous medium is lZl to 50Zl.
  • the liquid culture method for oyster mushrooms of the present invention has a step of culturing mycelium of birch moss in an aqueous medium, and the weight ratio of potassium and sodium in the aqueous medium (potassium / sodium). ) Is lZl to 50Zl.
  • a culture such as a culture solution of bonito salmon having high physiological activity can be obtained at an inexpensive and industrial scale.
  • the present invention is a liquid culture, there is an advantage that a large-scale culture on an industrial scale is easier than a solid culture, and that the culture can be easily treated.
  • the birch (Scientific name: Fuscoporia obliqua or Inonotus obliquus) refers to a mushroom belonging to the order of the genus Cilantroidae.
  • the mycelium of Ranunculaceae, parasitic on birch in nature can be used as is, and the National Institute of Technology and Evaluation (Biotechnology Division, Biogenetic Resources Division ( (NBRC)] (NBRC No. 8681) Strength The cultured mycelium obtained can also be used.
  • the mycelium can be pre-cultured and then added to the aqueous medium.
  • the aqueous medium used in the present invention is a composition in which the content ratio of potassium and sodium in the aqueous medium is weight ratio (potassium / sodium) 1Zl to 50Zl.
  • the weight ratio here is the ratio of the total weight of potassium ions and non-ionized potassium in the aqueous medium to the total weight of sodium.
  • the presence of potassium and sodium at a strong ratio has the advantage that the superoxide scavenging activity is significantly increased.
  • the weight ratio (potassium to sodium) is preferably 3Zl to 50Zl, more preferably 6Zl to 45Z1, from a practical viewpoint.
  • the weight ratio is a ratio in an aqueous medium used for culturing, and an aqueous medium used for pre-culture and an aqueous medium continuously added during the culture have the same weight ratio. It is preferable.
  • the potassium and sodium contents in the aqueous medium may be calculated by calculating the potassium and sodium strength in the medium raw material, respectively, but preferably each content in the aqueous medium can be calculated by the method described later. .
  • the weight ratio of potassium to sodium in the aqueous medium is However, it is preferable that the weight ratio is always achieved during the culture period. In this case, it can be calculated by sampling an aqueous medium and directly measuring the content of potassium or sodium therein. In this case, the content of the sampled aqueous medium can be measured using a known elemental analysis method such as atomic absorption analysis, inductively coupled plasma emission analysis, or ion selective electrode method.
  • the content of potassium in the aqueous medium in view of the involvement in the bioactive, 0. 005 ⁇ 1.
  • O 0/ 0 (w / v) force S Preferably, from 0.01 to 0.5 0/0 (w / v) force Ri preferably, 0. 1 ⁇ 0. 5% (w Zv) it is more preferred.
  • the content of sodium in the aqueous medium is preferably 0.0001 to 0.1% (wZv), taking into account the ratio of bioactivity and potassium.
  • WZV is more preferable 0.01 to 0.1% (WZV) is more preferable.
  • one or two selected from the group having minerals such as magnesium, copper and zinc in the aqueous medium and amino acid strengths such as tyrosine and ferrolanine It is preferable to contain more than seeds.
  • the content of magnesium or copper, in the aqueous medium 0. 0001 ⁇ 1. 0 0 / o (w / v) force S
  • 0. 001 ⁇ 1. 0 0 / o (w / v) force RiYoshimi More preferred is 0.01 to 0.5% (wZv).
  • the content of zinc in the aqueous medium from 0.001 to 5.0 0/0 force S Preferably, from 0.001 to 3.
  • 0 0 / o (w / v) force S More preferably 0 0 / o (w / v) force S, 0. 01-3 More preferred is 0% (wZv). Moreover, tyrosine or Hue -.. The content of Ruaranin, aqueous medium, 0. 0001 ⁇ 5 0 0 / o ( w / v) force S Preferably, 0. 001 ⁇ 1 0 0/0 ( w / v ) More preferable than force S, and more preferably 0.01 to 0.5% (wZv).
  • main potassium sources include dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and potassium chloride.
  • main sodium source include sodium chloride sodium.
  • the raw material containing both potassium and sodium include various peptones and yeast extracts.
  • the aqueous medium used in the present invention includes glucose, various peptones (soybean peptone, etc.), yeast extract, dipotassium hydrogen phosphate, phosphorus in addition to water from the viewpoint of production cost and handling.
  • Preferred are those containing at least one selected from the group consisting of potassium dihydrogen acid, tyrosine, copper and magnesium, and those containing all of these. It is preferable.
  • Examples of such an aqueous medium include water, glucose, soybean peptone, yeast extract, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and magnesium sulfate.
  • the water-based medium may contain components other than those described above as additives.
  • sucrose, mannitol, galactose, trenosose, manoleose, ratatoses, dextrin, corn starch, glycerol and the like can be used.
  • various peptones such as casein-made peptone
  • malt extract such as casein-made peptone
  • soyton such as casein-made peptone
  • kashiton such as casamino acid, calcium nitrate, ammonium sulfate, and rice bran
  • Thiamine, piotin, folic acid, calcium chloride and the like can also be included in the aqueous medium.
  • aqueous medium water 90-96% (wZv) is also used, glucose 0.4-4% (wZ v), various peptone 0.01-1% (wZv), yeast extract 0. 01 to 3% (wZv), dipotassium hydrogen phosphate 0.05 to 0.5% (wZv), potassium dihydrogen phosphate 0.01 to l% (wZv), magnesium sulfate 0.01 to 0.5 % (wZv), copper 0.01-0.5% (wZv), and tyrosine 0.01-0.5% (wZv) More preferably, all of these are contained.
  • Examples of such an aqueous medium include water 90-96% (wZv), glucose 0.4-4% (wZv), soybean peptone 0.01-1% (wZv), yeast extract 0.01-3% ( wZv), dipotassium hydrogen phosphate 0.05 to 0.5% (w / v), potassium dihydrogen phosphate 0.01 to l% (wZv), and magnesium sulfate 0.01 to 0.5% (w Zv), water 90-96% (wZv), glucose 0.4-4% (wZv), yeast extract 0.01-3% (wZv), dipotassium hydrogen phosphate 0.05- 90-96% water containing 0.5% (wZv), potassium dihydrogen phosphate 0.01-1% (wZv), and tyrosine 0.01-0.5% (wZv) (wZv), glucose 0.4-4% (wZv), yeast extract 0.01-3% (w Zv), dipotassium hydrogen phosphate 0.05-0.5% (wZv), potassium dihydrogen phosphate
  • Examples include those containing 0.
  • the pH of the aqueous medium is preferably 4 to 8 forces, more preferably 5 to 7.5 forces, in consideration of the contribution to physiological activity.
  • the aqueous medium is prepared by appropriately sterilizing the above components and then sterilizing them.
  • Media kill There are no particular limitations on the fungus method as long as it is a method that is usually used in liquid culture methods.
  • inoculation refers to the process of planting cynomolgus mushroom mycelium as an inoculum in an aqueous medium. Specifically, the mycelium is punched out together with agar using a 4 mm diameter cork borer from an agar plate medium on which the mycelium has grown.
  • the aqueous medium obtained as described above can be scaled up and cultured.
  • the culture scale is not particularly limited as long as it satisfies the above conditions! /.
  • any apparatus that is used for normal liquid culture such as a small-scale apparatus that is cultured in a flask or a large-scale apparatus that uses a silo, can be used.
  • methods such as shaking culture and stirring culture can be selected as appropriate. Examples of the shaking condition include 100 to 150 rpm.
  • the culture period is not particularly limited, it is, for example, 7 to 60 days, and preferably 7 to 50 days from the viewpoint of increasing the physiological activity in the culture and reducing the production cost. 15 to 50 days is more preferred. 30 to 45 days is more preferred. Other culture conditions are not particularly limited.
  • a culture having a high physiological activity of the bamboo shoot can be obtained.
  • a culture filtrate having a high superoxide scavenging activity such as a superoxide scavenging activity value of 0% or more in the culture filtrate can be obtained.
  • a culture having a high superoxide elimination specific activity such that the superoxide elimination specific activity (the magnitude of the superoxide elimination activity relative to the dry weight of the mycelium) is 35% Zg or more can be obtained.
  • the method for measuring the superoxide scavenging activity can be exemplified by the method described in Examples below. It is done.
  • the obtained culture exhibits high physiological activity such as superoxide scavenging activity, and natural birch salmon itself has historically had very little side effects on the human body, so it eliminates superoxide. Therefore, it is possible to take a strong culture directly and it is considered safe as a food additive.
  • the above-mentioned culture is anticancer, immunity enhancement, blood sugar level lowering, blood pressure lowering, cholesterol lowering, antithrombosis, antiviral activity, active oxygen elimination, energy recovery, atopic dermatitis, hay fever, It can also be suitably used as various therapeutic agents such as rhinitis, infection of pathogenic bacteria, skin spots, cosmetics such as prophylactic agents, pharmaceutical compositions, foods or their raw materials.
  • the culture is a generic term for a medium obtained by culturing, and includes a culture solution, a culture filtrate (separated culture fluid cells), and cells (viable and dead bacteria). ), Cell extracts, purified products thereof, active fractions, dilutions, concentrates or dried products.
  • the method for producing the purified product, active fraction, dilution, concentrate and dried product is not particularly limited as long as it is a known method.
  • the present invention also provides a superoxide scavenging composition comprising the culture. Due to the strong characteristics, the composition has a physiological activity such as a high superoxide scavenging activity, and therefore can be suitably used when superoxide scavenging is required.
  • the composition can be suitably used as cosmetics, pharmaceutical compositions, foods, research reagents and the like. Therefore, the present invention also provides a cosmetic, a pharmaceutical composition, and a food characterized by including the culture.
  • the culture content in the composition for eliminating superoxide of the present invention may be the culture itself without particular limitation.
  • the method for producing the superoxide scavenging composition of the present invention is not particularly limited as long as the superoxide scavenging activity is maintained.
  • Ingredient strength It can manufacture using a well-known manufacturing method.
  • the dosage form of the cosmetic of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include basic cosmetics such as lotion, milky lotion, cream, makeup cosmetics, and hair cosmetics. These cosmetics can be obtained by formulating the above culture and optional ingredients for cosmetics by a conventional method.
  • the optional component that can be used include hydrocarbons, tridalylides, fatty acids, surfactants, polyhydric alcohols, thickeners, ultraviolet absorbers, and the like.
  • the cosmetic of the present invention can be used for prevention and improvement of hair stains, prevention and improvement of hair loss, prevention of generation of body odor, etc. by eliminating superoxide.
  • the content of the culture in the cosmetic of the present invention is preferably 0.001 to 80% by weight, more preferably 0.001 to 50% by weight, and still more preferably 0.01 to 30% by weight.
  • the cosmetic of the present invention can be used such that the culture is applied, for example, 5 mg to 50 g per day per adult.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include injections, tablets, and liquids. These pharmaceutical compositions can be obtained by formulating the above culture and optional ingredients for the pharmaceutical composition by conventional methods. Illustrative optional ingredients include excipients, binders, disintegrants, coating agents and the like.
  • the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the type of disease, symptoms, patient age, body weight, and the like.
  • the above culture can be administered orally at 1 mg to 20 g Zkg body weight once a day or several times a day, for example, 5 mg to 50 g per adult. Once a day or in several divided doses, it should be administered by transdermal absorption.
  • the form of the food of the present invention is not particularly limited. Examples of such forms include candies, gummies, jellies, drinks, breads, and the like. Examples of dosage forms include tablets, capsules, jellies, liquids, and the like. These foods can be obtained by blending the above-mentioned culture and optional ingredients for foods by a conventional method and calcining.
  • the content of the cultures in these foods different forces good Mashiku the type of food from 0.001 to 60 weight 0/0, more preferably 0.001 to 40 weight 0/0 More preferably, the content is 0.01 to 20% by weight.
  • the food of the present invention can be ingested so that the culture is ingested, for example, 1 mg to 20 gZkg body weight per day per adult.
  • the influence of superoxide on a living body includes tissue damage due to generation of radicals.
  • skin aging symptoms such as blemishes, tarmi, blemishes, hair loss, body odor, allergic reactions such as hay fever, rhinitis, bronchial asthma, atopic dermatitis, myocardial infarction, arteriosclerosis, Arrhythmia, pneumonia, gastric ulcer, cirrhosis, splenitis, dementia,
  • leukemia, hyperlipidemia, diabetes, autonomic neuropathy, cataract, collagen disease, rheumatoid arthritis, etc. are caused.
  • the superoxide erasing composition of the present invention (cosmetics, pharmaceutical composition, food, etc.) containing the above-mentioned culture derived from natural cynomolgus moss generally has an excellent superoxide erasing action. It can be effectively used for the improvement and prevention of the above-mentioned diseases, which are considered to be related to superoxide, skin aging symptoms, and the generation of body odor, and delay.
  • the present invention further provides a method for eliminating superoxide using the culture.
  • the culture may be used in an effective amount or more that provides a superoxide scavenging action.
  • liquid culture method for birch moss according to the present invention will be specifically described by way of examples.
  • the present invention is not intended to be limited to the scope of the powerful examples.
  • aqueous medium having the composition shown in Table 1 Place 200 mL of aqueous medium having the composition shown in Table 1 into a culture container (container with a cotton cap on an Erlenmeyer flask), then heat sterilize at 121 ° C for 15 minutes, isolate Hokkaido natural cynomolgus moss, and agar plate culture The obtained mycelium was aseptically inoculated into each culture container.
  • Table 1 the weight ratio of potassium and sodium was calculated from the potassium and sodium contents in the raw material of the initial culture medium.
  • shaking culture (condition: 120 rpm) was performed at 23 ° C for 30 days, and then the culture was taken out from each culture vessel, and the mycelium was filtered off to obtain a culture filtrate.
  • Table 1 shows the dry weight of the obtained birch mycelia, and the super 1-year-old oxidase scavenging activity value of the culture filtrate (3-fold diluted solution). Moreover, these measuring methods are shown below.
  • the mycelium is filtered, washed with distilled water, and 30 to 80 ° C, preferably 30 to 60 ° C for 24 hours. [0047] (Measurement of superoxide erasing activity and superoxide erasing specific activity value)
  • glucose is manufactured by -Sushi Co., Ltd. (trade name: Glu'Final), Polypeptone (registered trademark), and powdered yeast extract s is manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd. Umu 'potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate heptahydrate is manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (food additive). [0050] (Examples 6 and 7)
  • aqueous medium having the composition shown in Table 2 Place 200 mL of aqueous medium having the composition shown in Table 2 into a culture vessel (container with a cotton cap on an Erlenmeyer flask), then heat sterilize at 121 ° C for 15 minutes, isolate Hokkaido natural cynomolgus mosquito, and agar plate culture The obtained mycelium was aseptically inoculated into each culture container.
  • the weight ratio of potassium and sodium was calculated from the contents of potassium and sodium in the raw material of the initial culture medium.
  • shaking culture (condition: 120 rpm) was performed at 28 ° C for 30 days, and then the culture was taken out from each culture vessel, and the mycelium was filtered to obtain a culture filtrate.
  • Table 2 shows the superoxide scavenging activity values of the obtained culture filtrate (3-fold diluted solution). The method for measuring the superoxide erasing activity value is as described above.
  • glucose is manufactured by Nisshi Co., Ltd. (trade name: Guru's final)
  • yeast extract is manufactured by Nippon Paper Chemicals Co., Ltd. (trade name: SK yeast extract S-2)
  • dipotassium hydrogen phosphate 'phosphoric acid Potassium dihydrogen is manufactured by Yoneyama Chemical Co., Ltd.
  • L-tyrosine is manufactured by Kyowa Hakko Co., Ltd.
  • the mineral yeast is manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd. (trade name: mineral yeast Cu). Since mineral yeast contains abundant copper, the aqueous medium containing 0.1% by weight of mineral yeast as in Example 7 contains about 0.03% by weight of copper. .
  • the liquid culture method for cynomolgus of the present invention it is possible to stably cultivate cynomolgus mushroom in large quantities.
  • the cultivated cynomolgus mushroom obtained by the present invention and the superoxide erasing composition containing the culture have high physiological activity and can be suitably used when superoxide erasing is required.
  • the culture and composition are, for example, anticancer, immunity enhancement, blood glucose level lowering, blood pressure lowering, cholesterol lowering, antithrombosis, antiviral action, active oxygen elimination, energy recovery, atopic dermatitis, pollen It can also be suitably used as cosmetics such as various therapeutic agents such as infectious diseases, rhinitis, infection of pathogenic bacteria, skin spots, and preventive agents, pharmaceuticals, foods, and raw materials thereof.

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Abstract

　本発明は、カバノアナタケの液体培養方法および該液体培養方法により得られる培養物、並びにそれらに関連する発明に関する。本発明を用いることにより、カバノアナタケ、カバノアナタケの培養液等の培養物を、安価で、安全に、工業規模で得ることができるという効果が奏される。また、本発明の培養方法で得られた培養物等は高い生理活性を有することから、各種用途に利用できる。  

Description

カバノアナタケの液体培養方法
技術分野
[0001] 本発明は、カバノアナタケ（学名： Fuscoporia obliquaまたは Inonotus obliquus)の 液体培養方法および該液体培養方法により得られる培養物、並びにそれらに関連す る発明に関する。
背景技術
[0002] カバノアナタケは、ヒダナシタケ目タバコゥロコタケ科のキノコで、北海道やロシアな どの寒冷地で、成熟したシラカバに寄生する癌腫菌であり、中身は褐色、外見は黒く 硬い石炭状の塊で、直径 10〜20cmの大きさに成長するのに 10年以上力かることが 確認されている。このカバノアナタケは、従来、ロシアでは健康維持'風邪の予防や 二日酔いに効く健康茶として、また、 日本でもアイヌ民族が健康茶として煎じて飲用し てきた経緯があり、近年の研究では腫瘍細胞増殖抑制作用、抗ウィルス作用等があ ることち報告されている。
[0003] そのため、近年の健康ブームでカバノアナタケへの需要が増加することにより、天 然に存在するカバノアナタケの乱獲が進み、現在ではカノ Vアナタケが寄生するシラ カバの数が「1山に 1本」、「2万本に 1本」と言われるまでに激減している上に、主に口 シァカも輸入されるカバノアナタケにっ ヽてはその産地の特定が不明確である等、安 全性の点でも問題が生じている。
[0004] そこで、カノノアナタケの人工培養方法にっ 、て種々検討されて 、る (例えば、特 許文献 1〜3を参照)。
特許文献 1：特許第 3008292号公報
特許文献 2：特公昭 52— 44613号公報
特許文献 3 :特開平 10— 191783号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] し力しながら、前記の公知の培養方法で得られるカノ ノアナタケの培養物、中でも 液体培養物は、腫瘍細胞増殖抑制活性、抗ウィルス活性、スーパーォキシド消去活 性等が十分に高 、ものではな力つた。
[0006] そこで本発明者らは、これらの生理活性のうちスーパーォキシド消去活性に着目し て鋭意研究を進めたところ、従来着目されていな力つた培地中のカリウムとナトリウム の重量比を特定の範囲に調整してカノノアナタケを液体培養した場合に、培養物の スーパーォキシド消去活性が顕著に高くなること、中でも、菌糸体重量に対するスー バーオキシド消去活性の比率 (比活性)が顕著に高くなることを初めて見出した。本 発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
[0007] 即ち、本発明の目的は、スーパーォキシド消去活性などの生理活性を有するカバノ アナタケの培養物を、安価で、安全に、し力も工業的な規模で得るための、カバノア ナタケの液体培養方法、ならびに該液体培養方法を用いて得られる、高い生理活性 を有するカノノアナタケの培養物を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明の要旨は、
〔1〕 カバノアナタケの菌糸体を水系培地中で培養する工程を有し、該水系培地中 のカリウムとナトリウムの重量比（カリウム Zナトリウム）が lZl〜50Zlであることを特 徴とするカノくノアナタケの液体培養方法、
〔2〕 前記〔1〕記載の液体培養方法で得られた培養物、
〔3〕 前記〔2〕記載の培養物を含む、スーパーォキシド消去用組成物、
〔4〕 スーパーォキシド消去用組成物の製造のための、前記〔2〕記載の培養物の使 用、および
[5] 前記〔2〕記載の培養物を用いてスーパーォキシドを消去する方法
に関する。
発明の効果
[0009] 本発明を用いることにより、カバノアナタケ、カバノアナタケの培養液等の培養物を 、安価で、安全に、工業規模で得ることができるという効果が奏される。また、本発明 の培養方法で得られた培養物は高!ヽ生理活性を有することから、各種用途に利用で きる。 発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明のカノ ノアナタケの液体培養方法は、前記のように、カバノアナタケの菌糸 体を水系培地中で培養する工程を有し、該水系培地中のカリウムとナトリウムの重量 比 (カリウム/ナトリウム)が lZl〜50Zlであることを特徴とする。かかる特徴を有する ことにより、生理活性の高いカノ ノアナタケの培養液等の培養物を安価で、工業的規 模で得ることができるという効果が奏される。また、本発明は、液体培養であるため、 固体培養に比べて工業的規模での大量培養が容易であり、また培養物の処理も容 易であるという利点もある。
[0011] 本発明にお 、て、カバノアナタケ (学名： Fuscoporia obliquaまたは Inonotus obliquus )とは、ヒダナシタケ目タバコゥロコタケ科のキノコをいう。本発明に使用する場合、自 然界でシラカバに寄生して 、るカノ ノアナタケの菌糸体をそのまま使用してもょ 、し、 独立行政法人製品評価技術基盤機構〔バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門 (NBRC)〕（NBRC番号 8681)力 入手した菌糸体を培養したものを使用することも できる。また、水系培地への植菌時の菌糸体の植え傷みを防ぐために、菌糸体を前 培養してから、水系培地に添加することもできる。
[0012] 本発明に用いられる水系培地は、該水系培地中のカリウムとナトリウムの含有量力 重量比 (カリウム/ナトリウム) lZl〜50Zlであるものである。ここでの重量比は、水系 培地中のカリウムイオン、イオンィ匕していないカリウムの総重量と、同じくナトリウムの 総重量の比である。力かる比率でカリウムとナトリウムが存在することで、スーパーォ キシド消去活性が有意に高くなるという利点がある。中でも、前記重量比 (カリウム Ζ ナトリウム)は、実用的な観点から、 3Zl〜50Zlであることが好ましぐ 6Zl〜45Z 1であることがより好ましい。
[0013] 前記重量比は、培養を行う際に使用される水系培地中での比率であり、前培養に 用いられる水系培地や培養時に継続的に追加される水系培地も同様の重量比であ ることが好ましい。なお、水系培地中のカリウム及びナトリウムの含有量は、培地原料 中のカリウム、ナトリウム力もそれぞれ算出してもよいが、好ましくは水系培地中の各 含有量を、後述の方法で測定して算出できる。
[0014] また、前記の水系培地中におけるカリウム Ζナトリウムの重量比は、カノ ノアナタケ を培養している間のいずれかの時点で達成されていればよいが、培養期間中、常に 前記重量比が達成されていることが好ましい。この場合、水系培地をサンプリングし てその中のカリウムまたはナトリウムの含有量を直接測定することで算出することがで きる。この場合、サンプリングした水系培地を原子吸光分析、誘導結合型プラズマ発 光分析、イオン選択電極法等の公知の元素分析方法を用いて、その含有量を測定 することができる。
[0015] 水系培地中のカリウムの含有量としては、生理活性への関与を考慮して、 0. 005 〜1. O0/0(w/v)力 S好ましく、 0. 01〜0. 50/0(w/v)力 り好ましく、 0. 1〜0. 5%(w Zv)がさらに好ましい。また、水系培地中のナトリウムの含有量としては、生理活性な らびにカリウムとの比率を考慮して、 0. 0001-1. 0%(wZv)が好ましぐ 0. 001-0 . 1%(WZV)がより好ましぐ 0. 01〜0. 1%(WZV)がさらに好ましい。
[0016] さらに、生理活性への最適な関与を考慮して、水系培地中にマグネシウム、銅、亜 鉛等のミネラル及びチロシン、フエ-ルァラニン等のアミノ酸力もなる群より選択される 1種又は 2種以上を含有することが好ま 、。マグネシウム又は銅の含有量としては、 水系培地中、 0. 0001〜1. 00/o(w/v)力 S好ましく、 0. 001〜1. 00/o(w/v)力 り好 ましぐ 0. 01〜0. 5%(wZv)がさらに好ましい。亜鉛の含有量としては、水系培地中 、 0. 001〜5. 00/0力 S好ましく、 0. 001〜3. 00/o(w/v)力 Sより好ましく、 0. 01〜3. 0 %(wZv)がさらに好ましい。また、チロシン又はフエ-ルァラニンの含有量としては、 水系培地中、 0. 0001〜5. 00/o(w/v)力 S好ましく、 0. 001〜1. 00/0 (w/v)力 Sより好 ましく、 0. 01〜0. 5%(wZv)がさらに好ましい。
[0017] 主なカリウム源としては、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム 等が挙げられる。主なナトリウム源としては、塩ィ匕ナトリウム等が挙げられる。また、カリ ゥムとナトリウムとを共に含有する原料としては、各種ペプトン、酵母エキス等が挙げら れる。
[0018] 本発明に用いられる水系培地としては、製造コストの観点及び取り扱い性の観点か ら、水とともに、グルコース、各種ペプトン (大豆製ペプトン等）、酵母エキス、リン酸水 素二カリウム、リン酸二水素カリウム、チロシン、銅及びマグネシウム力もなる群より選 択される少なくとも 1種を含有して 、るものが好ましく、これらを全て含有して 、るもの 力 り好ましい。かかる水系培地としては、例えば、水、グルコース、大豆製ペプトン、 酵母エキス、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム及び硫酸マグネシウムを含 有して 、るものが挙げられる。
[0019] 前記水系培地中には、上記以外の成分を添加剤として混含してもよい。例えば、ス クロース、マンニトーノレ、ガラクトース、トレノヽロース、マノレトース、ラタトース、デキストリ ン、コーンスターチ、グリセロール等を使用することができる。また、各種ペプトン (カゼ イン製ペプトン等）、モルトエキス、ソィトン、カシトン、カザミノ酸、硝酸カルシウム、硫 酸アンモ-ゥム、米ぬか等を使用することができる。また、チアミン、ピオチン、葉酸、 塩化カルシウム等も前記水系培地中に含ませることができる。
[0020] 中でも水系培地としては、水 90〜96%(wZv)ととも〖こ、グルコース 0. 4〜4%(wZ v)、各種ペプトン 0. 01〜l%(wZv)、酵母エキス 0. 01〜3%(wZv)、リン酸水素二 カリウム 0. 05〜0. 5%(wZv)、リン酸二水素カリウム 0. 01〜l%(wZv)、硫酸マグ ネシゥム 0. 01〜0. 5%(wZv)、銅 0. 01〜0. 5%(wZv)、及びチロシン 0. 01〜0. 5%(wZv)力 なる群より選択される少なくとも 1成分を含有してなるものがより好まし ぐこれらを全て含有してなるものがさらに好ましい。かかる水系培地としては、例えば 、水 90〜96%(wZv)、グルコース 0. 4〜4%(wZv)、大豆製ペプトン 0. 01〜1%( wZv)、酵母エキス 0. 01〜3%(wZv)、リン酸水素二カリウム 0. 05〜0. 5%(w/v) 、リン酸二水素カリウム 0. 01〜l%(wZv)、及び硫酸マグネシウム 0. 01〜0. 5%(w Zv)を含有してなるもの、水 90〜96%(wZv)、グルコース 0. 4〜4%(wZv)、酵母 エキス 0. 01〜3%(wZv)、リン酸水素二カリウム 0. 05〜0. 5%(wZv)、リン酸二水 素カリウム 0. 01〜l%(wZv)、及びチロシン 0. 01〜0. 5%(wZv)を含有してなるも の、水 90〜96%(wZv)、グルコース 0. 4〜4%(wZv)、酵母エキス 0. 01〜3%(w Zv)、リン酸水素二カリウム 0. 05〜0. 5%(wZv)、リン酸二水素カリウム 0. 01〜1% (wZv)、チロシン 0. 01〜0. 5%(wZv)、及び銅 0. 01〜0. 5%(w/v)を含有してな るもの等が挙げられる。
[0021] 水系培地の pHとしては、生理活性への関与を考慮して、 4〜8力好ましく、 5〜7. 5 力 り好ましい。
[0022] 水系培地は、前記各成分を適宜混含した後、殺菌することで調製される。培地の殺 菌方法としては、液体培養方法で通常使用される方法であれば、特に限定はない。
[0023] 本発明の液体培養方法においては、好ましくは、カリウムとナトリウムの重量比 (カリ ゥム Zナトリウム）が lZl〜50Zlであることを特徴とする水系培地中に、植菌して培 養を開始する。ここで植菌とは、水系培地に種菌としてカノノアナタケの菌糸体を植 えつける工程をいい、具体的には、菌糸の成育した寒天平板培地より 4mm径のコル クボーラ等で寒天ごと菌糸体を打ち抜き、前記水系培地に植えつける方法や菌糸体 を水系培地中で前培養し、この培養液を前記水系培地に添加する方法、又は、天然 のカノノアナタケ菌糸体をそのまま直接に前記水系培地に添加する方法等が挙げら れる。
[0024] また、本発明において、工業的規模での製造を行なう場合には、前記のようにして 得られた水系培地をスケールアップして培養することができる。中でも、生理活性が 高くなるという観点から、植菌した水系培地を 15〜30°C、好ましくは 15〜27°C、より 好ましくは 18〜27°Cで培養するのが望ましい。
[0025] また、培養スケールとしては、前記条件を満たすものであれば、特に限定はな!/、。
例えば、フラスコ中で培養する小規模のもの、サイロを用いた大規模のものなど通常 の液体培養に使用される装置であればいずれでも実施可能である。また、培養スケ ールに応じて、振とう培養、撹拌培養などの方式を適宜選択することができる。振とう 条件としては、例えば、 100〜150rpmが挙げられる。
[0026] 培養期間としては特に限定はないが、培養物中の生理活性が高くなる、製造コスト を低減する等の観点から、例えば、 7〜60日間であり、 7〜50日間が好ましぐ 15〜 50日間がより好ましぐ 30-45日間がさらに好ましい。なお、これ以外の培養条件に ついては、特に限定はない。
[0027] 力かる方法により、カノノアナタケの生理活性の高い培養物が得られる。たとえば、 該培養ろ液中のスーパーォキシド消去活性値力 0%以上のような高いスーパーォ キシド消去活性を有する培養ろ液が得られる。また、たとえば、スーパーォキシド消去 比活性 (菌糸体乾燥重量に対するスーパーォキシド消去活性の大きさ)が 35%Zg以 上のような高いスーパーォキシド消去比活性を有する培養物が得られる。なお、スー バーオキシド消去活性の測定方法にっ 、ては、後述の実施例に記載の方法が挙げ られる。
[0028] 得られる培養物は高いスーパーォキシド消去活性などの生理活性を示し、天然の カバノアナタケ自体は、歴史的には人体に対して副作用が極めて小さいものであつ たため、スーパーォキシドを消去するために、力かる培養物を直接服用することがで き、また食品添加剤としても安全であると考えられる。例えば、前記の培養物は、抗が ん、免疫力増強化、血糖値降下、血圧降下、コレステロール低下、抗血栓、抗ウィル ス作用、活性酸素消去、精力回復、アトピー性皮膚炎、花粉症、鼻炎、病原菌の感 染、肌のシミ等の種々の治療剤、予防剤等の化粧料、医薬組成物、食品又はそれら の原料としても好適に使用され得る。
[0029] また、前記培養物は、培養によって得られた培地等を総称するもので、培養液、培 養ろ液 (培養液力 菌体を分離したもの)、菌体 (生菌、死菌を含む)、菌体の抽出物、 これらの精製物、活性画分、希釈物、濃縮物または乾燥物等を含む。この精製物、 活性画分、希釈物、濃縮物および、乾燥物の製造方法としては、公知の方法であれ ば特に限定は無い。
[0030] 本発明はまた、前記培養物を含むことを特徴とするスーパーォキシド消去用組成物 を提供する。力かる特徴を有することにより、該組成物は、高いスーパーォキシド消去 活性などの生理活性を有するため、スーパーォキシド消去を必要とする場合に好適 に用いられ得る。例えば、該組成物は、化粧料、医薬組成物、食品、研究用試薬等 として、好適に使用され得る。従って、本発明はまた、前記培養物を含むことを特徴と する化粧料、医薬組成物、及び食品を提供する。
[0031] 本発明のスーパーォキシド消去用組成物中の前記培養物の含有量としては、特に 限定はなぐ前記培養物そのものであってもよい。
[0032] 本発明のスーパーォキシド消去用組成物の製造法としては、スーパーォキシド消 去活性が維持される限り特に限定はなぐ前記の液体培養方法を用いて得られた培 養物と任意成分力 公知の製造方法を用いて製造することができる。
[0033] 本発明の化粧料の剤型としては、特に限定されず、化粧水、乳液、クリーム等の基 礎化粧料、メークアップ料、頭髪用化粧料等を例示できる。これらの化粧料は、前記 の培養物とィ匕粧料用の任意成分を常法により製剤化することにより得ることができる。 力かる任意成分としては、例えば、炭化水素類、トリダリセライド類、脂肪酸類、界面 活性剤、多価アルコール、増粘剤、紫外線吸収剤等を例示できる。
[0034] 本発明の化粧料は、スーパーォキシドを消去することによって、シヮゃシミの予防や 改善、脱毛の予防や改善、体臭発生の防止等に使用され得る。本発明の化粧料中 の前記培養物の含有量としては、好ましくは 0. 001〜80重量％、より好ましくは 0. 0 01〜50重量％、さらに好ましくは 0. 01〜30重量％である。本発明の化粧料は、前 記培養物が、例えば、成人 1人 1日当たり、 5mg〜50g適用されるように使用され得る
[0035] 本発明の医薬組成物の剤型としては、特に限定されないが、例えば、注射剤、錠剤 、液剤等を例示できる。これらの医薬組成物は、前記の培養物と医薬組成物用の任 意成分を常法により製剤化することにより得ることができる。力かる任意成分としては、 賦形剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤等を例示できる。
[0036] 医薬組成物の投与量は、疾患の種類、症状、患者の年齢、体重等により異なる。か 力る投与量としては、成人 1人あたり、前記の培養物を、例えば、 lmg〜20gZkg体 重を 1日に 1回ないしは数回に分けて経口投与する力、例えば、 5mg〜50gを 1日に 1回な 、しは数回に分けて経皮吸収で投与すればょ 、。
[0037] 本発明の食品の形態としては特に限定されない。かかる形態としては、例えば、キ ヤンディー、グミ、ゼリー、ドリンク、パン等を例示でき、剤型としては、錠剤状、カプセ ル状、ゼリー状、液状等を例示できる。これらの食品は、前記の培養物と食品用の任 意成分を常法により配合し、カロ工すること〖こより得ることができる。
[0038] これらの食品中の前記の培養物の含有量としては、食品の種類により異なる力 好 ましくは 0. 001〜60重量0 /0、より好ましくは 0. 001〜40重量0 /0、さらに好ましくは 0. 01〜20重量％である。本発明の食品は、前記培養物が、例えば、成人 1人 1日当た り、 lmg〜20gZkg体重摂取されるように摂取され得る。
[0039] 一般的に、スーパーォキシドが生体に及ぼす影響として、ラジカルの発生による組 織の損傷が挙げられる。その結果として、シヮ、タルミ、シミ、脱毛等の皮膚の老化症 状、体臭の発生や、花粉症、鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎等のアレルギー 反応の惹起、心筋梗塞、動脈硬化、不整脈、肺炎、胃潰瘍、肝硬変、脾炎、認知症、 白血病、高脂血症、糖尿病、自律神経障害、白内障、膠原病、関節リューマチ等が 引き起こされることが知られている。ここで、天然のカノノアナタケは、実際に、抗がん 作用、免疫増強作用等の優れた効果を奏し、スーパーォキシド消去を必要とする被 験体において、スーパーォキシド消去作用を発揮することが分力つている。従って、 天然のカノノアナタケに由来する前記培養物を含有する本発明のスーパーォキシド 消去用組成物 (化粧料、医薬組成物、食品等）は、その優れたスーパーォキシド消去 作用により、一般的にスーパーォキシドが関与しているとされている上記の疾患等や 皮膚の老化症状、体臭の発生等の改善や予防、遅延化に対して有効に使用され得 る。
[0040] 本発明はさらに、前記培養物を用いてスーパーォキシドを消去する方法を提供す る。
[0041] 本発明の方法においては、前記培養物をスーパーォキシド消去作用が得られる有 効量以上用いればよい。
実施例
[0042] 以下に、本発明によるカバノアナタケの液体培養方法を実施例でもって具体的に 示すが、本発明は力かる実施例の範囲に限定することを意図するものではない。
[0043] (実施例 1〜5、比較例 1〜4)
表 1に示す組成を有する水系培地 200mLを培養容器 (三角フラスコに綿栓をした 容器）にそれぞれ入れた後、 121°C15分間加熱滅菌し、北海道産天然カノノアナタ ケカも単離して、寒天平板培養した菌糸体を各培養容器中に無菌的に植菌した。な お、表 1中、カリウムとナトリウムの重量比率は培養初発培地の原料中のカリウム、ナト リウム含有量より算出した。
[0044] 次いで 23°Cで振とう培養 (条件 :120rpm)を 30日間行った後、各培養容器から培養 物を取り出し、菌糸体をろ別して培養ろ液を得た。
[0045] 表 1に得られたカバノアナタケ菌糸体の乾燥重量、培養ろ液（3倍希釈液)のスーパ 一才キシド消去活性値を示す。また、以下に、これらの測定方法を示す。
[0046] (カバノアナタケ菌糸体の乾燥重量測定）
菌糸体をろ過後、蒸留水で洗浄して、 30〜80°C、好ましくは 30〜60°Cで 24時間 [0047] (スーパーォキシド消去活性測定およびスーパーォキシド消去比活性値）
「SOD Assay kit—WST」（同仁ィ匕学研究所)を用いて、上記で得られた培養ろ 液を 3倍に希釈した液のスーパーォキシド消去活性を測定した。校正にはゥシ赤血 球由来のスーパーォキシドジスムターゼ (和光純薬工業 (株)製)を標準サンプルとした 。測定した 3倍希釈の培養ろ液のスーパーォキシド消去活性値 (SOD活性値)を、乾 燥菌糸体重量で割ることでスーパーォキシド消去比活性 (SOD比活性値)を算出し た。結果を表 1に示す。
[0048] [表 1]
Figure imgf000012_0001
なお、表 1中、グルコースは株式会社-ッシ製 (商品名：グル 'ファイナル)、ポリぺプ トン (登録商標）、粉末酵母エキス sは日本製薬株式会社製のもの、リン酸水素二カリ ゥム 'リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム 7水和物は、和光純薬工業株式会社 製 (食品添加物)である。 [0050] (実施例 6及び 7)
表 2に示す組成を有する水系培地 200mLを培養容器 (三角フラスコに綿栓をした 容器）にそれぞれ入れた後、 121°C15分間加熱滅菌し、北海道産天然カノノアナタ ケカも単離して、寒天平板培養した菌糸体を各培養容器中に無菌的に植菌した。な お、表 2中、カリウムとナトリウムの重量比率は培養初発培地の原料中のカリウム、ナト リウム含有量より算出した。
[0051] 次いで 28°Cで振とう培養 (条件 :120rpm)を 30日間行った後、各培養容器から培養 物を取り出し、菌糸体をろ別して培養ろ液を得た。
[0052] 表 2に得られた培養ろ液（3倍希釈液)のスーパーォキシド消去活性値を示す。な お、スーパーォキシド消去活性値の測定方法は上記の通りである。
[0053] [表 2]
Figure imgf000013_0001
表 2中、グルコースは株式会社二ッシ製 (商品名：グル 'ファイナル)、酵母エキスは 日本製紙ケミカル株式会社製 (商品名： SK酵母エキス S— 2)、リン酸水素二カリウム 'リン酸二水素カリウムは米山化学株式会社製、 Lーチロシンは協和発酵株式会社製 、ミネラル酵母は、オリエンタル酵母株式会社製 (商品名：ミネラル酵母 Cu)である。 なお、ミネラル酵母は、銅を豊富に含むため、実施例 7のようにミネラル酵母を 0. 1重 量％含有させた場合の水系培地は、約 0. 03重量％の銅を含有している。
[0055] 表 1及び 2の結果より、実施例 1〜7では、比較例 1〜4に比べて、いずれも培養ろ液 中のスーパーォキシド消去活性値が極めて高いことがわかる。特に、実施例 1〜5で は、比較例 1〜4に比べて、いずれもスーパーォキシド消去比活性が極めて高いもの であることがわかる。
産業上の利用可能性
[0056] 本発明のカノノアナタケの液体培養方法を用いることで、カノノアナタケを大量に 安定培養できる。また、本発明により得られるカノノアナタケの培養物及び該培養物 を含むスーパーォキシド消去用組成物は、高い生理活性を有し、スーパーォキシド 消去を必要とする場合に好適に用いられ得る。前記培養物及び組成物は、例えば、 抗がん、免疫力増強化、血糖値降下、血圧降下、コレステロール低下、抗血栓、抗ゥ ィルス作用、活性酸素消去、精力回復、アトピー性皮膚炎、花粉症、鼻炎、病原菌の 感染、肌のシミ等の種々の治療剤、予防剤等の化粧料、医薬品、食品又はそれらの 原料としても好適に使用され得る。

Claims

請求の範囲
[1] カバノアナタケの菌糸体を水系培地中で培養する工程を有し、該水系培地中の力 リウムとナトリウムの重量比 (カリウム Zナトリウム）が lZl〜50Zlであることを特徴と するカバノアナタケの液体培養方法。
[2] 水系培地中におけるカリウムの含有量力 0. 005〜1. 0%(wZv)であり、ナトリウ ムの含有量が 0. 0001-1. 0%(wZv)である、請求項 1に記載の液体培養方法。
[3] 水系培地中におけるマグネシウムの含有量が 0. 001-1. 0%(wZv)である、請求 項 1又は 2に記載の液体培養方法。
[4] 水系培地が、銅、亜鉛、チロシン及びフエ二ルァラニン力 なる群より選択された少 なくとも 1種をさらに含有する請求項 1〜3 、ずれか記載の液体培養方法。
[5] 請求項 1〜4の ヽずれかに記載の液体培養方法で得られた培養物。
[6] 請求項 5記載の培養物を含む、スーパーォキシド消去用組成物。
[7] 化粧料、医薬組成物、又は食品である請求項 6記載のスーパーォキシド消去用組 成物。
[8] スーパーォキシド消去用組成物の製造のための、請求項 5記載の培養物の使用。
[9] 請求項 5記載の培養物を用いてスーパーォキシドを消去する方法。
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