KR101246143B1 - 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물 - Google Patents
뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유산균으로 발효된 인진쑥 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물에 있어서, 상기 인진쑥 발효 추출물은 인진쑥을 추출하여 인진쑥 추출물을 준비하고 상기 인진쑥 추출물의 수용액을 준비한 후 상기 인진쑥 추출물의 수용액에 유산균을 접종하고 발효시켜 수득한 것임을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 식품원료로서의 인진쑥의 활용가치를 높이고 생체에 유용한 생리활성 기능을 향상시키는 새로운 인진쑥 발효 추출물 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물은 종래에 알려진 인진쑥의 열수 추출물이나 에탄올 추출물 보다 항산화력이 우수하면서도 뼈성장촉진 효능을 나타낸다.
Description
본 발명은 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인진쑥을 유산균을 이용하여 발효시킴으로써 항산화력이 우수하면서도 뼈성장촉진 효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 인진쑥의 추출물 용액에 유산균을 접종하고 적합한 유산균 발효 조건 하에서 인진쑥을 발효시킴으로써 종래에 알려진 인진쑥의 열수 추출물이나 에탄올 추출물 보다 항산화력이 우수하면서도 뼈성장촉진 효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 식품원료로서의 인진쑥의 활용가치를 높이고 생체에 유용한 생리활성 기능을 향상시키는 새로운 인진쑥 발효 추출물 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
쑥은 우리나라 전역에 자생하는 식용식물로 단백질, 지방질, 섬유질, 당질 칼슘, 인, 비타민 A, B, C가 풍부한 식품자원으로 널리 섭취되어 왔다. 이 중 인진 쑥은 국화과 쑥속에 속하는 다년생 초본형 낙엽관목으로, 생당쑥, 애당쑥, 사철쑥, 인진초, 더위지기(Artemisia iwayomogi), 흰산쑥(Artemisa sacrorum subsp. Kitamura), 털산쑥(Artemisa sacrorum subsp. manshuria var. vestita Kitamura) 등으로 불리는데, 특히, 어린잎을 인진쑥 또는 더위지기라 부른다.
인진쑥은 그 특유의 향기와 약효로 인하여 전통적으로 민간에서 식용, 약용, 단방약으로 애용되어 왔다. 인진쑥은 국화과에 딸린 여러해살이풀인 사철쑥의 어린싹으로 예로부터 간을 이롭게 하는 약초로 알려져 있다. 특히 황달에 효험이 우수한 것으로 알려져 있는데, 동의보감과 본초강목에서는 손상된 간 회복, 지방간, 간암, 간염, 황달 등의 간질환의 치료 및 예방, 식욕의 증진, 소화불량, 위장병 등의 위장질환의 치료, 중풍, 혈액순환, 청혈작용 등의 순환기계 기능의 개선 및 당뇨병의 치료 등에 그 효능이 있다고 기록하고 있다. 최근의 연구에 따르면, 인진쑥은 이담작용이 높아 담즙을 많이 나오게 하는 동시에 담즙 속의 덩어리와 콜산, 빌리루빈을 밖으로 배출하여 간을 깨끗하게 하며, 혈압을 낮추고 열을 내리며 지질의 분해작용, 관상동맥 확장 작용과 이뇨 작용도 나타내는 것으로 보고되고 있다.
이러한 인진쑥의 인체에 유용한 생리활성 효능을 이용한 가공품으로 생당쑥엿, 편, 환 또는 추출차, 과립차 등의 제품이 개발되어 판매되고 있다.
그런데, 이러한 인진쑥을 이용한 건강 식품이나 생약 내지는 한약은 인진쑥을 에탄올로 추출하거나 열수로 추출한 추출물을 액상 또는 분말로서 이용한 것으로서 인진쑥의 단일 에탄올 추출물 내지 열수 추출물은 그 생리활성 효능 증강이나 다양한 생리활성물질의 유도에는 한계가 있는 것으로 나타났다.
이에 대한 대안으로 인진쑥을 다른 약용식물과 혼합·추출하여 효능의 다양화를 도모하고 있지만, 다양한 생리활성 물질을 유도하는 것과 관련하여서는 연구가 저조하였다. 이와 같이 인진쑥 제품들에 대한 연구는 학계와 연구소, 바이오벤처기업 등을 중심으로 활발히 진행되고 있지만, 대부분의 제품들은 효능이 알려진 인진쑥 자체를 이용하거나 천연 약재들을 단순히 추출하여 혼합한 것으로서 효능 만을 내세워 판매하고 있을 뿐, 한방에서 비방으로 알려진 혼합 생약 추출물의 범주를 벗어나지 못하고 있는 실정이다.
이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0379722호는 인진쑥 메탄올 추출분획물 중 일부가 발기부전 치료 효과가 있음을 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-0637699호에서는 인진쑥을 열수 추출하고 환류 냉각하여 추출한 농축액을 유효성분으로 함유하는 젖산 축적 억제용 음료를 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0401472호는 인진을 가열하고 환류냉각한 후 단백질 분해효소를 첨가하고 감압농축하여 얻은 인진쑥 추출물 함유 기능성 음료가 혈관이완효과, 뇌졸중 예방효과 및 항암효과를 높일 수 있다는 내용이 기술되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-0549661호에서는 녹차 수용성 추출물 40~70 중량%, 인진쑥 수용성 추출물 14~40 중량%, 솔잎 수용성 추출물 14~40 중량% 및 비타민 C 2~10 중량%를 함유하는 화장료 조성물이 항산화 효과 및 항염 효과를 나타낸다는 것이 개시되어 있다.
또한, 대한민국 등록특허 제10-0601265호는 인진쑥 에탄올 추출물이 성장 촉진 또는 성장 호르몬 분비 촉진 효과를 나타낸다고 기술하고 있고, 대한민국 공개특허 제10-2011-0058287호에서는 인진쑥 에탄올 추출물이 근육 신진대사를 촉진하고 기억력을 향상시킨다는 내용을 소개하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0656086호는 인진쑥 에탄올 및 유기용매 추출물이 식후 혈중 포도당 농도의 급격한 상승을 억제한다는 내용을 개시하고 있다.
이와 같이 인진쑥을 이용한 제품들에 대한 연구는 학계와 연구소, 바이오벤처기업 등을 중심으로 활발히 진행되고 있지만, 대부분의 제품들은 인진쑥의 메탄올 추출방식, 에탄올 추출방식, 열수 추출방식과 같은 종래의 인진쑥 추출방식을 벗어나지 못하고 있는 실정이며, 한방에서 알려진 인진쑥의 효능이나 용도를 과학적으로 규명하거나 의학적 가능성을 제시하는데 그치는 정도에 불과하여 식품원료로서의 인진쑥의 활용가치를 높이고 생체에 유용한 생리활성 기능을 향상시키는 새로운 인진쑥 발효 추출물 조성물의 제조방법과는 거리가 먼 것이었다.
한편, 대한민국 공개특허 제10-2010-0048707호에서는 인진쑥과 떡갈나무잎을 호기, 혐기조건을 교대로 반복하여 발효시킨 인진쑥 발효액을 개시하며 이것의 운동계질환 치료제, 동물의 백내장치료제, 개 PARVO 치료제로서의 가능성을 언급하고 있고, 대한민국 공개특허 제10-2011-0012118호는 녹차잎과 인진쑥의 혼합물에 소금을 넣고 6∼12개월간 발효 숙성시켜 제조한 미백용 피부 외용제 조성물을 개시하고 있다. 이들 종래기술은 발효라는 과정을 이용하여 전술한 종래기술들 보다는 진일보한 방식이나 인진쑥 단일 발효가 아닌 다른 성분과의 혼합물을 발효시킨 것이고 대기 중이나 토양 중에 존재하는 균류나 박테리아에 의해 발효되는 것이기 때문에 발효 과정이 복잡하고 발효 조건이 까다로운 문제점이 있었으며 대량 생산이 가능한 최적화된 발효공정과 발효 균주를 제시한 인진쑥 발효물질의 제조방법이 아니라는 한계가 있었다.
따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 인진쑥의 유기용매 추출물이나 열수 추출물의 단순한 제조공법을 탈피하고 인진쑥의 건강식품 또는 생약으로서의 가치를 높이는 새로운 인진쑥 추출물의 제조방법의 제시가 요구되고 있었다.
이에 본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 인진쑥의 추출물에 유산균을 접종하고 적합한 유산균 발효 조건 하에서 인진쑥을 발효시키면 종래에 알려진 인진쑥의 열수 추출물이나 에탄올 추출물 보다 항산화력이 우수하면서도 뼈성장촉진 효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물을 수득할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 인진쑥을 유산균을 이용하여 발효시킴으로써 항산화력이 우수하면서도 뼈성장촉진 효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
구체적으로, 본 발명의 목적은 인진쑥의 추출물 용액에 유산균을 접종하고 적합한 유산균 발효 조건 하에서 인진쑥을 발효시킴으로써 종래에 알려진 인진쑥의 열수 추출물이나 에탄올 추출물 보다 항산화력이 우수하면서도 뼈성장촉진 효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 식품원료로서의 인진쑥의 활용가치를 높이고 생체에 유용한 생리활성 기능을 향상시키는 새로운 인진쑥 발효 추출물 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유산균으로 발효된 인진쑥 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예의 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물에 있어서, 상기 인진쑥 발효 추출물은 인진쑥을 추출하여 인진쑥 추출물을 준비하고 상기 인진쑥 추출물의 수용액을 준비한 후 상기 인진쑥 추출물의 수용액에 유산균을 접종하고 발효시켜 수득한 것임을 특징으로 한다. 상기 인진쑥 추출물은 인진쑥 에탄올 추출물 또는 열수 추출물인 것이 바람직하고, 상기 인진쑥 에탄올 추출물 또는 열수 추출물은 동결건조과정을 거친 분말 형태인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물에 있어서, 상기 유산균으로는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리엄 인펀티스(Bifidobacterium infantis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconstoc mesenteroides), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 또는 이들의 혼합균주 등을 예시할 수 있으며, 김치에서 흔히 볼 수 있는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconstoc mesenteroides) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 또는 이들의 혼합균주를 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하기로는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 사용하는 것이다.
본 발명의 일실시예의 인진쑥 발효 추출물 조성물의 제조방법은,
(a) 인진쑥 추출물을 준비하는 단계와,
(b) 상기 인진쑥 추출물의 수용액을 준비하는 단계와,
(c) 상기 인진쑥 추출물의 수용액에 유산균을 접종하고 발효시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 인진쑥 발효 추출물 조성물의 제조방법에 있어서, 상기 인진쑥 추출물은 인진쑥 에탄올 추출물 또는 열수 추출물인 것이 바람직하고, 상기 인진쑥 에탄올 추출물 또는 열수 추출물은 동결건조과정을 거친 분말 형태인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 인진쑥 발효 추출물 조성물의 제조방법에 있어서, 상기 (c) 단계를 수행하기 전에 상기 인진쑥 추출물의 수용액을 가열하여 살균처리할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 인진쑥 발효 추출물 조성물의 제조방법에 있어서, 상기 (c) 단계에서는 상기 인진쑥 추출물의 수용액에 유산균을 0.1 내지 30 중량%, 바람직하게는 1 내지 5 중량%가 되도록 접종하고, 이를 20 내지 40℃, 바람직하게는 사용되는 유산균의 최적생육온도에서, 6 내지 76시간, 바람직하게는 16시간 내지 48시간 동안 정치 배양 혹은 진탕 배양하여 발효물을 제조한다. 또한, 상기 발효물의 pH를 3.0 내지 4.0로 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 인진쑥 발효 추출물 조성물의 제조방법에 사용되는 유산균으로는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리엄 인펀티스(Bifidobacterium infantis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconstoc mesenteroides), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 또는 이들의 혼합균주 등을 예시할 수 있으며, 김치에서 흔히 볼 수 있는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconstoc mesenteroides) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 또는 이들의 혼합균주를 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하기로는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 사용하는 것이다.
또한, 본 발명의 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물은 식품에도 쉽게 적용이 가능하다. 본 발명의 식품의 형태는 특별히 제한되지는 않으나 드링크류, 음료류 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물은 건강기능식품인 티백(tea bag), 캡슐, 분말, 또는 타정 제품 등에도 사용이 가능하다.
상기 식품에 있어서 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물의 함량은 특별히 제한되지는 않으나, 일반 식품류의 경우에는 최종 식품 중량에 대해 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물이 약 0.01 내지 50중량%로 포함되는 것이 바람직하고, 건강기능식품의 경우에는 최종 식품 중량에 대해 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물이 약 0.01에서 100중량%까지 포함되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물은 다양한 경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경·연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제(elixirs) 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분인 인진쑥 발효 추출물 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 항산화력과 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
본 발명에 따르면 인진쑥의 추출물 용액에 유산균을 접종하고 적합한 유산균 발효 조건 하에서 인진쑥을 발효시킴으로써 식품원료로서의 인진쑥의 활용가치를 높이고 생체에 유용한 생리활성 기능을 향상시키는 새로운 인진쑥 발효 추출물 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따르는 인진쑥 발효 추출물 조성물은 종래에 알려진 인진쑥의 열수 추출물이나 에탄올 추출물 보다 항산화력이 우수하면서도 뼈성장촉진 효능을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 종래의 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)의 산소 라디칼 흡수능을 비교하여 도시한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 종래의 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)의 환원 능력을 비교하여 도시한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 종래의 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)의 금속 킬레이팅 활성을 비교하여 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 종래의 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)의 HepG2 세포에 있어서의 AAPH에 의한 산화 스트레스에 대한 항산화 능력을 비교하여 도시한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 종래의 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)의 HepG2 세포에 있어서의 Cu2+에 의한 산화 스트레스에 대한 항산화 능력을 비교하여 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 종래의 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)의 조골세포 증식율을 비교하여 도시한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 종래의 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)의 환원 능력을 비교하여 도시한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 종래의 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)의 금속 킬레이팅 활성을 비교하여 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 종래의 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)의 HepG2 세포에 있어서의 AAPH에 의한 산화 스트레스에 대한 항산화 능력을 비교하여 도시한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 종래의 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)의 HepG2 세포에 있어서의 Cu2+에 의한 산화 스트레스에 대한 항산화 능력을 비교하여 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 종래의 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)의 조골세포 증식율을 비교하여 도시한 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
제조실시예 1: 인진쑥 추출액 및 추출분말의 제조방법
본 발명이 속한 기술분야의 당업자에게 널리 알려진 인진쑥 공급원으로부터 인진쑥(더위지기)를 150kg 공급받아 하기 표 1의 추출 조건으로 추출액을 제조하였다. 즉, 주정 50%의 에탄올 용매로 2회 추출하였으며, 추출 온도 및 시간 등 세부적인 사항은 하기 표 1과 같다.
표 1: 인진쑥의 추출 조건 및 농축 결과
상기와 같은 조건으로 수득된 인진쑥 농축액을 대용량 동결건조기(당업계에서 널리 사용되는 동결건조장치)를 이용하여 동결건조하여 인진쑥 추출분말을 수득하였다. 수득된 인진쑥 추출분말의 수분 함량은 3.45%였으며 인진쑥 건조량 150kg으로부터 추출분말을 21.72kg을 얻어 그 수율은 14.48%로 나타났다.
제조실시예 2: 인진쑥 발효 추출물 제조방법
제조실시예 1에서 수득된 인진쑥 에탄올 추출물(Lot 1, Lot 2, Lot 3)은 후술하는 시험예에서 본 발명의 인진쑥 발효 추출물의 비교예로서 사용된다. 그리고, 본 발명의 인진쑥 발효 추출물을 제조하기 위해 추가적으로 제조실시예 1에서 수득된 인진쑥 추출분말을 물에 환원하여 10% 용액으로 만들었고, 100℃에서 15분간 살균한 다음, 예시로서 다음과 같은 유산균을 접종하여 35℃에서 2일간 발효시켰다. 발효 후 pH를 측정하여 발효된 정도를 파악하였으며 그 결과는 하기 2표와 같다.
표 2: 유산균 종류별로 발효된 인진쑥 추출물 10% 용액의 pH 저하
상기 표 2를 보면, 인진쑥 추출물 10% 용액에서 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)의 발효가 가장 잘 이루짐을 확인할 수 있다. 따라서, 이하의 시험예에서는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의한 인진쑥 추출물 발효액으로 항산화 활성 및 조골세포 성장 효과를 평가하였다.
한편, 본 실시예에서는 유산균으로서 락토바실러스 플란타럼이 예시로서 사용되었으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리엄 인펀티스(Bifidobacterium infantis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconstoc mesenteroides), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 또는 이들의 혼합균주를 사용할 수 있다.
시험예 1: 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물의 항산화 활성 비교
시험예 1-1:
In vitro
항산화 활성 비교
시험예 1-1-A: 산소 라디칼 흡수능 (ORAC) 분석법을 이용한 퍼록실 라디칼 소거 활성
제조실시예 1과 제조실시예 2를 통해 제조된 인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물의 항산화 활성을 퍼록실 라디칼(Peroxyl radical) 소거 활성에 의해 평가하였다. 퍼록실 라디칼(Peroxyl radical) 소거 활성은 산소 라디칼 흡수능(Oxygen Radical Absorbance Capacity; ORAC), 즉 ORAC 지수(항산화 지수)를 쿠리하라(Kurihara) 등의 방법[Biol. Pharm. Bull. 27(7), 1093(2004)]을 변형한 ORAC 분석법을 이용하여 하기와 같이 비교 측정하였다.
참고로, ORAC 지수 (Oxygen Radical Absorbance Capacity)는 트롤록스 당량(Trolox Equivalent: μM)으로 나타내며, 식품의 항산화 능력을 측정하여 비교하는 수치로 볼티모어의 매릴랜드 소재, 국립 노화 연구소(National Institute on Aging)에서 개발한 항산화 지표이다. ORAC 지수의 수치가 높을 수록 활성 산소 흡수 능력(항산화력)이 높다는 뜻이다. 이러한 ORAC 분석법은 차, 과일, 동물의 조직 및 혈액 등과 같은 다양한 식품 및 생물소재들의 항산화 활성 분석에 널리 이용되고 있다.
ORAC 분석에는 형광의 간섭을 최소화하기 위하여 96-웰 마이크로 플레이트(96-well micro-plate)(black, flat bottom)를 사용하였다. 75 mM PBS(potassium phosphate buffer)(pH 7.4)에 녹인 100 ㎕의 40 nM 플루오레세인(fluorescein)을 상기 96-웰 마이크로 플레이트에 넣은 뒤 5 mM PBS (pH 7.4)에 희석한 각각의 농도별 측정 시료(인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물) 50 ㎕을 넣었다. 그 후 바로 75 mM PBS (pH 7.4)에 녹인 50 ㎕의 20 mM AAPH[2,2'-azobis (2-aminopropane) dihydrochloride]를 상기 플레이트에 첨가하였다.
수용성 비타민 E 유도체인 트롤록스(Trolox)와 AAPH는 분석시마다 새로 만들어 사용하였다. 측정은 형광 플레이트 측정기(fluorescence plate reader, GENios)(TECAN Trading AG, Switzerland)를 사용하였으며, 형광 분석기는 측정 전 10초간 쉐이킹(shaking)한 후 5초 동안 안정화하도록 설정하였다. 96-웰 마이크로 플레이트는 37℃에서 2분 간격으로 총 200분 동안 형광을 측정하도록 설정하였다. 플루오레세인은 여기파장(excitation wavelength) 485nm, 방출파장(emission wavelength) 535nm에서 측정하였다.
최종 결과는 측정시료의 형광값과 공시험(blank)의 형광값 간의 넓이 차이로 계산하였으며 표준 곡선(standard curve)은 1, 5 그리고 10 μM의 수용성 비타민 E 유도체인 트롤록스를 이용하여 측정하였다. 모든 결과를 TE (Trolox equivalents, μM)로 환산하여 나타내었다.
Hyunil Ha (Exp. Cell. Res., 2004)를 비롯한 다른 연구자들은 ROS(reactive oxygen species)는 파골세포 생성의 신호전달에 관여하여 파골세포의 생성을 촉진함으로써 골 흡수(bone resorption)를 활성화한다는 연구 결과를 보고하였다. 이는 항산화 활성을 가진 성분이 골 형성과 흡수 기전에 긍정적인 영향을 주는 것을 시사한다.
본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물의 퍼록실 라디칼(Peroxyl radical) 소거 활성은 도 1에 나타내었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 1 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖에서 1.34 (TE)에서 5.94 (TE)까지 퍼록실 라디칼 소거활성을 보였으며, 인진쑥 에탄올 추출물에 비해 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물의 퍼록실 라디칼 소거활성이 유의적으로 높은 것으로 나타났다. 이는 발효 과정 중 유산균에 의해서 인진쑥 생리활성 물질이 생물전환(bioconversion)되어 퍼록실 라디칼 소거활성이 높은 물질로 전환되었기 때문일 것으로 판단된다.
시험예 1-1-B: 환원 능력 (Reducing capacity) 비교
측정 시료의 환원 능력은 Arouma 등의 방법 (Arouma I O et al. J. Agic. Food Chem. 1998)을 이용하여 분석하였다. 10 mM PBS (pH 7.4)에 용해시킨 100 μM CuCl2 용액 20 ㎕와 동일한 버퍼에 용해시킨 250 μM 네오큐프로인(neocuproine) 용액 80 ㎕를 혼합한 후 측정시료(인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물) 40 ㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 반응액 200 ㎕를 96-웰 마이크로 플레이트로 옮겨 454 nm에서 ELISA 리더기를 이용해 흡광도를 측정하였다.
공시험 샘플(Sample blank)은 CuCl2 용액 대신에 10 mM PBS를 사용하였으며, 시료의 환원 능력은 Cu1+/네오큐프로인의 소광계수(extinction coefficient)(7.95×103 M-1cm-1)를 사용하여 상기 측정된 흡광도로부터 계산된 Cu1+의 농도로서 표시하였다.
Ronald L. Prior (J. Argi. Food Chem., 2005)를 비롯한 다른 연구자들은 생리활성물질이 전자를 공여함으로써 환원 능력이 증가한다고 보고하였다.
본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물의 환원 능력 비교는 도 2에 나타내었다. 도 2에 도시된 바와 같이, 1㎍/㎖ 및 5㎍/㎖에서 환원 능력을 측정한 결과 퍼록시 라디칼 소거활성과 유사한 결과를 보여 주었다. 이러한 결과는 발효과정 중에 인진쑥에 함유된 생리활성물질들이 유산균에 의해서 전자를 더 잘 공여할 수 있는 물질로 전환됨으로써 나타난 것으로 판단된다.
시험예 1-1-C: 금속 킬레이팅 활성 (Metal chelating activity) 비교
칼세인(Calcein)은 금속 이온과의 킬레이팅 활성을 측정하는데 널리 사용되는 형광 프로브이다. 금속 킬레이팅 활성은 Mariana 등의 방법 (Mariana DA et al. Arch. Biochem. Biophys., 2003)을 일부 변형하여 사용하였다.
측정 시료(인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물) 100 ㎕에 0.1 μM CuSO4 용액 100 ㎕을 가하여 잘 혼합한 다음 100 ㎕를 취해 0.1 μM 칼세인 용액 100 ㎕와 혼합하였다. 혼합한 용액 200 ㎕를 96-웰 블랙 마이크로 플레이트에 넣고 형광 플레이트 측정기(GENios fluorescence plate reader)를 사용하여 형광 강도를 측정하였다(여기 파장 485nm, 방출 파장 535nm). CuSO4를 첨가하지 않은 군을 대조군으로 하여 형광 강도(대조군에 대한 백분율: %)를 계산하였다.
DNA 골격은 음전하를 띄는 포스페이트 그룹으로 구성되어 있어 Fe2+나 Cu+ 같은 금속 이온이 쉽게 결합할 수 있으며, 대사과정 중에 생성되는 H2O2에 의해 펜톤 유사 반응(Fenton-like reaction) (Fe2+ 또는 Cu+ + H2O2 → Fe3+ 또는 Cu2+ + OH· + H2O)으로 DNA 손상을 야기할 수 있다(Nathan R. Perron et al. Cell Biochem. Biophys., 2009). Fe2+ 또는 Cu+ 이온과 같은 전이 금속 이온들을 킬레이팅하여 Cu2+ + OH· + H2O 생성을 억제시키는 것은 체내의 산화 스트레스를 억제하는데 중요한 의미를 가지게 된다.
본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물의 금속 킬레이팅 활성은 도 3에 나타내었다. 도 3에서 확인되는 바와 같이, 1㎍/㎖ 및 5㎍/㎖에서 금속 킬레이팅 활성을 측정한 결과, 인진쑥 에탄올 추출물의 경우 37.50 ~ 45.87% 사이의 금속 킬레이팅 활성을 나타내었으나, 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물의 경우 51.68%까지 금속 킬레이팅 활성이 증가하였다. 이러한 결과는 비교적 약한 금속 킬레이팅 활성을 가진 인진쑥이 발효에 의해 금속 킬레이팅 활성이 높은 물질들로 전환됨으로써 인진쑥 에탄올 추출물에 비해 본 발명의 인진쑥 발효 추출물이 높은 금속 킬레이팅 활성을 나타낸 것으로 판단된다.
시험예 1-2:
In vivo
항산화 활성 비교
시험예 1-2-A: 세포내 항산화 활성 (Cellular antioxidant capacity) 비교
AAPH 또는 Cu2+로 유도시킨 ROS(reactive oxygen species)에 대한 측정 시료(인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물)의 세포내 항산화 활성은 DCFH-DA를 이용하여 측정하였다. DCFH-DA는 세포막을 통해 세포로 유입되면 세포질에 존재하는 에스터라아제(esterase)에 의해 DCFH로 가수분해되고, 세포내에 ROS가 존재하게 되면 DCF로 산화되어 여기 파장 485nm, 방출 파장 535nm에서 녹색의 형광강도를 나타낸다.
측정 시료를 세포에 처리한 뒤 AAPH 또는 Cu2+로 산화적 스트레스를 유발하면 항산화 능력의 정도에 따라 차별적인 DCF 형광강도를 나타내므로 이를 이용하여 측정 시료의 세포내 항산화 활성을 측정할 수 있다.
시험예 1-2-B: 세포 배양
인간 유래 간암세포주인 HepG2 (KCLB, No. 88065)는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank)(Seoul, Korea)에서 구입하였다. HepG2 세포는 10% 열-불활성화된 FBS(fetal bovine serum)와 1% 항생-항균제를 포함한 DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium)으로 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 배양 배지는 1주에 3회 1:3 비율로 하여 계대 배양하였다.
시험예 1-2-C: AAPH [2,2'-azobis (2-aminopropane) dihydrochloride]에 의해 유도된 산화 스트레스에 대한 세포내 항산화 활성 비교
HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 5×105 세포/웰의 수로 배양하여 24시간 미리 인큐베이션(pre-incubation)하고 측정 시료를 30분간 처리하였다. 배지를 제거한 후 각 웰을 50 ㎕의 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 1회 씻어 주었다. 배지 대신 각 웰에 형광의 간섭을 받지 않는 200 ㎕의 HBSS로 교체해 주었다. 60 μM의 AAPH를 가하고 30분간 배양한 후 40 μM의 DCFH-DA를 가하여 30분간 추가로 배양하였다. 형광 플레이트 측정기(GENios fluorescence plate reader)(TECAN Trading AG, Switzerland)를 사용하여 여기 파장 485 nm, 방출 파장 535 nm에서 형광을 측정하였다.
세포주를 이용한 항산화 활성 분석은 in vitro의 항산화 활성 분석법에 비해 세포내 환경을 반영한다는 점에서 매우 유용한 모델이라 할 수 있다. 그 중 HepG2 세포는 항산화 활성을 분석하기에 잘 분화되어 있으며 Caco-2나 RAW 264.7 세포에 비해 일관된 결과를 도출할 수 있다는 장점을 가지고 있다(Liu et al. J. Argi. Food Chem., 2008).
본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물의 세포내 항산화 활성을 분석한 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인되는 바와 같이, AAPH에 의해 유도된 산화 스트레스(148.16%)에 대해 1, 5 그리고 10 ㎍/㎖의 측정 시료 모두에서 124.32 ~ 108.81%까지 산화 스트레스를 감소시켰으며, 특히 본 발명의 인진쑥 발효 추출물의 경우 인진쑥 에탄올 추출물에 비해 AAPH에 의해 유도된 산화 스트레스를 더욱 효과적으로 감소시킨 것(117.46 ~ 108.81%)으로 나타났다.
시험예 1-2-D: Cu
2+
에 의해 유도된 산화 스트레스에 대한 세포내 항산화 활성 비교
HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 5×105 세포/웰의 수로 배양하여 24시간 미리 인큐베이션(pre-incubation)하고 측정 시료를 30분간 처리하였다. 배지를 제거한 후 각 웰을 50 ㎕의 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 1회 씻어 주었다. 배지 대신 각 웰에 형광의 간섭을 받지 않는 200 ㎕의 HBSS로 교체해 주었다. 10 μM의 CuSO4를 가하고 30분간 배양한 후 40 μM의 DCFH-DA를 가하여 30분간 추가로 배양하였다. 형광 플레이트 측정기(GENios fluorescence plate reader)(TECAN Trading AG, Switzerland)를 사용하여 여기 파장 485 nm, 방출 파장 535 nm에서 형광을 측정하였다.
본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물의 세포내 항산화 활성을 분석한 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인되는 바와 같이, Cu2+에 의해 유도된 산화 스트레스(173.68%)에 대해 1, 5 그리고 10 ㎍/㎖의 측정 시료 모두에서 149.96 ~ 125.74%까지 산화 스트레스를 감소시켰으며, 특히 인진쑥 발효 추출물이 1, 5 그리고 10 ㎍/㎖에서 각각, 134.63, 130.73, 125.74 %까지 Cu2+에 의해 유도된 산화 스트레스를 농도 의존적으로 감소시켰다. 이는 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물이 천연 항산화 소재로 활용될 수 있음을 강력히 시사한다.
시험예 2: 본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물의 조골세포 성장촉진 활성 비교
시험예 2-1: 조골세포 배양 (Osteoblast culture)
MC3T3-E1 서브클론(subclone) 4 (ATCC, No. CRL-2593)는 ATCC(American Type Culture Collection) (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. MC3T3-E1 서브클론 4 세포는 10% 열-불활성화시킨 FBS(fetal bovine serum)와 1% 항생-항균제를 포함한 α-MEM(Minimum Essential Media Eagle, Alpha Modification)으로 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 배양 배지는 1주에 2~3회 1:3 비율로 하여 계대 배양하였다.
시험예 2-2: 유산균 발효에 의한 인진쑥 발효 추출물의 조골세포 증식촉진 활성의 증가
MC3T3-E1 서브클론 4 세포를 24-웰 플레이트에 5×105 세포/웰의 수로 배양하여 24시간 미리 인큐베이션(pre-incubation)하고 측정 시료를 48시간 처리한 후 5 mg/mL의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 용액을 4시간 처리하였다. 배지를 제거한 후 세포를 500 ㎕의 PBS (pH 7.4)로 2회 씻어준 후 수용액에 용해되지 않는 포르마잔(formazan)을 300 ㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 녹이고 그 중 200 ㎕를 96-웰 마이크로 플레이트로 옮겨 ELISA 리더기(Tecan, Austria)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 발명의 인진쑥 발효 추출물 조성물과 인진쑥 에탄올 추출물의 조골세포(osteoblast) 증식 활성(proliferation activity)은 도 6에 도시된 바와 같다. 도 6에서 확인되는 바와 같이, 0.1에서 10 ㎍/㎖의 농도에서 조골세포의 증식율이 농도 의존적으로 증가되는 것으로 나타났다. 본 발명의 인진쑥 유산균 발효 추출물의 경우 0.1, 0.5, 1, 5 그리고 10 ㎍/㎖에서 각각 118.19, 121.72, 129.70, 144.07 그리고 169.36%까지 조골세포의 증식율을 증가시켰으며 비교대상이 되는 인진쑥 에탄올 추출물에 비해 높은 증식율을 나타내었다.
이러한 결과는 인진쑥의 유산균 발효과정에서 조골세포의 증식을 증가시키는 물질의 함량이 증가된 것에 기인한 것으로 판단된다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
Claims (9)
- 유산균으로 발효된 인진쑥 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뼈성장촉진효능을 갖는 인진쑥 발효 추출물 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 인진쑥 발효 추출물은 인진쑥을 추출하여 인진쑥 추출물을 준비하고 상기 인진쑥 추출물의 수용액을 준비한 후 상기 인진쑥 추출물의 수용액에 유산균을 접종하고 발효시켜 수득한 것임을 특징으로 하는 인진쑥 발효 추출물 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 인진쑥 추출물은 인진쑥 에탄올 추출물 또는 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 인진쑥 발효 추출물 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
드링크류, 음료류, 티백(tea bag), 캡슐, 분말, 또는 타정 제품의 식품 형태인 것을 특징으로 하는 인진쑥 발효 추출물 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
정제, 환제, 경·연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 또는 엘릭시르제(elixirs)로 제형화되는 것을 특징으로 하는 인진쑥 발효 추출물 조성물. - 삭제
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