WO2005103077A1 - Rekombinante polypeptide der mitglieder der tnf ligandenfamilie und deren verwendung - Google Patents

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Klaus Pfizenmaier
Peter Scheurich
Ingo Grunwald
Anja Krippner-Heidenreich
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Definitions

  • the present invention relates to polypeptides comprising at least three monomers of a member of the TNF ligand family as component A and at least two peptide ligands as components B, wherein the peptide linker link together the monomers of the member of the TNF ligand family. Furthermore, the present invention relates to the use of these polypeptides for the treatment of diseases, for the production of a medicament or a vaccine. Moreover, the invention relates to processes for the preparation and isolation of these polypeptides as well as nucleic acids coding for the polypeptides, vectors containing them, with these transfected host cells and pharmaceutical compositions containing said subject matter. Finally, the invention relates to methods for extracorporeal manipulation, depletion and / or removal of constituents contained in body fluids, e.g. by apheresis.
  • the members of the TNF ligand family are proinflammatory cytokines.
  • Cytokines in general and in particular the members of the TNF-igandfa_nilie play an important role in the stimulation and coordination of the innate immune system and the humoral (antibody-mediated) immune response, the induction of apoptosis, the formation of bones, the formation of facilities for hair growth, Tooth growth and swelling gland development, attachment of lymph nodes and much more (Aggarwal, BB (2003) Nat Rev. Immunol., 3, 745-756).
  • incorrect regulation of members of the TNF ligand family can lead to numerous pathological conditions to lead. These include, for example, septic shock, autoimmune disorders, such as rheumatoid arthritis, or neurodegenerative diseases.
  • Tumor necrosis factor (TNF) is the eponymous and probably the most important member of this large Zyto___nfamilie.
  • CMP Cartilage Matrix Protein
  • proteins from the KoHagen family such as the Clq family, to the Clq, collagen ⁇ l (X ), ⁇ 2 (VII), the hibernation protein, ACRP30, the inner ear structure protein, cellebrin, and multimerin (Kishore and Reid, (1999), Immunopharmacol., 42, 15-21), and collectin family proteins such as the lung surfactant protein A (SP-A) and the Mannose Binding Protein (MBP) (Epstein et al., (1996), Current Opinion in Immunology, Vol. 8 No. 1, 29-35).
  • SP-A lung surfactant protein A
  • MBP Mannose Binding Protein
  • the assembly of proteins into a trimer occurs on the surfaces of these trimerizing proteins in solution due to interactions such as hydrophobic interactions, hydrogen bonds, covalent bonds (eg disulfide bridges), and / or Coulomb forces, but also due to structural motives, ie characteristic Amino acid sequences that cause a formation of intermolecular super secondary structures.
  • the three monomers are held together non-covalently via hydrophobic bonds in the hot-emergency structure.
  • they in turn activate opposing members of the TNF receptor family which as such have no enzymatic activity.
  • TNF binds as a member of the TNF ligand family to the two membrane receptors TNFR1 and TNFR2 and mediates trimerization or activation of already trimeric but signal-inactive receptors.
  • the complex formation of the receptors initiates a signal cascade, which is accompanied by an association of cytoplasmic adapter proteins (Wajant, H. et al (2003), Cell Death, Differ, 10, 45-65).
  • the trimeric structure of TNFR1 and TNFR2 is such that the receptors each bind in the space between two of the three TNF monomers of the TNF homotrimer (Banner et al. (1993) supr.). From this it is clear that both TNF and the other members of the TNF ligand family are / are biologically active only in its / their structure as a homotrimer.
  • the members of the TNF ligand family or their membrane receptors can be used in a variety of ways to treat numerous diseases such as infectious and inflammatory diseases, metabolic diseases, diseases that are due to defective regulation of apoptosis, neutodegenerative diseases, and many other diseases. be used.
  • a particularly important role is played by their use in the treatment of cecal diseases, since the members of the TNF ligand family are generally antitumoral substances.
  • TNF itself (Eggermont, AM and ten Hagen, TL (2003), Curr. Oncol. Rep.
  • TRAIL TNF releated apoptotic inducing ligand
  • Apo 2L also called Apo 2L
  • in vivo studies have shown strong systemic side effects in TNF and agonists of the Fas receptor and in vitro studies also indicate similar toxic effects in certain TRAIL preparations (Jo et al (2000) Nat Med 6: 564-567, Ichikawa et (2001) Nat Med 7: 954-960; Ogasawara et al. (1993) Nature 364: 806-809).
  • Fas activating ligands / agonists For example, agonistic antibodies against Fas, the receptor of FasL, displayed an extremely hepatotoxic effect (Ogasawara et al. (1993) supr ⁇ ). Therefore, in the case of Fas activating ligands / agonists, clinical application has been ruled out for safety reasons. However, due to the great importance of TNF, TRAIL, FasL and other TNF ligand family members in this field and the side effects associated with their application in the form of clinical systemic administration, several approaches have been taken to minimize these side effects. (Eggermont, A.M. and ten Hagen, TL (2003) Curr. Oncol Rep.5: 79-80).
  • WO 02/22680 describes fusion proteins which allow a directed and tissue-specific or cell-specific action of cytokines by the fusion of the cytokine with an antigen-binding antibody. In this way it is achieved that the cytokines on tissue or cells that do not come into contact with these fusion proteins, have no effect and that side effects are reduced to these tissues or cells.
  • an antibody-independent system is disclosed, which also allows a directed and tissue or cell-specific action of the cytokines.
  • These are fusion proteins in which the activation of a biological function protein portion contained therein via its binding to a ZeUobervidmolekül- binding domain, which is another protein portion of the fusion protein is carried out. In addition to reducing side effects on non-target tissue, this system can also be advantageously used for cell surface molecules on the target cells for which there are no antibodies or antibodies with too low specificity.
  • the present invention has for its object to provide a system by which the stability of the members of the TNF ligand family is increased.
  • the present invention is based on the finding that naturally occurring soluble cytotin members of the TNF ligand family display their full bioactivity only as homotrimers but, on the other hand, tend to denature via dissociation into their monomers.
  • a "soluble wild-type member of the TNF ligand family” is to be understood as meaning a soluble extracellular portion of a membrane-bound member of the TNF ligand family.
  • it may be soluble wild-type TNF (as a member of the TNF ligand family) for which the synonymous terms "wild-type TNF", "wtTNF” , soluble TNF and "sTNF” are used.
  • a component A in the context of the invention is a monomer of a member of the TNF ligand family or a functional fragment or a functional variant thereof.
  • a “monomer” is meant the smallest protein or polypeptide moiety that can be separated from an oligomeric protein without separation of covalent bonds.
  • a polypeptide or a component A or a fragment or variant thereof is functional in the sense of the invention, provided that it has its biological activity or function, in particular its binding property to an interaction partner, e.g. a membrane-bound receptor, and also its trimerization property.
  • an interaction partner e.g. a membrane-bound receptor
  • trimerization property e.g. trimerization property
  • these biological functions may indeed be altered, e.g. however, in terms of their specificity or selectivity, the fundamental biological function is retained.
  • a fragment according to the invention means both a fragment of a monomer of a member of the TNF ligand family and a fragment of a polypeptide or protein of the present invention. It may be N-terminal, C-terminal or intrasequentieU truncated amino acid sequences of the monomer, polypeptide or protein. Particularly in the case of intrasequency truncations of the polypeptide or protein, these may be truncations of the sequence of one or more of the three monomers, which in turn may occur N-terminally, C-terminally or intrasequately.
  • the fragment of a monomer is the extracellular domain corresponding to the entire extracellular domain of the soluble wild type member of the TNF ligand family or a portion thereof.
  • the fragment of a monomer represents its extracellular domain corresponding to either the wild type TNF (amino acids 77-233) or the entire extracellular domain (amino acids 53-233).
  • fragments of the invention are well known in the art and may be performed by one skilled in the art using standard techniques (see, e.g., Maniatis et al., (2001), Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the preparation of fragments of the monomers, polypeptides, or proteins may be accomplished by modifying the DNA sequence encoding the native monomer, polypeptide, or protein, followed by transformation of that DNA sequence into a suitable host and expression of these modified DNA fragments. Sequence, provided that the modification of the DNA does not destroy the functional activities of the monomer, polypeptide or protein.
  • the identification of a fragment according to the invention can be carried out either by checking its functionality by measuring its biological activity, as described above, or also by sequencing the fragment and a subsequent one Comparison of the sequence obtained with the native sequence.
  • the sequencing can be done by standard methods that are numerous and well known in the art.
  • Variants of biologically active monomers, polypeptides or proteins or fragments thereof or a component A in the context of the invention are in particular those monomers, polypeptides or proteins or fragments thereof, which have sequence differences from the corresponding native sequences. These sequence deviations may be one or more insertion (s), deletion (s) and / or substitutions) of amino acids, with a sequence homology of at least 60%, preferably 70%, more preferably 80%, even more preferably 85% , even more preferably 90%, and most preferably 97%.
  • the sequences can be matched to be compared below.
  • Gaps are introduced into the sequence of the first amino acid or nucleic acid sequence and the amino acids or nucleotides at the corresponding position of the second amino acid or nucleic acid sequence are compared. If a position in the first amino acid sequence is occupied by the same amino acid or nucleotide, as it is at a position in the second sequence of the FaU, then both sequences are identical at that position.
  • the percent identity between two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences.
  • the determination of the percentage identity of two sequences can be carried out using a mathematical algorithm.
  • a preferred, but not limiting, example of a mathematical algorithm that can be used to compare two sequences is the algorithm of Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90: 5873-5877. Such an algorithm is integrated into the NBLAST program which can identify sequences having a desired identity to the sequences of the present invention.
  • the gapped BLAST program can be used as described in Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.
  • Bioly active, ie functional, variants of monomers, polypeptides or proteins or fragments thereof within the meaning of the invention may preferably have selective receptor binding properties, wherein the variant may be optimized, for example, with regard to its specific bioactivity or other properties, in particular its stability.
  • variants are in particular those amino acid sequences which have conservative substitution with respect to the physiological sequences.
  • Conservative substitutions refer to those substitutions in which amino acids derived from the same class are interchanged.
  • amino acids with aliphatic side chains, positively or negatively charged side chains, aromatic groups in the side chains or amino acids whose side chains can form hydrogen bonds for example side chains which have a hydroxy function.
  • one amino acid with one polar side chain is replaced by another amino acid with a likewise polar side chain or, for example, an amino acid characterized by a hydrophobic side chain is substituted by another amino acid with the same hydrophobic side chain (eg serine (threonine) by threonine (Serine) or leucine (isoleucine) by isoleucine (leucine)).
  • an amino acid characterized by a hydrophobic side chain is substituted by another amino acid with the same hydrophobic side chain
  • eg serine (threonine) by threonine (Serine) or leucine (isoleucine) by isoleucine (leucine) Insertions and substitutions are possible in particular at those sequence positions which do not cause any change in the three-dimensional structure or affect the binding region.
  • variants for example of monomers, polypeptides or proteins or fragments thereof having amino acid sequences which have substitutions with respect to the native sequences are described, for example, in US Pat. Nos. 4,737,462, 4,588,585, 4,959,314 and 5,116,943. U.S. 4,879,111 and U.S. 5,017,691.
  • the preparation of variants in general is also described by Maniatis et al, (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). It codons can be omitted, supplemented or replaced.
  • variants may also be those proteins or polypeptides which are stabilized, To avoid the physiological degradation, for example by stabilizing the protein backbone by substitution of the amide-like bond, for example. By the use of ß-amino acids.
  • Variations within the meaning of the invention can likewise be produced by introducing changes into the nucleic acids which code for the variants, such as, for example, insertions, deletions and / or substitutions of one or more nucleotides.
  • Numerous methods for such alterations of nucleic acid sequences are known in the art.
  • One of the most commonly used technique is ougonucleotide-directed site-specific mutagenesis (see Comack B., Current Protocols in Molecular Biology, 8.01-8.5.9, Ausubel F. et al., Ed. 1991). In this technique, an oligonucleotide is synthesized whose sequence has a specific mutation.
  • This oligonucleotide is then hybridized to a template containing the type of nucleic acid sequence.
  • a template containing the type of nucleic acid sequence.
  • a single-stranded template is used in this technique.
  • a DNA-dependent DNA polymerase is used to synthesize the second strand of the oligonucleotide that is complementary to the template DNA strand.
  • a heteroduplex molecule containing a mismatch caused by the above-mentioned mutation in the oligonucleotide is obtained.
  • the oligonucleotide sequence is introduced into a suitable plasmid, this is inserted into a host and in this host the oligonucleotide DNA is replicated. With this technique one obtains nucleic acid sequences with targeted alterations (mutations), which can be used for the production of variants according to the invention.
  • components A encompassed by the polypeptide of the invention may be identical or different, ie components A may be monomers of the same member of the TNF-1 ligand family or different members of the TNF-1 ligands.
  • three different components A may be three monomers of three different members of the TNF ligand family, or two monomers of the same MitgHeds of the TNF ligand family and one monomer of another member of the TNF ligand family. This is good for more than three components A accordingly.
  • a polypeptide of the invention may contain 4, 5, 6 or more components A forming a tetramer, pentamer, hexamer, etc.
  • a polypeptide according to the invention preferably contains an integer multiple of a trimer of components A as described above, for example two, three, four or more trimers arranged one behind the other.
  • the components ⁇ contained in polypeptides according to the invention can be separated from each other by links (see below). If, as described above, two, three, four, or more trimers of the components A are arranged one behind the other, the linkers which connect the various trimers with one another may be longer than the linkers which contain the components A connect in a single trimer.
  • Components A of the invention may be from the same or different organisms. These can be vertebrates, in particular mammals, for example the mouse, the rat, the pig and, above all, the human.
  • components A of the polypeptide of the invention are each a monomer of one of the members of the TNF ligand family or a functional fragment or a functional variant thereof selected from the group consisting of FasL (GenBank Accession No. NM_000639 ), TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand, GenBank Accession No. NM_003810), also called Apo2L, TNF (Tumor Necrosis Factor, GenBank Accession No. NM_000594), LT alpha (GenBank Accession No. NM_000595), Lymphotoxin beta (GenBank Accession No. NMJ302341 ).
  • FasL GenBank Accession No. NM_000639
  • TRAIL TNF Related Apoptosis Inducing Ligand, GenBank Accession No. NM_003810
  • Apo2L also called Apo2L
  • TNF Tuor Necrosis Factor
  • LT alpha GenBank Accession No. NM_
  • NM_002506 CD30L (CD153, GenBank Accession No. NM_001244), CD40L (CD154, GenBank Accession No. NM_00074), OX40L (GenBank Accession No. NM_003326), RANKL (GenBank Accession No. NM_003701), TWEAKL (GenBank Accession No. NM_003809 ), LTalpha, LTbeta, LIGHT (GenBank Accession No. NM_003807), CD27L (GenBank Accession No. NMJD01252), 4-1BBL (GenBank Accession No. NM_003811), "GITRL (GenBank Accession No. NM_005092), APRIL (GenBank Accession No. NM_172089), EDA ( GenBank Accession No. NM_001399), VEGI (GenBank Accession No. NM_005118), and BAFF (GenBank Accession No. NM_006573).
  • the component A of the polypeptide of the invention as defined above is a monomer of one of the constituents of the invention TNF ligand family that is resistant to the processing enzyme TACE.
  • TACE is a member of the ADAM protease family and is the physiological TNF-specific processing enzyme of the naturally occurring cell membrane-forming TNF. TNF is sometimes cleaved from the cell membrane and released into the environment.
  • a TACE-resistant component A according to the invention is preferably lacking the Ala-Val cleavage site (eg AS 76-77 in scTNF according to SWISSPROT nomenclature for human TNF, No. P01375).
  • the cleavage site can be removed according to the invention by deletion of one or both of the relevant amino acids Ala or Val.
  • the recognition sequence for TACE eg AS 77-88 in scTNF according to SWISSPROT nomenclature for human TNF, No. P01375
  • Such a deletion in component A prevents a potential cleavage of component A, eg scTNF, by TACE near the linking sites of components A in the region of the left (component B, see below), thus increasing the in vivo stability of the polypeptides of the invention. If necessary, the shortening of the sequence resulting from the deletion can be compensated for by a corresponding extension of the linker.
  • the deletion of the sequence of component A described by way of example for scTNF can be applied to each of the abovementioned components A. If the TACE sequence is not or only partially removed, it is preferably ensured that the use of additional components B or C (see below) in the polypeptide according to the invention does not restore the TACE recognition sequence and the TACE cleavage site.
  • the components A of the polypeptide of the invention as defined above are modified so that the polypeptides according to the invention can couple covalently to surfaces.
  • This coupling is preferably carried out on planar surfaces or on spherical particles, such as magnetic particles (Magnetbeads), or on nanoparticles / MU ⁇ op motherboard, preferably as ZeU-mimetic, therapeutic reagent with membränoffem TNF similar properties.
  • a coupling group preferably the SH group of a cysteine residue, in the N-terminal region of at least one component A of a polypeptide according to the invention. (Further preferred coupling groups according to the invention are described below).
  • the coupling group may be located at any position of the N-tertiary region of component A, preferably near the N-terminus. Most preferably, the coupling group is in a range of the first 1-15, and even more preferably in a range of the first 1-10 N-terminal amino acids.
  • the modification in the case of a prokaryotic-expressed scTNF, the modification can be introduced after an initial methionine (position 2) of the amino acid sequence or in a eukaryotic-expressed scTNF directly after the cleaved leader sequence, ie the N-terminal amino acids of the component A represent.
  • a tag used according to the invention for example a His tag
  • a flag tag can be introduced according to the invention, for example resulting in a CysHis tag with a cysteine at amino acid position 9.
  • a further alternative includes Introducing a coupling group into one or both components B (linker) of the polypeptide according to the invention.
  • a polypeptide according to the invention Preferably, in a polypeptide according to the invention, only the component A located at the N-terminus or the further N-terminally located tag are / is modified / modified with a coupling group as described above.
  • a polypeptide according to the invention which contains 3 components A for example 2 or 3 of the components A are modified with a coupling group, so that the total molecule (the polypeptide according to the invention) binds to two or three covalent bonds suitable matrix can be coupled.
  • each of the polypeptides according to the invention preferably contains the subunits (components A) necessary for the biological function in a functionally relevant manner. Order.
  • a polypeptide according to the invention By coupling a polypeptide according to the invention to a surface / a particle, it is possible in accordance with the invention to prepare surfaces or particles with, for example, coupled TNF flomo or heterotrimer cres and rs. On these surfaces / particles are the coupled TNF homo- or Hcterotrimere or -yogre stabU and bioactively immobilized.
  • the functionally relevant trimeric state of components A is stabilized by components B, which ensures that after covalent coupling to a surface / particles, dissociation of individual components A is precluded and thus loss of biological activity is prevented ,
  • a preferred property of such polypeptides coupled to surfaces or particles according to the present invention is their biomimetic activity, which corresponds to the natural, membrane-bound ligand of the TNF family.
  • an inventive, immobi-scTNF obtained a high affinity for T R2 and thus high signal sensitivity
  • polypeptides which contain components A modified with a coupling group and are coupled to a surface and / or particles as described above can be used for the detection as well as for the manipulation, depletion and / or removal of binding partners of members of the TNF.
  • IigandenfamiUe as well as associated with it compounds are used.
  • the polypeptides of the present invention comprise, in addition to the described components A (monomers of at least one member of the TNF ligand family) at least two components B, wherein the component B has the property of a peptide linker.
  • a peptide linker in the sense of the invention, any peptide sequence which can be expressed in a biological system is conceivable.
  • Peptide linkers are, for example, a flexible compound in the polypeptide constructs according to the invention, which, however, preferably does not negatively influence the intrinsic trimerization properties of the relevant constituent of the TNF oligidine family.
  • linkers having such properties, in particular flexibility and length are chosen which are able to stabilize the spontaneously formed homotrimers of the particular ligand (derivative).
  • the component B is accordingly peptide linkers consisting of 2 to 30, preferably between 4 and 16 and more preferably between 4 and 12 amino acids, which are preferably glycine-serine repetitive structures, more preferably Gly-Gly -Gly-Ser modules (GGGS modules) contained in a repetitive arrangement.
  • GGGS modules Gly-Gly -Gly-Ser modules
  • the peptide linkers of the invention are glycine (G) rich peptide linkers, i. in that the amino acid sequence of a peptide linker has a high glycine anteU, preferably from 60 to 80%, particularly preferably 75%.
  • the peptide linker comprises the amino acid sequence GGGSGGGSGGGS, also called (GGGS) 3 or L short , or the amino acid sequence GGGSGGGSGGGSGGS, also called (GGGS) 4 or Tu.
  • the peptide linkers according to the invention are referred to inter alia as Ll and L2, so that also designations such as Ll short , L2 short , Ll long and / or L2 Iong arise. It is possible to use two different links to stabilize a trimeric molecule.
  • the peptide linkers according to the invention that is to say components B, preferably associate two of the at least three components A with one another. This linkage occurs covalently via the C-terminus of a component A and the N-terminus of another component A.
  • the polypeptide according to the invention is a single-chain molecule (also called a single-chain or sc molecule). This means that all Components A and Components B comprising the polypeptide of the invention on a single polypeptide or protein strand.
  • components A and components B form a trimeric protein structure. This is preferably a homotrimeric protein structure, but heterotrimeric protein structures are also encompassed by the invention.
  • the AushUdung this trimeric protein structure is preferably effected by the component B and / or reinforced by them. Since the trimerization-leading component B or the trimerization-enhancing component B of the polypeptide of the invention would essentially have no higher aggregates, component B would typically not have a cysteine residue capable of undergoing intermolecular disulfide bonding. Preferably, in a polypeptide according to the invention, therefore, component B does not contain any cysteine residue or only those cysteine residues which possess an intramolecular disulfide bridge, ie polypeptide according to the invention, in order to avoid covalent linkage with the at least one cysteine residue of a fusion protein of another under oxidizing conditions Trimmers can occur.
  • sequences of native polypeptides or fragments of these native polypeptides which are used as peptide linkers according to the invention can also be present in the form of biologically active functional variants thereof within the meaning of this invention and as defined above.
  • Components B of the invention may be identical or different naturally occurring peptide sequences. They can come from the same or different organisms.
  • the organisms may be vertebrates, in particular mammals, for example the mouse, the rat, the pig and, above all, humans.
  • the polypeptide according to the invention may additionally have several sequences.
  • So-called tag sequences for example at least one flag tag, ie the amino acid sequence DYKDDDDK, and / or, for example, at least one His tag (containing several consecutive histidines, eg. at least 5) and / or other tag or antigenic sequences.
  • a particularly preferred additional sequence segment is a leader peptide sequence.
  • this leader peptide sequence is a signal for secretion of the polypeptide or protein in eukaryotic cells. This leader peptide sequence is preferably N-terminal.
  • a polypeptide according to the invention comprises a further component C, which is characterized by specific interaction with a complementary cell surface molecule ("antigen")
  • a complementary cell surface molecule (“antigen")
  • the principle of action of polypeptide constructs according to the invention, such as constructs according to the invention with the a-poptoseinucleotide TRAIL or FasL as component A is particularly suitable for those components of the TNF ligand family which are effective exclusively or as a membrane molecule for certain receptors, including TRAIL (TNFSF10), FasL (TNFSF6) and TNF (TNFSF2), for example. also the immunomodulators CD40L (TNFSF5) and CD30L (TNFSF8), so component C has "targeting" func- tion.
  • component C is an antibody fragment, preferably a single-chain antibody fragment, so-called scFv, or an antibody derivative which recognizes a specific target molecule on a cell surface.
  • component C is a protein or peptide which does not belong to the antibodies, but which likewise selectively recognizes a specific target molecule on a cell surface analogously to an antibody-antigen interaction or a receptor-ligand interaction.
  • the present invention comprises a polypeptide according to the invention as component A as described above, at least one member of the scTNF family as defined above, e.g. scTNF and, as component C, an antibody fragment as described above, e.g. scFv. This results in smaller polypeptides of the invention having each a "targeting domain.” Such smaller polypeptides of the invention are advantageously less susceptible to, for example, aggregation.
  • Component C is preferably an antigen-binding antibody fragment or an antigen-binding antibody derivative of a mammal, in particular of murine or human origin, or is a humanized antibody fragment or a humanized antibody derivative, for example of mammalian origin.
  • component C typically consists of one Prior art single chain Fv derivative murine, CDR grafting humanized component C, or a component C of entirely human origin that has been converted to a scFv derivative.
  • component C is a protein or peptide ligand which, as monomer, undergoes a specific binding to a membrane receptor.
  • the component C is a protein or peptide with specificity for cell surface molecules, which is in particular a cytokine receptor, a growth factor receptor, an integrin or cell adhesion molecule. Most preferably, it is a cytokine receptor selected from the group of TNFR genes.
  • Component C of a polypeptide according to the invention preferably has specificity for an antigen which is selectively or predominantly expressed in tumor tissue.
  • a tumor antigen may also be expressed on the normal cell itself or may also be expressed in the non-normal anteU of the tumor, the stromal or the tumor endothelium.
  • antigens of non-tumor tissue attachments of such a tumor are on the one hand genetically invariant, on the other hand occurring in a wide variety of tumor entities, and thus are all tumor markers.
  • tumor-associated ligands against which a component C of the polypeptide of the invention may be directed are the VEGFR and the VEGFR / VEGF complex, as well as the integrin ⁇ v ⁇ 3 and the vibronectin isoform ⁇ Fn as largely selective target structures of the tumor endothelium and the Fibroblast Activation Protein (as a selective marker of the tumor stroma). All of the aforementioned examples can be detected effectively with specific scFv, which is why such scFv (“single chain Fv”) are particularly suitable as component C of a polypeptide according to the invention. Galectin also comes into consideration as a tumor marker against which component C is directed.
  • antibody fragments in various antibody formats for example scFv, in particular scFv40, are particularly preferred as component C.
  • the polypeptide recognizes, via its component C as the specific target molecule, a cell membrane-bound receptor of a TNG-ganged member, preferably different from the TNF-IgM component of component A. Examples which are not exhaustive.
  • Such potential ligands include TNFSF1 (LTalpha), TNFSF2 (TNF), TNFSF3 (LTbeta), TNFSF4 (OX40L), TFSF5 (CD40L), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27L), TNFSF8 (CD30L), TNFSF9 (4-1BBL ), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (RANKL), TNFSF12 (TWEAKL), TNFSF13 (APRIL), TNFSF143B (BLYS), TNFSF14 (LIGHT), TNFSF15 (VEGI), TNFSF16 (CD30L), and TNFSF18 (AITRL), as well as EDA , which or their functional fragments or functional variants of the native sequence or of the fragments can equally serve as component A in a polypeptide construct according to the invention.
  • membrane-type II proteins extentastal C-terminus
  • their functional fragments or functional variants which require a trimeric organization of their subunits as
  • a further subject of the present invention is a nucleic acid encoding a polypeptide of the invention.
  • nucleic acid constructs which contain a sequence coding for a polypeptide according to the invention and one or more further sequence segment (s).
  • Such further sequence segments may be, for example, sequences encoding a lead peptide which acts as a signal for secretion of the polypeptide or protein of the invention in eukaryotic cells, or encode an scFv40, i.
  • scFv single chain antibody fragment 40 which is specific for the tumor stroma antigen FAP, or for an antibody-mediated apoptosis inducing cytokine (AMAIZe) or for a HIS / flag tag, a peptide sequence for affinity purification of the expressed proteins or polypeptides.
  • AMAIZe antibody-mediated apoptosis inducing cytokine
  • HIS / flag tag a peptide sequence for affinity purification of the expressed proteins or polypeptides.
  • nucleic acid sequences that may be included in the nucleic acid sequence are also non-coding sequences, such as non-coding 3 'and 5' sequences, including, for example, regulatory sequences.
  • the nucleic acid sequences of the present invention may also be fused to nucleic acid sequences encoding, for example, a marker sequence or coding for a sequence encoding a polypeptide which facilitates, for example, the isolation or purification of the polypeptide of the invention.
  • Representative sequences include, for example, those encoding a glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, a polyhistidine (eg, HIS 6) hemagglutinin, or HSV tag.
  • GST glutathione-S-transferase
  • HIS 6 polyhistidine hemagglutinin
  • HSV tag hemagglutinin
  • Nucleic acids of the present invention may be DNA or RNA, in particular mRNA.
  • the nucleic acid molecules can be double or single-stranded.
  • Single-stranded RNA or DNA can be either the coding (sense) or non-coding (antisense) strand.
  • nucleic acids according to the invention can preferably be isolated. This means that the nucleic acid molecule or nucleic acid sequence is not flanked by nucleic acid sequences which normally flank the gene or nucleic acid sequence (as in genomic sequences) and / or which have been fully or partially purified (such as in a DNA or RNA sequence). BibUothek). For example.
  • an isoated nucleic acid of the invention may be isomeric to the cellular environment in which it naturally occurs.
  • the nucleic acid comprises one of the nucleic acid sequences shown in FIGS. 19 to 26 or consists of one of these nucleic acid sequences.
  • nucleic acids, nucleic acid constructs or functional fragments or functional variants thereof according to the invention can be carried out by standard methods which are known to the person skilled in the art (see, for example, Maniatis et al. (2001) supr ⁇ ). In particular application in this context finds the PCR technique.
  • a review of the sequence of nucleic acids produced according to the invention can be carried out by means of sequencing or hybridization methods, which are likewise familiar to the person skilled in the art.
  • gene products of the nucleic acids according to the invention preferably encodes a polypeptide of the amino sequences shown in FIGS. 19 to 26.
  • a gene product of the present invention concerns not only the transcript (mRNA) but also polypeptides or proteins, preferably in purified form. Also included are alleles, functional fragments or functional variants of such gene products. For functional fragments or functional variants of the gene products, the above definitions of these terms apply correspondingly.
  • vectors of the invention are expression vectors, i. vectors having the ability to express and / or amplify the nucleic acids in a prokaryotic and / or eukaryotic cell.
  • the present invention relates to plasmid vectors, e.g. pBABEpuro, phages or retroviral vectors, in particular also vector systems which can be used for gene therapy, e.g. also adenoviral vector systems.
  • gene therapy methods with vectors or nucleic acids or nucleic acid constructs according to the invention are thus also disclosed as a treatment method for the medical indications disclosed according to the invention.
  • Vectors according to the invention preferably have control sequences which enable or enhance expression of the nucleic acid according to the invention and regulate transcription.
  • control sequences include, for example, polyadenylation signals, promoters, eg, natural or synthetic promoters, enhancers to effect transcription, operator sequences to regulate transcription, suencers for tissue-specific transcription, sequences encoding suitable ribosome binding sites on the mRNA. ren, sequences which stabilize the mRNA and sequences which regulate the ter atation of transcription and / or translation. This is only an exemplary listing of possible control sequences.
  • control sequences are well known in the art and are described, for example, by Goeddel (1990), Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. , The control sequences can be modified, for example by deletion, addition or substitution of one or more nucleic acids, in order to enhance their control function.
  • promoters for various organisms are known.
  • a preferred promoter for vectors used in Bacillm subtilis is the AprE promoter
  • a preferred vector used in E. coli is the T7 / Lac promoter
  • a preferred promoter used in sacch romyces cerevi ⁇ ae is PGK1
  • a preferred promoter used in pergspergillus niger is glaA
  • a preferred promoter used in Trichoderma reesei (r ⁇ esei) is cbhl.
  • Promoters suitable for use in prokaryotic hosts e.g.
  • beta-lactamase (vector pGX2907 [ATCC39344], containing the RepUcon and the beta-lactamase gene), lactose promoter systems (Chang et al., (1978), Nature (London, 275: 615), Goeddel et al ), Nature (London), 281: 544), AlkaU phosphatase, the tryptophan (trp) promoter system (vector pATHI [ATCC37695]) and hybrid promoters such as the tac promoter (isoUerbar from the plasmid pDR540 [ATCC37282]), on.
  • promoters used in bacterial systems also contain a Shine-Dalgarno sequence that is operably linked to the nucleic acid.
  • Suitable expression vectors may, for example, consist of segments of chromosomal, non-chromosomal and synthetic DNA.
  • numerous derivatives of SV40 and Baktetienplasmiden are known examples are plasmids from E. coli, such as col El, pBK, pCRl, pBR322, pMb9, pUC19 and their derivatives, plasmids, which are useful for a wide host range, such as RP4, and phage DNAs, such as numerous derivatives of the phage lambda, eg NM989, as well as other DNA phages, eg M13 as well as filamentous single-stranded DNA Phages, yeast plasmids, vectors suitable for use in eukaryotic cells, and vectors consisting of a combination of plasmid and phage DNA.
  • Numerous expression techniques for using expression vectors of the invention are known in the art. Such techniques are, for example, generally written in Maniatis et al
  • Another object of the invention relates to a WirtszeUe containing a nucleic acid according to the invention and / or a vector according to the invention.
  • Hosts within the meaning of the invention are cells which are able to act as host and expression vehicle for a nucleic acid or vector according to the invention. These may be prokaryotic and eukaryotic hosts. Examples of prokaryotic - bacterial host cells are R, marinus, E. coli, Streptomyces, Pseudomonas, Bacillus, Serratia marcescens, Samonella thyphimurium. Eukaryotic hosts include, for example, yeasts such as Saccharomyces ceremsiae, Pichia pastoris, insect cells such as S ⁇ , or mammalian cells such as COS, CHO. These lists are by no means exhaustive. The choice of a suitable host is dependent on several factors, e.g. when introducing a vector into a host, in particular from the vector according to the invention used.
  • a further subject of the invention relates to the preparation of a host according to the invention, which comprises the following steps:
  • step (a) preparation of a nucleic acid according to the invention or of a vector according to the invention, (b) introduction of the nucleic acid and / or the vector according to step (a) into a cell.
  • nucleic acid or a vector can be carried out according to the invention by the standard methods and exemplary descriptions already described above.
  • introduction of the nucleic acid or the vector according to the invention into the host can be carried out using any suitable standard method. These include, for example, transformation, electroporation, transfection using, for example, calcium monium chloride. Lipofection, infection, transduction, etc.
  • suitable standard method include, for example, transformation, electroporation, transfection using, for example, calcium monium chloride. Lipofection, infection, transduction, etc.
  • Various standard methods are described, for example, in Maniatis et al. (2001) supra.
  • a further subject of the present invention is a method for the production of a polypeptide according to the invention, which method typically comprises the following steps: (a) culturing a host cell according to the invention under suitable conditions, (b) expressing the nucleic acid or nucleic acid construct according to the invention under suitable conditions and (c) isolating the polypeptide from the host and / or culture supernatant.
  • Culturing a host cell means allowing the host to grow in a suitable culture medium, at a suitable pH, and at suitable temperatures. Such growth conditions depend on the particular host used and are well known to those skilled in the art. Hints for cultivating ZeUen are also found in Maniatis et al. (2001), supra.
  • polypeptide may typically be accomplished in the art in suitable expression systems, preferably as a secreted product of stable transfectants, e.g. CHO cells or other animal cells, such as Cos7 or SF9 (insects), or other eukaryotic cell systems, for example Pichia pastoris.
  • the expressed polypeptides of the invention have suitable leader sequences for secretion in the cell system. Therefore, the vectors of the invention used for expression will also contain coding portions which code for a functional leader sequence, e.g. as in Brocks et al. (Immunology - ?: 173-184, 1997) for mammals and insects or using, for example, pPIC-Zalpha vectors (Tnvitrogen, Düsseldorf, Germany) for expression and secretion in the yeast Pichia pastoris.
  • Isolation of the host polypeptide of the invention may be by standard methods such as chromatography methods, precipitation methods, etc., useful for purifying polypeptides and proteins (see also Maniatis et al., (2001), supra.
  • the polypeptides if appropriate, but also nucleic acids, nucleic acid constructs, vectors or WirtszeUen, (summarized here under the category "substances according to the invention") of the invention, as a drug or for the preparation of a medicament for the treatment of diseases into consideration.
  • the substances according to the invention comprise a component C according to the invention (such an antibody fragment or another specific binding protein / peptide), their use is given in particular if the substances are after binding of the polypeptide or fusion protein to a specific, cell membrane-expressed target molecule which exert full biological activity via the corresponding receptor of the TNF ligand family member.
  • a component C according to the invention such an antibody fragment or another specific binding protein / peptide
  • their use is given in particular if the substances are after binding of the polypeptide or fusion protein to a specific, cell membrane-expressed target molecule which exert full biological activity via the corresponding receptor of the TNF ligand family member.
  • the specificity of the targeting component C the activity of the substance of the invention on the tissue to be treated, e.g. Tumor tissue, and it can be made to the respective indicator / tumor entity specific tillsti_r_mtes / optimized therapeutic agent.
  • a polypeptide of the invention is e.g.
  • the targeting component C when used as a tumor therapeutic agent, in particular for the treatment of tumors, but also lymphatic tumors (benign or maugne), after in vivo administration by the targeting component C initially enriched specifically in the tumor area by the tumor itself or the reactive Tumorstroma / tumor vessel system gebUdete membrane marker and there TNF Receptor tumor-positive tumor cells or sensitive cells of the reactive tumor-bearing normal tissue that are sensitive to a member of the TNF ligand family.
  • substances according to the invention is, however, in principle also desirable for use in the therapeutic field whenever the activation of a signal transduction chain, for example the signal cascades triggered by the TNF receptors, for example an apoptotic signal cascade, is triggered.
  • a signal transduction chain for example the signal cascades triggered by the TNF receptors, for example an apoptotic signal cascade
  • the use of substances according to the invention in the treatment or for the preparation of a drug for the treatment of hyperproUferativer diseases into consideration, for example, for the targeted elimination of cells of the immune system in excessive immune reactions, for example.
  • Autoimmunerkrar kung such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis Diabetes mellitus and TEN, or in the case of misguided immune reactions against foreign antigens, such as, for example, in infectious diseases (bacterium U (for example by mycobacteria), vital or protozoan). zoologically) can occur. Also suitable is the treatment of metabolic diseases or general hyperinflammatory conditions, in particular chronic inflammations, for example also in the case of allergies, but also the treatment of rejection reactions of the immune system of the patient to foreign tissue.
  • the polypeptide according to the invention eg via a component C, must recognize characteristic markers on the surface of the target cells, in which preferably an apoptotic signal cascade with the aim of the cell death is triggered.
  • the body's own cells responsible for the rejection reaction of the immune system of the transplant patient will serve as target cells.
  • the substances or medicaments according to the invention are suitable for the treatment of intestinal diseases, in particular soils or lymphatic tumors, infectious diseases, metabolic diseases, inflammatory conditions, hyperproferferious diseases, autoimmune diseases, in particular rheumatoid / arthritic diseases, toxic epidermal necrolysis (TEN), multiple sclerosis, Hashimoto's thyroiditis, GvHD, viral hepatitis (HSV, HCV), alcohol-induced hepatitis, liver transplantation rejection, hyperapoptotic reactions, degenerative diseases, especially neurodegenerative diseases.
  • recombinant-produced protein is administered to the patient to be treated.
  • the patient is taken from transfected cells, transfected with in vitro (expression) vectors of the invention, cultured and then transferred as a retransplant into the patient.
  • the transfection is preferably performed by nucleic acids, nucleic acid constructs or (expression) vectors which couple the expression to a regulatable promoter.
  • the transfected self-transplant may be injected locally, for example, depending on the specific disease and specific target sites. Local administration is preferred, for example, in the case of tumor therapy.
  • tumor cells are taken from the patient, transfected in vitro and then, if possible, injected directly into the tumor, for example for the treatment of skin tumors (eg melanomas), tumors of the nervous system (eg GUoblastomas).
  • skin tumors eg melanomas
  • tumors of the nervous system eg GUoblastomas.
  • Further objects of the present invention relate to the use of substances according to the invention both for the preparation of a vaccine for active or passive immunization against infectious diseases, in particular against viral infectious diseases, as well as for the production of a vaccine for vaccination against rubella, measles, PoUomyeUtis, ToUwut, tetanus, diphtheria , BCG, malaria, yellow fever, HIV or influenza.
  • Substances according to the invention can likewise be used for in vitro diagnosis.
  • a further object of the present invention relates to methods for extracorporeal (ex vivo) manipulation, depletion and / or removal of constituents contained in body fluids, such as e.g. Binding partners of a component A as defined above or cells binding thereto or associated therewith.
  • Such extracorporeal methods preferably include ⁇ 1, such as e.g. Apheresis, in particular the basic forms of aphe- ses, plasmapheresis and cytapheresis.
  • the plasmapheresis involves the extracorporeal manipulation, depletion and / or removal of certain soluble or suspended constituents in the plasma component of the blood, as well as the return of the blood thus treated to the patient.
  • peripheral blood is preferably taken from a patient by means of a pheresis machine, the remedy is optionally added to the blood and the blood is separated into its main components - solid (red blood cells, white blood cells and platelets) and liquid AnteUe (plasma).
  • the soluble or suspended constituents of the blood contained in the plasma fraction thus obtained can be manipulated, depleted and / or removed in a further process step, for example using polypetides according to the invention.
  • plasmapheresis is preferably carried out using methods such as therapeutic plasma exchange (TPE), immunoabsorption (LA), precipitation (HELP), different membrane filtration and other methods. performed.
  • TPE therapeutic plasma exchange
  • LA immunoabsorption
  • HELP precipitation
  • MDF membrane filtration systems
  • Fütern like PlasmaFlo ® OP-05 are L and RheoFüter ® AR2000 blood filters, used (hergesteUt by Asahi Medical Company, Ltd. of Japan) , Alternatively, any suitable surface and particle can be used in plasmapheresis methods of the invention.
  • circulatory and / or marrow-bound cell components red blood cells, white blood cells, stem cells or thrombocytes
  • peripheral blood is preferably taken from a patient by means of a pheresis machine.
  • anticoagulant agents are then added to the blood and the blood is separated into its major components. Accordingly, in the fraction of the blood containing the components, these components can be manipulated, depleted and / or removed in a further process step, preferably also using polypeptides according to the invention.
  • the treated fraction can finally be reinjected to the patient.
  • the separation of the blood into different fractions and optionally the separation of certain ZeU suedteüe of the blood by means of methods such as centrifugation, differentieer membrane filtration, or other means. It can continue to membrane filtration systems (MDF) as, PlasmaFlo ® OP-05 (W) L and RheoFUter ® AR2000 blood filters, are using various particles and surfaces, for example. Fütem used (hergesteUt by Asahi Medical Company, Ltd. of Japan).
  • the above-described methods of plasmapheresis and cytapheresis may be combined with each other, for example, for both soluble or suspended components in the plasma portion of the blood and circulating and / or marrow-bound cell components (red blood cells, white blood cells, Stem cells or platelets) or specific subpopulations Manipulate, deplete and / or remove these cells in order to achieve a clinical effect.
  • Such a combination of plasmapheresis and cytapheresis is preferably produced using the polypeptides according to the invention.
  • the present invention relates to an (apheresis) method for exttakorporal manipulation, depletion and / or removal of suspended, suspended or cellular constituents of the blood, comprising the following steps: optionally providing separation of the blood into one or more solid and / or fractions or liquid constituents; Binding of soluble, suspended or cellular constituents of the blood to a surface or particle coupled to a polypeptide according to the invention; and, optionally, separating the bound soluble, suspended or cellular constituents of the blood.
  • a blood sample may optionally be taken from a patient prior to the possible separation of the blood taking place.
  • the blood treated with the method according to the invention or the blood fraction thus treated can be reinjected to the patient.
  • Volume losses resulting from the process according to the invention can be achieved by adding suitable liquids, e.g. by adding an isotonic saline solution.
  • the step of binding the soluble, suspended or cellular constituents of the blood to a surface or particle coupled to a polypeptide according to the invention may be carried out once or more times as required to obtain a desired selectivity.
  • those surfaces and / or particles which are covalently bound with a polypeptide according to the invention as defined above are used. were coupled.
  • the polypeptide according to the invention is preferably covalently coupled to the surface and / or the particles via the coupling group (s) A contained in the polypeptide.
  • a coupling of the polypeptides used according to the invention via the individual components A preferably takes place as described in DE 101 44 252 A1.
  • the coupling of the polypeptides used according to the invention is preferably carried out on surfaces or particles (carrier) via a bond between first functional groups present on the carrier surface and in the polypeptide via the coupling groups contained in components A.
  • These coupling groups are preferably complementary to the functional groups of the carrier and can enter into an affine, preferably covalent, bond with them.
  • the functional group of component A is positioned within component A such that it is located at a suitable distance outside the domains of the polypeptide of the invention which are responsible for the biological activity.
  • the polypeptide of the invention is preferably fixed on the support surface such that the three-dimensional structure of the domain (s) required for the biological activity is unaffected by unimmobilized polypeptide of the invention, and the domain (s) are in contact with cerebral reactants this freely accessible is / are.
  • the functional group of the support surface is selected from the group consisting of amino group, carboxy group, epoxy group, Maleiniixiido group, alkyl ketone group, aldehyde group, Hydrazin devis, Hydrazidgrup- PE, thiol group and thioester group.
  • the coupling groups of the components A to be immobilized of the polypeptide according to the invention are selected from a group which contains the same species as for the functional group of the support surface.
  • a surface / particle (carrier) which can be used in the apheresis process according to the invention thus has on its surface a functional group which is covalently linked to a coupling group of the polypeptide of the invention to be immobilized, the coupling group of the polypeptide being a different group than the functional proteins of the polypeptide Carrier is.
  • the two Bonding groups and functional groups must be complementary to one another, ie able to form a covalent bond with each other.
  • the coupling group of component A of the polypeptide according to the invention is a carboxy group. If, in accordance with the invention, a carboxy group conversely is used as the functional group of the carrier, according to the invention the coupling group of component A of the polypeptide according to the invention is an amino group. If, according to the invention, a thiol group is selected as the functional group of the carrier, according to the invention the complementary coupling group of component A of the polypeptide according to the invention is a maleimido group.
  • the complementary coupling group of component A of the polypeptide according to the invention is a thiol group. If, according to the invention, a functional group of the carrier alkylketone group, in particular methyl ketone or aldehyde group, is used, the functionally complementary coupling group of component A of the polypeptide according to the invention is a hydrazine or hydrazide group.
  • the functionally complementary coupling group of component A of the polypeptide according to the invention is an alkyU-acetone, especially methyl ketone or aldehyde group.
  • the functional group on the carrier surface is preferably a maleierimido group and the coupling group of component A of the polypeptide according to the invention is a thiol group.
  • the Immobütician is preferably directed.
  • the term "directed immobilized” or “directed immobilization” means that a polypeptide of the invention, particularly a scTNF member, is immobilized on a support at defined positions within the scTNF member such that the three-dimensional Structure of the required for the biological activity domain ⁇ ) is not changed compared to the non-nmobüinstrumenten state and that this TNF domain (s), such as binding pockets for zeUulare reactants, on contact with zeUulDC reactants for these freely accessibleUch is / are.
  • immobilized also means that the coupling of the polypeptide according to the invention on the support surface is done so that the immobilized protein can not be degraded or only very slowly degraded by protein-degrading enzymes in a later use in a cell or zeUähnUchen environment. That is, the immobilized TNF molecule of the present invention is oriented on the support surface so as to provide as few as possible target sites for proteases.
  • the polypeptide of the invention may be made resistant to proteases prior to coupling by molecular biological methods, such as described above for TNF members in the protease TACE.
  • the polypeptide of the invention retains its biological function via its coupled component (s) A and the ability to interact with other compounds / agents.
  • Surfaces and / or particles suitable for coupling may comprise any suitable surface and / or particle to which polypeptides of the invention may be coupled.
  • Particularly preferred are culture plates or so-called microbeads, eg Dynabeads (Dynal Biotech GMBH), nano-beads, nanoparticles, or solid phases such as nylon compassione, Sepharose, Sephadex, etc.
  • the Carrier systems used according to the invention are compact or hollow nanoparticles with sizes between 25 and 1000 n. These consist of either organic or inorganic particle bacteria.
  • the type of material can be varied according to the later application, wherein the carrier of the nanoparticles preferably consists of biocompatible and / or biodegradable materials.
  • nanoparticles furthermore refer to binding matrices which comprise a support having a surface on which chemically reactive functional groups are arranged which have complementary functional groups of molecules to be bound, in particular polypeptides according to the invention, affine bonds, ie Covalent and / or non-covalent bonds, enter and thus fix the polypeptides of the invention on their surfaces stabü.
  • the carriers of the nanoparticles consist of chemically inert inorganic or organic materials and have a size of less than 1 ⁇ , preferably from 25 to 500 nm.
  • a particular embodiment of the apheresis method according to the invention comprises a biofunctionalized surface (planar or as a particle), for example with the polypeptide scTNF according to the invention, which has been covalently and directionally surface-immobilized in the manner described above.
  • a biofunctional surface containing for example several immobilized scTNF molecules or variants thereof, allows a high affinity for the respective complementary binding partners, for example TNFR1 and TNFR2.
  • the receptors TNFR1 and in particular TNFR2 are found in greatly increased concentrations as processed, soluble molecules in the blood of tumor patients and in other diseases.
  • ITSIFR ITSIFR
  • An apheresis method using polypeptides according to the invention, for example scTNF, makes it possible to preferentially remove both TNF receptors from samples simultaneously and efficiently.
  • a further advantage of this method is the fact described above that dissociation of individual components A of the polypeptide according to the invention is not possible, ie no loss of activity of the functionalized surface or contamination of the treated blood with dissociated substances is to be expected.
  • the apheresis process according to the invention can be carried out as a continuous process or as a continuous process.
  • the process according to the invention is preferably carried out directly after the blood is withdrawn or the fractionated blood is removed and before the blood is returned to the patient without intermediate storage of the blood or blood fractions obtained.
  • the withdrawn blood or the fractions of the withdrawn blood can be stored after each step for a certain period of time.
  • the temperature in Apherese Kunststoff invention preferably at 0-40 ° C.
  • the temperature is preferably at 25 to 40 ° C, especially It prefers in a range between 36 and 38 ° C.
  • the temperature may be between 0-40 ° C.
  • the apheresis method according to the invention as described above is preferably used for the diagnosis, therapy and / or prophylaxis in diseases associated with the ligands of the TNF ligand family, in particular in tumor diseases, in particular soutn or lymphatic tumors, in particular soils and lymphatic tumors.
  • the restoration of homeostasis of the immune system with its humoral and cellular components is considered to be the key to the effectiveness of apheresis procedures.
  • the apheresis system according to the invention can therefore also be used for restoring immune homeostasis in non-malignant diseases.
  • inflammatory diseases include inflammatory diseases, arthritic and rheumatic diseases, or disorders of the immune system, and for the treatment of infectious diseases, metabolic diseases, inflammatory conditions, hyperproferferential diseases, autoimmune diseases, in particular rheumatoid / artistic diseases, toxic epidermal necrolysis (TEN), multiple sclerosis, Hashimoto's thyroiditis, GvHD, vitreous hepatitis (HBV, HCV), alcohol-induced hepatitis, liver transplantation rejection, hyperapoptotic reactions, degenerative diseases, especially neurodegenerative diseases.
  • infectious diseases include inflammatory diseases, metabolic diseases, inflammatory conditions, hyperproferential diseases, autoimmune diseases, in particular rheumatoid / artistic diseases, toxic epidermal necrolysis (TEN), multiple sclerosis, Hashimoto's thyroiditis, GvHD, vitreous hepatitis (HBV, HCV), alcohol-induced hepatitis, liver transplantation rejection, hyperapoptotic reactions, degenerative diseases
  • tumors include colon carcinoma, melanoma, renal carcinoma, lymphoma acute myeloid leukemia (AML), acute lymphoid leukemia (ALL), chronic myeloid leukemia (CML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), gastrointestinal tumors, lung carcinoma, GUome, gonadal tumor, Breast cancers, prostate tumors, hepatomas, various virus-induced tumors such as papulomavirus-induced carcinomas (eg cervical carcinoma), adenocarcinomas, herpesvirus-induced tumors (eg Burkitt's lymphoma, EBV-induced B cell lymphoma), hepatitis B-induced tumors (hepatocellular carcinomas) , HTLV-1 and HTLV-2-induced lymphomas, acoustic neuroma, cervical cancer, lung cancer, pharyngeal cancer, anaerial carcinoma, GUoblastoma, lymphoma, rectal cancer, astrocytoma, brain tumors
  • Baconchial cancer testicular cancer, melanoma, thyroid carcinoma, bladder cancer, Hodgkin's syndrome, meningiomas, Schneeberger Disease, Biocharcinoma, Flypophyseal Tumor, Mycosis fungoides, Esophageal Cancer, Breast Cancer, Carcinoids, Neurinoma, SpinaUom, Burkitt's Lymphoma, Laryngeal Cancer, Kidney Cancer, Thymoma, Corpus Carcinoma, Bone Cancer, Non-Hodgkin's Lymphoma, Urethral Cancer, CUP's, Headache Cervical Tumors, Ovarian Dye, Vaginal Cancer, Colon Cancer, Colon Carcinoma, Esophageal Cancer, Wart Removal, Small Intestinal Tumors, Craniopharyngiomas, Ovar_al-I, Dermatitis, Ovarian Cancer, Liver Cancer, Pancreatic Carcinoma, Cervix Carcinoma, Endometibular Carcinom
  • Arthritis includes, in particular, monarthritis, osteoarthritis, polyarthritis, acute artiitis (especially septic, instinct-induced, reactive arthritis and acute arcoidosis), subacute arthritis, chronic artiitis, (especially rheumatoid arthritis, arthritis in seronegative spondylarthritis), infectious arthritis, paraplegic or postinfectious Arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile chronic arthritis, arthritis in inflammatory connective tissue diseases and vasculature, allergic arthritis, arthritis associated with metabolic disorders and nutritional disorders, arthritis in endocrine disorders, arthritis in granulomatous disorders, arthritis in diseases of the family hematopoietic system, arthritis in joint bleeding due to blood clotting disorders, neoplastic arthritis, paraneop- roplastic artiitis, (post-) traumatic arthritis, arthritis in articular cartilage diseases, arthritis in neuropathies, artiitis at pu arthritic allergic, chlamydia-induced arthritis
  • a further subject of the present invention is a pharmaceutical composition or a vaccine comprising polypeptides according to the invention, nucleic acid constructs according to the invention, vectors according to the invention and / or novel host systems as well as pharmaceutically acceptable excipients, additives and / or carriers (eg also solution mediators).
  • the pharmaceutical compositions or vaccines according to Invention are preferred for treating I_rebser__ra ü_ache.
  • soUden or lymphatic tumors used and for the treatment of infectious diseases, metabolic diseases, inflammatory conditions, hyperproUferatorische diseases, autoimmune diseases, especially rheumatoid / arthritic diseases, toxic epidermal necrolysis (TEN), multiple sclerosis, Hashimoto's thyroiditis, GVHD, viral hepatitis (HBV, HCV) , Alcohol-induced hepatitis, rejection reactions in liver transplantation, diseases based on hyperapoptotic reactions, degenerative diseases, especially neurodegenerative diseases.
  • the invention also discloses a combination of substances according to the invention with pharmaceutically acceptable carriers, excipients and / or additives.
  • pharmaceutically acceptable carriers for example, sterile water, sterile saline solutions are used as carriers.
  • compositions according to the invention are suitable for all the medical indications disclosed above
  • compositions according to the invention may be fillers or substances, such as lactose, mannitol, substances for .alpha.-polyalkylene glycols, hydrogenated naphthalene and especially biocompatible lactide polymers, lactide / glycoUdcopolymer or polyoxyethylene / polyoxypropylene copolymers covalent attachment of polymers such as polyethylene glycol to inhibitors of the invention, complexation with meta-ions or inclusion of materials in or on specific preparations of polymer compound such as polylactate, polyglycolic acid, Hydrogel or on liposomes, microemulsion, mice, unilamelar or multilamelar vesicles, erythrocyte fragments or spheroplasts.
  • compositions are selected depending on the physical behavior, for example, with regard to solubility, stability, bioavailability or degradability.
  • Controlled or constant release of the active ingredient component of the invention in the composition includes preparations based on up-poultice depots (eg fatty acids, waxes or oils).
  • up-poultice depots eg fatty acids, waxes or oils.
  • coatings of substances according to the invention or compositions containing such substances are also disclosed nich coatings with polymers (eg poloxamers or poloxamines).
  • the inventions Substances or compositions according to the invention have protective coatings, for example protease inhibitors or permeation enhancers.
  • compositions of the invention will be solid, liquid or aerosolized (eg spray), depending on the nature of the confection or administration.
  • a therapeutically effective amount of a polypeptide of the invention is administered to a patient.
  • the exact dose will often depend on the purpose of the treatment being administered and may be determined by one skilled in the art using known prior art methods.
  • adjustments may be made to the metabolic degradation of the polypeptides of the present invention in terms of systemic versus local administration, as well as age, body weight, general health, sex, diet, time of administration , Interaction of the drugs with each other, or be necessary to the severity of Erkranl ⁇ ing.
  • Such adjustments may be made by one skilled in the art by methods known in the art.
  • an adjuvant in the context of this invention is a composition which, as such, does not elicit a specific immune response to an immunogen, but is capable of controlling the immune response to that immunogen. to increase.
  • administration of the adjuvant alone does not elicit an immune response against this immunogen, while administration with this immunogen produces an immune response that is more potent Immune response upon administration of the immunogen aOn.
  • An adjuvant may additionally contain or be administered pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants and / or additives as disclosed herein for vaccines and pharmaceutical compositions.
  • an adjuvant may be administered together with vaccines or pharmaceutical compositions disclosed above.
  • the invention provides a polypeptide having increased stability in that the entire molecule of a member of the TNF gene family consists of a protein or polypeptide strand (eg, scTNF) such that the monomers (components A) of the MitzUeder of the TNF ligands family can no longer dissociate.
  • scTNF as well as polypeptides according to the invention which relate to other members of the TNF ligand family, shows no qualitative differences in the nature of its bioactivity to the normal solution sTNF (also WT type TNF or wtTNF), but is much more stable and therefore shows higher bioactivity effective at lower concentrations.
  • scTNF is capable of inducing apoptosis in sensitive cells, activating the transcription factor NF- ⁇ B, activating the receptor TNFR1, but not TNFR2, and activating the receptor TNFR2 in the presence of certain antibodies (e.g., 80M2).
  • This is good for polypeptides of the invention which affect other members of the TNF ligand family.
  • polypeptides according to the invention having a coupling group for the production of biofunctional surfaces and using the same, for example for apheresis no bleeding of the polypeptide according to the invention or a recycling of harmful ligands into the system can be observed.
  • the polypeptide according to the invention is an ideal starting material for the preparation of new, bi-functional molecules.
  • the polypeptide according to the invention for example scTNF, or functional fragments thereof, can covalently bind to cell surfaces. This has the advantage according to the invention that only a single covalent bond has to be produced here for the stable binding of the molecule.
  • all three monomers of the individual homotrimer must be covalently bound to the supernatant. surface in order to obtain a stable structure, since otherwise the non-covalently bound monomers abdissozüeren.
  • an application in apheresis for example with scTNF as a biofunctional active substance for the removal of TNF receptors from body fluids, is particularly advantageous.
  • TNF TNF
  • wtTNF TNF
  • the fusion protein derived from scTNF is linked to only one molecule of antibody, so that the entire fusion protein again consists of a single rod of protein or polypeptide strand, respectively
  • the TNF described above is transferable to all of the TNF ligand family.
  • the present invention due to the covalent linkage of the monomers (components A) of the polypeptide according to the invention, to selectively introduce mutations into only one or two or more of the at least three monomers (components A).
  • Point mutations are known which enforce receptor selectivity, i.
  • TNF binding occurs only to one of the two TNF receptors (TNFR1 and TNFR2).
  • the first time it is possible for the first time to use e.g. Produce TNF mutant, for example, which is able to selectively bind one molecule TNFR1 and two molecules TNFR2 simultaneously, i. this would result in heteromeric receptor complexes.
  • Figures 1-3 show results of various biological cytotoxicity assays in which the characteristics, in particular the specificity, of different scTNF variants with those of classical soluble WTT, i. of the soluble extracellular domain of human TNF (NCBI gi: 25952111, 17.09 kDa as a soluble monomer monomer, abbreviated to TNFhum or sTNF, AA 79-181).
  • scTNF variants were tested which have different length peptide linkers between the individual TNF modules (i.e., TNF monomers).
  • the peptide linkers each consist of three times or four times the amino acid repetition GGGS (or else GlyGlyGlySer) (referred to as "singlechain TNF3x” or “single chain TNF4x” or as “scTNF3x” or “scINF4x").
  • Figure 1 shows the result of a typical cytotoxicity assay of TNF.
  • the target cells used were mouse fibroblasts (MF) from TNFR1 / TNFR2 double-knockout mice, expressing stably TNFR1 receptor chimeras (TNFR1-Fas) (MF TNFR1-Fas cells).
  • MF stably TNFR1 receptor chimeras
  • Such cells expressed a hybrid molecule which extracellularly consists of the corresponding part of TNFR1 and thus binds TNF, and has intracellularly the strongly apoptotic intra murine domain of the Fas receptor.
  • These MF TNFR1-Fas cells can be activated by TNFR1-specific stimuli, but mediate a Fas-specific death signal.
  • the surviving cell count was quantified after 24 hours by staining with a dye by its absorbance.
  • a negative control a controU bacterial lysate was used, which was a non-scTNF-inhibiting bacterial lysate that was processed identically to the recombinant scTNF proteins.
  • both the human TNF (TNFhum) as well as the recombinant scTNF variants led to the death of ZeU.
  • a comparable dose-dependent cytotoxic effect of TNFhum or scTNF can be seen (see the lower three graphs.), Where the specific activity of scTNF is at least equivalent, if not even higher than that of the Wüd type TNF. As expected, the negative control shows no toxic effect.
  • FIG. 2 shows the result of a cytotoxicity test in which the effect of sTNF and scTNF variants on cells expressing TNFR2 receptor chimeras (TNFR2-Fas) was investigated.
  • mouse fibroblasts were used which express receptor chimeras consisting of TNFR2 and Fas (TNFR2-Fas, the extracellular part of TNFR2 originating from the intracellular Fas receptor) (MF TNFR2-Fas ZeUen).
  • MF TNFR2-Fas cells (as well as the wild type TNFR2) can only be activated by an adequate TNFR2 strain, for example by membrane-bound TNF, but not by soluble TNF.
  • FIG. 3 shows the result of a cytotoxicity assay in which the effects of soluble human type TNF and a scTNF variant in combination with a specific TNFR2-specific antibody, 80M2, on TNFR2 chimera (TNFR2-Fas) expressing cells was examined .
  • the experimental procedure corresponds to that of FIG. 2, with the difference that the soluble WT type TNF or the scTNF with triple peptide linker (scTNF3x) were added together with the antibody 80M2.
  • the antibody 80M2 is known to confer to normal TNF the particular signaling capacity of membrane-bound TNF.
  • Figures 4-10 show results of various stability tests demonstrating that, due to their structure, the scTNF variants of the present invention have a significantly better stability than soluble wildtype TNF.
  • STNF or the scTNF variants were incubated in serum-containing culture medium at concentrations of 3.0 to 0.01 ng / ml at 37 ° C. and 5% CO 2 for different times. Subsequently, the functionality of the sTNF or scTNF variants (scTNF3x, scTNF4x) was tested in cytotoxicity assays based on MF TNFR1-Fas ZeUen and Kyml ZeUen. For this cytotoxicity test, 1: 3 dilutions were used starting from a 3.0 ng / ml TNF sample.
  • FIG. 4 shows the bioactivity of the molecules used BEFORE the stability tests on mouse fibroblasts MF TNFR1-Fas ZeUen. Soluble human type TNF (TNFhuman) and scTNF dilutions were freshly prepared and diluted out on the cells. Both the soluble KontroU-TNF and the scTNF variants, after incubation with the MF, led to their death.
  • the KontroU bacterial lysate was not expected to have a toxic effect.
  • the ED 50 values (half maximum effective concentration) were about 0.2 ng / ml for the soluble human type TNF and 0.1 ng / ml for the two different scTNF variants used.
  • the controU bacterial lysate used as a negative control showed no toxic effect.
  • Figure 5 shows the result of a Stabstabtician test with mouse fibroblasts MF TNFRl-Fas ZeUen.
  • the Wüd type TNF and scTNF dilutions shown in FIG. 5 were incubated in the cell incubator for 8 days before the test was carried out, in order to be able to assess the stability of the samples.
  • an ED 50 value of about 2 ng / ml fresh used: 0.2 ng / ml, see FIG. 4
  • the scTNF variants are just as active with ED 50 values of about 0.1 ng / ml as the freshly used samples (see FIG.
  • the contra-UC bacterial lysate used as a negative control showed no toxic effect.
  • Figure 6 shows the result of a Stabstabtician test with mouse fibroblasts MF TNFRl-Fas ZeUen.
  • the type of tft-type TNF and scTNF solutions were now incubated in the cell incubator for 14 days as explained in FIG. It was possible to measure a significant further decrease in the bioactivity of the wild-type TNF after 14 days at 37 ° C., while the activity of the scTNF variants was approximately equal to bUeB.
  • the negative control used was the above-described controBacterial lysate. Wt type TNF and scTNF dilutions were freshly prepared and used. The result shows that both wildtype TNF and the scTNF variants had potent cytotoxic activity.
  • the ED 50 values were about 0.1 ng / ml for the wild-type TNF and about 0.06 ng / ml for the scTNF variants.
  • the controU bacterial lysate used as a negative control showed no toxic effect.
  • Figure 8 shows the result of a Stab Chemie test with the human ZeUUnie Kyml.
  • the WTT and scTNF solutions were incubated for 16 days in the cell incubator. Subsequently, the Kyml -ZeUen cytotoxicity test was performed. A significant decrease in the activity of sTNF after 16 days at 37 ° C could be measured, whereas the toxicity, ie the bioactivity, of the scTNF variants was approximately the same.
  • an ED 50 value of approximately 1.2 ng / ml resulted.
  • the scTNF variants are just as active at 0.06 ng / ml as the freshly prepared samples. As expected, the controU bacterial lysate used as a negative control showed no toxic effect.
  • FIG. 9 shows the result of a Stabstab test with the human ZeUUnie Kyml. sTNF and scTNF solutions were incubated in the ZeU incubator for 22 days. There was a clear further decrease in the activity of sTNF after 22 days at 37 ° C. The scTNF variants were still stable. As expected, the controU bacterial lysate used as a negative control showed no toxic effect.
  • Table 1 below shows the result data of the stability tests according to FIGS. 7 and 9 in comparison: Table 1: Comparison of the ED 50 values from FIGS. 7 and 9
  • FIG. 10 shows the result of a stability test with the human ZeUUnie Kyml. Dilutions of 3 ng / ml were titrated out after 16 days at 37 ° C. In contrast to the previous FIGS. 4 to 9, in this experiment a titration curve was prepared starting from a 3 ng / ml TNF dilution stored for 16 days, whereas in the previously shown titration curves the respective dilutions were prepared and then stored for the stated time. It should be noted that a comparison of the data from FIG. 8 (analogous experiment with 16 days incubation time) and FIG. 10 shows no significant differences. As expected, the controU bacterial lysate used as a negative control showed no toxic effect.
  • FIG. 11 shows the result of a stability test in human serum.
  • the soluble wt-TNF and the scTNF4x variant were diluted in 100% serum and freshly balanced.
  • an ED 50 value of 0.004 ng / ml and for the scTNF variant an ED 50 value of 0.007ng / ml.
  • FIG. 12 shows the result of a stability test in human serum.
  • Wüdtype TNF and the scTNF4x variant were stored in 100% fresh non-heat-inactivated serum for 8 days at 37 ° C and then titered out on Kyml ZeUen , As a result, an ED 50 value of 0.40 ng / ml was measured for wild-type TNF and an ED 50 value of 0.03 ng / ml for the scTNF variant.
  • the effects of 8-day storage in 100% serum are as follows: compared to freshly titrated scTNF, the scTNF stored for 8 days showed a loss of activity by the factor of approximately 4.3, whereas for the solution, sTNF was more dramatic Loss of activity by a factor of 100 during storage in 100% serum showed.
  • the scTNF according to the invention showed in similar to the sTNF, therefore a considerably higher bioactivity after 8 days incubation in serum and thus proved to be very stable in human serum at physiological temperatures.
  • Figure 13 shows the result of analysis by polyacrylamide gel electrophoresis under reducing and denaturing conditions.
  • DargesteUt is a supernatant of purified wildtype TNF and the purified scTNF variants scTNF3x and scTNF4x.
  • the samples were each incubated with ⁇ -mercaptoethanol (final 5%) at 95 ° C for 5 min.
  • About 500 ng of sTNF and scTNF4x and about 150 ng of scTNF3x per lane were applied to the supernatant.
  • Figure 14 shows the result of a stability test under reducing and denaturing conditions.
  • a Western blot of the samples separated from 15% SDS-PAGE by Wüdtype TNF and the scTNF variants scTNF3x and scTNF4x was performed.
  • Two separate approaches were carried out in which the samples were incubated in each batch with ⁇ -mercaptoethanol (final 5%) at 95 ° C. for 5 min, while in the other batch no ⁇ -mercaptoethanol incubation took place.
  • the Detection after the course of the electrophoresis was carried out with an anti-TNF antibody.
  • the antibody specifically detected the protein of both scTNF variants in distinct bands at about 50 kDa.
  • the protein was specifically detected at approximately 17 kDa. This in turn confirms the stability of the inventive scTNF3x and scTNF4x variants under reducing and denaturing conditions and, as expected, coincides with the results from FIG. 13.
  • FIG. 15 shows the result of an IkappaB degradation assay.
  • IkappaB is an inhibitor of the transcription factor nuclear factor kappa B (NF- ⁇ B), which is known to be degraded by TNF, thereby activating NF- ⁇ B.
  • NF- ⁇ B transcription factor nuclear factor kappa B
  • ZeU lysates were produced 0, 30 and 60 minutes after stimulation with 10 ng / ml each of Wüd type TNF, scTNF3x and scTNF4x and subsequently analyzed in the Western blot with I- ⁇ B-specific antibodies.
  • tran- sient degradation of I- ⁇ B was induced by both wild-type TNF and by both scTNF variants, with the reaction behavior of the scTNF variants corresponding to that of the wild-type TNF.
  • the controU bacterial lysate used as a negative control (as described above, a non-scTNF expatriate bacterial lysate that was processed identically to the recombinant scTNF proteins) was expected to show no effect on I- ⁇ B degradation.
  • FIG 16 shows the result of a JNK assay.
  • JNK c-jun N-terminal kinase
  • TNF TNF-induced kinase
  • FIG. 17 shows the result of an Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).
  • ESA Electrophoretic Mobility Shift Assay
  • the nuclear translocated transcription factor NF- ⁇ B was detected with hooves of NF-B-specific radioactively labeled oligonucleotides. The result shows that NF- ⁇ B has been translocated into the cell nucleus.
  • the reaction behavior of the scTNF variants corresponds to that of the Wüd type TNF.
  • FIG. 18 shows an exemplary construct schematic of the polypeptides according to the invention, depicting TNF (as a member of the TNF ligand family).
  • the names have the following meanings:
  • the constructs AI / AII and BI / II have optimized codon expression for expression of the proteins in E. coli, and are molecules linked to GlyGlyGlySer triple linkers and quadruple linkers, respectively.
  • a ⁇ e. Molecules carry a histidine tag N-terminal for easier purification, and the molecules BI / BII additionally carry a short amino acid chain with a cysteine residue for directional covalent linkage.
  • constructs C to H are suitable for the expression of the proteins in eukaryotic cells, they carry N-terminally corresponding lead peptide sequences.
  • cys denotes an N-terminal peptide linker with internal cysteine for covalent coupling
  • Ll and L2 jong long denotes the linker 1 or 2, with the jeweüs Arninoklaresequenz (GGGS-GGGS-GGGS) or (GGGS) 4>
  • Ll short or L2 short denotes the linkers 1 and 2, respectively, with the amino acid sequence (GGGS-GGGS-GGGS) or (GGGS) 3>
  • Lead peptide sequence is the amino acid sequence for the secretion of the protein from eukaryotic (host) cells.
  • scFv40 represents the sequence of the single chain (scFv) antibody fragment 40 which is specific for the tumor stroma antigen FAP,
  • AMAIZe is the abbreviation for "Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Cytokines"
  • His / Flag-Tag represents the peptide sequence for the affinity purification of the expressed proteins
  • Figure 19 shows the nucleic acid sequence and the corresponding amino acid sequence of scTNF-L sh0 "(construct A-II) features construct A-II
  • His-tag peptide sequence for affinity purification of the protein being produced amino acids (hereinafter abbreviated to "AA” in Figs. 19 to 26) AA 5-10, nucleotide (hereinafter abbreviated to "NT” in Figs. 19 to 26) NT 13-30
  • FIG. 20 shows the nucleic acid sequence and the corresponding amino acid sequence of cys-scTNF-L short (construct B-II) Features construct B-II • amino acid Cys .ein for covalent coupling: AA 9, NT 25-27
  • His-tag peptide sequence for the affinity purification of the protein being produced AA 15-20, NT 43-60
  • FIG. 21 shows the nucleic acid sequence and the corresponding amino acid sequence of scFasL (construct C) Characteristics construct C
  • Lead peptide sequence for secretion of the protein in eukaryotic cells AAl-15, NT 1-45
  • Flag tag peptide sequence for affinity purification of the protein being formed AA 19-26, NT 55-78
  • Figure 22 shows the nucleic acid sequence and the corresponding amino acid sequence of scTRAIL (construct D) construct D constructs
  • Lead peptide sequence for secretion of the protein in eukaryotic cells AA 1-15, NT 1-45
  • Flag tag peptide sequence for affinity purification of the protein being formed AA 19-26, NT 55-78
  • Figure 23 shows the nucleic acid sequence and the corresponding amino acid sequence of scTNF (Construct E) Characteristics Construct E
  • Lead peptide sequence for secretion of the protein in eukaryotic cells AA 1-15, NT 1-45
  • Flag Tag peptide sequence for affinity purification of the protein being formed :: AA 19-26, NT 55-78
  • Figure 24 shows the nucleic acid sequence and the corresponding amino acid sequence of scFasL-AMAlZe (Construct F) Features construct F
  • Flag day peptide sequence for affinity purification of the protein being formed AA278-285, NT 832-855
  • Figure 25 shows the nucleic acid sequence and the corresponding amino acid sequence of scTRAlL-AMAIZe (Construct G) Characteristics construct G
  • Lead peptide sequence for secretion of the protein in eukaryotic cells AA 1-19, NT 1-57
  • scFv single chain antibody fragment 40 specific for the tumor stroma antigen FAP: AA 20-267, NT 58-801
  • Flag day peptide sequence for affinity purification of the protein being formed AA278-285, NT 832-855
  • Figure 26 shows the nucleic acid sequence and the corresponding amino acid sequence of scTNF-AMAlZe (Construct H) Characteristics Construct H
  • Lead peptide sequence for secretion of the protein in eukaryotic cells AA 1-19, NT 1-57
  • Sequence of single chain (scFv) antibody fragment 40 specific for tumor stromal antigen FAP AN 20-267, NT 58-801
  • Flag tag peptide sequence for affinity purification of the protein being formed :: AA 278-285, NT 832-855
  • Figure 27 shows the pharmacology of human type TFT and human scTNF (see Example 2).
  • the data in Figure 27 show a clear increase in the in vivo half-life of the scTNF variants.
  • scTNF a significantly increased expected in vivo, thus underscoring the value of scTNF, in particular of scTNF-L 2 , as a potential ap erapeutikum.
  • Figure 28 shows CysHis scTNF covalently coupled to particles (Sosa). This covalently coupled CysHis scTNF is bioactive and has the particular activity of membrane-borne TNF, i. it activates TNFR2.
  • Figure 28 shows that cells from mouse fibroblasts transfected with construct TNFR2-Fas and treated with serial dilutions of the indicated reagents are completely resistant to soluble wtTNF. After covalent coupling of reduced CysHis-scTNF to pacemakers (eta) according to etab-protected protocols (DPA 2001, No.
  • the PCR product was purified on an agarose gel and eluted and subsequently digested with the respective restriction enzymes (see specifications) in a 40 ⁇ l reaction mixture at optimal cleavage temperature (to be specified by the manufacturer) for 2 hours.
  • scTNF Two variants of scTNF were produced, which differ in the length of the peptide linker between the individual modules.
  • Primers with 4 -fold or 3-fold peptide-linker sequence were used: Left ion with (GGGS) 4 or I_inker sIl0rt with (GGGS) 3 sequence.
  • the constructs generated thus contained either only two quadruple linkers (L1 or L2 with (GGGS) 4 - referred to as "long") or only two 3-times left (L1 or L2 with (GGGS) 3 - designated "short").
  • a standard PCR was carried out with the primers V and I or II (for Iinker long ) and the pQE-9 vector with a TNF module (pQE9-HisTNF) as template.
  • the vector carries a His tag sequence for later affinity purification of the protein produced.
  • the resulting PCR product I was subsequently digested with 20 U of the respective restriction enzymes StuI and HindIII at 37.degree. The same digestion and a dephosphorylation reaction were carried out with the pQE9-HisTNF vector and the PCR product I was introduced by ligation into the pQE9-HisTNF vector. The result of this step was a His tag - TNF modulus with a linker l shortb2V long . or the following construct in the pQE9 vector: EcoRI-His Tag - TNF Modull-Linke_l shortb2w . Iong - BamHI 3.
  • the PCR product II was generated by means of another PCR with the primers III and I or II (for Iinker long ) and the pQE9-HisTNF vector as template.
  • the PCR product II was subsequently cut with each 20 U of the restriction enzymes EcoRI and HindIII and inserted into the pQE9-HisTNF vector cut with the same enzymes and dephosphorylated.
  • the result of this cloning was a pQE9 vector, which looked like this: TNF Modul2-Linke_2 shortb2w . long - BamHI This construct does not carry a sequence for a His tag before the TNF sequence.
  • the cloned PCR product II from step 3 was first cut out of the vector with the restriction enzyme Hind III and subsequently with BamHI (1 U / ⁇ g DNA).
  • the pQE9-His tag TNF modulus linker l short bz _. long vector was also cut with the restriction enzymes BamHI and HindIII sequentially, dephosphorylated and the PCR product II transformed into this vector.
  • Result was a pQE9 vector with the following construct: His tag - TNF modulus linker shortb2w long -TNF modulus2 -Li__ke_2 8hortb2w . long .
  • step 6 the pBluescript SKII vector containing the TNF module 3 was cut with the restriction enzyme XbaI, then this vector was treated with the Klenow fragment of DNA polymerase I from E. coU to give a "ful After this step, a second restriction digestion with the enzyme BamHI was performed under standard conditions with additional dephosphorylation. 8. The fragment from step 6 obtained by the restriction digest was subsequently ligated in the linear vector generated in step 7.
  • the reverse endogenous TNF construct from step 8 was excised from the pBluescript SKII vector with the restriction enzymes EcoRI and HindIII and subjected to the same enzymes and dephosphorylated pQE9-HisTNF vector. This resulted in the following construct with the correct scTNF in the correct orientation: EcoRI His tag TNF Modull-Li ⁇ _ke_l shortb2w . long -TNF Modul2- Li_ ⁇ ker2 shortb2w long - TNF ModuB- Hindlll
  • a scTNF with an N-terminal cysteine the OUgos cys-scTNF VI and VII were annealed (20 ⁇ l 100 ⁇ M OUgo VI and VII, respectively, were heated together at 95 ° C for 5 min and allowed to cool slowly to room temperature) and so on OUgo 1 was raised.
  • the construct of item 9 was digested with the restriction enzymes EcoRI and Bbsl, and the OUgol, which has the same cutting sites, was inserted into the vector.
  • the cysteine was inserted via PCR mutagenesis.
  • Expression was carried out in E.coU strain XL-1 blue. Purification of the expressed scTNF variants was carried out by hoof chromatographic methods (His Tag affinitase and anion exchange chromatography).
  • the construct was cloned into the pcDNA3-HA sequence vector digested with the same enzymes via the Notl and Xbal restriction cut sections, so that the following Constructs: HA Sequence - Flag Tag - FasL Modull - Linkerl - BamHI - Xbal
  • the pcDNA3 vector from point 2 was digested with BamHI, these sections were filled with the Klenow enzyme and subsequently cut with XbaI to form a "blund end" and a "sticky end”.
  • the PCR product 2 was subsequently cloned into this modified vector, resulting in the following construct: HA Sequence - Flag Tag - FasL Modull - Linkerl-Fasl Module 2 - Left_2 - BamHI - XbaI
  • the respective scFasL or scTNF-AMAIZe constructs were digested with the restriction enzymes NotI or EcoRI and XbaI, respectively, and the inserts were inserted as a cassette into the corresponding AMAlZe vectors (see patent application DE 10045591.3) Vectors were also cut with the enzymes Notl or EcoRI and XbaI.
  • the following constructs were produced thereunder:
  • PCR with primer TRAIL # 1 and TRAIL # 2 on template pcDNA3-sc40-TRAIL see patent application DE 10045591.3.
  • PCR product 1 was cut with EcoRI and XbaI. and in the pcDNA3 scFasL vector digested with the same restriction enzymes. This digestion deleted the FasL sequence, resulting in the HA and flag tag sequences obtained from bUeb and now the following construct: HA sequence - Flag tag - TRAIL module - Linkerl- BamHI - Xbal 2.
  • TRAIL module 3 For the cloning of the TRAIL module 3, a PCR was carried out with the primers TRAIL # 4 and TRAIL # 5 on the template TRAIL-AMAlze, the product subsequently digested with BamHI and XbaI and into the construct from point 2 - likewise with BamHI and Xbal Digested - Moniert, resulting in the following construct: HA Sequence - Flag Tag - TRAIL Modull - Linkerl - TRAIL Module2 - Left_2 - TRAIL ModuB Stop - Xbal
  • the particular scTRAIL vectors were digested with the restriction enzymes Notl or EcoRI and XbaI and the inserts as a cassette in the corresponding AMAlZe vectors (see patent application DE 10045591.3), these vectors also with the enzymes Notl or EcoRI and XbaI were cut.
  • the following constructs were produced thereunder:
  • Example 2 Phamiakokinetics of human type TNF and human scTNF.
  • Example 3 CysHis scTNF covalently coupled to particles (Sosa).
  • Example 4 Comparison of standard recombinant human (rh) TNF and scTNF in in vivo tumor necrosis mode and in vitro L929 cytotoxicity activity
  • mice C3H / HeJ (female), 17-19 g from Charles River
  • Tumor ZeUen CFS-1 methylcholanthrene-induced fibrosarcomaUnion derived from mouse C3H / HeN (Reference: Hafner M., P. Orosz, A. Krüger, and DN bellennel 1996. TNF promotes metastasis by im.pairing natural küler ceü activity J. Cancer 66: 388-392);
  • mice received 1.6 x 10 7 CFS-1 cells in 50 ⁇ l of medium (RPMI, 10% FCS) intradermally in the back; The tumors were allowed to grow for 12 days until they reached a size of about 5-6 mm in diameter, before intertaperitoneal injection with TNF (10 ⁇ g per mouse), 200 ⁇ l PBS or PBS alone as a control. Tumor size was measured daily and examined macroscopically. The mice were sacrificed on the 6th day after treatment and the tumors for histology were removed. The tumors were excised, fixed overnight in 4% PBS-buffered formalin and embedded in paraffin.
  • medium RPMI, 10% FCS
  • Equatorial vertices (4 ⁇ m) were stained with hematoxin and eosin and examined microscopically for necrosis (as described, for example, in: Lucas R et al., 2001, Int J Cancer, 91: 543-549).
  • TNF rhTNF specific activity 6.6 x 10 6 U / mg (48 h L929 assay without Act D) scTNF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, welche mindestens drei Monomere eines Mitglieds der TNF-Ligandenfamilie als Komponenten A und mindestens zwei Peptid-Linker als Komponenten B umfassen, wobei die Peptid-Linker die Monomere des Mitglieds der TNF-Ligandenfamilie miteinander verknüpfen. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfin­dung die Verwendung dieser Polypeptide zur Behandlung von Erkrankungen, zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Vakzine. Darüber hinaus betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung und Isolierung dieser Polypeptide sowie für die Polypeptide codierende Nuklein­säuren, diese enthaltende Vektoren, mit diesem transfizierte Wirtszellen und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese genannten Erfindungsgegenstände enthalten. Schliesslich betrifft die Erfindung Verfahren zur extrakorporalen Manipulation, Depletion und/oder Ent­fernung von in Körperflüssigkeiten enthaltenen Bestandteilen, z.B. mittels Apherese.

Description

Anmeldet: Universität Stuttgart 70049 Stuttgart
Rekombinante Polypeptide der Mitglieder der TNF Ligandenfamilie und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, welche mindestens drei Monomere eines Mitglieds der TNF-Ligandenfamilie als Komponente A und mindestens zwei Peptid-Liαker als Komponenten B umfassen, wobei die Peptid-Linker die Monomere des Mitglieds der TNF-Ligandenfamilie miteinander verknüpfen. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfin- düng die Verwendung dieser Polypeptide zur Behandlung von Erkrankungen, zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Vakzine. Darüber hinaus betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung und Isolierung dieser Polypeptide sowie für die Polypeptide codierende Nukleinsäuren, diese enthaltende Vektoren, mit diesen transfizierte Wirtszellen und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die genannten Erfindungsgegenstände enthalten. Schließlich betrifft die Erfindung Verfahren zur exttakorporalen Manipulation, Depletion und/oder Entfernung von in Körperflüssigkeiten enthaltenen Bestandteilen, z.B. mittels Apherese.
Bei den Mitgliedern der TNF-I_igandenfamilie handelt es sich um proinflammatorische Zyto- kine. Zytokine im allgemeinen und insbesondere die Mitglieder der TNF-__igandenfa_nilie spielen eine wichtige Rolle bei der Stimulation und Koordination des angeborenen Immunsystems sowie der humoralen (Antikörper-vermittelten) Immunantwort, der Induktion von Apoptose, dem Aufbau von Knochen, der Ausbildung der Anlagen für Haarwuchs, Zahnwuchs und Schweißclrüsenentwicklung, der Anlage von Lymphknoten und vielem mehr (Ag- garwal, B.B. (2003), Nat. Rev. Immunol. 3, 745-756). Eine fehlerhafte Regulierung von Mit- gliedern der TNF-Ligandenfamilie kann dagegen zu zahlreichen pathologischen Zuständen führen. Hierzu gehört bspw. der septische Schock, Autoimmuner__rankungen, wie Rheuma- toide Arthritis, oder neurodegenerative Erkrankungen. Der Tumor-Nekose-Faktor (TNF) ist das namensgebende und wohl wichtigste Mitglied dieser großen Zyto___nfamilie.
Ihre Wirkung entfalten die Mitglieder der TNF-lligandenfamilie in ihrer biologisch aktiven Form als Homotrimere (Banner, D.W. et al., (1993) Cell 73, 431-445). Trimere Strukturen und auch Aggregationen höherer Ordnung (z.B. Oligo- oder Multimere von Trimeren) von Proteinen sind in der Natur zahlreich anzutreffen. Beispiele sind das Cartilage Matrix Protein (CMP), ein Bindegewebsprotein (Beck et al. (1996), J Mol Biol 256, 909-923), Proteine aus der KoHagenfamilie, wie die Clq-Familie, zu der Clq, Kollagen αl (X), α2 (VII), das Überwinterungsprotein, ACRP30, das innere Ohrstrukturprotein, Cellebrin und Multimerin gehören (Kishore und Reid, (1999), Immunopharmacol. 42, 15-21), und Proteine der Collectin- Familie, wie das Lung Surfactant Protein A (SP-A) und das Mannose-Bindungsprotein (MBP) (Epstein et al. (1996), Current Opinion in Immunology, Vol 8 Nr.l, 29-35).
Die Zusammenlagerung von Proteinen zu einem Trimer erfolgt an den Oberflächen dieser in Lösung trimerisierenden Proteine aufgrund von Wechselwirkungen, wie hydrophoben Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, kovalenten Bindungen (z.B. Disulfidbrücken), und/oder Coulomb-Kräften, aber auch aufgrund von Sttukturmotiven, d.h. charakteristi- sehen Aminosäuresequenzen, die eine Formation von intermolekularen Supersekundärstrukturen bewirken. Bei den Mitgliedern der TNF-πgandenfamilie werden die drei Monomere in der hotnotrimeren Struktur nicht-kovalent über hydrophobe Bindungen zusammengehalten. In ihrer aktivierten Form aktivieren sie wiederum ihnen gegenüberstehende Mitglieder der TNF-Rezeptorfamilie, die als solche keine enzymatische Aktivität besitzen. Beispielsweise bindet TNF als ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie an die zwei Membranrezeptoren TNFR1 und TNFR2 und vermittelt die Trimerisierung bzw. die Aktivierung bereits trimer- vorliegender, aber Signal-inaktiver Rezeptoren. Durch die Komplexbildung der Rezeptoren wird eine Signalkaskade eingeleitet, mit der u.a. eine Assoziation zytoplasmatischer Adapterproteine einhergeht (Wajant, H. et al (2003), Cell Death, Differ, 10, 45-65). Die trimere Struk- tur von TNFR1 und TNFR2 stellt sich derart dar, daß die Rezeptoren jeweils im Zwischenraum zwischen zwei der drei TNF-Monomere des TNF-Homotrimers binden (Banner et al. (1993) suprά). Hieraus wird deutlich, dass sowohl TNF als auch die anderen Mitglieder der TNF Ligandenfamilie nur in seiner/ihrer Struktur als Homotrimer biologisch aktiv ist/sind.
Aufgrund ihrer Funktion können die Mitglieder der TNF-_ igandenfamilie bzw. deren Memb- ranrezeptoren mannigfaltig zur Behandlung zahlreicher Erkrankungen, wie Infektions- und Endzündungskrankheiten, Stoffwechselerkrankungen, Erkrankungen, die in einer fehlerhaften Regulierung der Apoptose begründet sind, neutodegenerative Erkrankungen und vielen weiteren Erkrankungen, eingesetzt werden. Eine besonders wichtige Rolle spielt ihr Einsatz bei der Behandlung von Kcebserkrankungen, da es sich bei den Mitgliedern der TNF- Ligandenfamilie generell um antitumoral wirkende Substanzen handelt. Insbesondere zu erwähnen sind in diesem Zusammenhang TNF selbst (Eggermont, A.M. and ten Hagen, T.L. (2003), Curr. Oncol. Rep. 5, 79-80), TRAIL (TNF releated apoptoses inducing ligand), auch Apo 2L genannt (Weley et al. (1995), Immunity 6: 673-682; Petti et al. (1996) J Biol Chem 271: 12687-12689) und FasL. In vivo Untersuchungen zeigten jedoch starke systemische Ne- benwirkungen bei TNF und Agonisten des Fas Rezeptors und in vitro Untersuchungen deuten auch auf ähnliche toxische Wirkungen bei bestimmten TRAIL Präparaten hin (Jo et al. (2000) Nat Med 6: 564-567, Ichikawa et al. (2001) Nat Med 7: 954-960; Ogasawara et al. (1993) Nature 364: 806-809). Beispielsweise zeigten agonistische Antikörper gegen Fas, den Rezeptor von FasL, eine extrem hepatoxische Wirkung (Ogasawara et al. (1993) suprά). Im Falle von Fas aktivierenden liganden/Agonisten wurde deshalb eine klinische Anwendung aus Sicherheitsgründen bisher ausgeschlossen. Aufgrund der großen Bedeutung von TNF, TRAIL, FasL und anderer TNF-Ligandenfamilienmitghedern auf diesem Gebiet und der mit ihrer Applikation in Form einer klinischen systemischen Verabreichung einhergehenden Nebenwirkungen wurden allerdings mehrere Ansätze verfolgt, diese Nebenwirkungen zu mini- mieren. (Eggermont, A.M. and ten Hagen, TL. (2003), Curr. Oncol. Rep. 5, 79-80).
So beschreibt beispielsweise WO 02/22680 Fusionsproteine, die eine gerichtete und gewebs- bzw. zellspezifische Wirkung von Zytokinen durch die Fusion des Zytokins mit einem Anti- gen-bindenden Antikörper ermöglichen. Auf diese Weise wird erreicht, dass die Zytokine auf Gewebe bzw. Zellen, die mit diesen Fusionsproteinen nicht in Kontakt kommen, keine Wirkung entfalten und dass Nebenwirkungen auf diese Gewebe oder Zellen verringert werden. In der DE 102 47 755 wird ein Antikörper-unabhängiges System offenbart, welches ebenfalls eine gerichtete und gewebs- bzw. zellspezifische Wirkung der Zytokine ermöglicht. Es handelt sich hier um Fusionsproteine, bei denen die Aktivierung eines darin enthaltenen Proteinabschnitts mit biologischer Funktion über dessen Bindung an eine ZeUoberflächenmolekül- Bindungsdomäne, die einen weiteren Proteinabschnitt des Fusionsproteins darstellt, erfolgt. Neben einer Verringerung von Nebenwirkungen auf Nicht-Zielgewebe kann dieses System vorteilhafterweise auch für ZeUoberflächenmoleküle auf den Zielzellen, für die keine Antikörper bzw. Antikörper mit zu geringer Spezifität vorhanden sind, eingesetzt werden.
Neben den erwähnten Nebenwirkungen ist jedoch ebenfalls die Tatsache äußerst problematisch, daß die aktiven Homottimere der Mitglieder der TNF-Iigandenfamilie in Verdünnungen, und das heißt auch bei physiologisch sinnvollen Konzentrationen, dissoziieren. Diese Dissoziation ist zwar grundsätzlich reversibel, jedoch verliert das Protein rasch seine Bioaktivität, da es denaturiert. Es wird angenommen, dass diese Denaturierung über die Stufe der instabilen Monomere erfolgt (Smith,R.A. and Baglioni, C. (1987), J. Biol. Chem. 262, 6951- 6954; Narhi, L.O. and Arakawa, T. (1987), Biochem. Biophys. Res. Commun 147, 740-746).
Aufgrund entsprechender Beobachtungen bei TRAIL, welches eine besondere Labilität aufweist, wurde versucht, eine Stabilität des Proteins durch Anfügen eines Leucin-Zippers als Trimetisierungsmodul zu überkommen (Cha, S.S. et al., (1999), Immunity. 11, 253-261). Im natürlichen Zustand wird TRAIL durch ein Zink-Ion stabilisiert, welches im Zentrum des trύneren Liganden sitzt, und welches durch Cystein-Reste koordiniert wird (Hymowitz, S.G. et al. (2000), Biochemistry 39, 633-640). Nachteilig kann hier jedoch sein, dass durch das Anfügen des Leucin-Zippers nicht nur erhöhte Stabilität erreicht wird, sondern auch andere Ei- genschaften, z.B. Struktureigenschaften, wie Strukturveränderungen, Aktivitätsrate oder physiologische Eigenschaften, beeinträchtigt werden könnten.
Es besteht daher ein Bedarf, die Stabilität aktiver Zytokine, insbesondere Mitglieder der TNF- I_igandenfamilie, zu erhöhen, ohne dass deren natürliche Eigenschaften durch eine Änderung ihrer Struktur nachteilig beeinflusst werden, und ohne daß sie starke zytotoxische oder andere Nebenwirkungen bei therapeutischen Anwendungen zeigen. Im Stand der Technik sind keine Systeme bekannt, die dies erreichen, d.h., durch welche die Mitglieder der TNF-I igandenfamilie in einer aktiven und stabilen Form bereitgestellt werden, die ohne die vorgenannten Nachteile selbst oder als biologisch aktive Komponente komplexer Fusionsproteine zur therapeutischen Anwendung geeignet sind.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein System bereitzustellen, durch das die Stabilität der Mitglieder der TNF-Ligandenfamilie erhöht wird.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausfuhrungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst. Insbesondere wird diese Aufgabe durch den Gegenstand des Anspruchs 1 gelöst, nämlich durch die Bereitstellung eines Polypeptids, das mindestens drei Komponenten A und mindestens zwei Komponenten B umfasst, wobei jede Komponente A ein Monomer eines Mitglieds der TNF-Ligandenfamilie oder ein funktionelles Fragment, und/oder eine funktionelle Variante hiervon ist und jede Komponente B ein Peptid-Linker ist.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß natürlich vorkommende lösliche Zytottinmitglieder der TNF-Ligandenfamilie ihre volle Bioaktivität lediglich als Ho- motrimere entfalten, aber auf der anderen Seite dazu neigen, über Dissoziation in ihre Mo- nomere zu denaturieren.
Es gilt daher, diese Dissoziation der Homottimere in Monomere zu unterbinden. Erfindungsgemäß wurde dies erreicht, indem mindestens drei Monomere eines Mitglieds der TNF- ligandenfamilie, insbesondere TNF, über ihre C- und N-Terrnini mittels kurzer Peptid- Linker kovalent miteinander verbunden wurden zu einem „single chain" -Molekül (nachfolgend „sc"), insbesondere zu einem scTNF. Erfindungsgemäß besteht demnach das gesamte Molekül (mindestens drei Monomere eines Mitglieds der TNF-Ligandenfamilie mit den zwei Peptid-Iinkern) aus einem einzigen Proteinstrang, so dass eine Dissoziation in die Monomere nicht mehr erfolgen kann. Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, dass derartig erfindungs- gemäße Moleküle im Vergleich zu ihren entsprechenden löslichen Wildtyp-Mitgliedern der TNF-I_igandenfamilie einen sehr geringen Verlust in ihrer Bioaktivität aufweisen. Es wurde im Gegenteil erfindungsgemäß nicht nur nachgewiesen, dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung dieselben (qualitativen) Aktivitäten aufweisen wie ihr entsprechendes lösliches Wildtyp Mitglied der TNF-__igandenfamiüe, sondern auch, dass sie aufgrund ihrer erheblich höheren Stabilität auch zu einem Zeitpunkt noch Bioaktivitäten aufweisen, zu dem das lösliche Wildtyp Mitglied der TNF-Ligandenfamilie seine Aktivität bereits verloren hat, d.h. dis- soziiert bzw. denaturiert ist (hierzu wird auf die nachfolgend beschriebenen verschiedenen Stabilitätstests verwiesen, welche in den Beispielen sowie in den Figuren beschrieben werden).
Unter einem „löslichen Wildtyp-Mitglied der TNF-Ligandenfamilie" ist ein löslicher extrazellulärer Abschnitt eines membranständigen Mitglieds der TNF-Ligandenfamilie zu verstehen. Nachfolgend werden synonym zu dem Begriff „löslicher/n/s Wildtyp" die Ausdrücke „Wildtyp", „wt", „löslich" und „s" (für „soluble") verwendet. Insbesondere kann es sich um lösliches Wildtyp TNF (als ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie) handeln, für das entsprechend nachfolgend die synonymen Begriffe „Wildtyp TNF", „wtTNF", lösliches TNF und „sTNF" verwendet werden.
Eine Komponente A im Sinne der Erfindung ist ein Monomer eines Mitglieds der TNF- I_igandenfamilie oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon. Unter einem „Monomer" ist die kleinste Protein- oder Polypeptideinheit zu verstehen, die von einem oligomeren Protein ohne Trennung kovalenter Bindungen separiert werden kann.
Ein Polypeptid oder eine Komponente A oder ein Fragment oder eine Variante hiervon sind im Sinne der Erfindung funktionell, sofern es/sie seine/ihre biologische Aktivität bzw. Funktion aufweist, insbesondere seine/ihre Bindungseigenschaft an einen Interaktionspartner, z.B. einen membranständigen Rezeptor, und auch seine/ihre Trimeήsierungseigenschaft. Bei den funktioneUen Fragmenten und den funktioneUen Varianten der Erfindung können diese biologischen Funktionen zwar verändert sein, z.B. hinsichtlich ihrer Spezifität oder Selektivität, die grundsätzUche biologische Funktion wird jedoch beibehalten.
Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren zur Messung der biologischen Aktivität eines Proteins, Polypeptids bzw. Moleküls bekannt, bspw. Protein-Assays, die markierte Substrate verwenden, Substratanalysen durch chromatographische Verfahren, wie HPLC oder Dünnschicht-Chromatographie, spektrophotometrische Verfahren etc. (siehe z.B. Maniatis et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY).
Unter einem Fragment im Sinne der Erfindung ist sowohl ein Fragment eines Monomers eines MitgUeds der TNF-Ligandenfamüie als auch ein Fragment eines Polypeptids bzw. Proteins der vorHegenden Erfindung zu verstehen. Es kann sich hierbei um N-terminal, C- terminal oder intrasequentieU verkürzte Aminosäuresequenzen des Monomers, Polypeptids bzw. Proteins handeln. Insbesondere bei intrasequentieUen Verkürzungen des Polypeptids bzw. Proteins kann es sich um Verkürzungen der Sequenz eines oder mehrerer der drei Mo- nomere handeln, die wiederum N-terminal, C-terminal oder intrasequentieU auftreten können.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsfortn der Erfindung steUt das Fragment eines Monomers dessen extrazeUuläre Domäne dar, die der gesamten extrazeUulären Domäne des löslichen Wildtyp Mitglieds der TNF-LigandenfamiUe oder einem Abschnitt hiervon ent- spricht. Insbesondere steUt das Fragment eines Monomers dessen extrazeUuläre Domäne dar, die entweder dem lösHchen Wildtyp TNF (Aminosäuren 77-233) oder der gesamten extrazellulären Domäne (Aminosäuren 53 — 233) entspricht.
Die HersteUung solcher erfindungsgemäßer Fragmente ist im Stand der Technik gut bekannt und kann von einem Fachmann unter Anwendung von Standardverfahren durchgeführt werden (siehe z.B. Maniatis et al. (2001), Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press). Im allgemeinen kann die HersteUung von Fragmenten der Monomere, Polypeptide bzw. Proteine durch Modifizieren der DNA-Sequenz, die das native Monomer, Polypeptid bzw. Protein codiert, gefolgt von einer Transformation dieser DNA- Sequenz in einen geeigneten Wirt und Expression dieser modifizierten DNA-Sequenz, unter der Voraussetzung, daß die Modifikation der DNA die funktioneUen Aktivitäten des Monomere, Polypeptids bzw. Proteins nicht zerstört, durchgeführt werden.
Die Identifizierung eines erfindungsgemäßen Fragments kann entweder über die Überprü- fung seiner Funktionalität durch Messung seiner biologischen Aktivität erfolgen, wie oben beschrieben, oder auch anhand einer Sequenzierung des Fragments und einem nachfolgenden Vergleich der erhaltenen Sequenz mit der nativen Sequenz. Die Sequenzierung kann anhand von Standardverfahren, die im Stand der Technik zahlreich und gut bekannt sind, erfolgen.
Als Varianten von biologisch aktiven Monomeren, Polypeptiden bzw. Proteinen oder Frag- menten hiervon oder einer Komponente A im Sinne der Erfindung werden insbesondere solche Monomere, Polypeptide bzw. Proteine oder Fragmente hiervon bezeichnet, welche Sequenzunterschiede zu den entsprechenden nativen Sequenzen aufweisen. Bei diesen Sequenzabweichungen kann es sich um eine oder mehrere Insertion(en), Deletion(en) und/oder Substitutionen) von Aminosäuren handeln, wobei eine Sequenzhomologie von mindestens 60%, bevorzugt 70%, stärker bevorzugt 80%, ebenfaUs stärker bevorzugt 85%, noch stärker bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 97% vorhegt.
Um die prozentuale Identität zweier Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen zu bestimmen, können die Sequenzen abgegnchen werden, um nachfolgend miteinander verglichen zu werden. Hierfür können z.B. Lücken in die Sequenz der ersten Aminosäure- bzw. Nuklein- säuresequenz eingeführt werden und die Aminosäuren bzw. Nükleotide an der entsprechenden Position der zweiten Arninosäure- bzw. Nukleinsäuresequenz vergUchen werden. Wenn eine Position in der ersten Aminosäuresequenz mit der gleichen Aminosäure bzw. dem gleichen Nukleotid besetzt ist, wie es an einer Position in der zweiten Sequenz der FaU ist, dann sind beide Sequenzen an dieser Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen geteüt durch die Sequenzen.
Die Bestimmung der prozentualen Identität zweier Sequenzen kann anhand eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes, jedoch nicht beschränkendes, Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich zweier Sequenzen herangezogen werden kann, ist der Algorithmus von Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873- 5877. Ein solcher Algorithmus ist in dem NBLAST-Programm integriert, mit dem Sequenzen identifiziert werden können, die eine gewünschte Identität zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung besitzen. Um einen Lücken-Abgleich (auch "gapped aHgnment"), wie oben beschrieben, zu erhalten, kann das "Gapped BLAST"-Programm verwendet werden, wie in Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 beschrieben. Biologisch aktive, also funktioneUe, Varianten von Monomeren, Polypeptiden bzw. Proteinen oder Fragmenten hiervon im Sinne der Erfindung, können vorzugsweise selektive Rezeptorbindungseigenschaften aufweisen, wobei die Variante z.B. hinsichtlich ihrer spezifischen Bioaktivität oder anderer Eigenschaften, insbesondere ihrer Stabilität, optimiert sein kann.
Unter den Begriff Varianten faUen insbesondere solche Aminosäuresequenzen, die gegenüber den physiologischen Sequenzen konservative Substitution aufweisen. Als konservative Substitutionen werden solche Substitutionen bezeichnet, bei denen Aminosäuren gegeneinander ausgetauscht werden, die aus der gleichen Klasse stammen. Insbesondere gibt es Aminosäu- ren mit aUphatischen Seitenketten, positiv oder negativ geladenen Seitenketten, aromatischen Gruppen in der Seitenketten oder Aininosäuren, deren Seitenketten Wasserstoffbrücken eingehen können, bspw. Seitenketten, die eine Hydtoxyfunktion besitzen. Das bedeutet, daß bspw. eine Aminosäure mit einer polaren Seitenkette durch eine andere Aminosäure mit einer gleichfalls polaren Seitenkette ersetzt wird oder beispielsweise eine durch eine hydrophobe Seitenkette gekennzeichnete Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit gleichfaUs hydrophober Seitenkette substituiert wird (z.B. Serin (Threonin) durch Threonin (Serin) bzw. Leucin (Isoleucin) durch Isoleucin (Leucin)). Insertionen und Substitutionen sind insbesondere an solchen Sequenzpositionen möglich, die keine Veränderung der dreidimensionalen Struktur hervorrufen oder den Bindungsbereich betreffen. Eine Veränderung einer dreidi- mensionalen Struktur durch Insertion(en) oder Deletion(en) ist bspw. mit Hufe von CD- Spektren (Zirkulardichroismus-Spektren) leicht überprüfbar (Urry, 1985, Absorption, circukr Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neu- berger et al. (Hrgb.), Elsevier, Amsterdam).
Geeignete Verfahren zur HersteUung von Varianten, z.B. von Monomeren, Polypeptiden bzw. Proteinen oder Fragmenten hiervon mit Aminosäuresequenzen, die gegenüber der (den) nativen Sequenzen Substitutionen aufweisen, werden bspw. in den Druckschriften US 4,737,462, US 4,588,585, US 4,959,314, US 5,116,943, US 4,879,111 und US 5,017,691 offenbart. Die HersteUung von Varianten im allgemeinen wird insbesondere auch von Maniatis et al, (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Es können hierbei Codons weggelassen, ergänzt oder ausgetauscht werden. Varianten können insbesondere auch solche Proteine oder Polypeptide sein, die stabilisiert sind, um der physiologischen Degradation zu entgehen, bspw. durch Stabilisierung des Proteinrückgrats durch Substitution der amidartigen Bindung, bspw. auch durch den Einsatz von ß- Aminosäuren.
Varianten im Sinne der Erfindung können ebenfaUs hergesteUt werden, indem in die Nukleinsäuren, welche für die Varianten codieren, Veränderungen eingeführt werden, wie bspw. In- sertionen, Deletionen und/oder Substitutionen einer oder mehrerer Nukleotide. Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren für derartige Veränderungen von Nukleinsäuresequenzen bekannt. Eine der meist verwendeten Technik ist die OUgonukleotid-gerichtete Orts- spezifische Mutagenese (siehe Comack B., Current Protocols in Molecular Biology, 8.01-8.5.9, Ausubel F. et al., Aufl. 1991). Bei dieser Technik wird ein Oligonukleotid synthetisiert, dessen Sequenz eine bestimmte Mutation aufweist. Dieses OUgonukleotid wird dann mit einem Template hybridisiert, das die Wüdtyp-Nukleinsäuresequenz enthält. Bevorzugt wird bei dieser Technik ein einzelsttängiges Template verwendet. Nach dem Annealing von OHgonukleo- tid und Template, wird eine DNA-abhängige DNA-Polymerase eingesetzt, um den zweiten Strang des OUgonukleotids, der komplementär zu dem Template-DNA-Strang ist, zu synthetisieren. Als Ergebnis wird ein Heteroduplex-Molekül erhalten, welches eine Fehlpaarung enthält, die durch die oben erwähnte Mutation in dem OUgonukleotid entsteht. Die OUgo- nukleotidsequenz wird in ein geeignetes Plasmid eingeführt, dieses wird in eine WirtszeUe eingeführt und in dieser WirtszeUe wird die OUgonukleotid-DNA repliziert. Mit dieser Technik erhält man Nukleinsäuresequenzen mit gezielten Veränderungen (Mutationen), welche für die HersteUung von Varianten gemäß der Erfindung verwendet werden können.
Die von dem Polypeptid der Erfindung umfassten Komponenten A können identisch oder verschieden sein, d.h. es kann sich bei den Komponenten A um Monomere desselben Mit- gUeds der TNF-__igandenfamilie oder verschiedener MitgUeder der TNF-I_igandenfa____Ue handeln. Es kann sich beispielsweise bei drei verschiedenen Komponenten A um drei Monomere von drei verschiedenen MitgHedern der TNF-Ligandenfamilie handeln oder um zwei Monomere desselben MitgHeds der TNF-Iigandenfamilie und ein Monomer eines anderen MitgUeds der TNF-LigandenfamiUe. Dies gut für mehr als drei Komponenten A entsprechend. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid 4, 5, 6 oder mehr Komponenten A enthalten, die ein Tetramer, Pentamer, Hexamer, etc. bilden. EbenfaUs besonders be- vorzugt enthält ein erfϊndungsgemäßes Polypeptid ein ganzzahliges Vielfaches eines wie zuvor beschriebenen Trimers der Komponenten A, z.B. zwei, drei, vier, oder mehr hintereinander angeordnete Trimere. Die in erfindungsgemäßen Polypeptiden enthaltenen Komponenten Λ können durch linker voneinander getrennt sein (siehe unten). Sind dabei, wie oben be- schrieben, zwei, drei, vier, oder mehr Trimere der Komponenten A hintereinander angeordnet, so können die Linker, die die verschiedenen Trimere miteinander verbinden, gegebenen- faUs länger sein, als die Linker, die die Komponenten A in einem einzelnen Trimer miteinander verbinden.
Die Komponenten A der Erfindung können aus dem gleichen oder verschiedenen Organismen stammen. Es kann sich hierbei um Vertebraten, insbesondere um Säugetiere, beispielsweise der Maus, der Ratte, dem Schwein und vor aUem dem Menschen, handeln.
In einer bevorzugten Ausfülirungsform der Erfindung handelt es sich bei den Komponenten A des Polypeptids der Erfindung jeweils um ein Monomer eines der MitgUeder der TNF- IligandenfarniUe oder ein funktioneUes Fragment oder eine funktioneUe Variante hiervon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FasL (GenBank Zugriffsnr. NM_000639), TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand; GenBank Zugriffsnr. NM_003810), auch Apo2L genannt, TNF (Tumor Nekrose Faktor; GenBank Zugriffsnr. NM_000594), LT alpha (Gen- Bank Zugriffsnr. NM_000595), Lymphotoxin beta (GenBank Zugriffsnr. NMJ302341). NGF (GenBank Zugriffsnr. NM_002506), CD30L (CD153; GenBank Zugriffsnr. NM_001244), CD40L (CD154; GenBank Zugriffsnr. NM_00074), OX40L (GenBank Zugriffsnr. NM_003326), RANKL (GenBank Zugriffsnr. NM_003701), TWEAKL (GenBank Zugriffsnr. NM_003809), LTalpha, LTbeta, LIGHT (GenBank Zugriffsnr. NM_003807), CD27L (GenBank Zugriffsnr. NMJD01252), 4-1BBL (GenBank Zugriffsnr. NM_003811)„ GITRL (GenBank Zugriffsnr. NM_005092), APRIL (GenBank Zugriffsnr. NM_172089), EDA (GenBank Zugriffsnr. NM_001399), VEGI (GenBank Zugriffsnr. NM_005118) und BAFF (GenBank Zugriffsnr. NM_006573).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der wie oben definierten Komponente A des Polypeptids der Erfindung um ein Monomer eines der MitgUeder der TNF- LigandenfamiUe, das resistent gegen das Prozessierungsenzym TACE ist. TACE ist ein Mitglied der ADAM Protease Famüie und steUt das physiologische TNF-spezifische Prozessierungsenzym des natürUcherweise in der Zellmembran bcfindUchen TNF dar. TNF wird übHcherweise von der Zellmembran abgespalten und in die Umgebung freigesetzt. Einer erfindungsgemäßen, gegen TACE resistenten, Komponente A, fehlt bevorzugt die SpaltsteUe Ala-Val (z.B. AS 76-77 bei scTNF gemäß SWISSPROT Nomenklatur für humanes TNF, No. P01375). Die SpaltsteUe kann dabei erfindungsgemäß durch Deletion einer oder beider relevanten Aminosäuren Ala oder Val entfernt werden. Alternativ oder zusätzUch kann erfindungsgemäß die Erkennungssequenz für TACE (z.B. AS 77-88 bei scTNF gemäß SWISSPROT Nomenklatur für humanes TNF, No. P01375) ganz oder teUweise deletiert werden. Dies erfolgt bevorzugt durch Deletion von zwei, drei, vier oder mehr Aminosäuren, bspw. aUer Aminosäuren der TACE Erkennungssequenz. Für scTNF Hegt beispielsweise die TACE resistente Sequenz im Bereich der Aminosäuren 89-233 (AS 89-233) des scTNF gemäß SWISSPROT Nomenklatur für humanes TNF, No. P01375. Eine solche Deletion in Komponente A verhindert eine potentieUe Spaltung der Komponente A, z.B. scTNF, durch TACE nahe der VerknüpfungssteUen der Komponenten A im Bereich der linker (Komponente B, siehe unten), und erhöht damit die in vivo StabiUtät der erfindungsgemäßen Polypeptide. GegebenenfaUs kann die durch die Deletion entstehende Verkürzung der Sequenz durch eine entsprechende Verlängerung der Linker kompensiert werden. Die beispielhaft für scTNF beschriebene Deletion der Sequenz der Komponente A kann auf jede der oben genannten Komponenten A angewendet werden. SoUte die TACE-Sequenz nicht oder nur teUweise entfernt werden, so wird bevorzugt darauf geachtet, daß bei Verwendung zusätzU- cher Komponenten B oder C (siehe unten) im erfindungsgemäßen Polypeptid die TACE- F_rkennungssequenz und die TACE Spaltstelle nicht wiederhergesteUt werden.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfiihrungsform sind die wie oben definierten Komponenten A des Polypeptids der Erfindung so modifiziert, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide kovalent an Oberflächen koppeln können. Diese Kopplung erfolgt bevorzugt an planaren Oberflächen oder an sphärischen Partikeln, wie z.B. an magnetische Partikel (Magnetbeads), oder an Nanopartikel/MUαopartikel, vorzugsweise als ZeU-mimetisches, therapeutisches Reagenz mit dem membrängebundenem TNF ähnlichen Eigenschaften. Zur Kopplung wird eine Kopplungsgruppe, bevorzugt die SH-Gruppe eines Cysteinrestes, in den N-terminalen Bereich mindestens einer Komponente A eines erfindungsgemäßen Polypeptids eingefül rt. (Weitere erfindungsgemäß bevorzugte Kopplungsgruppen werden weiter unten beschrieben). Dies kann besonders bevorzugt durch Einführen eines Cysteinrestes in Form einer Addition tmd/oder Substitution an der gewünschten Position erfolgen. Die Kopp- lungsgruppe kann sich an jeder Position des N-tertninalen Bereichs der Komponente A befinden, bevorzugt nahe am N-Terminus. Besonders bevorzugt befindet sich die Kopplungsgruppe in einem Bereich der ersten 1-15, und noch stärker bevorzugt in einem Bereich der ersten 1-10 N-terminalen Aminosäuren. Beispielsweise kann die Modifikation bei einem pro- karyotisch exprimierten scTNF nach einem initialen Methionin (Position 2) der Aminosäure- sequenz oder bei einem eukaryotisch exprimierten scTNF direkt nach der abgespaltenen Lea- der-Sequenz eingeführt werden, die also die N-terminalen Aminosäuren der Komponente A darsteUen. Alternativ kann bei einem erfindungsgemäß verwendeten Tag, bspw. einem His- Tag, einem Flag-Tag (siehe z.B. Figur 18) erfindungsgemäß eine Kopplungsgruppe eingeführt werden, z.B. resultierend in einem CysHis-Tag mit einem Cystein an Aminosäureposition 9. Eine weitere Alternative beinhaltet das Einführen einer Kopplungsgruppe in eine bzw. beide Komponenten B (Linker) des erfindungsgemäßen Polypeptids.
Bevorzugt wird in einem erfindungsgemäßen Polypeptid nur die am N-Terminus gelegene Komponente A bzw. der weiter N-terminal gelegene Tag mit einer wie oben beschriebenen Kopplungsgruppe versehen/modifiziert. In einer weiteren Ausführt gsform werden im FaUe eines erfindungsgemäßen Polypeptids, welches 3 Komponenten A enthält, beispielsweise 2 oder 3 der Komponenten A mit jeweüs einer Kopplungsgruppc modifiziert, sodass das Ge- samttαolekül (das erfindungsgemäße Polypeptid) über zwei bzw. 3 kovalcntc Bindungen an eine dafür geeignete Matrix gekoppelt werden kann. Die Kopplung des erfindungsgemäßen Polypeptids über eine oder mehrere Koppkingsgruppen aller Komponenten A eines erfindungsgemäßen Polypeptids beeinträchtigt bevorzugt nicht die Funktion der einzemen Komponenten A, z.B. von TNF, sondern ermögUcht vielmehr eine Verbesserung der Immobilisa- tion, bspw. von scTNF, an Oberflächen und/oder Partikel. Wie zuvor ausgeführt, z.B. bei scTNF wie auch bei scFasL und scTRAIL oder anderen Mtgliedem der TNF-Familie in der sc-Form, enthält jedes der erfindungsgemäßen Polypeptide bevorzugt die für die biologische Ft ktion notwendigen Untereinheiten (Komponenten A) in einer funktioneU relevanten An- Ordnung. Durch die Kopplung eines erfindungsgemäßen Polypeptids an eine Oberfläche/einen Partikel ist es erfindungsgemäß mögHch Oberflächen bzw. Partikel mit z.B. gekoppelten TNF-Flomo- oder Heterotrimercn bzw. — ultimeren herzusteUen. Auf diesen Oberflächen/Partikeln sind die gekoppelten TNF-Homo- oder Hcterotrimere bzw. — ultimere stabU und bioaktiv immobilisiert sind. Durch das erfindungsgemäße single-chain Prinzip ist der funktioneU relevante trimere Zustand der Komponenten A durch die Komponenten B stabilisiert, wodurch sichergesteUt ist, dass nach kovalenter Kopplung an eine Oberfläche/den Partikel eine Dissoziation einzelner Komponenten A ausgeschlossen und damit Verlust der biologischen Aktivität verhindert wird.
Eine bevorzugte Eigenschaft solcher erfindungsgemäß an Oberflächen oder Partikel gekoppelten Polypeptide ist ihre biomimetische Aktivität, die der natürUcher, membranständiger Liganden der TNF Familie entspricht. Beispielsweise erlangt ein erfindungsgemäßes, immobi- Usiertes scTNF eine hohe Affinität für T R2 und damit hohe Signalfälligkeit
Erfindungsgemäßc Polypeptide, die wie oben beschriebene, mit einer Kopplungsgruppe modifizierte, Komponenten A enthalten und an eine Oberfläche und/ oder Partikel gekoppelt werden/ sind, können erfindungsgemäß zur Detektion wie auch zur Manipulation, Depletion und/oder Entfernung von Bindungspartnern von MitgHedern der TNF-IigandenfamiUe wie auch damit assoziierten Verbindungen eingesetzt werden. Von vorrangigem Interesse sind dabei Verfahren zur extrakorporalen Manipulation, Depletion und/oder Entfernung von in Körperflussigkeiten enthaltenen Bestandteüen, z.B. mittels Apherese.
Die nachfolgenden Ausführungen zu den Gegenständen der Erfindung beziehen sich insbe- sondere auf das TNF-πgandenfamuLUerimitgUed TNF, sie sind jedoch auf aUe anderen MitgUeder der TNF-IligandenfamiUe übertragbar.
Die Polypeptide der vorUegenden Erfindung umfassen neben den beschriebenen Komponenten A (Monomere mindestens eines MitgHeds der TNF-Iigandenfamiüe) mindestens zwei Komponenten B, wobei die Komponente B die Eigenschaft eines Peptid-Iinkers aufweist. Als Peptid-Iinker im Sinne der Erfindung ist jede in einem biologischen System exprimierba- re Peptidsequenz denkbar. Peptidlinker steUen sich bei den erfindungsgemäßen Polypeptid- kons trukten bspw. als eine flexible Verbindung dar, die vorzugsweise jedoch die intrinsischen Trimerisierungseigenschaften des betreffenden MitgUeds der TNF-Iligandenfamiüe nicht ne- gativ beeinflusst. Vorzugsweise werden Linker mit solchen Eigenschaften, insbesondere Flexibilität und Länge, gewählt, welche die spontan gebüdeten Homotrimeren des jeweüigen Iiganden(derivats) zu stabilisieren vermögen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Komponente B demnach um Peptidlinker bestehend aus 2 bis 30, bevorzugt zwischen 4 und 16 und besonders bevorzugt zwischen 4 und 12 Aminosäuren, welche bevorzugt repetitive Glycin-Serin- Strukturen, ganz bevorzugt Gly-Gly-Gly-Ser-Module (GGGS-Module) in repetitiver Anordnung enthalten.
Bevorzugt handelt es sich bei den Peptid-Iinkern der Erfindung also um Glycin (G) reiche Peptid-Linker, d.h. dass die Aminosäuresequenz eines Peptid-Iinkers einen hohen Glycin- AnteU, vorzugsweise von 60 bis 80%, besonders bevorzugt von 75%, aufweist.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Peptid-Linker (Komponente B) die Aminosäuresequenz GGGSGGGSGGGS, auch (GGGS)3 oder Lshort genannt, oder die Aminosäuresequenz GGGSGGGSGGGSGGS, auch (GGGS)4 oder Tu genannt. Die Peptid-Linker werden erfindungsgemäß u.a. als Ll und L2 bezeichnet, so dass sich auch Bezeichnungen wie Llshort , L2short , Lllong und/oder L2Iong ergeben. Eine Verwendung zweier unterschiedücher linker zur StabiUsierung eines trimeren Moleküls ist mögUch.
Bevorzugt verknüpfen die Peptid-Linker gemäß der Erfindung, also die Komponenten B, jeweüs zwei der mindestens drei Komponenten A miteinander. Diese Verknüpfung erfolgt kovalent über den C-Terminus einer Komponente A und dem N-Terminus einer weiteren Komponente A. Das Polypeptid gemäß der Erfindung steUt ein Einzelketten-Molekül (auch single chain- oder sc-Molekül genannt) dar. Das bedeutet, daß sämtUche Komponenten A und Komponenten B, die das erfindungsgemäße Polypeptid umfasst, auf einem einzigen Polypeptid- bzw. Proteinstrang Uegen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung büden die Komponenten A und die Komponenten B eine trimere Proteinstruktur aus. Bevorzugt handelt es sich hierbei um eine homotrimere Proteinstruktur, jedoch sind auch heterotrimere Proteinstrukturen von der Er- findung umfasst.
Die AushUdung dieser trimeren Proteinstruktur wird bevorzugt durch die Komponente B bewirkt und/oder durch sie verstärkt. Da die zur Trimerisierung führende Komponente B bzw. die eine Trimerisierung verstärkende Komponente B des erfindungsgemäßen Polypep- tids im wesentlichen keine höheren Aggregate bUden soUte, soUte die Komponente B typischerweise keinen Cysteinrest aufweisen, der eine intermolekulare Disulfidbrücke ausbüden kann. Vorzugsweise wird die Komponente B in einem erfindungsgemäßen Polypeptid daher keinen Cysteinrest oder nur solche Cysteinreste, die eine intramolekulare Disulfidbrücke, also i erfindungsgemäßen Polypeptid selbst, besitzen, um zu vermeiden, daß unter oxidierenden Bedingungen eine kovalente Verknüpfung mit dem mindestens einen Cysteinrest eines Fusionsproteins eines anderen Trimers auftreten kann.
Die Sequenzen von nativen Polypeptiden oder Fragmenten dieser nativen Polypeptide, die als Peptid-Linker erfindungsgemäß eingesetzt werden, können auch in Form biologisch aktiver funktioneUer Varianten derselben im Sinne dieser Erfindung und nach obiger Definition vor- üegen.
Bei den erfindungsgemäßen Komponenten B kann es sich um identische oder verschiedene natürlich vorkommende Peptid-Sequenzen handeln. Sie können aus dem gleichen oder ver- schiedenen Organismen stammen. Bei den Organismen kann es sich um Vertrebraten, insbesondere um Säugetiere, beispielsweise um die Maus, die Ratte, das Schwein und vor aUem um den Menschen handeln.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann neben den Komponenten A und B zusätzHche Se- quenzabschnitte aufweisen. Bevorzugt sind in diesem Zusammenhang sog. Tag-Sequenzen, beispielsweise mindestens ein Flag-Tag, also die Arninosäurenfolge DYKDDDDK, und/oder beispielsweise mindestens ein His-Tag (enthaltend mehrere konsekutive Histidine, bspw. mindestens 5) und/oder weitere Tag- oder antigenische Sequenzen. Ein besonders bevorzugter zusätzUcher Sequenzabschnitt ist eine Leitpeptidsequenz. Vorzugsweise steUt diese Leitpeptidsequenz ein Signal zur Sekretion des Polypeptids bzw. Proteins in eukaryontischen Zellen dar. Diese Leitpeptidsequenz ist vorzugsweise N-terminal angeordnet.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst ein erfindungsgemäßes Polypeptid eine weitere Komponente C, wobei diese charakterisiert ist durch spezifische Wechselwirkung mit einem komplementären Ze oberflächenmolekül („Antigen"). Das Wirkprinzip erfindungsgemäßer Polypeptidkonstrukte, wie bspw. erfindungsgemäße Konstrukte mit dem A- poptoseinduktor TRAIL oder FasL als Komponente A ist insbesondere für aU diejenigen MitgUeder der TNF-LigandenfamiUe zutreffend, die für bestimmte Rezeptoren ausschließUch oder in besonders gutem Maße als Membranmolekül wirksam sind. Hierzu gehören neben TRAIL (TNFSF10), FasL (TNFSF6) und TNF (TNFSF2) bspw. auch die Immunmodulatoren CD40L (TNFSF5) und CD30L (TNFSF8). Komponente C hat damit „targeting" Funkti- on. Dementsprechend ist die Komponente C ein Antikörperfragment, vorzugsweise ein Einzelketten- Antikörperfragment, sog. scFv, oder ein Antikörperderivat das ein spezifisches Zielmolekül auf einer ZeUoberfläche erkennt. In einer weiteren Ausführungsforrn ist die Komponente C ein nicht den Antikörpern zugehöriges Protein bzw. Peptid, welches aber analog zu einer Antikörper-Antigen-Wechselwirkung bzw. einer Rezeptor-Iigand- Wechselwirkung ebenfaUs ein spezifisches Zielmolekül auf einer ZeUoberfläche selektiv erkennt. In einer besonders bevorzugten Ausführuiigsform umfasst die vorUegende Erfindung ein wie oben beschriebenes erfindungsgemäßes Polypeptid als Komponente A mindestens ein wie oben definiertes MitgUed der scTNF FamiUe, z.B. scTNF, sowie als Komponente C ein wie oben beschriebenes Antil örperfragment, z.B. scFv. Dadurch entstehen kleinere erfin- d αngsgemäße Polypeptide mit jeweUs einer „targeting-Domäne". Solche kleineren erfindungsgemäßen Polypeptide sind vorteilhafterweise weniger anfäUig für z.B. Aggregation.
Bevorzugt handelt es sich bei der Komponente C um ein Antigen-bindendes Antikörperfragment oder ein Antigen-bindendes Antikörperderivat eines Säugetiers, insbesondere muri- nen oder humanen Ursprungs, oder es handelt sich um ein humanisiertes Antikörperfragment oder ein humanisiertes Antikörperderivat, z.B. mit Säugetierursprung. Im FaUe der Derivati- sierung und/oder Humanisierung besteht die Komponente C typischerweise aus einem nach dem Stand der Technik hergesteUten single chain Fv-Derivat murinen, durch CDR grafting humanisierte Komponente C oder es handelt sich um eine Komponente C voUständig humanen Ursprungs die entsprechend zu einem scFv-Derivat umgewandelt wurde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Komponente C um einen Protein- oder Peptid-Liganden, der als Monomer eine spezifische Bindung an einem Membranrezeptor eingeht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Komponente C um ein Protein oder Peptid mit Spezifität für ZeUoberflächenmoleküle, das insbesondere ein Zy- tokinrezeptor, ein Wachstumsfaktorrezeptor, ein Integrin oder Zelladhäsionsmolekül ist. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Zytokinrezeptor, der aus der Gruppe der TNFR-Genfamiüe ausgewählt ist.
Die Komponente C eines erfindungsgemäßen Polypeptids weist vorzugsweise Spezifität für ein im Tumorgewebe selektiv bzw. dominant exprimiertes Antigen auf. Ein solches Tumorantigen kann genereU auf den maUgnen ZeUen selbst exprimiert sein oder auch im nicht- maUgnen AnteU des Tumors, den Stromazeüen oder dem Tumorendothel exprimiert sein. Derartige Antigene nicht-maUgner GewebeanteUe eines soHden Tumors (Karzinom) sind auf der einen Seite genetisch invariant, auf der anderen Seite bei unterschiedlichsten Tumorentitä- ten vorkommend und damit universeUe Tumormarker. Beispiele für solche Liganden für Tumorassoziierung, gegen die eine Komponente C des Polypeptids der Erfindung gerichtet sein kann, sind der VEGFR bzw. der VEGFR/VEGF Komplex sowie das Integrin av ß3 und die Vibronektinisoform ß Fn als weitgehend selektive Zielstrukturen des Tumorendothels und das Fibroblast Activation Protein (als selektiver Marker des Tumor stromas). AUe vorgenannten Beispiele können mit spezifischen scFv wirksam erfasst werden, weswegen sich derartige scFv ("single chain Fv") besonders als Komponente C eines erfindungsgemäßen Polypeptids eignen. Auch Galectin kommt hierbei als Tumormarker, gegen den die Komponente C gerichtet ist, in Betracht.
Demnach werden Antikörperfragmente in verschiedenen Antikörperformaten, bspw. scFv, insbesondere scFv40, als Komponente C besonders bevorzugt. In einer anderen Ausfuhrungsform der vorUegenden Erfindung erkennt das Polypeptid über seine Komponente C als spezifisches Zielmolekül einen Zellmembran-ständigen Rezeptor eines MitgUeds der TNF-πgandenfamiUe, bevorzugt unterschiedlich von dem TNF- I_igandenfarr__Uen-MitgUed der Komponente A. Beispiele, die keine abschließende Aufzählung darsteUen, solcher mögUcher Liganden sind TNFSF1 (LTalpha), TNFSF2 (TNF), TNFSF3 (LTbeta), TNFSF4 (OX40L), T FSF5 (CD40L), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27L), TNFSF8 (CD30L), TNFSF9 (4-1BBL), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (RANKL), TNFSF12 (TWEAKL), TNFSF13 (APRIL), TNFSF143B (BLYS), TNFSF14 (LIGHT), TNFSF15 (VEGI), TNFSF16 (CD30L),und TNFSF18 (AITRL), sowie EDA, die oder deren funktionel- le Fragmente oder funktioneUe Varianten der nativen Sequenz oder der Fragmente gleichfaUs als Komponente A in einem erfindungsgemäßen Polypeptidkonstrukt dienen können. Insbesondere werden diesbezügUch aUe Membran-ständigen Typ II-Proteine (C-Terminus exttazel- lulär), deren funktioneUe Fragmente oder funktioneUe Varianten, die eine trimere Organisati- on ihrer Untereinheiten als Voraussetzung für die biologische Aktivität bedingen, mit offenbart.
Ein weiterer Gegenstand der vorUegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert. EbenfaUs umfasst sind Nukleinsäurekonstrukte, die einen für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden Sequenzabschnitt sowie einen oder mehrere weitere Sequenzabschnitt(e) enthalten. Bei solchen weiteren Sequenzabschnitten kann es sich bspw. um Sequenzen handeln, die für ein Leitpeptid codieren, das als Signal für die Sekretion des Polypeptids bzw. Proteins gemäß der Erfindung in eukaryotischen ZeUen gibt, oder für ein scFv40 codieren, d.h. die Sequenz des Einzelketten (scFv)-Antikörperfragments 40, welches spezifisch für das Tumorstroma-Antigen FAP ist, oder für ein "Antibody Mediated Apoptosis Inducing Zytokine" (AMAIZe) oder für ein HIS/Flag-Tag, eine Peptidsequenz zur Affinitätsreinigung der exprimierten Proteine bzw. Polypeptide. Diese Aufzählung ist ledigUch beispielhaft und nicht abschließend.
Weitere Sequenzen, die von der Nukleinsäuresequenz umfasst sein können, sind ebenfaUs nicht-codierende Sequenzen, wie nicht-codierende 3'- und 5' Sequenzen, einschUeßUch z.B. regulatorische Sequenzen. Die Nukleinsäuresequenzen der vorUegenden Erfindung können ebenfaUs mit Nukleinsäuresequenzen fusioniert sein, die bspw. für eine Markersequenz codieren oder für eine Sequenz codieren, die ein Polypeptid codiert, welches bspw. die IsoUerung oder Aufreinigung des Po- lypeptids der Erfindung erleichtert. Repräsentative Sequenzen schüeßen bspw. solche ein, die ein Glutation-S-Transferase (GST) Fusionsprotein, ein Polyhistidin (z.B. HIS 6) Hämaggluti- nin oder HSV-Tag codieren. Diese Aufzählung ist jedoch keinesfaUs beschränkend.
Nukleinsäuren der vorUegenden Erfindung können DNA oder RNA, insbesondere mRNA sein. Die Nukleinsäuremoleküle können doppel- oder einzelstängig vorUegen. Einzelsträngige RNA oder DNA kann entweder der codierende (sense) oder der nicht-codierende (antisense) Strang sein.
Die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung können bevorzugt isoUert vorUegen. Dies bedeutet, daß das Nukleinsäuremolekül oder die Nukleinsäuresequenz nicht von Nukleinsäuresequenzen flankiert wird, die normalerweise das Gen oder die Nukleinsäuresequenz flankieren (wie in genomischen Sequenzen) und/oder die voUständig oder teUweise aufgereinigt worden sind (wie bspw. in einer DNA- oder RNA-BibUothek). Bspw. kann eine isoUerte Nukleinsäure der Erfindung in Bezug auf das zeUuläre Milieu, in welchem es natürUcherweise vorkommt, iso- Uert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure eine der in den Figuren 19 bis 26 dargesteUten Nukleinsäuresequenzen oder besteht aus einer dieser Nukleinsäuresequenzen.
Erfindungsgemäß sind auch funktioneUe Fragmente oder funktioneUe Varianten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäurekonstrukte umfasst, auf die die obigen Ausführungen zu den Begriffen funktioneU, Fragment und Variante entsprechende Anwendung finden.
Die HersteUung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukten oder funktioneUen Fragmenten oder funktioneUen Varianten hiervon kann mittels Standardverfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z.B. Maniatis et al. (2001) suprά). Insbesondere Anwendung in diesem Zusammenhang findet die PCR-Technik. Eine Überprüfung der Sequenz hergesteUter Nukleinsäuren gemäß der Erfindung kann anhand Sequezie- rungs- oder Hybridisierungs-Verfahren erfolgen, welche dem Fachmann ebenfaUs geläufig sind.
EbenfaUs von der Erfindung umfasst sind Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Bevorzugt codiert das Genprodukt ein Polypeptid der in den Figuren 19 bis 26 darge- steUten Aminosequenzen. Ein Genprodukt der vorUegenden Erfindung betrifft nicht ledigUch das Transkript (mRNA) sondern auch Polypeptide oder Proteine, bevorzugt in aufgereinigter Form. EbenfaUs umfasst sind Allele, funktioneUe Fragmente oder funktioneUe Varianten solcher Genprodukte. Für funktioneUe Fragmente oder funktioneUe Varianten der Genprodukte gelten die obigen Definitionen dieser Begriffe entsprechend.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen Vektor, welcher die Nukleinsäure enthält, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert. Vorzugsweise handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Expressionsvektoren, d.h. um Vektoren, die die Fähigkeit zur Expression und/oder AmpUfikation der Nukleinsäuren in einer prokaryotischen und/oder eukaryotischen ZeUe besitzen. Insbesondere betrifft die vorUegende Erfindung Plasmidvekto- ren, z.B. pBABEpuro, Phagen oder retrovirale Vektoren, insbesondere auch aUe Vektorsysteme, die gentherapeutisch zur Anwendung kommen können, z.B. auch adenovirale Vektorsysteme. Im Rahmen der vorUegenden Erfindung werden somit auch gentherapeutische Verfahren mit erfindungsgemäßen Vektoren oder Nukleinsäuren oder Nukleinsäurekonstrukten als Behandlungsmethode für die erfindungsgemäß offenbarten medizinischen Indikationen offenbart.
Erfindungsgemäße Vektoren weisen bevorzugt KontroUsequenzen auf, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ermögUchen bzw. verstärken und die Transkription regulieren. Solche KontroUsequenzen schließen bspw. PolyadenyUerungssignale, Promotoren, z.B. natürUche oder synthetische Promotoren, Enhancer zur Bewirkung der Transkription, Operatorsequenzen zur ReguUerung der Transkription, Süencer zur gewebsspezifischen Transkription, Sequenzen, die geeignete Ribosomen-BindungssteUen auf der mRNA codie- ren, Sequenzen, welche die mRNA stabiUsieren und Sequenzen, welche die Ter ination der Transkription und/oder Translation reguUeren. Dies steUt ledigUch eine beispielhafte Aufzählung von mögUchen KontroUsequenzen dar. Weitere mögUche KontroUsequenzen sind im Stand der Technik gut bekannt und sind bspw. beschrieben von Goeddel (1990), Gen Ex- pression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. Die KontroUsequenzen können modifiziert werden, z.B. durch Deletion, Addition oder Substitution einer oder mehrerer Nukleinsäuren, um ihre KontroUfunktion zu verstärken.
Es sind insbesondere zahlreiche verschiedene Promotoren für verschiedene Organismen be- kannt. Zum Beispiel ist ein bevorzugter Promoter für Vektoren, die in Bacillm subtilis verwendet werden, der AprE-Promoter, ein bevorzugter Vektor, verwendet in E. coli, ist der T7/Lac- Promotor, ein bevorzugter Promoter, verwendet in sacch romyces cereviήae ist PGK1, ein bevorzugter Promotor, verwendet in Λspergillus niger ist glaA, ein bevorzugter Promotor, verwendet in Trichoderma reesei (rβesei) ist cbhl. Promotoren, die für die Verwendung in prokaryotischen WirtszeUen geeignet sind, schUeßen z.B. beta-Lactamase (Vektor pGX2907 [ATCC39344], enthält das RepUcon und das beta-Lactamase Gen), Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al. (1978), Nature (London, 275: 615); Goeddel et al. (1979), Nature (London), 281: 544), AlkaU- sche Phosphatase, das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Vektor pATHl [ATCC37695]) und Hybridpromotoren, wie den tac-Promotor (isoUerbar aus dem Plasmid pDR540 [ATCC37282]), ein. Jedoch auch andere bakterieUe Promotoren, deren Nukleotidsequenzen aUgemein bekannt sind, versetzen einen Fachmann in die Lage, diesen mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zu Ugieren, wobei auch linker oder Adapter verwendet werden können, um gewünschte RestriktionssteUen zu erzeugen. Bevorzugt enthalten Promotoren, die in bakterieUen Systemen verwendet werden, ebenfaUs eine Shine-Dalgarno-Sequenz, die funkti- onsfähig mit der Nukleinsäure verbunden ist.
Geeignete Expressionsvektoren können bspw. aus Segmenten von chromosomaler, nicht- chromosomaler und synthetischer DNA bestehen. Hierfür sind zahlreiche Derivate von SV40 und Baktetienplasmiden bekannt Beispiele sind Plasmide aus E. coli, wie col El, pBK, pCRl, pBR322, pMb9, pUC19 sowie deren Derivate, Plasmide, die für einen weiten Wirtsbereich verwendbar sind, wie RP4, und Phagen-DNAs, wie zahlreiche Derivate des Phagen-Lambda, z.B. NM989, sowie andere DNA-Phagen, z.B. M13 sowie filamentöse einzelsträngige DNA- Phagen, Hefeplasmide, Vektoren, die für die Verwendung in eukaryotischen ZeUen geeignet sind, sowie Vektoren, die aus einer Kombination von Plasmid und Phagen-DNA bestehen. Im Stand der Technik sind zahlreiche Expressionstechniken zur Verwendung erfindungsgemäßer Expressionsvektoren bekannt. Solche Techniken werden bspw. allgemein geschrieben in Maniatis et al. (2001) supra.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine WirtszeUe, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält.
WirtszeUen im Sinne der Erfindung sind ZeUen, die in der Lage sind als Wirt und Expressi- onsvehikel für eine(n) erfindungsgemäße(n) Nukleinsäure oder Vektor zu fungieren. Es kann sich hierbei um prokaryontische und eukaryontische WirtseUen handeln. Prokaryotische — bakterieUe - WirtszeUen sind beispielsweise R, marinus, E. coli, Streptomjces, Pseudomonas, Bacillus, Serratia marcescens, Samonella thyphimurium. Eukaryotische WirtszeUen umfassen beispielsweise Hefen, wie Saccharomjces ceremsiae, Pichia pastoris, InsektenzeUen, wie Sφ, oder SäugetierzeUen, wie COS, CHO. Diese Aufzählungen sind keinesfalls abschliessend. Die Wahl einer geeigneten WirtszeUe ist von mehreren Faktoren abhängig, z.B. bei der Einführung eines Vektors in eine WirtszeUe insbesondere von dem verwendeten erfindungsgemäßen Vektor.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die HersteUung einer erfindungsgemäßen WirtszeUe, welches die folgenden Schritte umfaßt:
(a) HersteUung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektors, (b) Einbringen der Nukleinsäure und/oder des Vektors gemäß Schritt (a) in eine ZeUe.
Das HersteUen einer Nukleinsäure bzw. eines Vektors kann erfindungsgemäß nach den bereits oben beschriebenen Standardverfahren und beispielhaften Beschreibungen erfolgen. Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. des erfindungsgemäßen Vektors in die WirtszeUe kann unter Verwendung jeder geeigneter Standardverfahren erfolgen. Hierzu gehören bspw. Transformation, Elektroporation, Transfektion unter Verwendung von z.B. Kalzi- umchlorid. Lipofektion, Infektion, Transduktion etc. Diverse Standardverfahren sind bspw. in Maniatis et al. (2001) supra beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der vorUegenden Erfindung ist ein Verfahren zur HersteUung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, wobei dieses Verfahren typischerweise die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen WirtszeUe unter geeigneten Bedingungen, (b) Expression der/ des erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. Nukleinsäurekonstrukts unter geeigneten Bedingungen, und (c) IsoUeren des Polypeptids aus den WirtszeUen und/oder dem Kulturüberstand.
Kultivieren einer WirtszeUe bedeutet, der WirtszeUe ein Wachstum in einem geeigneten Kulturmedium, bei einem geeigneten pH und geeigneten Temperaturen zu ermögUchen. Solche Wachstumsbedingungen sind von den jeweüs verwendeten WirtszeUen abhängig und dem Fachmann gut bekannt. Hinweise zum Kultivieren von ZeUen finden sich auch in Maniatis et al. (2001), supra.
Die Expression des Polypeptids kann hierbei typischerweise nach dem Stand der Technik in geeigneten Expressionssystemen erfolgen, vorzugsweise als sezerniertes Produkt stabüer Transfektanten, z.B. CHO-ZeUen oder anderer tierischer ZeUen, wie Cos7 oder SF9 (Insek- tenzeUen), oder weiterer eukaryontischer ZeUsysteme, beispielsweise Pichia pastoris. Vorzugsweise weisen die exprimierten erfindungsgemäßen Polypeptide jeweiüge zur Sekretion in dem ZeUsystem geeignete Leadersequenzen auf. Daher werden die zur Expression eingesetzten erfindungsgemäßen Vektoren auch codierende Abschnitte enthalten, die für eine funktioneUe Leadersequenz codieren, z.B. wie in Brocks et al. (lmmunotechnology -?:173-184, 1997) für Säuger und InsektenzeUen beschrieben oder unter Verwendung von beispielsweise pPIC- Zalpha-Vektoren (Tnvitrogen, Karlsruhe, Deutschland) zur Expression und Sekretion in der Hefe Pichia pastoris.
Das IsoUeren des erfindungsgemäßen Polypeptids aus der WirtszeUe kann durch Standardver- fahren, wie Chromatographie-Verfahren, Präzipitationsverfahren usw., die zur Aufreinigung von Polypeptiden und Proteinen geeignet sind, erfolgen (s.a. Maniatis et al. (2001), supra. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kommen die Polypeptide, ggf. aber auch Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren oder WirtszeUen, (hier unter der Kategorie „erfindungsgemäße Substanzen" zusammengefaßt) der Erfindung, als Arzneimittel oder zur HersteUung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen in Betracht.
Sofern die erfindungsgemäßen Substanzen eine Komponente C gemäß der Erfindung (s.o. ein Antikörperfragment oder ein anderes spezifisch bindendes Protein/Peptid) umfassen, ist ihre Verwendung insbesondere dann gegeben, wenn die Substanzen nach Bindung des Polypeptids bzw. Fusionsproteins an ein spezifisches, Zellmembran-exprimiertes Zielmolekül, die voUe biologische Wirkung über den entsprechenden Rezeptor des MitgUeds der TNF- Iigandenfamiüe entfalten. Durch geeignete Auswahl der Spezifität der Targeting- Komponente C wird die Aktivität der erfindungsgemäßen Substanz auf das zu behandelnde Gewebe, z.B. Tumorgewebe, gerichtet und es kann ein auf die jeweiüge Indikati- on/Tumorentität spezifisch abgesti_r_mtes/optimiertes Therapeutikum hergesteUt werden. Ein erfindungsgemäßes Polypeptid wird z.B. bei Anwendung als Tumorthetapeutikum, insbesondere zur Behandlung soUder Tumore, aber auch lymphatischer Tumore (benigne oder maügne), nach in vivo Verabreichung durch die Targeting Komponente C zunächst spezifisch im Tumorareal durch vom Tumor selbst oder das reaktive Tumorstroma/Tumorgefäßsystem gebUdete Membranmarker angereichert und dort TNF-Rezeptorfamüien-positiven Tumorzel- len oder sensitiven ZeUen des reaktiven tumorversorgenden Normalgewebes, die sensitiv für ein MitgUed der TNF-Ligandenfamilie sind, präsentiert.
Die Verwendung erfindungsgemäßer Substanzen ist aber grundsätzUch auch immer dann zur Anwendung im therapeutischen Bereich erwünscht, wenn die Aktivierung einer Signaltrans- duktionskette, z.B. die durch die TNF-RezeptorfamiUe ausgelösten Signalkaskaden, bspw. eine apoptotische Signalkaskade, ausgelöst werden soU. Somit kommt die Verwendung erfindungsgemäßer Substanzen bei der Behandlung bzw. zur HersteUung eines Arzneimittels zur Behandlung aUer hyperproUferativer Erkrankungen in Betracht, bspw. auch zur zielgerichteten Ausschaltung von ZeUen des Immunsystems bei überschießenden Immunreaktionen, bspw. bei Autoimmunerkrar kungen, wie z.B. multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Diabetes melütus und TEN, oder bei fehlgeleiteten Immunreaktionen gegen Fremdantigene, wie sie z.B. bei Infektionserkrankungen (bakterieU (bspw. durch Mykobakterien), vital oder proto- zoologisch) auftreten können. In Betracht kommt ferner die Behandlung von Stoffwechselerkrankungen oder aUgemeinen hyperinflammatorischen Zuständen, insbesondere chronischen Entzündungen, bspw. auch bei Allergien, aber auch die Behandlung von Abstoßungsreaktionen des Immunsystems des Patienten gegen Fremdgewebe. In den vorgenannten FäUen muss das erfindungsgemäße Polypeptid, z.B. über eine Komponente C, charakteristische Marker auf der Oberfläche der ZielzeUen, bei denen vorzugsweise eine apoptotische Signalkaskade mit dem Ziel des ZeUtods ausgelöst werden soU, erkennen. Im FaUe der Behandlung nach einer Transplantation von Fremdgewebe werden also bspw. die körpereigenen für die Abstoßungsreaktion verantwortlichen ZeUen des Immunsystems des Transplantionspatienten als ZielzeUen dienen.
Im aUgemeinen eignen sich die erfindungsgemäßen Substanzen bzw. Arzneimittel zur Behandlung von K_tebserkrankungen, insbesondere soUden oder lymphatischen Tumoren, Infektionskrankheiten, Stoffwechselerkrankungen, Entzündungszuständen, hyperproUferatori- sehe Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, insbesondere rheurnatoide/arthritische Erkrankungen, toxischer epidermaler Nekrolyse (TEN), Multiple Sklerose, Hashimoto Thyroidi- tis, GvHD, virale Hepatitis (HSV, HCV), Alkohol-induzierter Hepatitis, Abstoßungsreaktionen bei Lebertransplantation, Erkrankungen, die auf hyperapoptotischen Reaktionen beruhen, degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen.
Bei der Verwendung erfindungsgemäßer Substanzen als Arzneimittel zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen wird dem zu behandelnden Patienten vorzugsweise rekombi- nant hergesteUtes Protein verabreicht. Alternativ werden dem Patienten zu transfizierende ZeUen entnommen, diese in vitro mit erfindungsgemäßen (Expressions-) Vektoren transfiziert, kultiviert und dann als Retransplantat in den Patienten überführt. Die Transfektion wird vorzugsweise durch Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder (Expressions-) Vektoren vorgenommen, die die Expression an einen reguUerbaren Promotor koppeln. Das transfizierte Eigentransplantat kann lokal bspw. injiziert werden — abhängig von der spezifischen Erkrankung und den spezifischen ZielzeUen. Lokale Verabreichung ist bspw. im FaU einer Tumor- therapie bevorzugt. Hierbei werden TumorzeUen dem Patienten entnommen, in vitro transfiziert und dann, sofern mögUch, direkt in den Tumor injiziert, bspw. zur Behandlung von Hauttumoren (z.B. Melanomen), Tumoren des Nervensystems (z.B. GUoblastomen). Weitere Gegenstände der vorUegenden Erfindung betreffen die Verwendung erfindungsgemäßer Substanzen sowohl zur HersteUung einer Vakzine zur aktiven oder passiven Immxini- sierung gegen Infektionskrankheiten, insbesondere gegen virale Infektionskrankheiten, als auch zur HersteUung einer Vakzine zur Vakzinierung gegen Röteln, Masern, PoUomyeUtis, ToUwut, Tetanus, Diphterie, BCG, Malaria, Gelbfieber, HIV oder Grippe.
Erfindungsgemäße Substanzen können ebenfaUs zur in vitro -Diagnose verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorUegenden Erfindung betrifft Verfahren zur exttakorporalen (ex vivo) Manipulation, Depletion und/oder Entfernung von in Körperflüssigkeiten enthaltenen Bestandteüen, wie z.B. Bindungspartnern einer wie oben definierten Komponente A oder daran bindende oder damit assoziierte Zellen. Solche exttakorporalen Verfahren umfassen bevorzugt λ^erfahren wie z.B. Apherese, insbesondere die grundlegenden Formen der Aphe- rese, die Plasmapherese und die Cytapherese.
Die Plasmapherese beinhaltet erfindungsgemäß die extrakorporale Manipulation, Depletion und/oder Entfernung bestimmter lösUcher oder suspendierter Bestandteile im Plasmaanteü des Blutes, sowie die Rückführung des so behandelten Blutes in den Patienten. Dazu wird einem Patienten bevorzugt mittels einer Pheresemaschine peripheres Blut entnommen, dem Blut werden optional geriiinutigshernrnende Mittel zugesetzt und das Blut wird in seine Hauptkomponenten — feste (rote Blutkörperchen, weisse Blutkörperchen und Blutplättchen) und flüssige AnteUe (Plasma) - aufgetrennt. Nach Auftrennung in diese Hauptbestandteüe können die in der so erhaltenen Plasmafraktion enthaltenen lösUchen oder suspendierten Be- standteUe des Blutes in einem weiteren Verfahrensschritt manipuUert, depletiert und/oder entfernt werden, beispielsweise unter Verwendung von erfindungsgemäßen Polypetiden. AnschUeßend kann das so behandelte Blutplasma zusammen mit den vorher abgetrennten festen Blutbestandteüen zusammengegeben und dem Patienten reinjiziert werden. Der durch die Plasmapherese bedingte Volumensverlust kann im erfindungsgemäßen Verfahren weiter- hin durch isotonische Kochsalzlösung ersetzt werden. Plasmapherese wird erfindungsgemäß bevorzugt unter Verwendung von Verfahren wie therapeutischem Plasmaaustausch (TPE), Immunabsorption (LA), Fällung (HELP), differentieUer Membranfiltration und anderen Mit- teln durchgeführt. Beispielhaft seien hier Plasmafiltrationssäulen genannt (siehe z.B. US 4,619,639, Asahi Medical Company, hier durch Referenz mit einbezogen). EbenfaUs können Membranfiltrationssysteme (MDF) unter Verwendung von verschiedenen Partikeln und O- berflächen, bspw. Fütern wie, PlasmaFlo®OP-05(W)L und RheoFüter®AR2000 Blutfilter, eingesetzt werden (hergesteUt durch Asahi Medical Company, Ltd. of Japan). Alternativ können in erfindungsgemäßen Plasmaphereseverfahren alle geeigneten Oberflächen und Partikel verwendet werden.
Bei der Cytapherese werden erfindungsgemäß im Unterschied zur zuvor beschriebenen Plas- mapherese extrakorporal im Blut zirkuUerende und/oder an Knochenmark gebundenen zeUu- läre BestandteUe (rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen, StammzeUen oder Thrombozy- ten) oder spezifische Subpopulationen dieser ZeUen manipuliert, depletiert und/oder entfernt, um einen ldinischen Effekt zu erzielen. Auch hier wird bevorzugt einem Patienten mittels einer Pheresemaschine peripheres Blut entnommen. Dem Blut werden danach optional gerinnungshemmende Mittel zugesetzt und das Blut wird in seine Hauptkomponenten aufgetrennt. AnschUeßend können in der die ZeUbestandteüe enthaltenden Fraktion des Blutes diese ZeUbestandteüe in einem weiteren Verfalirensschritt manipuUert, depletiert und/oder entfernt werden, bevorzugt ebenfaUs unter Verwendung von erfindungsgemäßen Polypeptiden. Die so behandelte Fraktion kann abschließend dem Patienten wieder reinjiziert werden. Bevorzugt erfolgt bei der erfindungsgemäßen Cytapherese die Auftrennung des Blutes in verschiedene Fraktionen sowie gegebenenfalls die Abtrennung bestimmter ZeUbestandteüe des Blutes mittels Verfahren wie Zentrifugation, differentieUer Membranfiltration, oder anderen Mitteln. Es können weiterhin Membranfiltrationssysteme (MDF) unter Verwendung von verschiedenen Partikeln und Oberflächen, bspw. Fütem wie, PlasmaFlo®OP-05(W)L und RheoFUter® AR2000 Blutfilter, eingesetzt werden (hergesteUt durch Asahi Medical Company, Ltd. of Japan).
In einer dritten erfindungsgemäßen Alternative können die oben beschriebenen Verfahren der Plasmapherese und der Cytapherese miteinander kombiniert werden, beispielsweise um sowohl lösUche oder suspendierter Bestandteile im Plasmaanteü des Blutes wie auch im Blut zirkuUerende und/oder an Knochenmark gebundenen zeUuläre Bestandteüe (rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen, StammzeUen oder Thrombozyten) oder spezifische Subpopula- tionen dieser ZeUen zu manipuUeren, depletieren und/oder entfernen, u einen klinischen Effekt zu erzielen. Eine solche Kombination aus Plasmapherese und Cytapherese wird bevorzugt unter Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide hergesteUt.
In einer bevorzugten Ausführuiigsform betrifft die vorUegende Erfindung ein (Apherese-) Verfahren zur exttakorporalen Manipulation, Depletion und/oder Entfernung lösücher, suspendierter oder zeUulärer Bestandteüe des Blutes umfassend die folgenden Schritte: • GegebenenfaUs Auftrennung des Blutes in eine oder mehrere Fraktionen mit festen und/oder flüssigen Bestandteüen; • Bindung von lösUchen, suspendierten oder zeUulären Bestandteüe des Blutes an eine mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid gekoppelte Oberfläche oder Partikel; und • GegebenenfaUs Abtrennung der gebundenen lösUchen, suspendierten oder zeUulären Bestandteüe des Blutes.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Aphereseverfahrens kann vor der gegebenenfaUs stattfindenden Aufteennung des Blutes optional eine Blutentnahme an einem Patienten durchgeführt werden. Weiterhin kann optional das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Blut oder die so behandelte Blutfraktion dem Patienten wieder reinjiziert werden. Dazu ist es gegebenenfaUs erforderUch, die zuvor aufgetrennten und unter Umständen verschieden behandelten Blutfraktionen mit anderen nicht behandelten festen und/oder flüssigen Bestandteüen des Blutes wiederzuvereinigen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren entstandene Volumenverluste können durch Zugabe geeigneter Flüssigkeiten, z.B. durch Zugabe einer isotonischen Kochsalzlösung, ausgegUchen werden.
Der im erfindungsgemäßen Aphereseverfahren enthaltene Schritt zur Bindung der lösUchen, suspendierten oder zeUulären Bestandteüe des Blutes an eine mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid gekoppelten Oberfläche oder Partikel kann je nach Erfordernis einmalig oder mehrmaUg durchgeführt werden, um eine gewünschte Selektivität zu erzielen.
In dem erfindungsgemäßen Aphereseverfahren werden solche Oberflächen und/oder Partikel eingesetzt, die mit einem erfindungsgemäßen, wie oben definierten Polypeptid, kovalent ge- koppelt wurden. Dazu wird bevorzugt das erfindungsgemäße Polypeptid über die im Polypeptid enthaltene(n) Kopplungsgruppe(n) A auf die Oberfläche und/oder den Partikel kovalent gekoppelt.
Eine Kopplung der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide über die einzelnen Komponenten A findet bevorzugt wie in DE 101 44 252 AI beschrieben statt. Die Kopplung der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide erfolgt dabei bevorzugt an Oberflächen oder Partikeln (Träger) über eine Bindung zwischen ersten auf der Trägeroberfläche vorhandenen funktioneUen Gruppen und im Polypeptid über die in Komponenten A enthaltenen Kopp- lungsgruppen. Diese Kopplungsgruppen sind bevorzugt komplementär zu den funktioneUen Gruppen des Trägers und können mit diesen eine affine, vorzugsweise kovalente Bindungen eingehen. Vorzugsweise ist die funktioneUe Gruppe der Komponente A innerhalb der Komponente A so positioniert, dass sie außerhalb der für die biologische Aktivität verantwortlichen Domänen des erfindungsgemäßen Polypeptids in einem geeigneten Abstand angeordnet ist. Auf diese Weise ist es erfindungsgemäß mögUch, TNF gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivitäten auf dem Träger zu immobilisieren. Nach Immobüisierung ist das erfindungsgemäße Polypeptid bevorzugt so auf der Trägeroberfläche fixiert, dass die dreidimensionale Struktur der für die biologische Aktivität erforderUchen Domäne(n) gegenüber nicht-immobüisiertem erfindungsgemäßem Polypeptid nicht verändert ist, und dass die Domäne(n) bei Kontakt mit zeUulären Reaktionspartnern für diese frei zugängUch ist/ sind.
In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die funktioneUe Gruppe der Trägeroberfläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygrup- pe, Maleiniixiidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgrup- pe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
Erfindungsgemäss werden die Kopplungsgruppen der zu immobüisierenden Komponenten A des erfindungsgemäßen Polypeptids ausgewählt aus einer Gruppe, die die gleichen Spezies wie für die funktioneUe Gruppe der Trägeroberfläche enthält. Eine im erfindungsgemäßen Aphereseverfahren verwendbare Oberfläche/Partikel (^Träger) weist also auf seiner Oberflä- ehe eine funktioneUe Gruppe auf, die kovalent mit einer Kopplungsgruppe des zu immobüisierenden erfindungsgemäßen Polypeptids verknüpft ist, wobei die Kopplungsgruppe des Polypeptids eine andere Gruppe als die funktioneUe Protein des Trägers ist. Die beiden mit- einander in Bindung tretenden Kopplungsgruppen und funktioneUen Gruppen müssen dabei komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine kovalente Bindung mit- einander einzugehen. Wird erfindungsgemäß als funktioneUe Gruppe des Trägers beispielsweise eine Aminogruppe verwendet, ist die Kopplungsgruppe der Komponente A des erfindungs- gemäßen Polypeptids eine Carboxygruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Carbo- xygruppe als funktioneUe Gruppe des Trägers verwendet, ist erfindungsgemäß die Kopplungsgruppe der Komponente A des erfindungsgemäßen Polypeptids eine Aminogruppe. Wird erfindungsgemäß als funktioneUe Gruppe des Trägers eine Thiolgruppe gewählt, ist erfindungsgemäß die komplementäre Kopplungsgruppe der Komponente A des erfindungs- gemäßen Polypeptids eine Maleinimidogruppe. Wird umgekehrt eine Maleirimidogruppe als funktioneUe Gruppe des Trägers ausgewählt, ist erfindungsgemäss die komplementäre Kopplungsgruppe der Komponente A des erfindungsgemäßen Polypeptids eme Thiolgruppe. Wird erfindungsgemäß als funktioneUe Gruppe des Trägers Alkylketongruppe, insbesondere Me- thylketon-oder Aldehydgruppe verwendet, ist die funktioneUe komplementäre Kopplungs- gruppe der Komponente A des erfindungsgemäßen Polypeptids eine Hydrazin-oder Hydra- zidgruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eme Hydrazin-oder Hydrazidgruppe als funktioneUe Gruppe des Trägers verwendet, ist erfindungsgemäß die funktioneUe komplementäre Kopplungsgruppe der Komponente A des erfindungsgemäßen Polypeptids eine AlkyU_eton-, insbesondere Methylketon- oder Aldehydgruppe. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt handelt es sich bei der funktioneUen Gruppe auf der Trägeroberfläche um eine Maleiriimido- Gruppe und bei der Kopplungsgruppe der Komponente A des erfindungsgemäßen Polypeptids um eine Thiol-Gruppe.
Die Immobüisierung erfolgt dabei bevorzugt gerichtet. Im Zusammenhang mit der vorUe- genden Erfindung bedeutet der Begriff „gerichtet immobiüsiert" oder "gerichtete Immobüisierung", dass ein erfindungsgemäßes Polypeptid, insbesondere ein scTNF-MitgUed, an definierten Positionen innerhalb des scTNF-MitgUeds dergestalt an einem Träger immobüisiert ist, dass die dreidimensionale Struktur der für die biologische Aktivität erforderUchen Domäne^) gegenüber dem nicht- nmobüisierten Zustand nicht verändert ist und dass diese TNF- Domäne (n), beispielsweise Bindungstaschen für zeUuläre Reaktionspartner, bei Kontakt mit zeUulären Reaktionspartnern für diese frei zugängUch ist/ sind. "Gelichtet immobüisiert" bedeutet auch, dass die Kopplung des erfindungsgemäßen Polypeptids auf der Trägeroberfläche so erfolgt, dass das immobilisierte Protein bei einer späteren Verwendung in einer zeUulären beziehungsweise zeUähnUchen Umgebung durch Protein-degradierende Enzyme nicht oder nur sehr langsam degradiert werden kann. Das heißt, das immobüisierte erfindungsgemäße TNF-Molekül ist auf der Trägeroberfläche so ausgerichtet, das es so wenig wie mögUch An- griffsptmkte für Proteasen bietet. ZusätzUch kann das erfindungsgemäße Polypeptid vor der Kopplung durch molekularbiologische Verfahren gegen Proteasen resistent gemacht werden, wie z.B. oben für TNF-Mitgüeder bei der Protease TACE beschrieben.
Das erfindungsgemäße Polypeptid behält via seiner gekoppelten Komponente(n) A seine biologische Funktion und die Fähigkeit, mit anderen Verbindungen/Stoffen eine Wechselwirkung einzugehen. Enthält ein erfindungsgemäßes Polypeptid beispielsweise drei Komponenten A (Tiimer). so werden typischerweise jede, zwei oder bevorzugt nur eine der drei Komponenten A auf der Oberfläche/dem Partikel kovalent gebunden.
Zur Kopplung geeignete Oberflächen und/oder Partikel können aUe geeigneten Oberflächen und/oder Partikel umfassen, an die sich erfindungsgemäße Polypeptide koppeln lassen. Bevorzugt sind insbesondere Kulturplatten oder sogenannte Mikrobeads, z.B. Dynabeads (Dy- nal Biotech GMBH), nano-beads, Nanopartikel, oder Festphasen wie beispielsweise Nylon- woüe, Sepharose, Sephadex, etc.. Erfindungsgemäß ist w terhin vorgesehen, dass es sich bei den erfindungsgemäss verwendeten Trägersystemen um kompakte oder hohle Nanopartikel mit Grossen zwischen 25 und 1000 n handelt. Diese bestehen entweder aus organischen oder anorganischen PartikeknateiiaUen. Die Art des Materials kann erfindungsgemäss entsprechend der späteren Anwendung variiert werden, wobei der Träger der Nanopartikel vorzugsweise aus biologisch verträgHchen und/oder biologisch abbaubaren MateriaUen besteht. Im Zusammenhang mit der vorUegenden Erfindung werden unter "Nanopartikeln" weiterhin Bindematrizen verstanden, die einen Träger mit einer Oberfläche umfassen, an dem chemisch reaktive funktioneUe Gruppen angeordnet sind, die mit komplementären funktioneUen Gruppen von zu bindenden Molekülen, insbesondere erfindungsgemäße Polypeptide, affine Bindungen, also kovalente und/oder nicht-kovalente Bindungen, eingehen und auf diese Weise die erfindungsgemäßen Polypeptide an ihren Oberflächen stabü fixieren können. Die Träger der Nanopartikel bestehen aus chemisch inerten anorganischen oder organischen MateriaUen und besitzen eine Grosse von weniger als lμ , vorzugsweise von 25 bis 500 nm. Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Aphereseverfahrens beinhaltet eine biofunktionalisiertc Oberfläche (planar oder als Partikel) z.B. mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid scTNF, welches in der zuvor beschriebenen Art und Weise kovalent und ge- richtet auf der Oberfläche ünmobüisiert wurde. Ein derart biofunktionaUsierte Oberfläche, enthaltend beispielsweise mehrere immobilisierte scTNF Moleküle oder Varianten davon, ermögUcht eine hohe Affinität für die jeweiligen komplementären Bindungspartner, beispielsweise TNFR1 und TNFR2. Die Rezeptoren TNFR1 und insbesondere TNFR2 werden in stark erhöhten Konzentrationen als prozessierte, lösliche Moleküle im Blut von Tumorpa- tienten und bei anderen Erkrankungen gefunden. Die Entfernung von ITSIFR aus dem Blut von Tumorpatienten führt nachweisüch zu klinisch dokumentierten Tumorregressionen, was auf eine Rekonstitution der körpereigenen Abwehr zurückgeführt wird (siehe bspw. Lentz M R, (1999) Therapeutics Apheresis, Vol. 3, No. 1). Ein Aphereseverfahren mit erfindungsge- äßen Polypeptiden, beispielsweise scTNF, ermöglicht, dass bevorzugt beide TNF Rezepto- ren gleichzeitig und effizient aus Proben entfernt werden können. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist die oben beschriebene Tatsache, dass eine Dissoziation einzelner Komponenten A des erfindungsgemäßen Polypeptids nicht mögUch ist, d.h. weder ein Aktivitätsverlust der funktionalisierten Oberfläche noch eine Kontamination des behandelten Blutes mit abdissoziierten Stoffen zu erwarten ist.
Das erfindungsgemäße Aphereseverfahren kann als kontinuierUches Verfahren oder als dis- kontinuierUches Verfahren durchgeführt werden. Als kontinuierUches Verfahren wird das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt direkt anschließend an die Blutentnahme bzw. die Fraktionierung des entnommenen Blutes und vor der Rückführung des Blutes in den Patien- ten ohne zwischenzeitliche Lagerung des Blutes oder der erhaltenen Blutfraktionen durchgeführt. In einem diskontinuierUchen Verfahren kann dagegen das entnommene Blut bzw. die Fraktionen des entnommenen Blutes nach jedem Schritt für einen bestimmten Zeitraum gelagert werden.
Die Temperatur in erfindungsgemäßen Aphereseverfahren Uegt bevorzugt bei 0-40°C. Bei einen kontinuieUchen Verfahren Uegt die Temperatur bevorzugt bei bei 25 bis 40°C, beson- ders bevorzugt in einem Bereich zwischen 36 und 38°C. Bei einen diskontinuierUchen Verfahren kann die Temperatur zwischen 0-40°C Uegen.
Das wie oben beschriebene erfindungsgemäße Aphereseverfahren wird bevorzugt zur Diag- nose, Therapie und/oder Prophylaxe bei mit den mit MitgUedern der TNF-Ligandenfamüie assozüerten Erkrankungen eingesetzt, insbesondere bei Tumorerkrankungen, insbesondere soüden oder lymphatischen Tumoren, insbesondere soUden und lymphatischen Tumoren. Die Wiederherstellung der Homöostase des Tmmunsystcms mit seinen humoralen und zellulären Komponenten wird als Schlüssel der Wirksamkeit von Aphereseverfahren angesehen. In einer weiteren Anwendung kann das erfindungsgemäße Apheresesystem deshalb auch zur WiederhersteUung der Immunhomöostase bei nicht malignen Erkrankungen eingesetzt werden. Dazu gehören inflammatorische Erkrankungen, arthritische und rheumatischen Erkrankungen, oder Erkrankungen des Immunsystems, sowie zur Behandlung Infektionskrankheiten, Stoffwechselerkrankungen, Entzündungszuständen, hyperproUferatorische Erkrankun- gen, Autoimmtineiiαrankungen, insbesondere rheumatoider/ artistischer Erkrankungen, toxischer epidermaler Nekrolyse (TEN), Multiple Sklerose, Hashimoto Thyroiditis, GvHD, vitale Flepatitis (HBV, HCV), Alkohol-induzierter Hepatitis, Abstoßungsreaktionen bei Lebertransplantation, Erkrankungen, die auf hyperapoptotischen Reaktionen beruhen, degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen.
Bei Tumorerkrankungen sind insbesondere mit umfasst Kolonkarzinome, Melanome, Nierenkarzinome, Lymphome Akute myeloide Leukämie (AML), Akute Lymphoide Leukämie (ALL), chronische myeloide Leukämie (CML), chronische lymphozytische Leukämie (CLL), Gastrointestinale Tumore, Lungenkarzinome, GUome, SchÜddrüsentumore, Mammakarzi- nome, Prostatatumore, Hepatome, diverse virus-induzierte Tumoren wie z.B. Papülomvirus- duzierte Karzinome (z.B. Cervixkarzinom), Adenokarzinome, Herpesviren-induzierte Tumore (z.B. Burkitt's Lymphom, EBV- duziertes B ZeUlymphom), Hepatitis B-induzuierte Tumore (HepatozelUcarzinome), HTLV-1 und HTLV-2 induzierte Lymphome, Akustikus- neurinom, Gebärmuttehalskrebs, Lungenkrebs, Rachenkrebs, AnaUsarzinom, GUoblastom, Lymphome, Rektumkarzinom, Astrozytom, Himtumore, Magenkrebs, Retinoblastom, Basa- Uom, Hirnmetastasen, MeduUoblastome, Scheidenkrebs. Batxchspeicheldrüsenkrebs, Hodenkrebs, Melanom, Schüddrüsenkarzinom, Blasenkrebs, Hodgkin-Syndrom, Meningeome, Schneeberger Krankheit, BiOnchialkarzinom, Flypophysentumor, Mycosis fungoides, Speiseröhrenkrebs, Brustkrebs, Karzinoide, Neurinom, SpinaUom, Burkitt-Lymphom, Kehlkopf- krebs, Nierenkrebs, Thymom, Corpuskarzinom, Knochenkrebs, Non-Hodgkin-Lymphome, Urethrakrebs, CUP-Sysndrom, Kopf-Hals-Tumore, OUgodendrogUom, Vtüvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinom, Ösphaguskarzinom, Warzenbeteüigung, Dünndarmtumore, Krani- opharyngeome, Ovar_al-I<_arzinom, Weichteütumore, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Pankreas- karzinom, Zervixkarz om, Endomettiumkarzinom, Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, GaUenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytom, Gebärmutterkrebs, Lidtumor, Prostatakrebs, etc..
Arthritische Erkrankungen umfassen insbesondere Monarthritis, OUgoarthritis, Polyarthritis, akute Artiiritis (v.a. septische, I stallinduzierte, reaktive Arthritis und akute Arkoidose), subakute Arthritis, chronische Artiiritis, (v.a. rheumatoide Arthritis, Arthritis bei seronegativer Spondylarthritis), infektiöse Arthritis, para- oder postinfektiöse Arthritis, rheumatoide Arthri- tis, juvenüe chronische Arthritis, Arthritis bei entzündUchen Bindegewebeerkrankungen und VaskuUtiden, aUergische Arthritis, Arthritis in Verbindung mit Stoffwechselerkraiikungen und ernährungsbedingten Störungen, Arthritis bei endokrinen Störungen, A_.i-hritis bei granuloma- tösen Erkrankungen, Arthritis bei Erkrankungen des hämatopoietischen Systems, Arthritis bei Gelenkblutungen infolge von Störungen der Blutgerinnung, neoplastische Arthritis, para- neoplastische Artiiritis, (post-)traumatische Arthritis, Arthritis bei Erkrankungen des Gelenkknorpels, Arthritis bei Neuropathien, Artiiritis bei pustulösen abszedierenden, nekrotisieren- den oder mit Gewebeneuttophüie einhergehenden Dermatosen, Arthritis bei sonstigen exttaartikulären Grunderkrankungen, sowie Arthritis allergica, Chlamydien-induzierte Arthritis, Arthritis dysenterica, Artiiritis gonnorrhoica, Arthritis mutilans, Arthritis psoriatica, Artl - ritis sicca, Arthritis syphiUtica, Arthritis tuberculosa, Arthritis urica. etc..
Ein weiterer Gegenstand der vorUegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Vakzin, enthaltend erfindungsgemäße Polypeptide, erfindungsgemäße Nuk- leinsäurekonstrukte, erfindungsgemäße Vektoren und/oder erfindungsgemäße WirtszeUen sowie pharmazeutisch unbedenkUche Hufs-, Zusatz- und/oder Trägersubstanzen (z.B. auch Lösungs Vermittler). Die pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Vakzine gemäß der Erfindung werden bevorzugt zur Behandlung von I_rebser__ra ü_ungen. insbesondere soUden oder lymphatischen Tumoren, eingesetzt sowie zur Behandlung von Infektionskrankheiten, Stoffwechselerkrankungen, Entzündungszuständen, hyperproUferatorische Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, insbesondere rheumatoider/arthritischer Erkrankungen, toxischer epidermaler Nekrolyse (TEN), Multipler Sklerose, Hashimoto Thyroiditis, GvHD, viraler Hepatitis (HBV, HCV), Alkohol-induzierter Hepatitis, Abstoßungsreaktionen bei Lebertransplantation, Erkrankungen, die auf hyperapoptotischen Reaktionen beruhen, degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen.
Damit wird erfindungsgemäß auch eine Kombination erfindungsgemäßer Substanzen mit pharmazeutisch akzeptablen Träger-, Hufs- und/oder Zusatzstoffen offenbart. Entsprechende HersteUungswege sind bei „Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Eas- ton, PA, 1980) offenbart, das Bestandteü der Offenbarung der vorUegenden Erfindung ist. Für die parenterale Verabreichung kommen als Trägerstoffe bspw. steriles Wasser, sterüe Kochsalzlösungen, Polyalkylenglykole, hydrogenierte Naphthalen und insbesondere biokompatible Lactidpolymere, Lactid/GlycoUdcopolymer oder Polyoxyethylen- /Polyoxypropylencopolymere in Betracht. Derartige erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen kommen für alle oben offenbarten medizinischen Indikationen in Betracht. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Zusammensetzungen Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Lactose, Mannitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol an erfindungsgemäße Inhibitoren, Komplexierung mit MetaUionen oder Einschluß von MateriaUen in oder auf besondere Präparationen von Polymerverbindung, wie z.B. Polylaktat, Polyglykolsäure, Hydrogel oder auf Liposomen, Mikroemulsion, MiceUen, unilamelare oder multilamelare Vesikel, Erythrozyten-Fragmente oder Sphä- roplasten, enthalten. Die jeweiligen Ausführungsformen der Zusammensetzungen werden abhängig vom physikaUschen Verhalten, beispielsweise in HinbUck auf die LösUchkeit, die Stabüität, Bioverfügbarkeit oder Abbaubarkeit gewählt. Kontrollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wirkstoffkomponente in der Zusammensetzung schließt For- muüerungen auf der Basis Upophüer Depots ein (z.B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vorUegenden Erfindung werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer Substanzen oder Zusammensetzungen, enthaltend solche Substanzen, nä üch Beschichtungen mit Polymeren offenbart (z.B. Poloxamere oder Poloxamine). Weiterhin können die erfin- dungsgemäßen Substanzen bzw. Zusammensetzungen protektive Beschichtungen, z.B. Pro- teaseinhibitoren oder Permeabüitätsverstärker, aufweisen.
GrundsätzUch werden im Rahmen der vorUegenden Erfindung für erfindungsgemäße Sub- stanzen oder erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen oder Vakzine aUe im Stand der Technik bekannten Verabreichungswege offenbart, bevorzugt erfolgt die Herstellung eines Arzneimittels bzw. einer Vakzine zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen oder Störungen auf dem parenteralen, d.h. beispielsweise subkutanen, intramuskulären oder intravenösen, oralen, intranasalen, intraoticalen, transdermalen, topicalen (z.B. via Gele, Sal- ben, Lotionen, Cremes, etc.), intraperitonealen, intrapuknonalen (z.B. AERx® Inhalations- technologie, kommerzieü erhältlich von Aradig oder Inhance™ Pulmonales Übertragungssystem, kommerzieU erhältlich von Inhale Therapeutics), vaginalem, rectalem, oder intraoku- larem Verabreichungsweg. Typischerweise werden erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen fest, flüssig oder aerosolartig (z. B. Spray) sein - je nach Art der Konfekti- onierung oder Verabreichung.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird bei Bedarf einem Patienten eme therapeutisch effektive Menge emes erfindungsgemäßen Polypeptids verabreicht. Die genaue Dosis hängt übücherweise von dem Zweck der zugrundeUegenden Behandlung ab und kann durch einen Fachmann unter Heranziehung bekannter Verfahren aus dem Stand der Technik bestimmt werden. Wie im Stand der Technik bekannt können beispielsweise Anpassungen in Bezug auf den metaboUschen Abbau der erfindtu gsgemäßen Polypeptide, in Bezug auf systemische versus lokale Verabreichung, wie auch an das Alter, Körpergewicht, an den aUgemeinen Gesundheitszustand, das Geschlecht, die Ernährung, Zeit der Verabreichung, Wechselwirkung der Wirkstoffe miteinander, oder an die Schwere der Erkranlαing notwendig sein. Solche Anpassungen können durch einen Fachmann mittels im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Kombination erfindungsgemäßer Polypep- tide zur Verwendung als Adjuvanz offenbart. Ein Adjuvanz im Sinne dieser Erfindung ist insbesondere eine Zusammensetzung, die als solche keine spezifische Immunantwort gegen ein Immunogen hervorruft, jedoch in der Lage ist, die Immunantwort gegen dieses Immuno- gen zu steigern. Anders formuUert ruft eine Verabreichung des Adjuvanz aüeine keine Immunantwort gegen dieses Immunogen hervor, während eine Verabreichung zusammen mit diesem Immunogen eine Immunantwort erzeugt wird, die stärker ist Immunantwort nach Verabreichung des Immunogens aUeine. Ein Adjuvanz kann zusätzUch pharmazeutisch ak- zeptable Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthalten oder verabreicht werden, wie hier für Vakzine und pharmazeutische Zusammensetzungen offenbart. Weiterhin kann ein Adjuvanz zusammen mit oben offenbarten Vakzinen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden.
Zusammenfassend ist festzusteüen, daß die Erfindung ein Polypeptid bereitsteüt, das erhöhte Stabüität aufweist, dadurch dass das gesamte Molekül eines Mitgüeds der TNF- I gandenfamüie aus einem Protein- bzw. Polypeptidstrang besteht (z.B. scTNF), so daß die Monomere (Komponenten A) der MitgUeder der TNF-Ligandenfamüie nicht mehr dissozüe- ren können. scTNF, wie auch erfindungsgemäße Polypeptide, die andere MitgUeder der TNF- ligandenfamilie betreffen, zeigt in der Art seiner Bioaktivität keine qualitativen Unterschiede zu dem normalen lösUchen sTNF (auch Wüdtyp TNF oder wtTNF), ist jedoch weitaus stabiler und zeigt daher höhere Bioaktivität, ist also bei niedrigeren Konzentrationen wirksam. Wie normal lösUches TNF (wtTNF), vermag scTNF in sensitiven ZeUen Apoptose auszulösen, den Transkriptionsfaktor NF-κB zu aktivieren, den Rezeptor TNFR1, nicht aber TNFR2, zu aktivieren sowie in Gegenwart bestimmter Antikörper (z.B. 80M2) auch den Rezeptor TNFR2 zu aktivieren. Dies gut für erfindungsgemäße Polypeptide, die andere MitgUeder der TNF-Ligandenfamüie betreffen. Im Falle einer Verwendung erfindungsgemäßer Polypeptide mit einer Kopplungsgruppe zur HersteUung biofunktionaUsierter Oberflächen und Verwendung derselben bspw. zur Apherese ist kein Ausbluten des erfindungsgemäßen Polypeptids oder eine Rückführung von schädUchen 1 iganden in das System zu beobachten.
Weiterhin steUt das erfindungsgemäße Polypeptid, beispielsweise scTNF, ein ideales Ausgangsmaterial zur HersteUung neuer, bi-funktioneUer Moleküle dar. Zum einen kann das erfindungsgemäße Polypeptid, beispielsweise scTNF, bzw. funktioneUe Fragmente hiervon kovalent an ZeUoberflächen binden. Das hat erfindungsgemäß den Vorteü, dass hier zur sta- büen Bindung des Moleküls nur eine einzige kovalente Bindung hergesteUt werden muss. Bei einem normalen lösUchen Wüdtyp MitgUed der TNF-IJgandenfamüie, beispielsweise lösU- chem sTNF, müssen aUe drei Monomere des einzelnen Homotrimers kovalent an die Ober- fläche geknüpft werden, um eine stabüe Kontruktion zu erhalten, da sonst die nicht-kovalent gebundenen Monomere abdissozüeren. In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Polypeptids ist eine Anwendung in der Apherese, z.B. mit scTNF als biofiinktionalem Wirkstoff zur Entfernung von TNF Rezeptoren aus Körperflüssigkeiten, besonders vorteilhaft.
Entsprechendes gut bei der HersteUung von Fusionsproteinen. Diese sind insbesondere interessant, um ein MitgUed der TNF-Ligandenfamüie, beispielsweise TNF, mit Hufe eines an das TNF fusionierten Antikörperfragmentes, bspw. scFv, an einen entsprechenden gewünschten Ort im Körper zu konzentrieren (sog. „targeting" Strategien). Bei normalem lösUchen TNF (wtTNF) muss ein solches Fusionsprotein aus homotrimerem TNF bestehen, bei dem jedes der mindestens drei Monomere den Antikörperteü trägt, wodurch große und instabüe Moleküle entstehen, die wiederum in ihre Monomere dissozüeren und/oder zur Aggregation neigen und damit inaktiviert werden können. Ein vom scTNF abgeleitetes Fusionsprotein ist mit nur einem Molekül Antikörper verknüpft, so dass das gesamte Fusionsprotein wiederum aus einem einzigen, stabüen Protein- bzw. Polypeptidstrang besteht. Das vorstehend für TNF Beschriebene ist auf aUe MitgUeder der TNF-Ligandenfamüie übertragbar.
EbenfaUs ist es durch die vorUegende Erfindung mögUch, aufgrund der kovalenten Verknüpfung der Monomere (Komponenten A) des erfindungsgemäßen Polypeptids gezielt Mutatio- nen in nur eines oder auch zwei oder mehrere der mindestens drei Monomere (Komponenten A) stabü einzufügen. So sind z.B. Punktmutationen bekannt, welche eine Rezeptorselektivität erzwingen, d.h. zum Beispiel im Fall von TNF erfolgt eine Bindung nur noch an einen der beiden TNF-Rezeptoren (TNFR1 und TNFR2). Erfindungsgemäß ist es mögUch, erstmals eine z.B. TNF-Mutante hersteüen, die beispielsweise gezielt ein Molekül TNFR1 und zwei Moleküle TNFR2 gleichzeitig zu binden vermag, d.h. es entstünden heteromere Rezeptorkomplexe. Auf diese Weise ist es erstmals mögUch, heteromere, stabüe, single chain MitgUeder TNF-Iigandenfamüie herzusteüen, die gezielt nur einen von mehreren mögUchen Rezeptor binden und aktivieren.
Selbstverständlich sind die vorstehenden beispielhaft zu TNF erläuterten Ausführungen auf die anderen MitgUeder der TNF-Ligandenfamüie übertragbar. Die vorUegende Erfindung wird durch die nachstehenden Figuren näher erläutert:
Figuren 1 - 3 zeigen Ergebnisse verschiedener biologischer Zytotoxitätstests, in denen die Eigenschaften, insbesondere die Spezifität, unterschiedUcher scTNF Varianten mit denen von klassische lösUchem Wüdtyp-TNF, d.h. der lösUchen extrazeUulären Domäne des humanen TNF (NCBI gi:25952111, 17,09 kDa als Monomer der lösUchen Form, abgekürzt mit TNFhum oder sTNF, AA 79-181) untersucht vergUchen werden.
Für diese Versuche wurden sowohl transfizierte Mausfibroblasten als auch humane Kyml- ZeUen verwendet. DargesteUt werden beispielhafte Ergebnisse der Analysen, wobei scTNF Varianten getestet wurden, die unterschiedlich lange Peptid-Linker zwischen den einzelnen TNF Modulen (d.h. TNF Monomeren) aufweisen. Die Peptid-Linker bestehen jeweüs aus der dreifachen bzw. der vierfachen A ninosequenzwiederholung GGGS (oder auch GlyGlyGly- Ser) (bezeichnet als „singlechainTNF3x" bzw. „singlechainTNF4x" oder als "scTNF3x" bzw. "scINF4x").
Figur 1 zeigt das Ergebnis eines typischen Zytotoxizitästests von TNF. Als ZielzeUen wurden Mausfibroblasten (MF) aus TNFR1/TNFR2 doppel-knockout-Mäusen verwendet, die stabü TNFR1 -Rezeptorchimären (TNFRl-Fas) exprimieren (MF TNFRl-Fas-ZeUen). Solche Zellen exprimierten ein Hybridmolekül, das extrazeüulär aus dem entsprechenden Teü des TNFR1 besteht, und somit TNF bindet, und intrazeUulär die stark apoptotisch wirkende in- trazeUuläre Domäne des Fas-Rezeptors aufweist. Diese MF TNFRl-Fas ZeUen können durch TNFR1 -spezifische Stimuli aktiviert werden, vermittelten jedoch ein Fas-spezifisches Todes- signal. Die überlebende Zellzahl wurde nach 24 Stunden durch Anfärben mit einem Farbstoff durch ihre Absorption quantifiziert. Als NegativkontroUe wurde ein KontroU-Bakterienlysat eingesetzt, wobei es sich um ein nicht-scTNF e_ rimierendes Bakterienlysat handelte, das identisch zu den rekombinanten scTNF-Proteinen prozessiert wurde Im Ergebnis ist festzu- steüen, dass sowohl das herköm nüche humane lösUche TNF (TNFhum) als auch die rekom- binanten scTNF-Varianten zum ZeUtod führten. Es ist ein vergleichbarer dosisabhängiger zytotoxischer Effekt von TNFhum bzw. scTNF zu erkennen (siehe die unteren drei Kurven der Grafik.), wobei die spezifische Aktivität des scTNF mindestens äquivalent, wenn nicht sogar höher, als die des Wüdtyp-TNF ist. Wie erwartet, zeigt die NegativkontroUe keinen toxischen Effekt.
In einem weiteren Versuchsansatz wurde die Wirkung neutralisierender TNF-spezifischer Antikörper auf die Zytotoxität von Wüdtyp TNF (TNFhum) bzw. scTNF getestet. Es wurden frisch angesetzte Verdünnungen von lösUchem humanen TNF (TNFhum) bzw. den o- ben beschriebenen scTNF Varianten mit 3fach (3x) bzw. 4fach (3x) Glycin-Serin Peptid- Linker (sc3_NF3x: GGGS-GGGS-GGGS / scTNF4x: GGGS-GGGS-GGGS-GGGS) eingesetzt. Es wurden Konzentrationsreihen mit 1:3 Verdünnungen in An- und Abwesenheit neut- ralisierender TNF-spezifischer Antikörper (αTNF-AK) [lμg/mL] eingesetzt. Als NegativkontroUe wurde das oben beschriebenen KontroU-Bakterienlysat eingesetzt. Als Ergebnis ist zu erkennen, dass der zytotoxische Effekt von lösUchem humanem Wüdtyp-TNF bzw. scTNF durch neutraUsierende TNF-spezifische Antikörper aufgehoben werden kann (siehe die oberen drei Kurven der Grafik.) und zwar in einem weiten Konzentrationsbereich (0,03 - 10 ng/mL). Unterschiede zwischen der Reaktion von scTNF mit 3-fach und scTNF mit. 4-fach Peptid-Linker wurden nicht festgesteüt werden.
Figur 2 zeigt das Ergebnis eines Zytotoxizitäts-Test, in dem die Wirkung von sTNF und scTNF-Varianten auf TNFR2-Rezeptorchimären (TNFR2-Fas) exprimierende ZeUen unter- sucht wurde. In diesem Versuchsansatz wurden Mausfibroblasten eingesetzt, die stabü Rezeptorchimären, bestehend aus TNFR2 und Fas (TNFR2-Fas, wobei der extrazeUuläre Teü von TNFR2, der intrazeUuläre Teü vom Fas-Rezeptor stammt), exprimieren (MF TNFR2-Fas ZeUen). MF TNFR2-Fas ZeUen (wie auch der WÜdtyp-TNFR2) können ledigUch durch einen adäquaten TNFR2-St_mulus aktiviert werden, beispielsweise durch membranständiges TNF, nicht jedoch durch lösUches TNF. Ergebnis: Wie erwarten, zeigten sowohl das lösUche humane TNF (TNFhuman) als auch die scTNF Varianten mit 3fach und 4fach Peptid-Linker (scTNF3x, scTNF4x) keinen toxischen Effekt auf die MF TNFR2-Fas ZeUen. Mit anderen Worten, sTNF und die scTNF-Varianten vermögen gleichermaßen TNFR2-Chimären (TNFR2-Fas) exprimierende ZeUen nicht zu aktivieren, d.h. sie rufen in diesen ZeUen keinen ZeUtod hervor. Das als NegativkontroUe eingesetzte KontroU-Bakterienlysat (wie oben beschrieben) zeigte erwartungsgemäß ebenfaUs keinen toxischen Effekt. Figur 3 zeigt das Ergebnis eines Zytotoxizitäts-Test, in dem die Wirkung von lösUchem humanem Wüdtyp-TNF und einer scTNF-Variante in Kombination mit einem spezieüen TNFR2-spezifischem Antikörper, 80M2, auf TNFR2-Chimären (TNFR2-Fas) exprimierende ZeUen untersucht wurde. Der Versuchsansatz entspricht dem aus Figur 2 mit dem Unter- schied, dass das lösUche Wüdtyp-TNF bzw. das scTNF mit 3fach Peptid-Linker (scTNF3x) zusammen mit dem Antikörper 80M2 zugegeben wurden. Der Antikörper 80M2 ist dafür bekannt, dass er normalem lösUchem TNF die besondere Signalkapazität von membrangebundenem TNF verleiht. Das Ergebnis zeigt, das sowohl lösUches Wüdtyp-TNF als auch scTNF in Kombination mit dem Antikörper 80M2 über die TNFR2-Fas Rezeptorchimäre einen starken zytotoxischen Effekt erzielen. Grund hierfür ist, dass lösUches TNF in Kombination mit bestimmten TNFR2-spezifischen Antikörpern, wie z.B. 80M2, die Aktivität von membrangebundenem TNF entfalten kann. MF TNFR2-Fas ZeUen sterben nach Inkubation mit lösUchem TNF bzw. dem scTNF in Anwesenheit eines solchen Ligand-Rezeptor Kom- plex-stabüisierenden Antikörpers (80M2-AK). D.h., in Gegenwart dieses Antikörpers rufen lösUches TNF sowie scTNF gleichermassen einen toxischen Effekt in den MF TNFR2/FAS- ZeUen hervor, wie dies sonst nur durch membranständiges TNF erfolgen kann. Das als NegativkontroUe eingesetzte KontroU-Bakterienlysat (wie oben in Fig. 1 beschrieben) zeigte erwartungsgemäß keinen toxischen Effekt.
Figuren 4 — 10 zeigen Ergebnisse verschiedener Stabüitätstests, die nachweisen, dass die erfindungsgemäßen scTNF Varianten aufgrund ihrer Struktur über eine erhebUch bessere Stabi- Utät verfügen als lösUches Wüdtyp-TNF.
Es wurde sTNF bzw. die scTNF Varianten in serumhaltigem Kulturmedium bei Konzentra- tionen von 3,0 bis 0,01 ng/mL bei 37°C und 5% C02 für unterschiedliche Zeiten inkubiert. Im Anschluss wurde die FunktionaUtät der sTNF bzw. scTNF Varianten (scTNF3x, scTNF4x) in Zytotoxizitäts-Tests, basierend auf MF TNFRl-Fas ZeUen und Kyml ZeUen, überprüft. Für diesen Zytotoxizitätstest wurden 1:3 Verdünnungen verwendet, ausgehend von einer 3,0 ng/ml TNF-Probe. Als NegativkontroUe wurde das in den oben beschriebenen Zytotoxitätstests verwendete KontroU-Bakterienlysat eingesetzt (nicht-scTNF exptimierendes Bakterienlysat, das identisch zu den rekombinanten scTNF-Proteinen prozessiert wurde). Figur 4 zeigt die Bioaktivität der eingesetzten Moleküle VOR den Stabüitätstests auf Mausfibroblasten MF TNFRl-Fas ZeUen. Es wurden lösUches humanes Wüdtyp-TNF (TNFhuman) und scTNF Verdünnungen frisch angesetzt und auf den ZeUen ausverdünnt. Sowohl das lösUche KontroU-TNF als auch die scTNF Varianten führten nach Inkubation mit den MF zu deren ZeUtod. Das KontroU-Bakterienlysat zeigte erwartungsgemäß keinen toxischen Effekt. Die ED50— Werte (halbmaximale Wirkkonzentration) lagen bei ca. 0,2 ng/ml für das lösUche humane Wüdtyp-TNF und bei 0,1 ng/ml für die zwei eingesetzten unterschiedUchen scTNF Varianten. Das als NegativkontroUe eingesetzte KontroU-Bakterienlysat zeigte erwartungsgemäß keinen toxischen Effekt.
Figur 5 zeigt das Ergebnis eines Stabüitätstest mit Mausfibroblasten MF TNFRl-Fas ZeUen. Die in Figur 5 gezeigten Wüdtyp-TNF und scTNF Verdünnungen waren hierbei für 8 Tage im Zellinkubator vor Durchführung des Tests inkubiert worden, um die Stabüität der Proben beurteüen zu können. Es konnte eine deutliche Abnahme der Bioaktivität des lösUchen Wüd- typ-TNF (TNFhuman) nach 8 Tagen bei 37°C gemessen werden, während die Aktivität beider scTNF Varianten (scTNF3x, scTNF4x; Erklärung siehe oben) unverändert bUeb. Für das Wüdtyp-TNF ergab sich ein ED50-Wert von etwa 2 ng/ml (frisch verwendet: 0,2 ng/ml, vgl. Figur 4). Die scTNF Varianten bUeben mit ED50 -Werten von ca. 0,1 ng/ml genauso aktiv wie die frisch eingesetzten Proben (vgl. Figur 4). Das als NegativkontroUe eingesetzte Kon- troU-Bakterienlysat zeigte erwartungsgemäß keinen toxischen Effekt.
Figur 6 zeigt das Ergebnis eines Stabüitätstest mit Mausfibroblasten MF TNFRl-Fas ZeUen. Die Wüdtyp-TNF und scTNF Lösungen waren wie in Figur 5 erklärt jetzt für 14 Tage im Zellinkubator inkubiert worden. Es konnte eine deutliche weitere Abnahme der Bioaktivität des Wüdtyp-TNF nach 14 Tagen bei 37°C gemessen werden, während die Aktivität der scTNF Varianten annähernd gleich bUeb. Für sTNF ergab sich ein ED50 -Wert von etwa 2,8 ng/ml (frisch verwendet 0,2 ng/mL, vgl. Figur 4), die scTNF Varianten bUeben mit 0,13 ng/ml fast genauso aktiv wie die frisch angesetzten Proben (0,1 ng/ml, vgl. Figur 4). Das als NegativkontroUe eingesetzte KontroU-Bakterienlysat zeigte erwartungsgemäß keinen toxi- sehen Effekt. Figur 7 zeigt das Ergebnis eines Stabüitätstest mit der humanen ZeUUnie Kyml. Kyml Zellen exprimieren normale humane Wüdtyp TNF Rezeptoren und reagieren ebenfaUs zytoto- xisch auf TNF. Der Versuch wurde analog zu den Stabüitätstests mit Mausfibroblasten gemäß Figuren 4 - 6 durchgeführt: Es wurden lösUches Wüdtyp-TNF bzw. scTNF Varianten (scTNF3x, scTNF4x) in serumhaltigem Medium bei Konzentrationen von 3,0 bis 0,01 ng/mL bei 37°C und 5% COz für unterschiedUche Zeiten inkubiert. Nachfolgend wurde die FunktionaUtät des lösUchen sTNF bzw. der scTNF Varianten in Zytotxizitäts-Tests auf Kyml -ZeUen überprüft. Ausgehend von einer 3,0 ng/mL TNF-Probe wurden 1:3 Verdünnungen für den Test verwendet. Als NegativkontroUe wurde das oben beschriebene KontroU- Bakterienlysat eingesetzt. Es wurden Wüdtyp-TNF und scTNF Verdünnungen frisch angesetzt und eingesetzt. Das Ergebnis zeigt, dass sowohl Wüdtyp-TNF als auch die scTNF Varianten starke zytotoxische Aktivität besaßen. Die ED50-Werte Uegen bei etwa 0,1 ng/ml für das Wüdtyp-TNF und bei ca. 0,06 ng/mL für die scTNF Varianten. Das als NegativkontroUe eingesetzte KontroU-Bakterienlysat zeigte erwartungsgemäß keinen toxischen Effekt.
Figur 8 zeigt das Ergebnis eines Stabüitätstest mit der humanen ZeUUnie Kyml. Die Wüdtyp- TNF und scTNF Lösungen wurden hierbei für 16 Tage im Zelünkubator inkubiert. Anschließend wurde der Kyml -ZeUen Zytotoxizitäts-Test durchgeführt. Es konnte eine deutliche Abnahme der Aktivität des sTNF nach 16 Tagen bei 37°C gemessen werden, wohingegen die Toxizität, d.h. die Bioaktivität, der scTNF Varianten annähernd gleich bUeb. Für Wüdtyp- TNF ergab sich ein ED50 -Wert von ca. 1,2 ng/ml. Die scTNF Varianten bUeben mit 0,06 ng/ml genauso aktiv wie die frisch angesetzten Proben. Das als NegativkontroUe eingesetzte KontroU-Bakterienlysat zeigte erwartungsgemäß keinen toxischen Effekt.
Figur 9 zeigt das Ergebnis eines Stabüitätstest mit der humanen ZeUUnie Kyml. sTNF und scTNF Lösungen wurden hierbei für 22 Tage im ZeUinkubator inkubiert. Es konnte eine deutliche weitere Abnahme der Aktivität des sTNF nach 22 Tagen bei 37°C gemessen werden Die scTNF Varianten waren nach wie vor stabü. Das als NegativkontroUe eingesetzte KontroU-Bakterienlysat zeigte erwartungsgemäß keinen toxischen Effekt.
Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die Ergebnisdaten der Stabüitätstests gemäß Figuren 7 und 9 im Vergleich: Tabelle 1: Vergleich der ED50-Werte aus Figuren 7 + 9
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Figur 10 zeigt das Ergebnis eines Stabüitätstest mit der humanen ZeUUnie Kyml. Es wurden Verdünnungen aus 3 ng/ml nach 16 Tagen bei 37°C austitriert. Im Gegensatz zu den vorherigen Figuren 4 — 9 wurde in diesem Versuch eine Titrationskurve ausgehend von einer 16 Tage gelagerten 3 ng/mL TNF-Verdünnung angefertigt, während bei den vorherigen gezeigten Titrationskurven die jeweiügen Verdünnungen hergesteUt und dann für die angegebene Zeit gelagert wurden. Es bleibt festzusteüen, dass ein Vergleich der Daten aus Figur 8 (analoger Versuch mit 16 Tagen Inkubationszeit) und Figur 10 keine wesentlichen Unterschiede ergibt. Das als NegativkontroUe eingesetzte KontroU-Bakterienlysat zeigte erwartungsgemäß keinen toxischen Effekt.
Figur 11 zeigt das Ergebnis eines Stabüitätstests in humanem Serum. Um die Stabüität von Wüdtyp-TNF und scTNF in humanem Serum zu testen, wurde in einem ersten Versuchsansatz das lösUche Wüdtyp-TNF und die scTNF4x Variante in 100% Serum verdünnt und frisch austariert Als Ergebnis wurde für Wüdtyp-TNF ein ED50 -Wert von 0,004 ng/ml gemessen und für die scTNF Variante ein ED50 -Wert von 0,007ng/ml.
Figur 12 zeigt das Ergebnis eines Stabüitätstests in humanem Serum. Um die Stabüität von Wüdtyp-TNF und scTNF in humanem Serum zu testen, wurde in einem weiteren Versuchsansatz Wüdtyp-TNF und die scTNF4x Variante in 100%igen frischem nicht- hitzeinaktivierten Serum für 8 Tage bei 37°C gelagert und anschließend auf Kyml ZeUen austitriert. Als Ergebnis wurde für Wüdtyp-TNF ein ED50 -Wert von 0,40 ng/ml gemessen und für die scTNF Variante ein ED50 -Wert von 0,03 ng/ml. Die Auswirkungen der 8-tägigen Lagerung in 100%igem Serum steüten sich wie folgt dar: im Vergleich zum frisch austitrierten scTNF zeigte das 8 Tage gelagerte scTNF einen Aktivitätsverlust um den Faktor von ca. 4,3, wohingegen sich für das lösUche sTNF ein dramatischer Aktivitätsverlust um den Faktor 100 während der Lagerung in 100% Serum zeigte. Das erfindungsgemäße scTNF zeigte im Ver- gleich zum sTNF demnach eine erhebUch höhere Bioaktivität nach 8-tägiger Inkubation in Serum und erwies sich damit als sehr stabü in humanem Serum bei physiologischen Temperaturen.
In der nachfolgenden Tabelle 2 sind die Daten der Ergebnisse aus den Figuren 11 und 12 noch einmal zur Verdeutlichung aufgeführt.
Tabelle 2: Vergleich der ED50-Werte aus Figuren 11 + 12
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Figur 13 zeigt das Ergebnis einer Analyse durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen. DargesteUt ist ein Sübergel von aufgereinigtem Wüdtyp-TNF und den aufgereinigten scTNF Varianten scTNF3x und scTNF4x. Die Proben wurden jeweüs mit ß-Mercaptoethanol (final 5%) bei 95°C für 5 min inkubiert. Auf das Sübergel wurden ca. 500 ng sTNF und scTNF4x und ca. 150 ng scTNF3x pro Spur auf- getragen. Das Ergebnis des Sübergels der in einem 15%igem SDS-PAGE aufgetrennten scTNF Varianten zeigt, dass beide scTNF-Varianten auch unter reduzierenden Bedingungen ein Molekulargewicht von ca. 50 kDa aufwiesen, das mit ihrer Struktur übereinstimmt. Fest- zusteüen ist auch, dass die unterschiedlichen Mengen der aufgetragenen Proteine scTNF3x und scTNF4x keinen Einfluss auf das Ergebnis hatten. Dies belegt die Stabüität der erfin- dungsgemäßen Proteine bzw. Polypeptide unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen. Das Ergebnis für sTNF hingegen zeigt, dass das Protein in seine Monomere von ca. 17 kDa zetfillt
Figur 14 zeigt das Ergebnis eines Stabüitätstest unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen. In diesem Versuchsansatz wurde ein Western Blot der in einem 15%igem SDS- PAGE aufgetrennten Proben von Wüdtyp-TNF und den scTNF Varianten scTNF3x und scTNF4x durchgeführt. Es wurden zwei paraüele Ansätze durchgeführt, bei denen die Proben in einem Ansatz jeweüs mit ß-Mercaptoethanol (final 5%) bei 95°C für 5 min inkubiert wurden, während in dem anderen Ansatz keine ß-Mercaptoethanol Inkubation erfolgte. Die Detektion nach dem Lauf der Elektrophorese erfolgte mit einem AntiTNF-Antikörper. Als Ergebnis ist zu erkennen, dass der Antikörper das Protein beider scTNF Varianten in deutlichen Banden bei ca. 50 kDa spezifisch detektierte. Für Wüdtyp-TNF wurden das Protein bei ca. 17 kDa spezifisch detektierte. Dieses belegt wiederum die Stabüität der erfindungsgemä- ßen scTNF3x und scTNF4x Varianten unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen und deckt sich ebenfaUs erwartungsgemäß mit den Ergebnissen aus Figur 13.
Figur 15 zeigt das Ergebnis eines IkappaB-Degradations-Assays. IkappaB (I-κB) ist ein Inhibitor des Transkriptionsfaktors Nuklearer Faktor kappa B (NF-κB), der bekanntermaßen durch TNF der Degradierung zugeführt wird, wodurch NF-κB aktiviert wird. Für den Nachweis der Degradation von I-κB wurden ZeU-Lysate 0, 30 und 60 Minuten nach StimuUerung mit jeweüs 10 ng/ml Wüdtyp-TNF, scTNF3x und scTNF4x hergesteUt und nachfolgend im Western-Blot mit I-κB-spezifischen Antikörpern analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass die tran- siente Degradation von I-κB sowohl von Wüdtyp-TNF als auch von beiden scTNF Varianten induziert wurde, wobei das Reaktionsverhalten der scTNF Varianten dem des Wüdtyp-TNF entsprach. Das als NegativkontroUe eingesetzte KontroU-Bakterienlysat (wie oben beschrieben ein nicht-scTNF expatriierendes Bakterienlysat, das identisch zu den rekombinanten scTNF-Proteinen prozessiert wurde) zeigte erwartungsgemäß keinen Effekt auf die I-κB- Degradation.
Figur 16 zeigt das Ergebnis eines JNK-Assays. JNK (c-jun N-terminale Kinase) ist eine Stress-induzierte Kinase, welche durch TNF bekanntermaßen sehr stark aktiviert wird. Nach StimuUerung von Kym-1 ZeUen für 0, 30 bzw. 60 Minuten mit jeweüs 10 ng/ml Wüdtyp- TNF, scTNF3x und scTNF4x wurden ZeU-Lysate hergesteUt und die JNK-Aktivität über Immunopräzipitation der JNK mit JNK-spezifischen Antikörpern und nachfolgendem Kina- se-Assay mit GST c-Jun als Substrat überprüft. Das als NegativkontroUe eingesetzte KontroU- Bakterienlysat (wie oben beschrieben) zeigte erwartungsgemäß keine Aktivierung der JNK- Kinase. Das Ergebnis zeigt, dass eine Aktivierung von JNK sowohl durch beide scTNF Variante als auch Wüdtyp-TNF erfolgte, wobei das Reaktionsverhalten der scTNF Varianten dem des Wüdtyp-TNF entsprach. Figur 17 zeigt das Ergebnis eines Electrophoretic Mobüity Shift Assays (EMSA). Einen weiteren typischen Nachweis für die Aktivität von TNF steUt die nach erfolgter Induktion der I- κB-Degradation ablaufende Translokation des Transkriptionsfaktors NF-κB in den Zellkern dar. Dazu wurden ZeUkernpräparationen von rucht-stimuUerten KYM-1 KontrollzeUen (NuU Minuten StimuUerung) bzw. von stimuUerten ZeUen (30 und 60 Minuten StimuUerung) hergesteUt. Die StimuUerung der ZeUen erfolgte jeweüs mit Wüdtyp-TNF, scTNF3x und scTNF4x. Der in den Zellkern translozierte Transkriptionsfaktor NF-κB wurde mit Hufe von NF- B- spezifischen, radioaktiv markierten OUgonukleotiden nachgewiesen. Das Ergebnis zeigt, dass NF-κB in den Zellkern ttansloziert wurde. Dabei entspricht das Reaktionsverhalten der scTNF Varianten dem des Wüdtyp-TNF.
Figur 18 zeigt ein beispielhaftes Konstruktschema der erfindungsgemäßen Polypeptide, dar- gesteüt anhand von TNF (als ein MitgUed der TNF-Ligandenfamüie). Die Bezeichunungen haben die folgenden Bedeutungen:
die Konstrukte AI/AII und BI/II weisen eine optimierte Codonusage für die Expression der Proteine in E.coli auf, und steüen Moleküle dar, die mit jeweüs GlyGlyGlySer-Dreifachlinker bzw. Vierfachlinker verknüpft sind. AΑe. Moleküle tragen N-terminal einen Histidin-tag zur leichteren Anreinigung, die Moleküle BI/BII tragen zusätzUch eine kurze Arninosäurenkette mit einem Cysteinrest zur gerichteten kovalenten Verknüpfung.
die Konstrukte C bis H sind geeignet für die Expression der Proteine in eukaryontischen Zellen, sie tragen N-terminal entsprechende Leitpeptidsequenzen.
sc = ist die Abkürzung für single chain,
cys = bezeichnet einen N-terminalen Peptidlinker mit internem Cystein für eine kovalente Kopplung,
Ll Iong bzw. L2 long = bezeichnet die Linker 1 bzw. 2, jeweüs mit der Arninosäuresequenz (GGGS-GGGS-GGGS-GGGS) bzw. (GGGS)4> Ll short bzw. L2 short = bezeichnet die Linker 1 bzw. 2 jeweüs mit der Aminosäuresequenz (GGGS-GGGS-GGGS) bzw. (GGGS)3>
Leitpeptidsequenz = ist die Aminosäuresequenz für die Sekretion des Proteins aus eukaryon- tischen (Wirts-)ZeUen.
scFv40 = steht für die Sequenz des Einzelketten (scFv)-Antikörperfragmentes 40, das spezifisch für das Tumorstroma-Antigen FAP ist,
AMAIZe = ist die Abkürzung für "Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine" und
His/Flag-Tag = steht für die Peptidsequenz zur Affinitätsreinigung der exprimierten Proteine
Figur 19 zeigt die Nukleinsäuresequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz von scTNF-Lsh0„ (Konst ukt A-II) Merkmale Konstrukt A-II
• His-Tag Peptidsequenz zur Affinitätsreinigung des gebüdeten Proteins: Aminosäuren (nachfolgend in Figuren 19 bis 26 mit „AA" abgekürzt) AA 5-10, Nukleotid (nachfolgend in Figuren 19 bis 26 mit „NT" abgekürzt) NT 13-30
• Sequenz des humanen TNF Modull (extrazeUuläre Domäne, AA 79-181, des natürUchen, humanen TNF Moleküls, Sequenz mit optimierter E.coü Codonverwendung): AA 11-169, NT 31-507
• Sequenz des (GGGS)3-Iinkerl: AA 170-181, NT 508-543
• Sequenz des humanen TNF Modul2 (extrazeUuläre Domäne, AA 79-181, des natürUchen, humanen TNF Moleküls, Sequenz mit optimierter E.coU Codonverwendung): AA 182- 335, NT 544-1005
• Sequenz des (GGGS)3-Iinker2: AA 336-347, NT 1006-1041 • Sequenz des humanen TNF Modul3 (extrazeUuläre Domäne, AA 79-181, des natürUchen, humanen TNF Moleküls, Sequenz mit optimierter E.coU Codonverwendung): AA 348- 501, NT 1042-1503
• Stopcodon: NT 1504-1506
Figur 20 zeigt die Nukleinsäuresequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz von cys- scTNF-Lshort (Konstrukt B-II) Merkmale Konstrukt B-II • Aminosäure Cys .ein für kovalente Kopplung: AA 9, NT 25-27
• His-Tag Peptidsequenz zur Affinitätsreinigung des gebüdeten Proteins: AA 15-20, NT 43- 60
• Sequenz des humanen TNF Moduli (extrazeUuläre Domäne des natürUchen, humanen TNF Moleküls, Sequenz mit optimierter E.coU Codonverwendung): AA 21-181, NT 61- 543
• Sequenz des (GGGS)3-Linkerl: AA 182-193, NT 544-579
• Sequenz des humanen TNF Modul2 (extrazeUuläre Domäne des natürUchen, humanen TNF Moleküls, Sequenz mit optimierter E.coU Codonverwendung): AN 194-347, NT 580-1041
• Sequenz des (GGGS)3-Iinker2: AA 348-359, NT 1042-1077
• Sequenz des humanen TNF ModuB (extrazeUuläre Domäne des natürUchen, humanen TNF Moleküls, Sequenz mit optimierter E.coU Codonverwendung): AA 360-513, NT 1078-1539
Stopcodon: NT 1540-1542
Figur 21 zeigt die Nukleinsäuresequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz von scFasL (Konstrukt C) Merkmale Konstrukt C
• Leitpeptidsequenz für Sekretion des Proteins in eukaryontischen ZeUen: AAl-15, NT 1- 45
• Flag Tag Peptidsequenz zur Affinitätsreinigung des gebüdeten Proteins: AA 19-26, NT 55-78
• Sequenz des humanen FasL Modull (exttazeUuläre Domäne N 139-281 des natürUchen, humanen FasL Moleküls): AA 30- 173, NT, 90-519
• Sequenz des (GGGS)4-Linkerl : AA 174-189, NT 520-567
• Sequenz des humanen FasL Modul2 (exttazeUuläre Domäne AA 139-281 des natürUchen, humanen FasL Moleküls): AA 190- 332, NT 568-996
• Sequenz des (GGGS)4-Linker2: AA 333-348, NT 997-1044
• Sequenz des humanen FasL Modul3 (exttazeUuläre Domäne AA 139-281 des natürUchen, humanen FasL Moleküls): AN 349-491, NT 1045-1473
Stopcodon: NT 1474-1476
Figur 22 zeigt die Nukleinsäuresequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz von scTRAIL (Konstrukt D) Merkmale Konstrukt D
• Leitpeptidsequenz für Sekretion des Proteins in eukaryontischen ZeUen: AA 1-15, NT 1- 45
• Flag Tag Peptidsequenz zur Affinitätsreinigung des gebüdeten Proteins: AA 19-26, NT 55-78
• Sequenz des humanen TRAIL Modull (exttazeUuläre Domäne AA95-281 des natürUchen, humanen TRAIL Moleküls): AA 30-216, NT 88-648
• Sequenz des (GGGS)4-Iinkerl: AN 217-232, NT 649-696
• Sequenz des humanen TRAIL Modul2 (exttazeUuläre Domäne AA95-281 des natürUchen, humanen TRAIL Moleküls): AA 233-419, NT 697-1257 • Sequenz des (GGGS)4-Linker2: AA 420-435, NT 1258-1305
• Sequenz des humanen TRAIL Modul3 (extrazeUuläre Domäne AA95-281 des natürUchen, humanen TRAIL Moleküls): AA 436-622, NT 1306-1866
• Stopcodon: NT 1861-1863
Figur 23 zeigt die Nukleinsäuresequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz von scTNF (Konstrukt E) Merkmale Konstrukt E
• Leitpeptidsequenz für Sekretion des Proteins in eukaryontischen ZeUen: AA 1-15, NT 1- 45
• Flag Tag Peptidsequenz zur Affinitätsreinigung des gebüdeten Proteins:: AA 19-26, NT 55-78
• Sequenz des humanen TNF Modull (exttazeUuläre Domäne des natürUchen, humanen TNF Moleküls): AA30-184 , NT 88-552
• Sequenz des (GGGS)4-Iinkerl: AA 85-200, NT 553-600
• Sequenz des humanen TNF ModuLZ (exttazeUuläre Domäne des natürUchen, humanen TNF Moleküls): AA 201-355, NT 601-1065
• Sequenz des (GGGS)4-Linker2: AA 356-371, NT 1066-1113
• Sequenz des humanen TNF ModuB (exttazeUuläre Domäne des natürUchen, humanen TNF Moleküls): AA 372-526, NT 1114-1581
• Stopcodon: NT 1799-1581
Figur 24 zeigt die Nukleinsäuresequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz von scFasL-AMAlZe (Konstrukt F) Merkmale Konstrukt F
• Leitpeptidsequenz für Sekretion des Proteins in eukaryontischen ZeUen: AA 1-19, NT 1- 57 • Sequenz des Einzelketten (scFv)-Ant_körperfragmentes 40 spezifisch für das Tumorstroma-Antigen FAP: AA 20-267, NT 58-801
• Flag Tag Peptidsequenz zur Affinitätsreinigung des gebüdeten Proteins: AA278-285, NT 832-855
Sequenz des humanen FasL Modull (extrazeUuläre Domäne, AA 139 -281, des natürUchen, humanen FasL Moleküls): AA 290-432, NT 868-1296
Sequenz des (GGGS)4-Linkerl: AA 433-448, NT 1297-1344
• Sequenz des humanen FasL ModuLZ (exttazeUuläre Domäne, AA 139-281, des natürUchen, humanen FasL Moleküls): AA 449-591, NT 1345-1773
• Sequenz des (GGGS)4-Linker2: AA 592-607 , NT 1774-1821
• Sequenz des humanen FasL ModuB (exttazeUuläre Domäne, AA 139-281, des natürUchen, humanen FasL Moleküls): AA 608-750, NT 1822-2250
• Stopcodon: NT 2251 -2253
Figur 25 zeigt die Nukleinsäuresequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz von scTRAlL-AMAIZe (Konstrukt G) Merkmale Konstrukt G
• Leitpeptidsequenz für Sekretion des Proteins in eukaryontischen ZeUen: AA 1-19, NT 1- 57
• Sequenz des Einzelketten (scFv)-Antikörperfragmentes 40 spezifisch für das Tumorstroma-Antigen FAP: AA 20-267, NT 58-801
• Flag Tag Peptidsequenz zur Affinitätsreinigung des gebüdeten Proteins: AA278-285, NT 832-855
• Sequenz des humanen TRAIL Modull (extrazeUuläre Domäne, AA95-281, des natürU- chen, humanen TRAIL Moleküls): AA 289-475, NT 865-1426
• Sequenz des (GGGS)4-Iinkerl : AA 476-491, NT 1427-1476
• Sequenz des humanen TRAIL ModuLZ (exttazeUuläre Domäne, AA95-281, des natürUchen, humanen TRAIL Moleküls): AA 492-678, NT 1477-2034 • Sequenz des (GGGS)4-Iinker2: AA 679-694, NT 2035-208
• Sequenz des humanen TRAIL ModuB (exttazeUuläre Domäne, AA95-281, des natürUchen, humanen TRAIL Moleküls): AA 695-, NT 2083-2643
• Stopcodon: NT 2644-2646
Figur 26 zeigt die Nukleinsäuresequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz von scTNF-AMAlZe (Konstrukt H) Merkmale Konstrukt H
• Leitpeptidsequenz für Sekretion des Proteins in eukaryontischen ZeUen: AA 1-19, NT 1- 57
• Sequenz des Einzelketten (scFv)-Antikörperfragmentes 40 spezifisch für das Tumorstroma-Antigen FAP: AN 20-267, NT 58-801
• Flag Tag Peptidsequenz zur Affinitätsreinigung des gebüdeten Proteins:: AA 278-285, NT 832-855
• Sequenz des humanen TNF Modull (exttazeUuläre Domäne, AA 79-181, des natürUchen, humanen TNF Moleküls): AA 289-443, NT 865-1329
• Sequenz des (GGGS)4-Linkerl: AA 444- , NT 1330-1377
• Sequenz des humanen TNF ModuLZ (extrazeUuläre Domäne, AA 79-181, des natürUchen, humanen INF Moleküls): AA 460-614, NT 1378-1842
• Sequenz des (GGGS)4-Iinker2: AA 615-630 , NT 1843-1890
• Sequenz des humanen TNF ModuB (exttazeUuläre Domäne, AA 79-181, des natürUchen, humanen TNF Moleküls): AA 631-785, NT 1891-2353
• Stopcodon: NT 2356-2358
Figur 27 zeigt die Pharmakoldnetik von humanem Wüdtyp-TNF und humanem scTNF (vgl. Beispiel 2). Die Daten in Figur 27 zeigen einen klaren Anstieg der in vivo Halbwertszeit der scTNF Varianten. Es wird für scTNF damit gegenüber TNF eine deutUch erhöhte Wir- kungsdauer in vivo erwartet, was damit den Wert von scTNF, insbesondere von scTNF-L2, als potentielles Η erapeutikum unterstreicht.
Figur 28 zeigt kovalent an Partikel (Süica) gekoppeltes CysHis-scTNF. Dieses kovalent ge- koppelte CysHis-scTNF ist bioaktiv und besitzt die besondere Aktivität von membrangebt - denem TNF, i.e. es aktiviert TNFR2. Figur 28 zeigt , daß ZeUen aus Mausfibroblasten, die mit dem Konstrukt TNFR2-Fas transfiziert sind und mit serieUen Verdünnungen der angegebenen Reagenzien behandelt wurden, völlig rcsistent gegen lösUches wtTNF sind. Nach kova- lenter Kopplung von reduziertem CysHis-scTNF an Süica- Micropartikel (beads) nach etab- Uerten ProtokoUen (DPA 2001, Nr. DE10144252) bewirken diese eine starke zytotoxische Antwort (Kreis), ähiüich wie eine PositivkonttoUe bestehend aus CysHis-scTNF und einem TNFR2 vernetzenden Antikörper, mAk 80M2 (Dreieck). Nicht gekoppletes Cys-FIis scTNF zeigt erwartungsgemäß keine Aktivität auf TNFR2 positiven ZeUen (Quadrate).
Die vorUegende Erfindung wird nachfolgend durch die Beispiele ülustriert:
Beispiele
Beispiel 1: HersteUung verschiedener erfindungsgemäßer Polypeptid-Konstrukte
AUe Klonierungen wurden nach StandardprotokoUen durchgeführt. Im Folgenden werden die
Bedingungen dieser aufgeführt.
Standard-PCR:
60 ng Template, 0,5 μl 100 μM Primer, 1 μl 10 mM dNTPs sowie 5μl lOx Puffer und 2 U Taq-Polymerase wurden in einem Reaktionsvolumen von 50 μl mit folgendem PCR-
Programm ampUfiziert Denaturierung: 94°C 3 min; 15 Zyklen: Denaturierung 94°C 30s, An- neaüng 55°C 30s, Elongation 72°C 90s; finale Elongation: 72°C 7 min.
Verdau von PCR Produkten:
Das PCR-Produkt wurde über ein Agarose Gel aufgereinigt und eluiert und nachfolgend mit den jeweiUgen Restriktionsenzymen (s. genaue Angaben) in einem 40 μl Reationsansatz bei optimaler Spalttemperatur (wird vom HersteUer angeben) für 2 Stunden verdaut.
Verdau von Vektoren: lμg Vektor wurde mit 5U der entsprechenden Restriktionsenzyme in einem 20 μl Reaktionvolumen für 2 Stunden bei optimaler Spalttemperatur (diese ist abhängig vom verwendeten Enzym und wird vom HersteUer angegeben) verdaut. Zur DephosphoryUerung von Vektoren wurde 10 U Alkalische Phosphatase für 1 Stunde zu dem Reaktionsverdau gegeben. ..Fill in"-Reaktion:
Der Ansatz eines Vektorverdaus wurde mit 33 μM dNTPs und lU/lμg DNA Klenow- Fragment der DNA-Polymaerase I versetzt und 15 min bei 25°C inkubiert. Diese Reaktion wurde mit 10 mM EDTA für 20 min bei 75°C gestoppt. Ligation: Vektor und Insert wurden in einem molaren Verhältnis von 1:5 zusammen mit 400 U Ligase in einem 10 μl Volumen über Nacht bei 16°C Ugiert
1. HersteUung von scTNFhuman (scTNF) mit vier- oder dreifach Linkern:
Es wurden zwei scTNF Varianten hergesteUt, die sich durch die Länge des Peptid-Linkers zwischen den einzelnen Modulen unterscheiden. Es wurden Primer mit 4fach bzw. 3fach Peptid-Iinker-Sequenz eingesetzt: LinkerIong mit (GGGS)4- oder I_inkersIl0rt mit (GGGS)3- Sequenz. Die erzeugten Konstrukte enthielten demnach entweder nur zwei 4fach Linker (Ll oder L2 mit (GGGS)4- als „long" bezeichnet) oder nur zwei 3-fach linker (Ll oder L2 mit (GGGS)3- mit „short" bezeichnet). 1. Mit den Primem V und I bzw. II (für Iinkerlong) und dem pQE-9 Vektor mit einem TNF Modul (pQE9-HisTNF) als Template wurde eine Standard-PCR durchgeführt. Der Vektor trägt eine His Tag Sequenz zur späteren Affinitätsaufreinigung des produzierten Proteins.
2. Das erhaltene PCR-Produkt I wurde nachfolgend mit 20 U der jeweiUgen Restriktionsen- zyme StuI und Hindlll bei 37°C verdaut. Der gleiche Verdau sowie eine Dephosphory- Uerungsreaktion wurde mit dem pQE9-HisTNF Vektor durchgeführt und durch eine Ligation das PCR-Produkt I in den pQE9-HisTNF Vektor eingebracht. Ergebnis dieses Schrittes war ein His Tag - TNF Modull mit einem Linker lshortb2V long. bzw. folgendes Konstrukt im pQE9-Vektor: EcoRI- His Tag - TNF Modull -Linke_lshortb2w. Iong - BamHI 3. Über eine weitere PCR mit den Primern III und I bzw. II (für Iinkerlong) und dem pQE9- HisTNF Vektor als Template wurde das PCR-Produkt II erzeugt. Das PCR-Produkt II wurde nachfolgend mit jeweüs 20 U der Restriktionsenzyme EcoRI und Hindlll geschnitten und in den pQE9-HisTNF Vektor, der mit den gleichen Enzymen geschnitten und dephosphoryUert wurde, eingebracht. Ergebnis dieser Klonierung war ein pQE9-Vektor, der wie folgt aussah: TNF Modul2- Linke_2shortb2w.long - BamHI Dieses Konstrukt trägt keine Sequenz für einen His-Tag vor der TNF Sequenz.
4. Das Monierte PCR-Produkt II aus Schritt 3 wurde zunächst mit dem Restriktionsenzym Hind III und nachfolgend partieU mit BamHI (1 U/μg DNA) aus dem Vektor herausgeschnitten Der pQE9-His Tag TNF Modull -Linker lshort bz_. long Vektor wurde ebenfaUs mit den Restriktionsenzymen BamHI und Hindlll sequentieü geschnitten, dephosphoryUert und das PCR-Produkt II in diesen Vektor Ugiert Ergebnis war ein pQE9-Vektor mit folgendem Konstrukt: His Tag - TNF Modull -Linkerlshortb2w long-TNF Modul2 -Li__ke_28hortb2w.long.
5. Mit dem pQE9-HisTNF-Nektor als Template und den Primern III und IV wurde eine weitere PCR unter Standardbedingungen durchgeführt und das erhaltene PCR-Produkt III mit den Restriktionsenzymen BamHI (40U) und Hindlll (40U) sequentieü verdaut. Dieses Fragment wurde dann in einen pBluescript SKII Vektor, der ebenfaUs mit den Re- striktionsenzymen BamHI und Hindlll geschnitten wurde, Ugiert. Ergebnis dieser Klonierung war ein pBluescript SKII Vektor, der das TΝF Modul 3 ohne Linker enthält.
6. Der pQE9- Vektor mit dem His Tag - TΝF Modull -L_nkerl8hort b2w. long -TΝF Mo- dul2 -Linker2short b2w long Konstrukt wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten, anschUeßend wurde dieser Vektor mit dem Klenow-Fragment der DΝA-Polymerase I aus E. coU behandelt, um ein „fül in" vorzunehmen. Nach diesem Schritt wurde ein par- tieüer Restriktionsverdau mit dem Enzym BamHI (1 U/μg DNA) durchgeführt
7. ParaUel zum Schritt 6. wurde der pBluescript SKII Vektor, der das TNF Modul 3 enthält, mit dem Restriktionsenzym Xbal geschnitten, anschließend wurde dieser Vektor mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coU behandelt, um ein „fül in" vorzu- nehmen. Nach diesem Schritt wurde ein zweiter Restriktionsverdau mit dem Enzym BamHI unter Standardbedingungenmit zusätzlicher DephosphoryUerung durchgeführt. 8. Das durch den Restriktionsverdau erhaltene Fragment aus Schritt 6. wurde nachfolgend in den im Schritt 7 generierten linearem Vektor Ugiert. Die Konstrukte lagen in reverser Anordnung wie folgt gezeigt vor: Hindlll- TNF ModuB- Linker2short .Iong-TNF Modul2-Iinkerlshortbzw.long-TNF Modull- His Tag -EcoRI
9. Das reverse Uegende TNF- Konstrukt aus Schritt 8. wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Hindlll aus dem pBluescript SKII Vektor herausgeschnitten und in dem mit den gleichen Enzymen behandelten sowie dephosphoryUerten pQE9-HisTNF Vektor U- giert. Hierdurch entstand folgendes Konstrukt mit dem voüständigen scTNF in korrekter Orientierung: EcoRI- His Tag-TNF Modull-Liι_ke_lshortb2w.long-TNF Modul2- Li_ιker2shortb2w long- TNF ModuB- Hindlll
10. Zur HersteUung eines scTNF mit einem N-terminalen Cystein wurden die OUgos cys- scTNF VI und VII annealed (je 20μl lOOμM OUgo VI bzw VII wurden zusammen für 5 min bei 95°C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abkühlen lassen) und so das OUgo 1 gebüdet Es wurde das Konstrukt aus Punkt 9 mit den Restiktionsenzymen EcoRI und Bbsl verdaut und das OUgol, welches über die gleichen SchnittsteUen verfügt, in den Vektor Ugiert. . Alternativ wurde das Cystein über PCR-Mutagenese eingefügt. Ergebnis dieser Klonierung war folgendes Konstrukt: EcoRI- Cystein - His Tag - TNF Modull-Linke_lshortb2w long- TNF Modul2- Lin- ket28hortb2w long- TNF ModuB- Hindlll
AUe Konstrukte wurden mittels Sequenzierung verifiziert
Die Expression erfolgte im E.coU Stamm XL-1 blue. Die Aufreinigung der exprimierten scTNF Varianten erfolgte mit Hufe chromatographischer Methoden (His Tag Affinitäs- und Anionenaustauscherchromatographie) .
Nachfolgend werden die Sequenzen der verwendeten Primer angegeben: Peptid-Linker Sequenzen auf Proteinebene
3fach GGGS-Linker (short) = (GGGS)3: GGGS GGGS GGGS 4fach GGGS-Linker (long) = (GGGS)4: GGGS GGGS GGGS GGGS
Peptid-Linker Sequenzen auf Nukleotidebene
3fach GGGS-Linker (short): 5'GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGA TCC3' 4fach GGGS-Linker (long): 5 'GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGA TCC3
Primer für die Klonierungen
scTNF Primer I
5'- TCG ATT AAG CTT CCC GGG GGA TCC GCC ACC AGA ACC GCC ACC AGA ACC GCC ACC CAG AGC GAT GAT ACC GAA GTA AAC CTG ACC -3'
scTNF Primer II 5'- ATC GAT TAA GCT TCC CGG GGG ATC CGC CAC CAG AAC CGC CAC CAG AAC CGC CAC CAG AAC CGC CAC CCA GAG CGA TGA TAC CGA AGT AAA CCT GAC C -3'
scTNF Primer III 5'- CCC CGA ATT CGG ATC CTC TTC TCG TAC CCC GTC TGA CAA ACC G -3'
scTNF Primer IV
5'- GGG GGG GAA GCT TAT CGA TAG TTA GAT ATC ATC ACA GAG CGA TGA
TAC CGA AG -3'
scTNF Primer V
5'- CCT GTA CCT GAT CTA CTC CCA GGT TCT GTT CAA AGG CCA GG -3' OUgo für CysHis-Insertion :
cys-scTNF Primer VI
AAT TCA TTA AAG AGG AGA AAT TAA CTA TGG GAG AGC TCA TCG ANG GTC GCT GCG CCG GTG GAT CTG GTC ATC ATC ATC ACC ATC ACG GCT CAG ACG G
cys-scTNF Primer VII
CGCTCC GTCTGAGCC GTGATGGTGATGATGATGACCAGATCCACC GGC GCA GCGACC TTC GAT GAG CTC TCC CATAGTTAATTT CTC CTC TTT AATG
II. HersteUung von scFasL in pcDNA3 und AMAIZe-Konstrukte: Für nachfolgende Klonierungen wurden die unter Beispiel 1 angegebenen Standardbedingungen verwendet.
A. Generierung vom HA-Signal in pcDNA3
1. Verdau des pcDNA3-Vektors mit Kpnl und Notl. 2. HersteUung des HA-OUgo mit Kpnl-HA-Signal-Notl-Sequenz über Anneaüng der Primer HA-IF und HA-IIR für Leitpetidsequenz:
3. Ligation des HA-OUgos (enthält Kpnl und Notl- SchnittsteUe) in den pcDNA3-Vektor
B. HersteUung des scFasL im pcDNA3(+)- Vektor 1. PCR mit Primer FasL#lF und FasL#2R auf Template FasL-AMAIZE-Vektor. Die HersteUung dieser Art von Konstrukten werden in der Patenanmeldung DE 10045591.3 beschrieben, die hiermit voUinhaltUch zum Offenbarungsgehalt der vorUegenden Erfindung gemacht wird. Produkt dieser PCR 1 war ein Notl - Flag Tag - FasL Modull-Linkerl- BamHI-Xbal Konstrukt. 2. Über die Notl und Xbal Resttiktionsschnittsteüe wurde dieses Konstrukt in den mit den gleichen Enzymen verdauten pcDNA3-HA Sequenz Vektor kloniert, so dass folgendes Konstrukt entsteht: HA Sequenz - Flag Tag - FasL Modull - Linkerl - BamHI - Xbal
3. Mit Hufe einer weiteren PCR auf dem Template FasL-AMAIZE Vektor und den Primern FasL#3 und FasL#l wurde folgendes PCR-Produkt 2 generiert: blunt end- FasL Modul2 - Litιker2 - BamHI - Xbal
4. Im nächsten Schritt wurde der pcDNA3 Vektor aus Punkt 2 mit BamHI verdaut, diese Schnittsteüe mit dem Klenow Enzym aufgefüüt und nachfolgend mit Xbal geschnitten, so dass ein „blund end" und ein „sticky end" entstand. In diesen so modifizierten Vektor wurde anschUeßend das PCR-Produkt 2 Moniert, wodurch folgendes Konstrukt gebüdet wurde: HA Sequenz - Flag Tag - FasL Modull - Linkerl-Fasl Modul2- Linke_2- BamHI - Xbal
5. Für das dritte Modul wurde eine weitere PCR mit dem Template FasL-AMAIZE Vektor und den Primern FasL#4 und FasL#5 durchgeführt. Das gebüdete PCR-Produkt wurde anschließend mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xbal verdaut und in den mit den gleichen Enzymen geschnitten Vektor aus Punkt 4 Ugiert. Resultat dieser Klonierung war folgendes Konstruk im pcDNA3 Vektor: HA Sequenz - Notl - Flag Tag - FasL Modull - Linkerl-FasL Modul2- Linker2- FasL ModuB - stop -Xbal.
Für die HersteUung der scFasL- bzw. scTNF-AMAIZe Konstrukte wurden die jeweiligen scFasL bzw. scTNF mit den Restriktionsenzymen Notl bzw. EcoRI und Xbal verdaut und die Inserts als Kassette in die entsprechenden AMAlZe-Vektoren (siehe Patentanmeldung DE 10045591.3) eingefügt, wobei diese Vektoren ebenfaUs mit den Enzymen Notl bzw. E- coRI und Xbal geschnitten wurden. Hierüber wurden folgende Konstrukte hergesteUt:
Leitpeptid-scFv40-Flag Tag- FasL Modull-Linkerl-FasL Modul2-Linker2- FasL ModuB
Leitpeptid-scFv40-Flag Tag- TNF Modull-Linkerl-TNF Modul2-Linker2- TNF ModuB Nachfolgend werden die Sequenzen der verwendeten Primer angegeben:
FasL#lR:
5'ATCGATTTCTAGACCCGGGGGATCCGCCACCAGAACCGCCACCAGAACCGCC ACCAGAACCGCCACCGAGCTTATATANGCCGAAAANCGTCTGAGATTC3 '
FasL#2F:
5 'GGGGTAGCGGCCGCGCTGTCGACGATTACAAAGAC3 '
FasL#3F:
5 ΑGAAAAAAAGGAGCTGAGGAAAGTGG3X
FasL#4F:
5 'GGGGCGGATCCGAAAAAAAGGAGCTGAGGAAAGTGG3 '
FasL#5R:
5 'GGGGCCTCTAGAATCGATGGTCAGAGCTTATATAAGCCGAAAAACGTCTG3 '
HA-IF 5 'CGCCAT GGCTATCATC TACCTCATCC TCCTGTTCAC CGCTGTGCGG GGAGC3'
HA-IIR
5 'GGC CGC TGC CCC GCA CAG CGG TGA ACA GGA GGA TGA GGT AGA TGA TAG CCA TGG CGG TAC3'
III. scTRAIL-Klonierung und HersteUung von scTRAIL AMAIZe Konstrukten Für nachfolgende Klonierungen wurden die unter Beispiel 1 angegebenen Standardbedingun- gen verwendet.
1. PCR mit Primem TRAIL#1 und TRAIL#2 auf Template pcDNA3-sc40-TRAIL (siehe Patenanmeldung DE 10045591.3). PCR-Produkt 1 wurde mit EcoRI und Xbal geschnit- ten und in den mit den gleichen Restriktionsenzymen verdauten pcDNA3-scFasL Vektor Ugiert. Dieser Verdau deletierte die FasL Sequenz, wobei die HA- und die Flag Tag Sequenz erhalten bUeb und nun folgendes Konstrukt entstanden war: HA-Sequenz - Flag Tag - TRAIL Modull - Linkerl- BamHI - Xbal 2. Mit Hufe der Primer TRAIL#1R und TRAIL#2F wurde mit dem Template TRAIL- AMAlZe (siehe. Patentanmeldung DE 10045591.3) das PCR-Produkt 2 generiert. Dieses wurde nur mit Xbal geschnitten, wobei ein blund-end und ein sticky-end entsteht. Das Konstrukt aus Punkt 1 wurde mit BamHI verdaut und nachfolgend mit dem Klenow- Enzym behandelt, so dass die Enden aufgefüllt wurden. Im Anschluß daran wurde ein Xbal Verdau durchgeführt und das PCR-Produkt 2 in diesen Vektor Moniert. Ergebnis war folgendes Konstrukt: HA-Sequenz - Flag Tag - TRAIL Modull - Linkerl - TRAIL Modul2 - Linker2 - BamHI - Xbal
3. Für die Klonierung des TRAIL Moduls 3 wurde eine PCR mit den Primem TRAIL#4 und TRAIL#5 auf dem Template TRAIL-AMAlze durchgeführt, das Produkt nachfolgend mit BamHI und Xbal verdaut und in das Konstrukt aus Punkt 2 — ebenfaUs mit BamHI und Xbal verdaut- Moniert, wodurch folgendes Konstrukt entstanden ist: HA-Sequenz - Flag Tag - TRAIL Modull - Linkerl - TRAIL Modul2 - Linke_2 - TRAIL ModuB Stop - Xbal
Für die HersteUung der scTRAIL-AMAlZe Konstrukte wurden die jeweüigen scTRAIL Vektoren mit den Restriktionsenzymen Notl bzw. EcoRI und Xbal verdaut und die Inserts als Kassette in die entsprechenden AMAlZe-Vektoren (siehe. Patentanmeldung DE 10045591.3), wobei diese Vektoren ebenfaUs mit den Enzymen Notl bzw. EcoRI und Xbal geschnitten wurden. Hierüber wurden folgende Konstrukte hergesteUt:
HA-svFv40-Flag Tag- TRAIL Modull -Linkerl -TRAIL Modul2-Linker2- TRAIL ModuB
Nachfolgend werden die Sequenzen der verwendeten Primer angegeben: Primer für die scTRAIL Klonierung
TRAIL#1R:
5'ATCGATTTCTAGACCCGGGGGATCCGCCACCAGAACCGCCACCAGAACCGCC ACCAGAACCGCCACCGCCAACTAAAAAGGCCCCGANAAAACTGGCTT- CATGGTC3'
TRAIL#2F:
5 'GGGGTAGANTrCGGAACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAGTTCAAG3 '
TRAIL#3F:
5 'AACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAG3 '
TRAIL#4F:
5 'GGGGCGGATCCACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAG3 '
TRAIL#5R:
5'GGGGCCTCTAGAATCGATGGTCAGCCANCTAAAAAGGCCCCGAAAAAACTGG
C3'
Beispiel 2: Phamiakokinetik von humanem Wüdtyp-TNF und humanem scTNF.
6 Wochen alte Balb/c Mäusen wurden i.v. mit 12 μg TNF oder sc TNF (jeweüs 3 Mäuse) injiziert. AUe 45 min. wurde Blut abgenommen, gesammelt und die Konzentration von TNF im Serum wurde mittels eines humanen TNF spezifischen ELISA Kits bestimmt. Die Daten in Figur 27 zeigen einen Maren Anstieg der in vivo Flalbwertszeit der scTNF Varianten. Es wird daher für scTNF erwartet, daß es eine deutlich erhöhte biologische Wirkdauer in vivo besitzt, was damit den Wert von scTNF als potentieUes Therapeutikum unterstreicht
Beispiel 3: Kovalent an Partikel (Süica) gekoppeltes CysHis-scTNF.
Mausfibroblasten, die mit dem Konstrukt TNFR2-Fas ttansfiziert sind, wurden mit serieUen Verdünnungen der angegebenen Reagenzien behandelt. Diese ZeUen sind völlig resistent ge- gen lösUches wtTNF. Nach kovalenter Kopplung von reduziertem CysHis-scTNF an Süica- Micropartikel (beads) nach etabUerten ProtokoUen (DPA 2001, Nr. DE10144252) bewirken diese eine starke zytotoxische Antwort (Kreis), ähnUch wie eine PositivkonteoUe bestehend aus CysHis-scTNF und einem TNFR2 vernetzenden Antikörper, mAk 80M2 (Dreieck). Nicht gekoppletes Cys-His scTNF zeigt erwartungsgemäß keine Aktivität auf TNFR2 positiven ZeUen (Quadrate). Kovalent gekoppeltes CysFIis-scTNF ist bioaktiv und besitzt die besondere Aktivität von membrangebundenem TNF, i.e. es aktiviert TNFR2.
Beispiel 4: Vergleich von Standard rekombmantem humanen (rh)TNF und scTNF in in vivo Tumornekrose- ModeUen und in vitro L929-Zytotox_zitäts-Aktivität
Mäuse: C3H/HeJ (weibUch), 17 - 19 g von Charles River
Tumor ZeUen: CFS-1 Methylcholanthrene-induziertc FibrosarkomazeUünie aus C3H/HeN abgeleitet aus Maus (Referenz: Hafner M., P. Orosz, A. Krüger, und D.N. Männel. 1996 TNF promotes metastasis by im.pairing natural küler ceü activity. Internat. J. Cancer 66:388-392);
Tumornekrose Experiment: Die Mäuse erhielten 1.6 x 107 CFS-1 ZeUen in 50 μl Medium (RPMI, 10% FCS) intradermal in den Rücken; Die Tumore Ueß man 12 Tage wachsen, bis sie eine Größe von etwa 5-6 mm Durchmesser, vor der inttaperitonealen Injektion mit TNF (10 μg pro Maus) üi 200 μl PBS oder PBS aüeine als KontroUe, erreichten. Die Tumorgröße wurde tägUch gemessen und makroskopisch untersucht. Die Mäuse wurden am 6. Tag nach der Behandlung getötet und die Tumore für die Histologie entfernt. Die Tumore wurden herausgeschnitten, über Nacht in 4% PBS-gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin ein- gebettet. Equatoriale Vertikdschnitte (4μm) wurden mit Hematoxüin und Eosin gefärbt und mikroskopisch auf Nekrose untersucht (wie z.B. beschrieben in: Lucas R. et al., 2001, Int J Cancer, 91:543-549).
TNF: rhTNF spezifische Aktivität 6.6 x 106U/mg (48 h L929 Test ohne Act D) scTNF
In vitro Experiment, LD50 Aktivität im L929 Zytotoxizitätsassay mit ActD für: rhTNF = 391 pg/ml scTNF = 39 pg/ml (getestet mit den gleichen TNF Proben, die für in vivo Experimente eingesetzt wurden) scTNF zeigt in diesem in vitro Experiment eine 10-fach erhöhte Aktivität.
In vivo Tumor Nekrose Experiment:
Gruppe n Tumordurchmesser Nekrose dO d4 makroscopisch* mikroskopisch** <5% >10%
PBS 6 5.2+1 7.4+0.5 1 2 0 rhTNF 7 5.2+0.9 6.6+1.7 3 6 1 scTNF 7 5.9+0.5 7.3+0.3 5 0 7
* = makroskopisch Mar erkennbare oberflächliche Nekrose ** = bei mikroskopischer Untersuchung zentrale hämorrhagische Nekrose, <5% oder >10% des Tumorgewebes
Schlußfolgerung: Nach 4 Tagen Behandlung mit Einzeldosen wurde kein Unterschied in der Tumorgröße festgesteUt (einen UberbUck über TNF als Tumortherapeutücum siehe z.B. Eggermont et al, Lancet Oncol. 4.429 (2003)). rhTNF induzierte Meine hämorrhagische Nekrosen (<5% des Tumorareals), makrosko- pisch nur in 3/7 der Tiere zu sehen. scTNF induziert größere hämorrhagische Nekrosen (> 10% des Tumorareals) in aüen Tumoren (7/7), 5/7 davon sind makroskopisch zu sehen. scTNF >> rhTNF in Bezug auf Tumorzyto toxizität in vitro und Induktion von Nekrose.

Claims

Patentansprüche
1. Polypeptid umfassend mindestens drei Komponenten A und mindestens zwei Komponenten B, wobei jede Komponente A ein Monomer eines MitgUeds der TNF- Iigandenfamüie oder ein funktioneUes Fragment und/oder eine funktioneUe Variante hiervon ist und jede Komponenten B ein Peptid-Iinker ist.
2. Polypeptid gemäß Anspruch 1, wobei die Komponenten A identisch oder verschieden sind.
3. Polypeptid gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Komponenten A aus dem gleichen Organismus oder verschieden Organismen stammt/ stammen.
4. Polypeptid gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Komponenten A ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus FasL, TRAIL, TNF, CD30L, CD40L, OX40L, RANKL, TWEAKL, LTalpha, LTbeta, LIGHT, CD27L, 41-BB, 41BBL, GITRL, APRIL, EDA, VEGI und BAFF.
5. Polypeptid gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Komponenten B jeweüs zwei der mindestens drei Komponenten A miteinander verknüpfen.
6. Polypeptid gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei mindestens eine der Komponenten B die Aminosäuresequenz (GGGS)3 oder (GGGS)4 aufweist.
7. Polypeptid gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Komponenten A und die Komponenten B ein trimere Proteinstruktur ausbüden.
8. Polypeptid gemäß Anspruch 7, wobei die Komponenten A und die Komponenten B eine homotrimere Proteinstruktur ausbüden.
9. Polypeptid gemäß Anspruch 7, wobei die Komponenten A und die Komponenten B eine heterotrimere Proteinstruktur ausbüden.
10. Polypeptid gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Komponenten B identisch oder verschieden sind.
11. Polypeptid gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Komponenten B aus dem gleichen Organismus oder verschieden Organismen stammt/stammen.
12. Polypeptid gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Polypeptid eine vorzugsweise N-terminale Tag-Sequenz, insbesondere eine His-Tag-Sequenz oder eine Flag-Tag-Sequenz, aufweist.
13. Polypeptid gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Polypeptid eine vorzugsweise N-terminale Leitpeptidsequenz aufweist.
14. Polypeptid gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Polypeptid mindestens eine weitere Komponente C enthält, die ein Antikörperftagment oder ein anders Protein oder Peptid ist, welches ein spezifisches Zielmolekül auf einer ZeU- Oberfläche selektiv erkennt.
15. Polypeptid gemäß Anspruch 14, wobei die Komponente C ein Antikörperfragment eines Säugetiers, insbesondere murinen oder humanen Ursprungs, oder ein humanisiertes Antikörperfragment ist.
16. Polypeptid gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei das Antikörperfragment in verschiedenen Antikörperformaten vorUegen kann, z.B. als scFv, insbesondere scFv40.
17. Polypeptid gemäß Anspruch 14, wobei die Komponente C ein Protein oder Peptid mit Spezifität für ein ZeUoberflächenmolekül, insbesondere einen Zytokinrezeptor, ein Wachstumsfaktorrezeptor, ein Integrin oder ZeUadhäsionsmolekül ist.
18. Polypeptid gemäß Anspruch 17, wobei der Zytokinrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe der TNFR Genfamüie,.
19. NuMeinsäure, kodierend für ein Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden An- Sprüche 1 bis 18.
20. Vektor, enthaltend die NuMeinsäure gemäß Anspruch 19.
21. WirtszeUe, enthaltend die NuMeinsäure gemäß Anspruch 19 und/oder den Vektor gemäß Anspruch 20.
22. Verfahren zur HersteUung einer WirtszeUe gemäß Anspruch 21, umfassend die folgenden Schritte: a. HersteUen einer NuMeinsäure gemäß Anspruch 19 oder eines Vektors gemäß Anspruch 20, und b. Einbringen der NuMeinsäure und/oder des Vektors gemäß Schritt (a) in eine ZeUe.
23. Verfahren zur HersteUung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 umfassend die folgenden Schritte: a. Kultivieren einer WirtszeUe gemäß Anspruch 21 unter geeigneten Bedingungen, b. Expression der NuMeinsäure gemäß Anspruch 19 unter geeigneten Bedingungen, und c. IsoUeren des Polypeptids aus den WirtszeUen und/oder dem Kulturüberstand.
24. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, einer NuMeinsäure gemäß Anspruch 20, eines Vektors gemäß Anspruch 20 oder einer WirtszeUe gemäß Anspruch 21 zur HersteUung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs- erkrankungen, insbesondere soUden oder lymphatischen Tumoren, Infektionskrankheiten, Stoffwechselerkrankungen, Entzündungszuständen, hyperproUferatorische ErMankungen, Autoimmunerkrankungen, insbesondere rheumato/arthritische Er- krankungen, toxischer epidermaler Nekrolyse (TEN), Multiple SMerose, Hashimoto Thyroiditis, GvHD, vitale Hepatitis (HBV, HCV), Alkohol-induzierter Hepatitis, Abstoßungsreaktionen bei Lebertransplantation, Erkrankungen, die auf hyperapoptoti- schen Reaktionen beruhen, degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegene- rativen Erkrankungen.
25. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, einer NuMeinsäure gemäß Anspruch 19, eines Vektors gemäß Anspruch 20 oder einer WirtszeUe gemäß Anspruch 21 zur Behandlung von Kirebserkrankungen, insbesondere soUden oder lymphatischen Tumoren, Infektionskrankheiten, Stoffwechselerkrankungen, Entzündungszuständen, hyperproUferatorische Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, insbesondere rheumato/arthritische Erkrankungen, toxischer epidermaler Nekrolyse (TEN), Multiple SMerose, Hashimoto Thyroiditis, GvHD, vitale Hepatitis (HBV, HCV), Alkohol-induzierter Hepatitis, Abstoßungsreaktionen bei Lebertrans- plantation, Erkrankungen, die auf hyperapoptotischen Reaktionen beruhen, degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen.
26. Pharmazeutische Zusammensetzung, mindestens enthaltend ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 und/oder einer NuMeinsäure gemäß Anspruch 19 und/oder einen Vektor gemäß Anspruch 20 und/oder eine WirtszeUe gemäß Anspruch 21 sowie pharmazeutisch unbedenkUche Hufs-, Zusatz- und/oder Trägersubstanzen.
27. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 26 zur Behandlung von Krebs- erkrankungen, insbesondere soUden oder lymphatischen Tumoren, Infektionskrankheiten, Stoffwechselerkrankungen, Entzündungszuständen, hyperproUferatorische Erkrankungen, AutoirrrmunerMankungen, insbesondere rheumato/arthritische Erkrankungen, toxischer epidermaler Nekrolyse (TEN), Multiple SMerose, Hashimoto Thyroiditis, GvHD, virale Hepatitis (HBV, HCV), Alkohol-induzierter Hepatitis, Ab- stoßungsreaktionen bei Lebertransplantation, Erkrankungen, die auf hyperapoptotischen Reaktionen beruhen, degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen.
28. Verfaliren zur exttakorporalen Manipulation, Depletion und/oder Entfernung lösU- cher, suspendierter Bestandteile oder zeUulärer Bestandteüe des Blutes umfassend die folgenden Schritte: a) GegebenenfaUs Aufteennung des Blutes in e te oder mehrere Fraktionen mit festen und/oder flüssigen Bestandteüen; b) Bindung von lösUchen, suspendierten oder zeUulären Bestandteüe des Blutes an eine mit einem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 gekoppelte O- berfläche oder Partikel; und c) GegebenenfaUs Abtrennung der gebundenen lösUchen, suspendierten oder zeUulären Bestandteüe des Blutes.
29. Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei vor Schritt a) oder b) eine Blutentnahme an einem Patienten durchgeführt wird.
30. Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei nach Schritt b) oder c) das so behandelte Blut oder die Blutfraktion einem Patienten wieder reinjiziert wird.
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