KR101946666B1 - 제한 증식형 아데노바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 제한 증식형 아데노바이러스 및 이것을 포함하는 암 세포의 검출용 또는 암의 진단용 시약을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 인간 텔로머라아제 역전사 효소 (hTERT) 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자를 이 순서로 포함하고, 또한, 제 1 miRNA 의 표적 배열을 포함하는 폴리뉴클레오티드. 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복제 카세트가 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에 삽입된 재조합 아데노바이러스를 제공한다.

Description

제한 증식형 아데노바이러스 {CONDITIONALLY REPLICATION-COMPETENT ADENOVIRUS}
본 발명은 신규 제한 증식형 아데노바이러스 및 이것을 포함하는 암 세포의 검출용 시약 또는 암의 진단용 시약에 관한 것이다.
현재, 암의 진단 방법으로는, 주로 (i) MRI 등 대형 검사 기기를 사용하는 수법과, (ii) 혈액 중의 종양 마커 등을 측정하는 방법이 이용되고 있으며, 간편하고 또한 환자 부담이 적은 (ii) 의 방법에 기대가 모아지고 있다. 특히, 암 환자의 말초혈 중에 순환하는 암 세포 (순환 종양 세포 (Circulating Tumor Cells : CTC)) 는, 전신 전이의 위험성을 높이는 점이나, CTC 가 확인된 환자의 예후가 현저하게 낮은 점 등 임상 증상과 밀접한 관계를 나타내는 점에서, 예후의 예측 인자나 서로게이트 마커로서, CTC 를 간편하고 또한 고감도로 검출하는 수법의 개발이 기대되고 있다.
CTC 를 검출하는 수법으로는, EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) 이나 Cytokeratin-8 등의 암 관련 항원으로 검출하는 방법 (CellSearch system 등) 이나 RT-PCR 등으로 검출할 방법이 이용되고 있다. 그러나, 이들 암 관련 항원은 정상적인 상피 세포에서도 발현하고 있기 때문에 위양성 (僞陽性) 을 검출할 가능성이 높고, 또한, PCR 법으로는 암 세포에 특징적인 세포 형태를 동시에 관찰할 수 없는 등, 감도나 간편성, 정확성, 비용의 관점에서, 새로운 수법이 요구되고 있다.
다른 한편, 본 발명자는 이전, 암 세포 특이적으로 증식하고, 또한 GFP 를 발현하는 제한 증식형 아데노바이러스 (GFP-expressing Conditionally Replicating Adenovirus : GFP-CRAd) (텔로메스캔 (등록상표), OBP-401 또는 텔로멜라이신-GFP 라고 칭한다) 를 개발하였다 (특허문헌 1 : WO 2006/036004). 그리고, 이 텔로메스캔을 이용하여, CTC 를 간편하게 검출하는 방법을 개발하였다 (비특허문헌 1 : Kojima T., et al, J. Clin. Invest., 119 ; 3172, 2009).
그러나, 텔로메스캔은 5 형 아데노바이러스의 파이버 단백질을 갖고, 표적 세포인 Coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) 를 개재하여 감염되기 때문에, CAR 을 발현하고 있지 않은 세포에는 감염되지 않을 가능성이 있다. 특히, 침윤, 전이 및 증식능이 높아, 악성도가 높은 암 세포는 CAR 의 발현이 저하되는 것이 알려져 있는데 (비특허문헌 2 : Okegawa T., et al, Cancer Res., 61 : 6592-6600, 2001), 텔로메스캔은 이들 악성도가 높은 암 세포를 검출할 수 없을 가능성이 있다. 또한, 가능성은 낮기는 하지만, 텔로메스캔이 정상적인 혈액 세포 (예를 들어 백혈구) 에 감염되어 증식하여, GFP 를 발현함으로써, 위양성을 발생시키는 것도 상정된다.
그 때문에, CAR 음성을 포함하는 거의 모든 암 세포를 검출하고, 또한 정상적인 혈액 세포에 있어서 위양성을 발생시키지 않는 암 세포의 검출용 시약 및 암의 진단용 시약이 요구되고 있다.
WO 2006/036004
Kojima T., et al, J. Clin. Invest., 119 : 3172, 2009 Okegawa T., et al, Cancer Res., 61 : 6592-6600, 2001
본 발명은 이와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 해결하고자 하는 과제는 CAR 음성 세포를 포함하는 거의 모든 암 세포를 검출하고, 또한 혈액 세포에 있어서 위양성을 발생시키지 않는, 암 세포의 검출용 시약 및 암의 진단용 시약을 제공하는 것, 그리고 이와 같은 시약으로서 유용한 제한 증식형 재조합 아데노바이러스를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 실시한 결과, 텔로메스캔에 있어서의 5 형 아데노바이러스의 파이버를, 거의 모든 인간 세포, 특히 암 세포 전반에서 고발현하고 있는 CD46 에 결합하는 아데노바이러스의 파이버로 치환함으로써, CAR 양성 세포뿐만 아니라, CAR 음성 세포를 검출할 수 있는 것을 알아냈다. 또한, 텔로메스캔에 마이크로 RNA (miRNA) 에 의한 유전자 제어계를 삽입함으로써, 혈액 세포에 있어서 위양성이 발생하지 않도록 하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 인간 텔로머라아제 역전사 효소 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자를 이 순서로 포함하고, 또한, 제 1 마이크로 RNA 의 표적 배열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(2) 제 1 마이크로 RNA 가 비암 세포에서 발현하는 것인 상기 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(3) 제 1 마이크로 RNA 가 miR-142, miR-15, miR-16, miR-21, miR-126, miR-181, miR-223, miR-296, miR-125, miR-143, miR-145, miR-199 및 let-7 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(4) 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복제 카세트가 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에 삽입된 재조합 아데노바이러스.
(5) 리포터 유전자 및 그 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터를 포함하는 표지 카세트가 아데노바이러스 게놈의 E3 영역에 추가로 삽입된 상기 (4) 에 기재된 재조합 아데노바이러스.
(6) 표지 카세트가 추가로 제 2 마이크로 RNA 의 표적 배열을 포함하는 것인 상기 (5) 에 기재된 재조합 아데노바이러스.
(7) 세포사 유도 관련 단백질을 코드하는 유전자 및 그 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터를 포함하는 세포사 유도 카세트가 아데노바이러스 게놈의 E3 영역에 추가로 삽입된 상기 (4) 에 기재된 재조합 아데노바이러스.
(8) 세포사 유도 카세트가 추가로 제 2 마이크로 RNA 의 표적 배열을 포함하는 것인 상기 (7) 에 기재된 재조합 아데노바이러스.
(9) 제 2 마이크로 RNA 가 비암 세포에서 발현하는 것인 상기 (6) 또는 (8) 에 기재된 재조합 아데노바이러스.
(10) 제 2 마이크로 RNA 가 miR-142, miR-15, miR-16, miR-21, miR-126, miR-181, miR-223, miR-296, miR-125, miR-143, miR-145, miR-199 및 let-7 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 상기 (9) 에 기재된 재조합 아데노바이러스.
(11) 리포터 유전자가 형광을 발하는 단백질을 코드하는 유전자 또는 효소 반응에 의해 발광 물질 혹은 발색 물질을 발생시키는 효소 단백질을 코드하는 유전자인 상기 (5) 또는 (6) 에 기재된 재조합 아데노바이러스.
(12) 상기 프로모터가 인간 텔로머라아제 역전사 효소 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스 프로모터인 상기 (5) ∼ (10) 중 어느 한 항에 기재된 재조합 아데노바이러스.
(13) CD46 에 결합하는 파이버 단백질을 코드하는 유전자를 추가로 포함하는 상기 (4) ∼ (12) 중 어느 한 항에 기재된 재조합 아데노바이러스.
(14) CD46 에 결합하는 파이버 단백질이 34 형 또는 35 형 아데노바이러스의 파이버 단백질의 적어도 파이버 노브 영역을 포함하는 것인 상기 (13) 에 기재된 재조합 아데노바이러스.
(15) 상기 (4) ∼ (14) 중 어느 한 항에 기재된 재조합 아데노바이러스를 포함하는 암 세포의 검출용 시약.
(16) 상기 (4) ∼ (14) 중 어느 한 항에 기재된 재조합 아데노바이러스를 포함하는 암의 진단용 시약.
(17) 암 세포가 피검자로부터 채취된 생체 시료 유래의 것인 상기 (15) 에 기재된 시약.
(18) 생체 시료가 혈액인 상기 (17) 에 기재된 시약.
(19) 암 세포가 순환 종양 세포인 상기 (15) 또는 (18) 에 기재된 시약.
(20) 암 세포가 약물 내성 암 세포인 상기 (15) 및 (17) ∼ (19) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(21) 암 세포가 암 줄기 세포인 상기 (15) 및 (17) ∼ (20) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(22) 암 세포가 상피 간엽 이행 또는 간엽 상피 이행을 일으킨 암 세포인 상기 (15) 및 (17) ∼ (21) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(23) 상기 (11) 에 기재된 재조합 아데노바이러스를 암 세포에 접촉시켜, 당해 암 세포가 발하는 형광 또는 색을 검출하는 것을 특징으로 하는 암 세포의 검출 방법.
(24) 암 세포가 피검자로부터 채취된 생체 시료 유래의 것인 상기 (23) 에 기재된 방법.
(25) 생체 시료가 혈액인 상기 (24) 에 기재된 방법.
(26) 암 세포가 순환 종양 세포인 상기 (25) 에 기재된 방법.
본 발명에 의해, 정상적인 혈액 세포 (백혈구 등) 를 검출하지 않고, CAR 음성의 암 세포를 간편하고 또한 고감도로 검출할 수 있다.
도 1 은 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 구조의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 2 는 플로우 사이토메트리에 의한 재조합 아데노바이러스의 활성 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은 혈액 시료에 포함되는 H1299 세포의 검출 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는 혈액 시료에 포함되는 A549 세포의 검출 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 각종 암 세포에 있어서의 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 활성 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은 상피 간엽 이행 (EMT) 을 일으킨 암 세포의 검출 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 은 암 줄기 세포의 검출 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은 혈액 시료에 포함되는 H1299 세포 및 T24 세포를 적색 형광 단백질을 이용하여 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 이하의 실시형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시이며, 본 발명을 이 실시형태에만 한정하는 취지는 아니다. 본 발명은, 그 요지를 일탈하지 않는 한, 다양한 형태로 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서는 본원 우선권 주장의 기초가 되는 2011년 8월 23일에 출원된 일본국 특허 출원 (특원 2011-181414호) 의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.
1. 개요
본 발명자가 이전 개발한 텔로메스캔 (5 형 아데노바이러스의 E1 결손 영역에 hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열, 및 E1B 유전자가 이 순서로 삽입되고, 또한, E3 결손 영역에 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 GFP 가 이 순서로 삽입된 제한 증식형 아데노바이러스) 에 있어서는, (i) CAR 의 발현이 저하되어 있는 악성도가 높은 암 세포를 검출할 수 없을 가능성이 있는 것, 및 (ii) 정상적인 혈액 세포를 위양성으로서 검출할 가능성이 있는 것이 과제였다. 본 발명자는 이들 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 실시한 결과, 텔로메스캔에 있어서의 5 형 아데노바이러스의 파이버를, 거의 모든 인간 세포, 특히 암 세포 전반에서 고발현하고 있는 CD46 에 결합하는 아데노바이러스의 파이버로 치환함으로써, 악성도가 높은 CAR 음성의 암 세포를 검출할 수 있는 것을 알아냈다. 또한, miRNA 인 miR-142-3p 의 표적 배열을, 텔로메스캔의 증식 카세트 및 표지 카세트에 삽입함으로써, 정상적인 혈액 세포에 있어서 바이러스의 증식 및 표지 단백질의 발현이 억제되어, 정상적인 혈액 세포에 있어서 위양성의 발생을 억제할 수 있는 것을 알아냈다.
즉, 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는, hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열, E1B 유전자 및 마이크로 RNA 의 표적 배열을 포함하는 복제 카세트가 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에 삽입됨과 함께, 리포터 유전자, 그 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터 및 마이크로 RNA 의 표적 배열을 포함하는 표지 카세트가 아데노바이러스 게놈의 E3 영역에 삽입되고, 또한, CD46 에 결합하는 아데노바이러스의 파이버 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스로 (도 1), 이하의 특징을 갖는다.
(i) CD46 에 결합하는 아데노바이러스의 파이버 단백질을 코드하는 유전자를 포함함으로써, CAR 음성 세포를 포함하는 거의 모든 세포에 감염될 수 있다.
(ii) hTERT 프로모터를 포함함으로써, hTERT 를 발현하는 암 세포에서 특이적으로 증식하고, 또한 증식에 의해 리포터 유전자의 발현이 증가하여, 표지 단백질이나 발색 물질 등의 생성량을 검출 가능한 레벨까지 증가시킬 수 있다.
(iii) miRNA 의 표적 배열을 포함함으로써, 바이러스가 만일 hTERT 프로모터 활성을 갖는 정상 세포에 감염된 경우에도, miRNA 의 발현에 의해, 당해 바이러스의 증식은 억제되고, 또한 리포터 유전자의 발현은 억제되기 때문에, 위양성의 발생을 억제할 수 있다. 특히, 혈액 세포 특이적으로 발현하는 miRNA 의 표적 배열을 포함함으로써, 바이러스가 만일 hTERT 프로모터 활성을 갖는 정상 혈액 세포에 감염된 경우에도, 당해 miRNA 의 발현에 의해, 당해 바이러스의 혈액 세포에서의 증식은 억제되고, 또한 리포터 유전자의 발현은 억제되기 때문에, 위양성의 발생을 억제할 수 있다.
본 발명은 이들 지견에 기초하여 완성된 것이다.
2. 재조합 아데노바이러스
(1) 복제 카세트
본 발명은 인간 텔로머라아제 역전사 효소 (hTERT) 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자를 이 순서로 포함하고, 또한 마이크로 RNA 의 표적 배열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복제 카세트가 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에 삽입된 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는, 상기 폴리뉴클레오티드 (또는 이것을 포함하는 복제 카세트) 의 기능에 의해, 암 세포에서 특이적으로 증식하는 것이 가능하고, 또한 목적으로 하는 miRNA 가 발현하는 세포에 있어서 바이러스의 증식을 억제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 복제 카세트에 포함되는 miRNA 의 표적 배열이 혈액 세포에서 특이적으로 발현하는 miRNA 의 표적 배열인 경우, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 hTERT 를 발현하는 암 세포에서 특이적으로 증식하고, 또한 혈액 세포에서 증식이 억제된다.
인간 텔로머라아제 역전사 효소 (hTERT) 프로모터는 인간 텔로머라아제의 구성 성분인 역전사 효소의 프로모터이다. 인간 텔로머라아제 활성의 상승에는, hTERT mRNA 의 스플라이싱이나 hTERT 단백질의 번역 후 수식 등이 관여하고 있는데, hTERT 유전자 발현의 증강, 즉, hTERT 프로모터 활성의 상승이 가장 중요한 분자 기구로 생각되고 있다. 인간 텔로머라아제는, 인간의 암의 85 ％ 이상에서 활성의 상승이 확인되고 있는 한편으로, 대부분의 정상 세포에서 활성을 나타내지 않기 때문에, hTERT 프로모터를 사용함으로써, 암 세포 특이적으로 그 하류의 유전자를 발현시킬 수 있다. 본 발명에 있어서는, hTERT 프로모터를, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자의 상류에 배치함으로써, hTERT 를 발현하고 있는 암 세포에서 특이적으로 바이러스를 증식시킬 수 있다.
hTERT 는 그 5' 말단의 상류 1.4 kbp 의 영역에 있어서 많은 전사 인자 결합 배열이 확인되어 있으며, 그 영역이 hTERT 프로모터인 것으로 생각된다. 그 중에서도, 번역 개시 부위의 상류 181 bp 의 배열이 하류의 유전자 발현에 중요한 코어 영역이다. 본 발명에 있어서는, 이 코어 영역을 포함하는 것이면, 한정되지 않고 사용할 수 있지만, 이 코어 영역을 완전히 포함하는 상류 378 bp 정도의 배열을 hTERT 프로모터로서 사용하는 것이 바람직하다. 이 378 bp 정도의 배열은, 181 bp 의 코어 영역 단독의 경우와 비교하여, 그 유전자 발현 효율이 동등한 것이 확인되어 있다. 455 bp 의 길이의 hTERT 프로모터의 염기 배열을 배열 번호 1 에 나타낸다.
hTERT 프로모터의 염기 배열은, 배열 번호 1 에 나타내는 것 외에, 배열 번호 1 로 이루어지는 DNA 에 대하여 상보적인 염기 배열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 hTERT 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드의 염기 배열도 포함된다. 이와 같은 뉴클레오티드는 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 단편을 프로브로 하여, 콜로니 하이브리다이제이션, 플라크 하이브리다이제이션, 서든 블롯 등의 공지된 하이브리다이제이션법에 의해, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리로부터 얻을 수 있다.
cDNA 라이브러리의 제작 방법에 대해서는, 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」 (Cold Spring Harbor Press (1989)) 를 참조할 수 있다. 또한, 시판되는 cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리를 사용해도 된다.
상기 하이브리다이제이션에 있어서 스트린젠트한 조건으로는, 예를 들어, 1×SSC ∼ 2×SSC, 0.1 ％ ∼ 0.5 ％ SDS 및 42 ℃ ∼ 68 ℃ 의 조건을 들 수 있고, 보다 상세하게는, 60 ∼ 68 ℃ 에서 30 분 이상 프레하이브리다이제이션을 실시한 후, 2×SSC, 0.1 ％ SDS 중, 실온에서 5 ∼ 15 분의 세정을 4 ∼ 6 회 실시하는 조건을 들 수 있다.
하이브리다이제이션법의 상세한 순서에 대해서는, 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」 (Cold Spring Harbor Press (1989) ; 특히 Section 9.47-9.58) 등을 참조할 수 있다.
E1A 유전자 및 E1B 유전자는 아데노바이러스의 E1 유전자에 포함되는 유전자인데, 이 E1 유전자란, 바이러스가 갖는 DNA 복제에 관한 초기 유전자 (early : E) 와 후기 유전자 (late : L) 중 초기 유전자의 1 개를 말하며, 바이러스 게놈의 전사의 제어에 관련된 단백질을 코드하고 있다. 아데노바이러스의 E1A 유전자에 의해 코드되는 E1A 단백질은 감염 가능한 바이러스 산생에 필요한 유전자군 (E1B, E2, E4 등) 의 전사를 활성화한다. 아데노바이러스의 E1B 유전자에 의해 코드되는 E1B 단백질은, 후기 유전자 (L 유전자) 의 mRNA 가, 감염된 숙주 세포의 세포질에 축적되는 것을 도와, 숙주 세포의 단백질 합성을 저해함으로써, 바이러스의 복제를 촉진시킨다. E1A 유전자, E1B 유전자의 염기 배열을 각각 배열 번호 2 및 배열 번호 3 에 나타낸다. E1A 유전자 및 E1B 유전자의 염기 배열은, 각각 배열 번호 2 및 배열 번호 3 에 나타내는 것 외에, 배열 번호 2 및 배열 번호 3 으로 이루어지는 DNA 에 대하여 상보적인 염기 배열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 각각 E1A 및 E1B 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 배열도 포함된다. 하이브리다이제이션의 방법 및 스트린젠트한 조건 등에 대해서는 상기 hTERT 프로모터와 동일하다.
IRES (Internal Ribosome Entry Site) 배열은 피코르나바이러스과에 특이적인 단백질 합성 개시 시그널로, 18S 리보솜 RNA 의 3' 말단과 상보적인 배열이 있기 때문에 리보솜 결합 부위로서의 역할을 하는 것으로 생각되고 있다. 피코르나바이러스과의 바이러스 유래 mRNA 는 이 배열을 개재하여 번역되는 것이 알려져 있다. IRES 배열로부터의 번역 효율은 높아, mRNA 의 도중에서부터도 캡 구조 비의존적으로 단백질 합성이 실시된다. 따라서, 본 발명의 바이러스에서는, hTERT 프로모터에 의해 E1A 유전자와 IRES 배열의 하류에 있는 E1B 유전자의 양방이 독립적으로 번역된다. IRES 배열을 사용함으로써, hTERT 프로모터의 발현 제어가 E1A 유전자, E1B 유전자에 독립적으로 달하기 때문에, E1A 유전자 또는 E1B 유전자의 어느 일방을 hTERT 프로모터로 제어하는 경우에 비하여, 바이러스의 증식을 보다 엄격하게 텔로메라아제 활성을 갖는 세포에 한정할 수 있다. 또한, IRES 배열을 E1A 유전자와 E1B 유전자 사이에 삽입함으로써, 숙주 세포에 있어서의 바이러스의 증식능을 높일 수 있다. IRES 배열의 염기 배열을 배열 번호 4 에 나타낸다. IRES 배열의 염기 배열은, 배열 번호 4 에 나타내는 것 외에, 배열 번호 4 로 이루어지는 DNA 에 대하여 상보적인 염기 배열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 IRES 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 배열도 포함된다. 하이브리다이제이션의 방법 및 스트린젠트한 조건 등에 대해서는 상기 hTERT 프로모터와 동일하다.
miRNA 는 일반적으로 15 ∼ 25 염기 정도의 짧은 1 개 사슬 RNA 라고 일컬어지고 있으며, mRNA 에 존재하는 표적 배열에 결합함으로써, 다양한 유전자의 번역 제어를 실시하는 것으로 생각되고 있다. 따라서, 예를 들어, miRNA 를 발현하는 세포에 목적 유전자와 당해 miRNA 의 표적 배열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 감염시킨 경우, 그 세포에 있어서 목적 유전자의 발현은 억제된다. miRNA 의 표적 배열의 삽입 지점으로는, 목적 유전자의 발현을 억제할 수 있으면 특별히 제한은 없지만, 목적 유전자의 비번역 영역에 삽입하는 것이 바람직하고, 목적 유전자의 하류에 삽입하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 사용되는 miRNA 의 표적 배열로는, 비암 세포에서 발현하는 miRNA 의 표적 배열을 들 수 있다. 비암 세포는 악성 종양 세포가 아닌 세포를 의미하며, 예를 들어, 정상 세포, 양성 종양 세포 등이 포함된다. 정상 세포에는, 예를 들어 정상적인 혈액 세포, 정상적인 내피 세포, 정상적인 섬유아세포, 정상적인 줄기 세포 등이 포함된다. 한편, 순환 종양 세포는 악성 종양에서 유래하는 세포인 것으로 생각되고 있으며, 본 발명에 있어서는, 악성 종양 세포에 포함된다.
또한, 본 발명에 사용되는 miRNA 의 표적 배열로는, 혈액 세포에서 특이적으로 발현하는 miRNA 의 표적 배열을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 「혈액 세포」 는 정상적인 혈액 세포뿐만 아니라 암화한 혈액 세포를 포함하고 있어도 된다. 즉, 본 발명에 있어서, 「혈액 세포에서 특이적으로 발현하는 miRNA」 는 정상 혈액 세포에서 특이적으로 발현하고 있어도 되고, 정상적인 혈액 세포 및 암화한 혈액 세포의 양방에 특이적으로 발현하고 있어도 된다. 정상적인 혈액 세포 및 암화한 혈액 세포의 양방에 특이적으로 발현하는 경우에 있어서도, 순환 종양 세포를 검출할 때에 정상 혈액 세포의 위양성을 줄여, 고형암으로부터 유리된 순환 종양 세포를 정확하게 검출할 수 있다. 본 발명에 있어서, 「혈액 세포에서 특이적으로 발현하는 miRNA」 로는, 정상적인 혈액 세포에서 발현하지만 암화한 혈액 세포에서는 발현하지 않는 miRNA 가 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, 혈액 세포로는, 한정되는 것은 아니지만, 백혈구 (호중구, 호산구, 호염기구, 임파구 (T 세포 및 B 세포), 단구, 수상 세포), CD34 양성 세포, 조혈 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 말초혈 단핵구 (PBMC) 등을 들 수 있다. 또한, 암화한 혈액 세포로는, 백혈병 세포, 임파종 세포 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 어느 세포에서 「특이적으로 발현한다」 란, 그 세포에서만 발현하는 것을 의미할 뿐만 아니라, 다른 세포에 비하여 그 세포에서 발현량이 높은 것도 의미한다. 예를 들어, 「혈액 세포에서 특이적으로 발현한다」 란, 혈액 세포에서만 발현하는 것을 의미할 뿐만 아니라, 혈액 세포 이외의 세포에 비하여 혈액 세포에서 발현량이 높은 것도 의미한다.
혈액 세포에서 특이적으로 발현하고 있는 miRNA 로는, 예를 들어, miR-142, miR-15, miR-16, miR-21, miR-126, miR-181, miR-223, miR-296 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 miR-142, miR-15 및 miR-16 이다.
miRNA 는 1 개 사슬 RNA 이지만, premature 의 2 개 사슬 RNA 중 목적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 한, 어느 측의 1 개 사슬 RNA 의 표적 배열을 사용해도 된다. 예를 들어, miR-142 에는 miR-142-3p 및 miR-142-5p 가 존재하는데, 본 발명에 있어서는 어느 표적 배열을 사용해도 된다. 즉, 본 발명에 있어서, 「miR-142」 에는, miR-142-3p 및 miR-142-5p 의 양자가 포함되고, 바람직하게는 miR-142-3p 이다. 또한 마찬가지로, 본 발명에 있어서, 「miR-15」 에는, premature 의 2 개 사슬 RNA 중, 센스 사슬 (「miR-15S」 라고 표기) 및 안티센스 사슬 (「miR-15AS」 라고 표기) 이 포함된다. 다른 miRNA 에 대해서도 동일하다.
miR-142-3p 의 유전자는 B 세포 백혈병 (aggressive B cell leukemia) 에 있어서 전좌가 일어나는 부위에 존재하고 있으며, 조혈 조직 (골수, 비장, 흉선 등) 에서 발현하고 있지만, 그 밖의 조직에서는 발현하고 있지 않은 것이 알려져 있다. 또한, miR-142-3p 는 마우스 태아 간장 (태아의 조혈 조직) 에 있어서 발현이 확인되어, 조혈계의 분화에 관여하고 있는 것으로 생각되고 있다 (Chang-Zheng Chen, et al., Science, 2004).
본 양태에 있어서는, hTERT 프로모터의 작용에 의해 암 세포에 있어서의 특이적인 유전자 발현이 실시되고, miRNA 의 작용에 의해 혈액 세포에서의 유전자 발현이 제어되기 때문에, 2 단계의 선택적인 유전자 발현 제어가 실시된다.
또한, 다른 양태에 있어서, 본 발명에 사용되는 miRNA 의 표적 배열로는, 암 세포에 있어서 발현이 억제되어 있는 miRNA 의 표적 배열을 들 수 있다. 암 세포에 있어서 발현이 억제되어 있는 miRNA 로는, 예를 들어, miR-125, miR-143, miR-145, miR-199, let-7 등을 들 수 있다. 본 양태에 있어서는, hTERT 프로모터와 miRNA 의 작용에 의해 암 세포에 있어서의 특이적인 유전자 발현이 이중으로 제어된다.
miRNA 는 당초, 선충, 효모 등에서 발견되었지만, 현재는 인간이나 마우스에서 수백 개 발견되어 있다. 이들의 배열은 공지이며, 공공의 DB (예를 들어 miRBase sequence database (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index. shtml, http://www.mirbase.org/)) 에 액세스함으로써, 배열 정보 등을 취득할 수 있다.
miR-142, miRNA-15, miRNA-16, miR-21, miR-126, miR-181, miR-223, miR-296, miR-125, miR-143, miR-145, miR-199, let-7 의 각 배열을 이하에 나타낸다.
miR-142-3p : 5'-UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA (배열 번호 5)
miR-142-5p : 5'-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU (배열 번호 6)
miR-15S : 5'-UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG (배열 번호 7)
miR-15AS : 5'-CAGGCCAUAUUGUGCUGCCUCA (배열 번호 8)
miR-16S : 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (배열 번호 9)
miR-16AS : 5'-CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA (배열 번호 10)
miR-21S : 5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (배열 번호 11)
miR-21AS : 5'-CAACACCAGUCGAUGGGCUGU (배열 번호 12)
miR-126S : 5'-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG (배열 번호 13)
miR-126AS : 5'-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG (배열 번호 14)
miR-181 : 5'-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU (배열 번호 15)
miR-223S : 5'-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA (배열 번호 16)
miR-223AS : 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU (배열 번호 17)
miR-296-3p : 5'-GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC (배열 번호 18)
miR-296-5p : 5'-AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU (배열 번호 19)
miR-125 : 5'-UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA (배열 번호 20)
miR-143S : 5'-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC (배열 번호 21)
miR-143AS : 5'-GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGU (배열 번호 22)
miR-145S : 5'-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU (배열 번호 23)
miR-145AS : 5'-GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU (배열 번호 24)
miR-199 : 5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC (배열 번호 25)
let-7 : 5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU (배열 번호 26)
본 발명에 있어서, miRNA 의 표적 배열 1 단위는 miRNA 의 전부 또는 일부에 대하여 상보적인 배열로 이루어지고, 염기 길이는 7 ∼ 30 염기 길이이고, 바람직하게는 19 ∼ 25 염기 길이이고, 보다 바람직하게는 21 ∼ 23 염기 길이이다. 본 발명에 있어서, miRNA 의 표적 배열 1 단위란, 어느 miRNA 가 표적으로 할 수 있는 최저한의 길이의 염기 배열을 말한다. 구체적으로는, 배열 번호 5 ∼ 26 의 어느 염기 배열의 상보 배열에서 선택되는 적어도 7 염기 길이의 올리고뉴클레오티드를 말하고, 어느 지점에 있어서, 1 또는 몇 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 부가 또는 삭제되어 있어도 된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 아데노바이러스에 삽입되는 표적 배열 전체로는, miRNA 와 표적 배열의 상호 작용을 효과적으로 발휘시키기 위해서, 1 단위의 표적 배열을 복수 포함하는 것이어도 된다. 재조합 아데노바이러스에 삽입하는 표적 배열 전체의 길이는 당해 바이러스 게놈에 삽입 가능한 길이이면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 1 단위의 표적 배열을 1 ∼ 10 카피, 바람직하게는 2 ∼ 6 카피, 보다 바람직하게는 2 카피 또는 4 카피 포함하고 있어도 된다 (John G. Doench, et al., Genes Dev. 2003 17 : 438-442). 표적 배열 전체 중에 포함되는 표적 배열 1 단위의 배열과 배열 사이에는, 적당한 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 있어도 된다. 적당한 길이의 올리고뉴클레오티드의 길이는 특별히 한정되지 않지만, 표적 배열 전체로서 재조합 아데노바이러스 게놈에 삽입 가능한 길이이면 되고, 예를 들어 0 ∼ 8 염기 길이의 올리고뉴클레오티드이어도 된다. 또한, 복수 단위의 miRNA 의 표적 배열을 포함하는 경우에는, 각각의 단위의 표적 배열이 동일한 miRNA 에 대한 표적 배열이어도 되고, 상이한 miRNA 에 대한 표적 배열이어도 된다. 또한, 동일한 miRNA 에 대한 표적 배열을 포함하는 경우에 있어서도, 각각의 단위의 표적 배열의 길이나 표적 배열의 염기 배열이 상이해도 된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 (또는 이것을 포함하는 복제 카세트) 에 포함되는 miRNA 의 표적 배열에 대해서는, 당해 폴리뉴클레오티드가 재조합 아데노바이러스에 삽입된 경우에, 재조합 아데노바이러스에 존재하는 다른 miRNA 의 표적 배열과 구별하기 위해서, 「제 1 마이크로 RNA 의 표적 배열」 이라고 칭할 수도 있다.
본 발명에 있어서, miRNA 로서 miR-142-3p 를 사용하는 경우, 그 표적 배열로는, 예를 들어 이하의 배열을 포함하는 배열을 들 수 있다.
(i) miR-142-3p 의 표적 배열 2 단위를 포함하는 배열 :
5'-gcggcctccataaagtaggaaacactacacagctccataaagtaggaaacactacattataagcg gtac
(배열 번호 27, 밑줄은 miR-142-3p 의 표적 배열 1 단위를 나타낸다)
(ii) miR-142-3p 의 표적 배열 4 단위를 포함하는 배열 :
5'-ggcctccataaagtaggaaacactacacagctccataaagtaggaaacactacattaattccata aagtaggaaacactacaccactccataaagtaggaaacactacagtac
(배열 번호 28, 밑줄은 miR-142-3p 의 표적 배열 1 단위를 나타낸다)
본 발명에 있어서는, hTERT 프로모터-E1A 유전자-IRES 배열-E1B 유전자의 콘스트럭트의 하류에 miRNA 의 표적 배열을 배치하고, hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열, E1B 유전자 및 miRNA 의 표적 배열을 이 순서로 포함하는 폴리뉴클레오티드 (복제 카세트라고 한다) 를 아데노바이러스 게놈에 삽입함으로써, 당해 miRNA 를 발현하는 세포에 있어서, E1 유전자의 발현을 억제하고, 바이러스의 증식을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, E1B 유전자 또는 후술하는 리포터 유전자의 하류에 miRNA 의 표적 배열을 삽입함으로써, 그 상류에 존재하는 유전자의 발현은 억제된다. 이 메커니즘의 상세한 것은 분명하지는 않지만, 이하와 같은 기구를 생각할 수 있다. 먼저, miRNA-RISC (RNA-induced silencing complex) 가 mRNA 상의 표적 배열을 절단함으로써, mRNA 의 폴리 A 가 제거된다. 이로써, mRNA 의 안정성이 낮아지고, mRNA 가 분해되어, 유전자의 발현이 억제되는 것으로 생각된다. 혹은, miRNA-RISC 가 통상적인 miRNA 와 동일하게 폴리 A 분해 효소를 리크루트하여, 폴리 A 가 분해된 결과, mRNA 의 안정성이 낮아져, 유전자의 발현이 억제되는 것으로 생각된다.
또한, 종래, IRES 배열의 하류에 삽입된 유전자의 발현 (번역) 에 대해서는, miRNA 에 의한 유전자 발현의 억제 효과가 얻어지지 않았던 것이 보고되어 있지만 (Ramesh S. Pillai et al., Science 309, 1573 (2005) ; Geraldine Mathonnet, et al., Science 317, 1764 (2007)), 본 발명자가 본 발명의 hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열, E1B 유전자 및 miRNA 의 표적 배열을 이 순서로 포함하는 재조합 아데노바이러스에 대하여 유전자 발현을 확인한 결과, miRNA 에 의해 IRES 배열의 하류에 삽입된 E1B 유전자의 발현은 충분히 억제되었다. 이것은 본 발명에 있어서의 새로운 지견이다.
본 발명의 복제 카세트에 포함되는 유전자는 통상적인 유전자 공학적 수법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 유전자 공학적 수법으로서 일반적으로 이용되고 있는 DNA 합성 장치를 사용한 핵산 합성법을 사용할 수 있다. 또한, 주형이 되는 유전자 배열을 단리 또는 합성한 후에, 각각의 유전자에 특이적인 프라이머를 설계하고, PCR 장치를 이용하여 그 유전자 배열을 증폭하는 PCR 법 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4) 또는 클로닝 벡터를 사용한 유전자 증폭법을 사용할 수 있다. 상기 방법은, Moleculer cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 등에 따라, 당업자라면 용이하게 실시할 수 있다. 얻어진 PCR 산물의 정제에는 공지된 방법을 사용할 수 있다. 필요에 따라, 관용의 배열 결정법에 의해 기대된 유전자가 얻어진 것을 확인할 수 있다. 예를 들어, 디데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션법 (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463) 등에 의해 실시할 수 있다. 또한, 적당한 DNA 시퀀서 (예를 들어, ABI PRISM (어플라이드 바이오 시스템즈사)) 를 이용하여 배열을 해석하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, miRNA 의 표적 배열은 표적 배열 1 단위별로 miRNA 의 전부 또는 일부의 염기 배열에 대하여 상보적이 되도록 설계하고, 합성함으로써 취득할 수 있다. 예를 들어, miR-142-3p 의 표적 배열은 miR-142-3p 의 염기 배열에 상보적이 되도록 DNA 를 합성함으로써 취득할 수 있다.
그 후, 상기와 같이 하여 얻어진 각각의 유전자를 소정의 순서가 되도록 연결시킨다. 먼저, 상기 각각의 유전자를 공지된 제한 효소 등으로 절단하고, 절단한 당해 유전자의 DNA 단편을 공지된 벡터에 공지된 방법에 따라 삽입하고, 연결한다. 공지된 벡터로는, 예를 들어, pIRES 벡터를 사용할 수 있다. pIRES 벡터는 뇌심근염 바이러스 (ECMV) 의 IRES (Internal Ribosome Entry Site) 배열이 포함되어 있고, 1 종류의 mRNA 로부터 2 개 지점의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 을 번역하는 것이 가능한 벡터이다. pIRES 벡터를 사용하면, 멀티 클로닝 사이트에, 순차적으로 필요한 유전자를 삽입함으로써, 「hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자를 이 순서로 포함하고, 또한 마이크로 RNA 의 표적 배열을 포함하는 폴리뉴클레오티드」 를 제작할 수 있다. miRNA 의 표적 배열의 삽입 지점은 특별히 제한은 없지만, hTERT 프로모터-E1A-IRES-E1B 의 콘스트럭트의 하류에 삽입하는 것이 보다 바람직하다. DNA 의 연결에는, DNA 리가아제를 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라, pShuttle 등의 공지 벡터에 포함되는 CMV 프로모터를 공지된 제한 효소에 의해 제거하고, 그 부위에 hTERT 프로모터-E1A-IRES-E1B-miRNA 표적 배열로부터 적당한 제한 효소를 이용하여 자른 배열을 삽입할 수 있다. hTERT 프로모터의 제어하에 아데노바이러스의 증식에 필요한 E1 유전자를 발현시킴으로써, 바이러스를 암 세포 특이적으로 증식시킬 수 있다.
(2) 표지 카세트
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에 상기 복제 카세트가 삽입되고, E3 영역에 추가로 표지 카세트가 삽입된 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다. 표지 카세트는 리포터 유전자 및 그 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터를 포함하는 것으로, 추가로 miRNA 의 표적 배열을 포함하고 있어도 된다.
아데노바이러스 E3 영역에는 11.6 kDa 의 ADP (adenovirus death protein) 가 존재하고, ADP 는 세포 장해 및 바이러스의 확산을 촉진시키는 기능을 가지고 있다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 ADP 를 포함하는 E3 영역과 같은 세포 장해 및 바이러스의 확산을 촉진시키는 기능을 갖는 단백질을 코드하는 바이러스 게놈 영역이 제거되어 있기 때문에, 세포사의 타이밍이 늦어, GFP 등의 형광 발현에 의한 암 조직의 동정이 용이해져 있다. 이것은, 후술하는 순환 종양 세포 (Circulating Tumor Cells : CTC) 를 장시간 살아있는 채로 검출할 수 있는 점에서도 유효하다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스의 표지 카세트에 포함되는 리포터 유전자로는, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 형광을 발하는 단백질을 코드하는 유전자, 효소 반응에 의해 발광 물질 혹은 발색 물질을 발생시키는 효소 단백질을 코드하는 유전자, 항생 물질을 코드하는 유전자, 태그 융합 단백질을 코드하는 유전자, 세포 표면에 발현하여 특정한 항체에 결합하는 단백질을 코드하는 유전자, 막 수송 단백질을 코드하는 유전자 등을 들 수 있다. 형광을 발하는 단백질 (표지 단백질) 로는, 예를 들어, 에쿼리아 빅토리아 (Aequorea victorea) 등의 발광 해파리 유래의 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein : GFP), 그것을 개변한 EGFP (Enhanced-humanized GFP), rsGFP (red-shift GFP), 황색 형광 단백질 (yellow fluorescent protein : YFP), 남색 형광 단백질 (cyan fluorescent protein : CFP), 청색 형광 단백질 (blue fluorescent protein : BFP), 바다 팬지 (Renilla reniformis) 유래의 GFP 등을 들 수 있고, 이것들을 코드하는 유전자를 본 발명에 사용할 수 있다. 상기 형광을 발하는 단백질로는, GFP 또는 EGFP 가 바람직하다.
또한, 효소 반응에 의해 발광 물질 혹은 발색 물질을 발생시키는 효소 단백질로는, 예를 들어, β-갈락토시다아제, 루시페라아제 등을 들 수 있다. β-갈락토시다아제는, 효소 반응에 의해, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드 (X-gal) 로부터, 청색의 발색 물질을 발생시킨다. 또한, 루시페라아제는, 루시페린과 효소 반응하여, 발광 물질을 발생시킨다. 루시페라아제로는, 반딧불이 루시페라아제나 박테리아 루시페라아제, 바다 팬지 루시페라아제 등이 알려져 있으며, 당업자는 공지된 루시페라아제로부터 적절히 선택할 수 있다.
또한, 상기 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터란, 목적으로 하는 상기 유전자의 발현에 사용하는 바이러스에 대응할 수 있는 적절한 프로모터이면 어떠한 것이어도 된다. 예를 들어, CMV 프로모터, hTERT 프로모터, SV40 후기 프로모터, MMTV LTR 프로모터, RSV LTR 프로모터, SRα 프로모터, β 액틴 프로모터, PGK 프로모터, EF-1a 프로모터 등을 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 CMV 프로모터 또는 hTERT 프로모터를 사용할 수 있다.
표지 카세트에 삽입되는 miRNA 의 표적 배열은 복제 카세트에 삽입되는 miRNA 의 표적 배열과 동일해도 되고, 상이한 것이어도 된다.
본 발명에 있어서는, miRNA 의 표적 배열을, 리포터 유전자의 비번역 영역, 바람직하게는 당해 유전자의 하류에 배치함으로써, 리포터 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 즉, 본 발명에 있어서, 표지 카세트는 리포터 유전자를 제어할 수 있는 프로모터, 리포터 유전자 및 마이크로 RNA 의 표적 배열을 이 순서로 포함하는 것이 바람직하다. 표지 카세트에 삽입되는 miRNA 의 표적 배열은, 복제 카세트에 포함되는 miRNA 의 표적 배열과 구별하기 위해서, 「제 2 마이크로 RNA 의 표적 배열」 이라고 칭한다. miRNA 에 관한 그 밖의 설명은 상기와 동일하다.
본 발명의 표지 카세트에 포함되는 재조합 유전자의 취득 방법, 정제 방법, 배열 결정 방법 등에 대해서는 상기 복제 카세트의 경우와 동일하다.
(3) 세포사 유도 카세트
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에 상기 복제 카세트가 삽입되고, E3 영역에 세포사 유도 카세트가 삽입된 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다. 세포사 유도 카세트는 세포사 유도 관련 단백질을 코드하는 유전자 및 그 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터를 포함하는 것으로, 추가로 마이크로 RNA 의 표적 배열을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스에 사용되는 세포사 유도 카세트에는, 세포사 유도 관련 단백질을 코드하는 유전자와 그 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터가 포함된다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 암 세포에 감염시키면, 암 세포에서 특이적으로 바이러스가 증식하는 결과, 세포사 유도 관련 단백질의 세포 내 발현량이 높아져, 다른 정상 세포를 손상시키지 않고, 암 세포에서만 세포사를 유도할 수 있다.
세포사 유도 관련 단백질을 코드하는 유전자란, 특정한 세포의 세포사의 유도에 관련하는 단백질을 코드하는 유전자를 말한다. 세포사 유도 관련 단백질로는, 예를 들어, 면역 관련 단백질로서 PA28 을 들 수 있다. PA28 은 세포 내의 프로테아좀을 활성화하는 단백질로, 과잉 발현에 의해 면역 반응을 야기함과 함께 세포사도 유도하는 단백질이다. 또한, 아포토시스 유도 단백질로서 TRAIL 을 들 수 있다. TRAIL 은 세포 표면의 수용체와 결합함으로써 아포토시스 세포사를 유도하는 분자를 말한다.
또한, 세포사 유도 관련 단백질을 코드하는 유전자로는, 암 억제 유전자를 들 수 있다. 암 억제 유전자는 암 세포의 증식을 억제하는 기능을 갖는다. 암 억제 유전자로는, 예를 들어 종래의 유전자 치료에서 이용되고 있는 이하의 것을 들 수 있다. 각 유전자의 염기 배열의 배열 번호 및 GenBank Accession No. 를 이하에 나타낸다.
p53 (배열 번호 29 ; Accession No. M14694) : 다종의 암
p15 (배열 번호 30 ; Accession No. L36844) : 다종의 암
p16 (배열 번호 31 ; Accession No. L27211) : 다종의 암
APC (배열 번호 32 ; Accession No. M74088) : 대장암, 위암, 췌장암
BRCA-1 (배열 번호 33 ; Accession No. U14680) : 난소암, 유방암
DPC-4 (배열 번호 34 ; Accession No. U44378) : 대장암, 췌장암
FHIT (배열 번호 35 ; Accession No. NM 112012) : 위암, 폐암, 자궁암
p73 (배열 번호 36 ; Accession No. Y11416) : 신경아세포종
PATCHED (배열 번호 37 ; Accession No. U59464) : 기저 세포암
Rbp110 (배열 번호 38 ; Accession No. M15400) : 폐암, 골육종
DCC (배열 번호 39 ; Accession No. X76132) : 대장암
NF1 (배열 번호 40 ; Accession No. NM 000267) : 신경 섬유종증 1 형
NF2 (배열 번호 41 ; Accession No. L11353) : 신경 섬유종증 2형
WT-1 (배열 번호 42 ; Accession No. NM 000378) : 바이러무스 종양
세포사 유도 카세트에 포함되는 miRNA 의 표적 배열은 복제 카세트에 삽입되는 miRNA 의 표적 배열과 동일해도 되고, 상이한 것이어도 된다. 본 발명에 있어서는, miRNA 의 표적 배열을, 세포사 유도 관련 단백질을 코드하는 유전자의 비번역 영역, 바람직하게는 당해 유전자의 하류에 배치함으로써, 당해 세포사 유도 관련 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 즉, 본 발명에 있어서, 세포사 유도 카세트는 세포사 유도 관련 단백질을 코드하는 유전자를 제어할 수 있는 프로모터, 세포사 유도 관련 단백질을 코드하는 유전자 및 마이크로 RNA 의 표적 배열을 이 순서로 포함하는 것이 바람직하다. miRNA 에 관한 그 밖의 설명은 상기와 동일하다.
본 발명의 세포사 유도 카세트에 포함되는 재조합 유전자의 취득 방법, 정제 방법, 배열 결정 방법 등에 대해서는 상기 복제 카세트의 경우와 동일하다.
세포사가 유도되었는지 여부를 판단하는 데에는, 이하의 형태학적 관찰에 의해 실시할 수 있다. 즉, 배양 용기의 저면에 부착된 세포에 본 발명의 재조합 바이러스를 감염시키고 일정한 시간이 경과하면, 도립 현미경하에서 세포는 원형화하여, 저면으로부터 박리되어 광택을 가진 세포로서 배양액 중에 부유한다. 이 시점에서 세포는 그 생명을 유지하는 기구에 파탄을 초래하고 있어, 세포사가 유도된 것으로 판단할 수 있다. 또한, 테트라졸륨염 (MTT, XTT 등) 을 사용한 시판되는 생세포 어세이 키트로도 세포사를 확인할 수 있다.
(4) CD46 에 결합하는 파이버 단백질
또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 CD46 에 결합하는 아데노바이러스 파이버 단백질을 코드하는 유전자를 포함할 수 있다.
현재, 일반적으로 사용되고 있는 아데노바이러스 벡터는, 51 종류의 혈청형의 인간 아데노바이러스 중, Subgroup C 에 속하는 5 형 (혹은 2 형) 아데노바이러스를 기본 골격으로 하여 제작되고 있다. 5 형 아데노바이러스는 그 우수한 유전자 도입 특성으로부터 널리 사용되고 있는데, 표적 세포인 Coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) 에 결합하여 감염되기 때문에, CAR 의 발현이 낮은 세포에는 감염되는 것이 곤란하다는 과제가 있다. 특히, 침윤, 전이 및 증식능이 높아, 악성도가 높은 암 세포는 CAR 의 발현이 저하되어 있기 때문에, 5 형 아데노바이러스의 파이버 단백질을 갖는 아데노바이러스는 이와 같은 악성도가 높은 암 세포에 감염시킬 수 없을 가능성이 있다.
이에 반하여, CD46 은 인간에서는 적혈구를 제외한 거의 모든 세포에서 발현하고 있어, 악성도가 높은 암 세포에 있어서도 발현하고 있다. 따라서, CD46 에 결합하는 아데노바이러스 파이버 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스는 CAR 음성이고 악성도가 높은 암 세포에도 감염시킬 수 있다. 예를 들어, 34 형 및 35 형 아데노바이러스는, 수용체로서 CD46 에 결합하여, 세포에 감염된다 (Marko Marttila, et al., J. Virol. 2005, 79 (22) : 14429-36). 전기한 바와 같이, CD46 은 인간에서는 적혈구를 제외한 거의 모든 세포에서 발현하고 있는 점에서, 34 형 및 35 형 아데노바이러스는, CAR 음성 세포를 포함하여, 광범위한 세포에 대하여, 감염시키는 것이 가능하다. 또한, 아데노바이러스의 파이버는 노브 영역, 샤프트 영역 및 테일 영역으로 이루어지고, 아데노바이러스는 파이버 노브 영역이 수용체에 결합함으로써 세포에 감염되는 점에서, 파이버 단백질의 적어도 파이버 노브 영역을 5 형 아데노바이러스 유래의 것으로부터 34 형 또는 35 형 아데노바이러스 유래의 것으로 치환함으로써, 당해 바이러스는 CD46 을 개재하여 CAR 음성 세포에 감염시킬 수 있다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는, CD46 에 결합하는 아데노바이러스의 파이버 단백질을 코드하는 유전자를 포함함으로써, 적혈구를 제외한 거의 모든 감염될 수 있기 때문에, 침윤, 전이 및 증식능이 높아, 악성도가 높은 CAR 음성의 암 세포에 감염시키는 것이 가능하다. 본 발명에 있어서, 「CAR 음성」 세포란, CAR 의 발현이 낮은 세포 또는 전혀 발현하지 않는 세포를 의미한다.
현재, 인간 아데노바이러스는 57 종류의 혈청형이 동정되어 있으며, 그들은 A ∼ F 군의 6 개의 그룹으로 분류되어 있다. 그 중에서, B 군에 속하는 아데노바이러스는 CD46 에 결합하는 것이 보고되어 있다. B 군에 속하는 아데노바이러스로는, 34 형 및 35 형 아데노바이러스 외에, 예를 들어, 3 형, 7 형, 11 형, 16 형, 21 형, 50 형의 아데노바이러스를 들 수 있다.
본 발명의 CD46 에 결합하는 아데노바이러스의 파이버 단백질로는, B 군에 속하는 아데노바이러스의 파이버 단백이 바람직하고, 3 형, 7 형, 34 형, 35 형, 11 형, 16 형, 21 형 및 50 형 아데노바이러스의 파이버 단백이 보다 바람직하고, 34 형 및 35 형 아데노바이러스의 파이버 단백이 더욱 바람직하다.
34 형, 35 형, 3 형, 7 형, 11 형, 16 형, 21 형 또는 50 형 아데노바이러스의 파이버 단백질을 코드하는 유전자의 염기 배열은, 각각, NCBI (The National Center for Biotechnology Information) 의 GenBank 등 공지된 유전자 정보 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 34 형, 35 형, 3 형, 7 형, 11 형, 16 형, 21 형 또는 50 형 아데노바이러스의 파이버 단백질을 코드하는 유전자의 염기 배열에는, 상기 데이터베이스로부터 입수한 각 유전자의 염기 배열 외에, 당해 염기 배열로 이루어지는 DNA 에 대하여 상보적인 염기 배열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 CD46 에 대한 결합 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 배열도 포함된다.
CD46 에 대한 결합 활성은, 당해 염기 배열을 포함하는 DNA 를 갖는 재조합 아데노바이러스의 CD46 발현 세포에 대한 감염성을 측정함으로써, 평가할 수 있다. 재조합 아데노바이러스의 감염성의 측정은, 예를 들어 CD46 발현 세포에 감염된 바이러스가 발현하는 GFP 를 형광 현미경이나 플로우 사이토메트리 등으로 검출하는 등, 공지된 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 하이브리다이제이션의 방법 및 스트린젠트한 조건 등에 대해서는 상기와 동일하다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는, CD46 에 결합하는 아데노바이러스의 파이버 단백질의 전부 또는 일부의 영역을 포함하는 것이어도 되고, 당해 파이버 단백질의 적어도 파이버 노브 영역이 CD46 에 결합하는 것이면 된다. 즉, 본 발명에 있어서, CD46 에 결합하는 아데노바이러스의 파이버 단백질은 B 군에 속하는 아데노바이러스의 파이버 단백질의 적어도 파이버 노브 영역을 포함하는 것이면 되고, 34 형, 35 형, 3 형, 7 형, 11 형, 16 형, 21 형 및 50 형으로 이루어지는 군에서 선택되는 형의 아데노바이러스의 파이버 단백질의 적어도 파이버 노브 영역을 포함하는 것이 보다 바람직하고, 34 형 또는 35 형 아데노바이러스의 파이버 단백질의 적어도 파이버 노브 영역을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명의 기술적 사상은, CD46 에 결합하는 것이면, 파이버 단백질에 한정되지 않고, CD46 에 결합 가능한 다양한 단백질이나 CD46 에 결합 가능한 모티프를 갖는 단백질에까지 이른다.
또한, 본 발명에 있어서, CD46 에 결합하는 파이버 단백질은 B 군에 속하는 아데노바이러스의 파이버 단백질의 파이버 노브 영역 및 파이버 샤프트 영역으로 이루어지는 영역을 포함하는 것이어도 되고, 34 형, 35 형, 3 형, 7 형, 11 형, 16 형, 21 형 및 50 형으로 이루어지는 군에서 선택되는 형의 아데노바이러스의 파이버 단백질의 파이버 노브 영역 및 파이버 샤프트 영역으로 이루어지는 영역을 포함하는 것이 보다 바람직하고, 34 형 또는 35 형 아데노바이러스의 파이버 단백질의 파이버 노브 영역 및 파이버 샤프트 영역으로 이루어지는 영역을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, CD46 에 결합하는 파이버 단백질은, B 군에 속하는 아데노바이러스의 파이버 단백질의 파이버 단백질의 적어도 파이버 노브 영역을 포함하는 것이면, 상기 형 이외의 형 (예를 들어 2 형, 5 형) 의 아데노바이러스의 파이버 단백질의 파이버 샤프트 영역 또는 파이버 테일 영역을 포함하는 것이어도 된다.
이와 같은 파이버 단백질로는, 예를 들어, 34 형, 35 형, 3 형, 7 형, 11 형, 16 형, 21 형 및 50 형으로 이루어지는 군에서 선택되는 형의 아데노바이러스의 파이버 단백질의 파이버 노브 영역 및 파이버 샤프트 영역 그리고 5 형 아데노바이러스의 파이버 단백질의 파이버 테일 영역으로 이루어지는 영역을 포함하는 파이버 단백질을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
34 형 아데노바이러스의 파이버 단백질의 파이버 노브 영역을 코드하는 유전자, 파이버 샤프트 영역을 코드하는 유전자, 그리고 파이버 노브 영역 및 파이버 샤프트 영역으로 이루어지는 영역을 코드하는 유전자의 염기 배열을 각각 배열 번호 47, 48 및 49 로 나타낸다.
또한, 34 형 아데노바이러스의 파이버 단백질의 파이버 노브 영역 및 파이버 샤프트 영역 그리고 5 형 아데노바이러스의 파이버 단백질의 파이버 테일 영역으로 이루어지는 영역을 코드하는 유전자의 염기 배열을 배열 번호 50 으로 나타낸다. 본 발명에 있어서, 상기 유전자의 염기 배열에는, 배열 번호 50 으로 나타내는 염기 배열 외에, 당해 염기 배열로 이루어지는 DNA 에 대하여 상보적인 염기 배열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 CD46 에 대한 결합 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 배열도 포함된다. CD46 에 대한 결합 활성의 평가 방법, 하이브리다이제이션의 방법 및 스트린젠트한 조건 등에 대해서는 상기와 동일하다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는, 복제 카세트, 표지 카세트 및/또는 세포사 유도 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드를, 적당한 제한 효소를 이용하여 잘라내고, 적당한 바이러스 발현 벡터에 삽입함으로써 제작할 수 있다. 바이러스 발현 벡터로는, 아데노바이러스 벡터가 바람직하고, 5 형 아데노바이러스 벡터가 보다 바람직하고, CD46 에 결합하는 아데노바이러스의 파이버 단백질 (예를 들어 34 형 또는 35 형 아데노바이러스의 파이버 단백질) 을 코드하는 유전자를 포함하는 5 형 아데노바이러스 벡터가 특히 바람직하다.
또한, 후기하는 실시예 2 에서 나타내는 바와 같이, 복제 카세트의 하류에 miRNA 표적 배열을 삽입한 경우 및 표지 카세트의 하류에 miRNA 표적 배열을 삽입한 경우의 각각에 있어서 혈액 세포에 있어서의 GFP 의 발현은 충분히 억제되지만, 복제 카세트의 하류 및 표지 카세트의 하류의 양방에 동시에 삽입한 경우에는 혈액 세포에 있어서의 GFP 의 발현이 예기치 않을 정도로 현저하게 억제되었다. 이것은 본 발명에 있어서의 새로운 지견이다.
본 발명에 있어서, 재조합 아데노바이러스는 예를 들어 이하의 방법에 의해 취득할 수 있다.
먼저, pHMCMV5 (Mizuguchi H. et al., Human Gene Therapy, 10 ; 2013-2017, 1999) 를 제한 효소 처리하여 miRNA 의 표적 배열을 삽입하여, miRNA 의 표적 배열을 갖는 벡터를 제작한다. 다음으로, hTERT 프로모터-E1A-IRES-E1B 의 콘스트럭트를 포함하는 pSh-hAIB (WO 2006/036004) 를 제한 효소 처리하고, 얻어진 hTERT 프로모터-E1A-IRES-E1B 의 콘스트럭트를 포함하는 단편을, 상기 miRNA 의 표적 배열을 갖는 벡터에 삽입하여, hTERT 프로모터-E1A-IRES-E1B-miRNA 표적 배열을 포함하는 벡터를 얻는다. 다른 한편, pHMCMVGFP-1 (EGFP 유전자가 삽입된 pHMCMV5) 을 제한 효소 처리하여, CMV 프로모터 및 EGFP 유전자를 포함하는 단편을 취득하고, 이 단편을, 상기 miRNA 의 표적 배열을 갖는 벡터에 삽입하여, CMV-EGFP-miRNA 표적 배열의 콘스트럭트를 포함하는 벡터를 얻는다. 그리고, hTERT 프로모터-E1A-IRES-E1B-miRNA 표적 배열을 포함하는 벡터와 CMV-EGFP-miRNA 표적 배열을 포함하는 벡터를 각각 제한 효소 처리하고, 라이게이션함으로써, 아데노바이러스 게놈의 E1 결손 영역에 hTERT 프로모터-E1A-IRES-E1B-miRNA 표적 배열이 삽입되고, 또한 E3 결손 영역에 CMV-EGFP-miRNA 표적 배열이 삽입된 벡터를 얻을 수 있다. 또한, 콘스트럭트를 포함하는 DNA 단편을 삽입하는 벡터로서, CD46 에 결합하는 아데노바이러스의 파이버 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 벡터를 사용함으로써, 아데노바이러스 게놈의 E1 결손 영역에 hTERT 프로모터-E1A-IRES-E1B-miRNA 표적 배열이 삽입됨과 함께, E3 결손 영역에 CMV-EGFP-miRNA 표적 배열이 삽입되고, 또한 CD46 에 결합하는 아데노바이러스의 파이버 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 벡터를 얻을 수 있다. 그리고, 이 벡터를 공지된 제한 효소로 선상화한 후, 293 세포 등의 배양 세포에 트랜스펙션함으로써, 감염성이 있는 재조합 아데노바이러스를 제작할 수 있다. 또한, 당업자이면, 상기 제조 방법을 약간 개변함으로써, 본 발명에 관련된 모든 바이러스를 용이하게 제작할 수 있다.
3. 암 세포의 검출용 시약 또는 암의 진단용 시약
상기한 바와 같이, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 이하의 특징을 갖는다.
(i) 적혈구를 제외한 거의 모든 세포에 감염되고, 악성도가 높은 CAR 음성의 암 세포에도 감염되는 것이 가능하고,
(ii) hTERT 를 발현하는 암 세포에서 특이적으로 증식하고, 또한 증식에 의해 리포터 유전자의 발현량을 증가시키고, 표지 단백질이나 발색 물질 등의 생성량을 검출 가능한 레벨까지 증가시킬 수 있고,
(iii) 만일 hTERT 프로모터 활성을 갖는 정상 세포에 감염된 경우에도, miRNA 의 발현에 의해, 당해 바이러스의 증식은 억제되고, 또한 리포터 유전자의 발현은 억제되기 때문에, 위양성의 발생을 억제할 수 있다. 특히, 혈액 세포 특이적으로 발현하는 miRNA 의 표적 배열을 포함함으로써, 바이러스가 만일 hTERT 프로모터 활성을 갖는 정상 혈액 세포에 감염된 경우에도, 당해 miRNA 의 발현에 의해, 당해 바이러스의 혈액 세포에서의 증식은 억제되고, 또한 리포터 유전자의 발현은 억제되기 때문에, 위양성의 발생을 억제할 수 있다.
따라서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 암 세포의 검출용 시약 또는 암의 진단용 시약으로서 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 재조합 바이러스는 상기와 같은 특징을 갖기 때문에, 혈중에 존재하는 순환 종양 세포 (Circulating Tumor Cells : CTC)) 의 검출에 매우 유효하다.
그런데, 2004 년에 New England Journal of Medicine (Cristofanilli M. et al., The New England Journal of Medicine, 2004, 781-791) 에 혈액 중에 존재하는 암 세포인 CTC 가 수술 후 유방암 환자의 예후 인자가 된다는 것이 보고된 이후, 구미에서는 이미 많은 임상 시험에서 CTC 가 바이오 마커로서 측정되고, 특히 유방암, 전립선암 및 피부암에서는 CTC 가 그 예후를 결정하는 독립적인 인자인 것이 증명되어 있다. 또한, 유럽에서는, 전립선암의 Ajuvant Setting 에 의한 임상 시험 (SUCCESS) 에 있어서, 계수된 CTC 의 개수가 Inclusion Criteria 에 포함되어, 1 개 이상 검출된 환자만이 포함되도록 되어 있다. 이 시험은 2000 예 이상이 포함되는 대규모 임상 시험으로, 그 결과가 주목되고 있다. 또한, CTC 의 증감 그 자체가 Clinical Endpoint 의 하나가 되어 있는 임상 시험 (MDV3100) 도 존재한다.
최근에는 미국의 FDA 로부터 분자 표적 항암제의 허인가에 관한 가이드 라인이 나와, 암의 진단에 있어서의 CTC 검사의 중요성이 더욱 높아져 있다. FDA 로부터 나온 가이드 라인에는, 분자 표적 항암제를 선택할 때에, 종양에 있어서의 분자 표적의 유전자 변화 등을 검사할 필요가 있는 것이 규정되어 있다. 이 가이드 라인을 종래의 기술로 달성하고자 하면, 외과적으로 환자의 종양 조직으로부터 생검 (Biopsy) 을 실시하여 유전자 검사를 실시할 필요가 발생하여, 환자에게 매우 강한 부담을 강요하게 된다. 이것을 해결하기 위해서, 혈액 중에서 채취한 CTC 에 대하여 유전자 검사를 실시하는 것이 검토되어 있으며, 종래의 「Biopsy」 에 대하여 「Liquid Biopsy」 라고 불리고 있다. 이것이 달성되면, 혈액을 채취하는 것만으로 종양 조직의 유전자 검사를 실시할 수 있어, 환자에 대한 부담이 대폭 경감되기 때문에, CTC 검사는 매우 유용성이 높은 검사 기술로서 임상 현장에 있어서 크게 주목받고 있다.
현재, CTC 검출 기기로 FDA 의 승인을 받고 있는 것은 Veridex 사의 CellSearch System 뿐으로, 임상 시험에서 이용되고 있는 CTC 검출 방법의 대부분은 CellSearch System 에 의한 것이다. CellSearch System 은 암 세포를 EpCAM 항체 및 Cytokeratin 항체로 검출하는 것을 기본 기술로 한다.
그러나, CTC 검출 기술은 혈액 세포 10 억 개 중에서 수 개 ∼ 수십 개의 세포를 검출하는 방법이기 때문에, 감도 및 정밀도를 향상시키는 것이 매우 곤란하여, CellSearch System 을 이용한 CTC 검출 방법에도 몇 가지의 과제가 지적되고 있다. 예를 들어, CellSearch System 에 의한 CTC 검사에서 음성인 암 세포가 다른 검사에서 양성으로서 검출되거나, 암종에 따라 감도나 정밀도에 큰 차가 있는 것 등이 지적되고 있다 (Allard W. J. et al., Clinical Cancer Research, 2004, 6897-6904). 또한, CellSearch System 은 임상 현장에 있어서 폐암의 CTC 검출률이 낮은 것도 과제로서 거론되어 있다 (동일).
또한, CellSearch System 은 상피 간엽 이행 (EMT : Epithelial-Mesenchymal Transition) 을 일으킨 암 세포에서 EpCAM 을 포함하는 세포 표면 항원의 발현이 저하하기 때문에, CTC 검출률이 저하되는 것도 과제로서 거론되어 있다 (Anieta M. et. al., J Natl Cancer Inst, 101, 2009, 61-66, Janice Lu et. al., Int J Cancer, 126(3), 2010, 669-683).
또한, 상기 「Liquid Biopsy」 를 실시하는 데에는, CTC 를 농축하여 Phenotyping 이나 Genotyping 을 실시하는 공정이 필요하기 때문에, 간단히 CTC 의 수를 계수하는 것 보다 더욱 높은 감도 및 높은 정밀도의 CTC 검출 기술이 요구된다.
이에 반하여, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 상기 (i) ∼ (iii) 의 특징을 갖기 때문에, 혈액 중의 CTC 를, 백혈구 등의 정상 혈액 세포를 검출하지 않고, 간편, 고감도 그리고 고정밀도로 검출하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 시약은, CTC 를 살아있는 채로 검출할 수 있는 점에서, CTC 의 세포 표면 상에 존재하는 표면 항원 등을 해석함으로써, 검출된 CTC 가 어느 장기 유래의 것인가 등을 분명히 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 CTC 의 검출 및 암의 진단에 유용하다.
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 또는 암 세포의 검출용 시약을 사용함으로써, EMT 또는 간엽 상피 이행 (MET : Mesenchymal-Epithelial Transition) 을 일으킨 암 세포를 검출할 수 있다. EMT 는 암 세포가 상피로서의 특성을 잃고, 주변 조직으로 이동하기 쉬운 간엽계 세포로서의 특징을 획득하는 현상으로, 암 세포의 침윤이나 전이에도 관여하고 있다. 다른 한편, 간엽 상피 이행 (MET) 은 간엽화한 세포가 상피로서의 특징을 획득하는 현상을 말한다. 상기와 같이, CellSerch System 등의 공지된 수법에서는, EMT 를 일으킨 암 세포를 검출하는 것이 곤란한 데에 반하여, 본 발명에서는 EMT 또는 MET 를 일으킨 암 세포를 검출할 수 있기 때문에, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 암 세포의 검출 및 암의 진단에 유용하다.
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 사용함으로써, 약물 내성 암 세포를 검출할 수 있다. 본 발명에 있어서 약물이란, 암의 화학 요법에 사용되는 약물을 의미한다. 그러한 약물로는, 예를 들어, 아드리아마이신, 카르보플라틴, 시스플라틴, 5－플루오로우라실, 마이토마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 도세탁셀 및 악티노마이신 D 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 재조합 바이러스를 사용함으로써, 암 줄기 세포 (cancer stem cells) 를 검출할 수 있다. 본 발명에 있어서, 암 줄기 세포는 암 세포의 기원이 되는 세포 (간세포) 를 말한다. 암 줄기 세포에는 약물 내성을 갖는 것도 포함된다.
본 발명에 있어서 검출 또는 진단의 대상이 되는 암 또는 종양의 종류는 한정되는 것은 아니며, 모든 종류의 암 세포를 사용할 수 있다. 예를 들어, 고형암 또는 혈액 종양을 들 수 있고, 구체적으로는, 뇌종양, 경부암, 식도암, 설암, 폐암, 유방암, 췌장암, 위암, 소장암, 십이지장암, 대장암, 방광암, 신장암, 간암, 전립선암, 자궁암, 자궁 경부암, 난소암, 갑상선암, 담낭암, 인두암, 육종, 멜라노머, 백혈병, 임파종 및 다발성 골수종 (MM) 을 들 수 있다. 인간의 조직 유래의 암 세포의 대부분 (85 ％ 이상) 은 텔로메라아제 활성의 상승을 나타내고 있으며, 본 발명은 그러한 텔로메라아제를 발현하는 암 세포를 전반적으로 검출하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에 있어서, CTC 는 혈액 중에 존재하는 암 세포이면 한정되지 않고, 고형암으로부터 유리된 암 세포뿐만 아니라, 상기 백혈병 세포나 임파종 세포 등의 혈액 종양 세포도 포함된다. 단, CTC 가 혈액 종양 세포인 경우, 본 발명의 아데노바이러스에 포함되는 miRNA 표적 배열로는, 정상 혈액 세포 특이적으로 발현하는 miRNA 의 표적 배열인 것이 바람직하다.
본 발명의 시약은, 재조합 아데노바이러스를, 예를 들어 동결 등의 방법에 의해 취급하기 쉽게 한 후, 그대로 혹은 부형제, 증량제, 결합제, 활택제 등 공지된 약학적으로 허용되는 담체, 공지된 첨가제 (완충제, 등장화제, 킬레이트제, 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제 등이 포함된다) 등과 혼합함으로써 제조할 수 있다.
4. 암 세포의 검출 방법 또는 암의 진단 방법
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 암 세포에 접촉시켜, 당해 암 세포가 발하는 형광 또는 색을 검출함으로써, 암 세포의 검출 또는 암의 진단을 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「접촉」 이란, 암 세포와 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 동일한 반응계에 존재시키는 것을 의미하며, 예를 들어, 암 세포를 포함하는 시료 중에 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 첨가하는 것, 암 세포와 당해 재조합 아데노바이러스를 혼합하는 것, 재조합 아데노바이러스의 존재하에서 암 세포를 배양하는 것 등을 들 수 있고, 당해 재조합 아데노바이러스를 암 세포에 감염시키는 것이 포함된다. 또한, 본 발명에 있어서, 「형광 또는 색」 은, 리포터 유전자로부터 발현한 단백질에 의해 발생한 광 또는 색이면, 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, GFP 등의 표지 단백질이 발하는 형광, 루시페라아제에 의한 효소 반응에 의해 생성된 발광 물질이 발하는 광, β-갈락토시다아제와 X-gal 의 효소 반응에 의해 생성된 발색 물질이 발하는 청색 등을 들 수 있다.
암 세포의 검출 방법 또는 암의 진단 방법에 사용하는 암 세포는 피험자로부터 채취된 생체 시료 유래의 것이어도 된다. 피험자로부터 채취된 생체 시료는 암 세포를 포함할 가능성이 있는 조직이면 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, 혈액, 종양 조직, 림프 조직 등을 들 수 있다. 또한, 암 세포는 혈액 중의 순환 종양 세포 (CTC) 이어도 되며, CTC 에 대한 설명은 상기와 동일하다.
본 발명의 시약을 사용한 암 세포의 검출 및 암의 진단은 예를 들어 이하와 같이 실시할 수 있다.
피험자로부터 채취된 생체 시료가 혈액인 경우, 그 혈액 시료로부터 적혈구 용혈 시약을 첨가하여 적혈구를 제거하고, 그 밖의 세포 부유액에 일정한 비율 (0.01 ∼ 1000 MOI (multiplicity of infection), 바람직하게는 0.1 ∼ 100 MOI, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 MOI) 의 본 발명의 시약을 시험관 내에서 혼합한다. 실온 또는 37 ℃ 에서 일정한 시간 (예를 들어 4 ∼ 96 시간, 바람직하게는 12 ∼ 72 시간, 보다 바람직하게는 18 ∼ 36 시간) 방치 또는 선회 배양하여, 암 세포에 대한 바이러스의 감염 및 증식을 촉진시킨다. 그 세포 분획에 있어서의 GFP 형광 발현을 플로우 사이토메트리로 정량적으로 해석한다. 또는, 형광 현미경으로 GFP 발현 세포를 관찰하여 형태적으로 해석한다. 이 시스템을 이용하여, 말초혈 중에 존재하는 CTC 를 고감도로 검출하는 것이 가능해진다. 이 방법은 말초혈 중에 아주 미량만이 존재하는 CTC 를 검출하기 위하여 사용할 수 있다.
CTC 의 검출에 플로우 사이토메트리를 사용하는 경우, 예를 들어 이하의 기준에 의해 GFP 의 양성 또는 음성을 판정하여, CTC 를 검출할 수 있다.
먼저, 바이러스를 감염시키지 않은 샘플 중의 세포군을 해석하고, 백그라운드의 형광값을 얻는다. 그 형광 최대값에 대하여 임계값을 설정하고, 다음으로 본 발명의 바이러스를 감염시킨 샘플 중의 세포군을 해석하고, 임계값 이상의 형광값을 나타내는 샘플 중의 세포군을 GFP 양성이라고 판정한다. 피험자로부터 채취한 혈액 시료를 사용하는 경우, GFP 양성 세포는 CTC 로서 검출할 수 있다. 또한, GFP 양성 세포 (CTC) 를 농축하여, Phenotyping 이나 Genotyping 을 실시할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 피험자로는, 예를 들어, 인간, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 햄스터, 고양이, 개, 염소, 돼지, 양, 소, 말, 원숭이 등의 포유 동물을 들 수 있다.
본 발명의 시약의 사용량은 검출에 사용하는 생체 시료의 상태 및 양, 그리고 사용하는 검출 방법 등에 따라 적절히 선택된다. 예를 들어, 혈액 시료의 경우, 혈액 시료 1 ∼ 50 ㎖, 바람직하게는 3 ∼ 25 ㎖, 보다 바람직하게는 5 ∼ 15 ㎖ 당, 약 0.01 ∼ 1000 MOI, 바람직하게는 0.1 ∼ 100 MOI, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 MOI 의 범위로 사용할 수 있다. MOI 란, 일정량의 배양 세포에 일정량의 바이러스 입자를 감염시키는 경우의 바이러스량 (감염 단위) 과 세포수의 비를 말하며, 바이러스를 세포에 감염시킬 때의 지표로서 사용된다.
재조합 바이러스를 세포에 감염시키는 데에는, 예를 들어, 이하의 방법이 있다. 먼저, 세포를 적당한 배양액이 들어간 배양 플레이트에 뿌리고, 탄산 가스 존재하에서, 37 ℃ 에서 배양한다. 배양액은 동물 세포 배양에 일반적으로 사용되는 DMEM, MEM, RPMI-1640 등이 채용되고, 필요에 따라 혈청, 항생 물질, 비타민 등을 첨가할 수 있다. 배양한 세포에 일정량의 바이러스, 예를 들어, 0.1 ∼ 10 MOI 를 접종함으로써 감염시킨다.
바이러스 증식을 확인하는 데에는, 바이러스 감염 세포를 회수하고, DNA 를 추출하여, 본 발명의 바이러스가 갖는 적당한 유전자를 표적으로 하는 프라이머를 이용하여 리얼타임 PCR 을 실시함으로써 정량적으로 해석할 수 있다.
리포터 유전자로서 GFP 유전자를 사용하는 경우, 표지된 세포의 검출에 대해서는, 바이러스 증식이 보이는 세포는 여기 광을 비춤으로써 소정의 형광 (예를 들어 GFP 의 경우에는 녹색 형광) 을 발하기 때문에, 그것에 의해 암 세포를 가시화할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 감염 세포를 형광 현미경하에 관찰하면, 세포에서 GFP 형광 발현을 볼 수 있다. 또한 바이러스 감염 세포를 시간경과적으로 관찰하는 데에는, CCD 카메라를 이용하여, 시간경과적으로 GFP 형광 발현을 관찰할 수 있다.
또한, 본 발명의 시약은 생체 내에 존재하는 암 세포를 리얼타임으로 검출하는 것도 가능하다. 생체 내에 있어서 세포를 리얼타임으로 표지 및 검출하는 데에는, 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 생체 내에 투여하면 된다.
본 발명의 시약은 그대로 환부에 적용할 수도 있고, 모든 공지된 방법, 예를 들어, 정맥, 근육, 복강 내 또는 피하 등에의 주사, 비강, 구강 또는 폐로부터의 흡입, 경구 투여, 카테터 등을 사용한 혈관 내 투여 등에 의해 생체 (대상이 되는 세포나 장기) 에 도입할 수도 있다. 바람직하게는, 근육, 복강 등으로의 국부 주사, 정맥으로의 주사 등이 예시된다.
본 발명의 시약을 피험자에게 투여하는 경우, 그 투여량은 유효 성분의 종류, 투여 경로, 투여 대상, 환자의 연령, 체중, 성별, 증상 그 밖의 조건에 따라 적절히 선택되지만, 1 일 투여량으로서, 통상 유효 성분인 본 발명 바이러스의 양을 106 ∼ 1011 PFU (plaque forming units) 정도, 바람직하게는 109 ∼ 1011 PFU 정도로 하는 것이 바람직하고, 1 일 1 회 투여할 수도 있고, 수 회로 나누어 투여할 수도 있다.
생체 내에 있어서 리얼타임으로 암 세포의 형광을 관찰하는 것은 체내 진단약에 사용하는 장점이 있다. 이것은 이른바 네비게이션 수술 등에 유용하다. 네비게이션 수술의 상세한 것에 대해서는, 국제 공개 공보 WO 2006/036004 에 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 시약은 바이오 마커로서의 CTC 의 검출에 유용한 점에서, 본 발명의 시약을 사용함으로써 예후의 판정을 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 바이러스에 있어서 표지 단백질로서 GFP 를 사용하는 경우, 먼저, 임의의 암 치료 방법 (예를 들어, 화학 요법, 방사선 요법, 외과 수술 등) 으로 암 환자를 처치하기 전의 환자로부터 채취한 생체 시료와, 처치로부터 일정 기간 (예를 들어 1 ∼ 90 일) 경과 후의 시점에서 채취한 생체 시료에 각각 본 발명의 바이러스를 감염시킨다. 다음으로, 처치 전에 채취한 시료에 포함되는 GFP 양성 세포와 처치 후의 어느 시점에서 채취한 시료에 포함되는 GFP 양성 세포의 수를 동일 조건에서 비교한다. 그 결과, 처치 후의 GFP 양성 세포의 수가 처치 전 보다 감소되어 있으면 예후가 향상된 것으로 판정할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
Ad34 fiber 142-3 pT 의 제작
(1) pHMCMV5-miR-142-3pT 의 제작
pHMCMV5 (Mizuguchi H. et al., Human Gene Therapy, 10 ; 2013-2017, 1999) 를 NotI/KPnI 처리한 프래그먼트를, 하기의 합성 올리고 DNA 를 어닐링함으로써 제작한 더블 스트랜드 올리고와 라이게이션함으로써 pHMCMV5-miR-142-3pT (pre) 를 제작하였다.
miR-142-3pT-S1 :
5'-GGCCTCCATAAAGTAGGAAACACTACACAGCTCCATAAAGTAGGAAACACTACATTAATTAAG CGGTAC-3' (배열 번호 43, 밑줄은 miR-142-3p 표적 배열)
miR-142-3pT-AS1 :
5'-CGCTTAATTAATGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAGCTGTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGA-3' (배열 번호 44, 밑줄은 miR-142-3p 표적 배열)
다음으로, pHMCMV5-miR-142-3pT (pre) 를 PacI/KpnI 처리한 프래그먼트를, 이하의 합성 올리고 DNA 를 어닐링함으로써 제작한 더블 스트랜드 올리고와 라이게이션함으로써, miR-142-3p 표적 배열의 4 회 반복 배열을 갖는 pHMCMV5-miR-142-3pT 를 얻었다.
miR-142-3pT-S2 :
5'-TCCATAAAGTAGGAAACACTACAGGACTCCATAAAGTAGGAAACACTACAGTAC-3' (배열 번호 45, 밑줄은 miR-142-3p 표적 배열)
miR-142-3pT-AS2 :
5'-TGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAGTCCTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAAT-3' (배열 번호 46, 밑줄은 miR-142-3p 표적 배열)
(2) E1 shuttle plasmid 인 pHM5-hAIB-miR-142-3pT 의 제작
pSh-hAIB (WO 2006/036004) 를 I-CeuI/PmeI 로 소화하고, 소화 산물을 아가로오스 겔을 이용하여 전기 영동하였다. 약 4.5 kbp (hAIB cassette) 의 밴드를 겔로부터 잘라내고, GENECLEANII (Q-Biogene 사) 를 이용하여 DNA 단편을 정제 회수하였다. 정제한 DNA 단편 (hAIB cassette) 과 pHMCMV5-miR-142-3pT 를 NheI 로 소화시킨 후, Klenow Fragment 로 처리하고, 추가로 I-CeuI 로 소화시킨 프래그먼트를 라이게이션함으로써 hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES (internal ribosomal entry site) 배열, E1B 유전자 및 miR-142-3pT 표적 배열을 갖는 pHM5-hAIB-miR-142-3pT 를 얻었다.
(3) E3 shuttle plasmid 인 pHM13CMV-EGFP-miR-142-3pT 의 제작
pEGFP-N1 (Clontech 사) 을 ApaI 및 NotI 로 소화시키고, 얻어진 소화 산물을 pHMCMV5 의 ApaI/NotI 사이트에 삽입하여, pHMCMVGFP-1 을 얻었다. pHMCMVGFP-1 을 PmeI/HindIII 으로 소화시키고, 소화 산물을 아가로오스 겔을 이용하여 전기 영동하였다. 약 750 bp (EGFP) 의 밴드를 겔로부터 잘라내고, GENECLEANII 를 이용하여 DNA 단편을 정제 회수하였다. 정제한 DNA 단편 (EGFP) 과 pBluescriptII KS+ 를 HincII/HindIII 으로 소화시킨 프래그먼트를 라이게이션함으로써 pBSKS-EGFP 를 제작하였다. pBSKS-EGFP 를 ApaI/XbaI 로 소화시키고, 소화 산물을 아가로오스 겔을 이용하여 전기 영동하였다. 약 750 bp (EGFP) 의 밴드를 겔로부터 잘라내고, GENECLEANII 를 이용하여 DNA 단편을 정제 회수하였다. 정제한 DNA 단편 (EGFP) 과 pHMCMV5-miR-142-3pT 를 ApaI/XbaI 로 소화시킨 프래그먼트를 라이게이션함으로써 pHMCMV5-EGFP-miR-142-3pT 를 취득하였다. pHMCMV5-EGFP-miR-142-3pT 를 BglII 로 소화시키고, 소화 산물을 아가로오스 겔을 이용하여 전기 영동하였다. 약 2 kbp (CMV-EGFP-miR-142-3pT) 의 밴드를 겔로부터 잘라내고, GENECLEANII 를 이용하여 DNA 단편을 정제 회수하였다. 정제한 DNA 단편 (CMV-EGFP-miR-142-3pT) 과 pHM13 (Mizuguchi et al., Biotechniques, 30 ; 1112-1116, 2001) 을 BamHI 로 소화시킨 후, CIP (Alkaline Phosphatase, Calf Intest) 로 처리한 프래그먼트를 라이게이션함으로써 pHM13CMV-EGFP-miR-142-3pT 를 얻었다.
(4) pAdHM49-hAIB142-3pT-CG142-3pT 의 제작
pAdHM49 (Mizuguchi et al, J. Controlled Release 110 ; 202-211, 2005) 를 I-CeuI/PI-SceI 처리하여 얻어진 프래그먼트와, 동일하게 I-CeuI/PI-SceI 처리한 pHM5-hAIB-miR-142-3pT 를 라이게이션함으로써, Ad 벡터의 E1 결손 영역에 hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열, E1B 유전자 및 miR-142-3pT 표적 배열이 삽입된 pAdHM49-hAIB142-3pT 를 제작하였다. pAdHM49 는, 5 형 아데노바이러스 파이버의 파이버 노브 및 파이버 샤프트를 코드하는 유전자를 포함하는 영역이, 34 형 아데노바이러스 파이버의 파이버 노브 및 파이버 샤프트를 코드하는 유전자를 포함하는 영역으로 치환된 재조합 아데노바이러스로, 34 형 아데노바이러스의 파이버 단백질의 파이버 노브 영역 및 파이버 샤프트 영역으로 이루어지는 영역을 코드하는 유전자의 염기 배열 (배열 번호 49) 을 포함하는 것이다. pAdHM49 의 파이버 단백질 (34 형 아데노바이러스 파이버의 파이버 노브 영역 및 파이버 샤프트 영역 그리고 5 형 아데노바이러스 파이버의 파이버 테일 영역) 을 코드하는 유전자의 염기 배열을 배열 번호 50 으로 나타낸다. 배열 번호 50 으로 나타내는 염기 배열에 있어서, 5 형 아데노바이러스 파이버의 파이버 테일 영역을 코드하는 유전자의 염기 배열은 1 ∼ 132 번째의 염기 배열이고, 34 형 아데노바이러스 파이버의 파이버 샤프트 영역을 코드하는 유전자의 염기 배열은 133 ∼ 402 번째의 염기 배열이고, 34 형 아데노바이러스 파이버의 파이버 노브 영역을 코드하는 유전자의 염기 배열은 403 ∼ 975 번째의 염기 배열이다. 즉, 배열 번호 50 으로 나타내는 염기 배열에 있어서, 5 형 아데노바이러스 파이버 유래의 영역의 염기 배열은 1 ∼ 132 번째의 염기 배열이고, 34 형 아데노바이러스 파이버 유래의 영역의 염기 배열은 133 ∼ 975 번째의 염기 배열이다.
다음으로, pAdHM49-hAIB142-3pT 를 Csp45I 로 소화시킨 프래그먼트와 pHM13CMV-EGFP-miR-142-3pT 를 ClaI 로 소화시킨 프래그먼트를 라이게이션하였다. 이로써, 아데노바이러스 벡터의 E1 결손 영역에 hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열, E1B 유전자 및 miR-142-3pT 표적 배열이 삽입되고, E3 결손 영역에 CMV 프로모터, EGFP 및 miR-142-3pT 표적 배열이 삽입되고, 또한 34 형 아데노바이러스의 파이버 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는, pAdHM49-hAIB142-3pT-CG142-3pT 를 얻었다.
(5) Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 의 제작
pAdHM49-hAIB142-3pT-CG142-3pT 중의 아데노바이러스 게놈 양 말단에 인식 부위가 존재하는 제한 효소 PacI 로 절단함으로써 선상으로 하고, Lipofectamine 2000 (Invitrogen 사) 을 이용하여 60 ㎜ 배양 티슈에 파종한 293 세포로 트랜스펙션하였다. 약 2 주일 후에, 재조합 아데노바이러스 Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 를 취득하였다 (도 1).
실시예 2
Ad34 fiber 142-3 pT ( E1 , E3 ) 의 활성 측정
(1) 세포
CAR 양성 세포로서, HeLa (인간 자궁암 세포 유래), LN319 (인간 신경 교종 세포 유래) 를 사용하고, CAR 음성 세포로서 LNZ308 (인간 신경 교종 세포 유래), LN444 (인간 신경 교종 세포 유래), K562 (인간 골수성 백혈병 세포 유래) 를 사용하였다. K562 는 miR-142-3p 를 발현하고 있다. HeLa, LN319, LNZ308, LN444 에는 DMEM (10 ％ FCS, 항생 물질 함유) 을 이용하고, K562 에는 RPMI-1640 Medium (10 ％ FCS, 항생 물질 함유) 을 이용하여, 37 ℃, 포화 증기압, 5 ％ CO2 존재하에서 배양하였다.
(2) 플로우 사이토메트리를 사용한 Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 의 활성 측정
각 세포를 24 웰 플레이트에 5x104 cells/500 ul/well 로 파종하고, Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 를 10 MOI 로 작용시켰다. 대조로서, 텔로메스캔 (5 형 아데노바이러스의 E1 결손 부위에 hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열, E1B 유전자가 이 순서로 삽입되고, 또한, E3 결손 부위에 CMV 프로모터, GFP 가 이 순서로 삽입된 제한 증식형 아데노바이러스) 을 사용하였다. 24 시간 배양 후, 세포를 회수하고, 플로우 사이토미터 MACSQuant (Miltenyi Biotec) 를 이용하여 GFP 양성 세포 수를 측정하였다.
그 결과를 도 2 에 나타낸다. 본 명세서 및 도 2 에 있어서, 「TelomeScan (Ad5 fiber)」 는 텔로메스캔을 나타내고, 「Ad34 fiber」 는, 아데노바이러스 게놈의 E1 결손 부위에 hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자가 이 순서로 삽입됨과 함께, E3 결손 부위에 CMV 프로모터, GFP 가 이 순서로 삽입되고, 또한 34 형 아데노바이러스 유래의 파이버 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 나타낸다. 또한, 「Ad34 fiber 142-3pT (E1)」 는 상기 Ad34 fiber 의 E1 결손 영역 (E1B 유전자의 하류) 에 추가로 miR-142-3p 의 표적 배열이 삽입된 재조합 아데노바이러스를 나타내고, 「Ad34 fiber 142-3pT (E3)」는 상기 Ad34 fiber 의 E3 결손 영역 (GFP 유전자의 하류) 에 추가로 miR-142-3p 의 표적 배열이 삽입된 재조합 아데노바이러스를 나타낸다. 또한, 「Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3)」 는 상기 Ad34 fiber 의 E1 및 E3 결손 영역 (각각 E1B 유전자의 하류 및 GFP 유전자의 하류) 에 추가로 miR-142-3p 의 표적 배열이 삽입된 재조합 아데노바이러스를 나타낸다. 또한, 도 2 이후의 도면에 있어서, (GFP 를 포함한다) 란, 각 바이러스 게놈에 GFP 유전자가 삽입되어 있는 것을 나타낸다.
활성 측정의 결과, CAR 음성 세포인 LNZ308, LN444, K562 에 TelomeScan (Ad5 fiber) 를 감염시킨 경우, GFP 양성 세포는 검출되지 않은 것에 반하여 (도 2, 패널 k, p 및 u), Ad34 fiber 를 감염시킨 경우에는, GFP 양성 세포가 검출되었다 (LNZ308 에서 85.5 ％ 양성, LN444 에서 58.4 ％ 양성, K562 에서 63.7 ％ 양성) (패널 l, q, v).
이 결과로부터, 34 형 아데노바이러스의 파이버 단백질을 코드하는 유전자를 갖는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 CAR 음성 세포를 유의하게 검출할 수 있는 것이 나타났다.
또한, CAR 음성에서 miR-142-3p 를 발현하고 있는 K562 세포에 있어서, Ad34 fiber 를 감염시킨 경우, GFP 양성 세포는 63.7 ％ 였던 것에 반하여 (패널 v), Ad34 fiber 142-3pT (E1) 를 감염시킨 경우에는 12.2 ％, Ad34 fiber 142-3pT (E3) 를 감염시킨 경우에는 34.8 ％ 이고, Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 를 감염시킨 경우에는 검출되지 않았다 (패널 w, x, y). 즉, 아데노바이러스 게놈의 E1 또는 E3 결손 영역의 어느 것에 miR-142-3p 의 표적 배열이 삽입된 아데노바이러스를 사용한 경우, K562 세포의 검출률은 유의하게 저하되고, 또한 E1 및 E3 결손 영역의 쌍방에 miR-142-3p 의 표적 배열이 삽입된 아데노바이러스를 사용한 경우, K562 세포는 검출되지 않았다.
이 결과로부터, miR-142-3p 의 표적 배열을 포함하는 본 발명의 재조합 바이러스는 miR-142-3p 를 고발현하고 있는 세포, 예를 들어 정상적인 혈액 세포를 검출하지 않는 것이 나타났다.
실시예 3
Ad34 fiber 142-3 pT ( E1 , E3 ) 를 사용한 혈액 시료 중의 암 세포의 검출
5x104 개의 H1299 세포 (CAR 양성) 를 5 ㎖ 중의 혈액에 현탁하고, 적혈구를 용혈시켜 PBMC 를 회수하였다. 거기에 1x109, 1x1010 또는 1x1011 VP (virus particle) 량의 바이러스를 첨가하여 로테이터로 회전시키면서 37 ℃ 에서 24 시간 감염시켰다. 세포를 회수하여 항 CD45 항체로 면역 염색을 실시하고, 형광 현미경하에서 GFP 양성 세포를 관찰하였다. CD45 는 적혈구 및 혈소판을 제외한 혈구계 유래 세포의 표면 항원인 것이 알려져 있다. 도 3 및 도 4 의 세로축에 기재된 「GFP Positive Cancer cells (％)」 란, 「GFP 양성 세포 중에 포함되는 GFP 양성 그리고 CD45 음성의 세포 수 (％)」 를 나타낸다.
그 결과, TelomeScan (Ad5 fiber) 의 감염에서는 많은 위양성 세포 (GFP 양성 그리고 CD45 양성) 가 관찰되었지만, Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 의 감염에서는 위양성이 매우 적어, 암 세포를 특이적으로 검출할 수 있었다.
또한, H1299 세포의 검출 특이도의 정량적 해석을 실시한 결과, TelomeScan (Ad5 fiber) 에서는 1x109 VP 량의 바이러스 감염에서 다수의 위양성 세포를 검출하였지만, Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 에서는 바이러스 감염량을 증가시켜도, 검출 특이도는 90 ％ 이상을 나타내고, 샘플에 따라서는 100 ％ 를 나타냈다 (도 3). 또한, A549 세포 (CAR 양성) 에 대해서도 동일한 수법에 의해 정량적 해석을 실시한 결과, 1x109 VP 량의 바이러스 감염에서 검출 특이도는 100 ％ 를 나타냈다 (도 4). 이들 결과로부터, 본 발명의 재조합 바이러스를 사용함으로써, PBMC 획분에 포함되는 암 세포를 특이적으로 검출할 수 있는 것이 나타났다.
이상으로부터, 본 발명의 검출용 시약 및 진단용 시약은 악성도가 높은 CAR 음성의 암 세포를 검출할 수 있고, 다른 한편, miR-142-3p 를 고발현하고 있는 정상적인 혈액 세포 (백혈구 등) 등을 위양성으로서 검출하지 않는 것이 나타나, 혈중의 순환 종양 세포 (Circulating Tumor Cells : CTC) 의 검출에 매우 유효한 것이 나타났다.
실시예 4
각종 인간 암 세포주에 있어서의 Ad34 fiber 142-3 pT ( E1 , E3 ) 의 활성 측정
(1) 세포
본 실시예에서는, 암 세포로서, 인간 폐 비소세포암 유래 H1299 세포, 인간 폐암 유래 A549 세포, 인간 유방암 유래 MCF7 세포, 인간 유방암 유래 MDA-MB-231 세포, 인간 방광암 유래 KK47 세포, 인간 위암 유래 MKN45 세포, 인간 대장암 유래 SW620, 인간 간암 유래 Huh7 세포, 인간 췌장암 유래 PancI 세포, 인간 신경 교종 유래 LN319 세포, 인간 방광암 유래 T24 세포, 인간 신경 교종 유래 LNZ308 세포, 및 인간 신경 교종 유래 LN444 세포를 사용하였다.
(2) 플로우 사이토메트리를 사용한 Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 의 활성 측정
5x104 개의 각종 암 세포를 500 ㎕ 의 배지에 현탁하고, 거기에 5x105 혹은 5x106 pfu/㎖ 로 조제한 제한 증식형 Ad 현탁액을 100 ㎕ 첨가하였다. 세포와 제한 증식형 Ad 의 혼합액을 24 웰 플레이트에 파종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 배양하였다. 세포를 회수하고, 1500 rpm 으로 5 분간 원심하고, 배지를 제거한 후, 2 ％ FCS 함유 PBS 300 ㎕ 에 현탁하고, 플로우 사이토미터 (MACS Quant Analyzer ; Miltenyi Biotec) 를 이용하여 GFP 양성률을 측정하였다. 데이터는 FCS 멀티 컬러 데이터 해석 소프트웨어 (Flowjo) 에 의해 해석하였다.
그 결과, Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 는 거의 모든 암 세포에 대하여 효율적으로 감염되어, 60 ％ 이상이 GFP 양성이 되었다. 특히 CAR 음성 세포 (T24, LNZ308, LN444) 에 대해서는, 종래의 텔로메스캔에 비하여 크게 GFP 양성률이 향상되었다 (도 5).
이 결과로부터, 본 발명의 재조합 바이러스를 사용함으로써, CAR 양성 세포뿐만 아니라 CAR 음성 세포를 효율적으로 검출 가능한 것이 나타났다.
실시예 5
상피 간엽 이행 ( EMT ) 을 일으킨 암 세포의 검출
인간 췌장암 PancI 세포를 10 ng/㎖ 의 재조합 TGF-β1 존재하에서 6 일간 배양함으로써, 상피 간엽 이행 (EMT) 을 유도하였다. EMT 를 유도한 후에, E-카드헤린, EpCAM, hTERT, N-카드헤린, Slug 및 Snail 을 코드하는 mRNA 의 상대적 발현을 리얼타임 RT-PCR 로 측정하였다. 또한, Panc I 세포에 있어서의 CAR 및 CD46 발현을 플로우 사이토메트리에 의해 해석하였다. 본 발명의 바이러스의 세포에 대한 감염은 실시예 4 와 동일한 방법에 의해 실시하였다.
그 결과, TGF-β 함유 배지에서 배양함으로써, EMT 의 마커 유전자인 Slug, Snail 및 N-카드헤린의 발현이 상승함과 함께, 상피계의 마커인 E-카드헤린, EpCAM 의 발현이 감소하고, EMT 가 유도되어 있는 것이 나타났다 (도 6A). 또한, EMT 의 유도에 수반하여 CAR 의 발현이 감소하였지만, CD46 의 발현은 전혀 감소하지 않았다 (도 6B). 또한, EMT 를 일으킨 PancI 세포에 대하여, 종래의 텔로메스캔을 사용한 경우에는 약 35 ％ 만이 GFP 양성이었던 데에 반하여, Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 에서는 대략 90 ％ 이상 GFP 양성이었다 (도 6C).
이들 결과로부터, 본 발명의 재조합 바이러스를 사용함으로써, 상피 간엽 이행 (EMT) 을 일으킨 암 세포를 고감도로 검출할 수 있는 것이 나타났다.
실시예 6
암 줄기 세포의 검출
MCF7 세포 및 MCF7-ADR (항암제인 아드리아마이신에 내성을 갖는 암 세포) 을, 각각 96 웰 플레이트에 1x103 개/웰로 파종하고, 다음날, 아드리아마이신을 0.2, 1, 5, 25, 125 ㎍/㎖ 로 첨가하였다. 아드리아마이신의 첨가로부터 24 시간 후에 alamarBlue (등록상표) cell viability reagent 를 이용하여 세포 생존률을 측정하였다 (값 : 평균±S.D. (n = 6)).
또한, 플로우 사이토메트리에 의해 MCF7 세포 및 MCF7-ADR 세포의 CAR, CD46, P-글리코 프로테인 (MDR), CD24 및 CD44 의 발현을 해석하였다. 5x105 개의 MCF7-ADR 세포를 2 ％ FCS 함유 PBS 100 ㎕ 에 현탁하고, FITC 표지 마우스 항인간 CD24 항체, PE 표지 마우스 항인간 CD44 항체를 1 ㎕ 첨가하고, 1 시간 빙상, 차광에서 반응시켰다. 2 ％ FCS 함유 PBS 를 4 ㎖ 로 세정 후, 1500 rpm, 5 분간 원심하고 상청을 흡인 제거하였다. 세포를 재차 2 ％ FCS 함유 PBS 100 ㎕ 에 현탁하고, 셀 소터 (FACS Aria II cell sorter ; BD Biosciences) 를 이용하여 CD24 음성 CD44 양성 세포 획분을 소트하였다. 데이터는 FCS 멀티 컬러 데이터 해석 소프트웨어 (Flowjo) 에 의해 해석하였다. 인간 유방암 세포에 있어서, CD24 음성 CD44 양성 세포의 특징을 갖는 획분은 암 줄기 세포인 것이 알려져 있다 (Al-Hajj M., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100 ; 3983-3988, (2003)). 또한, 본 발명의 바이러스의 세포에 대한 감염은 실시예 4 와 동일한 방법에 의해 실시하였다.
그 결과, MCF7-ADR 세포는 MCF7 세포와 비교하여 아드리아마이신 존재하에 있어서도 유의하게 높은 생존률을 나타내고, 약물 내성능을 갖는 것이 나타났다 (도 7A). 또한, MCF7-ADR 세포는 MCF7 세포와 마찬가지로 CAR 및 CD46 을 고발현하고 있었다. 또한 약물 배설능을 담당하는 막 단백질인 MDR 을 고발현하고 있었다 (도 7B). 또한, MCF-ADR 세포 중의 CD24 음성 CD44 양성 세포에, Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 를 작용시킨 결과 80 ％ 이상이 GFP 양성이었다. 한편으로, 종래의 텔로메스캔에서는, 약 70 ％ 가 GFP 양성이었다 (도 7C).
이들 결과로부터, 본 발명의 재조합 바이러스를 사용함으로써, 약물 내성의 암 세포를 검출할 수 있는 것이 나타났다. 또한, 본 발명의 재조합 바이러스를 사용함으로써, 암 줄기 세포를 검출할 수 있는 것이 나타났다.
실시예 7
Ad34 fiber 142-3 pT ( E1 , E3 ) 를 사용한 혈액 시료 중의 암 세포의 검출
H1299 세포, T24 세포에 100 MOI 로 적색 형광 단백 (monomeric Red Fluorescent Protein ; RFP) 발현 렌티바이러스 벡터를 작용시켜 배양하였다. 그 후, 클론 세포를 취득하기 위해서, 96 웰 플레이트에 0.1 cells/well 이 되도록 세포를 파종하고, 콜로니를 형성할 때까지 배양하였다. 형광 현미경으로 RFP 를 발현하고 있는 세포를 선택하고, 확대 배양한 후, 플로우 사이토메트리를 이용하여 RFP 발현 강도를 측정하였다. 그리고 RFP 의 발현 강도가 강한 세포를 RFP 발현 세포로 하였다.
1.0 ㎖ 의 인간 말초혈로부터 얻어진 인간 말초혈 단핵구 (hPBMC) 를 800 ㎕ 의 RPMI-1640 배지 (10 ％ FCS, 항생 물질 함유) 에 현탁하였다. hPBMC 현탁액에 1.0x105 혹은 5.0x105 cells/㎖ 로 조제한 암 세포를 100 ㎕ 첨가하였다 (도 8 중, 「spiked cancer cells」 는 hPBMC 현탁액에 첨가한 암 세포의 개수를 나타낸다). 또한 2x108 pfu/㎖ 로 조제한 제한 증식형 Ad 현탁액을 100 ㎕ 첨가하여, 합계 1 ㎖ 의 현탁액으로 한 후, 로테이터로 천천히 회전시키면서, 37 ℃ 에서 24 시간 배양하였다.
바이러스 감염 후 24 시간 배양한 세포 현탁액을 300 x g 으로 5 분간 원심하고, 상청을 제거하였다. 세포 고정액을 200 ㎕ 첨가하고, 4 ℃, 차광 상태에서 15 분간 반응시켰다. 1 ㎖ 의 PBS 를 첨가하고, 300 x g 으로 5 분간 원심하여, 상청을 제거하였다. 2 ％ FCS 함유 PBS 에 현탁하고, 플로우 사이토미터 (MACS Quant Analyzer ; Miltenyi Biotec) 를 이용하여 GFP 양성률을 측정하였다. 데이터는 FCS 멀티 컬러 데이터 해석 소프트웨어 (Flowjo) 에 의해 해석하였다.
본 검토에서는, hPBMC 에 RFP (적색 형광 단백질) 로 표지한 암 세포를 혼입시키고, hPBMC 중의 암 세포를 검출 가능한지 검토하였다. 그 결과, CAR 양성 암 세포 (H1299) 의 경우, TelomeScan (Ad5 fiber), Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 모두 80 ％ 이상의 암 세포가 검출 가능하였다. 한편으로, CAR 음성 암 세포 (T24) 의 경우, TelomeScan (Ad5 fiber) 에서는 약 10 ％ 가 GFP 양성으로 매우 검출 효율이 낮은 것이었지만, Ad34 fiber 142-3pT (E1, E3) 에서는 80 ％ 이상의 암 세포가 검출 가능하였다 (도 8).
이 결과로부터, 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 사용함으로써 CAR 양성 암 세포뿐만 아니라, CAR 음성 암 세포도 효율적으로 검출 가능한 것이 나타났다.
산업상 이용가능성
본 발명의 재조합 아데노바이러스를 포함하는 시약은 정상적인 혈액 세포 (백혈구 등) 를 검출하지 않고, CAR 음성의 암 세포를 간편하고 또한 고감도로 검출할 수 있다.
[배열표 프리텍스트]
배열 번호 4 : 합성 DNA
배열 번호 5 ∼ 26 : 합성 RNA
배열 번호 27 ∼ 28 : 합성 DNA
배열 번호 43 ∼ 46 : 합성 DNA
배열 번호 50 : 합성 DNA
SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Biomedical Innovation <120> Conditionally replicating adenovirus <130> PCT12-0008 <150> JP2011-181414 <151> 2011-08-23 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 455 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tggcccctcc ctcgggttac cccacagcct aggccgattc gacctctctc cgctggggcc 60 ctcgctggcg tccctgcacc ctgggagcgc gagcggcgcg cgggcgggga agcgcggccc 120 agacccccgg gtccgcccgg agcagctgcg ctgtcggggc caggccgggc tcccagtgga 180 ttcgcgggca cagacgccca ggaccgcgct ccccacgtgg cggagggact ggggacccgg 240 gcacccgtcc tgccccttca ccttccagct ccgcctcctc cgcgcggacc ccgccccgtc 300 ccgacccctc ccgggtcccc ggcccagccc cctccgggcc ctcccagccc ctccccttcc 360 tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg cgagtttcag gcagcgctgc gtcctgctgc 420 gcacgtggga agccctggcc ccggccaccc ccgcg 455 <210> 2 <211> 899 <212> DNA <213> Adenovirus <400> 2 acaccgggac tgaaaatgag acatattatc tgccacggag gtgttattac cgaagaaatg 60 gccgccagtc ttttggacca gctgatcgaa gaggtactgg ctgataatct tccacctcct 120 agccattttg aaccacctac 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cgctgaccac atcccccttt 540 ttcttttctt acattacaga agacgacaac taa 573 <210> 48 <211> 270 <212> DNA <213> Adenovirus <400> 48 ggagttctta ctcttaagtg tttaacccca ctaacaacca caggcggatc tctacagcta 60 aaagtgggag ggggacttac agtggatgac actgatggta ccttacaaga aaacatacgt 120 gctacagcac ccattactaa aaataatcac tctgtagaac tatccattgg aaatggatta 180 gaaactcaaa acaataaact atgtgccaaa ttgggaaatg ggttaaaatt taacaacggt 240 gacatttgta taaaggatag tattaacacc 270 <210> 49 <211> 843 <212> DNA <213> Adenovirus <400> 49 ggagttctta ctcttaagtg tttaacccca ctaacaacca caggcggatc tctacagcta 60 aaagtgggag ggggacttac agtggatgac actgatggta ccttacaaga aaacatacgt 120 gctacagcac ccattactaa aaataatcac tctgtagaac tatccattgg aaatggatta 180 gaaactcaaa acaataaact atgtgccaaa ttgggaaatg ggttaaaatt taacaacggt 240 gacatttgta taaaggatag tattaacacc ttatggactg gaataaaccc tccacctaac 300 tgtcaaattg tggaaaacac taatacaaat gatggcaaac ttactttagt attagtaaaa 360 aacggagggc ttgttaatgg ctacgtgtct ctagttggtg tatcagacac tgtgaaccaa 420 atgttcacac 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gtgacatttg tataaaggat agtattaaca ccttatggac tggaataaac 420 cctccaccta actgtcaaat tgtggaaaac actaatacaa atgatggcaa acttacttta 480 gtattagtaa aaaacggagg gcttgttaat ggctacgtgt ctctagttgg tgtatcagac 540 actgtgaacc aaatgttcac acaaaagaca gcaaacatcc aattaagatt atattttgac 600 tcttctggaa atctattaac tgatgaatca gacttaaaaa ttccacttaa aaataaatct 660 tctacagcga ccagtgaaac tgtagccagc agcaaagcct ttatgccaag tactacagct 720 tatcccttca acaccactac tagggatagt gaaaactaca ttcatggaat atgttactac 780 atgactagtt atgatagaag tctatttccc ttgaacattt ctataatgct aaacagccgt 840 atgatttctt ccaatgttgc ctatgccata caatttgaat ggaatctaaa tgcaagtgaa 900 tctccagaaa gcaacatagc tacgctgacc acatccccct ttttcttttc ttacattaca 960 gaagacgaca actaa 975

Claims (26)

  1. 인간 텔로머라아제 역전사 효소 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자를 이 순서로 포함하고, 또한, miR-142 의 표적 배열을 포함하는 복제 카세트가, 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에 삽입되고,
    리포터 유전자, 그 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터 및 miR-142 의 표적 배열을 포함하는 표지 카세트가, 아데노바이러스 게놈의 E3 영역에 추가로 삽입되고, 또한,
    CD46 에 결합하는 파이버 단백질을 코드하는 유전자가 아데노바이러스 게놈에 삽입된, 재조합 아데노바이러스.
  2. 제 1 항에 있어서,
    리포터 유전자가 형광을 발하는 단백질을 코드하는 유전자 또는 효소 반응에 의해 발광 물질 혹은 발색 물질을 발생시키는 효소 단백질을 코드하는 유전자인 재조합 아데노바이러스.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 프로모터가 인간 텔로머라아제 역전사 효소 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스 프로모터인 재조합 아데노바이러스.
  4. 제 1 항에 있어서,
    CD46 에 결합하는 파이버 단백질이 34 형 또는 35 형 아데노바이러스의 파이버 단백질의 적어도 파이버 노브 영역을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  5. 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 아데노바이러스를 포함하는 암 세포의 검출용 시약.
  6. 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 아데노바이러스를 포함하는 암의 진단용 시약.
  7. 제 5 항에 있어서,
    암 세포가 피검자로부터 채취된 생체 시료 유래의 것인 시약.
  8. 제 7 항에 있어서,
    생체 시료가 혈액인 시약.
  9. 제 5 항에 있어서,
    암 세포가 순환 종양 세포인 시약.
  10. 제 5 항에 있어서,
    암 세포가 약물 내성 암 세포인 시약.
  11. 제 5 항에 있어서,
    암 세포가 암 줄기 세포인 시약.
  12. 제 5 항에 있어서,
    암 세포가 상피 간엽 이행 또는 간엽 상피 이행을 일으킨 암 세포인 시약.
  13. 제 2 항에 기재된 재조합 아데노바이러스를 암 세포에 접촉시켜, 당해 암 세포가 발하는 형광 또는 색을 검출하는 것을 특징으로 하는 암 세포의 검출 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    암 세포가 피검자로부터 채취된 생체 시료 유래의 것인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    생체 시료가 혈액인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    암 세포가 순환 종양 세포인 방법.
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