CN115299515A - 一种三七茎叶发酵粉及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明具体公开了一种三七茎叶发酵粉及其制备方法和用途，将三七茎叶烘干、粉碎、过筛得到三七茎叶粉，将三七茎叶粉加水调浆得到三七茎叶粉原浆，灭菌后冷却至60±5℃，加入植物乳杆菌与酿酒酵母(1:2)复配发酵剂，加水补至三七茎叶粉和水的料液比为1:20，混匀，利用酸度调节剂调节三七茎叶粉发酵原液的pH值为5.5，于30℃恒温发酵144h，得到三七茎叶发酵液，再将三七茎叶发酵液进行干燥、粉碎、过筛，即得三七茎叶发酵粉。该三七茎叶发酵粉富含皂苷、黄酮等活性成分，可替代三七应用于制备部分保健品，既将三七茎叶变废为宝、缓解环境治理压力，还缓解三七药材资源紧张的状况，降低利用三七制备大健康产品的生产成本。

Description

一种三七茎叶发酵粉及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及大健康产品制备技术领域，具体涉及一种三七茎叶发酵粉及其制备方法和用途。
技术背景
三七(学名：Panax notoginseng(Burkill)F.H.Chen ex C.H.)是五加科人参属多年生直立草本植物。三七，温性植物，味苦后甘，对其肝、胃都有一定调节作用，具有活血化瘀、消肿定痛等功效，有“金不换”、“南国神草”之美誉，三七的花和茎叶也是被列入新资源食品原料，是典型的具有功能导向的食药同源类食品。《本草纲目》称三七茎叶“治折伤、跌扑出血，敷之即止，青肿经夜即散，余功同根”。三七茎叶含有丰富的化学成分，主要以皂苷(人参皂苷、三七皂苷等)为主，其次还含有黄酮、多酚、脂质、蛋白质等，能够防止脑出血，增强记忆力等作用。自古以来，云南当地的壮族、苗族民间有用三七茎叶、花制作菜肴及将其泡茶饮用的习惯。到目前为止，民间尚无因食用三七茎叶而产生毒副作用及相关不良反应的报道。
研究发现三七茎叶功效丰富，含有活血化淤、止痛消炎、促进消化等功能以及多种活性成分。近年来，学者发现利用微生物发酵，使生物酶破壁，促使有效成分溶出，提高提取效率及药用价值。目前研究者大多关注三七根的开发与利用，研究其有效活性成分，常常将三七茎叶作为废弃物丢弃。据初步统计，每年三七总产量大约2000吨，但有80％的三七茎叶被浪费，既污染环境还占用土地。近年来，大多学者在植物化学及其药理实验等方面研究发现，在同株植物中，90％以上的植株器官之间存在关联性：如成分种类相对一致、功能特性效果一致等，因此三七茎叶中也存在着很多与三七根类似的活性成分，且通过微生物发酵能提高含量及成分。
综上，亟需探索出一种微生物发酵技术，可将三七茎叶中的有关活性成分充分提炼形成提取物，为三七茎叶综合开发利用寻求新的突破。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种三七茎叶发酵物及其制备方法和用途，利用微生物发酵技术将三七茎叶中活性成分充分提炼形成提取物，相比传统提取技术，显著提高三七茎叶中的皂苷类、黄酮类、总多酚类成分的提取率。
为了实现上述目的，本发明是通过如下技术方案得以实现的：
一种三七茎叶发酵粉，其制备方法包括如下步骤：
S1备料：将三七茎叶烘干、粉碎、过筛，得到三七茎叶粉；
S2复配发酵剂：将植物乳杆菌和酿酒酵母分别活化、培养得到植物乳杆菌菌液和酿酒酵母菌液，再按1:2的比例将植物乳杆菌菌液和酿酒酵母菌液混合均匀，得到发酵剂；
S3调浆：将三七茎叶粉加水调浆，得到三七茎叶粉原浆；
S4灭菌接种：将三七茎叶粉原浆灭菌，冷却至60±5℃，移入发酵设备，加入发酵剂，再加水补至三七茎叶粉和水的料液比为1:20，混匀，得到三七茎叶粉发酵原液；
S5发酵：利用酸度调节剂调节三七茎叶粉发酵原液的pH值为5.5，于30℃恒温发酵144h，得到三七茎叶发酵液；
S6干燥：将三七茎叶发酵液干燥，再将干燥物粉碎、过筛，即得三七茎叶发酵粉。
作为优选，所述烘干是指将新鲜三七茎叶洗净，置于恒温干燥箱内以48℃烘至轻捏即碎。
作为优选，所述过筛是指过60目筛。
作为优选，所述调浆是指三七茎叶粉和水按料液比为1:5混匀。
进一步地，所述发酵剂，其加入量为三七茎叶粉原浆体积的2％。
作为优选，所述灭菌是指将高压灭菌锅的温度设定为121℃，进行高压灭菌20min。
作为优选，所述酸度调节剂为醋酸、盐酸、苹果酸的其中一种。
作为优选，所述干燥是指将样品置于-80℃冰箱内过夜冻实，次日将样品放入冷冻干燥机干中，-30℃预冻2h,-40℃后预冻1h，升华干燥温度为-20℃，升华干燥时间为24h，真空度为15Pa，40℃解析干燥6h，真空度为15Pa。
本发明的另一目的在于提供一种三七茎叶发酵粉的用途，将上述三七茎叶发酵粉用于制备保健茶、保健酒、饮料、汤料包、膳食添加剂。
相对于现有技术，本发明的有益效果包括：
(1)相比于传统提取技术，本发明制备方法操作简便，三七茎叶中的有关活性成分皂苷、黄酮、总多酚的提取更为充分；
(2)通过对该三七茎叶发酵粉合理的应用，既改善三七茎叶作为废弃物丢弃的状况，缓解环境治理压力，将三七茎叶变废为宝的同时，还可以替代三七应用于制备部分保健品，缓解三七药材资源紧张的状况，降低各类大健康产品的生产成本。
附图说明
图1为本发明考察菌种种类对三七茎叶发酵提取影响图；
图2为本发明考察发酵剂复配比例对三七茎叶发酵提取影响图；
图3为本发明考察三七茎叶和水的料液比对三七茎叶发酵提取影响图；
图4为本发明考察发酵剂添加量对三七茎叶发酵提取影响图；
图5为本发明考察发酵温度对三七茎叶发酵提取影响图；
图6为本发明考察发酵时长对三七茎叶发酵提取影响图；
图7为本发明三七茎叶发酵粉与三七茎叶水提物关于抗氧化性能的对比图；
图8为本发明三七茎叶发酵粉与三七茎叶水提物关于稳定性测定(DPPH清除率)对比结果图；
图9为本发明三七茎叶发酵粉与三七茎叶水提物关于稳定性测定(ABTS+·清除率)对比结果图；
图10为本发明三七茎叶发酵粉与三七茎叶水提物关于抗疲劳能力测定(动物游泳模型)对比结果图；
图11为本发明三七茎叶发酵粉与三七茎叶水提物关于抗疲劳能力测定(负重游泳模型)对比结果图；
图12为本发明三七茎叶发酵粉对动脉粥样硬化的改善作用测定结果图。
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非限定本发明的范围。下述实施中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例具体考察了部分菌种种类对三七茎叶发酵提取影响，所涉及的菌种包括：CICC 20710嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、CICC 6226罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、CICC 194165植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、CICC32845克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、CICC 31393酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，CICC 6064瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)和CICC 6084约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，具体通过如下步骤完成考察，筛选得到用于本发明三七茎叶发酵粉的发酵剂所需菌种。
步骤一 菌种活化
将上述菌种按细菌、乳酸菌、真菌分类，依据下述相对应的活化方法进行菌种活化。
细菌活化：取菌种接种于200mL灭菌营养肉汤培养基中，于28℃在恒温培养箱中培养24h得到一代菌悬液。按12％的接种量将一代菌悬液接种于营养肉汤培养基中，28℃恒温培养18h得二代菌悬液。重复上述步骤28℃恒湿培养12h，进行第三次活化得到三代活化菌悬液，4℃冰箱储存备用。
乳酸菌活化：取菌种接种于200mL灭菌MRS肉汤培养基中，于37℃在恒温培养箱中培养24h得到一代菌悬液。按12％的接种量将一代菌悬液接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养18h得二代菌悬液。重复上述步骤37℃恒湿培养12h，进行第三次活化得到三代活化菌悬液，4℃冰箱储存备用。
真菌的活化：将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基，30℃恒温培养箱培养6d，使菌种充分活化。
步骤二 菌种筛选
细菌、乳酸菌类发酵剂制备：将上述步骤一中活化得到的各菌悬液加灭菌生理盐水调节至吸光度OD600＝2，分别以4000r/min离心15min收集沉淀，用灭菌生理盐水洗涤两次后，加入灭菌生理盐水调至吸光度OD600＝4，制得各菌种对应的发酵剂，备用；
真菌类发酵剂制备：将上述步骤一中活化得到的真菌用PDA液体培养基培养，加灭菌生理盐水调节至吸光度OD600＝1，离心取沉淀，用灭菌生理盐水洗涤两次后，加入灭菌生理盐水调至吸光度OD600＝2，制成发酵剂，备用；
原浆液制备：将三七茎叶烘干、粉碎、过60目筛，得到三七茎叶粉；将三七茎叶粉按料液比为1:5加水调浆，移入高压灭菌锅，以121℃高压灭菌20min，得到三七茎叶原浆液，备用；
接种发酵：待上述三七茎叶原浆液冷却至60±5℃，移入发酵设备，按原浆液体积的2％接入各发酵菌液，加水补至三七茎叶粉和水的料液比为1:20，混匀，利用酸度调节剂调节初始pH为5.5，在各菌种最适发酵温度下，发酵72h，得到发酵液；
测定原浆液、发酵液中皂苷、黄酮的含量，确定适宜的发酵菌株。测定方法如下：
(1)皂苷含量测定
采用香草醛-冰乙酸测定法，使用分析天平准确称取人参皂苷Re标准品1.5mg，置10ml试管中，利用移液管准确加6mL甲醇溶液，混匀，使溶液充分溶解，浓度为0.25mg/mL。使用移液枪分别将50μL-700μL人参皂苷Re标准品溶液放于10mL试管中，盖塞，每组平行三次。将其溶液蒸干(75℃-80℃水浴)，使用移液枪依次精确加入0.2mL现配(5％)香草醛-冰乙酸溶液及0.8mL高氯酸溶液，将水浴温度下降至65℃后持续水浴15min，拿出置于冰水5min，再加入5mL冰乙酸溶液，使用漩涡振荡仪震荡摇匀，并进行空白对照(随行试剂)。每组平行三次，测量前需润洗比色皿，保证数据准确性。在波长560nm条件下，采用1cm比色皿在下测定其吸光度，横坐标为标准品浓度，纵坐标为吸光值，绘制人参皂苷标准曲线：Y＝0.0048X-0.0104，R2＝0.9982。
(2)黄酮含量测定
采用AlCl3比色法测定三七茎叶发酵粉中总黄酮含量。准确称取5mg样品测定黄酮含量，并根据标准曲线回归方程：y＝0.918x+0.0207(芦丁浓度0.2-1.2mg/mL，R2＝0.9962)计算总黄酮含量。
测定结果见表1和图1。
表1菌种种类对三七茎叶发酵提取影响测定结果表
Figure BDA0003812262140000061
由表1和图1可见，经干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌发酵的三七茎叶发酵液皂苷含量均比未发酵的有所下降；植物乳杆菌、酿酒酵母在发酵过程中皂苷含量均有一定程度的上升，其单一菌种发酵时，活性物质皂苷及黄酮含量相接近，因此可以经本实施例筛选得到：植物乳杆菌、酿酒酵母为三七茎叶发酵相适宜的发酵菌株。
实施例2
本实施例将植物乳杆菌、酿酒酵母进行复配，考察复配比例对三七茎叶发酵提取的影响，筛选最优复配比例。
分别将植物乳杆菌、酿酒酵母进行活化；
将活化得到的植物乳杆菌菌悬液加灭菌生理盐水调节至吸光度OD600＝2，分别以4000r/min离心15min收集沉淀，用灭菌生理盐水洗涤两次后，加入灭菌生理盐水调至吸光度OD600＝4，制得植物乳杆菌菌液；
将活化得到的酿酒酵母用PDA液体培养基培养，加灭菌生理盐水调节至吸光度OD600＝1，离心取沉淀，用灭菌生理盐水洗涤两次后，加入灭菌生理盐水调至吸光度OD600＝2，制成酿酒酵母菌液；
将植物乳杆菌菌液、酿酒酵母菌液，按体积比为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3进行复配，得到复配发酵剂。
与实施例1同法制备三七茎叶原浆液，以上述复配发酵剂同法接种发酵，得到发酵液，同法测定各发酵液中皂苷、黄酮的含量，确定最适宜的复配比例。测定结果见图2。
由图2可见，复配比例为1:2时三七茎叶发酵液中皂苷、黄酮含量均为最高区域，因此本实施例筛选得到，适宜三七茎叶发酵的复配发酵剂最优复配方案为：植物乳杆菌与酿酒酵母的复配比例为1:2。
实施例3
本实施例针对三七茎叶发酵液中三七茎叶和水的料液比，对三七茎叶发酵提取的影响进行考察，考察方法具体如下：
原浆液制备：将三七茎叶烘干、粉碎、过60目筛，得到三七茎叶粉；将三七茎叶粉按料液比为1:5加水调浆，移入高压灭菌锅，以121℃高压灭菌20min，得到三七茎叶原浆液，备用；
复配发酵剂：同实施例2所述分别将植物乳杆菌与酿酒酵母进行活化，制备成菌液，将植物乳杆菌菌液、酿酒酵母菌液，按体积比为1:2进行复配，混合均匀，得到复配发酵剂，备用；
接种发酵：待上述三七茎叶原浆液冷却至60±5℃，移入发酵设备，按原浆液体积的2％接入复配发酵剂，分别加水补至三七茎叶粉和水的料液比为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，混匀，利用酸度调节剂调节初始pH为5.5，于30℃发酵72h，得到发酵液；
与实施例1同法测定各发酵液中皂苷、黄酮的含量，确定最适宜的料液比。测定结果见图3。
由图3可见，料液比为1:20时三七茎叶发酵液中皂苷、黄酮含量均为最高区域，因此本实施例筛选得到，适宜三七茎叶发酵的料液比最优方案为：三七茎叶与水的料液比为1:20。
实施例4
本实施例具体考察复配发酵剂(植物乳杆菌与酿酒酵母的复配比例为1:2)的添加量对三七茎叶发酵提取的影响，考察方法具体如下：
原浆液制备：将三七茎叶烘干、粉碎、过60目筛，得到三七茎叶粉；将三七茎叶粉按料液比为1:5加水调浆，移入高压灭菌锅，以121℃高压灭菌20min，得到三七茎叶原浆液，备用；
复配发酵剂：同实施例2所述分别将植物乳杆菌与酿酒酵母进行活化，制备成菌液，将植物乳杆菌菌液、酿酒酵母菌液，按体积比为1:2进行复配，混合均匀，得到复配发酵剂，备用；
接种发酵：待上述三七茎叶原浆液冷却至60±5℃，移入发酵设备，分别按原浆液体积的0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％接入复配发酵剂，加水补至三七茎叶粉和水的料液比为1:20，混匀，利用酸度调节剂调节初始pH为5.5，于30℃发酵72h，得到发酵液；
如实施例1，同法测定各发酵液中皂苷、黄酮的含量，确定最适宜的复配发酵剂添加量。测定结果见图4。
由图4可见，添加量为2％时三七茎叶发酵液中皂苷、黄酮含量均为最高区域，因此本实施例筛选得到，适宜三七茎叶发酵的复配发酵剂添加量最优方案为：三七茎叶原浆液的料液比为1:5时，复配发酵剂添加量为三七茎叶原浆液体积的2％。
实施例5
本实施例具体考察发酵温度对三七茎叶发酵提取的影响，考察方法具体如下：
原浆液制备：将三七茎叶烘干、粉碎、过60目筛，得到三七茎叶粉；将三七茎叶粉按料液比为1:5加水调浆，移入高压灭菌锅，以121℃高压灭菌20min，得到三七茎叶原浆液，备用；
复配发酵剂：同实施例2所述分别将植物乳杆菌与酿酒酵母进行活化，制备成菌液，将植物乳杆菌菌液、酿酒酵母菌液，按体积比为1:2进行复配，混合均匀，得到复配发酵剂，备用；
接种发酵：待上述三七茎叶原浆液冷却至60±5℃，移入发酵设备，分别按原浆液体积的2％接入复配发酵剂，加水补至三七茎叶粉和水的料液比为1:20，混匀，利用酸度调节剂调节初始pH为5.5，分别于26℃、28℃、30℃、32℃、34℃发酵72h，得到发酵液；
与实施例1同法测定各发酵液中皂苷、黄酮的含量，确定适宜发酵温度。测定结果见图5。
由图5可见，发酵温度为30℃时，制备所得发酵液中皂苷、黄酮含量均为最高，因此本实施例筛选得到，最适宜三七茎叶发酵的发酵温度为30℃。
实施例6
本实施例具体考察发酵时长对三七茎叶发酵提取的影响，考察方法具体如下：
原浆液制备：将三七茎叶烘干、粉碎、过60目筛，得到三七茎叶粉；将三七茎叶粉按料液比为1:5加水调浆，移入高压灭菌锅，以121℃高压灭菌20min，得到三七茎叶原浆液，备用；
复配发酵剂：同实施例2所述分别将植物乳杆菌与酿酒酵母进行活化，制备成菌液，将植物乳杆菌菌液、酿酒酵母菌液，按体积比为1:2进行复配，混合均匀，得到复配发酵剂，备用；
接种发酵：待上述三七茎叶原浆液冷却至60±5℃，移入发酵设备，分别按原浆液体积的2％接入复配发酵剂，加水补至三七茎叶粉和水的料液比为1:20，混匀，利用酸度调节剂调节初始pH为5.5，分别于30℃发酵0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h，得到发酵液；
与实施例1同法测定各发酵液中皂苷、黄酮的含量，确定适宜的发酵时长。测定结果见图6。
由图6可见，发酵时长为144h时，制备所得发酵液中皂苷、黄酮含量均为最高，因此本实施例筛选得到，最适宜三七茎叶发酵的发酵时长为144h。
实施例7
三七茎叶发酵液不利于储存和运输，因此需要干燥成粉，在众多干燥方法中，冷冻干燥是保留皂苷、黄酮类成分最佳的干燥方案。
本实施例结合上述实施例1-6筛选得到的最优方案，制备得到三七茎叶发酵液，再通过冷冻干燥制备为三七茎叶发酵粉，具体步骤如下：
原浆液制备：将三七茎叶烘干、粉碎、过60目筛，得到三七茎叶粉；将三七茎叶粉按料液比为1:5加水调浆，移入高压灭菌锅，以121℃高压灭菌20min，得到三七茎叶原浆液，备用；
复配发酵剂：同实施例2所述分别将植物乳杆菌与酿酒酵母进行活化，制备成菌液，将植物乳杆菌菌液、酿酒酵母菌液，按体积比为1:2进行复配，混合均匀，得到复配发酵剂，备用；
接种发酵：待上述三七茎叶原浆液冷却至60±5℃，移入发酵设备，分别按原浆液体积的2％接入复配发酵剂，加水补至三七茎叶粉和水的料液比为1:20，混匀，利用酸度调节剂调节初始pH为5.5，于30℃发酵144h，得到发酵液；
冷冻干燥：将样品置于-80℃冰箱内过夜冻实，次日将样品放入冷冻干燥机干中，-30℃预冻2h,-40℃后预冻1h，升华干燥温度为-20℃，升华干燥时间为24h，真空度为15Pa，40℃解析干燥6h，真空度为15Pa，收集冻干物料，粉碎、过筛，即得三七茎叶发酵粉。
实施例8
取上述实施例7所述三七茎叶发酵粉，以及适量白砂糖、蜂蜜、柠檬酸，加纯净水搅拌溶解，制备为饮料。该饮料每100mL含有三七茎叶发酵粉3.6g、白砂糖10.0g、蜂蜜1.0g、柠檬酸0.1g，按250mL的规格进行瓶装，饮用时，每日限量饮用一瓶。
实施例9
取上述实施例7所述三七茎叶发酵粉，以及白砂糖适量，加45％voL玉米酒搅拌溶解，制备为保健酒。该保健酒每100mL含有三七茎叶发酵粉1.5g、白砂糖2.0g。该保健酒每次饮用最大量建议为50mL。
实施例10
取上述实施例7所述三七茎叶发酵粉，按三七茎叶发酵粉与绿茶叶质量比为1:10加入绿茶叶，混合均匀，以15g/袋进行分装，制备为保健茶。
实施例11
取上述实施例7所述三七茎叶发酵粉，按13g/袋进行分装，制备为膳食添加剂。使用时，每500g鸡肉加水5L炖煮6h，所得鸡汤放冷至60±5℃后，加入13g三七茎叶发酵粉，搅拌溶解，即可出锅食用。
实施例12
取上述实施例7所述三七茎叶发酵粉，将鸡肉和水按料液比按1:10炖煮6h后，每1L鸡汤加入2.6g三七茎叶发酵粉，继续炖煮90min，200目纱布过滤，所得鸡汤加入15％变性淀粉、14g食用盐调配，进行喷雾干燥得三七茎叶鸡汤粉，按15g的规格进行袋装，制备为汤料包。
实验1
本实验针对实施例7所述三七茎叶发酵粉与三七茎叶水提物中皂苷、黄酮含量进行对比考察，与实施例1中同法进行皂苷、黄酮含量测定。
所述三七茎叶水提物的制备方法为：将干燥后的三七茎叶粉碎，以纯水为提取液，采用料液比1:10(m/V,g/mL)进行熬煮，沸腾后继续煮60min，使用三层医用纱布过滤，滤渣以料液比1:5(m/V,g/mL)加水过夜浸泡，重复以上熬煮过滤过程1次，将得到的提取液混合后减压浓缩至浸膏并预冻后冷冻干燥得粗提物,即得三七茎叶水提物样品。
测定结果见表2。
表2三七茎叶发酵粉与水提物中皂苷、黄酮含量测定结果表
Figure BDA0003812262140000111
由表2可知，三七茎叶发酵粉相比三七茎叶水提物，皂苷、黄酮含量更高，其中，三七茎叶发酵粉中皂苷含量约为三七叶提取物的2.5倍，黄酮含量约为三七叶提取物的2.1倍。由此说明，三七茎叶经过微生物发酵，活性物质更易从三七茎叶中溶出。
实验2
本实验针对实施例7所述三七茎叶发酵粉与三七茎叶水提物做抗氧化性能对比考察，考察结果见图7。
与实验1同法制备三七茎叶水提物。
本实验的具体步骤包括：
(1)样品溶液的制备
1)三七茎叶发酵粉溶液：精密称取实施例7所述三七茎叶发酵粉1.0g，加入10ml纯化水中，搅拌溶解，以4000r/min离心处理10min，备用。
2)三七茎叶水提物溶液：精密称取上述三七茎叶水提物1.0g，加入10ml纯化水中，搅拌溶解，以4000r/min离心处理10min，备用。
(2)抗氧化性能测定
1)羟自由基清除能力测定
反应体系中加入9mmol/L的FeSO4溶液0.2mL，以及9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液0.2mL，然后加入上述0.2mL上述样品溶液，最后加入8.8mmol/L的H2O2溶液0.2mL启动反应。于37℃条件下保温30min，以纯水为参比液，在510nm测定吸光值。按以下公式计算：
·OH清除率(％)＝[(A0-(A1-A2))/A2]×100％
式中：A0为空白对照吸光度，A1为样品吸光度；A2为不加显色剂H2O2样品溶液的吸光度。
2)总抗氧化能力测定
吸取上述样品溶液0.5mL，加入ABTS·+稀释工作液3.8mL，室温下反应6min，于734nm测定吸光度，纯水替代经三七茎叶发酵液作为空白，纯水代替ABTS·+稀释工作液进行调零。按以下公式计算：
ABTS·自由基清除率(％)＝[(s-sb)/(c-cb)]×100％
式中：s为ABTS·自由基清除能力吸光度，sb为样品干扰试验吸光度(调零)，c为ABTS·工作液吸光度，cb为纯水吸光度(调零)。
3)还原力测定：吸取上述样品溶液1mL于试管中，加入0.2mL磷酸盐缓冲液(0.2，pH＝6.6，PBS)，0.5mL的1％铁氰化钾溶液，混匀，50℃水浴20min。取出迅速冷却，加入1mL的10％TCA，混匀，4000r/min离心10min，取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL的1％FeCl3溶液。在700nm波长测定吸光值，以蒸馏水调零。空白组：用1mL蒸馏水代替多糖溶液；对照组：用0.5mL蒸馏水代替铁氰化钾溶液。按以下公式计算：
还原力＝(A样品-A对照)-A空白
4)Fe2+螯合力的测定：吸取上述样品溶液1mL，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL，以及蒸馏水3.7mL，混合放置5min，再加入5mmol/L的Ferrozine 0.2mL，室温放10min，于562nm波长测吸光值。空白组：用蒸馏水代替多糖样品溶液；对照组：用蒸馏水代替FeCl2溶液。按以下公式计算：
Fe2+螯合力(％)＝{A空白-(A样品-A对照)}/A空白×100％
由图7可见，三七茎叶发酵粉的羟自由基清除能力、总抗氧化能力、还原力、Fe2+螯合力，与三七茎叶水提物相比均更高，结合实验1的结论，三七茎叶发酵粉中皂苷、黄酮含量高于三七茎叶水提物，可以推论得知，三七茎叶发酵粉具有更强的抗氧化活性，其各项抗氧化性能指标与皂苷、黄酮等活性成分浓度呈正相关。
实验3
本实验针对实施例7所述三七茎叶发酵粉与三七茎叶水提物做稳定性对比考察，考察结果见图8、图9。
与实验1同法制备三七茎叶水提物。
本实验的具体步骤包括：
(1)样品溶液的制备：以纯水分别溶解三七茎叶水提物和三七茎叶发酵粉，并进行适当稀释以确保两种溶液中的总皂苷浓度相同。
(2)稳定性测定
采用外置紫外灯管(G15T8，Philips)进行稳定性测定。将上述样品溶液移取5mL于离心管内，放置于30℃的培养箱，保持紫外灯与样品的垂直距离为20cm，紫外照射0-7d。通过测量其DPPH·自由基清除能力及ABTS·+自由基清除能力来研究三七叶生物活性化合物的变化情况。
1)DPPH·自由基清除能力测定
吸取0.2mL上述样品溶液，加入31μg/mL的DPPH溶液，充分振摇后，室温下暗处放置0.5h，517nm处测定吸光度，纯水替代样品溶液作为空白，纯水代替DPPH溶液进行调零。按以下公式计算：
DPPH·清除率(％)＝[(s-sb)(c-cb)]×100％
式中：s为DPPH·自由基清除能力吸光度，sb为样品干扰试验吸光度(调零)，c为DPPH纯水溶液吸光度，cb为纯水吸光度(调零)。
2)ABTS·自由基清除能力测定
吸取离心后的的三七茎叶发酵液0.5mL，加入ABTS·+稀释工作液3.8mL，室温下反应6min，于734nm测定吸光度，纯水替代三七茎叶发酵液作为空白，纯水代替ABTS·+稀释工作液进行调零。按以下公式计算：
ABTS·自由基清除率(％)＝[(s-sb)/(c-cb)]×100％
式中：s为ABTS·自由基清除能力吸光度，sb为样品干扰试验吸光度(调零)，c为ABTS·工作液吸光度，cb为纯水吸光度(调零)。
由图8、图9可见，三七茎叶发酵粉与三七茎叶水提物分别长时间在紫外灯照射下，DPPH·自由基清除能力及ABTS·自由基清除能力逐步减弱。于同等照射时间下，三七茎叶发酵粉的DPPH·自由基清除能力及ABTS·自由基清除能力相比三七茎叶水提物更强。由此表明，经过微生物发酵，使三七茎叶中皂苷、黄酮等活性物质更充分地释放出来，能一定程度上对抗外界环境对活性物质造成的损失，进而提高了产品的稳定性。
实验4
本实验针对实施例7所述三七茎叶发酵粉与三七茎叶水提物做抗疲劳能力对比考察。
与实验1同法制备三七茎叶水提物。
本实验考察步骤具体包括：
(1)三七茎叶发酵粉溶液精密称取实施例7所述三七茎叶发酵粉，按每1.0g三七茎叶发酵粉加9ml生理盐水，搅拌溶解，现配现用。
(2)三七茎叶水提物溶液精密称取上述三七茎叶水提物，按每1.0g三七茎叶水提物加9ml生理盐水，搅拌溶解，现配现用。
(3)动物游泳模型
将4周龄雄性C57/BL6小鼠(体重20g±2g)在SPF环境中喂养，所有动物实验均按照云南农业大学动物伦理委员会(YNAU-201911017)批准的方案进行。然后将所有小鼠随机分为5组(每组6只)：对照组(蒸馏水)、低剂量组(50mg/kg发酵粉溶液)、中剂量组(100mg/kg发酵粉溶液)、高剂量组(200mg/kg发酵粉溶液)和非发酵组(200mg/kg水提物溶液)，各组每天同时间灌药，连续灌胃28d，每4天测量一次小鼠的体重和总摄食量，各组取平均值，考察结果见图10。
灌胃后，所有小鼠休息30min，然后进行负重游泳试验。小鼠被放置在游泳池里，附加自身5％的重量，每周在水温25±1℃、水深30厘米的水箱中游泳。记录小鼠从游泳到疲劳的时间，各组取平均值，考察结果见图11。
由图10、图11可见，三七茎叶发酵粉溶液组与三七茎叶水提物溶液组的小鼠体重无明显变化，表明三七茎叶发酵粉、三七茎叶水提物对小鼠均无毒性作用，均能改善小鼠的运动状态，各组小鼠生活习惯正常，同等剂量下，三七茎叶发酵粉相比三七茎叶水提物缓解小鼠运动疲劳的能力更强。
实验5
本实验针对实施例7所述三七茎叶发酵粉对动脉粥样硬化的改善作用进行考察，考察结果见图12。
与实验1同法制备三七茎叶水提物。
本实验考察步骤具体包括：
(1)三七茎叶发酵粉溶液精密称取实施例7所述三七茎叶发酵粉，按每1.0g三七茎叶发酵粉加9ml生理盐水，搅拌溶解，现配现用。
(2)动物粥样硬化模型
将雄性小鼠(年龄约8周)随机分为以下三个实验组：低脂饮食组(n＝5)、高脂饮食组(n＝8)、高脂饮食+三七茎叶发酵液组(n＝8)。低脂组的小鼠被喂食低脂饮食；高脂组的小鼠被喂食高脂肪饮食；高脂+三七茎叶发酵液组小鼠喂食高脂饮食，并严格按照200mg/kg灌胃三七茎叶发酵粉溶液。在SPF环境中喂养12周后，所有小鼠禁食过夜，用10％水合氯醛麻醉，并处死。采集了所有小鼠的主动脉、肝脏和血液样本。用4％中和福尔马林固定小鼠主动脉，然后在数字显微镜下去除主动脉周围多余的脂肪。然后从中心仔细剥离主动脉，用油红O染色分析主动脉斑块。所有动物实验程序均按照《云南农业大学实验动物护理与使用指南》进行，并经云南农业大学动物伦理委员会批准(YNAU202103042)批准。未观察到不良事件。
由图12可见，经三七茎叶发酵粉溶液干预治疗后，高脂饮食小鼠的动脉粥样硬化显著减轻，肝脏脂肪堆积也明显降低。由此表明，三七茎叶发酵粉具有改善动脉粥样硬化的功效。
综上实验，本发明三七茎叶发酵粉相比传统水提工艺所得的三七茎叶水提物中，皂苷、黄酮等活性成分含量更高，抗氧化性能、稳定性、抗疲劳能力，以及对动脉粥样硬化的改善作用都更显著。
以上所述实施例仅表达了本发明较佳的部分具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。本发明三七茎叶发酵粉可替代三七应用于制备部分保健品，既将三七茎叶变废为宝、缓解环境治理压力，还缓解三七药材资源紧张的状况，降低利用三七制备大健康产品的生产成本。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种三七茎叶发酵粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1备料：将三七茎叶烘干、粉碎、过筛，得到三七茎叶粉；
S2复配发酵剂：将植物乳杆菌和酿酒酵母分别活化、培养得到植物乳杆菌菌液和酿酒酵母菌液，再按1:2的比例将植物乳杆菌菌液和酿酒酵母菌液混合均匀，得到发酵剂；
S3调浆：将三七茎叶粉加水调浆，得到三七茎叶粉原浆；
S4灭菌接种：将三七茎叶粉原浆灭菌，冷却至60±5℃，移入发酵设备，加入发酵剂，再加水补至三七茎叶粉和水的料液比为1:20，混匀，得到三七茎叶粉发酵原液；
S5发酵：利用酸度调节剂调节三七茎叶粉发酵原液的pH值为5.5，于30℃恒温发酵144h，得到三七茎叶发酵液；
S6干燥：将三七茎叶发酵液干燥，再将干燥物粉碎、过筛，即得三七茎叶发酵粉。
2.根据权利要求1所述的一种三七茎叶发酵粉的制备方法，其特征在于：所述烘干是指将新鲜三七茎叶洗净，置于恒温干燥箱内以48℃烘至轻捏即碎。
3.根据权利要求1所述的一种三七茎叶发酵粉的制备方法，其特征在于：所述过筛是指过60目筛。
4.根据权利要求1所述的一种三七茎叶发酵粉的制备方法，其特征在于：所述调浆是指三七茎叶粉和水按料液比为1:5混匀。
5.根据权利要求4所述的一种三七茎叶发酵粉的制备方法，其特征在于：所述发酵剂，其加入量为三七茎叶粉原浆体积的2％。
6.根据权利要求1所述的一种三七茎叶发酵粉的制备方法，其特征在于：所述灭菌是指将高压灭菌锅的温度设定为121℃，进行高压灭菌20min。
7.根据权利要求1所述的一种三七茎叶发酵粉的制备方法，其特征在于：所述酸度调节剂为醋酸、盐酸、苹果酸的其中一种。
8.根据权利要求1所述的一种三七茎叶发酵粉的制备方法，其特征在于：所述干燥是指将样品置于-80℃冰箱内过夜冻实，次日将样品放入冷冻干燥机干中，-30℃预冻2h,-40℃后预冻1h，升华干燥温度为-20℃，升华干燥时间为24h，真空度为15Pa，40℃解析干燥6h，真空度为15Pa。
9.一种三七茎叶发酵粉，其特征在于，由权利要求1-8中任一项所述三七茎叶酵素粉的制备方法制备得到。
10.一种三七茎叶发酵粉的用途，其特征在于，将权利要求9所述三七茎叶发酵粉用于制备保健茶、保健酒、饮料、汤料包、膳食添加剂。
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