WO2005097844A1 - ポリマー粒子 - Google Patents

ポリマー粒子 Download PDF

Info

Publication number
WO2005097844A1
WO2005097844A1 PCT/JP2005/004929 JP2005004929W WO2005097844A1 WO 2005097844 A1 WO2005097844 A1 WO 2005097844A1 JP 2005004929 W JP2005004929 W JP 2005004929W WO 2005097844 A1 WO2005097844 A1 WO 2005097844A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sugar chain
group
functional group
substrate
polymer particles
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/004929
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shinichiro Nishimura
Hideyuki Shimaoka
Original Assignee
Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. filed Critical Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Priority to US10/594,182 priority Critical patent/US7985874B2/en
Priority to JP2006511969A priority patent/JP5026070B2/ja
Priority to EP05721116A priority patent/EP1731540A4/en
Publication of WO2005097844A1 publication Critical patent/WO2005097844A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates

Definitions

  • the present invention relates to a support having a functional group that specifically reacts with an aldehyde group of a sugar chain, for example, a sample containing a contaminant such as a biological tissue, and a sugar chain and a sugar chain-containing substance. It relates to polymer particles used for separation, purification and concentration. Further, for example, the present invention relates to a sugar chain chip which is a device in which a sugar chain or a sugar chain derivative is immobilized on a solid phase substrate, and a method of using the same.
  • a sugar chain is a monosaccharide such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N acetyl darcosamine, N acetyl galatatosamine, sialic acid, and a molecule in which derivatives thereof are linked in a chain by glycosidic bonds.
  • Sugar chains are very diverse and are involved in various functions of naturally occurring organisms. Sugar chains are one of the important constituents in living organisms, which often exist as complex carbohydrates bound to proteins, lipids, etc. in the living organism. It is becoming clear that sugar chains in living organisms are deeply involved in intercellular communication, regulation of protein functions and interactions, and so on.
  • biomacromolecules having sugar chains include proteodalican on cell walls of plant cells that contribute to cell stabilization, glycolipids that affect cell differentiation, proliferation, adhesion, migration, and the like.
  • Glycoproteins involved in cell-to-cell interactions and cell recognition include high-precision and precise living organisms, while these high-molecular sugar chains substitute, assist, amplify, regulate, or inhibit each other's functions. The mechanisms that control the reaction are being revealed.
  • this sugar chain engineering, medicine, cell engineering, or organ It is expected that new developments will be closely linked to engineering.
  • Non-Patent Document 1 As an example, research on the occurrence of diseases due to abnormal interactions between cell surface sugar chains and sugar chain receptors, and the role of sugar chains in the infection of viruses such as AIDS. Is becoming active. Research on the involvement of sugar chains in cell-cell interaction and cell-matrix interaction is also becoming important for understanding biological reactions (for example, Non-Patent Document 1).
  • a biochip can be a powerful tool for advancing the analysis of sugar chains that act in various biological reactions.
  • a biochip is a biologically-related substance such as a nucleic acid, a protein, a sugar chain, or the like.
  • a biochip is a substance in which a cell or the like is immobilized on a substrate, and the immobilized substance or the like (referred to as a probe).
  • targets biological substances or other compounds
  • DNA is used to immobilize nucleic acids at a high density on a substrate that has already been widely used in the field of gene function analysis, and to detect the presence of complementary sequences by means of hybridization and hybridization.
  • Examples include a chip (DNA microarray) and a protein chip (protein chip) for fixing proteins expected to be used in the future and detecting interacting proteins.
  • Glycochips with immobilized sugar chains are expected to greatly contribute to the study of interactions between sugar chains and sugar chain receptors, sugar chains and cells, and sugar chains and viruses (for example, Non-Patent Document 2, 3).
  • Sarapiko is also expected to use the sugar chain chip as a device for diagnosing infectious diseases and diseases associated with abnormal sugar chains.
  • Non-Patent Document 1 Cold Spring Harbor Glycobiology, Maruzen, 2003
  • Non-Patent Document 2 Nature (2003, 421, 219-220)
  • Non-Patent Document 3 Current Opinion in Structural Biology (2003, 13, 637-645) Disclosure of Invention
  • an object of the present invention is to provide a support useful for studying the involvement of sugar chains in biological reactions.
  • the present invention provides a polymer particle for separating and purifying only a sugar chain and a sugar chain-containing substance containing a foreign substance such as a biological tissue by a simple operation. It is intended to provide.
  • an object of the present invention is to provide a means for producing a sugar chain chip, which is a device having a sugar chain immobilized on a substrate, by a simple and efficient method. .
  • the present invention is a support comprising a functional group that specifically reacts with an aldehyde group of a sugar chain.
  • a polymer particle used as a carrier for capturing a sugar chain wherein the polymer particle has a functional group that specifically reacts with an aldehyde group of the sugar chain on the surface of the polymer particle.
  • the polymer particles are also composed of a polymer having a functional group that specifically reacts with an aldehyde group of a sugar chain or a polymer obtained by polymerizing a derivative of the monomer.
  • (A1) — (A3) V The polymer particles according to
  • the polymer particles according to (A4), wherein the monomer having a functional group that specifically reacts with the aldehyde group of the sugar chain includes a monomer represented by the following general formula (1) or a derivative of the monomer.
  • R is H or CH, and R is an arbitrary molecular chain and may contain a hetero atom.
  • the polymerization is performed by a suspension polymerization method.
  • A4) (A7) Polymer particles described in V ⁇ or
  • the polymerization is based on an emulsion polymerization method.
  • the polymer particles are spherical particles (A1) — (A9) V, the polymer particles described in any of the above,
  • (B1) a sugar chain chip obtained by immobilizing a sugar chain on at least a part of a substrate, wherein a functional group that specifically reacts with an aldehyde group of the sugar chain is previously introduced on the substrate, A sugar chain chip, wherein a sugar chain is immobilized via the functional group.
  • (B2) The sugar chain chip according to (B1), wherein the functional group is at least one selected from the group consisting of an oxylamino group, a hydrazide group, and a semithiol group.
  • (B5) a coating force on a substrate surface of a substance having a functional group
  • the sugar chain chip according to (B4) which is a molecular film formed on the substrate surface by a Langmuir-Blodgett method
  • R is H or CH, and R may contain a hetero atom in any molecular chain.
  • Substrate is made of plastic.
  • the aldehyde group of the sugar chain is one introduced by periodate oxidation of the sugar chain or an enzyme treatment typified by galactose oxidase treatment (B1) — (Bl 1).
  • the substance contained in the sample solution is selected from blood, serum, cell lysate, protein, nucleic acid, enzyme, lectin, peptide, peptide nucleic acid, antibody, sugar chain, glycoprotein, glycolipid, and their derivatives.
  • (B17) A cell is seeded on the sugar chain chip according to any one of (B1) to (B13), and differentiation, proliferation, adhesion, and mutagenicity of the cell are selected by utilizing an interaction between the sugar chain and the cell. How to use sugar chain chips to control one behavior,
  • the present invention it is possible to provide a support useful for studying the involvement of sugar chains in biological reactions.
  • a sugar chain and a sugar chain-containing substance are separated and purified by a simple operation without going through complicated steps such as fluorescent labeling and purification by chromatodaraph.
  • the polymer particles of the present invention can also be used after being packed in a column or the like, and automation of sugar chain purification and continuous operation can be easily realized.
  • a sugar chain When the support according to the present invention is applied to a sugar chain chip, a sugar chain can be covalently immobilized on a substrate, and a highly reliable and practical sugar chain chip can be obtained. Is achieved.
  • the sugar chain chip prepared by the method of the present invention is used, for example, for studying the interaction between sugar chains and receptors, between sugar chains and cells, and between sugar chains and viruses, and for researching infectious diseases and diseases associated with abnormal sugar chains. Alternatively, it can be used as a diagnostic device.
  • FIG. 1 shows the results of analysis of the sugar chain sample of Experimental Example A4 by MALDI-TOF-MS.
  • FIG. 2 shows the results of MALDI-TOF-MS analysis of the sugar chain sample of Experimental Example A5.
  • FIG. 3 shows the results of MALDI-TOF-MS analysis of the sugar chain sample of Experimental Example A6.
  • FIG. 4 shows the results of measurement of the sugar chain chip of Example B2 using a microarray scanner.
  • FIG. 5 shows the results of measurement of the sugar chain chip of Experimental Example B3 using a microarray scanner.
  • FIG. 6 shows the results of measurement of the sugar chain chip of Experimental Example B4 using a microarray scanner.
  • the support of the embodiment of the present invention has a functional group that specifically reacts with the aldehyde group of the sugar chain.
  • Sugar chains are the only substances in the body that have an aldehyde group. That is, in a sugar chain, a cyclic hemiacetal type and an acyclic aldehyde type exist in an equilibrium state in an aqueous solution or the like. In vivo substances other than sugar chains such as proteins, nucleic acids, and lipids do not contain aldehyde groups. From this, a stable bond is formed by reacting specifically with the aldehyde group. By utilizing the formed functional group, it is possible to selectively capture or immobilize only the sugar chain.
  • Examples of the functional group that specifically reacts with the aldehyde group include an oxylamino group, a hydrazide group, an amino group, a semithiocarbazide group, and derivatives thereof. Among them, an oxylamino group is preferable.
  • the oxime bond generated by the reaction between the oxylamino group and the aldehyde group is easily cleaved by acid treatment or the like, so that after the sugar chain is captured, the sugar chain can be easily separated from the carrier. It is known to be stable at pH.
  • an amino group is frequently used for capturing and supporting a physiologically active substance.
  • the bond (Schiff base) generated by the reaction between an amino group and an aldehyde group has a weak binding force, and therefore a reducing agent or the like is used. Since the secondary treatment is required, the oxylamino group can be more suitably used than the amino group in consideration of performing various treatments of the captured or immobilized sugar chain.
  • the support may be configured in a particle form and used as polymer particles.
  • the polymer particles can be suitably used as a carrier for capturing a sugar chain.
  • the polymer particles used as a carrier for capturing sugar chains are solid or gel that has a functional group that specifically reacts with the aldehyde group of the sugar chain on at least a part of its surface. It is preferably a particle.
  • capture carriers solid or gel particles that has a functional group that specifically reacts with the aldehyde group of the sugar chain on at least a part of its surface. It is preferably a particle.
  • the shape of the polymer particle is not particularly limited, but a spherical shape or a similar shape is preferred.
  • the average particle size is preferably 0.05-1000 m, more preferably 0.05-200 m, even more preferably 0.1-200 m, most preferably Or 0.1-100 / zm. If the average particle size is too small, the polymer particles When it is used after filling, it is necessary to remove a large pressure due to poor liquid permeability, and it is also difficult to recover the polymer particles by centrifugation or filtration. On the other hand, if the average particle size is too large, the contact area between the polymer particles and the sample solution is reduced, and the efficiency of sugar chain capture is reduced. Therefore, by setting the average particle size of the polymer particles in the above range, it becomes possible to provide a sugar chain-trapping carrier excellent in these balances.
  • the polymer particles may exhibit solid or gel properties only when collected by means such as centrifugation or filtration.
  • the polymer dissolved in a solvent can be reacted with a aldehyde group of a sugar chain through a functional group that specifically reacts with the aldehyde group.
  • the solubility can be changed to precipitate the polymer, and the recovered polymer can be recovered.
  • the polymer whose solubility changes depending on the environment include poly (N-isopropylacrylamide).
  • the solubility of the sugar chain-trapping carrier is changed depending on the environment, and the sugar chain is captured. Can be performed.
  • the polymer particles suitably used in the application of the support of the present embodiment as described above can be mass-produced.
  • the polymer particles can be produced, for example, by polymerizing a monomer having a functional group that specifically reacts with an aldehyde group of a sugar chain or a derivative of the monomer.
  • the monomer is preferably a vinyl monomer containing a vinyl group in the molecule.
  • methacrylic acid derivatives, acrylic acid derivatives, styrene derivatives, propylene derivatives, and acrylamide derivatives can be preferably used. More preferred.
  • a functional group which specifically reacts with the aldehyde group of the sugar chain preferably an oxylamino group, is contained as a side chain.
  • the oxylamino group may be protected with a protecting group such as a t-butoxycarbol (BOC) group or a 9-fluorylmethyloxycarbol (Fmoc) group.
  • a spacer single molecular chain may exist between the oxylamino group and the butyl group.
  • oxygen atoms When a spacer monomolecular chain containing a terrorist atom is present, a hydrophilic environment is formed around the oxylamino group, and polymer particles obtained by polymerizing such a monomer have an affinity for a sugar chain around the oxylamino group. Especially preferred because it improves the sex.
  • Examples of such a compound include those represented by the following formula (1).
  • R is H or CH, and R is an arbitrary molecular chain and may contain a hetero atom.
  • the polymer may be a homopolymer of a monomer having a functional group that specifically reacts with an aldehyde group of the sugar chain, for example, a homopolymer of a monomer having an oxylamino group.
  • the polymer does not react with the aldehyde group of the sugar chain.
  • Copolymers with other types of monomers such as acrylic acid, methacrylic acid, acrylamide, styrene, and derivatives thereof which do not have a functional group that reacts with the aldehyde group of the sugar chain may be used. From the viewpoint of obtaining a particulate polymer, it is preferable to obtain the polymer by a heterogeneous polymerization method such as suspension polymerization or emulsion polymerization.
  • the rigidity of the particles can be adjusted by copolymerizing a polyfunctional monomer as a crosslinking agent.
  • a cross-linking agent a divinyl ether conjugate, for example, ethylene glycol dimethacrylate, dibutylbenzene, methylenebisacrylamide, or the like can be appropriately used.
  • the physical properties of the polymer particles can be controlled by changing the intramolecular chain length of the crosslinking agent to be copolymerized.
  • the density of oxylamino groups in the polymer can be controlled by adjusting the charged amount of each monomer and changing the copolymer composition ratio.
  • the control of the oxylamino group density is important from the viewpoint of optimizing the efficiency of capturing sugar chains.
  • the method for obtaining the polymer particles by a method other than polymerizing a monomer having a functional group that specifically reacts with the aldehyde group of the sugar chain includes a method of specifically reacting with the aldehyde group of the sugar chain.
  • a sugar chain is formed via another functional group of a side chain contained in a polymer having no group. It is also possible to introduce a method by grafting a functional group which specifically reacts with the aldehyde group.
  • a step of capturing a sugar chain and a step of separating the sugar chain can be performed to purify the sugar chain.
  • an enzymatic method such as glycobeptidase or a chemical method such as hydrazinolysis or the like is cut out from a biological sample such as serum, tissue fragments or cells.
  • a biological sample such as serum, tissue fragments or cells.
  • a functional group that specifically reacts with the aldehyde group of the sugar chain contained in the polymer particle is bonded to the aldehyde group of the sugar chain, so that only the sugar chain in the biological sample is removed. Supported on.
  • the polymer particles are brought into contact with the sugar chains in the biological sample in a buffer having a predetermined pH.
  • the pH of the buffer for providing this sugar chain capture reaction system is preferably 2-9, more preferably 2-7, and even more preferably 2-6.
  • Various buffers can be used for pH adjustment.
  • the temperature of the sugar chain capture reaction system is preferably 4 to 90 ° C, more preferably 4 to 70 ° C. C, more preferably 10-70 ° C, most preferably 15-60 ° C.
  • the reaction time can be appropriately set.
  • the polymer particles may be packed in a column and passed through a solution of a biological sample so that only the sugar chains are supported on the polymer particles.
  • washing solution water, a buffer solution, an aqueous solution containing a surfactant or a buffer solution, an organic solvent, or the like can be used in an appropriate combination.
  • a particularly preferred method is a method of thoroughly washing with an aqueous solution or buffer containing a surfactant, washing with an organic solvent, and finally washing with water. With these washes, virtually all non-specific adsorbates are polymer Removed from particles. When a sugar chain is captured using a column, the solution can be washed by passing the solution through the column.
  • the bond between the polymer particle and the sugar chain is cleaved, whereby the sugar chain can be cut out and collected.
  • the bond with the sugar chain is an oxime bond, and this bond can be cleaved by acid treatment or the like.
  • an aqueous solution of 0.1 to 10% by volume of trifluoroacetic acid can be suitably used in order to cut out the sugar chains from the polymer particles.
  • the sugar chains recovered by such a method are pure sugar chains that have been purified so as not to contain pods such as proteins, peptides, and nucleic acids, and can be directly subjected to mass spectrometry, nuclear magnetic resonance analysis, and immunological analysis. It can be evaluated by an analysis method such as an analysis method.
  • the polymer particles of the present invention As described above, by using the polymer particles of the present invention, 1) the sample solution and the polymer particles are dispersed and reacted, and the reactant specifically reacts with the aldehyde group of the sugar chain of the polymer particles. 2) Washing and removal of non-specific pods that are non-specifically bound to the polymer particle surface as required, 3) Sugar chain This makes it possible to realize simpler sugar chain purification than conventional methods. Furthermore, the polymer particles of the present invention can be easily mass-produced, and are advantageous in view of industrial applicability.
  • the support can be configured as a part of a substrate, and this substrate can be used as a sugar chain chip.
  • this sugar chain chip at least a part of the functional group specifically reacting with the aldehyde group of the sugar chain contained in the portion corresponding to the support is bonded to the sugar chain, so that the sugar chain is immobilized on the substrate. ing.
  • a sugar chain chip refers to a sugar chain, a sugar chain derivative, a sugar chain-containing substance, etc.
  • the solid substrate may be a flat plate or other shapes, for example, the shape of the above-mentioned particles, a flat plate having a groove, a porous plate, a hollow fiber plate, or the like. Further, it may be a flat plate having a partition like a microtiter plate.
  • the sugar chain may be immobilized on a part of the support constituting the substrate, but may be immobilized on the whole.
  • the sugar chains immobilized may be of one type or of various types.
  • One of the preferred forms is a form (so-called microarray) in which various kinds of sugar chains are aligned and fixed on the surface of a flat substrate.
  • one or more sugar chains are immobilized on the entire surface of the substrate.
  • a sugar chain may be immobilized on the entire inner wall of each well of the microtiter plate.
  • the substrate for the sugar chain chip is preferably made of plastic from the viewpoint of mass productivity and variety of surface treatment.
  • a plastic having a low fluorescence is preferable, for example, a saturated cyclic polyolefin can be suitably used.
  • a polymer As the substance having the functional group, a polymer is preferable.
  • the polymer can be produced by polymerizing a monomer having a functional group that specifically reacts with an aldehyde group of a sugar chain, such as the above-mentioned polymer particles.
  • the monomer is preferably a vinyl monomer containing a vinyl group in the molecule.
  • methacrylic acid derivatives, acrylic acid derivatives , Styrene derivatives, propylene derivatives, acrylamide derivatives and the like can be preferably used, and methacrylic acid derivatives are more preferable.
  • a functional group which specifically reacts with the aldehyde group of the sugar chain preferably an oxylamino group
  • the oxylamino group may be protected with a protecting group such as a t-butoxycarbol (BOC) group or a 9-fluorenylmethyloxycarbol (Fmoc) group.
  • a spacer molecular chain may exist between the oxylamino group and the butyl group.
  • This polymer may be a homopolymer of a monomer having a functional group specifically reacting with an aldehyde group of a sugar chain, for example, a homopolymer of a monomer having an oxylamino group, and does not react with the monomer and an aldehyde group of the sugar chain.
  • Copolymers with other types of monomers such as acrylic acid, methacrylic acid, acrylamide, styrene, and derivatives thereof which do not have a functional group that reacts with the aldehyde group of the sugar chain may be used.
  • a method of introducing a polymer into the polymer by the above-described graft reaction is also possible.
  • a general method such as a dip coating method, a casting method, and a spin coating method can be appropriately used.
  • the concentration of the polymer solution used for coating is preferably 0.01% to 10% by weight, more preferably 0.01% to 5% by weight, and still more preferably 0.01% to 2% by weight.
  • a method of forming a monomolecular film on the substrate surface using the Langmuir-Blodgett method can also be used.
  • an oxylamino group is used as the functional group that reacts with the aldehyde group of the sugar chain, and if the oxylamino group is protected by a predetermined protecting group, the deprotection treatment is appropriately performed after the coating step. So that it can be used for coating.
  • a first functional group is introduced into the surface of a substrate, and a second functional group capable of binding to a sugar chain is introduced through the first functional group.
  • the first functional group include an amino group, a carboxyl group, and a hydroxyl group.
  • plasma irradiation, coating with the first functional group-containing alkoxysilane, surface graft polymerization of the first functional group-containing monomer, or the like can be appropriately used.
  • the first functional group is reacted with a substance having both the functional group capable of reacting with the first functional group and the second functional group, so that the first functional group is interposed.
  • a substance having both the functional group capable of reacting with the first functional group and the second functional group so that the first functional group is interposed.
  • the second functional group As a specific example, a case where an amino group is introduced as the first functional group and an oxylamino group is introduced as the second functional group will be described.
  • a compound (molecule) having both an oxylamino group and a carboxyl group By causing a compound (molecule) having both an oxylamino group and a carboxyl group to act on the first functional group on the substrate surface, a condensation reaction between the amino group and the carboxyl group occurs, and this compound is fixed to the substrate surface.
  • oxylamino groups are introduced on the substrate.
  • aminooxyacetic acid represented by the following formula (2) can be used as the molecule having both an oxylamino group and a carboxyl group.
  • the oxylamino group may be protected with a protecting group.
  • the amino group as the first functional group introduced on the substrate and the carboxyl group of the compound of the formula (2) can be reacted in the presence of a condensing agent represented by a carbodiimide compound. And can be combined.
  • the oxylamino group may be appropriately removed after the step of introducing the oxylamino group, that is, the reaction between the compound of the formula (2) and the amino group on the substrate. Can be.
  • the immobilization of the sugar chain on the substrate is realized by bringing a solution containing the dissolved sugar chain into contact with the substrate surface.
  • One of the preferable modes is a method in which a solution containing a sugar chain is spotted on the substrate surface in an aligned manner.
  • spotted pins for example, “SPBIO” series manufactured by Hitachi Software Engineering Co., Ltd.
  • ink jet methods for example, “Piezorray” manufactured by Perkin-Elmer
  • the liquid for dissolving the sugar chain may contain additives other than the sugar chain, which may be water, a buffer, or other solvents.
  • the additive examples include a surfactant, a polymer compound, and various salts.
  • Surfactants are a useful method for controlling the wettability between the sugar chain solution and the substrate surface. It is preferable that the pH of the sugar chain solution is adjusted to a value which is optimal for the reaction between the aldehyde group of the sugar chain and the functional group on the substrate surface.
  • the type of the sugar chain immobilized may be one or more.
  • a method of immersing the substrate in a solution containing a sugar chain and developing the solution containing the sugar chain on the surface of the substrate.
  • This method is particularly useful when immobilizing sugar chains on the entire surface of the substrate.
  • the substrate has a shape provided with a partition like a well of a microtiter plate, a method of dispensing a sugar chain solution to each well is also useful.
  • one or more kinds of sugar chains may be immobilized.
  • the immobilized small sugar chains may be washed away.
  • the conditions such as the solution for washing and the washing method can be set as appropriate, and for example, a buffer containing a surfactant, pure water, an organic solvent, or the like is preferably used.
  • the bond between the sugar chain and the substrate for immobilizing the sugar chain is caused by the reaction between the aldehyde group of the sugar chain and a functional group that specifically reacts with the sugar chain formed on the substrate, for example, an oxylamino group. It is due to
  • the aldehyde group of the sugar chain may be derived from the reducing end of the sugar chain or may be introduced by other means. Further, the aldehyde group may be introduced into the sugar chain by an enzyme treatment such as acidification by galactose oxidase treatment. This method can be applied to sugar chains with galactose or N-acetylgalatatosamine at the non-reducing end. This is a method for converting hydroxymethyl at the 6-position of galactose to an aldehyde. In addition, the aldehyde group may be guided by converting the terminal of the sugar chain to an aldehyde by periodate oxidation of the sugar chain.
  • a sample solution is spread on a sugar chain chip, and the interaction between a substance contained in the sample solution and the sugar chain on the chip is quantitatively determined.
  • Method This method is used in the same manner as conventional DNA chips and protein chips.
  • Sample solutions include blood, serum, tissue crushed or extracted products, cell crushed or extracted products, proteins, nucleic acids, enzymes, lectins, peptides, peptide nucleic acids, antibodies, sugar chains, glycoproteins. , Glycolipids, and their derivatives.
  • sample solution After the sample solution is spread on the chip and allowed to react for a predetermined time, it is preferable to wash and remove the unreacted sample. If the sample solution contains a substance that interacts with the sugar chain on the chip, this substance remains in the part (spot part) that reacted with the sugar chain immobilized on the chip even after the washing operation. I do. By measuring this residual amount, it is possible to quantify the strength of the interaction between the sugar chain and the sample substance.
  • labeling with a fluorescent substance labeling with a radioisotope, coloring with various coloring agents, spectroscopic measurement means, physical measurement means using an atomic force microscope, etc.
  • it is preferable to quantify the interaction by detecting a signal by fluorescence using labeling with a fluorescent substance.
  • Another preferred method of using the sugar chain chip of the present embodiment is a method of seeding cells on a sugar chain chip and examining the behavior of the cells on the chip. It is said that the sugar chains affect the adhesion, proliferation, differentiation ability, and mutability of cells. Therefore, by utilizing the interaction between sugar chains and cells, the differentiation, proliferation, adhesion, And at least one behavior selected from the variants can also be controlled. That is, such use of a sugar chain chip is a useful means for studying the sugar chain recognition ability of cells, cell-specific culture, control of stem cell induction, and the like.
  • the monomer lg synthesized in Experimental Example A1 was dissolved in 1 ml of chloroform-form, and charged into a reaction vessel equipped with a reflux condenser. 30 ml of pure water and 0.05 g of polyvinyl alcohol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., degree of polymerization: about 1500) were charged into the reaction vessel, and the reaction vessel was set in a constant temperature bath at 65 ° C. While stirring the solution in the reaction vessel, a nitrogen purge was performed for 30 minutes. A solution prepared by dissolving 0.05 g of 2,2'-azobis (isobutyrate-tolyl) in a small amount of chloroform was injected into the reaction vessel to initiate the polymerization reaction.
  • the reaction vessel was immersed in cold water to stop the polymerization reaction.
  • the precipitate formed in the reaction vessel was collected by centrifugation, and the precipitate was washed five times each with methanol and pure water.
  • the precipitate after washing was placed in a container, and a solution obtained by diluting trifluoroacetic acid three-fold with methanol was added in a large excess with respect to the amount of the precipitate.
  • the reaction vessel was placed in a constant temperature bath at 40 ° C., and reacted with shaking for 3 hours to remove the protecting group (BOC group) bonded to the oxylamino group.
  • the precipitate was collected by centrifugation, and washed with methanol and pure water five times each to produce polymer particles.
  • the average particle size of the obtained polymer particles was about 10 m.
  • N-acetyllactosamine manufactured by Sigma
  • the polymer particles lOmg produced in Experimental Example A2 were dispersed.
  • the pH of the solution was adjusted to 2 with a hydrochloric acid buffer, and the reaction was carried out at 40 ° C for 16 hours with shaking. After the reaction, polymer particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was removed. The collected polymer particles were washed five times each with 0.1% aqueous sodium dodecyl sulfate, 50% methanol and pure water.
  • the polymer particles were dispersed in 10% trifluoroacetic acid, and the sugar chains were released by shaking at room temperature for 3 hours.
  • the polymer particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was collected. The collected supernatant was freeze-dried to obtain a sugar chain sample.
  • the amount of the collected sugar chain sample was quantified by the orcinol Z-sulfuric acid method according to a standard method, and the sugar chain capture rate was determined. The results are shown in Table 1. The sugar chain trapping rate was significantly higher than that of Experimental Example 7 described below as a comparative object, indicating that the polymer particles according to the present invention can efficiently collect sugar chains.
  • mice immunoglobulin G IgG
  • N-linked sugar chains were cut out using N-glycopeptidase F according to a standard method.
  • 10 mg of the polymer particles prepared in Experimental Example A2 were dispersed in this solution, the pH was adjusted to 2, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 16 hours with shaking. After the reaction, polymer particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was removed. The collected polymer particles were washed five times each with 0.1% aqueous sodium dodecyl sulfate, 50% methanol and pure water.
  • the polymer particles were dispersed in 10% trifluoroacetic acid, and the sugar chains were released by shaking at room temperature for 3 hours. Centrifugation The polymer particles were precipitated by separation, and the supernatant was recovered. The collected supernatant was freeze-dried to obtain a sugar chain sample.
  • the obtained sugar chain sample was analyzed by MALDI-TOF-MS.
  • the matrix used was 2,5-dihydroxybenzoic acid.
  • Figure 1 shows the measurement results. The molecular weight peak derived from the sugar chain clearly appears, indicating that the sugar chain of the glycoprotein can be purified and recovered using the polymer particles of the present invention.
  • the methyl methacrylate monomer lg was mixed with 1 ml of chloroform, and charged into a reaction vessel equipped with a reflux condenser.
  • 30 ml of pure water and 0.05 g of polyvinyl alcohol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., degree of polymerization: about 1500) were charged into the reaction vessel, and the reaction vessel was set in a constant temperature bath at 65 ° C. .
  • a nitrogen purge was performed for 30 minutes.
  • a solution prepared by dissolving 0.05 g of 2,2'-azobis (isobutyrate-tolyl) in a small amount of chloroform was injected into the reaction vessel to initiate the polymerization reaction.
  • reaction vessel was immersed in cold water to stop the polymerization reaction.
  • the precipitate formed in the reaction vessel was collected by centrifugation, and the precipitate was washed five times each with methanol and pure water to produce polymer particles.
  • the amount of sugar chains contained in the collected sample was quantified by the orcinol Z sulfate method according to a standard method. The results are shown in Table 1. The sugar chain was hardly recovered, and it was shown that the sugar chain could not be purified from polymer particles containing no functional group that specifically reacts with the aldehyde group of the sugar chain.
  • the monomer lg synthesized in Experimental Example A1 and 3 g of methyl methacrylate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were charged into a reaction vessel equipped with a reflux condenser. 30 ml of chloroform was charged into the reaction vessel, and the reaction vessel was set in a constant temperature bath at 65 ° C. While stirring the solution in the reaction vessel, a nitrogen purge was performed for 30 minutes. 0.05 g of 2,2'-azobis (isobutymouth-tolyl) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was charged into the reaction vessel to initiate a polymerization reaction. After the reaction for 16 hours, the polymerization reaction was stopped by immersing the reaction vessel in cold water to obtain a polymer solution.
  • a saturated cyclic polyolefin resin was molded by an injection molding method to produce a lmm-thick flat substrate.
  • the surface of the substrate was subjected to a hydrophilic treatment by a plasma treatment in an oxygen atmosphere.
  • the above substrate was immersed in the polymer solution obtained in Experimental Example B1, and allowed to stand for 30 minutes. After immersion, the substrate was gently lifted and dried at 25 ° C for 1 hour. Subsequently, the substrate was immersed in 1 M hydrochloric acid containing 10% acetic acid for 3 hours to remove the BOC group. The substrate was washed with pure water and air-dried.
  • Mannotriose (manufactured by Dextra Laboratories) was dissolved in acetate buffer (pH 4, 100 mM) at each concentration of 10 mg Zml, lmg / ml, and 0.1 mg / ml. 1 ⁇ l of this solution was spotted on the surface of the substrate prepared above. The substrate after spotting was placed in a humidified chamber and allowed to stand at room temperature for 1 hour. 3% by weight of serum albumin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in Tris-HCl buffer ( ⁇ 7.4, 10 mM). The substrate surface after standing was immersed in this solution at room temperature for 1 hour to block the substrate surface. After blocking, the substrate was washed with pure water and air-dried.
  • acetate buffer pH 4, 100 mM
  • Rhodamine-labeled dani conkananokurin A (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) was dissolved in phosphate buffer (PBS, pH 7.4, 100 mM) at a concentration of 20 ⁇ g Zml. 20 ⁇ l of this solution was dropped onto the substrate after blocking, covered with a cover glass, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, remove the cover glass from the substrate, the cleaning liquid substrate was washed 3 times with (a 0.05 weight 0/0 of TWEEN-20 that was dissolved in PBS). The substrate was further washed with pure water and air-dried.
  • PBS phosphate buffer
  • FIG. 4 shows an image of the fluorescence intensity on the substrate surface.
  • the upper three spots show the mannotriose concentration at the time of spot of 10 mgZml
  • the middle three spots show lmgZml
  • the lower three spots show 0.1 mgZml.
  • a saturated cyclic polyolefin resin was molded by an injection molding method to produce a lmm-thick flat substrate.
  • the surface of the substrate was subjected to a hydrophilic treatment by a plasma treatment in an oxygen atmosphere.
  • Step 1 3-Aminopropyltrimethoxysilane was dissolved in pure water at a concentration of 2% by weight. The above substrate was immersed in this solution. Immersion was performed at 25 ° C for 1 hour. After immersion, the substrate was washed with pure water and dried. This was vacuum dried using a vacuum dryer kept at 45 ° C.
  • Step 2 BOC-aminooxyacetic acid was dissolved in methanol at a concentration of 2% by weight. Further, 1.5 equivalents of a water-soluble carbodiimide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to BOC-aminooxyacetic acid. The substrate of Step 1 was immersed in this solution. The immersion was performed at 25 ° C for 12 hours. After immersion, the substrate was washed with methanol and dried. Subsequently, the substrate was immersed in 1 M hydrochloric acid containing 10% acetic acid for 3 hours to desorb the BOC group. The substrate was washed with pure water and air-dried.
  • a water-soluble carbodiimide manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Rhodamine-labeled concanapalin A was reacted in the same manner as in Experimental Example B2. (Measurement)
  • FIG. 5 shows an image of the fluorescence intensity on the substrate surface.
  • the upper three spots show the mannotrioose concentration at the time of spot of 10 mgZml
  • the middle three spots show lmgZml
  • the lower three spots show 0.1 mgZml.
  • a saturated cyclic polyolefin resin was molded by an injection molding method to produce a lmm-thick flat substrate.
  • the surface of the substrate was subjected to a hydrophilic treatment by a plasma treatment in an oxygen atmosphere.
  • the oxylamino group introduction treatment as performed in Experimental Example B2 did not work.
  • Rhodamine-labeled concanapalin A was reacted in the same manner as in Experimental Example B2.
  • FIG. 6 shows an image of the fluorescence intensity on the substrate surface.

Abstract

　糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を担持してなる支持体、およびこの支持体を適用したポリマー粒子ならびに糖鎖チップ、およびこれらの用途。

Description

明 細 書
ポリマー粒子
技術分野
[0001] 本発明は、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を担持してなる支持体 に関し、例えば生体組織など莢雑物を含む試料力ゝら糖鎖および糖鎖含有物質を分 離 ·精製'濃縮するために用いるポリマー粒子に関する。また、例えば、本発明は糖 鎖あるいは糖鎖誘導体を固相基板上に固定ィ匕したデバイスである糖鎖チップとその 使用方法に関する。
背景技術
[0002] 糖鎖とは、グルコース，ガラクトース，マンノース，フコース，キシロース， N ァセチ ルダルコサミン， N ァセチルガラタトサミン，シアル酸などの単糖およびこれらの誘導 体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
[0003] 糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に 関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質と して存在することが多ぐ生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は 細胞間情報伝達，タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていること が明らかになりつつある。
[0004] 例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の 細胞壁のプロテオダリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質 、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられるが、 これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあ いながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さ らに、このような糖鎖と細胞の分ィ匕増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係 が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に 関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
[0005] その一例として、細胞表面の糖鎖や、糖鎖 レセプター間の相互作用異常による疾 病の発生、あるいはエイズなどのウィルス感染における糖鎖の役割等に関する研究 が活発化してきている。また、細胞 細胞間相互作用、細胞 マトリックス間相互作用 における糖鎖の関与に関する研究も、生体反応を理解する上で重要になってきてい る (たとえば、非特許文献 1)。
[0006] これらの解析のため、糖鎖構造解析の技術が開発されており、これらの技術は、複 合糖質力もの糖鎖切り出し、糖鎖の分離精製，糖鎖の標識ィ匕などの工程を組み合わ せたものである力 これらの工程はきわめて煩雑である。特に、莢雑物を含む試料か ら糖鎖のみを回収する分離精製工程は非常に困難で、高度の熟練を要する。
[0007] 糖鎖の分離精製には、たとえば、イオン交換榭脂，逆相クロマトグラフィ，活性炭， ゲル濾過クロマトグラフィなどの手法が用いられるが、これらの分離手段は糖を特異 的に認識する方法ではないので、莢雑物 (ペプチド，タンパク質など)の混入が避け られず、また糖鎖の構造によって回収率に差異が生じることが多い。さらに、クロマト グラフィで糖鎖を高精度に分離する場合には、糖鎖にピリジルァミノ化などの蛍光標 識を施す必要があり、煩雑な操作が必要となる。蛍光標識した糖鎖を分析するには、 標識後の反応液中より未反応の 2 -アミノビリジン等の夾雑物を除き、該標識化糖鎖 を精製することが必要である。
[0008] 一般には、該標識化糖鎖と夾雑物の分子量の差を利用してゲルろ過を行い、夾雑 物を除去する。し力しながら、この方法は器具を多く用いる点と、操作に多くの時間を 要する点から、多数の試料を短時間に処理するのは困難である。また、簡易な方法と して共沸により夾雑物を留去する方法も試みられているが、十分に夾雑物を除去す るのは難しい。糖鎖構造と各種疾患の関係を調べるためには、統計的処理が可能な 多数の検体の糖鎖構造を調べる必要がある。この場合、従来法のように煩雑な手法 を用いると膨大なコストと時間が必要になる。そこで、簡単な作業で糖鎖を分離精製 する手段が求められていた。
[0009] また、様々な生体反応で作用する糖鎖につ!ヽて解析を進める上で、バイオチップ が強力な手段となり得る。
[0010] ここで、バイオチップとは、核酸、タンパク質、糖鎖等の生体関連物質、ある 、は細 胞等を基板上に固定ィ匕し、固定化された物質等 (プローブと称する）と、生体関連物 質あるいはそれ以外の化合物 (ターゲットと称する）とを接触させ、生じた特異的な相 互作用を検出する生化学的な手法の中で、特に相互作用を大量かつ同時並行的に 行うことによりハイスループットな検出 Z解析を可能としたものをいう。具体的には、既 に遺伝子機能解析分野で広く利用されるようになってきた基板上に核酸を高密度に 固定化し、ノ、イブリダィゼーシヨンにより相補的な配列の存在を検出する DNAチップ (DNAマイクロアレイ)や、今後利用の期待されるタンパク質を固定ィ匕し相互作用す る蛋白質を検出するタンパク質チップ (プロテインチップ)などが挙げられる。糖鎖を 固定ィ匕した糖鎖チップは、糖鎖と糖鎖レセプター，糖鎖と細胞，糖鎖とウィルスなどの 相互作用の研究に大いに寄与すると予想されている（たとえば，非特許文献 2, 3)。 さら〖こは，糖鎖チップを感染性疾患や糖鎖異常関連疾患の診断用デバイスとして利 用することも期待されている。しかしながら、糖鎖を基板上に効率よぐかつ簡便な操 作で固定ィ匕する手段はこれまでに無ぐ解決方法が求められていた。
非特許文献 1 :コールドスプリングハーバー糖鎖生物学，丸善， 2003年
非特許文献 2 : Nature (2003, 421, 219-220)
非特許文献 3 : Current Opinion inStructural Biology (2003, 13, 637-645) 発明の開示
[0011] そこで、本発明は生体反応への糖鎖の関与に関する研究に有用な支持体を提供 することを目的にしている。
[0012] そこで、一つの側面から、本発明は生体組織など莢雑物を含む試料力ゝら糖鎖およ び糖鎖含有物質のみを、簡単な操作で分離精製するための、ポリマー粒子を提供す ることを目的としている。
[0013] また、別の側面から、本発明は基板上に糖鎖を固定ィ匕したデバイスである糖鎖チッ プを、簡便かつ効率的な方法で作製する手段を提供することを目的とする。
[0014] 本発明は、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を担持してなる支持体 である。
具体的には、
(A1)糖鎖を捕捉する担体に用いるポリマー粒子であって、ポリマー粒子の表面に糖 鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有することを特徴とするポリマー粒子 (A2)糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基がォキシルァミノ基，ヒドラジド 基，及びセミチオ力ルバジド基力 選ばれる少なくとも一つである (A1)記載のポリマ 一粒子、
(A3)糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基がォキシルァミノ基である (A1) 記載のポリマー粒子、
(A4)ポリマー粒子が糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有するモノマ 一又は該モノマーの誘導体を重合したポリマー力も構成されるものである (A1)— (A 3) V、ずれか記載のポリマー粒子、
(A5)糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有するモノマーが下記一般 式（1)で表されるモノマー又は該モノマーの誘導体を含むものである (A4)記載のポ リマー粒子、
[0015] [化 1]
( 1 )
Figure imgf000005_0001
[0016] (式中、 Rは H又は CH、 Rは任意の分子鎖でヘテロ原子を含んでもよい。 )
1 3 2
(A6)ポリマーが糖鎖のアルデヒド基と反応しな 、モノマーとの共重合体である (A4) 又は (A5)記載のポリマー粒子、
(A7)糖鎖のアルデヒド基と反応しな 、モノマーが架橋剤として多官能性モノマーを 含むものである（A5)記載のポリマー粒子、
(A8)重合が懸濁重合法によるものである (A4)— (A7) Vヽずれか記載のポリマー粒 子、
(A9)重合が乳化重合法によるものである (A4)— (A7) V、ずれか記載のポリマー粒 子、
(A10)ポリマー粒子の形状が球状の粒子である（A1)— (A9) V、ずれか記載のポリ マー粒子、
(Al 1)粒子の平均粒径が 0. 05— 200 μ mである（A10)記載のポリマー粒子、 (A12) (Al)一 (Al 1) 、ずれか記載のポリマー粒子を用いて糖鎖を捕捉する工程、 及び糖鎖を分離する工程を有することを特徴とする糖鎖の精製方法、
である。
[0017] また、具体的には、
(B1)基板上の少なくとも一部に糖鎖を固定ィ匕してなる糖鎖チップであって、基板上 にはあらかじめ糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基が導入してあり、該官 能基を介して糖鎖が固定化されていることを特徴とする糖鎖チップ、
(B2)官能基がォキシルァミノ基，ヒドラジド基，及びセミチオ力ルバジド基力も選ばれ る少なくとも一つである（B1)記載の糖鎖チップ、
(B3)官能基がォキシルァミノ基である（B1)記載の糖鎖チップ、
(B4)基板上への官能基の導入が、該官能基を有する物質の基板表面へのコーティ ングによるものである（B1)— (B3) V、ずれか記載の糖鎖チップ、
(B5)官能基を有する物質の基板表面へのコーティング力 ラングミュアーブロジェット 法による基板表面での分子膜形成である（B4)記載の糖鎖チップ、
(B6)官能基を有する物質がポリマーである（4)又は（5)記載の糖鎖チップ、
(B7)ポリマーが下記一般式（1)で表されるモノマー単位を含むものである（B6)記載 の糖鎖チップ、
[0018] [化 2]
Figure imgf000006_0001
[0019] (式中、 Rは H又は CH、 Rは任意の分子鎖でヘテロ原子を含んでもよい。 )
1 3 2
(B8)基板上への官能基の導入が、あらカゝじめ基板上に導入された別種の官能基を 介してなる（B1)— (B3) V、ずれか記載の糖鎖チップ、
(B9)基板上への官能基の導入が，あら力じめ基板上に導入されたァミノ基と、ォキ シルァミノ基およびカルボキシル基の両方を有する物質との反応による（B8)記載の 糖鎖チップ、 (BIO)ォキシルァミノ基およびカルボキシル基の両方を有する物質が下記（2)で表 されるものである（B9)記載の糖鎖チップ、
[化 3]
(2)
Figure imgf000007_0001
[0021] (式中， Pは任意の保護基を示す。 )
1
(B11)基板がプラスチック製である (B1)— (BIO) V、ずれか記載の糖鎖チップ、 (B12)糖鎖のアルデヒド基力 糖鎖の還元末端に由来するものである（B1)—（Bl 1 ) Vヽずれか記載の糖鎖チップ、
(B13)糖鎖のアルデヒド基が、糖鎖を過ヨウ素酸酸化、またはガラクトースォキシダー ゼ処理に代表される酵素処理によって導入されたものである（B1)—（Bl 1)いずれ か記載の糖鎖チップ、
(B14) (B1)—（B13)いずれか記載の糖鎖チップ上に試料溶液を展開し、該試料 溶液に含まれる物質と基板上に固定化された糖鎖との相互作用を定量ィ匕する糖鎖 チップの使用方法、
(B15)試料溶液に含まれる物質が、血液，血清，細胞破砕物，タンパク質，核酸，酵 素，レクチン，ペプチド，ペプチド核酸，抗体，糖鎖，糖タンパク質，糖脂質，および それらの誘導体力も選ばれるすくなくとも一つである（B14)記載の糖鎖チップの使用 方法、
(B16)相互作用の定量化が，蛍光によるシグナルの検出によるものである（B14)又 は（B15)記載の糖鎖チップの使用方法、
(B17) (B1)—（B13)いずれか記載の糖鎖チップ上に細胞を播種し、糖鎖と細胞と の相互作用を利用して該細胞の分化，増殖，接着，変異力 選ばれる少なくとも一つ の挙動を制御する糖鎖チップの使用方法、
である。
[0022] 本発明によれば、生体反応への糖鎖の関与に関する研究に有用な支持体を提供 することができる。 [0023] 本発明に係る支持体を、ポリマー粒子に適用する場合、蛍光標識化やクロマトダラ フによる精製など煩雑な工程を経ることなぐ簡単な操作で糖鎖および糖鎖含有物質 を分離精製することが可能となる。本発明のポリマー粒子は、カラムなどに充填して 用いることもでき、糖鎖精製の自動化'連続操作化が容易に実現される。
[0024] また、本発明に係る支持体を糖鎖チップに適用する場合、基板上に糖鎖を共有結 合で固定ィ匕することが可能となり、信頼性が高く実用的な糖鎖チップが実現される。 本発明の方法によって作製された糖鎖チップは、たとえば糖鎖-レセプター間，糖鎖 細胞間，糖鎖 ウィルス間の相互作用の研究、さらには感染性疾患や糖鎖異常関 連疾患の研究用あるいは診断用デバイスとしての利用が可能である。
図面の簡単な説明
[0025] 上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実 施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
[0026] [図 1]実験例 A4の糖鎖サンプルの MALDI-TOF-MSによる分析結果である。
[図 2]実験例 A5の糖鎖サンプルの MALDI-TOF-MSによる分析結果である。
[図 3]実験例 A6の糖鎖サンプルの MALDI-TOF-MSによる分析結果である。
[図 4]実施例 B2の糖鎖チップのマイクロアレイスキャナーによる測定結果である。
[図 5]実験例 B3の糖鎖チップのマイクロアレイスキャナーによる測定結果である。
[図 6]実験例 B4の糖鎖チップのマイクロアレイスキャナーによる測定結果である。 発明を実施するための最良の形態
[0027] 以下、本発明の実施形態について説明する。
(支持体）
本発明の実施形態の支持体は、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を 担持してなるものである。
[0028] (糖鎖と特異的に反応する官能基）
糖鎖は生体内物質のなかで唯一、アルデヒド基をもつ物質である。すなわち、糖鎖 は水溶液などの状態で環状のへミアセタール型と、非環状型のアルデヒド型とが平衡 で存在する。タンパク質や核酸，脂質など糖鎖以外の生体内物質にはアルデヒド基 が含まれていない。このことから、アルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形 成する官能基を利用すれば、糖鎖のみを選択的に捕捉または固定ィ匕することが可能 である。
[0029] アルデヒド基と特異的に反応する官能基としては、たとえばォキシルァミノ基，ヒドラ ジド基，アミノ基，セミチオカルバジド基ならびにそれらの誘導体が挙げられ、中でも ォキシルァミノ基が好ま U、。ォキシルァミノ基とアルデヒド基との反応によって生じる ォキシム結合は、酸処理などによって容易に切断されるため、糖鎖を捕捉したのち、 糖鎖を担体力 簡単に切り離すことができる一方で、中性付近の pHで安定であるこ とが知られている。
[0030] 一般的に、生理活性物質の捕捉 ·担持にはァミノ基が多用されている力 ァミノ基と アルデヒド基の反応によって生じる結合 (シッフ塩基）は結合力が弱いため、還元剤 などを用いた二次処理が必要であることから、捕捉または固定ィ匕した糖鎖の様々な 処理を行うことを考慮すると、ォキシルァミノ基はァミノ基よりも好適に用いることがで きる。
[0031] (ポリマー粒子への適用）
前記支持体を粒子状に構成して、ポリマー粒子として使用することができる。この ポリマー粒子は、糖鎖を捕捉する担体として好適に用いることができる。
[0032] (ポリマー粒子の性状）
糖鎖を捕捉するための担体 (以下，捕捉担体と略）に用いるポリマー粒子は、少なく とも表面の一部に糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有した固体ある いはゲル粒子であることが好ましい。このように、ポリマー粒子を固体粒子あるいはゲ ル粒子とすることで、ポリマー粒子に糖鎖を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの 手段によって、この糖鎖を捕捉したポリマー粒子を容易に回収することができる。また 、ポリマー粒子をカラムに充填して用いてもよぐこのような用途は、特に連続操作ィ匕 を実現するという観点力 重要となる。
[0033] ポリマー粒子の形状は特に限定しな!、が，球状またはそれに類する形状が好まし い。ポリマー粒子が球状の場合，平均粒径は好ましくは 0. 05— 1000 mであり、よ り好ましくは 0. 05— 200 mであり、さらに好ましくは 0. 1— 200 mであり、最も好 ましくは 0. 1— 100 /z mである。この平均粒径が小さすぎると、ポリマー粒子をカラム に充填して用いる際、通液性が悪くなるために大きな圧力をカ卩える必要がある上に、 ポリマー粒子を遠心分離やろ過で回収することも困難となる。一方で、平均粒径が大 きすぎると、ポリマー粒子と試料溶液の接触面積が少なくなり、糖鎖捕捉の効率が低 下する。したがって、ポリマー粒子の平均粒径を上記範囲とすることで、これらのバラ ンスに優れた糖鎖捕捉担体を提供することができるようになる。
[0034] ポリマー粒子は、遠心分離やろ過などの手段で回収する時にのみ固体あるいはゲ ルの性状を示すものであってもよい。具体的には、たとえば温度、 pHなどの環境変 化によって溶解性が変化するポリマーを用いることにより、溶媒に溶解した状態の該 ポリマーに糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を介して糖鎖を捕捉させ たのち、溶解性を変化させて該ポリマーを沈殿させ、回収するといつた手法をとること が可能である。環境によって溶解性が変化するポリマーとしては、たとえばポリ（N—ィ ソプロピルアクリルアミド）を挙げることができる。ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド） 分子の少なくとも一部に糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を導入するこ とで、環境により糖鎖捕捉担体の溶解性を変化させながら、糖鎖捕捉を行うことが可 能となる。
[0035] (ポリマー粒子の作製）
前述のような本実施形態の支持体の用途において好適に用いられるポリマー粒子 は、量産が可能である。
[0036] ポリマー粒子は、例えば糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有するモ ノマー又は該モノマーの誘導体を重合することによって作製することができる。モノマ 一は分子内にビニル基を含むビニル系モノマーであることが好ましぐたとえばメタク リル酸誘導体，アクリル酸誘導体，スチレン誘導体，プロピレン誘導体，アクリルアミド 誘導体などを好ましく用いることができ、メタクリル酸誘導体がより好ましい。さらに、こ のモノマー分子内では、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基、好ましくは ォキシルァミノ基が側鎖として含まれることが好ましい。また、ォキシルァミノ基は tーブ トキシカルボ-ル（BOC)基や 9 フルォレ -ルメチルォキシカルボ-ル（Fmoc)基な どの保護基で保護されていてもよい。さらに、モノマー分子内では、ォキシルァミノ基 とビュル基との間にスぺーサ一分子鎖が存在しても良い。特に、酸素原子などのへ テロ原子を含むスぺーサ一分子鎖が存在すると、ォキシルァミノ基の周囲が親水性 環境となり、このようなモノマーを重合して得られるポリマー粒子はォキシルァミノ基周 辺にお 、て糖鎖との親和性が向上するため特に好まし 、。
[0037] このような化合物としては、例えば下記式（1)のものが挙げられる。
[0038] [化 4]
( 1 )
Figure imgf000011_0001
[0039] (式中、 Rは H又は CH、 Rは任意の分子鎖でヘテロ原子を含んでもよい。 )
1 3 2
[0040] また、ポリマーは糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基、例えばォキシル アミノ基を有するモノマーの単独重合体であってもよぐこのモノマーと糖鎖のアルデ ヒド基と反応しない他種のモノマー、たとえばアクリル酸，メタクリル酸，アクリルアミド， スチレン、および糖鎖のアルデヒド基と反応する官能基を有さな ヽこれらの誘導体な どとの共重合体であってもよい。また、粒子状のポリマーを得るという観点から、懸濁 重合、乳化重合などの不均一系重合法により、ポリマーを得ることが好ましい。
[0041] このとき、多官能性モノマーを架橋剤として共重合させることにより、粒子の剛性を 調整することが可能である。架橋剤としてはジビニルイ匕合物、たとえばエチレングリコ ールジメタタリレート、ジビュルベンゼン、メチレンビスアクリルアミドなどを適宜用いる ことができる。共重合させる架橋剤の分子内の鎖長を変化させることによって、ポリマ 一粒子の物性を制御することも可能である。
[0042] また、架橋剤以外のモノマーを共重合させることも可能である。このとき、各モノマー 仕込み量を調整して、共重合組成比を変化させることにより、ポリマー中のォキシル ァミノ基の密度をコントロールすることが可能である。このォキシルァミノ基密度のコン トロールは、糖鎖捕捉効率の最適化を実現するという観点から重要である。
[0043] 糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有するモノマーの重合を行う以外 の方法で、前記ポリマー粒子を得る方法としては、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反 応する官能基を有しないポリマーに含まれる側鎖の別の官能基などを介して、糖鎖 のアルデヒド基と特異的に反応する官能基をグラフトすることにより導入する方法も可 能である。
[0044] (糖鎖の精製方法）
こうして得られるポリマー粒子を用いて、糖鎖を捕捉する工程、及び糖鎖を分離す る工程を行って、糖鎖を精製することができる。以下、この糖鎖の精製方法として、血 清，組織片，細胞などの生体試料からグリコべプチダーゼなどの酵素的方法，あるい はヒドラジン分解などの化学的方法を用いて切り出してお 、た糖鎖を含有する生体 試料を、ポリマー粒子と接触させることによって糖鎖のみを選択的に回収する方法に ついて説明する。
[0045] (糖鎖捕捉）
糖鎖を捕捉する工程では、ポリマー粒子に含まれる糖鎖のアルデヒド基と特異的に 反応する官能基と、糖鎖のアルデヒド基とを結合させて、生体試料の中の糖鎖のみを ポリマー粒子に担持させる。
[0046] 具体的には、ポリマー粒子と生体試料中の糖鎖とを所定の pHの緩衝液中で接触さ せる。この糖鎖捕捉反応系を提供する緩衝液の pHは、好ましくは 2— 9、より好ましく は 2— 7であり、さらに好ましくは 2— 6である。 pH調整のためには、各種緩衝液を用 いることができる。糖鎖捕捉反応系の温度は、好ましくは 4一 90°C、より好ましくは 4一 70。C、さらに好ましくは 10— 70°Cであり、最も好ましくは 15— 60°Cである。反応時間 は適宜設定することができる。なお、ポリマー粒子と糖鎖とを緩衝液中で接触させる 代わりに、ポリマー粒子をカラムに充填して生体試料の溶液を通過させて、糖鎖のみ をポリマー粒子に担持させてもょ 、。
[0047] (糖鎖回収）
糖鎖捕捉の際に、ポリマー粒子の表面には糖鎖以外の莢雑物が非特異的に吸着 しているため、糖鎖回収の前にこれらを洗浄除去する工程を設けることが好ましい。こ のときの洗浄液としては、水，緩衝液，界面活性剤を含む水溶液または緩衝液，有機 溶剤などを適宜組み合わせて用いることができる。特に好ましい形態は，界面活性剤 を含む水溶液または緩衝液で十分に洗浄したのち、有機溶剤で洗浄し、最後に水で 洗浄する方法である。これらの洗浄により、非特異的吸着物は実質的に全てポリマー 粒子から除去される。なお、カラムを用いて糖鎖を捕捉させた場合には、このカラムに これら溶液を通過させることで洗浄することができる。
[0048] 糖鎖をポリマー粒子に捕捉させて必要に応じて洗浄した後、ポリマー粒子と糖鎖の 結合を切断することで、糖鎖を切り出して回収することができる。例えば、糖鎖のアル デヒド基と特異的に反応する官能基としてォキシルァミノ基を有するポリマー粒子の 場合、糖鎖との結合はォキシム結合であるため、この結合は酸処理などによって切断 することができる。このような観点から、糖鎖をポリマー粒子力も切り出すために， 0. 1 一 10体積％のトリフルォロ酢酸水溶液を好適に用いることができる。また、酸処理以 外の方法で糖鎖を切り出すことも可能である。なお、カラムを用いて糖鎖を捕捉させ た場合には、このカラムに所定の溶出条件に沿った緩衝液を通過させることで、糖鎖 を溶出することが可能である。
[0049] このような方法によって回収された糖鎖は、タンパク質，ペプチド，核酸などの莢雑 物を含まないよう精製された純粋な糖鎖であり、そのまま質量分析，核磁気共鳴分析 ,免疫的分析法などの分析手段によって評価することが可能である。
[0050] 以上にように、本発明のポリマー粒子を用いることで、 1)試料溶液とポリマー粒子と を分散、反応させて、反応物がポリマー粒子の糖鎖のアルデヒド基を特異的に反応 する官能基にて担持され、 2)必要に応じてポリマー粒子表面に非特異的に結合した 莢雑物を洗浄除去、 3)糖鎖 ポリマー粒子の結合を切断、回収という操作で糖鎖の 精製が可能となり、従来法と比べて簡便な糖鎖精製を実現することが可能となる。さ らに、本発明のポリマー粒子は量産化が容易であり、産業上の利用性を考慮した場 合にも有利である。
[0051] (糖鎖チップへの適用）
前記支持体を基板の一部分として構成して、この基板を用いて糖鎖チップとして 使用することができる。この糖鎖チップでは、支持体に該当する部分に含まれる糖鎖 のアルデヒド基と特異的に反応する官能基の少なくとも一部が糖鎖と結合することで 、基板上で糖鎖が固定化されている。
[0052] (糖鎖チップの形態）
本実施形態において糖鎖チップとは、糖鎖，糖鎖誘導体，糖鎖含有物質など (以 下，特記しな 、限り「糖鎖」と表記する）を固相基板上に共有結合的に固定ィ匕したデ バイスをいう。
[0053] 固相基板は平板状であってもよぐそれ以外の形状、たとえば前述した粒子の形状 ,溝加工の施してある平板状，多孔質状，中空糸状などであってもよい。また、マイク ロタイタ一プレートのように仕切りを設けた平板状であってもよ ヽ。
[0054] 糖鎖は通常、基板を構成する支持体上の一部に固定化されていてもよいが、全部 に固定ィ匕されていてもよい。固定ィ匕される糖鎖は 1種類であってもよぐ多種類であつ てもよい。好ましい形態の一つとして、多種類の糖鎖を平板状の基板表面に整列的 に固定ィ匕した形態 (いわゆるマイクロアレイ）が挙げられる。他の好ましい形態の一つ として、 1種類あるいはそれ以上の糖鎖を、基板の全面に固定ィ匕することが挙げられ る。たとえば、マイクロタイタープレートの各ゥエルの内壁の全面に糖鎖を固定ィ匕する 等の形態である。
[0055] (糖鎖チップ用基板の作製）
糖鎖チップ用基板は，量産性および表面処理の多様性の観点から、プラスチック 製であることが好ましい。測定手段に蛍光を用いる場合には，プラスチックは低蛍光 性のものが好ましぐたとえば飽和環状ポリオレフインなどを好適に用いることができる
[0056] 糖鎖チップ用基板の表面には、上述のように糖鎖と特異的に反応して結合し得る 官能基を導入する必要がある。このような官能基の導入方法としては、大別して 2つ の手段が挙げられる。すなわち、（1)基板表面へ糖鎖と特異的に反応する官能基を 有する物質をコーティングして、基板の表面に当該官能基を有する支持体を形成す る方法と、 (2)基板上にあらかじめ導入された別種の官能基を介した官能基を導入 する方法である。以下、それぞれの手段について詳述する。
[0057] (1)基板表面への上記官能基を有する物質のコーティング
上記官能基を有する物質としてはポリマーが好ましい。該ポリマーは、前述のポリマ 一粒子のように、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有するモノマーを 重合することによって作製することができる。モノマーは、分子内にビニル基を含むビ -ル系モノマーであることが好ましく，たとえばメタクリル酸誘導体，アクリル酸誘導体 ,スチレン誘導体，プロピレン誘導体，アクリルアミド誘導体などを好ましく用いること ができ、メタクリル酸誘導体がより好ましい。さらに、このモノマー分子内では、糖鎖の アルデヒド基と特異的に反応する官能基、好ましくはォキシルァミノ基が側鎖として含 まれることが好ましい。また、ォキシルァミノ基は t ブトキシカルボ-ル（BOC)基や 9 フルォレニルメチルォキシカルボ-ル（Fmoc)基などの保護基で保護されて!ヽても よい。さらに、モノマー分子内では、ォキシルァミノ基とビュル基との間にスぺーサー 分子鎖が存在しても良い。特に、酸素原子などのへテロ原子を含むスぺーサ一分子 鎖が存在すると、ォキシルァミノ基の周囲が親水性環境となり、このようなモノマーを 重合して得られるポリマーはォキシルァミノ基周辺において糖鎖との親和性が向上す るため特に好ましい。このような化合物としては、上記式（1)で示されるものが挙げら れる。
[0058] このポリマーは、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基、例えばォキシル アミノ基を有するモノマーの単独重合体であってもよぐこのモノマーと糖鎖のアルデ ヒド基と反応しない他種のモノマー、たとえばアクリル酸，メタクリル酸，アクリルアミド， スチレン、および糖鎖のアルデヒド基と反応する官能基を有さな ヽこれらの誘導体な どとの共重合体であってもよい。また、このような方法以外には、前述したようなグラフ ト反応によりポリマーに導入する方法も可能である。
[0059] また、コーティングの好ましい形態として、ディップコート法，キャスト法，スピンコート 法など一般的な方法を適宜利用することができる。コーティングに用いるポリマー溶 液の濃度は、好ましくは 0. 01— 10重量パーセント、より好ましくは 0. 01— 5重量パ 一セントであり、さらに好ましくは 0. 01— 2重量パーセントである。また、他の方法とし て、ラングミュアーブロジェット法を利用して基板表面に単分子膜を形成する方法も利 用できる。なお、糖鎖のアルデヒド基と反応する官能基として例えばォキシルァミノ基 を用いる場合であって、このォキシルァミノ基が所定の保護基で保護されて ヽる場合 、コーティング工程の後に適宜、脱保護処理を施して力 コーティングに供するように する。
[0060] このようにして、糖鎖のアルデヒドと特異的に反応する官能基を有する支持体を、基 板表面に形成することにより、糖鎖と特異的に反応する官能基を基板上に導入する ことができる。
[0061] (2)基板上にあらかじめ導入された別種の官能基を介した官能基導入
基板表面に第 1の官能基を導入しておき、これを介して糖鎖と結合し得る第 2の官 能基を導入する方法である。第 1の官能基としては、アミノ基，カルボキシル基，水酸 基などが挙げられる。第 1の官能基の導入方法としては、プラズマ照射，第 1の官能 基含有アルコキシシランによるコーティング、第 1の官能基含有モノマーの表面グラフ ト重合などを適宜用いることができる。
[0062] 次に、第 1の官能基の導入後、この第 1の官能基と反応し得る官能基および第 2の 官能基の両方を有する物質との反応により、第 1の官能基を介して第 2の官能基を導 入する。具体例として、第 1の官能基としてアミノ基、および第 2の官能基としてォキシ ルァミノ基を導入する場合にっ 、て説明する。ォキシルァミノ基およびカルボキシル 基の両方を有する化合物 (分子)を基板表面の第 1の官能基に作用させることにより、 ァミノ基とカルボキシル基との縮合反応が生じ、この化合物は基板表面に固定ィ匕され て、結果としてォキシルァミノ基が基板上に導入される。
[0063] ここで、ォキシルァミノ基およびカルボキシル基の両方を有する分子としては、たと えば下記式（2)で示されるようなアミノォキシ酢酸などを用いることができる。この際、 ォキシルァミノ基は保護基で保護されて ヽてもよ ヽ。
[0064] [化 5]
(2)
Figure imgf000016_0001
(式中， Pは任意の保護基を示す。 )
1
[0065] なお、基板上に導入された第 1の官能基としてのァミノ基と、式（2)の化合物のカル ボキシル基とは、カルポジイミド化合物に代表される縮合剤の存在下で反応させるこ とで、結合させることができる。また、ォキシルァミノ基が保護基で保護されている場 合には、ォキシルァミノ基導入工程、すなわち式（2)の化合物と基板上のアミノ基と の反応の後に適宜、脱保護処理を施して外すことができる。
[0066] (糖鎖の固定化） 基板上への糖鎖の固定ィ匕は、糖鎖を溶解させて含む溶液を基板表面と接触させる こと〖こより実現される。好ましい形態の一つは、糖鎖を含む溶液を基板表面に整列的 に点着 (スポット）する方法である。スポットには点着用のピンを用いたスポッティング 方式 (たとえば， 日立ソフトウェアエンジニアリング (株)製「SPBIO」シリーズ）、インクジ エツト方式（たとえば、 Perkin-Elmer社製「Piezorray」 )などを適宜利用することができ る。糖鎖を溶解するための液体は、水，緩衝液，あるいはその他の溶媒であってもよ ぐ糖鎖以外の添加物を含んでいてもよい。添加物としてはたとえば、界面活性剤、 高分子化合物、各種の塩などを挙げることができる。界面活性剤の添カ卩は、糖鎖溶 液と基板表面との濡れ性をコントロールする際に有用な方法である。糖鎖溶液の pH は、糖鎖のアルデヒド基と基板表面の官能基との反応に最適な範囲の値に調整する ことが好ましい。いずれの方法においても、固定ィ匕する糖鎖は 1種類あるいは複数種 類であってもよい。
[0067] 他の好ま ヽ形態の一つとして、糖鎖を含む溶液に基板を浸漬、ある!、は糖鎖を含 む溶液を基板表面に展開する方法が挙げられる。この方法は、基板全面に糖鎖を固 定化する場合に特に有用である。基板がマイクロタイタープレートのゥエルの様に仕 切りが設けられた形状である場合には、糖鎖溶液を各ゥエルに分注する方法も有用 である。いずれの方法においても、固定ィ匕する糖鎖は 1種類あるいは複数種類であ つてもよい。
[0068] 糖鎖を基板上に固定ィ匕したのち、固定化されなカゝつた糖鎖を洗浄除去してもよい。
洗浄のための溶液、および洗浄方法などの条件は適宜設定することができるが、たと えば界面活性剤を含む緩衝液または純水、有機溶媒などを用いることが好ま ヽ。
[0069] また、糖鎖の固定化にかかる糖鎖と基板との結合は、糖鎖のアルデヒド基と基板上 に形成された糖鎖と特異的に反応する官能基、たとえばォキシルァミノ基との反応に よるものである。
[0070] ここで、糖鎖のアルデヒド基は、糖鎖の還元末端に由来するものであってもよぐ他 の手段により導入されたものであってもよい。また、アルデヒド基は、ガラクトースォキ シダーゼ処理による酸ィ匕などの酵素処理によって糖鎖に導入されてもよい。この方法 は、非還元末端にガラクトースまたは N—ァセチルガラタトサミンをもつ糖鎖に適用で きる方法であり、ガラクトースの 6位のヒドロキシメチルをアルデヒドに変換する方法で ある。また、アルデヒド基は、糖鎖を過ヨウ素酸酸ィ匕することにより、末端をアルデヒド に変換することによつても導人してもょ 、。
[0071] (糖鎖チップの使用形態）
本実施形態の糖鎖チップの好ま ヽ使用方法の一つとして、糖鎖チップ上に試料 溶液を展開し、該試料溶液に含まれる物質とチップ上の糖鎖との相互作用を定量ィ匕 する方法が挙げられる。この方法は、従来の DN Aチップやプロテインチップと同様の 使用形態である。
[0072] 試料溶液としては、血液，血清，組織の破砕物あるいは抽出物，細胞の破砕物ある いは抽出物，タンパク質，核酸，酵素，レクチン，ペプチド，ペプチド核酸，抗体，糖 鎖，糖タンパク質，糖脂質，およびそれらの誘導体などを含む溶液が挙げられる。
[0073] また、試料溶液をチップ上に展開し所定時間反応させたのち、未反応の試料を洗 浄除去することが好ましい。試料溶液中にチップ上の糖鎖と相互作用する物質が含 まれている場合、この物質は洗浄操作後もチップ上に固定化された糖鎖と反応して 結合した部分 (スポット部）に残留する。この残留量を測定することで、糖鎖と試料物 質との相互作用の強さを定量化することが可能となる。この相互作用の定量化の手 段として、たとえば蛍光物質による標識化，放射性同位体による標識化，各種発色剤 による発色，分光学的測定手段，原子間力顕微鏡を用いた物理的測定手段などを 用いることができる。測定の容易性、および操作の簡便性の観点から、蛍光物質によ る標識ィ匕を利用して、蛍光によるシグナルの検出を行うことにより、相互作用の定量 化を行うことが好ましい。
[0074] また、本実施形態の糖鎖チップの他の好ま 、使用方法の一つとして、糖鎖チップ 上に細胞を播種し、チップ上の細胞の挙動を調べる方法が挙げられる。細胞の接着 性，増殖性，分化能、変異性などは糖鎖に影響を受けるとされており、したがって糖 鎖と細胞との相互作用を利用することにより、この細胞の分化，増殖，接着，及び変 異カも選ばれる少なくとも一つの挙動を制御することができるようになる。すなわち、 糖鎖チップのこのような使用は、細胞の糖鎖認識能の研究、細胞特異的な培養、幹 細胞の分ィ匕誘導制御などに有用な手段となる。 実施例 1
[0075] (実験例 Al)
(ォキシルァミン含有モノマーの合成）
5gの無水メタクリル酸 (和光純薬工業 (株)製）と 25gの 2, 2'— (エチレンジォキシ） ビス（ェチルァミン）を 200mlのクロ口ホルム中で 16時間反応させた。反応の進行は 薄層クロマトグラフィ (TLC)で確認した。反応終了後、シリカゲルクロマトグラフィによ る通常の方法で精製を行ったのち、溶媒を留去した。
[0076] 生成物を再びクロ口ホルムに溶解し、 10gの水溶性カルポジイミド (和光純薬工業（ 株）製）、および 5gの BOC—ァミノォキシ酢酸 (Novabiochem社製）を投入し、室温で 1 6時間反応させた。反応の進行は TLCで確認した。反応終了後、純水で 3回抽出し たのち、シリカゲルクロマトグラフィにより精製した。核磁気共鳴分析 (NMR)およびマ トリックス支援レーザーイオン化-飛行時間型質量分析器 (MALDI-TOF- MS, Bruker社製 'UltraFlex')で生成物の確認を行った。合成したモノマーの構造式を下 記式に示す。
[0077] [化 6]
Figure imgf000019_0001
[0078] (実験例 A2)
(ポリマー粒子の合成）
実験例 A1にて合成したモノマー lgをクロ口ホルム lmlに溶解し、還流冷却管を取り 付けた反応容器内に投入した。反応容器内に 30mlの純水および 0. 05gのポリビニ ルアルコール (和光純薬工業 (株)製，重合度約 1500)を投入し、反応容器を 65°C の恒温槽内に設置した。反応容器内の溶液を攪拌しながら、 30分間窒素パージを 行った。 0. 05gの 2, 2'—ァゾビス（イソブチ口-トリル）を微量のクロ口ホルムに溶解し たものを反応容器内に注入し、重合反応を開始した。 16時間反応後、反応容器を冷 水に浸漬し、重合反応を停止した。反応容器内に生成した沈殿を遠心分離で回収し 、沈殿をメタノールおよび純水で各 5回洗浄した。 [0079] 洗浄後の沈殿を容器に入れ、トリフルォロ酢酸をメタノールで 3倍に希釈した溶液を 沈殿量に対して大過剰加えた。反応容器を 40°Cの恒温槽内に入れ、振とうしながら 3時間反応させ、ォキシルァミノ基に結合している保護基 (BOC基)を除去した。反応 終了後、沈殿を遠心分離で回収し、メタノールおよび純水で各 5回洗浄し、ポリマー 粒子を作製した。得られたポリマー粒子の平均粒径は約 10 mであった。
[0080] (実験例 A3)
(モデル糖鎖を用いた糖鎖捕捉率測定）
N-ァセチルラクトサミン（Sigma社製） lmgを 100 1の純水に溶解した。この溶液に 、実験例 A2にて作製したポリマー粒子 lOmg分散させた。塩酸緩衝液で溶液の pH を 2に調整し、振とうしながら 40°Cで 16時間反応させた。反応後、遠心分離でポリマ 一粒子を沈殿させ、上清を取り除いた。回収したポリマー粒子を、 0. 1%ドデシル硫 酸ナトリウム水溶液、 50%メタノール、純水でそれぞれ 5回ずつ洗浄した。洗浄後、ポ リマー粒子を 10%トリフルォロ酢酸中に分散させ、室温で 3時間振とうすることで糖鎖 を遊離させた。遠心分離によりポリマー粒子を沈殿させ、上清を回収した。回収した 上清を凍結乾燥し、糖鎖サンプルとした。
[0081] 回収した糖鎖サンプルの量を、定法に従ってオルシノール Z硫酸法で定量し、糖 鎖捕捉率を求めた。結果を表 1に示す。比較対象となる後述の実験例 7と比べて糖 鎖捕捉率が有意に高くなつており、本発明によるポリマー粒子により、糖鎖が効率よく 回収できることが示された。
[0082] (実験例 A4)
(糖タンパク質力もの糖鎖精製）
マウス由来の免疫グロブリン G (IgG) 50mgをプロテアーゼ処理したのち、定法に従 つて、 N-グリコべプチダーゼ Fを用いて N結合型糖鎖を切り出した。この溶液に 10m gの実験例 A2にて作製したポリマー粒子を分散させ、 pHを 2に調整したのち、振とう しながら 40°Cで 16時間反応させた。反応後、遠心分離でポリマー粒子を沈殿させ、 上清を取り除いた。回収したポリマー粒子を、 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液、 50%メタノール、純水でそれぞれ 5回ずつ洗浄した。洗浄後、ポリマー粒子を 10%ト リフルォロ酢酸中に分散させ、室温で 3時間振とうすることで糖鎖を遊離させた。遠心 分離によりポリマー粒子を沈殿させ、上清を回収した。回収した上清を凍結乾燥し、 糖鎖サンプルとした。
[0083] 得られた糖鎖サンプルを MALDI-TOF-MSにより分析した。マトリックスには 2,5-ジヒ ドロキシ安息香酸を用いた。測定結果を図 1に示す。糖鎖に由来する分子量ピーク が明確に現れており，本発明のポリマー粒子を用いて，糖タンパク質の糖鎖が精製' 回収できることが示された。
[0084] (実験例 A5)
鶏卵由来の卵白アルブミン 50mgを用いて、実験例 A4と同様の方法で糖鎖サンプ ルを精製し、 MALDI-TOF-MSにより分析した。測定結果を図 2に示す。糖鎖に由来 する分子量ピークが明確に現れており、本発明のポリマー粒子を用いて、糖タンパク 質の糖鎖が精製'回収できることが示された。
[0085] (実験例 A6)
マウスの皮膚力 真皮組織を採取し、アセトンで脱脂後、細片化した。実験例 A4と 同様の方法で糖鎖サンプルを精製し、 MALDI-TOF-MSにより分析した。測定結果を 図 3に示す。糖鎖に由来する分子量ピークが明確に現れており、本発明のポリマー 粒子を用いて、生体試料力ゝら糖鎖が精製 ·回収できることが示された。
[0086] (実験例 A7)
(ポリマー粒子の合成）
メタクリル酸メチルモノマー lgをクロ口ホルム lmlと混合し、還流冷却管を取り付け た反応容器内に投入した。反応容器内に 30mlの純水、 0. 05gのポリビュルアルコ ール (和光純薬工業 (株)製、重合度約 1500)を投入し、反応容器を 65°Cの恒温槽 内に設置した。反応容器内の溶液を攪拌しながら、 30分間窒素パージを行った。 0. 05gの 2, 2'—ァゾビス（イソブチ口-トリル）を微量のクロ口ホルムに溶解したものを反 応容器内に注入し、重合反応を開始した。 16時間反応後、反応容器を冷水に浸漬 し、重合反応を停止した。反応容器内に生成した沈殿を遠心分離で回収し、沈殿を メタノールおよび純水で各 5回洗浄して、ポリマー粒子を作製した。
[0087] (糖鎖精製）
N-ァセチルラクトサミン（Sigma社製） lmgを 100 1の純水に溶解した。この溶液に 上記の方法で作製したポリマー粒子を 10mg分散させた。塩酸緩衝液で溶液の pH を 2に調整し、振とうしながら 40°Cで 16時間反応させた。反応後、遠心分離でポリマ 一粒子を沈殿させ、上清を取り除いた。回収したポリマー粒子を、 0. 1%ドデシル硫 酸ナトリウム水溶液、 50%メタノール、純水でそれぞれ 5回ずつ洗浄した。洗浄後、ポ リマー粒子を 10%トリフルォロ酢酸中に分散させ、室温で 3時間振とうした。遠心分 離によりポリマー粒子を沈殿させ、上清を回収した。回収した上清を凍結乾燥し、実 験例 A3の結果に対する比較サンプルとした。
[0088] 回収したサンプル中に含まれる糖鎖の量を、定法に従ってオルシノール Z硫酸法 で定量した。結果を表 1に示す。糖鎖はほとんど回収されておらず、糖鎖のアルデヒ ド基と特異的に反応する官能基を含まないポリマー粒子では、糖鎖を精製できないこ とが示された。
[0089] [表 1]
表 1
Figure imgf000022_0001
[0090] (実験例 B1)
(ポリマー溶液の作製）
実験例 A1にて合成したモノマー lgおよびメタクリル酸メチル (和光純薬工業 (株） 製) 3gを、還流冷却管を取り付けた反応容器内に投入した。反応容器内に 30mlのク ロロホルムを投入し、反応容器を 65°Cの恒温槽内に設置した。反応容器内の溶液を 攪拌しながら、 30分間窒素パージを行った。 0. 05gの 2, 2'—ァゾビス (イソブチ口- トリル）（和光純薬工業 (株)製)を反応容器内に投入し、重合反応を開始した。 16時 間反応後、反応容器を冷水に浸漬して重合反応を停止し、ポリマー溶液を得た。
[0091] (実験例 B2)
(基板の作製）
飽和環状ポリオレフイン榭脂を射出成形法で成形し、厚さ lmmの平板状の基板を 作製した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面を親水化処理した。 [0092] (基板表面へのォキシルァミノ基導入）
上記の基板を、実験例 B1で得られたポリマー溶液に浸漬し、 30分間静置した。浸 漬後、基板を静かに引き上げ、 25°Cで 1時間乾燥した。引き続き、 10%の酢酸を含 む 1M塩酸に基板を 3時間浸漬することにより、 BOC基を脱離させた。基板を純水で 洗浄し、風乾した。
[0093] (糖鎖の固定化）
マンノトリオース（Dextra Laboratories社製）を 10mgZml、 lmg/ml,及び 0. lm g/mlの各濃度で酢酸緩衝液 (pH4, lOOmM)に溶解した。この溶液 1 μ 1を、上記 で作製した基板表面にスポットした。スポット後の基板を保湿したチャンバ一内に入 れ、室温で 1時間静置した。トリスー塩酸緩衝液 (ρΗ7. 4, 10mM)に 3重量％のゥシ 血清アルブミン (和光純薬工業 (株)製)を溶解した。この溶液に静置後の基板を室温 で 1時間浸漬することにより、基板表面をブロッキングした。ブロッキング後、基板を純 水で洗浄し風乾した。
[0094] (レクチンの反応）
ローダミン標識ィ匕コンカナノくリン A (フナコシ (株)製)をリン酸緩衝液 (PBS, pH7. 4, lOOmM)で 20 μ gZmlの濃度で溶解した。この溶液 20 μ 1を、ブロッキング後の 基板上に滴下し、カバーガラスをかぶせ、室温で 1時間静置した。静置後、基板から カバーガラスを外し、基板を洗浄液（0. 05重量0 /0の TWEEN— 20を PBSに溶解した もの）で 3回洗浄した。基板をさらに純水で洗浄し、風乾した。
[0095] (測定）
上記工程を経た基板の表面を、マイクロアレイ用スキャナー' ScanArray LITE' (Packard Biochip Technologies社製)を用いて測定した。測定条件は、レーザー強度 90%、 PMT感度 60%、励起 Z検出波長はローダミンチャンネルとした。基板表面の 蛍光強度を画像ィ匕したものを図 4に示す。図中、上段の 3スポットはスポット時のマン ノトリオース濃度 10mgZml、中段の 3スポットは lmgZml、下段の 3スポットは 0. 1 mgZmlをそれぞれ示す。
[0096] マンノトリオースをスポットした部位のみ蛍光強度が高くなつており、この部分にロー ダミン標識ィ匕コンカナパリン Aが結合して 、ることがわかる。コンカナパリン Aはマンノ ースを認識して結合することが知られている。よって、マンノトリオースが基板上に固 定化されて ヽることが示された。
[0097] (実験例 B3)
(基板の作製）
飽和環状ポリオレフイン榭脂を射出成形法で成形し、厚さ lmmの平板状の基板を 作製した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面を親水化処理した。
[0098] (基板表面へのォキシルァミノ基導入）
工程 1： 3—ァミノプロピルトリメトキシシランを 2重量％の濃度で純水に溶解した。こ の溶液に上記の基板を浸漬した。浸漬は 25°Cで 1時間行った。浸漬後、基板を純水 で洗浄し、乾燥した。これを 45°Cに保った真空乾燥機を用いて真空乾燥した。
工程 2： BOC—ァミノォキシ酢酸を 2重量％の濃度でメタノールに溶解した。さらに BOC—ァミノォキシ酢酸に対して 1. 5等量の水溶性カルポジイミド (和光純薬工業 (株 )製)を投入した。この溶液に、工程 1の基板を浸漬した。浸漬は 25°Cで 12時間行つ た。浸漬後、基板をメタノールで洗浄し、乾燥した。引き続き、 10%の酢酸を含む 1M 塩酸に基板を 3時間浸漬することにより、 BOC基を脱離させた。基板を純水で洗浄し 、風乾した。
[0099] (糖鎖の固定化）
実験例 B2と同様の方法で基板上にマンノトリオースを固定化させる処理をした。
(レクチンの反応）
実験例 B2と同様の方法でローダミン標識化コンカナパリン Aを反応させた。 (測定）
実験例 B2と同様の方法で基板表面の蛍光強度を測定した。基板表面の蛍光強度 を画像化したものを図 5に示す。図中、上段の 3スポットはスポット時のマンノトリオ一 ス濃度 10mgZml、中段の 3スポットは lmgZml、下段の 3スポットは 0. lmgZmlを それぞれ示す。
[0100] 実験例 B2の場合と同様に、マンノトリオースをスポットした部位のみ蛍光強度が高く なっており、この部分にローダミン標識ィ匕コンカナノ リン Aが結合していることがわか る。コンカナパリン Aはマンノースを認識して結合することが知られている。よって、マ ンノトリオースが基板上に固定ィ匕されていることが示された。
[0101] (実験例 B4)
(基板の作製）
飽和環状ポリオレフイン榭脂を射出成形法で成形し、厚さ lmmの平板状の基板を 作製した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面を親水化処理した。実験 例 B2で行ったようなォキシルァミノ基導入処理は行わな力つた。
[0102] (糖鎖の固定化）
実験例 B2と同様の方法で基板上にマンノトリオースを固定化させる処理をした。
(レクチンの反応）
実験例 B2と同様の方法でローダミン標識化コンカナパリン Aを反応させた。
(測定）
実験例 B2と同様の方法で基板表面の蛍光強度を測定した。基板表面の蛍光強度 を画像ィ匕したものを図 6に示す。
[0103] 実験例 B4では、蛍光強度が高くなつている部分は存在せず、実験例 B2, B3での 結果とは異なり、コンカナノ リン Aが特異的に結合した部位は無いことがわかる。すな わち、マンノトリオースは基板上に固定ィ匕されな力つたことが示された。
[0104] 以上、実験例 B2— B4より、ォキシルァミノ基の存在が糖鎖の固定ィ匕に重要である ことが示された。

Claims

請求の範囲
[1] 糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を担持してなる支持体。
[2] 請求項 1に記載の支持体において、
前記官能基が、ォキシルァミノ基，ヒドラジド基，及びセミチオ力ルバジド基力も選ば れる少なくとも一つであることを特徴とする支持体。
[3] 請求項 2に記載の支持体において、
前記官能基が、ォキシルァミノ基であることを特徴とする支持体。
[4] 請求項 1一 3のいずれか一つに記載の支持体力 構成され、糖鎖を捕捉する担体 に用いるポリマー粒子。
[5] 請求項 4に記載のポリマー粒子において、
前記官能基を有するモノマー又は該モノマーの誘導体を重合したポリマー力 構 成されることを特徴とするポリマー粒子。
[6] 請求項 5に記載のポリマー粒子において、
前記官能基を有するモノマーが下記一般式（1)で表されるモノマー又は該モノマ 一の誘導体を含むことを特徴とするポリマー粒子。
[化 7]
( 1 )
Figure imgf000026_0001
(式中、 Rは H又は CH
1 3、 Rは任意の分子鎖でヘテロ原子を含んでもよい。 )
2
[7] 請求項 5又は 6に記載のポリマー粒子において、
前記ポリマーが、前記官能基を有するモノマー又はその誘導体と、糖鎖のアルデヒ ド基と反応しないモノマーとの共重合体であることを特徴とするポリマー粒子。
[8] 請求項 7に記載のポリマー粒子において、
前記糖鎖のアルデヒド基と反応しないモノマーが架橋剤として多官能性モノマーを 含むことを特徴とするポリマー粒子。
[9] 請求項 5— 8の!、ずれか一つに記載のポリマー粒子にお!、て、 前記ポリマーが、懸濁重合法により得られることを特徴とするポリマー粒子。
[10] 請求項 5— 8の!、ずれか一つに記載のポリマー粒子にお!、て、
前記ポリマーが、乳化重合法により得られることを特徴とするポリマー粒子。
[11] 請求項 4一 10のいずれか一つに記載のポリマー粒子において、
粒子形状が球状であることを特徴とするポリマー粒子。
[12] 請求項 11に記載のポリマー粒子にぉ ヽて、
粒子の平均粒径が 0. 05— 200 μ mであることを特徴とするポリマー粒子。
[13] 請求項 4一 12いずれか記載のポリマー粒子を用いて糖鎖を捕捉する工程、及び糖 鎖を分離する工程を有することを特徴とする糖鎖の精製方法。
[14] 請求項 1一 3のいずれか一つに記載の支持体を含む糖鎖チップであって、
前記支持体が基板の少なくとも一部を構成し、当該支持体の官能基の少なくとも一 部が糖鎖と結合することで、当該基板上で糖鎖が固定化されていることを特徴とする 糖鎖チップ。
[15] 請求項 14に記載の糖鎖チップにおいて、
前記基板表面へ前記官能基を有する物質をコーティングして、前記基板の表面に 当該官能基を有する支持体が構成されることにより、当該基板に当該官能基が導入 されることを特徴とする糖鎖チップ。
[16] 請求項 15に記載の糖鎖チップにおいて、
前記官能基を有する物質の基板表面へのコーティング力 ラングミュアーブロジェッ ト法による基板表面での分子膜形成であることを特徴とする糖鎖チップ。
[17] 請求項 15又は 16に記載の糖鎖チップにおいて、
前記官能基を有する物質がポリマーであることを特徴とする糖鎖チップ。
[18] 請求項 17に記載の糖鎖チップにおいて、
前記ポリマーが下記一般式（1)で表されるモノマー単位を含むことを特徴とする糖 鎖チップ。
[化 8]
Figure imgf000028_0001
(式中、 Rは H又は CH、 Rは任意の分子鎖でヘテロ原子を含んでもよい。 )
1 3 2
[19] 請求項 14に記載の糖鎖チップにおいて、
前記基板上への前記官能基の導入が、あらかじめ当該基板上に導入された別種 の官能基を介してなることを特徴とする糖鎖チップ。
[20] 請求項 19に記載の糖鎖チップにおいて、
前記基板上への前記官能基の導入が、あらかじめ当該基板上に導入された第 1の 官能基と、当該第 1の官能基と反応し得る官能基およびォキシルァミノ基の両方を有 する物質との反応によることを特徴とする糖鎖チップ。
[21] 請求項 20に記載の糖鎖チップにおいて、
前記基板上への前記官能基の導入が、あらかじめ当該基板上に導入されたァミノ 基と、ォキシルァミノ基およびカルボキシル基の両方を有する物質との反応によること を特徴とする糖鎖チップ。
[22] 請求項 20に記載の糖鎖チップにぉ 、て、
前記ォキシルァミノ基およびカルボキシル基の両方を有する物質が下記（2)で表さ れることを特徴とする糖鎖チップ。
[化 9]
(2)
Figure imgf000028_0002
(式中， Pは任意の保護基を示す。 )
1
[23] 請求項 14一 22のいずれか一つに記載の糖鎖チップにおいて、
前記基板がプラスチック製であることを特徴とする糖鎖チップ。
[24] 請求項 14一 23のいずれか一つに記載の糖鎖チップにおいて、 前記官能基と結合する糖鎖のアルデヒド基が、還元末端に由来することを特徴とす る糖鎖チップ。
[25] 請求項 14一 23のいずれか一つに記載の糖鎖チップにおいて、
前記官能基と結合する糖鎖のアルデヒド基が、当該糖鎖を過ヨウ素酸酸化、または 所定の酵素処理によって導入されたことを特徴とする糖鎖チップ。
[26] 請求項 25に記載の糖鎖チップにおいて、
前記酵素処理は、ガラクトースォキシダーゼ処理であることを特徴とする糖鎖チップ
[27] 請求項 14一 26のいずれか一つに記載の糖鎖チップ上に試料溶液を展開し、該試 料溶液に含まれる物質と基板上に固定化された糖鎖との相互作用を定量ィ匕すること を特徴とする糖鎖チップの使用方法。
[28] 請求項 27に記載の糖鎖チップの使用方法において、
前記試料溶液に含まれる物質が、血液，血清，組織破砕物および抽出物，細胞破 砕物および抽出物，タンパク質，核酸，酵素，レクチン，ペプチド，ペプチド核酸，抗 体，糖鎖，糖タンパク質，糖脂質，およびそれらの誘導体から選ばれる少なくとも一つ であることを特徴とする糖鎖チップの使用方法。
[29] 請求項 27又は 28に記載の糖鎖チップの使用方法において、
前記相互作用の定量化がが、蛍光によるシグナルの検出によることを特徴とする糖 鎖チップの使用方法。
[30] 請求項 14一 26のいずれか一つに記載の糖鎖チップ上に細胞を播種し、糖鎖と細 胞との相互作用を利用して該細胞の分化，増殖，接着，及び変異から選ばれる少な くとも一つの挙動を制御することを特徴とする糖鎖チップの使用方法。
PCT/JP2005/004929 2004-03-31 2005-03-18 ポリマー粒子 WO2005097844A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/594,182 US7985874B2 (en) 2004-03-31 2005-03-18 Polymer particle
JP2006511969A JP5026070B2 (ja) 2004-03-31 2005-03-18 ポリマー粒子
EP05721116A EP1731540A4 (en) 2004-03-31 2005-03-18 POLYMER PARTICLE

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004102236 2004-03-31
JP2004-102237 2004-03-31
JP2004-102236 2004-03-31
JP2004102237 2004-03-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005097844A1 true WO2005097844A1 (ja) 2005-10-20

Family

ID=35125010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/004929 WO2005097844A1 (ja) 2004-03-31 2005-03-18 ポリマー粒子

Country Status (4)

Country Link
US (1) US7985874B2 (ja)
EP (1) EP1731540A4 (ja)
JP (2) JP5026070B2 (ja)
WO (1) WO2005097844A1 (ja)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006123686A1 (ja) * 2005-05-20 2006-11-23 Jsr Corporation 担体ポリマー粒子およびその製造方法ならびに特異捕捉用磁性粒子およびその製造方法
JP2006321932A (ja) * 2005-05-20 2006-11-30 Jsr Corp 担体ポリマー粒子およびその製造方法
JP2007145985A (ja) * 2005-11-28 2007-06-14 Jsr Corp 担体ポリマー粒子の製造方法
WO2008018170A1 (fr) 2006-08-09 2008-02-14 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Substance capable de capturer les chaînes glucidiques et procédé l'utilisant
JP2008173033A (ja) * 2007-01-17 2008-07-31 Tohoku Univ 糖鎖高分子の製造方法
JP2008541011A (ja) * 2005-05-06 2008-11-20 ヨンセイ ユニバーシティ インダストリー アカデミック コオペレーション ファンデーション 誘導体化された固体表面上への非修飾の炭水化物の固定による炭水化物チップの製作およびその用途
JP2012181181A (ja) * 2011-02-10 2012-09-20 Sumitomo Bakelite Co Ltd 生理活性物質固定化用粒子、生理活性物質固定粒子及び糖親和性物質捕捉粒子
JP2012211817A (ja) * 2011-03-31 2012-11-01 Sumitomo Bakelite Co Ltd 糖鎖測定方法および糖鎖固定化基材
JP2013070682A (ja) * 2011-09-29 2013-04-22 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞表面糖鎖の製造方法および細胞表面糖鎖試料
JP5500067B2 (ja) * 2008-04-30 2014-05-21 住友ベークライト株式会社 糖鎖標識方法
JP2015081788A (ja) * 2013-10-21 2015-04-27 住友ベークライト株式会社 電気化学的検出のための糖鎖試料の調製方法
JP2015099162A (ja) * 2015-02-20 2015-05-28 国立大学法人北海道大学 糖鎖アレイ
US9310358B2 (en) 2010-07-30 2016-04-12 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Sugar chain array
WO2019208669A1 (ja) * 2018-04-27 2019-10-31 キヤノン株式会社 粒子、及びその製造方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5869232A (ja) * 1981-10-20 1983-04-25 Otsuka Chem Co Ltd 多孔性で溶解性の良好なアクリル酸ヒドラジド系高分子化合物の製造法
EP0648739B1 (de) * 1993-10-19 1997-03-12 BASF Aktiengesellschaft Oximether und diese enthaltende Copolymerisate
JP2001521625A (ja) * 1997-04-16 2001-11-06 ベーイーオー メリュー 標的生物学的物質を単離するための方法、捕獲相、検出相、及び試薬
JP2002515081A (ja) * 1996-03-15 2002-05-21 ジェルテックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド ロタウイルス感染治療用多価ポリマー
JP2004264027A (ja) * 2003-01-15 2004-09-24 Toyobo Co Ltd 生体分子相互作用測定方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5853757A (ja) * 1981-09-25 1983-03-30 Denki Kagaku Kogyo Kk 免疫アフイニテイクロマトグラフイ−用吸着体及びその製法
KR100535170B1 (ko) * 1996-12-19 2005-12-09 아벤티스 파마슈티칼스 인크. 하이드록삼산 화합물의 고체상 합성 방법
FR2802536B1 (fr) * 1999-11-23 2003-06-13 Chru Lille Oligomannosides de synthese, leur preparation et leur utilisation a la detection d'anticorps et a la prevention d'infections
AU1861001A (en) 1999-11-29 2001-06-12 Syntesome Gesellschaft Fur Medizinische Biochemie Mbh Arrays of glycan molecules (glycoarrays) on the surface of biochips (glycochips)and uses thereof
CN101104594A (zh) * 2002-12-26 2008-01-16 盐野义制药株式会社 用捕捉糖链的分子纯化/浓缩糖链的方法和分析糖链结构的方法
JP2005097844A (ja) * 2003-09-22 2005-04-14 Kawamura Electric Inc 蝶番構造

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5869232A (ja) * 1981-10-20 1983-04-25 Otsuka Chem Co Ltd 多孔性で溶解性の良好なアクリル酸ヒドラジド系高分子化合物の製造法
EP0648739B1 (de) * 1993-10-19 1997-03-12 BASF Aktiengesellschaft Oximether und diese enthaltende Copolymerisate
JP2002515081A (ja) * 1996-03-15 2002-05-21 ジェルテックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド ロタウイルス感染治療用多価ポリマー
JP2001521625A (ja) * 1997-04-16 2001-11-06 ベーイーオー メリュー 標的生物学的物質を単離するための方法、捕獲相、検出相、及び試薬
JP2004264027A (ja) * 2003-01-15 2004-09-24 Toyobo Co Ltd 生体分子相互作用測定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1731540A4 *

Cited By (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008541011A (ja) * 2005-05-06 2008-11-20 ヨンセイ ユニバーシティ インダストリー アカデミック コオペレーション ファンデーション 誘導体化された固体表面上への非修飾の炭水化物の固定による炭水化物チップの製作およびその用途
JP2006321932A (ja) * 2005-05-20 2006-11-30 Jsr Corp 担体ポリマー粒子およびその製造方法
US9447232B2 (en) 2005-05-20 2016-09-20 Jsr Corporation Carrier polymer particle, process for producing the same, magnetic particle for specific trapping, and process for producing the same
WO2006123686A1 (ja) * 2005-05-20 2006-11-23 Jsr Corporation 担体ポリマー粒子およびその製造方法ならびに特異捕捉用磁性粒子およびその製造方法
JP2007145985A (ja) * 2005-11-28 2007-06-14 Jsr Corp 担体ポリマー粒子の製造方法
EP2518495A2 (en) 2006-08-09 2012-10-31 Sumitomo Bakelite Company, Ltd. Sugar chain-capturing substance and use thereof
JP2012211133A (ja) * 2006-08-09 2012-11-01 Sumitomo Bakelite Co Ltd 糖鎖捕捉物質およびその用途
JP2012177126A (ja) * 2006-08-09 2012-09-13 Sumitomo Bakelite Co Ltd 糖鎖捕捉物質およびその用途
WO2008018170A1 (fr) 2006-08-09 2008-02-14 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Substance capable de capturer les chaînes glucidiques et procédé l'utilisant
EP2503332A2 (en) 2006-08-09 2012-09-26 Sumitomo Bakelite Company, Ltd. Sugar chain-capturing substance and use thereof
JP2012184431A (ja) * 2006-08-09 2012-09-27 Sumitomo Bakelite Co Ltd 糖鎖捕捉物質およびその用途
JP2012189601A (ja) * 2006-08-09 2012-10-04 Sumitomo Bakelite Co Ltd 糖鎖捕捉物質およびその用途
US9714328B2 (en) 2006-08-09 2017-07-25 Sumitomo Bakelite Company, Ltd. Sugar chain-capturing substance and use thereof
JP2012211134A (ja) * 2006-08-09 2012-11-01 Sumitomo Bakelite Co Ltd 糖鎖捕捉物質およびその用途
US9340651B2 (en) 2006-08-09 2016-05-17 Sumitomo Bakelite Company Limited Sugar chain-capturing substance and use thereof
EP2799868A2 (en) 2006-08-09 2014-11-05 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Sugar chain-capturing substance and use thereof
JPWO2008018170A1 (ja) * 2006-08-09 2009-12-24 住友ベークライト株式会社 糖鎖捕捉物質およびその用途
JP2008173033A (ja) * 2007-01-17 2008-07-31 Tohoku Univ 糖鎖高分子の製造方法
JP5500067B2 (ja) * 2008-04-30 2014-05-21 住友ベークライト株式会社 糖鎖標識方法
US8828732B2 (en) 2008-04-30 2014-09-09 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Method of labeling sugar chain
US9310358B2 (en) 2010-07-30 2016-04-12 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Sugar chain array
JP2012181181A (ja) * 2011-02-10 2012-09-20 Sumitomo Bakelite Co Ltd 生理活性物質固定化用粒子、生理活性物質固定粒子及び糖親和性物質捕捉粒子
JP2012211817A (ja) * 2011-03-31 2012-11-01 Sumitomo Bakelite Co Ltd 糖鎖測定方法および糖鎖固定化基材
JP2013070682A (ja) * 2011-09-29 2013-04-22 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞表面糖鎖の製造方法および細胞表面糖鎖試料
JP2015081788A (ja) * 2013-10-21 2015-04-27 住友ベークライト株式会社 電気化学的検出のための糖鎖試料の調製方法
JP2015099162A (ja) * 2015-02-20 2015-05-28 国立大学法人北海道大学 糖鎖アレイ
WO2019208669A1 (ja) * 2018-04-27 2019-10-31 キヤノン株式会社 粒子、及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1731540A1 (en) 2006-12-13
JPWO2005097844A1 (ja) 2008-02-28
JP2012122073A (ja) 2012-06-28
JP5026070B2 (ja) 2012-09-12
US7985874B2 (en) 2011-07-26
EP1731540A4 (en) 2011-03-02
US20080254998A1 (en) 2008-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5026070B2 (ja) ポリマー粒子
AU2018302034B2 (en) Method of chemically modifying plastic surfaces
EP2056106A1 (en) Sugar chain-capturing substance and use thereof
US20050112650A1 (en) Reactive polyurethane-based polymers
JP2007326920A (ja) バイオアッセイ用高分子化合物およびこれを用いたバイオアッセイ用基材
JP5076878B2 (ja) 糖タンパク質糖鎖の分析方法
JP5866880B2 (ja) 生理活性物質固定化用粒子、生理活性物質固定粒子及び糖親和性物質捕捉粒子
JP2010117189A (ja) 生理活性物質固定化用基板
JP2012201653A (ja) 糖鎖ライブラリー、その作製方法、およびそれを固定した糖鎖アレイ
Dendane et al. Surface patterning of (bio) molecules onto the inner wall of fused-silica capillary tubes
JP2009216608A (ja) 試料調製方法
JPWO2015108020A1 (ja) 組成物、糖鎖試料の調製方法及び糖鎖の分析方法
KR20040063655A (ko) 광분해성 연결기가 도입된 생체 분자 분리용 고분자지지체 및 이를 이용한 생체분자의 검출 및 분석방법
US20030152961A1 (en) Polyfunctional support material for complex nucleic acid analysis
US20060183242A1 (en) Phthalate polymers
JP5682850B1 (ja) 糖鎖試料を標識するための化合物
US7384754B2 (en) Enrichment and tagging of glycosylated proteins
EP2645103B1 (en) Glycopeptide array
JP6241564B1 (ja) 糖鎖捕捉性ポリマー粒子
JP2022122455A (ja) 糖鎖を標識する方法及びキット
JP4414880B2 (ja) ペプチドまたはタンパク質の提示のための装置、その製造方法および使用
Farhadgholami et al. Preparation of Efficient Kit for the Semi-Quantitative Determination of Sarcosine as a cancer marker by Grafting Molecularly Imprinted-Stationary on Glass Plate
EP4083636A1 (en) Biochip and detection method
JP2022026938A (ja) 糖鎖を標識する方法及びキット
RU2261279C1 (ru) Способ приготовления аффинных поверхностей на основе химически прошитого белка а

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006511969

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2005721116

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005721116

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005721116

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10594182

Country of ref document: US