CN103857795A

CN103857795A - 限制增殖型腺病毒

Info

Publication number: CN103857795A
Application number: CN201280040617.5A
Authority: CN
Inventors: 水口裕之; 樱井文教
Original assignee: National Institute of Biomedical Innovation NIBIO
Current assignee: National Institute of Biomedical Innovation NIBIO
Priority date: 2011-08-23
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2032-02-17
Also published as: AU2012298013A1; US20140199688A1; EP2749647A1; DK2749647T3; NZ622585A; AU2012298013B2; EP2749647B1; SG11201400139PA; KR101946666B1; EP2749647A4; RU2642293C2; JPWO2013027427A1; HK1198835A1; RU2014110516A; KR20140049593A; CN103857795B; WO2013027427A1; CA2846015A1; JP5971599B2

Abstract

本发明的目的在于提供一种新型限制增殖型腺病毒及含有其的癌细胞的检测用或癌的诊断用试剂。本发明提供一种依次含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子、E1A基因、IRES序列及E1B基因、且含有第一miRNA的靶序列的多核苷酸。还提供一种在腺病毒基因组的E1区域中组入有含有所述多核苷酸的复制盒而成的重组腺病毒。

Description

限制增殖型腺病毒

技术领域

本发明涉及一种新型限制增殖型腺病毒及含有其的癌细胞的检测用试剂或癌的诊断用试剂。

背景技术

目前，作为癌的诊断方法，主要使用(i)使用MRI等大型检查设备的方法和(ii)测定血液中的肿瘤标记等的方法，简便且患者负担较少的方法(ii)备受期待。特别是从在癌患者的外周血液中循环的癌细胞(循环肿瘤细胞(CirculatingTumor Cells：CTC))显示与提高全身转移的危险性及确认到CTC的患者的预后显著低等临床症状密切的关系的方面考虑，期待开发一种简便且高灵敏度地检测作为预后的预测因子或替代标记的CTC的方法。

作为检测CTC的方法，使用以EpCAM(上皮细胞粘附分子)或细胞角蛋白-8等癌相关抗原检测的方法(细胞检验系统等)及RT-PCR等检测方法。但是，由于这些癌相关抗原即使在正常的上皮细胞中也会表达，因此，检测出假阳性的可能性较高，另外，从在PCR法中在癌细胞中无法同时观察特征性的细胞形态等、灵敏度及简便性、准确性、成本的观点考虑，寻求新的方法。

另一方面，本发明人以前开发了一种癌细胞特异性地增殖且表达GFP的限制增殖型腺病毒(GFP-表达限制增殖型病毒(GFP-expressing ConditionallyReplicating Adenovirus)：GFP-CRAd)(称为TelomeScan(注册商标)、OBP-401或Telomelysin-GFP)(专利文献1：WO2006/036004)。而且，开发了一种使用该TelomeScan的简便地检测CTC的方法(非专利文献1：Kojima T.,et al,J.Clin.Invest.,119;3172,2009)。

然而，TelomeScan具有5型腺病毒的纤毛蛋白(ファイバータンパク質，fiber protein)，经由靶细胞的柯萨奇病毒和腺病毒受体(Coxsackievirus andadenovirus receptor，CAR)感染，因此，有可能不会感染未表达CAR的细胞。特别是已知渗透、转移及增殖能力较高且恶性度较高的癌细胞的CAR的表达降低(非专利文献2：Okegawa T.,et al,Cancer Res.,61：6592-6600,2001)，但TelomeScan有可能无法检测这些恶性度较高的癌细胞。另外，虽然可能性较低，但TelomeScan感染正常的血液细胞(例如白血球)而增殖，表达GFP，由此也认为会产生假阳性。

因此，寻求检测包括CAR阴性的几乎全部的癌细胞，且在正常的血液细胞中不会产生假阳性的癌细胞的检测用试剂及癌的诊断用试剂。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2006/036004

非专利文献1：Kojima T.,et al,J.Clin.Invest.,119：3172,2009

非专利文献2：Okegawa T.,et al,Cancer Res.,61：6592-6600,2001

发明内容

发明要解决的问题

本发明鉴于这样的状况进行，其所要解决的问题在于，提供一种检测出包括CAR阴性细胞的几乎全部的癌细胞，且在血液细胞中不产生假阳性癌细胞的检测用试剂及癌的诊断用试剂，以及提供一种作为这样的试剂有用的限制增殖型重组腺病毒。

解决问题的方法

本发明人等为了解决上述问题进行了潜心研究，结果发现，通过将TelomeScan中的5型腺病毒的纤毛置换为与在几乎全部的人细胞、特别是全部癌细胞中高表达的与CD46结合的腺病毒的纤毛，不仅可以检测CAR阳性细胞，而且可以检测CAR阴性细胞。另外，通过在TelomeScan中组入利用

微RNA(miRNA)的基因控制系统，成功地做到在血液细胞中不会产生假阳性，以至完成了本发明。

即，本发明如下所述。

(1)一种多核苷酸，其依次含有人端粒酶逆转录酶启动子、E1A基因、IRES序列及E1B基因，并且含有第一微RNA的靶序列。

(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其中，第一微RNA在非癌细胞中表达。

(3)如上述(1)或(2)所述的多核苷酸，其中，第一微RNA为选自由miR-142、miR-15、miR-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296、miR-125、miR-143、miR-145、miR-199及let-7构成的组中的至少1个。

(4)一种重组腺病毒，其中，在腺病毒基因组的E1区域中组入有含有上述(1)～(3)中任一项所述的多核苷酸的复制盒。

(5)如上述(4)所述的重组腺病毒，其中，在腺病毒基因组的E3区域中还组入有标记盒，该标记盒含有报告基因及可控制该基因的表达的启动子。

(6)如上述(5)所述的重组腺病毒，其中，标记盒还含有第二微RNA的靶序列。

(7)如上述(4)所述的重组腺病毒，其中，在腺病毒基因组的E3区域中还组入有细胞死亡诱导盒，该细胞死亡诱导盒含有编码细胞死亡诱导相关蛋白质的基因及可控制该基因的表达的启动子。

(8)如上述(7)所述的重组腺病毒，其中，细胞死亡诱导盒还含有第二微RNA的靶序列。

(9)如上述(6)或(8)所述的重组腺病毒，其中，第二微RNA在非癌细胞中表达。

(10)如上述(9)所述的重组腺病毒，其中，第二微RNA为选自由miR-142、miR-15、miR-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296、miR-125、miR-143、miR-145、miR-199及let-7构成的组中的至少1个。

(11)如上述(5)或(6)所述的重组腺病毒，其中，报告基因为编码发出荧光的蛋白质的基因或编码通过酶反应产生发光物质或者发色物质的酶蛋白质的基因。

(12)如上述(5)～(10)中任一项所述的重组腺病毒，其中，所述启动子为人端粒酶逆转录酶启动子或巨细胞病毒启动子。

(13)如上述(4)～(12)中任一项所述的重组腺病毒，其还含有编码与CD46结合的纤毛蛋白的基因。

(14)如上述(13)所述的重组腺病毒，其中，与CD46结合的纤毛蛋白含有34型或35型腺病毒的纤毛蛋白的至少纤突结区域(ファイバーノブ領域)。

(15)一种癌细胞的检测用试剂，其含有上述(4)～(14)中任一项所述的重组腺病毒。

(16)一种癌的诊断用试剂，其含有上述(4)～(14)中任一项所述的重组腺病毒。

(17)如上述(15)所述的试剂，其中，癌细胞是源自从受试者中采集的生物试样的癌细胞。

(18)如上述(17)所述的试剂，其中，生物试样为血液。

(19)如上述(15)或(18)所述的试剂，其中，癌细胞为循环肿瘤细胞。

(20)如上述(15)及(17)～(19)中任一项所述的试剂，其中，癌细胞为耐药性癌细胞。

(21)如上述(15)及(17)～(20)中任一项所述的试剂，其中，癌细胞为癌干细胞。

(22)如上述(15)及(17)～(21)中任一项所述的试剂，其中，癌细胞为引起上皮间质转化或间质上皮转化的癌细胞。

(23)一种癌细胞的检测方法，其特征在于，使上述(11)所述的重组腺病毒与癌细胞接触，检测该癌细胞发出的荧光或颜色。

(24)如上述(23)所述的方法，其中，癌细胞是源自从受试者中采集的生物试样的癌细胞。

(25)如上述(24)所述的方法，其中，生物试样为血液。

(26)如上述(25)所述的方法，其中，癌细胞为循环肿瘤细胞。

发明效果

根据本发明，可以在不检测出正常的血液细胞(白血球等)的情况下简便且高灵敏度地检测CAR阴性癌细胞。

附图说明

图1是表示本发明的重组腺病毒的结构的一个例子的示意图；

图2是表示利用流式细胞术得到的重组腺病毒的活性测定结果的图；

图3是表示血液试样中所含的H1299细胞的检测结果的图；

图4是表示血液试样中所含的A549细胞的检测结果的图；

图5是表示各种癌细胞中的本发明的重组腺病毒的活性测定结果的图；

图6是表示引起上皮间质转化(EMT)的癌细胞的检测结果的图；

图7是表示癌干细胞的检测结果的图；

图8是表示使用红色荧光蛋白检测血液试样中所含的H1299细胞及T24细胞的结果的图。

具体实施方式

下面，对本发明详细地进行说明。以下的实施方式为用于说明本发明的例示，并非旨在于将本发明仅限定于该实施方式。本发明只要不背离其主旨就可以以各种方式进行实施。另外，本说明书包含成为本申请优先权主张的基础的2011年8月23日所申请的日本专利申请(日本特愿2011-181414号)的说明书及附图中记载的内容。

1.概要

在本发明人以前开发的TelomeScan(在5型腺病毒的E1缺失区域中依次组入有hTERT启动子、E1A基因、IRES序列、及E1B基因，且在E3缺失区域中依次组入有巨细胞病毒(CMV)启动子及GFP的限制增殖型腺病毒)中，存在(i)有可能无法检测CAR的表达降低的恶性度高的癌细胞及(ii)有可能将正常的血液细胞检测为假阳性的问题。本发明人为了解决这些问题进行了潜心研究，结果发现，通过将TelomeScan中的5型腺病毒的纤毛置换为与在几乎全部的人细胞、特别是全部癌细胞中高表达的与CD46结合的腺病毒的纤毛，可检测恶性度高的CAR阴性癌细胞。另外，发现通过将作为miRNA的miR-142-3p的靶序列组入TelomeScan的增殖盒及标记盒中，可在正常的血液细胞中抑制病毒的增殖及标记蛋白质的表达，可抑制在正常的血液细胞中产生假阳性。

即，在本发明优选的实施方式中，本发明的重组腺病毒为在腺病毒基因组的E1区域中组入有含有hTERT启动子、E1A基因、IRES序列、E1B基因及微RNA的靶序列的复制盒，并且在腺病毒基因组的E3区域中组入有含有报告基因、可控制该基因的表达的启动子及微RNA的靶序列的标记盒，且含有编码与CD46结合的腺病毒的纤毛蛋白的基因的重组腺病毒(图1)，其具有以下的特征。

(i)通过含有编码与CD46结合的腺病毒的纤毛蛋白的基因，可以感染包括CAR阴性细胞的几乎全部的细胞。

(ii)通过含有hTERT启动子，在表达hTERT的癌细胞中特异性地增殖，另外，通过增殖，报告基因的表达增加，可以使标记蛋白质及发色物质等的生成量增加至可检测的水平。

(iii)通过含有miRNA的靶序列，即使在病毒暂时感染具有hTERT启动子活性的正常细胞的情况下，通过miRNA的表达，也可抑制该病毒的增殖，另外，可抑制报告基因的表达，因此，可抑制假阳性的产生。特别是通过含有血液细胞特异性表达的miRNA的靶序列，即使在病毒暂时感染具有hTERT启动子活性的正常血液细胞的情况下，通过该miRNA的表达，也可抑制该病毒在血液细胞中的增殖，另外，可抑制报告基因的表达，因此，可抑制假阳性的产生。

本发明是基于这些见解而完成的。

2.重组腺病毒

(1)复制盒

本发明涉及一种依次含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子、E1A基因、IRES序列及E1B基因，并且含有微RNA的靶序列的多核苷酸。另外，本发明涉及一种在腺病毒基因组的E1区域中组入有含有上述多核苷酸的复制盒的重组腺病毒。

发明的重组腺病毒可利用上述多核苷酸(或含有其的复制盒)的功能在癌细胞中特异性地增殖，另外，可以在目标miRNA表达的细胞中抑制病毒的增殖。例如，在本发明的复制盒中所含的miRNA的靶序列为在血液细胞中特异性表达的miRNA的靶序列的情况下，本发明的重组腺病毒在表达hTERT的癌细胞中特异性地增殖，且可抑制在血液细胞中增殖。

人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子为作为人端粒酶的构成成分的逆转录酶的启动子。认为hTERT mRNA的剪接及hTERT蛋白质的翻译后修饰等参与到人端粒酶活性的上升中，hTERT基因表达的增强，即hTERT启动子活性的上升为最重要的分子机制。人端粒酶在人的癌的85%以上中确认到活性的上升，另一方面，在大部分的正常细胞中未显示活性，因此，通过使用hTERT启动子，可以使其下游的基因在癌细胞中特异性表达。在本发明中，通过在E1A基因、IRES序列及E1B基因的上游配置hTERT启动子，可以使病毒在表达hTERT的癌细胞中特异性地增殖。

hTERT在其5’末端的上游1.4kbp的区域中确认到较多的转录因子结合序列，认为该区域为hTERT启动子。其中，翻译开始部位的上游181bp的序列为对于下游的基因表达重要的核心区域。在本发明中，若为含有该核心区域的序列，就可以没有限定地使用，但优选将完全含有该核心区域的上游378bp左右的序列用作hTERT启动子。该378bp左右的序列与181bp的核心区域单独的情况相比，确认到其基因表达效率相同。将455bp长度的hTERT启动子的碱基序列示于序列号1中。

hTERT启动子的碱基序列除序列号1所示的序列以外，也包括与由相对于由序列号1构成的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严谨条件下杂交、且具有hTERT启动子活性的多核苷酸的碱基序列。这样的核苷酸可以以由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸、或其片段为探针并利用菌落杂交、噬菌斑杂交、印迹杂交等公知的杂交法由cDNA库及基因组库中得到。

关于cDNA库的制作方法，可以参照“分子克隆,实验室手册第二版”(冷泉港出版社(1989))。另外，也可以使用市售的cDNA库及基因组库。

作为上述杂交中的严谨条件，例如可以举出：1×SSC～2×SSC、0.1%～0.5%SDS及42℃～68℃的条件，更详细而言，可以举出在60～68℃下进行30分钟以上预杂交后，在2×SSC、0.1%SDS中，在室温下进行4～6次5～15分钟的清洗的条件。

关于杂交法的详细的步骤，可以参照“分子克隆,实验室手册第二版”(冷泉港出版社(1989)；特别是9.47-9.58节)等。

E1A基因及E1B基因为腺病毒的E1基因中所含的基因，该E1基因是指涉及病毒所具有的DNA复制的初期基因(early：E)和后期基因(late：L)中的初期基因之一，编码有关控制病毒基因组的转录的蛋白质。利用腺病毒的E1A基因编码的E1A蛋白质活化产生可感染的病毒所需要的基因群(E1B、E2、E4等)的转录。利用腺病毒的E1B基因编码的E1B蛋白质通过后期基因(L基因)的mRNA辅助在感染后的宿主细胞的细胞质中的积累、阻碍宿主细胞的蛋白质合成来促进病毒的复制。将E1A基因、E1B基因的碱基序列分别示于序列号2及序列号3中。E1A基因及E1B基因的碱基序列除分别示于序列号2及序列号3的碱基序列以外，也包括与由相对于由序列号2及序列号3构成的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严谨条件下杂交、且编码分别具有E1A活性及E1B活性的蛋白质的碱基序列。关于杂交的方法及严谨条件等与上述hTERT启动子相同。

IRES(内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site))序列为在小核糖核酸病毒科中特异性的蛋白质的合成开始信号，由于具有与18S核糖体RNA的3’末端互补的序列，因此认为发挥作为核糖体结合部位的作用。已知源自小核糖核酸病毒科的病毒的mRNA可经由该序列翻译。来自IRES序列的翻译效率较高，即使在mRNA的中途也可以不依赖帽结构地进行蛋白质合成。因此，在本发明的病毒中，利用hTERT启动子独立地翻译E1A基因和位于IRES序列的下游的E1B基因两者。通过使用IRES序列，hTERT启动子的表达控制独立地涉及E1A基因、E1B基因，因此，与用hTERT启动子控制E1A基因或E1B基因中的任一者的情况相比，可以将病毒的增殖更严格地限定于具有端粒酶活性的细胞中。另外，通过将IRES序列插入到E1A基因和E1B基因之间，可以提高宿主细胞中的病毒的增殖能力。将IRES序列的碱基序列示于序列号4中。IRES序列的碱基序列除序列号4所示的碱基序列以外，也包括与由相对于由序列号4构成的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严谨条件下杂交、且编码具有IRES活性的蛋白质的碱基序列。关于杂交的方法及严谨条件等与上述hTERT启动子相同。

miRNA通常认为是15～25个碱基左右的较短的单链RNA，认为通过与存在于mRNA的靶序列结合来进行各种基因的翻译控制。因此，例如在使表达miRNA的细胞感染含有目标基因和该miRNA的靶序列的重组腺病毒的情况下，可在该细胞中抑制目标基因的表达。作为miRNA的靶序列的插入位点，只要可以抑制目标基因的表达就没有特别限制，但优选插入到目标基因的非翻译区域，更优选插入到目标基因的下游。

作为本发明中所使用的miRNA的靶序列，可以举出在非癌细胞中表达的miRNA的靶序列。非癌细胞是指不是恶性肿瘤细胞的细胞，例如包括正常细胞、良性肿瘤细胞等。正常细胞例如包括正常的血液细胞、正常的内皮细胞、正常的成纤维细胞、正常的干细胞等。另一方面，认为循环肿瘤细胞为源自恶性肿瘤的细胞，在本发明中，包括在恶性肿瘤细胞中。

另外，作为本发明中所使用的miRNA的靶序列，可以举出在血液细胞中特异性表达的miRNA的靶序列。在本发明中，“血液细胞”不仅包括正常的血液细胞，而且也包括癌化的(已癌化的)血液细胞。即，在本发明中，“在血液细胞中特异性表达的miRNA”可以在正常血液细胞中特异性表达，也可以在正常的血液细胞及癌化的血液细胞这两者中特异性表达。即使在正常的血液细胞及癌化的血液细胞这两者中特异性表达的情况下，也可以在检测循环肿瘤细胞时减少正常血液细胞的假阳性，准确地检测从固体癌中游离的循环肿瘤细胞。在本发明中，作为“在血液细胞中特异性表达的miRNA”，更优选在正常的血液细胞中表达但在癌化的血液细胞中不表达的miRNA。

在本发明中，作为血液细胞，没有限定，可以举出：白血球(中性粒细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、淋巴细胞(T细胞及B细胞)、单核细胞、树突细胞)、CD34阳性细胞、造血细胞、造血干细胞、造血前驱细胞(造血前体细胞)、外周血单核细胞(PBMC)等。另外，作为癌化的血液细胞，可以举出：白血病细胞、淋巴瘤细胞等。在本发明中，在某一细胞中“特异性表达”不仅指仅在该细胞中表达，而且也指与其它的细胞相比在该细胞中表达量高。例如，“在血液细胞中特异性表达”不仅指仅在血液细胞中表达，而且也指与血液细胞以外的细胞相比在血液细胞中表达量高。

作为在血液细胞中特异性表达的miRNA，例如可以举出：miR-142、miR-15、miR-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296等，但优选miR-142、miR-15及miR-16。

miRNA为单链RNA，但只要可以抑制提前的(premature)双链RNA中的目标基因的表达就可以使用任一侧的单链RNA的靶序列。例如在miR-142中存在miR-142-3p及miR-142-5p，但在本发明中可以使用任一靶序列。即，在本发明中，“miR-142”包括miR-142-3p及miR-142-5p两者，优选miR-142-3p。另外，同样，在本发明中，“miR-15”包括提前的双链RNA中的有义链(记为“miR-15S”)及反义链(记为“miR-15AS”)。关于其它的miRNA也相同。

已知miR-142-3p的基因存在于在B细胞白血病(侵袭性B细胞白血病(aggressive B cell leukemia))中产生易位的部位，在造血组织(骨髓、脾脏、胸腺等)中表达，但在其它的组织中不表达。另外，miR-142-3p在小鼠胎儿肝脏(胎儿的造血组织)中确认到表达，认为参与到造血体系统的分化(Chang-ZhengChen,et al.,Science,2004)。

在本方式中，由于利用hTERT启动子的作用进行癌细胞中的特异性基因表达，利用miRNA的作用抑制血液细胞中的基因表达，因此，可进行二阶段的选择性的基因表达控制。

另外，在另一方式中，作为本发明中所使用的miRNA的靶序列，可以举出在癌细胞中抑制表达的miRNA的靶序列。作为在癌细胞中抑制表达的miRNA，例如可以举出：miR-125、miR-143、miR-145、miR-199、let-7等。在本方式中，通过hTERT启动子和miRNA的作用来双重抑制癌细胞中的特异性基因表达。

miRNA最初从线虫、酵母等中发现，但现在在人及小鼠中发现几百个。这些序列是公知的，通过访问公共的DB(例如miRBase序列数据库(http：//microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml,http：//www.mirbase.org/))，可以获得序列信息等。

将miR-142、miRNA-15、miRNA-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296、miR-125、miR-143、miR-145、miR-199、let-7的各序列示于以下。

miR-142-3p：5'-UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA(序列号5)

miR-142-5p：5'-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU(序列号6)

miR-15S：5'-UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG(序列号7)

miR-15AS：5'-CAGGCCAUAUUGUGCUGCCUCA(序列号8)

miR-16S：5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG(序列号9)

miR-16AS：5'-CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA(序列号10)

miR-21S：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(序列号11)

miR-21AS：5'-CAACACCAGUCGAUGGGCUGU(序列号12)

miR-126S：5'-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG(序列号13)

miR-126AS：5'-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG(序列号14)

miR-181：5'-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU(序列号15)

miR-223S：5'-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA(序列号16)

miR-223AS：5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU(序列号17)

miR-296-3p：5'-GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC(序列号18)

miR-296-5p：5'-AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU(序列号19)

miR-125：5'-UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA(序列号20)

miR-143S：5'-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC(序列号21)

miR-143AS：5'-GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGU(序列号22)

miR-145S：5'-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU(序列号23)

miR-145AS：5'-GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU(序列号24)

miR-199：5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC(序列号25)

let-7：5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(序列号26)

在本发明中，miRNA的靶序列1单位由相对于miRNA的全部或一部分互补的序列构成，碱基长为7～30个碱基长，优选为19～25个碱基长，更优选为21～23个碱基长。在本发明中，所谓miRNA的靶序列1单位是指某一miRNA可作为靶的最低限的长度的碱基序列。具体而言，是指选自序列号5～26中任意碱基序列的互补序列中的至少7个碱基长的寡核苷酸，在任意处中均可以置换、缺失、附加、删除1个或多个核苷酸。

作为本发明的多核苷酸或重组腺病毒中所组入的靶序列整体，为了有效地发挥miRNA和靶序列的相互作用，可以含有多个1单位的靶序列。组入于重组腺病毒的靶序列整体的长度只要为可组入到该病毒基因组中的长度即可，没有特别限定。例如可以含有1～10拷贝的1单位的靶序列，优选含有2～6拷贝，更优选含有2拷贝或4拷贝的1单位的靶序列(John G.Doench,et al.,Genes Dev.200317：438-442)。靶序列整体中所含的靶序列1单位的序列和序列之间可以含有适当长度的寡核苷酸。适当长度的寡核苷酸的长度没有特别限定，但只要为可作为靶序列整体组入到重组腺病毒基因组中的长度即可，例如可以为0～8个碱基长的寡核苷酸。另外，在含有多个单位的miRNA的靶序列的情况下，各个单位的靶序列可以为相对于相同的miRNA的靶序列，也可以为相对于不同的miRNA的靶序列。进而，在含有相对于相同的miRNA的靶序列的情况下，各个单位的靶序列的长度及靶序列的碱基序列也可以不同。

关于本发明的多核苷酸(或含有其的复制盒)中所含的miRNA的靶序列，在该多核苷酸被组入到重组腺病毒的情况下，为了区分存在于重组腺病毒的其它的miRNA的靶序列，也可以称为“第一微RNA的靶序列”。

在本发明中，在使用miR-142-3p作为miRNA的情况下，作为其靶序列，例如可以举出含有以下序列的序列。

(i)含有miR-142-3p的靶序列2单位的序列：

5’-gcggcctccataaagtaggaaacactacacagctccataaagtaggaaacactacattataagcggtac

(序列号27、下划线表示miR-142-3p的靶序列1单位。)

(ii)含有miR-142-3p的靶序列4单位的序列：

5’-ggcctccataaagtaggaaacactacacagctccataaagtaggaaacactacattaattccataaagtag gaaacactacaccactccataaagtaggaaacactacagtac

(序列号28、下划线表示miR-142-3p的靶序列1单位。)

在本发明中，在hTERT启动子-E1A基因-IRES序列-E1B基因的结构的下游配置miRNA的靶序列，并将依次含有hTERT启动子、E1A基因、IRES序列、E1B基因及miRNA的靶序列的多核苷酸(称为复制盒)组入腺病毒基因组，由此可以在表达该miRNA的细胞中抑制E1基因的表达，抑制病毒的增殖。

在本发明中，通过在E1B基因或后述的报告基因的下游组入miRNA的靶序列，可抑制存在于其上游的基因的表达。该机制的详细情况并未明确，但认为是如下所述的机理。首先，通过miRNA-RISC(RNA-诱导沉默复合物)切断mRNA上的靶序列，可除去mRNA的poly A。由此认为mRNA的稳定性变低，mRNA被分解，可抑制基因的表达。或者认为miRNA-RISC与通常的miRNA同样地募集poly A分解酶，poly A被分解，结果，mRNA的稳定性变低，可抑制基因的表达。

需要说明的是，以往报告有对于插入至IRES序列下游的基因的表达(翻译)，无法得到利用miRNA的基因表达的抑制效果(Ramesh S.Pillai et al.,Science309,1573(2005);Geraldine Mathonnet,et al.，Science317,1764(2007))，但本发明人对本发明的依次含有hTERT启动子、E1A基因、IRES序列、E1B基因及miRNA的靶序列的重组腺病毒进行确认基因表达，结果，利用miRNA可充分地抑制插入至IRES序列下游的E1B基因的表达。这为本发明的新的见解。

本发明的复制盒中所含的基因可以利用通常的基因工程方法得到。例如可以使用使用了作为基因工程方法通常所使用的DNA合成装置的核酸合成法。另外，可以使用如下方法：在分离或合成作为模板的基因序列后，在各个基因上设计特异性的引物，使用PCR装置扩增其基因序列的PCR法(CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987)Section6.1-6.4)或使用了克隆载体的基因扩增法。上述方法依据分子克隆第二版.冷泉港实验室出版社(1989)等，本领域技术人员可以容易地进行。得到的PCR产物的精制可以使用公知的方法。可以根据需要通过惯用的序列确定法确认得到所期待的基因。例如可以利用双脱氧链终止法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：5463)等进行。另外，也可以利用适当的DNA测序器(例如ABIPRISM(Applied Biosystems公司))分析序列。

在本发明中，miRNA的靶序列可以通过以使每靶序列1单位相对于miRNA的全部或一部分的碱基序列互补的方式设计、合成来获得。例如，miR-142-3p的靶序列可以通过以与miR-142-3p的碱基序列互补的方式合成DNA来获得。

然后，使如上得到的各基因以成为给定的顺序连结。首先，以公知的限制酶等切断上述各基因，依据公知的方法将切断的该基因的DNA片段插入到公知的载体中并连结。作为公知的载体，例如可以使用pIRES载体。pIRES载体为包括脑心肌炎病毒(ECMV)的IRES(内部核糖体进入位点)序列，且能够由1种mRNA翻译2处开放阅读框(ORF)的载体。若使用pIRES载体，则通过在多克隆位点依次插入需要的基因，可以制作“依次含有hTERT启动子、E1A基因、IRES序列及E1B基因，且含有微RNA的靶序列的多核苷酸”。对于miRNA的靶序列的插入位点没有特别限制，但更优选插入到hTERT启动子-E1A-IRES-E1B的结构的下游。DNA的连结可以使用DNA连接酶。另外，可以根据需要利用公知的限制酶去除pShuttle等公知载体中所含的CMV启动子，在该部位中插入使用适当的限制酶从hTERT启动子-E1A-IRES-E1B-miRNA靶序列中切出的序列。通过在hTERT启动子的控制下表达腺病毒的增殖所需要的E1基因，可以使病毒癌细胞特异性地增殖。

(2)标记盒

另外，在另一方式中，本发明涉及一种在腺病毒基因组的E1区域中组入有上述复制盒，还在E3区域中组入有标记盒的重组腺病毒。标记盒含有报告基因及可控制该基因的表达的启动子，进而，也可以含有miRNA的靶序列。

腺病毒E3区域中存在11.6kDa的ADP(腺病毒死亡蛋白)，ADP具有促进细胞损坏及病毒的扩散的功能。本发明的重组腺病毒由于可除去编码含有ADP的E3区域这样的具有促进细胞损坏及病毒的扩散的功能的蛋白质的病毒基因组区域，因此，细胞死亡的时机较慢，利用GFP等荧光表达的癌组织的鉴定变得容易。这对于能够在长时间保持存活的条件下检测后述的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells：CTC)方面也有效。

作为本发明的重组腺病毒的标记盒中所含的报告基因，没有限定，例如可以举出：编码发出荧光的蛋白质的基因、编码利用酶反应产生发光物质或者发色物质的酶蛋白质的基因、编码抗生素的基因、编码标签融合蛋白质的基因、编码在细胞表面表达且与特定的抗体结合的蛋白质的基因、编码膜输送蛋白质的基因等。作为发出荧光的蛋白质(标记蛋白质)，例如可以举出：源自维多利亚水母(Aequorea victorea)等发光水母的绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein：GFP)、修饰其而成的EGFP(Enhanced-humanized GFP)、rsGFP(red-shift GFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein：YFP)、青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein：CFP)、蓝色荧光蛋白(blue fluorescentprotein：BFP)、源自海肾(Renilla reniformis)的GFP等，可以将编码这些的基因用于本发明。作为上述发出荧光的蛋白质，优选GFP或EGFP。

另外，作为利用酶反应产生发光物质或者发色物质的酶蛋白质，例如可以举出：β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。β-半乳糖苷酶利用酶反应由5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)产生蓝色的发色物质。另外，荧光素酶与荧光素进行酶反应，产生发光物质。作为荧光素酶，已知有荧火虫荧光素酶、细菌荧光素酶及海肾荧光素酶等，本领域技术人员可以从公知的荧光素酶中适宜选择。

另外，所谓可控制上述基因表达的启动子，只要为能够与用于表达作为目标的上述基因的病毒对应的适当的启动子就可以为任意的启动子。例如可以举出：CMV启动子、hTERT启动子、SV40晚期启动子、MMTV LTR启动子、RSV LTR启动子、SRα启动子、β肌动蛋白启动子、PGK启动子、EF-1a启动子等，但并不限定于此。可优选使用CMV启动子或hTERT启动子。

标记盒中所组入的miRNA的靶序列与复制盒中所组入的miRNA的靶序列可以相同，也可以不同。

在本发明中，通过将miRNA的靶序列配置在报告基因的非翻译区域、优选该基因的下游，可抑制报告基因的表达。即，在本发明中，标记盒优选依次含有可控制报告基因的启动子、报告基因及微RNA的靶序列。为了与复制盒中所含的miRNA的靶序列相区别，标记盒中所组入的miRNA的靶序列称为“第二微RNA的靶序列”。涉及miRNA的其它的说明与上述相同。

关于本发明的标记盒中所含的重组基因的获得方法、精制方法、序列确定方法等与上述复制盒的情况相同。

(3)细胞死亡诱导盒

进而，在另一方式中，本发明涉及一种在腺病毒基因组的E1区域中组入有上述复制盒，在E3区域中组入有细胞死亡诱导盒的重组腺病毒。细胞死亡诱导盒含有编码细胞死亡诱导相关蛋白质的基因及可控制该基因的表达的启动子，进而，也可以含有微RNA的靶序列。

本发明的重组腺病毒中所使用的细胞死亡诱导盒中包含编码细胞死亡诱导相关蛋白质的基因和可控制该基因的表达的启动子。因此，例如若使本发明的重组腺病毒感染癌细胞，则病毒在癌细胞中特异性地增殖，结果，细胞死亡诱导相关蛋白质的细胞内表达量升高，可以在不损伤其它的正常细胞的情况下仅在癌细胞中诱导细胞死亡。

所谓编码细胞死亡诱导相关蛋白质的基因是指编码与特定的细胞的细胞死亡的诱导相关的蛋白质的基因。作为细胞死亡诱导相关蛋白质，例如可以举出作为免疫相关蛋白质的PA28。PA28为活化细胞内的蛋白酶体的蛋白质，为通过过量表达引起免疫反应，并且也诱导细胞死亡的蛋白质。另外，作为细胞凋亡诱导蛋白，可以举出TRAIL。TRAIL是指通过与细胞表面的受体结合来诱导细胞凋亡细胞死亡的分子。

另外，作为编码细胞死亡诱导相关蛋白质的基因，可以举出癌抑制基因。癌抑制基因具有抑制癌细胞的增殖的功能。作为癌抑制基因，例如可以举出现有的基因治疗中所使用的以下的基因。将各基因的碱基序列的序列号及GenBank Accession No.示于以下。

p53(序列号29；Accession No.M14694)：多种癌

p15(序列号30；Accession No.L36844)：多种癌

p16(序列号31；Accession No.L27211)：多种癌

APC(序列号32；Accession No.M74088)：大肠癌、胃癌、胰腺癌

BRCA-1(序列号33；Accession No.U14680)：卵巢癌、乳癌

DPC-4(序列号34；Accession No.U44378)：大肠癌、胰腺癌

FHIT(序列号35；Accession No.NM112012)：胃癌、肺癌、子宫癌

p73(序列号36；Accession No.Y11416)：成神经细胞瘤

PATCHED(序列号37；Accession No.U59464)：基底细胞癌

Rb p110(序列号38；Accession No.M15400)：肺癌、骨肉瘤

DCC(序列号39；Accession No.X76132)：大肠癌

NF1(序列号40；Accession No.NM000267)：神经纤毛瘤病1型

NF2(序列号41；Accession No.L11353)：神经纤毛瘤病2型

WT-1(序列号42；Accession No.NM000378)：肾母细胞瘤

细胞死亡诱导盒中所含的miRNA的靶序列可以与复制盒中所组入的miRNA的靶序列相同，也可以不同。在本发明中，通过将miRNA的靶序列配置在编码细胞死亡诱导相关蛋白质的基因的非翻译区域、优选该基因的下游，可以抑制该细胞死亡诱导相关蛋白质的表达。即，在本发明中，细胞死亡诱导盒优选依次含有可控制编码细胞死亡诱导相关蛋白质的基因的启动子、编码细胞死亡诱导相关蛋白质的基因及微RNA的靶序列。涉及miRNA的其它的说明与上述相同。

关于本发明的细胞死亡诱导盒中所含的重组基因的获得方法、精制方法、序列确定方法等与上述复制盒的情况相同。

为了判断是否诱导细胞死亡，可以利用以下的形态学观察来进行。即，若使附着于培养容器的底部的细胞感染本发明的重组病毒并经过一定的时间，则在倒置显微镜下细胞变圆，从底部剥落并作为具有光泽的细胞游离在培养液中。此时，细胞在维持其生命的结构中产生破裂，可以判断为诱导了细胞死亡。另外，使用了四唑

盐(MTT、XTT等)的市售的活细胞检测试剂盒也可以确认细胞死亡。

(4)与CD46结合的纤毛蛋白

进而，在另一方式中，本发明的重组腺病毒可以含有编码与CD46结合的腺病毒纤毛蛋白的基因。

现在，通常所使用的腺病毒载体以51种血清型的人腺病毒中属于C亚类的5型(或者2型)腺病毒为基本骨架来制作。5型腺病毒由于其优异的基因组入特性而被广泛使用，但由于与靶细胞的柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)结合并感染，因此，存在难以感染CAR的表达较低的细胞这样的问题。特别是渗透、转移及增殖能力较高且恶性度较高的癌细胞由于CAR的表达降低，因此，具有5型腺病毒的纤毛蛋白的腺病毒有可能无法感染这样的恶性度较高的癌细胞。

与此相对，CD46在人体中在除红血球以外的几乎全部的细胞中表达，在恶性度较高的癌细胞中也表达。因此，含有编码与CD46结合的腺病毒纤毛蛋白的基因的重组腺病毒也可以感染CAR阴性且恶性度较高的癌细胞。例如，34型及35型腺病毒作为受体与CD46结合，感染细胞(Marko Marttila,et al.,J.Virol.2005,79(22)：14429-36)。如上所述，CD46由于在人体中在除红血球以外的几乎全部的细胞中表达，因此34型及35型腺病毒可感染包括CAR阴性细胞在内的广泛的细胞。另外，腺病毒的纤毛由头节区域(ノブ領域)、轴区域及尾部区域构成，腺病毒由于通过纤突结区域(纤毛蛋白头部、纤毛头节区域)与受体结合而感染细胞，因此通过将纤毛蛋白的至少纤突结区域由源自5型腺病毒的物质置换为源自34型或35型腺病毒的物质，该病毒可以经由CD46感染CAR阴性细胞。

本发明的重组腺病毒通过含有编码与CD46结合的腺病毒的纤毛蛋白的基因，可以感染除红血球以外的几乎全部的细胞，因此，可感染渗透、转移及增殖能力较高且恶性度较高的CAR阴性癌细胞。在本发明中，所谓“CAR阴性”细胞是指CAR的表达较低的细胞或完全不表达的细胞。

目前，人腺病毒鉴定有57种血清型，它们分类为A～F组这6个组。其中，报告有属于B组的腺病毒与CD46结合。作为属于B组的腺病毒，除34型及35型腺病毒以外，例如可以举出：3型、7型、11型、16型、21型、50型腺病毒。

作为本发明的与CD46结合的腺病毒的纤毛蛋白，优选属于B组的腺病毒的纤毛蛋白，更优选3型、7型、34型、35型、11型、16型、21型及50型腺病毒的纤毛蛋白，进一步优选34型及35型腺病毒的纤毛蛋白。

编码34型、35型、3型、7型、11型、16型、21型或50型腺病毒的纤毛蛋白的基因的碱基序列可以分别从NCBI(国家生物技术信息中心)的GenBank等公知的基因信息数据库中获得。另外，在本发明中，编码34型、35型、3型、7型、11型、16型、21型或50型腺病毒的纤毛蛋白的基因的碱基序列中，除从上述数据库中获得的各基因的碱基序列以外，也包括与由相对于由该碱基序列构成的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严谨条件下杂交、且编码具有与CD46的结合活性的蛋白质的碱基序列。

与CD46的结合活性可以通过测定具有含有该碱基序列的DNA的重组腺病毒对于CD46表达细胞的感染性来评价。重组腺病毒的感染性的测定例如可以使用用荧光显微镜或流式细胞术等检测感染了CD46表达细胞的病毒表达的GFP等公知的方法来进行。关于杂交的方法及严谨条件等与上述相同。

本发明的重组腺病毒可以含有与CD46结合的腺病毒的纤毛蛋白的全部或一部分的区域，只要该纤毛蛋白的至少纤突结区域与CD46结合即可。即，在本发明中，与CD46结合的腺病毒的纤毛蛋白只要含有属于B组的腺病毒的纤毛蛋白的至少纤突结区域即可，更优选含有选自由34型、35型、3型、7型、11型、16型、21型及50型构成的组中的类型的腺病毒的纤毛蛋白的至少纤突结区域，进一步优选含有34型或35型腺病毒的纤毛蛋白的至少纤突结区域。另外，本发明的技术思想为只要与CD46结合就不限定于纤毛蛋白，扩及可与CD46结合的各种蛋白质及具有可与CD46结合的基序(模体)的蛋白质。

另外，在本发明中，与CD46结合的纤毛蛋白可以含有由属于B组的腺病毒的纤毛蛋白的纤突结区域及纤毛轴区域构成的区域，更优选含有由选自由34型、35型、3型、7型、11型、16型、21型及50型构成的组中的类型的腺病毒的纤毛蛋白的纤突结区域及纤毛轴区域构成的区域，进一步优选含有由34型或35型腺病毒的纤毛蛋白的纤突结区域及纤毛轴区域构成的区域。

在本发明中，与CD46结合的纤毛蛋白可以含有属于B组的腺病毒的纤毛蛋白的至少纤突结区域，也可以含有上述类型以外的类型(例如2型、5型)的腺病毒的纤毛蛋白的纤毛轴区域或纤毛尾部区域。

作为这样的纤毛蛋白，例如可以举出：含有由选自由34型、35型、3型、7型、11型、16型、21型及50型构成的组中的类型的腺病毒的纤毛蛋白的纤突结区域及纤毛轴区域以及5型腺病毒的纤毛蛋白的纤毛尾部区域构成的区域的纤毛蛋白，但并不限定于此。

将编码34型腺病毒的纤毛蛋白的纤突结区域的基因、编码纤毛轴区域的基因、以及编码由纤突结区域及纤毛轴区域构成的区域的基因的碱基序列分别以序列号47、48及49表示。

另外，将编码由34型腺病毒的纤毛蛋白的纤突结区域及纤毛轴区域以及5型腺病毒的纤毛蛋白的纤毛尾部区域构成的区域的基因的碱基序列以序列号50表示。在本发明中，上述基因的碱基序列中，除序列号50所示的碱基序列以外，也包括与由相对于由该碱基序列构成的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严谨条件下杂交、且编码具有与CD46的结合活性的蛋白质的碱基序列。关于与CD46的结合活性的评价方法、杂交的方法及严谨条件等与上述相同。

本发明的重组腺病毒可以通过使用适当的限制酶切出含有复制盒、标记盒和/或细胞死亡诱导盒的多核苷酸并插入于适当的病毒表达载体中来制作。作为病毒表达载体，优选腺病毒载体，更优选5型腺病毒载体，特别优选含有编码与CD46结合的腺病毒的纤毛蛋白(例如34型或35型腺病毒的纤毛蛋白)的基因的5型腺病毒载体。

需要说明的是，如后述的实施例2所示，在复制盒的下游插入miRNA靶序列的情况及在标记盒的下游插入miRNA靶序列的情况下，可分别充分地抑制血液细胞中的GFP的表达，但在同时插入于复制盒的下游及标记盒的下游两者的情况下，可显著抑制血液细胞中的GFP的表达至出乎意料的程度。这为本发明中的新的见解。

在本发明中，重组腺病毒例如可以利用以下的方法获得。

首先，对pHMCMV5(Mizuguchi H.et al.,Human Gene Therapy,10;2013-2017,1999)进行限制酶处理并插入miRNA的靶序列，制作具有miRNA的靶序列的载体。接着，对含有hTERT启动子-E1A-IRES-E1B的结构的pSh-hAIB(WO2006/036004)进行限制酶处理，将得到的含有hTERT启动子-E1A-IRES-E1B的结构的片段插入到上述具有miRNA的靶序列的载体中，得到含有hTERT启动子-E1A-IRES-E1B-miRNA靶序列的载体。另一方面，对pHMCMVGFP-1(插入有EGFP基因的pHMCMV5)进行限制酶处理，获得含有CMV启动子及EGFP基因的片段，将该片段插入到上述具有miRNA的靶序列的载体中，得到含有CMV-EGFP-miRNA靶序列的结构的载体。然后，分别对含有hTERT启动子-E1A-IRES-E1B-miRNA靶序列的载体和含有CMV-EGFP-miRNA靶序列的载体进行限制酶处理、连接，由此可得到在腺病毒基因组的E1缺失区域中组入有hTERT启动子-E1A-IRES-E1B-miRNA靶序列，且在E3缺失区域中组入有CMV-EGFP-miRNA靶序列的载体。另外，通过使用含有编码与CD46结合的腺病毒的纤毛蛋白的基因的载体作为插入含有结构的DNA片段的载体，可以得到在腺病毒基因组的E1缺失区域中组入有hTERT启动子-E1A-IRES-E1B-miRNA靶序列，并且在E3缺失区域中组入有CMV-EGFP-miRNA靶序列，且含有编码与CD46结合的腺病毒的纤毛蛋白的基因的载体。然后，以公知的限制酶将该载体线性化后，通过转染于293细胞等培养细胞，可以制作具有感染性的重组腺病毒。需要说明的是，若为本领域技术人员，则可以通过稍微改变上述制造方法来容易地制作本发明涉及的全部的病毒。

3.癌细胞的检测用试剂或癌的诊断用试剂

如上所述，本发明的重组腺病毒具有以下的特征。

(i)感染除红血球以外的几乎全部的细胞，也可感染恶性度高的CAR阴性癌细胞；

(ii)在表达hTERT的癌细胞中特异性地增殖，另外，可以通过增殖使报告基因的表达量增加，使标记蛋白质及发色物质等的生成量增加至可检测的水平；

(iii)即使在暂时感染具有hTERT启动子活性的正常细胞的情况下，通过miRNA的表达，也可抑制该病毒的增殖，另外，可抑制报告基因的表达，因此，可以抑制假阳性的产生。特别是在通过含有血液细胞特异性表达的miRNA的靶序列，即使病毒暂时感染具有hTERT启动子活性的正常血液细胞的情况下，通过该miRNA的表达，也可抑制该病毒在血液细胞中的增殖，另外，可抑制报告基因的表达，因此可抑制假阳性的产生。

因此，本发明的重组腺病毒可以用作癌细胞的检测用试剂或癌的诊断用试剂。特别是本发明的重组病毒具有如上所述的特征，因此，对存在于血中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells：CTC))的检测极有效。

因此，在2004年在新英格兰医学杂志(New England Journal ofMedicine)(Cristofanilli M.et al.,The New EnglandJournal of Medicine,2004,781-791)中报告有使作为存在于血液中的癌细胞的CTC成为术后乳癌患者的预后因子以来，在欧美已经在大量的临床试验中测定CTC作为生物标记，特别是证明在乳癌、前列腺癌及皮肤癌中CTC为确定其预后的独立的因子。另外，在欧洲，在前列腺癌的辅助治疗的临床试验(SUCCESS)中，将所统计的CTC的个数放入入选标准，仅纳入检测到1个以上的患者。该试验为纳入2000例以上的大规模临床试验，其结果备受关注。另外，CTC的增减本身也存在成为临床终点之一的临床试验(MDV3100)。

近年来，由美国的FDA发表涉及分子靶抗癌剂的许可的指导方针，癌的诊断中的CTC检查的重要性进一步提高。由FDA发表的指导方针中规定，在选择分子靶向抗癌剂时，需要检查肿瘤中的分子靶的基因变化等。若要以现有的技术实现该指导方针，则外科上需要由患者的肿瘤组织进行活检(Biopsy)并进行基因检查，迫使患者承担非常强的负担。为了解决该问题，研究对从血液中采集的CTC进行基因检查，相对于现有的“活检”称为“液体活检(liquid biopsy)”。若实现该研究，可以仅通过采集血液来进行肿瘤组织的基因检查，可大幅减轻对患者的负担，因此，CTC检查为有用性非常高的检查技术，在临床现场备受关注。

目前，在CTC检测设备中受到FDA承认的仅为Veridex公司的细胞检验系统(CellSearch System)，临床试验中所使用的CTC检测方法几乎均利用细胞检验系统。细胞检验系统将用EpCAM抗体及细胞角蛋白抗体检测癌细胞作为基本技术。

然而，CTC检测技术为从10亿个血液细胞中检测几个～几十个细胞的方法，因此，提高灵敏度及精度极其困难，在利用细胞检验系统的CTC检测方法中也指出几个问题。例如指出在利用细胞检验系统的CTC检查中，阴性癌细胞在另一检查中检测为阳性，灵敏度及精度因癌种的不同具有较大的差异等(Allard W.J.et al.,Clinical Cancer Research,2004,6897-6904)。另外，对细胞检验系统而言，在临床现场中肺癌的CTC检测率较低也作为问题被举出(Allard W.J.et al.,Clinical Cancer Research,2004,6897-6904)。

另外，对细胞检验系统而言，在引起上皮间质转化(EMT：Epithelial-Mesenchymal Transition)的癌细胞中，含有EpCAM的细胞表面抗原的表达降低，因此，CTC检测率降低也作为问题被举出(Anieta M.et.al.,J NatlCancer Inst,101,2009,61-66、Janice Lu et.al.,Int J Cancer,126(3),2010,669-683)。

进而，为了进行上述“液体活检”，需要浓缩CTC且进行表型及基因分型的工序，因此，要求比仅统计CTC数更高的灵敏度及高精度的CTC检测技术。

与此相对，本发明的重组腺病毒具有上述(i)～(iii)的特征，因此，可在未检测出白血球等正常血液细胞的情况下简便、高灵敏度且高精度地检测出血液中的CTC。进而，本发明的试剂由于可在CTC保持存活的状态下检测，因此，通过分析存在于CTC的细胞表面上的表面抗原等，可以明确所检测的CTC源自哪一个脏器等。因此，本发明的重组腺病毒对CTC的检测及癌的诊断有用。

另外，通过使用本发明的重组腺病毒或癌细胞的检测用试剂，可以检测出引起EMT或间质上皮转化(MET：Mesenchymal-Epithelial Transition)的癌细胞。EMT为癌细胞丧失作为上皮的特性，获得容易移动到周边组织的作为间质系细胞的特征的现象，也参与到癌细胞的渗透及转移中。另一方面，间质上皮转化(MET)是指间质化的细胞获得作为上皮的特征的现象。如上所述，相对于在CellSerch系统等公知的方法中难以检测出引起EMT的癌细胞，在本发明中可以检测出引起EMT或MET的癌细胞，因此，本发明的重组腺病毒对于癌细胞的检测及癌的诊断有用。

进而，通过使用本发明的重组腺病毒，可以检测耐药性癌细胞。在本发明中，所谓药物是指癌的化学疗法中所使用的药物。作为这样的药物，例如可以举出：阿霉素、卡铂、顺铂、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、博来霉素、多柔比星、柔红霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、多西紫杉醇及放线菌素D等，但不限定于这些。另外，通过使用本发明的重组病毒，可以检测癌干细胞(cancer stemcells)。在本发明中，癌干细胞是指作为癌细胞的起源的细胞(干细胞)。癌干细胞也包括具有耐药性的细胞。

在本发明中成为检测或诊断的对象的癌或肿瘤的种类没有限定，可以使用所有种类的癌的细胞。例如可以举出固体癌或血液肿瘤，具体而言，可以举出：脑肿瘤、颈癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、胰腺癌、胃癌、小肠癌、十二指肠癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、胆囊癌、鼻咽癌、肉瘤、黑素瘤、白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤(MM)。源自人的组织的癌细胞几乎(85%以上)显示端粒酶活性的上升，本发明可全部检测出表达这样的端粒酶的癌细胞。

另外，在本发明中，CTC只要为存在于血液中的癌细胞就没有限定，不仅包括从固体癌中游离的癌细胞，而且也包括上述白血病细胞或淋巴瘤细胞等血液肿瘤细胞。但是，在CTC为血液肿瘤细胞的情况下，作为本发明的腺病毒中所含的miRNA靶序列，优选为正常血液细胞特异性表达的miRNA的靶序列。

本发明的试剂可以通过在利用例如冻结等方法使重组腺病毒容易处理后，直接或者与赋形剂、增量剂、粘合剂、润滑剂等公知的药学上所容许的载体、公知的添加剂(包括缓冲剂、张度剂、螯合剂、着色剂、保存剂、香料、风味剂、甜味剂等)等混合来制造。

4.癌细胞的检测方法或癌的诊断方法

进而，通过使本发明的重组腺病毒与癌细胞接触来检测该癌细胞发出的荧光或颜色，可以进行癌细胞的检测或癌的诊断。

在本发明中，所谓“接触”是指使癌细胞和本发明的重组腺病毒存在于同一反应体系中，例如可以举出：在含有癌细胞的试样中添加本发明的重组腺病毒、混合癌细胞和该重组腺病毒、在重组腺病毒的存在下培养癌细胞等，包括使该重组腺病毒感染癌细胞。另外，在本发明中，“荧光或颜色”只要为由从报告基因中表达的蛋白质产生的光或颜色就没有特别限定，例如可以举出：GFP等标记蛋白质发出的荧光、通过利用荧光素酶的酶反应而生成的发光物质发出的光、通过β-半乳糖苷酶和X-gal的酶反应而生成的发色物质发出的蓝色等。

用于癌细胞的检测方法或癌的诊断方法的癌细胞可以源自从受试者中采集的生物试样。从受试者中所提取的生物试样只要为含有癌细胞的组织就没有限定，例如可以举出：血液、肿瘤组织、淋巴组织等。另外，癌细胞可以为血液中的循环肿瘤细胞(CTC)，关于CTC的说明与上述相同。

使用本发明的试剂的癌细胞的检测及癌的诊断例如可以如下所述进行。

在从受试者中采集的生物试样为血液的情况下，添加红血球溶血试剂从其血液试样中除去红血球，在试管内，将一定的比率(0.01～1000MOI(感染复数)、优选0.1～100MOI、更优选1～10MOI)的本发明的试剂混合于其它的细胞悬浮液中。在室温或37℃下放置或回转培养一定的时间(例如4～96小时、优选12～72小时、更优选18～36小时)，促进病毒在癌细胞中的感染及增殖。以流式细胞术定量分析其细胞组分中的GFP荧光表达。或以荧光显微镜观察GFP表达细胞进行形态分析。使用该系统可高灵敏度地检测存在于外周血液中的CTC。该方法可用于检测仅极微量存在于外周血液中的CTC。

在CTC的检测中使用流式细胞术的情况下，例如可以利用以下的基准判定GFP的阳性或阴性，检测CTC。

首先，分析未感染病毒的样品中的细胞群，得到背景荧光值。相对于其荧光最大值设定阈值，接着，分析感染了本发明的病毒的样品中的细胞群，将显示阈值以上的荧光值的样品中的细胞群判定为GFP阳性。在使用从受试者中采集的血液试样的情况下，GFP阳性细胞可以检测为CTC。进而，也可以浓缩GFP阳性细胞(CTC)并进行表型或基因分型。

在本发明中，作为受试者，例如可以举出：人、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠、仓鼠、猫、狗、山羊、猪、绵羊、牛、马、猴等哺乳动物。

本发明的试剂的使用量可根据用于检测的生物试样的状态及量以及使用的检测方法等适宜选择。例如，在血液试样的情况下，可以在相对于血液试样1～50ml、优选3～25ml、更优选5～15ml为约0.01～1000MOI、优选0.1～100MOI、更优选1～10MOI的范围内使用。所谓MOI是指使一定量的培养细胞感染一定量的病毒粒子时的病毒量(感染单位)和细胞数之比，可用作使细胞感染病毒时的指标。

为了使重组病毒感染细胞，例如有以下的方法。首先，将细胞接种于装有适当的培养液的培养板中，在二氧化碳存在下在37℃下培养。培养液采用动物细胞培养中通常所使用的DMEM、MEM、RPMI-1640等，可以根据需要添加血清、抗生素、维生素等。通过接种一定量的病毒，例如0.1～10MOI，感染培养的细胞。

为了确认病毒增殖，可以回收病毒感染细胞，提取DNA，以本发明的病毒所具有的适当的基因作为靶使用引物进行实时PCR，由此进行定量分析。

在使用GFP基因作为报告基因的情况下，关于所标记的细胞的检测，发现病毒增殖的细胞可以通过照射激发光来发出规定的荧光(例如在GFP的情况下为绿色荧光)，由此使癌细胞可见。例如，若在荧光显微镜下观察病毒感染细胞，则可在细胞中发现GFP荧光表达。另外，为了经时观察病毒感染细胞，可以使用CCD照相机经时观察GFP荧光表达。

另外，本发明的试剂也可以实时检测存在于生物体内的癌细胞。为了在生物体内实时标记及检测细胞，只要将本发明的重组腺病毒给药到生物体内即可。

本发明的试剂也可以直接应用于患部，也可以利用所有公知的方法，例如向静脉、肌肉、腹腔内或皮下等的注射、由鼻腔、口腔或肺的吸入、经口给药、使用导管等的血管内给药等组入到生物体(成为对象的细胞及脏器)中。优选可例示：向肌肉、腹腔等中的局部注射、向静脉的注射等。

在对受试者给药本发明的试剂的情况下，其给药量可根据有效成分的种类、给药径路、给药对象、患者的年龄、体重、性别、症状及其它的条件适宜选择，作为一天给药量，通常优选将作为有效成分的本发明病毒的量设为10⁶～10¹¹PFU(蚀斑形成单位(plaque forming units))左右，优选设为10⁹～10¹¹PFU左右，也可以1天给药1次，也可以分多次给药。

在生物体内实时观察癌细胞的荧光具有用于体内诊断剂的优点。其对于所谓的导航手术等有用。关于导航手术的详细情况记载于国际公开公报WO2006/036004。

进而，本发明的试剂由于对于作为生物标记的CTC的检测有用，因此，可以通过使用本发明的试剂进行预后的判定。

例如，在本发明的病毒中使用GFP作为标记蛋白质的情况下，首先，使本发明的病毒分别感染从以任意的癌治疗方法(例如化学疗法、放射线疗法、外科手术等)治疗癌患者之前的患者中采集的生物试样和在治疗经过一定时间(例如1～90天)后的时刻采集的生物试样。接着，在同一条件下比较治疗前采集的试样中所含的GFP阳性细胞和在治疗后的某一时刻采集的试样中所含的GFP阳性细胞的数量。其结果，若治疗后的GFP阳性细胞数比治疗前减少，则可以判定为预后提高。

下面，利用实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例1

Ad34纤毛(Ad34fiber)142-3pT的制作

(1)pHMCMV5-miR-142-3pT的制作

对pHMCMV5(Mizuguchi H.et al.,Human Gene Therapy,10;2013-2017,1999)进行NotI/KPnI处理，得到片段，将该片段与通过对下述的合成寡DNA进行退火而制作的双股寡(ダブルストランドオリゴ)连接，由此制作pHMCMV5-miR-142-3pT(pre)。

miR-142-3pT-S1：

5′-GGCCTCCATAAAGTAGGAAACACTACACAGCTCCATAAAGTAGG AAACACTACATTAATTAAGCGGTAC-3′(序列号43、下划线为miR-142-3p靶序列)

miR-142-3pT-AS1：

5′-CGCTTAATTAATGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAGCTGTGTAGTGT TTCCTACTTTATGGA-3′(序列号44、下划线为miR-142-3p靶序列)

接着，对pHMCMV5-miR-142-3pT(pre)进行PacI/KpnI处理，得到片段，将该片段与通过对以下的合成寡DNA进行退火而制作的双股寡连接，得到具有miR-142-3p靶序列的4次重复序列的pHMCMV5-miR-142-3pT。

miR-142-3pT-S2：

5′-TCCATAAAGTAGGAAACACTACAGGACTCCATAAAGTAGGAAAC ACTACAGTAC-3′(序列号45、下划线为miR-142-3p靶序列)

miR-142-3pT-AS2：

5′-TGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAGTCCTGTAGTGTTTCCTACTTTA TGGAAT-3′(序列号46、下划线为miR-142-3p靶序列)

(2)作为E1穿梭质粒(E1shuttle plasmid)的pHM5-hAIB-miR-142-3pT的制作

用I-CeuI/PmeI消化pSh-hAIB(WO2006/036004)，使用琼脂糖凝胶对消化产物进行电泳。从凝胶中切出约4.5kbp(hAIB盒(hAIB cassette))的带，使用GENECLEANII(Q-Biogene公司)精制回收DNA片段。用NheI消化精制后的DNA片段(hAIB盒)和pHMCMV5-miR-142-3pT后，用克列诺片段处理，进而用I-CeuI消化，将得到的片段连接，得到具有hTERT启动子、E1A基因、IRES(内部核糖体进入位点)序列、E1B基因及miR-142-3pT靶序列的pHM5-hAIB-miR-142-3pT。

(3)作为E3穿梭质粒(E3shuttle plasmid)的pHM13CMV-EGFP-miR-142-3pT的制作

用ApaI及NotI消化pEGFP-N1(Clontech公司)，将得到的消化产物插入到pHMCMV5的ApaI/NotI位点中，得到pHMCMVGFP-1。用PmeI/HindIII消化pHMCMVGFP-1，使用琼脂糖凝胶对消化产物进行电泳。从凝胶中切出约750bp(EGFP)的带，使用GENECLEANII精制回收DNA片段。用HincII/HindIII消化精制后的DNA片段(EGFP)和pBluescriptII KS+，将得到的片段连接，制作pBSKS-EGFP。用ApaI/XbaI消化pBSKS-EGFP，使用琼脂糖凝胶对消化产物进行电泳。从凝胶中切出约750bp(EGFP)的带，使用GENECLEANII精制回收DNA片段。用ApaI/XbaI消化精制后的DNA片段(EGFP)和pHMCMV5-miR-142-3pT，将得到的片段连接，获得pHMCMV5-EGFP-miR-142-3pT。用BglII消化pHMCMV5-EGFP-miR-142-3pT，使用琼脂糖凝胶对消化产物进行电泳。从凝胶中切出约2kbp(CMV-EGFP-miR-142-3pT)的带，使用GENECLEANII精制回收DNA片段。用BamHI消化精制后的DNA片段(CMV-EGFP-miR-142-3pT)和pHM13(Mizuguchi et al.,Biotechniques,30;1112-1116,2001)后，将用CIP(Alkaline Phosphatase,Calf Intest)处理了的片段连接，由此得到pHM13CMV-EGFP-miR-142-3pT。

(4)pAdHM49-hAIB142-3pT-CG142-3pT的制作

通过将对pAdHM49(Mizuguchi et al,J.Controlled Release110;202-211,2005)进行I-CeuI/PI-SceI处理而得到的片段和同样地进行I-CeuI/PI-SceI处理而得到的pHM5-hAIB-miR-142-3pT连接，制作在Ad载体的E1缺失区域中组入有hTERT启动子、E1A基因、IRES序列、E1B基因及miR-142-3pT靶序列的pAdHM49-hAIB142-3pT。pAdHM49为将含有编码5型腺病毒纤毛的纤突结及纤毛轴的基因的区域置换为含有编码34型腺病毒纤毛的纤突结及纤毛轴的基因的区域的重组腺病毒，含有编码由34型腺病毒的纤毛蛋白的纤突结区域及纤毛轴区域构成的区域的基因的碱基序列(序列号49)。用序列号50表示编码pAdHM49的纤毛蛋白(34型腺病毒纤毛的纤突结区域及纤毛轴区域以及5型腺病毒纤毛的纤毛尾部区域)的基因的碱基序列。在序列号50所示的碱基序列中，编码5型腺病毒纤毛的纤毛尾部区域的基因的碱基序列为第1～第132的碱基序列，编码34型腺病毒纤毛的纤毛轴区域的基因的碱基序列为第133～第402的碱基序列，编码34型腺病毒纤毛的纤突结区域的基因的碱基序列为第403～第975的碱基序列。即，在序列号50所示的碱基序列中，源自5型腺病毒纤毛的区域的碱基序列为第1～第132的碱基序列，源自34型腺病毒纤毛的区域的碱基序列为第133～第975的碱基序列。

接着，将用Csp45I消化pAdHM49-hAIB142-3pT而得到的片段和用ClaI消化pHM13CMV-EGFP-miR-142-3pT而得到的片段连接。由此，得到在腺病毒载体的E1缺失区域中组入有hTERT启动子、E1A基因、IRES序列、E1B基因及miR-142-3pT靶序列，在E3缺失区域中组入有CMV启动子、EGFP及miR-142-3pT靶序列，还含有编码34型腺病毒的纤毛蛋白的基因的pAdHM49-hAIB142-3pT-CG142-3pT。

(5)Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)的制作

通过用在pAdHM49-hAIB142-3pT-CG142-3pT中的腺病毒基因组两末端存在识别部位的限制酶PacI切断而形成线状，使用Lipofectamine2000(Invitrogen公司)转染在60mm培养组织中接种而得到的293细胞中。约2周后，获得重组腺病毒Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)(图1)。

实施例2

Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)的活性测定

(1)细胞

作为CAR阳性细胞，使用HeLa(源自人子宫癌细胞)、LN319(源自人神经胶质瘤细胞)，作为CAR阴性细胞，使用LNZ308(源自人神经胶质瘤细胞)、LN444(源自人神经胶质瘤细胞)、K562(源自人骨髓性白血病细胞)。K562表达miR-142-3p。HeLa、LN319、LNZ308、LN444使用DMEM(10%FCS、含抗生素)，K562使用RPMI-1640培养基(10%FCS、含抗生素)，在37℃、饱和蒸汽压、5%CO₂存在下培养。

(2)使用了流式细胞术的Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)的活性测定

将各细胞以5×10⁴细胞/500ul/孔接种于24孔板，以10MOI使Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)作用。作为对照，使用TelomeScan(在5型腺病毒的E1缺失部位中依次组入有hTERT启动子、E1A基因、IRES序列、E1B基因，且在E3缺失部位中依次组入有CMV启动子、GFP的限制增殖型腺病毒)。培养24小时后，回收细胞，使用流式细胞仪MACSQuant(Miltenyi Biotec)测定GFP阳性细胞数。

将其结果示于图2。在本说明书及图2中，“TelomeScann(Ad5纤毛)”表示TelomeScan，“Ad34纤毛”表示在腺病毒基因组的E1缺失部位中依次组入有hTERT启动子、E1A基因、IRES序列及E1B基因，并且在E3缺失部位中依次组入有CMV启动子、GFP，且含有编码源自34型腺病毒的纤毛蛋白的基因的重组腺病毒。另外，“Ad34纤毛142-3pT(E1)”表示在上述Ad34纤毛的E1缺失区域(E1B基因的下游)中还组入有miR-142-3p的靶序列的重组腺病毒，“Ad34纤毛142-3pT(E3)”表示在上述Ad34纤毛的E3缺失区域(GFP基因的下游)中还组入有miR-142-3p的靶序列的重组腺病毒。另外，“Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)”表示在上述Ad34纤毛的E1及E3缺失区域(分别为E1B基因的下游及GFP基因的下游)中还组入有miR-142-3p的靶序列的重组腺病毒。另外，在图2以后的附图中，(含有GFP)是指在各病毒基因组中插入有GFP基因。

活性测定的结果，在使TelomeScann(Ad5纤毛)感染作为CAR阴性细胞的LNZ308、LN444、K562的情况下，无法检测GFP阳性细胞(图2，panel k、p及u)，与此相对，在使其感染Ad34纤毛的情况下，可检测GFP阳性细胞(在LNZ308中85.5%阳性，在LN444中58.4%阳性，在K562中63.7%阳性)(panell、q、v)。

由该结果显示，具有编码34型腺病毒的纤毛蛋白的基因的本发明的重组腺病毒可显著地检测CAR阴性细胞。

另外，在用CAR阴性表达miR-142-3p的K562细胞中，在使其感染Ad34纤毛的情况下，GFP阳性细胞为63.7%(panel v)，与此相对，在使其感染Ad34纤毛142-3pT(E1)的情况下为12.2%，在使其感染Ad34纤毛142-3pT(E3)的情况下为34.8%，在使其感染Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)的情况下无法检测(panelw、x、y)。即，在使用在腺病毒基因组的E1或E3缺失区域的任意中组入有miR-142-3p的靶序列的腺病毒的情况下，K562细胞的检测率显著降低，进而在使用在E1及E3缺失区域这两者中组入有miR-142-3p的靶序列的腺病毒的情况下，无法检测K562细胞。

由该结果显示，含有miR-142-3p的靶序列的本发明的重组病毒未检测出高表达miR-142-3p的细胞，例如正常的血液细胞。

实施例3

使用了Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)的血液试样中的癌细胞的检测

将5×10⁴个H1299细胞(CAR阳性)悬浮于5mL的血液中，使红血球溶血并回收PBMC。在其中添加1×10⁹、1×10¹⁰或1×10¹¹VP(病毒颗粒(virus particle))量的病毒，一边用旋转器使其旋转一边使其在37℃下感染24小时。回收细胞并用抗CD45抗体进行免疫染色，在荧光显微镜下观察GFP阳性细胞。已知CD45为源自除红血球及血小板以外的血球系的细胞的表面抗原。图3及图4的纵轴中记载的“GFP阳性癌细胞(%)”表示“GFP阳性细胞中所含的GFP阳性且CD45阴性的细胞数(%)”。

其结果，在TelomeScann(Ad5纤毛)的感染中观察到大量的假阳性细胞(GFP阳性且CD45阳性)，但在Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)的感染中假阳性非常少，且可以特异性地检测癌细胞。

另外，进行了H1299细胞的检测特异性的定量分析，结果，在TelomeScann(Ad5纤毛)中在1×10⁹VP量的病毒感染中检测出多个假阳性细胞，但在Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)中即使增加病毒感染量，检测特异性也显示90%以上，根据样品的不同，显示100%(图3)。另外，关于A549细胞(CAR阳性)，也利用同样的方法进行了定量分析，结果，在1×10⁹VP量的病毒感染中检测特异性显示100%(图4)。由这些结果显示，通过使用本发明的重组病毒，可以特异性地检测PBMC组分中所含的癌细胞。

由以上结果显示，本发明的检测用试剂及诊断用试剂可以检测恶性度较高的CAR阴性的癌细胞，另一方面，未将高表达miR-142-3p的正常的血液细胞(白血球等)等检测为假阳性，显示对于血中的循环肿瘤细胞(CiculatingTumor Cells：CTC)的检测极其有效。

实施例4

各种人癌细胞株中的Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)的活性测定

(1)细胞

在本实施例中，作为癌细胞，使用源自人肺非小细胞癌的H1299细胞、源自人肺癌的A549细胞、源自人乳癌的MCF7细胞、源自人乳癌的MDA-MB-231细胞、源自人膀胱癌的KK47细胞、源自人胃癌的MKN45细胞、源自人大肠癌的SW620、源自人肝癌的Huh7细胞、源自人胰腺癌的PancI细胞、源自人神经胶质瘤的LN319细胞、源自人膀胱癌的T24细胞、源自人神经胶质瘤的LNZ308细胞、及源自人神经胶质瘤的LN444细胞。

(2)使用了流式细胞术的Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)的活性测定

将5×10⁴个各种癌细胞悬浮于500μl的培养基中，在其中添加100μl调整为5×10⁵或者5×10⁶pfu/ml的限制增殖型Ad悬浮液。将细胞和限制增殖型Ad的混合液接种于24孔板中，在37℃下培养24小时。回收细胞，以1500rpm离心5分钟，除去培养基后，悬浮在含有2%FCS的PBS300μl中，使用流式细胞仪(MACS Quant Analyzer;Miltenyi Biotec)测定GFP阳性率。数据利用FCS多色数据分析软件(Flowjo)分析。

其结果，Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)高效地感染几乎全部的癌细胞，60%以上为GFP阳性。特别是关于CAR阴性细胞(T24、LNZ308、LN444)，与现有的TelomeScan相比GFP阳性率大幅提高(图5)。

该结果显示，通过使用本发明的重组病毒，不仅可高效检测CAR阳性细胞，而且可高效检测CAR阴性细胞。

实施例5

引起上皮间质转化(EMT)的癌细胞的检测

通过将人胰腺癌PancI细胞在10ng/mL的重组TGF-β1存在下培养6天，诱导上皮间质转化(EMT)。诱导EMT后，以实时RT-PCR测定编码E-钙粘着蛋白、EpCAM、hTERT、N-钙粘着蛋白、Slug及Snail的mRNA的相对表达。进而，利用流式细胞术分析Panc I细胞中的CAR及CD46表达。本发明的病毒对细胞的感染通过与实施例4同样的方法进行。

其结果显示，通过在含有TGF-β的培养基中培养，作为EMT的标记基因的Slug、Snail及N-钙粘着蛋白的表达上升，并且作为上皮系的标记的E-钙粘着蛋白、EpCAM的表达减少，显示出诱导了EMT(图6A)。另外，随着诱导EMT，CAR的表达减少，但CD46的表达完全未减少(图6B)。进而，在相对于引起EMT的PancI细胞使用现有的TelomeScan的情况下，仅约35%为GFP阳性，与此相对，在Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)中大约90%以上为GFP阳性(图6C)。

由这些结果显示，通过使用本发明的重组病毒，可高灵敏度地检测引起上皮间质转化(EMT)的癌细胞。

实施例6

癌干细胞的检测

将MCF7细胞及MCF7-ADR(对作为抗癌剂的阿霉素具有耐性的癌细胞)分别以1×10³个/孔接种于96孔板中，第二天，以0.2、1、5、25、125μg/mL添加阿霉素。在阿霉素添加24小时后，使用AlamarBlue(注册商标)细胞活性试剂测定细胞生存率(值：平均±S.D.(n=6))。

另外，利用流式细胞术分析MCF7细胞及MCF7-ADR细胞的CAR、CD46、P-糖蛋白(MDR)、CD24及CD44的表达。将5×10⁵个MCF7-ADR细胞悬浮于含有2%FCS的PBS100μl中，加入1μl FITC标记小鼠抗人CD24抗体、PE标记小鼠抗人CD44抗体，使其在冰上在遮光下反应1小时。用4ml含有2%FCS的PBS清洗后，以1500rpm离心5分钟，抽吸除去上清液。再次将细胞悬浮于含有2%FCS的PBS100μl中，使用细胞分选仪(FACS Aria II细胞分选仪;BD生物科学)分类CD24阴性CD44阳性细胞组分。数据利用FCS多色数据分析软件(Flowjo)分析。已知在人乳癌细胞中具有CD24阴性CD44阳性细胞的特征的组分为癌干细胞(Al-Hajj M.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA,100;3983-3988,(2003))，另外，本发明的病毒对细胞的感染利用与实施例4同样的方法进行。

其结果显示，MCF7-ADR细胞与MCF7细胞相比，在阿霉素存在下也显著地显示较高的生存率，具有耐药性能(图7A)。另外，MCF7-ADR细胞与MCF7细胞，同样地高表达CAR及CD46。另外，高表达作为承担药物排泄功能的膜蛋白质的MDR(图7B)。进而，使MCF-ADR细胞中的CD24阴性CD44阳性细胞与Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)作用，结果，80%以上为GFP阳性。另一方面，在现有的TelomeScan中，约70%为GFP阳性(图7C)。

由这些结果显示，通过使用本发明的重组病毒，可检测出耐药性的癌细胞。另外，显示，通过使用本发明的重组病毒，可检测出癌干细胞。

实施例7

使用了Ad34纤毛142-3pT(E1,E3)的血液试样中的癌细胞的检测

使H1299细胞、T24细胞以100MOI与表达红色荧光蛋白(单体红色荧光蛋白;RFP)慢性病毒载体作用并培养。然后，为了获得克隆细胞，在96孔板中以0.1cells/well的方式接种细胞，进行培养直到形成菌落。用荧光显微镜选择表达RFP的细胞，扩大培养后，使用流式细胞术测定RFP表达强度。而且，将RFP的表达强度较强的细胞作为RFP表达细胞。

将由1.0mL的人外周血液得到的人外周血单个核细胞(hPBMC)悬浮于800μL的RPMI-1640培养基(10%FCS、含抗生素)中。在hPBMC悬浮液中添加100μL调整为1.0×10⁵或者5.0×10⁵cells/mL的癌细胞(图8中，“锥形癌细胞(spiked cancer cells)”表示在hPBMC悬浮液中添加的癌细胞的个数)。进而，添加100μL调整为2×10⁸pfu/mL的限制增殖型Ad悬浮液，形成合计1mL的悬浮液后，用旋转器使其缓慢旋转，同时在37℃下培养24小时。

以300x g离心病毒感染后培养24小时的细胞悬浮液5分钟，除去上清液。加入细胞固定液200μL，使其在4℃下在遮光状态下反应15分钟。加入1mL的PBS，以300x g离心5分钟，除去上清液。悬浮于含有2%FCS的PBS中，使用流式细胞仪(MACS Quant Analyzer;Miltenyi Biotec)测定GFP阳性率。数据利用FCS多色数据分析软件(Flowjo)分析。

在本研究中，将用RFP(红色荧光蛋白)标记的癌细胞混入hPBMC中，研究是否可检测出hPBMC中的癌细胞。其结果，在CAR阳性癌细胞(H1299)的情况下，TelomeScann(Ad5纤毛)、Ad34纤毛143-3pT(E1,E3)均可检测出80%以上的癌细胞。另一方面，在CAR阴性癌细胞(T24)的情况下，在TelomeScann(Ad5纤毛)中，约10%为GFP阳性，检测效率极低，但在Ad34纤毛143-3pT(E1,E3)中可检测出80%以上的癌细胞(图8)。

由该结果显示，通过使用本发明的重组腺病毒，不仅可高效检测CAR阳性癌细胞，而且也可高效检测CAR阴性癌细胞。

工业实用性

含有本发明的重组腺病毒的试剂可在不检测出正常的血液细胞(白血球等)的情况下简便且高灵敏度地检测CAR阴性癌细胞。

序列表Freetext

序列号4：合成DNA

序列号5～26：合成RNA

序列号27～28：合成DNA

序列号43～46：合成DNA

序列号50：合成DNA