WO2005121343A1

WO2005121343A1 - Construction d'une recombinaison d'adenovirus oncolytique exprimant de facon specifique un facteur immunomodulateur gm-csf dans des cellules tumorales et utilisations correspondantes

Info

Publication number: WO2005121343A1
Application number: PCT/CN2004/001321
Authority: WO
Inventors: Zunhong Ke
Original assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd.
Priority date: 2004-06-07
Filing date: 2004-11-19
Publication date: 2005-12-22
Also published as: CA2568995C; RU2361611C2; EP1767642A4; PT1767642E; BRPI0418805B1; JP2008501349A; US20100047208A1; CA2568995A1; JP4874247B2; EP1767642A1; BRPI0418805A; EP1767642B1; DK1767642T3; CN100361710C; RU2006146665A; ES2466415T3; CA2568995E; BRPI0418805B8; CN1706955A; PL1767642T3

Description

肿瘤细胞专一表达免疫调节因子 GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体的构建及其应用技术领域

本发明涉及肿瘤的基因治疗，更具体地说是涉及构建一种肿瘤细胞专一的、且能表达免疫调节因子、诱导机体针对肿瘤细胞产生免疫反应的复制型腺病毒基因重组体。技术背景

利用病毒治疗肿瘤可追溯到上世纪初。医生在临床上观察到一些病人的肿瘤在病人经历一场病毒感染之后惊奇的消失了。这个谜团一直到上世纪二十年代才得以解开，并引起众多科学家及临床医生的重视。由此也兴起了利用病毒治疗肿瘤的尝试。到上世纪中叶，已有 50多种病毒被用于人或动物肿瘤的治疗 [Mullen and Tanabe (2002) The Oncologist 7:106-119; McCormick F (2001)Nature Review Cancer 1:130-141]。 1956年,在美国国家癌症研究所， Smith先生领导的课题组 [Smith et al. (1956) 9: 1211-1218]利用 10种野生的人类腺病毒感染 HeLa细胞或 KB细胞产生的细胞裂解上清液对 30多位患有子宫肿瘤的病人进行原位注射、肝动脉及静脉给药治疗。所有的病人在接受注射之后没有出现严重的副作用，只是出现类似于感冒的症状。有为数不少的病人在接受治疗之后肿瘤肿块缩小且出现肿瘤细胞裂解现象。由于当时技术水平的限制，病毒无法得到纯化而使这项工作没有得到进一步的深入研究。但 Smith研究组的工作大大地激励了科学家们利用病毒治疗肿瘤的信心 [Chiocca EA (2002) Nature Review Cancer 2:938-950]。

随着基因工程技术的进步，特别是对人类病毒研究的深入，在上世纪 90年代，科学家们终于能够有目的地利用肿瘤细胞基因表达的特性，用分子生物学技术对病毒基因组进行适当的改造，而能够有目的地构建在肿瘤细胞中繁殖的专一型基因工程病毒 [McCormick F (2001)Nature Review Cancer 1:130-141]。如倾向于在脑肿瘤中复制的 G207 [Martuza et al. (1991) Science 252:854-856],在 p53缺陷型肿瘤细胞中复制的 Addll520 (Onyx-015) [Bischoffet al. (1996) Science 274:373-376]和在前列腺肿瘤中复制的 CV706 [Rodriguez et al. (1997) Cancer Research 57:2559-2563]。这些工作渐渐形成了被称为病毒肿瘤治疗法 (Virotherapy)的学科。目前有 20多种病毒正在临床试验之中 [Mullen and Tanabe (2002) The Oncologist 7:106-119]。

构建肿瘤细胞专一复制病毒的方法有好几种。其中一类方法是利用肿瘤细胞特异的基因调控因子（如启动子和增强子等），去控制病毒基因组中决定病毒基因表达和病毒复制的几个关键基因，如腺病毒基因组中的 EIA、 EIB E2和 E4基因 [DeWeese et al. (2001) Cancer Research 61 :7464-7472]。通过这样改造，使病毒的关键基因的表达及病毒复制受控于安装进去的肿瘤细胞专一的基因调控因子的控制之中，如前列腺专一抗原的启动子和增强子 (prostate-specific antigen, PSA, promoter and enhancer)、白球蛋白的启动子和增强子（alpha-feto protein, AFP)及人类的 E2F-1 基因的启动子等 [McMcormick F (2001 ) Nature Review Cancer 1:130-141]。

人端粒酶 (telomerase)是一种控制细胞中染色体末端长度的重要酶，调节细胞在分裂分化过程中染色体末端的长度。人端粒酶主要有三部分组成，其中的 R A 和具有催化作用的逆转录酶基因（telomerase reverse transcriptase gene, hTERT)控制着人端粒酶的活性，而 hTERT的启动子决定着端粒酶的表达水平和酶的活性。

进一步研究表明，人端粒酶在成年人的正常细胞中没有活性或活性很低 [Kim et al. (1994) Science 266:2011-2015; Shay et al. (1997) European Journal of Cancer 33:271 -282]，但在超过 90%的肿瘤细胞中则有较高的表达 (Hahn and Weinberg(2002) Nature Review Cancer 2: 331-341; Shay and Wright (1996) Current Opinion Oncology 8: ⁶6_⁷1)。利用这个特点，科学家们已利用克隆到的 hTERT启动子构建了好几例基因表达栽体，其中包括最近发表的利用 hTERT 去控制腺病毒复制的工作 [Lanson et al.(2003) Cancer Research 63: 7936-7941; Kawashima et al. (2004) Clinical Cancer Research: 10: 285-292; Kim et al. (2003) Oncogene 22: 370-380; Irving et al. (2004) Cancer Gene Therapy 11 : 174- 185]。

腺病毒的基因组当中有着自身控制基因表达调控的元件，如内源的 E1A 启动子和增强子，其中的增强子与病毒的包装序列是重叠的。因此在一些已发表的文章中，有人将病毒的包装序列从病毒基因组原来的左端搬到右端，以为这样就可以降低病毒内源调控元件对外源基因调控序列及其功能的影响, 进而可能提高外源序列对病毒基因表达调控的控制 [Bristol et al. (2003) Molecular Therapy 7(6): 755-764; Jakubczak et al. (2003) Cancer Research 63: 1490-1499]» 但是这样做的后果却出乎设计者的预料。包装序列经搬家的病毒基因组在病毒复制过程中则变得不稳定而产生一系列重组体病毒 [WO 02/067861; ASGT 2003 annual meeting, Molecular Therapy]。因此，将病毒包装序列从左端搬到右端的设计是不可行的。那么如何保证病毒基因组稳定，不在放大生产过程产生重组体病毒又能减低病毒内源等因调控元件对外源启动子的影响呢？

科学家同时也认识到，在早期胚胎发育和分化，特别是在一些细胞，如子宫内膜细胞 ,造血祖先细胞和干细胞中仍有一定水平的端粒酶的表达 [Wright et al. (1996) Development Genetics 18: 173-179; Sharma et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 12343-12346; Kolquist et al. (1996) British Journal Cancer 80: 1156-1161; Tahara et al. (1999) Oncogene 18: 1561-1567; Tanaka et al. (1998) American Journal of Pathology 153: 1985-1991]。这种低水平的端粒酶活性引起了想利用 hTERT启动子控制治疗型基因表达载体, 特别是利用 hTERT启动子去控制病毒关键基因制备肿瘤专一的复制型病毒的科研工作者的担心 [Hahn WC (2004) Clinical Cancer Research 10:1203-1205]。因为如果这样改造后的病毒如果在祖先细胞（progenitor) 中由于低水平病毒关键基因的表达而使复制型病毒的大量繁殖，将在临床 . 上引起严重的毒副作用 [Huang et al. (2004) Clinical Cancer Research 10: 1439-1445; Hahn WC (2004) Clinical Cancer Research 10: 1203-1205; Masutomi et al. (2003) Cell 114: 241-253]。因此提高 hTERT启动子对肿瘤细胞的专一性是研究的课题。发明内容

本发明的目的在于提供一种将肿瘤细胞特异性的转录调控元件安装到人类腺病毒的基因组中去控制腺病毒关键基因的表达的重组体。

为实现上述目的，本发明提供一种肿瘤细胞专一的溶瘤性病毒体，以及这种病毒体与免疫调节基因结合的基因工程重组体。该重组体是通过 DNA克隆技术将肿瘤细胞专一的启动子和免疫调节基因安装到腺病毒基因组中，构建成一个能在特定肿瘤细胞中繁殖，也能在肿瘤细胞中表达免疫调节基因的融合序列。

本发明提供了一种肿瘤细胞专一的，可以表达一种免疫调节细胞因子的溶瘤性复制型病毒重组体，该重组体由载体病毒，肿瘤细胞专一的基因调节元件和免疫调节基因构建而成。

本发明还提供了上述溶瘤性复制型病毒重组体的制备方法。

本发明还提供了上述溶瘤性复制型病毒重组体在制备治疗和 /或预防肿瘤的药物中的应用。

本发明还提供了一种具有序列表中序列 2表示的核苷酸序列的启动子。本发明还提供了一种含有上述溶瘤性复制型病毒重组体的药物组合物。本发明所提供的上述溶瘤性病毒与免疫调节基因的重组体，可以达到控制病毒只在肿瘤细胞中复制的目的。本发明通过对 hTERT启动子进行基因改造，提高了 hTERT启动子的肿瘤细胞的专一性。本发明提供的重组体的制备方法，是将具有诱导人体对肿瘤细胞产生特异免疫反应的细胞因子基因与上述肿瘤细胞专一的复制型病毒进行有机结合，得到的重组体能在特定细胞中繁殖、生产，并可直接在肿瘤细胞中复制、表达，具有杀死肿瘤细胞的功能，从而达到预防或和治疗肿瘤的目的。

本发明还提供了不同于现有技术的构建溶瘤病毒的制备方法。现在已发表的工作在构建溶瘤病毒或基因工程病毒载体时都是在一种基因工程改造的细胞中进行，如 293细胞。由于这类细胞中表达 E1已缺失或 E1改造之后腺病毒复制繁殖所需的 E1区编码的蛋白基因。但这类细胞生产的腺病毒产品中常常是包含着一定水平的野生型腺病毒或重组性腺病毒。其道理是在 293细胞一类的生产细胞中含有腺病毒的基因序列，这段 "野生" 的腺病毒序列，与需要生产的 E1已缺失或 E1已加工过的腺病毒在细胞内就会产生重组而产生要么是野生型腺病毒，要么是重组型腺病毒。这样就不但会降低产品质量，也会引起可能想不到的毒副作用。我们介绍的生产用细胞将是一类不含腺病毒基因序列的细胞，从而避免了上述介绍的可能问题。

本发明还对腺病毒的表面进行了改造，使它提高与肿瘤细胞的亲和力，而增加感染肿瘤细胞的能力。最近的研究表明，不少肿瘤细胞不表达或在很低水平上表达腺病毒 5 型受体 (the coxsackie virus B and adenovirus receptor, CAR), 而这些肿瘤细胞都表达 CD46 [Shayakhmetov et al. (2002) Cancer Research 62:1063-1068]。进一步研究指出腺病毒 35型所用的受体正是 CD46蛋白 [Sirena et al.(2004) Journal of Virology 78(9): 4454-4462]。因此，我们提出将与 CD46蛋白受体作用的腺病毒 35 型上的纤维蛋白基因 (Fiber)顶结（knob)序列代替腺病毒 5型的顶结而构建一个融合腺病毒与受体作用的重组体。根据推测，这样的重组体将更广泛且更有效地感染肿瘤细胞。

本发明所述的载体病毒可以为 DNA病毒或 R A病毒的任何一种，可以是腺病毒中各种血型型，如腺病毒 5型、 2型、 35型、 41型等，其优选载体为腺病毒 5型，也可以是改造的腺病毒改造体，如将腺病毒的 E1A和 E1B基因用核糖体介入因子（internal ribosome entry site, IRES)连起来的腺病毒；如用腺病毒 35型上的纤维蛋白基因（Fiber)顶结（knob)序列代替腺病毒 5型的顶结而构建一个融合腺病毒；如在腺病毒的末端 (ITR)、包装序列（packaging site)之后，和外源启动子（如 hTERT启动子）之前安装一个转录的阻断序列（transcription termination signal); 如在腺病毒 E3区中编码 10.4K, 14.5K和 14.7K的序列已删除的腺病毒。这些阻断序列可以阻断任何核糖核酸聚合酶 (R A polymerase)介导的基因转录，如 SV40早期的多聚 (A)信号序列（poly(A) terminal sequence); 如在腺病毒 E3 区中编码 10.4K, 14.5K和 14.7K的序列已删除的腺病毒。

所述肿瘤细胞专一的基因调节元件是任何癌细胞特异的启动子、增强子、静止子或他们的组合，优选的是序列表中序列 2所表示的经过改造的 hTERT启动子，该启动子有转录因子 E2F-1的结合位点。变体，如 1 -2， IL-10, IL-12, IL-15, IL-24, IL-25, GM-CSF, G-CSF和 INF-alpha，INF-beta等。其最优选免疫调节基因为 GM-CSF, 包括分泌型和膜结合型 GM-CSF或它们的变体。

本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，将腺病毒的 E1A和 E1B基因用核糖体介入因子 IRES连起来，并且用腺病毒 35型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒 5型的顶结，并且在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列 2 表示的 hTERT 启动子，其中的免疫调节基因是 GM-CSF基因。优选为膜结合型 GM-CSF基因。

本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件列表中序列 2表示的 hTERT启动子，其中的免疫调节基因是 GM-CSF基因，其 DNA序列为序列表中序列 3表示的序列（命名为 KH-901 ), 其中的 GM-CSF基因也可以是膜结合型 GM-CSF基因（命名为 KH-902 )。

本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，并且用腺病毒 35型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒 5型的顶结，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列 2表示的 hTERT 启动子，其中的免疫调节基因是 GM-CSF基因（命名为 KH-904 ), 优选是膜结合型 GM-CSF基因（命名为 KH-905 )。

本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，在腺病毒 E3 区中编码 10.4K, 14.5K和 14.7K的序列已删除的腺病毒，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件列表中序列 2表示的 hTERT启动子，其中的免疫调节基因是 GM-CSF基因 , 优选是膜结合型 GM-CSF基因（命名为 KH-903 )。

本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，并将腺病 ·的 E1A和 E1B基因用核糖体介入因子 IRES连起来，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列 2表示的 hTERT启动子，其中的免疫调节基因是 GM-CSF基因（命名为 KH-906 )。

本发明重组体包括但不限于以下：

KH-901 , KH-902, KH-903, KH-904, KH-905和 KH-906。

其中重组体 KH-901的基因序列如序列表中的序列 3, 其中： 1) 1-103:腺病毒左侧臂 (ITR) [腺病毒 5型基因组全序列： Genbank No: BK000408];

2) 194-358: 腺病毒基因组包装序列和 El增强子序列；

3) 362-534: SV40多聚腺嘌呤核苷酸信号序列和连接序列 (linker) (腺病毒 5型中碱基从 #362到 #551已删除)；

4) 525-811 : 经基因工程技术改造的 hTERT启动子序列和连接序列；

5) 812以右：腺病毒序列包括 E1A, E1B, E2等；

6) 28995-29436: 免疫调节基因人类 GM-CSF基因；

7) 29437以右：腺病毒序列包括 E4以及和右侧臂。

重组体 KH-900的基因组序列类似于序列 3，只是其中的 hTERT启动子是野生型没有减基的改变，请参阅序列 1和序列 2。在病毒基因包装区与 hTERT启动子之间没有多聚腺嘌呤核苷酸信号序列。

重组体 KH-902的基因组序列类似于 KH-901 , 只是其中的免疫调节基因 GM-CSF由 KH-901中的分泌型变成了膜结合型，其序列见序列 4。

重组体 KH-903的基因组序列类似于 KH-901 ,只是其中在 E3区中编码 10.4K, 14.5K和 14.7K的序列已删除。删除的序列是与腺病毒碱基 29804 至械基 30857。这三个基因编码的蛋白会抑制免疫反应，特别是肿瘤坏死因子介导的免疫反应。因此，删除这三个基因的溶瘤性腺病毒可能会诱导产生更强的抗肿瘤的免疫反应。

重组体 KH-904基因组序列类似于 KH-901只是其中的纤维蛋白基因中编码顶结 (knob)的序列由腺病毒 5型变成了 35型。其详细序列见序列 5。最近的研究工作表明，很多肿瘤细胞不表达腺病毒 5型的受体蛋白 (CAR), 而高水平的表达 CD46蛋白。 CD46蛋白是腺病毒 35型的受体。这样，如果将与 CD46蛋白作用的纤维蛋白上的相关序列嫁接到腺病毒 5型上，形成的重组体将作用于 CD46受体而增高感染肿瘤细胞的效率。

重组体 KH-905 是在重组体 KH-904 的基础上将其中的免疫调节蛋白 GM-CSF由分泌型变成膜结合型。

重组体 KH-906的基因组则是在 KH-901的基础上，用核糖体进入序列 (Internal ribosome entry site, IRES)取代 EIB 的启动子 [Li et al. (2001) Cancer Research 62: 1 Zhang J et al. (2002) Cancer Research 62: 3743-3750]。

本发明还包括序列表中序列 2所表示的经过改造的 hTERT启动子，该启动子有转录因子 E2F-1的结合位点。

本发明还包括该启动子的制备，根据图 1中 hTERT启动子序列设计合成两段引物：

A. 5 '-GTCTGGATCCGCTAGCCCCACG-3 '

B. 5 '-CGACCGGTGATATCGTTTAATTCGC-3 '

作为引物，以激活的人体基因组核糖核酸作为模板，经 PCR方法扩增到人的 hTERT启动子。其中，反应奈件为：第一循环： 94。C变性 5分钟， 81°C退火 1分钟， 72。C延伸 2分钟；以后的循环： 93。C变性 1分钟， 68。C 退火一分钟， 72°C延伸 2分钟，共 35个循环。由此得到的 PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳分析，回收得到 hTERT启动子片断。经测序分析，得到的启动子片段与发表的一样（图 1 )。然后将这段 DNA克隆到 pUC19载体之中，利用定点突变的方法 (Strategene定点诱导方法)将 hTERT启动子序列变成图 2所示的序列。

本发明还包括上述制备方法得到的启动子，其具有序列表中序列 2表示的核苷酸序列。

在本发明的 hTERT启动子中，没有常见的 "TATA"这样保守序列，但是其含有两个 "CACGTG" 的 E-盒和 4个 "GC" 丰富的 Sp-I结合区。这些保守序列是通过 C-Myc/Max复合体和 Sp-I调控 hTERT启动子转录特别端粒酶活性表达的关键 [Cong et al. (1999) Human Moleular Genetics 8(1): 137-142; Kyo et al. (2000) Nucleic Acids Research 28(3): 669-677].很多实验表明 Myc是在细胞增殖和细胞周期过程中扮演重要作用，从而进一步通过 hTERT启动子而影响到端粒酶的转录和表达。

为了减少 hTERT启动子在正常细胞如造血祖先细胞中的活性，进一步提高 hTERT启动子的肿瘤细胞的特异性，我们对 hTERT启动子做了很详细的序列计算机结构和转录蛋白因子结合的模拟。根据计算机对转录蛋白因子构象的分析 ,我们对 hTERT启动子中多个转录因子的结合部位进行了系统的序列突变分析。在一系列突变体中，我们选择了一个变体，这个变体中在第 4个 Sp-I结合序列之上变成了一个转录因子 E2F-1的结合位点。由原来的 ' ...TTTCCGCGGCCCCGGCC...' (图 1) 变成了 ' ...TTTCCG CGGCAACGCCC...，（图 2)

体外试验表明，经过突变之后的 hTERT启动子，不但具有原有肿瘤细胞中的活性，而且使它在正常细胞中的 "启动" 活性大大地降低了，从而阻断了 hTERT原始启动子在造血祖先细胞等正常细胞中的转录活性。利用报导基因的转染试验证明，经改造后的启动子在肿瘤细胞中要比野生的启动子高 5到.10倍，而在正常细胞中的活性则降氐了（图 6)。利用它控制腺病毒关键基因表达，而构建成的复制型腺病毒对干细胞已没有毒性 (图 7)。. 从而可能提高了这类复制型腺病毒在临床上的安全性。

由于 E2F-1启动子能在 pRb/E2F/pl 6通道途径缺失的肿瘤细胞中转录连接的基因，而使 E2F-1启动子广泛利用于基因治疗，特别是用于构建复制型腺病毒之中 [Parr et al. (1997) Nature Medicine 3(10): 1145-1149; Jakubczak et al. (2003) Cancer Research 63: 1490-1499; Bristol et al. (2003) Molecular Therapy 7(6): 755-763]。经我们这样的改造后的 hTERT启动子，不但有 E2F-1基因结合位点，而且有 E2F-1启动子中具有的 Sp-I和 NF-1 结合位点，从而使改造后的 hTERT启动子可以在端粒酶表达和 Rb通道途径变异的肿瘤细胞中转录相关基因。因此这个经我们改造后的 hTERT启动子将在这两类肿瘤细胞中有转录功能，而不能在正常细胞包括干细胞中表达，进而大大的提高了它的肿瘤细胞的专一性。与此同时，我们还进一步将腺病毒的 E1A和 E1B基因用核糖体介入因子（internal ribosome entry site, IRES)连起来，一同受控于 hTERT启动子。这样腺病毒的两个重要基因 E1A和 E1B在转录上同时受到 hTERT启动子的控制，从而进一步提高了病毒的细胞特异性（KH-906)。

本发明在腺病毒的末端 (ITR)和包装序列（packaging site)之后，和外源启动子（如 hTERT 启动子）之前安装一个转录的阻断序列（transcription termination signal)„ 这些阻断序列可以阻断任何核糖核酸聚合酶 (RNA polymerase)介导的基因转录。如 SV40 早期的多聚 (A)信号序列（poly(A) terminal sequence)。体外试验表明由于 SV40 poly(A)序列的介入，腺病毒末端序列 ITR和重叠于包装序列之中具有增强子效应的序列对 hTERT启动子的影响变得很少。

本发明的重组体安装有免疫调节基因。已知的几个溶瘤性病毒当中，都安装有细胞因子 GM-CSF 。本发明的重组体也安装有 GM-CSF, 但不局限于只用 GM-CSF, 可以是其它细胞因子（cytokines)。但是 GM-CSF是一种被认为是最具活力的免疫调节因子 (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3539-3543)„ 它是一种分泌型糖蛋白，能刺激粒性白细胞 (granulocytes), 单核白细月包 (monocytes), 巨¹^细月包 (macrophage)和树状细包 (dendritic cells)的分化，刺激抗原呈递细胞上的 MHC和 B7辅助分子的高表达。同时 GM-CSF还可促进免疫细胞的组织渗入及 B细胞的分化。因此在过去的几年里，科学家利用重组的 GM-CSF蛋白和化疗药物一起治疗肿瘤病人。同时，多个利用表达 GM-CSF的肿瘤细胞作为肿瘤疫苗正在临床试猃之中 [Armitage Jo (1998) Blood 92: 4491-4508; Mach et al. (2000) Cancer Research 60: 3239-3246; Gilboa E (2004) Nature Reviews Cancer 4: 401-411]。表达 GM-CSF的复制型溶瘤性病毒不但能通过病毒的复制杀死肿瘤细胞，而且由于感染的肿瘤细胞中也表达 GM-CSF, 在体内建立起了肿瘤疫苗站 (in situ cancer vaccine/immunotherapy), 具有月中瘤免疫治疗作用。这样，不但省去了常规肿瘤免疫加工过程中的繁瑣流程，而且由于肿瘤细胞未经体外分离培养，可以更好保存了肿瘤自身的特性，如抗原的表达，从而使这个 "体内" 肿瘤疫苗更加有效。这样设计的病毒可能通过原位给药，不但对原位癌细胞具有杀伤作用，也能针对对转移肿瘤产生治疗效果。所以这是一个构建溶瘤性腺病毒很特别的构思和设计。

在本发明的系列病毒之中，有两个病毒是表达一种膜结合型的细胞因子 GM-CSF (membrane bound GM-CSF, mbGM-CSF)。在溶瘤腺病毒中利用膜结合型 GM-CSF的构思是基于已发表的工作。研究工作表明，膜结合型 GM-CSF可以增进与皮下树状细胞（Dentritic cells) 的作用，而产生比分泌型 GM-CSF对树状细胞更强的调理作用作用 [Soo Hoo et al. (1999) Journal oflmmundogy 169: 7343-7349; Yei et al. (2002) Gene Therapy 6: 1302-1311]。在溶瘤性病毒中表达膜结合型细胞因子 GM-CSF的构思和重组基因工程药物未见报导。

本发明还包括本发明的重组体的制备方法，该方法包括以下步骤： a) 含有 hTERT启动子序列的腺病毒左侧臂的制备；

b) 含有免疫调节基因的腺病毒右侧臂的制备；

c) 将腺病毒左侧臂和腺病毒右侧臂转染到 293 细胞、 HeLa 细胞、 HeLa-S3细胞或 A549细胞中，通过同源重组的方法得到所述的重组体。

本发明的重组体具体可以通过如下方法获得：重组病毒是在真核细胞中同源重组获得的。首先，含有腺病毒左侧臂序列的 PXC.1 (购于加拿大的 Microbix)在体外通过 DNA克隆技术将内源 E1A启动子序列删除，取而代之的则是多聚腺嘌呤核苷酸和端粒逆转录酶 hTERT 启动子序列而得到 pKH-901a。同时，腺病毒的右侧臂 pBHGE3 (购于加拿大的 Microbix)通过类似的方法用免疫调节基因 GM-CSF取代 E3 区中的 gpl9k基因而得到 PKH-901b。

PKH-901a和 PKH-901b —起转化 HeLa细胞，通过同源重组的方法而得到 KH-901。同样的，其他重组腺病毒包括 KH-900, KH-902, KH-903, KH-904, KH-905和 KH-906也通过类似方法而构建而成。

实质上，该重组体可在任何直接细胞或原核细胞中以同源重组的方式获得。

根据上述方案，利用 PCR扩增方法在 pXC.l的碱基第 362位到 551位处分别加上内切酶位点 Sspl和 PinAI (Agel)。 hTERT启动子则用 PCR从人体基因库中放大得到 , 并与多聚腺嘌呤核苷 ^^列一起在体外经 PCR将两个片端取接起来而变成一段 DNA。在这段 DNA的两端加上内切酶位点 Sspl 和 PinAI。经酶切后分离到的 DNA片段与多重同样酶切的 pXC.l连接，转化大肠杆菌株 DH5-alpha细胞 (Invitrogen, USA)。'转化后挑选 10 菌斑，在培养箱中培养 24小时，提取 DNA，经酶切分析鉴定，将得到的序列命名为 PKH-901a。

以 5，-ATAACCATGTGGCTGC-3,和 5，-AAATTACTCCTGGACTGG-3，作为引物，通过 PCR A^的激活的巨噬细胞（macrophage)的 cDNA中增扩免疫调节因子 GM-CSF , 将扩增的全长 GM-CSF 基因克隆到原核质粒 pUC19, 进行测序验证。随后，利用运输载体将 GM-CSF的 cDNA片段克隆到 pBHGE3当中取代 gpl9k基因编码区，经测序和酶切检验，将得到的序列命名为 pKH-901b。

将构建好的重组载体 pKH-901a和 pKH-901b转染 HeLa 细胞，使二者发生同源共组。两个纯化的质粒 DNA用 Clal线性化，然后经 lipofectin [USA Invitrogen]介导转化 HeLa细胞，经转化 10天之后，细胞被刮下来，经冻溶三次，取 1.00微升，在 HeLa细胞上进行病毒斑检。 8天之后，在低凝点凝胶之下开始看到病毒斑点。挑选 6个病毒斑，接种到预先种好的 HeLa 细胞中，经 4天至 6天之后，收集并低温保存裂解的细胞液。这些裂解液被用来提取腺病毒的 DNA [Qiagen's kit], 经酶切， PCR和 Southern杂交确定病毒的分子结构，将序列命名为 KH-901。本发明的重组体可用于制备治疗和 /或预防各种恶性肿瘤的药物。本发明的重组体可以与放疗和化疗一起使用，取得更好的治疗效果。

本发明的重组体可制备成静脉注射，动脉注射，瘤内注射，肌肉注射，皮下注射，器官注射，和胸、腹水内注射的药物组合物。

对于大规模制备，可利用本发明方法制备的重组体，转染到 HeLa细胞或 HeLa-S3或 A549细胞中，经过培养，繁殖，浓缩，纯化等方法制备，得到大批量的可用于制药的本发明重组体原料，再进一步和 /或与药物可接受的载体混合，用药物制剂的常规技术，制备成临床上可利用的注射液。

以下通过实验数据说明本发明的有益效果：

实验 1: hTERT启动子的活性及肿瘤细胞专一性的比较

将野生型的 hTERT启动子 (telo)和经突变修饰之后 hTERT启动子 (Mtelo) 与报导基因 luciferase (luc)相连。然后分别将这两种质粒 DNA转化多种肿瘤细胞和人体正常细胞。 48小时之后，转化后的细胞被裂解并用于测定其中 luc的表达情况。其中转化效率用 lacz报导基因质粒来标准化。从相对的 luc活性中可以看出，第一，在肿瘤细胞中，突变修饰之后的 hTERT启动子 (Mtelo)要比野生型 hTERT启动子 (telo)活性高很多（见图 6 )。例如在 Hep3B细胞中， Mtelo活性比 telo高 6倍多，在 LNCap细胞中 Mtelo启动子比 telo启动子高 18倍多。第二，在正常细胞中， telo启动子有一定转录活性，而 Mtelo启动子则基本上只是背景水平的活性。如在 MRC5 胞当中， Mtelo介导的 luc活性比 telo启动子控制的 luc活性要低 6倍。这些结果表明，经修饰改造的 hTERT启动子具有更强的肿瘤细胞专一性和转录能力。

这个结论在随后的病毒对细胞的杀伤作用实验中得到进一步的确证。野生型腺病毒 Ad5, 缺陷型腺病毒 dl312 [E1A缺失]，重组体 KH-900和 KH-901被用来感染人体初生.前皮肤细胞 [foreskin keratinocytes, hFKs] 和转化人体乳头状瘤病毒血型 16型 (human papilloma virus type 16, HPV-16) 的 E6基因（hFKs-E6)。早先的研究工作表明转化 HPV16-E6基因细胞具有比父代细胞高许多的端粒酶活性 [Horikawa et al. (2001) Journal Virology 75(9): 4467-4472]。病毒感染之后，我们用定量的 PCR方法对其中 E1A信使 mRNA的拷贝数进行分析，确定在 hTERT启动子控制之下的腺病毒关键基因 E1A的转录表达情况。试验的结果如图 7所示，在 dl312感染的 hFKs 和 hFKs-E6细胞中没有检测到 E1A信使 mRNA; 在 Ad5感染的细胞中检测到高于 4000拷贝 mRNA; 在 hFKs和 hFKs-E6两种细胞中 E1A mRNA 的拷贝数差异不大。在 KH-900感染的细胞中， hGKs细胞中只有少数信使 E1A mRNA, 而在 hFKs-E6细胞中，则有比在 hFKs中高出 20倍的 El A信使核糖核酸。有趣的是，在 KH-901 感染的细胞中， hFKs-E6细胞中比在 hFKs细胞中超过 100倍的 E1A信使核糖核酸，同时， KH-901感染的 hFKs 细胞中 mRNA拷贝数比较低。这个实验表明， Mtelo启动子与报导基因相连时要比 telo启动子更强的活性，更高的肿瘤细胞专一性，而且在安装入腺病毒基因组中时，仍表现出更高的专一性和更强的对下游基因的启动转录控制能力。

这个结果在对体外培养的骨髓细胞的试验中也得到进一步的论证。重组体 KH-900和 KH-901用来感染（每细胞 1个感染单位） 293细胞和骨髓干细胞，然后检测细胞的存活力，如图 8所示， KH-900和 KH-901杀伤 293 细胞的能力相当。 KH-901对骨髓干细胞的杀伤能力几乎等于零，但 KH-900 对骨髓干细胞则有一定杀伤作用。

实验 2: 重组溶瘤性复制型腺病毒对肿瘤细胞杀伤能力之比较

重组体病毒 KH-900, KH-901 , ΚΉ-902和 KH-903对肿瘤细胞杀伤能力的比较是通过测定病毒感染之后存活细胞的多少来确定的。肺癌细胞系 A549预先接种在培养亚上等到 85%左右饱和度时用病毒去感染，感染的浓度是每个细胞受到 1个致斑单位 (PFU)(M01=1)。在病毒感染之后不同时间，对细胞的存活度进行测试 [Hallenbeck et al. (1997) Human Gene Therapy 11： 1172-1179]。所得的结果如图 9。四个重组体腺病毒当中， KH-904的杀死肿瘤细胞能力最强， KH-901和 KH-902杀伤肿瘤细胞的能力相差无几，都比 KH-904要弱。 KH-900杀伤能力最弱。

这个结果表明，经基因工程改造的 hTERT启动子 (Mtelo)比野生的启动子 (tdo)要强。同时，带有纤维溶合蛋白基因 (Ad5/35)的重组腺病毒比野生的纤维蛋白基因 (Ad5)的重组腺病毒要有更强的杀伤肿瘤细胞的能力。这个结论在更多肿瘤细胞和人体正常细胞的杀伤能力比较中得到了进一步的论证 [表 1]。表 2是 6种重组腺病毒在 9种肿瘤细胞和 5种人体正常细胞中所确定的 EC₅o值大小比较。这个实验操作如下：肿瘤细胞在加病毒之前 24小时，正常细胞在加病毒之后 72小时接种在培养中，然后加不同 MOI的腺病毒，再行培养。在培养 8-10天之后，对培养中的细胞进行存活的测试。然后用软件计算出 EC₅。值。 EC₅。值越小表示重組病毒杀死细胞的能力越强。在肿瘤细胞中， KH-901都表现出比 KH-900更强的杀伤力。再次表明经基因工程改选后的 Mtelo启动子要比野生的 telo启动子具有更强的转录活性，而使重组病毒具有更高的杀死肿瘤细胞的能力。 KH-901的杀伤能力与 KH-902, KH-903想比杀死肿瘤细胞的能力相似。在这 6个病毒中，重组体腺病毒 KH-904的杀伤肿瘤细胞的能力最强。这与前面得到的结果是相吻合的。

表 1 细胞 KH-901感染单 ELISA (纳克 /10⁶ 生物活性（Bioassay) (纳克

位 /细胞细胞 /24 his) /10⁶细胞 /24 hrs)

LNcaP 10 231 ± 21 195 ± 34

1 30 ± 9 15 ± 4

Hep3B 10 422 ± 13 355 土 44

1 94 ± 6 85 ± 12

SW680 10 527 ± 19 325 土 44

1 214 ± 4 135 ± 21

A549 10 748 ± 17 625 ± 94 1 83 ±2 55 ±24

HeLa 10 120 ± 11 105 ±56

1 9± 1 2 ±0.3

hFKs 10 5 ± 0.25 3.5 ±0.4

1 低于检测水平低于检测水平

表 2

更有意思的是，对人体正常细胞而言，装有基因工程改选过的 Mtelo 启动子的重组体病毒（包括 KH-901，KH-902,KH-903，KH-904)都表现出比 KH-900(装有原始未改造的 hTERT启动子)弱得多的杀伤能力（因为 EC₅₀值更高）。

同时，在 E1A基因和 E1B基因之间装有核糖体介入因子的重组体腺病毒： KH- 子控制)则表现出比其他重组体病毒都要高的肿瘤细胞专一性。虽然在对肿瘤细胞的杀死能力比其他重组体要弱一些。

实验 3: 重组体腺病毒 KH-901在肿瘤细胞中表达较高的具有生物学活性的免疫调节因子 GM-CSF

重组体腺病毒 KH-901用不同的 M0I (1和 10) 感染 5种肿瘤细胞和一种人体正常细胞（hFKs)。感染 48小时之后，收集细胞，经冻溶和 ELISA测定细胞裂解液中的 GM-CSFR浓度。结果如图 14所示， KH-901在实验的 5种肿瘤细胞中都表达出很高的 GM-CSF蛋白，如在前列腺肿瘤细胞中，每 10⁶细胞中每 24小时产生 30至 231纳克的 GM-CSF。在同样的实验中， KH-901在正常细胞中， GM-CSF表达很低或检测不到。在如后的生物活性实验中进一步表明，这些用 ELISA检测到的 GM-CSF具有生物学活性 (结果见表 2)。

实验 4: 重组体腺病毒在动物肿瘤模型上的抗肿瘤活性

前列腺肿瘤细胞系 LNcap细胞被用来在棵鼠上建立肿瘤模型，在皮下接种 6百万细胞，在 4个星期之后可以看到肿瘤长到 200立方微升左右。这个时候给药，一共给三针 (第 1天，第 5天和第 9天)，每针给药 3x10'° 病毒颗粒。然后每个星期测量肿瘤体积两次。所得的肿瘤生长数据如图 10。

在这个实验中三种重组型腺病毒 KH-901 , KH-904和 KH-907(没有显示，与 KH-901 —样只是其中没有 GM-CSF基因)被用来注射肿瘤，同时 Addl520作为对照，也包括在实验之中。

从图 10中可以看出，不含病毒的制剂处理的肿瘤长得很快， 48天之后的对照组的肿瘤体积是开始给药时的百分之一千二百（1200%)。而经病毒处理的肿瘤，肿瘤生长受到了一定的抑制，如经 KH-901处理的肿瘤 remain the same as baseline, KH-904处理的肿瘤则使肿瘤体积缩小到开始给药时的百分之 15 (15%)。这个时候，经 Addll520处理的肿瘤则生长受一定影响，其体积是开始给药时的百分之八百五十（850%)。

这说明 KH-901和 KH-904的杀伤肿瘤的能力比 Addll520 (Onyx-015) 要强。其中 KH-904又比 ΚΉ-901要强，这与前面在细胞水平中得到的结果是吻合的。

需要指出的是，虽然这是在棵鼠上做的肿瘤模拟实验，我们也看到 KH-901的杀伤肿瘤的能力比 ΚΗ-907(没有 GM-CSF基因)要强。

在这个实验过程中，对肿瘤中 GM-CSF表达情况也作了纪录。经给药之后 14 天，在 Addll520 处理和 KH-907 处理的动物血中没有检测到 GM-CSF的表达，而在 KH901和 KH-904处埋的动物血中，分别检测到 2.322 微克 /毫升和 2.776微克 /毫升的 GM-CSF。这个结果表明，重组腺病毒中的 GM-CSF 不但在体外肿瘤细胞中表达，而且在动物身上的肿瘤中也有较高水平的表达。

这个程序组建重组腺病毒的效率高，可操作性强。其它的重组腺病毒将分别在实施例中作具体介绍。

本发明的重组溶瘤性复制型腺病毒重组体具有以下特点：

1.结构特点：

这些重组体是一些活的重组腺病毒，能在肿瘤细胞中复制繁殖。不同于现有的化学合成药和基因工程药物。能直接在肿瘤细胞中专一表达复制，生物学活性高，可达到有效治疗作用。腺病毒中还携带免疫调节基因。这样，这个基因能在感染的肿瘤细胞中表达定点诱导针对肿瘤细胞的免疫反应。且安全性好，致病性低，尤其是安装肿瘤调控元件之后。

2.应用特点：

安装的肿瘤调控元件在超过 90%的肿瘤中都有活性，即在绝大多部分的肿瘤细胞中，这类腺病毒的关键基因可以表达而使病毒能够复制繁殖，进而杀死肿瘤细胞。所以这些重组溶瘤性复制型腺病毒将是非常广泛的，如头颈癌、肺癌、直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌等。

由于在这肿瘤专一的腺病毒中装有表达免疫调节因子的基因，正如前文中所述，这类产品将不但具有由于腺病毒复制感染而杀死肿瘤，而且在肿瘤细胞中表达的细胞因子，将调节免疫反应而通过加强免疫.系统而对原位及扩散的肿瘤进行进攻，进而杀死肿瘤细胞。

不同于现有产品的特点还包括： 1 )这些产品的肿瘤专一性提高了，不感染正常体细胞和干细胞；这些病毒在临床使用之中的副作用更低； 2 )表达免疫调节因子，包括分泌型和膜结合型免疫调节因子；使机体产生免疫作用，可杀伤远处肿瘤，减少复发； 3 )经过病毒外壳的改变，这些腺病毒对大部分肿瘤细胞的感染力大大的提高了，进而使它成为有可能有更好的治疗作用。

本发明的贡献在于:

1 )通过定向突变修饰肿瘤细胞基因调控元件 hTERT启动子，使之具有更高的肿瘤细胞特异性和转录活性，从而降低相连基因在部分成年体细胞特别是生殖细胞，造血祖先细胞和干细胞中表达的可能性，进而提高靶向作用效率。利用改造后的 hTERT启动子构建成的溶瘤性复制型腺病毒不能在骨髓细胞中繁殖，而能有效杀灭多种肿瘤细胞。

2 )利用肿瘤细胞专一的溶瘤性腺病毒表达可引起免疫反应的免疫调节基因 GM-CSF, 这样构件的病毒，不但可以通过原位给药，溶瘤性病毒通过复制繁殖而裂解肿瘤细胞，同时又通过裂解细胞中产生的肿瘤抗原结合肿瘤细胞中表达的 GM-CSF 而产生强烈的针对肿瘤细胞的免疫反应 (immune responses against cancer)。特别值得一提的是这种肺瘤专一的抗月中瘤免疫反应可以通过 "教育" 人体的免疫系统而对扩散的肿瘤发起攻击而将它们杀灭。这种经过 "教育" 的抗肿瘤特异免疫反应可以在病人体内持续很长时间，从而在病人体内起到预防肿瘤复发的作用。

3 )通过对腺病毒表面的改变而使其对绝大部分肿瘤细胞有较强的感染力。由于很大一部分肿瘤细胞中不表达或低水平表达腺病毒血型型 5 (Ad5) 的受体蛋白 (CAR), 因此经常会看到 Ad5不能很好地感染肿瘤细胞的现象。通过将腺病毒血型 35 (Ad35) 的受体作用的结合位点和序列接到 Ad5基因组中去，就可以大大的提高其感染多数肿瘤细胞的效率。体外和体内试验都已证明了这种设计中构建的重组体的优越性（参见实验例）。

序列表说明：

序列 1 : 人体 hTERT 启动子的碱基序列及转录因子的结合位点. SP-l(GC-boxes): SPl结合位点； E-boxes: Myc的结合部位； NF-1 : 和 NF 因子结合的位点。

序列 2:经修饰突变改造而具更高肿瘤细胞专一性及转录活性的 hTERT 启动子 . E2F-1 : E2F转录因子结合部位。

序列 3: 重组体 KH-901的基因组序列：

1) 1-103: 腺病毒左侧臂 (ITR) [腺病毒 5基因组全序列： Genbank No: BK000408];

2) 194-358: 腺病毒基因组包装序列和 El增强子序列；

4) 525-811：经基因工程技术改造的 hTERT启动子序列和连接序列；

5) 812以右：腺病毒序列包括 E1A，E1B, E2等；

6) 28995-29436: 免疫调节基因人类 GM-CSF基因；

7) 29437以右：腺病毒序列包括 E4已和右侧臂。

序列 4: 重组体 KH-902的基因组中免疫调节因子 GM-CSF基因的膜结合型基因 (mbGM-CSF)序列。

序列 5：重组体 KH-904的基因组中含腺病毒血型 35型的纤维蛋白基因序列（Fiber knob: Ad5/35)。附图说明：

图 1 : 人体 hTERT 启动子的碱基序列及转录因子的结合位点. SP-l(GC-boxes): SPl结合位点； E-boxes: Myc的结合部位； NF-1 : 和 NF 因子结合的位点。因子结合的位点。

图 2: 经修饰突变改造而具更高肿瘤细胞专一性及转录活性的 hTERT 启动子 . E2F-1 : E2F转录因子结合部位。

图 3-1和图 3-2: 重组体腺病毒的结构示意图。

图 4-1 ，图 4-2和图 4-3: 重组腺病毒 KH-901的构建过程示意图。图 5: 重组腺病毒 KH-901的技术路线框图。

图 6: hTERT启动子的活性：野生型启动子 (telo)与改造型启动子 (Mtelo) 之比较。

图 7: 重组体腺病毒在人体初始 hFK细胞和转化乳头状病毒 (HPV) E6 基因的 hFKs-E6细胞中 El A信使核糖核酸的表达。

图 8: 重组体病毒对体外培养的正常骨髓细胞 (bone marrow stem cells) 杀伤活性的比较。

图 9: 重组体腺病毒在 A549细胞中杀死细胞能力之比较 (存活细胞百分比)。

图 10: 重组体在前列腺肿瘤模型上杀死肿瘤能力之比较。具体实施方案

以下结合具体实施例对本发明进行进一步的详细阐述，并非用以限定本发明。实施例 1:

1.构建溶瘤性复制型腺病毒重组体 KH-901及鉴定（如图 4和图 5所示)。

2.根据图 1中 hTERT启动子序列设计合成两段引物：

A. 5 '-GTCTGGATCCGCTAGCCCCACG-3 '

B. 5 '-CGACCGGTGATATCGTTTAATTCGC-3 '

作为引物，以激活的人体基因组核糖核酸作为模板，经 PCR方法扩增到人的 hTERT启动子。其中，反应条件为：第一循环： 94。C变性 5分钟， 81。C退火 1分钟， 72。C延伸 2分钟；以后的循环： 93°C变性 1分钟，琼脂糖凝胶电泳分析，回收得到 hTERT启动子片断。经测序分析，得到的启动子片段与发表的一样（图 1 )。然后将这段 DNA克隆到 pUC19载体之中，利用定点突变的方法 (Strategene 定点诱导方法)将 hTERT启动子序列变成图 2所示的序列。

3.PCR扩增多聚腺嘌呤核苷酸信号序列。引物分别为：

C. 5 '-TAATATTTGTCTAGGGCCGCGGGGGATCTCTGC-3，

D. 5 '-GGATCCAGACATGATAAGATACATTGAGAG-3 '

用 pCMV/zero (Invitrogen, USA)作模板，同上的退火条件，扩增 poly(A) 序列，纯化后测序验证。

4.将纯化后的 hTERT启动子片段和 poly(A) DNA片段放在一起将 95°C 变性 5分钟，冷却到室温，然后用引物 A和引物 D做引物，以冷却后的 hTERT启动子和 poly(A)DNA片段混合物作模板，进行放大得到一段大小在 500个碱基对左右的 DNA片段。经纯化测序验证。验证正确之后用 Sspl 和 Agel切割，纯化得到所要的插入片段，这个片段含有 poly(A)信号序列和 hTERT启动子。

5. pXC.l(购自加拿大的 Microbix)在碱基对第 339和第 551的地方分别用定点突变的方法 (Strategene 定点诱导方法)加上酶切位点 Sspl 和 PinAI (Agel)切口。经突变之后的质粒，用 Sspl和 Agel切开，跑胶分离作为载体。这个载体与第 3步中纯化到，并经 Sspl和 Agel酶切割的 poly(A)/hTERT 启动子片段相联接。连接 20小时之后，转化 DH5 大肠杆菌，经 4°C孵育 30分钟， 42°C热休克 30秒钟，再在 4°C孵育 2分钟，加 1 mL LB培养液在 37°C培养箱中培养 45分钟。然后转到含安卡青霉素的琼脂培养板上 24 小时之后，用灭菌牙签挑取单个细菌克隆，然后放入干净的含有 LB 的培养瓶中， 24小时之后，按照常规方法提取质粒 DNA用酶切筛选所需质粒，得阳性克隆，命名为 pKH-901a，然后经测序确定其序列是正确。含有腺病毒左侧臂，已装序列， poly(A)序列， hTERT启动子（Mtelo), E1A和部分 E1B基因序列。

6.腺病毒右侧臂部分的构建。

pGEM-7载体上 (Promega公司购得)。然后用两对引物放大其中两个片段。

引物设计如下：

E. 5 '-AACCAAGGCGAACCTT-3 '

F. 5 '-CCACATGGTTATCTTGG-3 '

G. 5 '-CCAGTCCAGGAGTAATTTAC-3，

H. 5 '-TGCGCTTTAGGCAGCAGATG-3 '

利用这两对引物和 pBHGE3作模板放大得到两段 DNA序列。

然后利用下面两个引物：

M.5'-CCACCCAAGATAACCATGTGGCTGC-3'

N. 5 '-AACTTAGTAAATTACTCCTGGACTGG-3，

用激活的人体巨噬细胞的 cDNA作模板根据上述类似的放大扩增条件，得到大量的 GM-CSF基因的 cDNA片段。纯化之后测序确认序列，将这段 cDNA和上面从 pBHGE3放大得的两段 DNA—起作模板，已引物 E和 H 进行扩增放大而得到一段 DNA片段，纯化之后测序确定其序列。经 BsiWI 和 Notl酶切割之后接到上述 pGEM-7载体中。然后进一步转接到 pBHGE3 之中，而得到右侧端质粒 DNA命名为 pKH-901b。这个质粒含有部分 EIB 基因， E2基因， E3基因， GM-CSF和 E4基因。

7.重组腺病毒 KH-901的构建。

pKH-901a和 pKH-901b质粒 DNA分别用 Ndel和 Clal酶切割使之线性化，经純化后一起转化 HeLa细胞（Invitrogen转化剂）。在 37°C培养 10天之后，将细胞收集起来，经冻溶三次，取 100微升细胞上清液进行病毒菌斑分离试验，再加入细胞上清液之后 8到 12天之内，可以在低凝点琼脂胶之下，清晰看到很多分离的较好的病毒斑点。然后利用 10微升的自动取样枪吸取 10微升，加到预先种植好的 HeLa细胞之中。 4-8天之后，可以看到所有的细胞都裂解了，收集此细胞裂解清液。冻溶三次取 200微升，提取其中的病毒 DNA。利用 PCR方法和 Southern杂交的方法确认病毒的结构。然后在 HeLa细胞重复分离 3次，得到单克隆病斑在 HeLa细胞中成长起来，保存在 -80°C 的冷冻箱中，取部分裂解液，确认病毒序列后命名为 KH-901。

大批量产生 KH-901 的方法将在另文中介绍，简要的操作步骤如下: Hela-S3 (HeLa细胞经体外筛选变得能在无小牛血清的培养液中悬浮生长)。接种在 3 升的培养器亚中，然后等长成到一定数目的细胞之后，接种 KH-901 , 再培养 2-3天，收集细胞，往 CsCl₂中以梯度离心方法或离子交换（ion exchange)方法分离纯化病毒，然后保存在适当的制剂之中，如 PBS 和甘油。

实施例 2

KH-900的构建类似于 KH-901的流程，只是在 pKH-901a质粒中，没有多聚腺嘌呤核苷酸序列，在 hTERT启动子片段中没有突变，序列如同序列 1。得到的新质粒称为 pKH-900a。质粒 pKH-900a与 pKH-901b在 HeLa 细胞中共转化而得到 KH-900。

实施例 3

KH-902的构建类似于 KH-901 , 只是将其中 PKH-901b中的 GM-CSF cDNA基因换成如序列 4 的膜结合型 GM-CSF 基因。此质粒命名为 pKH-902b。质粒 pKH-902b和 pKH-901a在 HeLa细胞中一起转化而得到 KH-902.

实施例 4

KH-903的构建与 KH-901类似，只是将 pKH-901b中的编码 10.4k, 14.5k 和 14.7k 的编码序列用常规的基因工程方法切除，得到的盾粒命名为 pKH-903bo pKH-901a和 PKH-903b在 HeLa细胞中共转化而得到 KH-903。实施例 5

KH-904的构建与 KH-901类似，唯一不同的是其中的 pKH-901b中的纤维蛋白基因的端结 (Knob)由腺病毒血型 5型序列变成血型 35型。如序列 5 , 得到的质粒命名为 pKH-904b。

实施例 ό

ΚΗ-905的构建与 ΚΗ-904类似，只是其中 pKH-904b中 GM-CSF基因由分泌型变成了膜结合型，如序列 4。得到的序列命名为 pKH-905b。 pKH-901a和 pKH-905b一起共转化 HeLa细胞而得到 KH-905。 PCR分析和序列测试确定病毒的结构和序列。

实施例 7

KH-906的构建与 KH-901相似，只是其中用到的质粒 pKH-901a中的 E1B 启动子换成了核糖体进入序列。做得的质粒称为 pKH-906a。然后 pKH-906a与 pKH-901b—起转化 HeLa细胞得到 KH-906 [Li et al. (2001) Cancer Research 62: 2667-2674]. PCR分析和序列测试确定病毒的结构和序列。

Claims

权利要求

1、一种溶瘤性复制型病毒重组体，其特征在于，该重组体.由栽体病毒，肿瘤细胞专一的基因调节元件和免疫调节基因构建而成，所述载体病毒为 DNA病毒或 R A病毒的任何一种。

2、权利要求 1 所述的重组体，其特征在于，所述载体病毒为腺病毒或其改造体。

3、权利要求 2所述的重组体，其特征在于，所述腺病毒选自腺病毒 5 型、 2型、 35型、 41型。

4、权利要求 2所述的重组体，其特征在于，所述腺病毒改造体为，将腺病毒的 E1A和 E1B基因用核糖体介入因子 IRES连起来的腺病毒。

5、权利要求 2所述的重组体，其特征在于，所述腺病毒改造体为，用腺病毒 35型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒 5型的顶结而构建的腺病毒。

6、权利要求 2所述的重组体，其特征在于，所述腺病毒改造体为，在腺病毒的末端、包装序列之后，外源启动子之前安装一个转录的阻断序列的腺病毒。

7、权利要求 2所述的重组体，其特征在于，所述腺病毒改造体为，在腺病毒 E3区中编码 10.4K， 14.5K和 14.7K的序列已删除的腺病毒。

8、权利要求 2所述的重组体，其特征在于，所述腺病毒改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，将腺病毒的 El A和 E1B基因用核糖体介入因子 IRES连起来，并且用腺病毒 35型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒 5型的顶结，并且在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列。

9、权利要求 6所述的重组体，其特征在于，所述阻断序列为 SV40早期的多聚 (A)信号序列。

10、权利要求 1所述的重组体，其特征在于，所述肿瘤细胞专一的基因调节元件是任何癌细胞特异的启动子，增强子，静止子或他们的组合。

11、权利要求 10所述的重组体，其特征在于，所述启动子是序列表中序列 1表示的 hTERT启动子。

12、权利要求 1所述的重组体，其特征在于，所述免疫调节基因是能提高人体免疫能力的任何一种细胞因子基因，该细胞因子基因选自 IL-2 , IL-10, IL-12, IL-15, IL-24, IL-25, GM-CSF, G-CSF和 INF-alpha, INF-beta 基因或它们的变体。

13、权利要求 12所述的重组体，其特征在于，所述能提高人体免疫能力的细胞因子基因是 GM-CSF基因或它的变体。

14、权利要求 13 所述的重组体，其特征在于，所述能提高人体免疫能力的细胞因子基因 GM-CSF基因是膜结合型 GM-CSF基因。

15、权利要求 1所述的重组体，其特征在于，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，将腺病毒的 E1A 和 1B基因用核糖体介入因子 IRES连起来，并且用腺病毒 35型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒 5型的顶结，并且在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件列表中序列 2表示的 hTERT启动子，其中的免疫调节基因是 GM-CSF基因。

16、权利要求 1所述的重组体，其特征在于，其中的载体病毒是腺病毒？丈造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件列表中序列 2表示的 hTERT启动子，其中的免疫调节基因是 GM-CSF基因，其 DNA序列为序列表中序列 3表示的序列。

17、权利要求 1所述的重组体，其特征在于，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，并且用腺病毒 .35 型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒 5型的顶结，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列 2表示的 hTERT启动子，其中的免疫调节基因是 GM-CSF基因。

18、权利要求 1所述的重组体，其特征在于，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，在腺病毒 E3 区中编码 10.4K, 14.5K和 14.7K的序列已删除的腺病毒，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件列表中序列 2表示的 hTERT启动子，其中的免疫调节基因是 GM-CSF基因。

19、权利要求 15 - 18所述的任一重组体，其特征在于，其中的免疫调节基因是膜结合型 GM-CSF基因。

20、一种启动子，其特征在于，具有序列表中序列 2表示的核苷酸序列。

21、一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求 1-18所述的任一重组体。

22、权利要求 21所述的组合物，其特征在于，是注射剂。

23、权利要求 21 所述的组合物，其特征在于，可以联合用于肿瘤的放疗和化疗。

24、权利要求 1的重组体在制备治疗和 /或预防肿瘤的药物中的应用。

25、权利要求 1的重组体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： a)含有 hTERT启动子序列的腺病毒左侧臂的制备；

b)含有免疫调节基因的腺病毒右侧臂的制备；

c)将腺病毒左侧臂和腺病毒右侧臂转染到 293 细胞、 HeLa 细胞、 HeLa-S3细胞或 A549细胞中，通过同源重组的方法得到权利要求 1的重组体。