WO2005082384A1 - 人工生理的塩類溶液およびその製造方法 - Google Patents

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WO2005082384A1
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artificial
salt solution
artificial physiological
physiological salt
solution
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PCT/JP2005/002778
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Shigeru Kabayama
Shinkatsu Morisawa
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Nihon Trim Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to an artificial physiological salt solution and a method for producing the same.
  • Dry eye is a function that covers the surface of the eye by reducing the amount of tears that cover the surface of the eye and eliminate external pathogens and transport nutrients to the septum for various reasons. Is obstructed. This causes symptoms such as dryness of the eyes, foreign body sensation, eye fatigue, itching of the eyes, increased blinking blinks, and hyperemia.
  • Non-patent Document 2 Attention has been focused on the resulting inflammatory changes, and attempts have been made to alleviate the symptoms of dry eye by instilling steroids (eg, Avni M. Avunduk et al., I, he and omparison of Efncacies oi Topical Cor ticosteroids and Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drops on Dry Eye Patients: A Clinical and Immunocy to chemical Study ", American Journal of Ophthalmology, Elsevier Science, Vol. 136, No. 4, October 2003, p. 593-602 (non See Patent Document 2)).
  • steroids eg, Avni M. Avunduk et al., I, he and omparison of Efncacies oi Topical Cor ticosteroids and Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drops on Dry Eye Patients: A Clinical and Immunocy to chemical Study ", American Journal of Ophthalmology, Elsevier Science, Vol. 136, No. 4, October
  • a washing solution used for washing a nasal cavity for the purpose of reducing allergic symptoms such as hay fever has been conventionally known.
  • physiological saline or the like has been used as a nasal cavity washing solution, and thus has no ability to suppress oxidative and inflammatory reactions.
  • a nasal cavity washing solution that can sufficiently suppress the oxidation reaction and the inflammatory reaction as in the case of the eye washing solution described above.
  • the composition is adjusted to a composition close to the body fluid of the human body so as not to harm the cells or tissues to be cultured.
  • Cells and tissues cultured using cell's tissue culture solution are easily handled artificially unlike cells and tissues in the body, so they are more susceptible to oxidative stress than cells and tissues in the body. The development of novel cell and tissue culture solutions that can suppress such oxidative damage is particularly useful.
  • Non-Patent Document 1 Albert J. Augustin et al., Oxidative reactions in the tear f iuid of patients suffering from dry eyes ,,, Graeies Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology ⁇ Springer ⁇ 233, No. 11, 1995 , P. 694-698
  • Non-Patent Document 2 Avni M. AvunduK; et al., Hie Comparison oi Efficacies of Topical Corticosteroids and Nonsteroidal Anti-inflammatory Drops on Dry Eye Patients: A Clinical an ⁇ mmunocytochemical Study
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to have an active oxygen scavenging ability and an anti-inflammatory effect, and to have an organ washing solution (eye washing solution, nasal washing solution).
  • the present invention provides a novel artificial physiological salt solution that can be applied to various uses such as artificial fluid, artificial infusion fluid, artificial amniotic fluid, protective solution, and cell / tissue culture solution, and a method for producing the same. .
  • the artificial physiological salt solution of the present invention has an active hydrogen reaction value of 0.01-1 and a pH of 4.07.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention preferably contains sodium ions, potassium ions and chloride ions.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention may contain sodium ion of 200 mEq / L or less. preferable.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention preferably contains potassium ion of 100 mEq / L or less.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention preferably contains chloride ions of 200 mEqZL or less.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention is preferably prepared by adjusting the ion balance of electrolytically reduced water.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention preferably has an oxidation-reduction potential force of S-800 + 200mV.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention can be suitably used for the following uses (a) to (c).
  • the present invention also provides an electrolytic reduced water having an active hydrogen reaction value of 0.01-1 and a pH of 4.0-7.9 (preferably 6.0-7.9) and an osmotic pressure of 260-1.
  • the present invention also provides a method for producing an artificial physiological salt solution, which is adjusted to 2560 mOsm / L (preferably, 260 to 32 OmOsm / L).
  • the method for producing an artificial physiological salt solution of the present invention may further include a step of adjusting the ion balance of electrolytically reduced water by adding sodium chloride and / or potassium salt. preferable.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention has an ability to scavenge active oxygen, suppress the chemotactic and migratory activities of polymorphonuclear leukocytes, particularly neutrophils, which are inflammatory cells, Since it does not adversely affect organs, tissues, and cells, it can be suitably applied to various uses as an artificially prepared physiological salt solution.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention has a stronger ability to scavenge active oxygen and an anti-inflammatory effect than conventional eye washing solutions other than steroids, and is therefore suitable as an eye washing solution.
  • sufficient effects can be achieved with a smaller number of washings and instillations than in the past. Therefore, even in a modern society where you have to work hard, you can expect a substantial effect of treatment.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention can suppress eye inflammation without causing undesired side effects, and can inhibit eye tissue by active oxygen or a substance that causes it. It can be used to take damage, so that if you relieve symptoms such as dry eyes, foreign body sensation, eyestrain, itchy eyes, increased blinking, and redness, it can be effective. it can.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention When the artificial physiological salt solution of the present invention is applied as a nasal cavity washing solution, dust, germs, pollen, and the like in the nasal cavity can be removed, and the nasal cavity can be suitably washed.
  • the antioxidant and anti-inflammatory effects of the artificial physiological salt solution can exert the effect of suppressing allergic symptoms such as hay fever without causing undesired side effects.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention When the artificial physiological salt solution of the present invention is applied as an artificial infusion, artificial amniotic fluid or a protective solution, cells, tissues, organs, and fetuses are less susceptible to oxidative damage, resulting in faster recovery. , Can exhibit the effect.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention when applied as a cell or tissue culture solution, cells and tissues are less susceptible to oxidative damage, and cultured cells and cultured tissues in an environment closer to the body are used.
  • the experimental system used can be realized.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention when applied to primary culture cells (cultured cells before cell line formation) as a cell culture medium, the oxidative damage is suppressed and the life of the primary culture cells is reduced. It has a remarkable effect.
  • FIG. 1 is a graph showing the activity of the artificial physiological saline solution of the present invention to inhibit neutrophil migration and chemotaxis.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention is characterized in that each of them has an active hydrogen reaction value, pH, and osmotic pressure in a specific range.
  • the active oxygen scavenging ability as described below without adversely affecting the organs, tissues and cells to which it is applied, It can exert an anti-inflammatory effect by inhibiting the chemotactic and migratory activities of inflammatory cells, polymorphonuclear leukocytes, especially neutrophils.
  • the “artificial physiological salt solution” refers to an artificially prepared physiological salt solution having a composition similar to a body fluid in the human body.
  • composition similar to body fluid means that when an artificial physiological saline solution is applied to an organ, tissue or cell according to the intended use, the organ, tissue or cell is not damaged.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention includes, specifically, an organ washing solution (eg, an eye washing solution (including eye drops) or a nasal washing solution), an artificial infusion solution, an artificial amniotic fluid, a protective solution (eg, a cardioplegic solution),
  • an organ washing solution eg, an eye washing solution (including eye drops) or a nasal washing solution
  • an artificial infusion solution eg., an artificial amniotic fluid
  • a protective solution eg, a cardioplegic solution
  • the artificial physiological salt solution of the present invention has an active hydrogen reaction value (hydrogen radical reaction value) in the range of 0.011. If the active hydrogen reaction value is less than 0.01 or exceeds 1, the purpose of the present invention cannot be achieved because the active oxygen scavenging ability and the anti-inflammatory effect decrease or disappear.
  • the active hydrogen reaction value in the artificial physiological salt solution of the present invention is not particularly limited as long as it is within the above range, but it is preferably 0.1 to 1, more preferably 0.5 to 1. preferable.
  • the active hydrogen reaction value in the artificial physiological salt solution of the present invention can be determined by a method proposed by the present applicant in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-350420 (hereinafter, referred to as "DBNBS method"). Refers to the value measured according to. The measurement of the active hydrogen reaction value is specifically performed as follows.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention has a pH in the range of 4.0-7.9 (preferably 6.0-7.9). If the pH is less than 4.0 or more than 7.9, there is a possibility that the applied organs, tissues or cells may be undesirably damaged or degraded, and the object of the present invention cannot be achieved. ,.
  • the pH of the artificial physiological salt solution of the present invention is not particularly limited as long as it is within the above range. For example, when the artificial physiological salt solution of the present invention is applied to an organ washing solution, 6.0.
  • the pH is preferably in the range of 7.3-7.6, When used for nasal irrigation, a pH in the range of 6.0-7.4 is preferred.)
  • the artificial physiological saline solution of the present invention is used for artificial infusion, artificial amniotic fluid or protective solution, it is preferably 4.0-7.6, which is 7.1-7.6. It is particularly preferred that the force is 7.3-7.5.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention is applied to the use of a cell or tissue culture solution, 6.9-7.5 is preferred, and 7.1-7.3 is preferred. Is more preferred.
  • the pH of the artificial physiological salt solution of the present invention can be measured by using a pH meter ( ⁇ 260, manufactured by Beckman), reading the display by immersing the pH electrode in the artificial physiological salt solution. Refers to the measured value.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention has an osmotic pressure in the range of 260 to 2560 m ⁇ sm / L (preferably 260 to 320 mOsm / L). If the osmotic pressure is less than 260 m ⁇ sm / L or more than 2560 m ⁇ smZL, there is a risk that undesired damage or functional deterioration may occur in the organs, tissues or cells to which it is applied. I can't do it.
  • the osmotic pressure of the artificial physiological salt solution of the present invention is not particularly limited as long as it is within the above range.
  • 270-315 mOsmZL is preferred, and 280 305 m ⁇ smZL is preferred.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention is used for artificial infusion, artificial amniotic fluid, or protective fluid, it is preferably 270 2560 m ⁇ sm / L. It is more preferable to be 310 mOsm / L 280-300 m ⁇ sm / L is particularly preferable.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention is applied to the use of cell culture fluid, it is preferably 260-310 mOsm / L, more preferably 265-280 m ⁇ sm / L. .
  • the osmotic pressure in the artificial physiological salt solution of the present invention refers to a value measured using an osmometer (osmometer, manufactured by ROEBLING) and based on the principle of the freezing point drop method.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention in which the active hydrogen reaction value, the pH and the osmotic pressure are within specific ranges, respectively, the active oxygen scavenging ability, the polymorphonuclear leukocytes which are inflammatory cells, In particular, it has an inhibitory effect on neutrophil chemotactic and migratory activities and does not adversely affect the organs, tissues and cells to which it is applied. It can be suitably applied.
  • the active oxygen scavenging ability of the artificial physiological saline solution of the present invention can be confirmed by, for example, the Fenton reaction method.
  • the Fenton reaction is a method for measuring the amount of active oxygen. ⁇ is generated from hydrogen peroxide using iron as a catalyst, and ⁇ is used to excite luminol, which is a luminescent reagent. This is a method of observing the decrease in active oxygen using the emitted light.
  • the active oxygen scavenging ability of the artificial physiological saline solution of the present invention can also be measured by a hydrogen peroxide method or an HX-X ⁇ D method in addition to the Fenton reaction method.
  • the hydrogen peroxide method is a method for measuring H 2 O of active oxygen, and the method described above is used.
  • the HX-X ⁇ D method is a method for measuring ⁇ ′ in active oxygen, using HX (hypoxanthine) as a substrate and X ⁇ D (In this method, ⁇ 'is generated by cinoxidase, and O ⁇ excites the luminescent reagent CLA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the decrease in active oxygen generated at that time is observed.
  • the HX-XOD method is, specifically, 0.2 ⁇ LD of phosphate buffer (pH 7.8), 1 ⁇ M (7) CLA, 5 U / mL of XOD, in a cell of CLD-110. After adding 10 ⁇ M HX to the final concentration, add the test sample (artificial physiological salt solution), adjust the total volume to 2 mL, and measure the change in luminescence intensity. The ability to scavenge active oxygen can be confirmed.
  • the effect of attracting inflammatory cells (chemotaxis activity and migration activity) by the artificial physiological saline solution of the present invention can be confirmed by a chemotaxis chamber method. Specifically, first, neutrophils separated from human blood are suspended in the artificial physiological salt solution of the present invention and treated for a certain period of time. Thereafter, a solution of a chemokine such as IL-18 or RANTES is placed in the chamber well, and a polycarbonate membrane (polypyrrolidone-free) is placed on it (holes slightly smaller than neutrophils are provided regularly). On which neutrophil suspension is added and allowed to migrate for a certain period of time, migrate through the hole in the membrane and into the well. — The ability to evaluate by staining and counting with a staining solution such as Quik.
  • a staining solution such as Quik.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention preferably contains at least one of sodium ion (Na + ), potassium ion (K + ) and chloride ion (cr).
  • the artificial physiological salt solution of the present invention does not contain at least any of sodium ion (Na + ), potassium ion (K + ), and chloride ion (C ⁇ )
  • the artificial physiological salt solution is applied. This is because cell growth is stopped in organs, tissues, and cells, and the functions of organs, tissues, and cells may be reduced or stopped.
  • the artificial physiological salt solution according to a preferred embodiment of the present invention contains at least one of sodium ions, potassium ions, and chloride ions, and thereby functions of an organ, tissue, or cell to which the artificial physiological salt solution is applied. Can be maintained.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention contains sodium ions, it preferably contains 200 mEq / L or less. If the content of sodium ion exceeds 200 mEq / L, there is a possibility that an undesired damage or functional deterioration may occur in the organ, tissue or cell to which the ion is applied.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention reduces the function of the organ, tissue or cell to which it is applied. From the viewpoint of preventing lowering, it is preferable that sodium ion is contained at 30 mEq / L or more.
  • the content of sodium ions in the artificial physiological salt solution of the present invention is preferably 20 OmEq / L or less as described above.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention is used for an organ washing solution. If applicable, it is preferably 125 165 mEq / L, more preferably 1 35-155 mEqZL.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention is used for human infusion, artificial amniotic fluid or protective solution, it is preferably 135-170 mEq / L, more preferably 145-160 mEq / L.
  • Masire When the human physiological saline solution of the present invention is used for cell / tissue culture, it is more preferably 115-155 mEqZL, more preferably 125-145 mEq / L.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention contains potassium ions, it preferably contains 100 mEq / L or less. If the content of potassium ion exceeds 100 mEq / L, there is a possibility that the organs, tissues or cells to which the potassium ions are applied may cause undesired damage or functional deterioration.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention preferably contains potassium ions at lmEq / L or more from the viewpoint of preventing a decrease in the function of an organ, tissue or cell to which the artificial physiological salt solution is applied.
  • the content of potassium ion in the artificial physiological salt solution of the present invention is preferably 100 mEq / L or less as described above.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention is used for an organ washing solution. When applied, it is preferably 10-40 mEq / L, more preferably 20-30 mEq / L.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention is used for artificial infusion, artificial amniotic fluid, or protective solution, it is preferably 2 to 10 mEq / L, more preferably 3 to 7 mEq / L. preferable.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention is applied to the use of a cell or tissue culture solution, it is preferably 18 mEq / L, and more preferably 26 mEqZL.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention contains chloride ions, it preferably contains 200 mEqZL or less. If the chloride ion content exceeds 200 mEqZL, the organs, tissues or cells to which the chloride ion is applied may be undesirably damaged or deteriorate in function.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention preferably contains potassium ions of lmEqZL or more from the viewpoint of preventing a decrease in the function of the organ, tissue or cell to which the artificial physiological salt solution is applied.
  • the content of chloride ions in the artificial physiological salt solution of the present invention is as described above. Although it is preferably at most mEq / L, for example, when the artificial physiological salt solution of the present invention is applied to the use of an organ washing solution, it is preferably 110-150 mEq / L. L is more preferable to be L.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention is used for human infusion, artificial amniotic fluid or protective solution, it is preferably 90 to 130 mEq / L, more preferably 100 to 120 mEq / L.
  • Masire When the artificial physiological saline solution of the present invention is applied to the use of a cell or tissue culture solution, it is preferably 80 to 120 mEqZL, more preferably 90 to 110 OmEqZL.
  • the content of the above-mentioned sodium ion, potassium ion, and salt ion in the artificial physiological salt solution of the present invention is determined by ICP-MS (Induced coupling plasma-mass spectrometry) (ICP-MS).
  • ICP-MS Induced coupling plasma-mass spectrometry
  • Agilent 7500 manufactured by Agilent Technologies.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention may contain components other than the above-mentioned sodium ion, potassium ion, and chloride ion as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • examples of such components include amino acids, glucose, citric acid, calcium ions, hydrogen carbonate ions, hydrogen phosphate ions, dihydrogen phosphate ions, glucose, fructose, xylitol, acetic acid, lactic acid, and magnesium ions.
  • sodium chondroitin sulfate, hyaluronic acid, etc. may be mentioned.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention is preferably prepared by adjusting the ion balance of electrolytically reduced water.
  • the “electrolytically reduced water” is formed in the cathode chamber by introducing water (raw water) in which an electrolyte is dissolved into each of the cathode chamber and anode chamber separated by a diaphragm and electrolyzing it. With active hydrogen rich in atomic hydrogen is there. Electrolyzed reduced water has an antioxidant effect by being rich in reducing (antioxidant) active hydrogen, and as a result, is useful for the prevention and treatment of various diseases and suppresses the progress of aging. In addition, it is expected to be used in many fields other than medicine, such as food preservation and semiconductor cleaning.
  • the artificial physiological salt solution is ion-balanced is determined by using ICP-MS (Agilent7500, manufactured by Agilent Technologies) in the artificial physiological salt solution. It can be confirmed by calculating the molar ratio of sodium ion to potassium ion.
  • ICP-MS Agilent Technologies
  • the artificial physiological salt solution of the present invention preferably has an oxidation-reduction potential (ORP) power S-800- + 200 mV, more preferably -500- + 100 mV. It is more preferred, especially within the range of 400— + 50 mV. If the oxidation-reduction potential is less than 800 mV or more than +200 mV, the function of the organ, tissue or cell to which it is applied tends to decrease.
  • ORP oxidation-reduction potential
  • the oxidation-reduction potential of the artificial physiological saline solution of the present invention was measured using an oxidation-reduction potentiometer.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention can be applied to a wide range. It is preferable to use it for the following purposes: (1) organ washing solution, (b) artificial fluid, artificial amniotic fluid or protective solution, and (c) cell / tissue culture solution. Note that these are merely examples of applications to which the artificial physiological salt solution of the present invention can be particularly suitably applied, and the artificial physiological salt solution of the present invention is not limited to these uses, and may be used in a wide range of applications. Can be provided to
  • organ washing examples include eye washing (including eye drops) and nasal washings, as well as skin, ear, heart, lung, kidney, liver, muscle, knee, brain, mouth, peritoneal cavity, spleen
  • eye washing including eye drops
  • nasal washings as well as skin, ear, heart, lung, kidney, liver, muscle, knee, brain, mouth, peritoneal cavity, spleen
  • spleen The application to the washing of organs such as the gall bladder, appendix and digestive tract.
  • Eye inflammation includes the generation of active oxygen at the site of inflammation that occurs locally and the attraction of inflammatory cells to the local area, and the generation of active oxygen that is generated from the attracted cells. May cause eye strain and damage eye tissues. In order to prevent the harm of these reactive oxygen species, the ability to scavenge reactive oxygen species and the ability to make it difficult to attract inflammatory cells to sites of inflammation are necessary.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention as an eye wash, it has an ability to scavenge active oxygen and suppress the chemotactic and migratory activities of inflammatory cells such as polymorphonuclear leukocytes, especially neutrophils.
  • Eye wash eye disease prevention (when dust or sweat gets into eyes after swimming, use contact, VDT work, etc.), or when used as a cleaning solution during eye treatment or surgery, electrolytic reduced water Because of its anti-inflammatory effects, inflammation is suppressed and eye tissue is damaged by reactive oxygen species and the substances that cause it. It can relieve symptoms such as dry eyes, foreign body sensation, eye fatigue, itchy eyes, increased blinking and redness. Therefore, the artificial physiological saline solution of the present invention can be used for dry eye, contact lens use, VDT work, etc., dry eyes-foreign body sensation, eyestrain, itchy eyes, increased blink, active oxygen generated at the time of hyperemia, etc. Eye irrigation, eye irrigation (e.g.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention is used as an eye washing solution, for example, it is stored in a 5-20 mL cup provided with a lip that fits around the eye, and the lip of the cup is placed in the eye. The eye can be washed by blinking while contacting the artificial physiological salt solution to the eyes.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention can also be used in the form of eye drops. In this case, the solution is housed in a commonly used container for eye drops, and is dropped onto a few drops.
  • a preservative which is usually added to the eye drop, and use it as a cut-type package.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention when applied as a nasal cavity washing solution, dust, germs, pollen, etc. in the nasal cavity can be removed, and the nasal cavity can be suitably washed.
  • the antioxidant and anti-inflammatory actions of the physiological salt solution can suppress allergic symptoms such as hay fever without causing unwanted side effects.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention is preferably contained in a container provided with a spraying means, and is preferably in the form of a spray which can be sprayed into the nasal cavity as appropriate. Can be washed.
  • an artificial physiological saline solution of the present invention When used as an artificial infusion, an artificial amniotic fluid or a protective solution (for example, a myocardial protective solution), cells, tissues, organs, and fetuses are less susceptible to oxidative damage, and as a result, recovery is achieved. The effect of speeding up can be exhibited.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention when used as an artificial infusion, for example, the artificial physiological salt solution can be provided in a known infusion bag.
  • the artificial infusion was used as a concentrated solution having a high osmotic pressure (for example, having a concentration of 8 times that of a normal artificial saline solution) within the scope of the present invention described above. May be achieved.
  • a concentrated solution having a high osmotic pressure for example, having a concentration of 8 times that of a normal artificial saline solution
  • the artificial physiological salt solution of the present invention can be transluminally injected into the uterus using, for example, a catheter.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention is used as a protective solution (for example, a myocardial protective solution)
  • the artificial physiological salt solution can be provided, for example, in a known infusion bag.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention When used as a cell / tissue culture solution, there is an effect that cells and tissues are susceptible to oxidative damage. This makes it possible to implement an experimental system using cultured cells and cultured tissues in an environment closer to the body.
  • Examples of the cells that can be cultured in the artificial physiological saline solution of the present invention include various known cultured cells such as primary cultured cells (cultured cells before cell line conversion), subcultured cells, and ES cells. Can be.
  • primary cultured cells cultured cells before cell line conversion
  • subcultured cells and ES cells.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention is used as a cell or tissue culture solution, it is provided, for example, in a form that has been concentrated in advance and stored in a container, and is suitable for business, appropriate medium solution and cell / tissue culture They can be mixed and used at a desired ratio.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention may contain various proteins as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • Examples of powerful proteins include insulin, transferrin, superoxide dismutase (SOD), thioredoxin, glutathione peroxidase, urinary trypsin inhibitor (UTI), albumin, and activin.
  • the content of the protein is preferably 6.0% by mass or less. If the protein content exceeds 6.0% by mass, the organs or cells to which the protein is applied may be undesirably damaged or deteriorated in function.
  • the present invention also provides a method for producing the above-described artificial physiological saline solution of the present invention.
  • the electrolytic reduced water is prepared by reacting an active hydrogen with an active hydrogen reaction value of 0.01-1 and a ⁇ -force of 4.0-7.9 (preferably 6.0-7.9). And an osmotic pressure of 260 2560 mOs mZL (preferably 260 320 m ⁇ sm / L).
  • electrolytic reduced water is obtained using, for example, an electrolytic reduced water producing apparatus (TI-8000, manufactured by Nippon Trim Co., Ltd.).
  • Electrolytically reduced water can be obtained, for example, by adding an appropriate electrolyte to raw water (water before electrolysis) and then performing electrolysis.
  • Raw water used for the production of electrolytically reduced water includes ultrapure water (MilliQ water), pure water, distilled water, tap water, etc. Considering application to the human body and living cells, ultrapure water, pure water Alternatively, it is preferable to use distilled water as raw water.
  • Examples of the electrolyte include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium chloride, potassium chloride, and hexachloroplatinic acid. Among them, avoid mixing hypochlorous acid generated from the anode. In order not to generate hypochlorous acid, sodium hydroxide and / or potassium hydroxide are preferred.
  • the electrolyte is added to the raw water so that the electric conductivity of the raw water is preferably 100 ⁇ S / cm or more, more preferably 100 1000 ⁇ S / cm.
  • the amount of the electrolyte for obtaining the electric conductivity of the raw water is, for example, 4 to 800 mg / L, preferably 10 to 300 mg / L, more preferably 50 to 800 mg / L. — 200 mg / L.
  • the electrolysis is performed by a known electrolytic reduction water producing apparatus (preferably, TI-series) having at least an electrolytic cell having a cathode chamber including a cathode and an anode chamber including an anode, which are separated from each other via a diaphragm. 8000 (manufactured by Nippon Trim).
  • the conditions for the electrolysis can be performed according to conventionally known appropriate conditions without any particular restrictions. For example, the conditions are as follows: current is 115 ° C, voltage is 0 to 80 V, temperature is 460 ° C, time is 1 second to 1 hour, and flow rate is 0 to 1500 mL / min.
  • the water generated in the cathode chamber can be provided as electrolytic reduced water. Further, it is more preferable to provide the electrolytic reduced water after RO (reverse osmosis membrane) treatment.
  • RO reverse osmosis membrane
  • the electrolytically reduced water thus obtained is adjusted to have the active hydrogen reaction value, pH, and osmotic pressure in the above ranges, respectively.
  • the active hydrogen reaction value can be adjusted, for example, by diluting or concentrating the electroreduced water to a desired active hydrogen reaction value.
  • the pH is adjusted by adding a buffer (eg, sodium hydrogen carbonate, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, citric acid, sodium citrate, HEPES, etc.) or adding hydrochloric acid or sodium hydroxide. Can be adjusted.
  • a buffer eg, sodium hydrogen carbonate, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, citric acid, sodium citrate, HEPES, etc.
  • hydrochloric acid or sodium hydroxide can be adjusted.
  • the osmotic pressure can be adjusted, for example, by diluting or concentrating the electrolytically reduced water so as to have a desired osmotic pressure. Combining these methods as appropriate, taking into account the mutual effects, results in an active hydrogen reaction value of 0.01-1 and a pH of 4.07.9 (preferably 6.0-7.9). Adjustment is made so that the osmotic pressure becomes 260 2560 m ⁇ sm / L (preferably 260 320 m ⁇ smZL).
  • the method for producing an artificial physiological salt solution of the present invention may further include a step of adjusting the ion balance of electrolytically reduced water by adding sodium chloride and Z or potassium salt.
  • chloride salts are used for both sodium and potassium because they do not affect the pH.
  • the step of adjusting the strong ion balance may be performed before or after adjusting the above-described active hydrogen reaction value, pH and osmotic pressure. For this reason, it is preferable to do this before adjusting the active hydrogen reaction value, pH and osmotic pressure.
  • All the steps in the method for producing an artificial physiological salt solution of the present invention are performed under aseptic conditions, or after the artificial physiological salt solution is prepared, sterilization of a filter or sterilization using an auto-tarve is performed. Prefer to do ,.
  • the artificial physiological salt solution of the present invention has an active hydrogen reaction value of 0.01-1 and a pH of S4.0-7.9 (preferably 6.0-7. 9) If the osmotic pressure is 260-2560 mOsm / L (preferably 260-320 mOsm / L), the osmotic pressure is not limited to that produced by the above-mentioned production method of the present invention.
  • the method for appropriately adjusting the osmotic pressure can also produce the artificial physiological salt solution of the present invention.
  • the artificial physiological saline solution of the present invention is produced by the above-mentioned production method of the present invention.
  • a mixture of a 0.857mM NamH aqueous solution and a 0.143mM KOH aqueous solution (0.428mL of a 2N NaOH aqueous solution and a KOH aqueous solution (0.428mL of a 2N Na ⁇ H aqueous solution and 0.072mL of 2N KOH 1 liter MiliQ water) was electrolyzed (current: 5A, temperature: 20 ° C, flow rate: 1100mL / min) using an electrolytic reduced water production system (TI-80000, manufactured by Nippon Trim).
  • the active hydrogen reaction value 0 ⁇ 06 (measured by the DBNBS method), ⁇ 7.5 (measured using a pH meter ( ⁇ 260, manufactured by Beckman)), osmotic pressure 303 mOsm / L (osmotic pressure meter (osmometer, (Measured using ROEBLING) was obtained.
  • Such an artificial physiological salt solution contains 145 mEq / L of sodium ion, 24 mEq / L of potassium ion, and 170 mEq / L of chloride ion (measured using ICP-MS (Agilent 7500, manufactured by Agilent Technologies), respectively), The oxidation-reduction potential was 100 mV (measured using an oxidation-reduction potentiometer (RM-20P, manufactured by Toa Denpa Kogyo KK)).
  • An artificial physiological saline solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that distilled water was used instead of electrolytically reduced water.
  • the active hydrogen reaction value was 0, the pH was 7.5, and the osmotic pressure was 303 m ⁇ sm / L.
  • the content of sodium ion measured in the same manner as in Example 1 was 145 mEq / L, the content of potassium ion was 24 mEqZL, the content of chloride ion was 170 mEq / L, and the oxidation-reduction potential was +350 mV.
  • Comparative Example 2 An artificial physiological salt solution was prepared in the same manner as in Example 1, except that the electrolytically reduced water prepared in Example 1 was used after being concentrated 5-fold.
  • the active hydrogen reaction value was 1.8
  • the pH was 7.6
  • the osmotic pressure was 303 m ⁇ sm /.
  • the content of sodium ions was measured in the same manner as in Example 1, 145mEq / L, content of potassium ions 24MEqZL content of chloride ions l 8 0mEq / L, redox potential was _150MV.
  • An artificial physiological salt solution was prepared in the same manner as in Example 1, except that INHC1 was added to the electrolytic reduced water prepared in Example 1 to adjust the pH to 5.5.
  • the active hydrogen reaction value was 0.06
  • the pH was 5.5
  • the osmotic pressure was 303 mOsm / L.
  • the content of sodium ion measured in the same manner as in Example 1 was 145 mEqZL
  • the content of potassium ion was 24 mEq / L
  • the content of chloride ion was 200 mEq / L
  • the oxidation-reduction potential was _50 mV.
  • An artificial physiological salt solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that IN HC1 was added to the electrolytic reduced water prepared in Example 1 to adjust the pH to 8.5.
  • the active hydrogen reaction value was 0.06
  • the pH was 8.5
  • the osmotic pressure was 304 mOsm / L.
  • the content of sodium ion measured in the same manner as in Example 1 was 145 mEq / L
  • the content of potassium ion was 24 mEq / L
  • the content of chloride ion was 180 mEq / L
  • the oxidation-reduction potential was ⁇ 100 mV.
  • An artificial physiological saline solution was prepared in the same manner as described above.
  • the obtained artificial physiological salt solution was measured in the same manner as in Example 1.
  • the active hydrogen reaction value was 0.06
  • the pH was 7.5
  • the osmotic pressure was 240 m ⁇ smZL.
  • An artificial physiological saline solution was prepared in the same manner as described above.
  • the active hydrogen reaction value was 0.06
  • the pH was 7.5
  • the osmotic pressure was 360 m ⁇ smZL.
  • the content of sodium ion measured in the same manner as in Example 1 was 175 mEqZL, the content of potassium ion was 30 mEq / L, the content of chloride ion was 205 mEq / L, and the oxidation-reduction potential was ⁇ 50 mV.
  • Example 1 For the artificial physiological salt solutions of Example 1 and Comparative Examples 16 to 16, the measured value of active oxygen (cpm) was calculated by luminescence of luminol derived from hydrogen peroxide using the hydrogen peroxide method. The results are shown in Table 1.
  • Example 1 Comparative Example 1 Comparative Example 2 Comparative Example 3 Comparative Example 4 Comparative Example 5 Comparative Example 6 Active hydrogen reaction value 0.06 0 1.8 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06
  • Evaluation test 2 (survival rate (%)) 98 98 97 60 49 47 39
  • Evaluation test 3 (Ease of use of eye washing solution) Good Good / OK Good / OK Not possible Not possible Not possible Not possible Not possible Not possible Not possible Not possible Not possible Evaluation test 4 (TBA SCnmol / ml) 2.7 ⁇ 0.5 4.6 + 0.5 2-3 ⁇ 0.4 3.1 ⁇ 0.4---Evaluation test 5 (Viability after 24 hours culture (%)) 78 41 80 10 2 0 0 0
  • FIG. 1 shows that the artificial physiological salt solution according to the present invention can migrate human neutrophils by chemokines.
  • a chemotaxis chamber method capable of measuring inflammatory cell migration activity and chemotaxis activity was used.
  • neutrophils separated from human blood are suspended in the solution and treated for a certain time.
  • a solution of a chemokine (IL-18, RANTE S, etc.) was placed in the chamber jar and the membrane was placed on top of it.
  • the membrane is regularly provided with a force vj and a shark hole smaller than the size of the neutrophil.
  • After assembling the chamber add a neutrophil suspension to the well above the membrane and allow it to migrate for a period of time.
  • the effect of artificial saline solution on neutrophils was also confirmed by a live cell assay.
  • the trypan-blue test was used as a live cell measurement method. Live cells exclude trypan blue (blue dye) outside the cells, so cells are not stained, but dead cells cannot be eliminated and cells are stained.
  • the trypan-blue test measures the number of stained and unstained cells by phase contrast microscopy and calculates the viability (number of unstained cells ⁇ (number of stained cells + number of unstained cells). ) X 100) (%) is calculated.
  • Table 1 As shown in Table 1, it was confirmed that neutrophils were not damaged at all by the artificial physiological saline solution of the present invention of Example 1. On the other hand, in the case of Comparative Examples 3-6, the survival rate was less than half. Therefore, it was found that using the cells in such a state for a migration test was not appropriate.
  • Example 1 Using the artificial physiological saline solution of Example 1 to perform eye washing with one's own eyes, it was found that dust was properly removed from the liquid after washing without such an unpleasant stimulus. In addition, ten collaborators tried eye washing in the same way and were evaluated in the following three stages.
  • Acceptable Can wash eyes, but has unpleasant irritation to eyes, or does not cause irritation to eyes.
  • Table 1 shows the results. As shown in Table 1, all the persons evaluated that the eyes could be washed with no unpleasant irritation. This indicates that the artificial physiological salt solution of the present invention has an eye cleaning effect. On the other hand, in Comparative Examples 1 and 2, the evaluation of good and fair was halved, and there was variation among persons. In Comparative Example 36, all evaluations were unacceptable, and the eyes had unpleasant irritation.
  • Example 1 An artificial physiological saline solution prepared with electrolytically reduced water (Example 1) was continuously administered intravenously as an infusion to rats that had been subjected to oxidative stress using FNA (ferric nitrilot riacetic acid). The improvement effect on oxidative stress was evaluated.
  • TBARS thiobarbituric acid-reactive substances; thionorbituric acid reaction
  • FNA was intraperitoneally administered to be 10 mg Fe / kg.
  • the artificial physiological saline solution of Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 was applied to the rats of each group at a rate of 0.05 ml / min via a force neura using a syringe pump MODEL11 (manufactured by Harvard). The administration was continued for 1 hour at the flow rate.
  • the abdomen was opened under ether anesthesia, and whole blood was collected from the abdominal aorta. Plasma was stored frozen at -80 ° C until TBARS measurement.
  • the amount of TBARS in rat plasma was measured using a TBARS assay kit OXLtec (ZeptoMetrix) and according to the protocol. The results are shown in Table 1.
  • the TBARS value when treated with FNA for 0 hour was 1.5 ⁇ 0.3 nmolZml.
  • the FNA was treated for 6 hours and increased to 4.6 ⁇ 0.5 nmolZml by 3.1 times.
  • the increase was 2.7 ⁇ 0.5 nmol / l, a 1.8-fold increase.
  • the force which was not as effective as the concentration of the electrolytically reduced water, was 2.3 ⁇ 0.4 nmol, a 1.5-fold increase. This means that oxidative stress caused by FNA was reduced by 52%.
  • the evaluation test was not performed for Comparative Examples 416 because cytotoxicity was observed in the evaluation test 2 described above.
  • Neutrophils isolated from human blood were primarily cultured in the artificial physiological saline solution of the present invention to evaluate whether the survival rate was improved. Evaluation was performed by suspending neutrophils isolated from human blood in the artificial physiological saline solution of Example 1 and Comparative Example 16 and seeding them in a 5 ml culture dish, and using a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. Primary culture was performed for 24 hours, and the survival rate was calculated by the trypan blue test. The results are shown in Table 1.
  • Example 1 At the start of the culture, the survival rate was 98%, whereas as can be seen from Table 1, the survival rate of Comparative Example 1 after culturing for 24 hours was 41%. On the other hand, in Example 1, although the survival rate was reduced, it was as high as 78%. This indicates that the artificial physiological saline solution of Example 1 contributes to the improvement of the survival rate in the culture of primary cells having a poor survival rate. In Comparative Example 2, the ratio of the concentrated electrolytically reduced water increased the survival rate. Although it did not contribute to the above, it maintained a high survival rate of 80%. Regarding other survival rates, Comparative Example 3 was 10%, Comparative Example 4 was 2%, Comparative Example 5 was 0%, and Comparative Example 6 was 0%.

Abstract

　活性水素反応値が０．０１～１、ｐＨが４．０～７．９、浸透圧が２６０～２５６０ｍＯｓｍ／Ｌである人工生理的塩類溶液、およびその製造方法により、活性酸素消去能および抗炎症作用を有し、器官洗浄液（目の洗浄液、鼻の洗浄液など）、人工輸液、人工羊水、保護液、細胞・組織培養液など、多様な用途に適用することができる新規な人工生理的塩類溶液、およびその製造方法を提供することができる。

Description

明 細 書
人工生理的塩類溶液およびその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、人工生理的塩類溶液およびその製造方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、ドライアイやコンタクトレンズ使用による目の乾き、異物感、 目の疲れ、 目のか ゆみ、まばたきの増加、充血などの症状を呈する人が増加の一途をたどっている。ド ライアイとは、 目の表面をカバーし外界からの病原体を駆除したり、隔膜に栄養を運 んだりする役割を有する涙の量が様々な原因によって減少し、 目の表面をカバーす る機能が阻害されてしまう状態である。これにより、上記の目の乾き、異物感、 目の疲 れ、 目のかゆみ、まばたきの増カロ、充血などの症状が現れる。ドライアイの原因として は、加齢による涙腺分泌能低下、結膜炎、ビタミン A欠乏症、シエーダレン症候群、 S teven— Johnson症候群、リュウマチ、糖尿病、薬剤などが挙げられ、それにより分泌 不全型ドライアイが引き起こされる。また近年では、コンタクトレンズ装用による涙液の 蒸発亢進、 VDT (Visual Display Terminals)作業中に見られる瞬きの回数の減 少などにより、蒸発亢進型のドライアイが引き起こされる。
[0003] 従来から、ドライアイの治療としては、涙液の分泌量と蒸発量のバランスを保つこと を基本概念として、部屋の加湿や規則的な瞬きなどの生活指導、人工涙液の頻回点 目艮、保護眼鏡による涙液蒸発量の抑制、涙点の閉鎖といった方法が用いられていた 。近年では、ドライアイ患者の涙液層では、酸化反応や炎症反応が認められることが 既に明らかとなってきた（たとえば、 Albert J. Augustinら、 " Oxidative reactio ns in the tear fluid of patients suffering from dry eyes 、 Graefe s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology Λ Springer^弟 233卷、第 1 1号、 1995年、 p. 694—698 (非特許文献 1)を参照）。このため、ドライ アイの原因となる或いは結果となる炎症変化に注目されるようになっており、ステロイ ド剤を点眼することによりドライアイの症状を緩和する試みがなされている（たとえば、 Avni M. Avundukら、 i，he し omparison of Efncacies oi Topical Cor ticosteroids and Nonsteroidal Anti - inflammatory Drops on Dry Eye Patients： A Clinical and Immunocy to chemical Study"、 American J ournal of Ophthalmology, Elsevier Science,第 136卷、第 4号、 2003年 10 月、 p. 593— 602 (非特許文献 2)を参照）。
[0004] し力、しながら、涙液の分泌量と蒸発量のバランスを保つことを基本概念とした治療 法では、生活指導などを行なったとしても、忙しく働力、ざるを得ない現代社会におい て十分に遂行されることが困難であり、実質的効果は期待できない。また、ステロイド 剤の点眼に関しては、その効き目は確かであると予想されるが、度重なる使用による 効果の低下や中止時のリバウンドなどの重篤な副作用が十分に予想される。したが つて、副作用などが発現することなぐ酸化反応や炎症反応を抑制できる、 目の洗浄 あるいは点眼に適用可能な新規な組成物の開発が望まれている。
[0005] また、花粉症などのアレルギー症状の軽減を目的として、鼻腔の洗浄に用いられる 洗浄液も従来より知られている。鼻腔の洗浄液としては、従来、生理的食塩水などが 用いられているため、酸化反応や炎症反応を抑制する能力はない。このため、上述 した目の洗浄液の場合と同様に、酸化反応や炎症反応を十分に抑制できる鼻腔の 洗浄液の開発が望まれているのが現状である。
[0006] 近年では、たとえば総合アミノ酸輸液、高カロリー輸液用糖 ·電解質'アミノ酸液、電 解質輸液、高カロリー輸液用糖 ·電解質液、腹腔透析液、人工腎臓用透析液などの 人工輸液が、医療の現場で頻繁に用いられている。このような人工輸液は、術後の 回復や脱水の補給、生存維持などの目的で使用されるものであるが、このような状態 のときは体内にダメージがあり、活性酸素による酸化ダメージが考えられる。また、人 ェ輸液のほか、出産の現場で胎児の生命を維持するために用いられる人工羊水や、 心臓手術の際に用いられる心筋保護液などの保護液についても、活性酸素による同 様の酸化ダメージの問題が考えられる。したがって人工輸液、人工羊水、保護液に おいても、人体内での酸化反応や炎症反応を抑制できるものであることが望まれるが 、酸化ダメージに対する防御物質が組込まれた人工輸液、人工羊水、保護液は未だ 開発されていない。
[0007] また、培養する細胞や組織に害を及ぼさないよう人体の体液に近い組成で調整さ れる細胞'組織培養液にぉレ、ても、酸化ダメージを十分に防ぎ得る防御物質を含有 するものは未だないとレ、うのが現状である。細胞'組織培養液を用いて培養される細 胞ゃ組織は、体内における細胞 ·組織とは異なり人為的に扱い易い状態としているた め、体内の細胞 ·組織と比較して酸化ストレスを受け易ぐこのような酸化ダメージを抑 制し得る新規な細胞 ·組織培養液の開発は、特に有用であるとレ、える。
非特許文献 1： Albert J. Augustinら、 Oxidative reactions in the tear f iuid of patients suffering from dry eyes，，、 Graeie s Archive for Cli nical and Experimental Ophthalmology^ Springer^弟 233卷、第 11号、 19 95年、 p. 694-698
非特許文献 2 : Avni M. AvunduK;ら、 Hie Comparison oi Efficacies of Topical Corticosteroids and Nonsteroidal Anti - inflammatory Drops on Dry Eye Patients： A Clinical an 丄 mmunocytochemical Study
、 American Journal of Ophthalmology^ Elsevier Science、弟 136卷、第 4 号、 2003年 10月、 p. 593-602
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところ は、活性酸素消去能および抗炎症作用を有し、器官洗浄液（目の洗浄液、鼻腔の洗 浄液など）、人工輸液、人工羊水、保護液、細胞 ·組織培養液など、多様な用途に適 用することができる新規な人工生理的塩類溶液、およびその製造方法を提供するこ とである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明の人工生理的塩類溶液は、活性水素反応値が 0. 01— 1、 pHが 4. 0 7.
9 (好ましく ίま、 6. 0— 7. 9)、浸透圧力 S260— 2560mOsm/L (好ましく fま、 260 3
20mOsm/L)であることを特徴とする。
[0010] ここにおいて本発明の人工生理的塩類溶液は、ナトリウムイオン、カリウムイオンお よび塩化物イオンを含むものであることが好ましい。
[0011] 本発明の人工生理的塩類溶液は、ナトリウムイオンを 200mEq/L以下含むことが 好ましい。
[0012] また本発明の人工生理的塩類溶液は、カリウムイオンを 100mEq/L以下含むこと が好ましい。
[0013] 本発明の人工生理的塩類溶液は、塩化物イオンを 200mEqZL以下含むことが好 ましい。
[0014] また、本発明の人工生理的塩類溶液は、電解還元水にイオンバランスの調整を施 したものであることが好ましレ、。
[0015] さらに本発明の人工生理的塩類溶液は、酸化還元電位力 S-800 + 200mVであ ることが好ましい。
[0016] 本発明の人工生理的塩類溶液は、以下の（a)—（c)の用途に好適に用いることが できるものである。
(a)器官洗浄液
(b)人工輸液、人工羊水または保護液
(c)細胞 ·組織培養液
[0017] 本発明はまた、電解還元水を、活性水素反応値が 0. 01— 1、 pHが 4. 0— 7. 9 ( 好ましく ίま、 6. 0—7. 9)、浸透圧力 260— 2560mOsm/L (好ましく ίま、 260— 32 OmOsm/L)となるように調整することを特徴とする人工生理的塩類溶液の製造方 法も提供する。
[0018] 本発明の人工生理的塩類溶液の製造方法において、塩ィ匕ナトリウムおよび/また は塩ィ匕カリウムを添加することによって、電解還元水のイオンバランスを調整するェ 程をさらに含むことが好ましい。
発明の効果
[0019] 本発明の人工生理的塩類溶液は、活性酸素消去能、炎症性細胞である多形核白 血球、特に好中球の走化活性、遊走活性を抑制する作用を示し、さらには適用する 器官、組織、細胞に悪影響を及ぼすことがないので、人工的に作製した生理的塩類 溶液として多様な用途に好適に適用することができる。
[0020] たとえば、本発明の人工生理的塩類溶液は、ステロイド剤以外の従来の目の洗浄 液と比較して強い活性酸素消去能、抗炎症作用を有するため、 目の洗浄液として適 用した場合には、従来よりも少ない洗浄回数、点眼回数で十分な効果を発現し得る。 したがって忙しく働かざるを得ない現代社会においても、治療の実質的効果を期待 できる。また、本発明の人工生理的塩類溶液は、従来のステロイド剤を用いた場合と は異なり不所望な副作用が起こることなぐ 目の炎症を抑制でき、活性酸素やそれを 引き起こす物質による目の組織のダメージを受けに《することができ、それによつて 目の乾き'異物感、 目の疲れ、 目のかゆみ、瞬きの増カロ、充血などの症状を緩和する とレ、う効果を発揮することができる。
[0021] また、本発明の人工生理的塩類溶液を鼻腔の洗浄液として適用した場合には、鼻 腔内の埃や雑菌、花粉などを取り除き、鼻腔内の洗浄を好適に行なうことができ、ま た、人工生理的塩類溶液が有する抗酸化作用、抗炎症作用によって、不所望な副 作用が起こることなく花粉症などのアレルギー症状を抑制できるという効果を発揮す ること力 Sできる。
[0022] また本発明の人工生理的塩類溶液を人工輸液、人工羊水または保護液として適用 した場合には、細胞や組織、器官、胎児が酸化ダメージを受けにくくなり、結果として 回復が早くなるとレ、う効果を発揮することができる。
[0023] さらに、本発明の人工生理的塩類溶液を細胞'組織培養液として適用した場合に は、細胞や組織が酸化ダメージを受けにくくなり、より体内に近い環境での培養細胞 、培養組織を用いた実験系の実現が可能となる。また、特に、初代培養細胞（セルラ イン化する前の培養細胞）に本発明の人工生理的塩類溶液を細胞'組織培養液とし て適用した場合には、酸化ダメージの抑制により初代培養細胞の寿命が延びる、と レ、う顕著な効果を発揮する。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1]本発明の人工生理的塩類溶液による好中球の遊走 ·走化能の抑制活性を示す 図である。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 本発明の人工生理的塩類溶液は、それぞれ特定範囲の活性水素反応値、 pH、浸 透圧を兼ね備えることを特徴とする。本発明の人工生理的塩類溶液によれば、適用 する器官、組織、細胞に悪影響を及ぼすことなぐ後述するような活性酸素消去能、 炎症性細胞である多形核白血球、特に好中球の走化活性、遊走活性を抑制して抗 炎症効果を発揮し得る。ここで、「人工生理的塩類溶液」とは、人体中の体液に近似 した組成を有する人工的に作製された生理的塩類溶液を指す。なお、「体液に近似 した組成」とは、人工生理的塩類溶液を用途に応じ器官、組織または細胞に適用し た際に、器官、組織または細胞に害を及ぼさない程度に当該器官、組織または細胞 における体液の組成に近い組成を指す。本発明の人工生理的塩類溶液は、具体的 には、器官洗浄液 (たとえば目の洗浄液 (点眼剤を含む)や鼻腔の洗浄液）、人工輸 液、人工羊水、保護液 (たとえば心筋保護液)、細胞 ·組織培養液など、広範にわた る応用が期待できる。
[0026] 本発明の人工生理的塩類溶液は、活性水素反応値 (水素ラジカル反応値）が 0. 0 1一 1の範囲内にあるものである。活性水素反応値が 0. 01未満または 1を越えると、 活性酸素消去能、抗炎症効果が低下してしまう、あるいは消滅してしまうため、本発 明の目的を達成することができない。本発明の人工生理的塩類溶液における活性水 素反応値は、上記範囲内にあるならば特に制限されないが、 0. 1一 1であるのが好ま しく、 0. 5— 1であるのがより好ましい。
[0027] なお、本発明の人工生理的塩類溶液における活性水素反応値は、特開 2002-35 0420号公報にて、本出願人が提案した方法（以下、「DBNBS法」と呼称する。）に 準じて測定した値を指す。活性水素反応値の測定は、具体的には、以下のようにし て行なう。
(1) 517nm近傍に吸収を有する 1, 1_ジフヱ二ルー 2—ピクリルヒドラジル（DPPH)の 溶液に、白金黒存在下で一定の速度で水素ガスを吹き込み、 517nm近傍の吸光度 の減衰と水素ガスの吹き込み時間との相関のグラフを求める（検量線 Aの作成)。
(2) 100 μ Μ以下のシスティンと DPPHを反応させ、 DPPHの 517nm近傍の吸光の 減衰とシスティン濃度との相関のグラフを求める（検量線 Bの作成)。
(3) 450nm近傍に吸収を有する 3， 5_ジブロモ— 4_ニトロソベンゼンスルフォン酸の ナトリウム塩 (DBNBS)の溶液に白金黒存在下で一定の速度で水素ガスを吹き込み 、 450nm近傍の吸光度と活性水素濃度との相関のグラフを求める（検量線 Cの作成
) o (4)試料（人工生理的塩類溶液）に DBNBSを添加し、 60°Cで 1時間加熱後の 450η m近傍の吸光度を測定して、得られた測定値を活性水素反応値 (水素ラジカル反応 値)とする。
[0028] 本発明の人工生理的塩類溶液は、 pHが 4. 0-7. 9 (好ましくは 6. 0-7. 9)の範 囲内にあるものである。 pHが 4. 0未満または 7. 9を越えると、適用する器官、組織ま たは細胞に不所望な障害、機能低下が発生する虞があり、本発明の目的を達成する ことができなレ、。本発明の人工生理的塩類溶液における pHは、上記範囲内にあるな らば特に制限されないが、たとえば、本発明の人工生理的塩類溶液を器官洗浄液の 用途に適用する場合には、 6. 0-7. 7であるのが好ましい（中でも、本発明の人工 生理塩的塩類塩水を目の洗浄に用いる場合には、 pHが 7. 3-7. 6の範囲であるの が好適であり、鼻腔の洗浄に用いる場合には、 pHが 6. 0— 7. 4の範囲であるのが好 適である。）。また本発明の人工生理的塩類溶液を人工輸液、人工羊水または保護 液の用途に適用する場合には、 4· 0-7. 6であるのが好ましぐ 7. 1-7. 6であるの 力はり好ましぐ 7. 3-7. 5であるのが特に好ましい。また、本発明の人工生理的塩 類溶液を細胞'組織培養液の用途に適用する場合には、 6. 9-7. 5であるのが好ま しぐ 7. 1-7. 3であるのがより好ましい。
[0029] なお、本発明の人工生理的塩類溶液における pHは、 pHメータ（ φ 260、ベックマ ン社製）を用レ、、 pH電極を人工生理的塩類溶液に浸漬して表示を読み取ることで測 定された値を指す。
[0030] 本発明の人工生理的塩類溶液は、浸透圧が 260— 2560m〇sm/L (好ましくは 2 60— 320mOsm/L)の範囲内にあるものである。浸透圧が 260m〇sm/L未満ま たは 2560m〇smZLを越えると、適用する器官、組織または細胞に不所望な障害、 機能低下が発生する虞があり、本発明の目的を達成することができなレ、。本発明の 人工生理的塩類溶液における浸透圧は、上記範囲内にあるならば特に制限されな いが、たとえば、本発明の人工生理的塩類溶液を器官洗浄液の用途に適用する場 合には、 270— 315mOsmZLであるのが好ましぐ 280 305m〇smZLであるの 力はり好ましい。また本発明の人工生理的塩類溶液を人工輸液、人工羊水または保 護液の用途に適用する場合には、 270 2560m〇sm/Lであるのが好ましぐ 270 一 310mOsm/Lであるのがより好ましぐ 280— 300m〇sm/Lであるのが特に好 ましレ、。また、本発明の人工生理的塩類溶液を細胞'組織培養液の用途に適用する 場合には、 260— 310mOsm/Lであるのが好ましぐ 265— 280m〇sm/Lである のがより好ましい。
[0031] なお、本発明の人工生理的塩類溶液における浸透圧は、浸透圧計 (ォスモメータ、 ROEBLING社製）を用レ、、氷点降下法の原理に基づレ、て測定された値を指す。
[0032] 上述したように活性水素反応値、 pHおよび浸透圧がそれぞれ特定範囲内である 本発明の人工生理的塩類溶液によれば、活性酸素消去能、炎症性細胞である多形 核白血球、特に好中球の走化活性、遊走活性を抑制する作用を示し、さらには適用 する器官、組織、細胞に悪影響を及ぼすことがないので、人工的に作製した生理的 塩類溶液として多様な用途に好適に適用することができる。
[0033] ここで、本発明の人工生理的塩類溶液が有する活性酸素消去能については、たと えば、フェントン反応法によって確認することができる。フェントン反応法は、活性酸 素のうち ·〇Ηを測定する方法であり、過酸化水素から鉄を触媒として · ΟΗを発生さ せ、 · ΟΗにより発光試薬であるルミノールを励起させ、そのときに生じる発光を利用し て活性酸素の減少を見る方法である。具体的な操作方法は、高感度化学発光測定 器 (CLD— 1 10、東北電子産業株式会社製）を用い、セル中に 0. 1Mのトリス塩酸緩 衝液（ρΗ7. 8)、 2. 5 μ Μのルミノール、 5 μ Μの DTPA (diethylenetriamine_N , N, Ν ' , N " , N " ' -pentaacetic acid)、 5 μ Mの FeSO
4、 50 μ Mの過酸ィ匕水 素を週濃度になるように加えた後、試料 (人工生理的塩類溶液)を添加し、全量が 2 mLとなるように調整した上で発光強度の変化を測定することで確認することができる
[0034] また、本発明の人工生理的塩類溶液が有する活性酸素消去能については、上記 フェントン反応法以外にも、過酸化水素法や HX— X〇D法によって測定することも可 能である。過酸化水素法は、活性酸素のうち H Oを測定する方法であり、上述したフ
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ェントン反応法の反応液から DTPAの FeS〇混液を除いた反応液を用いて、過酸化
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水素に由来するルミノール発光を測定する方法である。また、 HX— X〇D法は、活性 酸素のうち〇 'を測定する方法であり、 HX (ヒポキサンチン）を基質とし、 X〇D (キサ ンチンォキシダーゼ）により〇 'を発生させ、 O ·が発光試薬である CLA (和光純薬 工業株式会社製）を励起させ、そのときに生じる活性酸素の減少を見る方法である。
HX— XOD法は、具体的には、 CLD—110のセル中に、 0. 2 μ Μのリン酸緩衝液（p H7. 8)、 1 μ M(7)CLA, 5U/mLの XOD、 10 μ Mの HXを終濃度となるように加え た後、試験体 (人工生理的塩類溶液)を添加し、全量が 2mLとなるように調製した上 で発光強度の変化を測定することで、活性酸素消去能を確認することができる。
[0035] また、本発明の人工生理的塩類溶液による炎症性細胞の引き寄せ（走化活性、遊 走活性）の効果は、ケモタキシスチャンバ法によって確認することができる。具体的に は、まず、本発明の人工生理的塩類溶液に、ヒト血液より分離された好中球を浮遊さ せ一定時間処理する。その後、 IL一 8、 RANTESなどのケモカインの溶液をチャンバ のゥエルに入れ、その上にポリカーボネート製の膜 (ポリビュルピロリドンフリー）（好中 球よりわずかに小さな穴が規則的に設けられている）を載置し、その上に上記好中球 の浮遊液を添加し、一定時間遊走'走化させ、膜の穴を通ってゥエルの中にまで遊 走 ·走化した好中球を、 Diff— Quikなどの染色液で染色しカウントすることで、評価す ること力 Sできる。
[0036] 本発明の人工生理的塩類溶液は、ナトリウムイオン (Na+)、カリウムイオン (K+)およ び塩化物イオン（cr)の少なくともレ、ずれかを含むことが好ましレ、。本発明の人工生 理的塩類溶液が、ナトリウムイオン (Na+)、カリウムイオン (K+)および塩化物イオン (C Γ)の少なくともいずれ力を含有しない場合には、人工生理的塩類溶液を適用した器 官、組織、細胞において細胞増殖の停止がみられ、器官、組織、細胞の機能が低下 または停止してしまう虞があるためである。本発明の好ましい態様の人工生理的塩類 溶液においては、ナトリウムイオン、カリウムイオンおよび塩ィ匕物イオンの少なくともい ずれかを含むことで、人工生理的塩類溶液を適用する器官、組織または細胞の機能 を維持できるという効果を発揮することができる。
[0037] 本発明の人工生理的塩類溶液は、ナトリウムイオンを含む場合、 200mEq/L以下 含むことが好ましい。ナトリウムイオンの含有量が 200mEq/Lを越えると、適用する 器官、組織または細胞に不所望な障害、機能低下が発生する虞があるためである。 また、本発明の人工生理的塩類溶液は、適用する器官、組織または細胞の機能低 下を防ぐ観点からは、ナトリウムイオンを 30mEq/L以上含むことが好ましい。
[0038] 本発明の人工生理的塩類溶液におけるナトリウムイオンの含量は、上記のように 20 OmEq/L以下であることが好ましいが、たとえば、本発明の人工生理的塩類溶液を 器官洗浄液の用途に適用する場合には、 125 165mEq/Lであるのが好ましぐ 1 35— 155mEqZLであるのがより好ましレ、。また本発明の人工生理的塩類溶液を人 ェ輸液、人工羊水または保護液の用途に適用する場合には、 135 170mEq/L であるのが好ましぐ 145— 160mEq/Lであるのがより好ましレ、。また、本発明の人 ェ生理的塩類溶液を細胞 ·組織培養液の用途に適用する場合には、 115— 155mE qZLであるのが好ましぐ 125 145mEq/Lであるのがより好ましい。
[0039] 本発明の人工生理的塩類溶液は、カリウムイオンを含む場合、 100mEq/L以下 含むことが好ましい。カリウムイオンの含有量が 100mEq/Lを越えると、適用する器 官、組織または細胞に不所望な障害、機能低下が発生する虞があるためである。ま た、本発明の人工生理的塩類溶液は、適用する器官、組織または細胞の機能低下 を防ぐ観点からは、カリウムイオンを lmEq/L以上含むことが好ましレ、。
[0040] 本発明の人工生理的塩類溶液におけるカリウムイオンの含量は、上記のように 100 mEq/L以下であることが好ましいが、たとえば、本発明の人工生理的塩類溶液を 器官洗浄液の用途に適用する場合には、 10— 40mEq/Lであるのが好ましぐ 20 一 30mEq/Lであるのがより好ましい。また本発明の人工生理的塩類溶液を人工輸 液、人工羊水または保護液の用途に適用する場合には、 2— 10mEq/Lであるのが 好ましぐ 3— 7mEq/Lであるのがより好ましい。また、本発明の人工生理的塩類溶 液を細胞'組織培養液の用途に適用する場合には、 1一 8mEq/Lであるのが好まし く、 2 6mEqZLであるのがより好ましい。
[0041] 本発明の人工生理的塩類溶液は、塩化物イオンを含む場合、 200mEqZL以下 含むことが好ましい。塩化物イオンの含有量が 200mEqZLを越えると、適用する器 官、組織または細胞に不所望な障害、機能低下が発生する虞があるためである。ま た、本発明の人工生理的塩類溶液は、適用する器官、組織または細胞の機能低下 を防ぐ観点からは、カリウムイオンを lmEqZL以上含むことが好ましレ、。
[0042] 本発明の人工生理的塩類溶液における塩化物イオンの含量は、上記のように 200 mEq/L以下であることが好ましいが、たとえば、本発明の人工生理的塩類溶液を 器官洗浄液の用途に適用する場合には、 110— 150mEq/Lであるのが好ましぐ 1 20— 140mEq/Lであるのがより好ましレ、。また本発明の人工生理的塩類溶液を人 ェ輸液、人工羊水または保護液の用途に適用する場合には、 90 130mEq/Lで あるのが好ましぐ 100— 120mEq/Lであるのがより好ましレ、。また、本発明の人工 生理的塩類溶液を細胞'組織培養液の用途に適用する場合には、 80— 120mEqZ Lであるのが好ましぐ 90— l lOmEqZLであるのがより好ましい。
[0043] なお、本発明の人工生理的塩類溶液における上記ナトリウムイオン、カリウムイオン 、塩ィ匕物イオンの含量は、 ICP— MS (Induced coupling plasma-mass spectr ometry;誘導結合プラズマ質量分析装置）（Agilent7500、 Agilent Technologi es社製)を用いて測定された値を指すものとする。
[0044] また、本発明の人工生理的塩類溶液においては、上記ナトリウムイオン、カリウムィ オン、塩化物イオン以外の成分を、本発明の効果を損なわない範囲で含有していて もよレ、。かかる成分としては、たとえば、アミノ酸類、グルコース、クェン酸、カルシウム イオン、炭酸水素イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、ブドウ糖、果糖、キ シリトール、酢酸、乳酸、マグネシウムイオンなどが挙げられる。その他にも、たとえば 本発明の人工生理的塩類溶液を器官洗浄液の用途に適用する場合には、コンドロ ィチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸などが挙げられ、本発明の人工生理的塩類溶液 を人工輸液、人工羊水または保護液の用途に適用する場合には、亜鉛、硫酸、タン パク質、糖類、脂質、リン、鉄、ョード、マンガン、銅、バナジウム、尿中トリプシンインヒ ビター（UTI)などが挙げられ、また、本発明の人工生理的塩類溶液を細胞'組織培 養液の用途に適用する場合には、亜鉛、硫酸、タンパク質、糖類、脂質、リン、鉄、ョ ード、マンガン、銅、バナジウム、セレナイト（亜セレン酸ナトリウム）、エタノールァミン 、尿中トリプシンインヒビター（UTI)、血清、血漿、ァクチビンなどが挙げられる。
[0045] 本発明の人工生理的塩類溶液は、電解還元水にイオンバランスの調整を施したも のであることが好ましい。ここで、「電解還元水」は、隔膜で隔てられた陰極室と陽極 室のそれぞれに電解質を溶解した水（原水）を導入して電気分解することによって陰 極室に生成される、反応性の大きい原子状水素である活性水素を豊富に含む水で ある。電解還元水は、還元性 (抗酸化性)を有する活性水素を豊富に含むことによつ て抗酸化作用を有し、結果、様々な疾病の予防や治療に役立ち、老化の進行を抑 制するほか、医療以外の分野でも、食品の保存や半導体の洗浄など、多くの分野で 利用が期待されている。このように、上述した本発明の人工生理的塩類溶液を電解 還元水を利用して調製することで、電解還元水中の活性物質の性質上、活性酸素を 消去してもその活性成分は水に戻るだけで副作用がないという利点がある。電解還 元水の製法については、たとえば電解還元水製造装置 (TI-8000、 日本トリム社製） を用いた方法が知られており、その好適な一方法については、本発明の人工生理的 塩類溶液の製造方法の説明におレ、て後述する。
[0046] また「イオンバランスの調整」とは、カリウムイオン：ナトリウムイオン = 1： 4一 1： 8 (モ ル比）となるように、ナトリウムイオンとカリウムイオンとの含量を調整することを指す。ィ オンバランスがカリウムイオン：ナトリウムイオン = 1 : 4未満である、あるいは、カリウム イオン:ナトリウムイオン = 1 : 8を越えると、適用する器官、組織または細胞の機能が 低下してしまう傾向にあるためである。イオンバランスは、上記中でも、カリウムイオン： ナトリウムイオン = 1： 5— 1： 7となるように調整されるのがより好ましぐカリウムイオン： ナトリウムイオン = 1： 6となるように調整されるのが最も好ましレ、。
[0047] なお、人工生理的塩類溶液がイオンバランスを施されてレ、るか否かは、 ICP-MS ( Agilent7500、 Agilent Technologies社製）を用いて、人工生理的塩類溶液中 に含有されるカリウムイオンに対するナトリウムイオンのモル比を算出することで確認 すること力 Sできる。
[0048] また、本発明の人工生理的塩類溶液は、酸化還元電位（ORP)力 S— 800— + 200 mVの範囲内であるのが好ましぐ—500— + 100mVの範囲内であるのがより好まし く、一 400— + 50mVの範囲内であるのが特に好ましレ、。酸化還元電位カ 800mV 未満または + 200mVを越えると、適用する器官、組織または細胞の機能が低下して しまう傾向にあるためである。
[0049] なお、本発明の人工生理的塩類溶液における酸化還元電位は、酸化還元電位計
(RM-20P,東亜電波工業社製)を用いて測定された値を指す。
[0050] 本発明の人工生理的塩類溶液は、広範な範囲への応用が可能であるが、特に、 (a )器官洗浄液、（b)人工輸液、人工羊水または保護液、（c)細胞 ·組織培養液の用途 に供するのが好ましい。なお、これらは本発明の人工生理的塩類溶液を特に好適に 適用することができる用途を例示したものに過ぎず、本発明の人工生理的塩類溶液 はこれらの用途に限定されず、広範な用途に供することができる。
[0051] (a)器官洗浄液としての用途
器官洗浄液の用途としては、たとえば、 目の洗浄液（点眼剤を含む）や鼻腔の洗浄 液、その他、皮膚、耳、心臓、肺、腎臓、肝臓、筋肉、膝臓、脳、 口腔、腹腔、脾臓、 胆嚢、虫垂、消化管などの器官の洗浄への適用が挙げられる。
[0052] (a-1)目の洗浄液 (点眼剤を含む）としての用途
目の炎症には、局所で起こる炎症部位での活性酸素の発生とさらに局所に炎症性 細胞を引き寄せ、その引き寄せられた細胞からの発生する活性酸素の発生があり、 その両者により目のかゆみ、眼精疲労などの症状につながり目の組織にダメージを 与える。これらの活性酸素の害を阻止するには、活性酸素を消去する能力と炎症性 細胞を炎症部位へ引き寄せにくくする能力が必要である。本発明の人工生理的塩類 溶液を目の洗浄液として用いることで、活性酸素消去能、炎症性細胞である多形核 白血球、特に好中球の走化活性、遊走活性を抑制する作用を示すため、 目の洗浄、 眼病予防 (水泳の後、埃や汗などが目に入ったとき、コンタクト使用、 VDT作業中な ど）、または目の治療時や手術時に洗浄液として使用した場合、電解還元水の抗炎 症効果により、炎症が抑制され、 目の組織が活性酸素やそれを引き起こす物質によ るダメージを受けに《なる。それにより目の乾き'異物感、 目の疲れ、 目のかゆみ、ま ばたきの増加、充血などの症状を緩和することができる。したがって、本発明の人工 生理的塩類溶液は、ドライアイ、コンタクトレンズ使用、 VDT作業などによる目の乾き -異物感、 目の疲れ、 目のかゆみ、瞬きの増加、充血などの時に発生する活性酸素 による目の組織のダメージを防ぐための、 目の洗浄、眼病予防 (水泳の後、埃や汗な どが目に入ったときなど）、または目の治療時や手術時に使用される目の洗浄液（点 目艮剤を含む）として特に好適に使用することができる。ドライアイの最近の臨床研究で は、 VDT作業者の 31. 2%がドライアイで、 44%がドライアイの疑いがある。近年、 V DT作業者数は増加の一途をたどっており、非常に多くの人がドライアイまたはそれ に近い症状で悩んでいるのが実態である。本発明の人工生理的塩類溶液はライン 化によって製造することが可能であり、再現性よく多量に生産することが可能であるた め、ドライアイまたはそれに近い症状で悩んでいる人々に広く提供することが可能で ある。
[0053] 本発明の人工生理的塩類溶液を目の洗浄液として使用する場合には、たとえば、 目の周りにフィットする形状のふちを備える 5— 20mLのカップに収容し、カップのふ ちを目に当てて目に人工生理的塩類溶液を接触させながら瞬きをすることで、 目の 洗浄を行なうことができる。また本発明の人工生理的塩類溶液は点眼剤の形態でも 使用することができ、この場合は、通常使用される点眼剤用の容器内に収容し、数滴 目に滴下するようにする。点眼剤とする場合、通常点眼剤に配合されるものである防 腐剤を配合せずに、使レ、切りタイプの包装とすることが好ましレ、。
[0054] (a— 2)鼻腔の洗浄液としての用途
また、本発明の人工生理的塩類溶液を鼻腔の洗浄液として適用した場合には、鼻 腔内の埃や雑菌、花粉などを取り除き、鼻腔内の洗浄を好適に行なうことができ、ま た、人工生理的塩類溶液が有する抗酸化作用、抗炎症作用によって、不所望な副 作用が起こることなく花粉症などのアレルギー症状を抑制できる。鼻腔の洗浄液とし て用いる場合には、たとえば本発明の人工生理的塩類溶液を、噴霧手段を備える容 器内に収容し、適宜鼻腔内に噴霧し得るスプレーの形態とすることで、好適に鼻腔の 洗浄を行なうことができる。
[0055] (b)人工輸液、人工羊水または保護液としての用途
本発明の人工生理的塩類溶液を人工輸液、人工羊水または保護液 (たとえば心筋 保護液）として用いた場合には、細胞や組織、器官、胎児が酸化ダメージを受けにく くなり、結果として回復が早くなるという効果を発揮することができる。本発明の人工 生理的塩類溶液を人工輸液として用いる場合、たとえば、人工生理的塩類溶液を公 知の輸液バッグ内に収容した形態にて供することができる。また、輸液投与量を少な くし浮腫を防ぐために、上述した本発明の範囲内の高い浸透圧を有する濃縮液 (たと えば通常の人工生理的塩類溶液の 8倍）の濃度を有する）として人工輸液を実現す るようにしてもよレ、。人工羊水として用いる場合には、出産の現場において早産破水 や羊水過少症の妊婦に、たとえばカテーテルなどを用いて本発明の人工生理的塩 類溶液を経腔的に子宮内に注入し得るよう、適宜の容器に収容された形態にて供す ること力 Sできる。また、本発明の人工生理的塩類溶液を保護液 (たとえば心筋保護液 )として用いる場合には、たとえば、人工生理的塩類溶液を公知の輸液バッグ内に収 容した形態にて供することができる。
[0056] (c)細胞'組織培養液としての用途
本発明の人工生理的塩類溶液を細胞 ·組織培養液として用いた場合には、細胞や 組織が酸化ダメージを受けに《なるという効果を奏する。これによつて、より体内に 近い環境での培養細胞、培養組織を用いた実験系の実現が可能となる。本発明の 人工生理的塩類溶液にて培養し得る細胞としては、初代培養細胞（セルライン化す る前の培養細胞）、継代培養細胞、 ES細胞など、公知の様々な培養細胞を挙げるこ とができる。中でも、本発明の人工生理的塩類溶液を初代培養細胞の培養に用いる と、酸化ダメージの抑制により初代培養細胞の寿命が延びるというような格別の効果 を発揮する。本発明の人工生理的塩類溶液を細胞'組織培養液として用いる場合に は、たとえば予め濃縮されて容器内に収容された形態で供され、用事、適宜の培地 溶液と細胞 ·組織培養に適した所望の割合で混合して用いることができる。
[0057] 本発明の人工生理的塩類溶液は、本発明の効果を阻害しない範囲で、種々のタン パク質を含有していてもよい。力かるタンパク質としては、たとえば、インスリン、トラン スフエリン、スーパーォキシドジスムターゼ（SOD)、チォレドキシン、グルタチオンぺ ルォキシダーゼ、尿中トリプシンインヒビター（UTI)、アルブミン、ァクチビンなどが例 示される。本発明の人工生理的塩類溶液中において、上記タンパク質の含有量は 6 . 0質量％以下であるのが好ましい。タンパク質の含有量が 6. 0質量％を越えると、 適用する器官または細胞に不所望な障害、機能低下が発生する虞があるためである
[0058] 本発明はまた、上述した本発明の人工生理的塩類溶液を製造する方法も提供する 。本発明の人工生理的塩類溶液の製造方法は、電解還元水を、活性水素反応値が 0. 01— 1、 ρίί力 4. 0— 7. 9 (好ましく fま、 6. 0 7. 9)、浸透圧力 260 2560mOs mZL (好ましくは、 260 320m〇sm/L)となるように調整する方法である。 [0059] 本発明の製造方法においては、まず、たとえば電解還元水製造装置 (TI-8000、 日本トリム社製）を用いて電解還元水を得る。電解還元水は、たとえば、原水（電気分 解する前の水）に適宜の電解質を添加した後、電気分解を行なうことで、得ることがで きる。電解還元水の作製に用いる原水としては、超純水（MilliQ水）、純水、蒸留水、 水道水などが挙げられるが、人体や生体細胞への適用を考慮すると、超純水、純水 または蒸留水を原水として用いるのが好ましい。
[0060] 電解質としては、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩化ナトリウム、塩ィ匕 カリウム、へキサクロ口白金酸などが挙げられ、中でも、陽極から発生する次亜塩素酸 の混入を避け、また次亜塩素酸を発生させないために、水酸化ナトリウムおよび/ま たは水酸化カリウムが好ましい。電解質は、原水の電気伝導率が好ましくは 100 μ S /cm以上、より好ましくは 100 1000 x S/cmとなるよう、原水に添加する。かかる 原水の電気伝導率とするための電解質の添加量は、たとえば電解質として水酸化ナ トリウムを用いる場合には、 4一 800mg/Lが例示され、好ましくは 10— 300mg/L 、より好ましくは 50— 200mg/Lである。
[0061] 電気分解は、隔膜を隔てて互いに分離された、陰極を含む陰極室および陽極を含 む陽極室とを有する電解槽を少なくとも備える公知の電解還元水製造装置 (好適に は、 TI-8000 (日本トリム社製））を用いて行なうことができる。電気分解の条件は、特 に制限はなぐ従来公知の適宜の条件にしたがって行なうことができる。たとえば、電 流が 1一 5Α、電圧が 0— 80V、温度が 4一 60°C、時間が 1秒一 1時間、流速が 0— 1 500mL/minである条件が例示される。このような電気分解を終えた後、陰極室に 生成された水を、電解還元水として供することができる。さらに電解還元水を RO (逆 浸透膜)処理してから供することがより好ましレ、。
[0062] 本発明の人工生理的塩類溶液の製造方法では、このようにして得られた電解還元 水を、それぞれ上記範囲の活性水素反応値、 pH、浸透圧となるように調整する。活 性水素反応値はたとえば、所望の活性水素反応値となるように電解還元水を希釈あ るいは濃縮することによって調整することができる。また、 pHは、緩衝剤（たとえば、 炭酸水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、クェン酸、クェン 酸ナトリウム、 HEPESなど）の添加、あるいは塩酸または水酸化ナトリウムの添カ卩によ つて調整することができる。また、浸透圧は、たとえば所望の浸透圧となるように電解 還元水を希釈あるいは濃縮することによって調整することができる。これらの手法を、 相互の影響を考慮しながら適宜組み合わせて、最終的に 0. 01— 1の活性水素反応 値、 4. 0 7. 9 (好ましくは、 6. 0— 7. 9)の pH、 260 2560m〇sm/L (好ましく は、 260 320m〇smZL)の浸透圧となるように、調整を行なう。
[0063] 本発明の人工生理的塩類溶液の製造方法においては、塩化ナトリウムおよび Zま たは塩ィ匕カリウムを添加することによって、電解還元水のイオンバランスを調整するェ 程をさらに含むことが好ましい。具体的には、塩化ナトリウムおよび/または塩化カリ ゥムを添カ卩することによって、電解還元水においてカリウムイオン:ナトリウムイオン = 1 : 4-1 : 8 (モル比）となるように、ナトリウムイオンとカリウムイオンとの含量を調整す る。ここで、ナトリウム、カリウムについてともに塩化物塩を用いるのは、 pHに影響を与 えないからである。
[0064] 力かるイオンバランスの調整の工程は、上述した活性水素反応値、 pHおよび浸透 圧を調整する前に行なっても後に行なってもよいが、浸透圧を調整する際にも用いる イオンであるため、活性水素反応値、 pHおよび浸透圧を調整する前に行なうのが好 ましい。
[0065] 本発明の人工生理的塩類溶液の製造方法における全ての工程は、無菌状態で行 なうか、あるいは、人工生理的塩類溶液の作製後、フィルタの滅菌あるいはオートタレ ーブを用いた滅菌を行なうことが好ましレ、。
[0066] なお、本発明の人工生理的塩類溶液は、上述したように活性水素反応値が 0. 01 一 1、 pH力 S4. 0-7. 9 (好ましく ίま、 6. 0— 7. 9)、浸透圧力 260— 2560mOsm/L (好ましくは、 260— 320mOsm/L)であるならば、上述した本発明の製造方法によ つて製造されたものに制限されるものではなレ、。たとえば、水に白金コロイド、パラジ ゥムコロイド、バナジウムコロイド、鉄コロイド、珪酸コロイド力らなる群より選ばれる水 素吸着 ·吸着金属コロイドを添加した後、水素ガスパブリング、ミネラル溶解、超音波 処理、磁化処理、物理的生得、マイクロ波原子振動、光照射などの方法によって溶 存水素を発生させた後、活性水素反応値、 pH、浸透圧を適宜調整する方法や、リチ ゥムゃナトリウム、マグネシウムを酸性の水に溶解させた後に、活性水素反応値、 pH 、浸透圧を適宜調整する方法によっても、本発明の人工生理的塩類溶液を製造する こと力 Sできる。し力しながら、本発明の人工生理的塩類溶液は、上述した本発明の製 造方法によつて製造されたものであるのが好ましい。
[0067] 以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定され るものではない。
[0068] ぐ実施例 1 >
0. 857mM Na〇H水溶液と 0. 143mM KOH水溶液の混合液（0. 428mLの 2N NaOH水溶液と KOH水溶液の混合液（0. 428mLの 2N Na〇H水溶液と 0. 072mLの 2N KOHを 1リットル MiliQ水に溶かす。）を電解還元水製造装置（TI—8 000、 日本トリム社製）で電気分解した（電流： 5A、温度： 20°C、流速： 1100mL/mi n)。生成された電解還元水に、浸透圧を調整するために 1. 437M NaCl— 238m MKC1水溶液を添加した (混合割合は NaCl - KC1水溶液：電解還元水 = 1： 9)。そ れから IN HC1と 0. IN HC1で pHを 7. 5まで調製した。
[0069] 結果、活性水素反応値 0· 06 (DBNBS法により測定）、 ρΗ7· 5 (pHメータ（ φ 260 、ベックマン社製）を用いて測定）、浸透圧 303mOsm/L (浸透圧計（ォスモメータ、 ROEBLING社製）を用いて測定）の人工生理的塩類溶液が得られた。かかる人工 生理的塩類溶液は、ナトリウムイオンを 145mEq/L、カリウムイオンを 24mEq/L、 塩化物イオンを 170mEq/L含有し（それぞれ ICP— MS (Agilent7500、 Agilent Technologies社製）を用いて測定）、酸化還元電位は一 lOOmV (酸化還元電位計（ RM-20P,東亜電波工業社製）を用いて測定)であった。
[0070] <比較例 1 >
電解還元水に換えて蒸留水を用いた以外は、実施例 1と同様にして、人工生理的 塩類溶液を調製した。得られた人工生理的塩類溶液について実施例 1と同様に測定 したところ、活性水素反応値 0、 pH7. 5、浸透圧 303m〇sm/Lであった。また、実 施例 1と同様に測定されたナトリウムイオンの含量は 145mEq/L、カリウムイオンの 含量は 24mEqZL、塩化物イオンの含量は 170mEq/L、酸化還元電位は + 350 mVであった。
[0071] ぐ比較例 2 > 実施例 1で調製した電解還元水を 5倍濃縮して用いた以外は、実施例 1と同様にし て、人工生理的塩類溶液を調製した。得られた人工生理的塩類溶液について実施 例 1と同様に測定したところ、活性水素反応値 1. 8、 pH7. 6、浸透圧 303m〇sm/ であった。また、実施例 1と同様に測定されたナトリウムイオンの含量は 145mEq/ L、カリウムイオンの含量は 24mEqZL、塩化物イオンの含量は l80mEq/L、酸化 還元電位は _150mVであった。
[0072] ぐ比較例 3 >
実施例 1で調製した電解還元水に IN HC1を添加して pHを 5. 5に調製した以外 は、実施例 1と同様にして、人工生理的塩類溶液を調製した。得られた人工生理的 塩類溶液について実施例 1と同様に測定したところ、活性水素反応値 0. 06、 pH5. 5、浸透圧 303mOsm/Lであった。また、実施例 1と同様に測定されたナトリウムィ オンの含量は 145mEqZL、カリウムイオンの含量は 24mEq/L、塩化物イオンの 含量は 200mEq/L、酸化還元電位は _50mVであった。
[0073] <比較例 4 >
実施例 1で調製した電解還元水に IN HC1を添加して pHを 8. 5に調製した以外 は、実施例 1と同様にして、人工生理的塩類溶液を調製した。得られた人工生理的 塩類溶液について実施例 1と同様に測定したところ、活性水素反応値 0. 06、 pH8. 5、浸透圧 304mOsm/Lであった。また、実施例 1と同様に測定されたナトリウムィ オンの含量は 145mEq/L、カリウムイオンの含量は 24mEq/L、塩化物イオンの 含量は 180mEq/L、酸化還元電位は- lOOmVであった。
[0074] <比較例 5 >
浸透圧の調整の際、 1. 437M NaCl-238mM KC1水溶液を電解還元水と混合 させた（混合割合は NaCl - KC1水溶液：電解還元水 =0. 8 : 9. 2)以外は、実施例 1 と同様にして、人工生理的塩類溶液を調製した。得られた人工生理的塩類溶液につ レ、て実施例 1と同様に測定したところ、活性水素反応値 0. 06、 pH7. 5、浸透圧 240 m〇smZLであった。また、実施例 1と同様に測定されたナトリウムイオンの含量は 11 5mEqZL、カリウムイオンの含量は 19mEq/L、塩化物イオンの含量は 135mEq /L、酸化還元電位は— 50mVであった。 [0075] <比較例 6 >
浸透圧の調整の際、 1. 437M NaCl-238mM KC1水溶液を電解還元水と混合 させた（混合割合は NaCl - KC1水溶液：電解還元水 = 1. 2 : 8. 8)以外は、実施例 1 と同様にして、人工生理的塩類溶液を調製した。得られた人工生理的塩類溶液につ レ、て実施例 1と同様に測定したところ、活性水素反応値 0. 06、 pH7. 5、浸透圧 360 m〇smZLであった。また、実施例 1と同様に測定されたナトリウムイオンの含量は 17 5mEqZL、カリウムイオンの含量は 30mEq/L、塩化物イオンの含量は 205mEq /L、酸化還元電位は— 50mVであった。
[0076] <評価試験 1 >
活性酸素消去能の評価試験
実施例 1、比較例 1一 6の人工生理的塩類溶液について、過酸化水素法を用いて 過酸化水素に由来するルミノール発光によって、活性酸素測定値 (cpm)を算出した 。結果を表 1に示す。
[0077] [表 1]
窗簿 SU?¾0782 <>
実施例 1 比較例 1 比較例 2 比較例 3 比較例 4 比較例 5 比較例 6 活性水素反応値 0.06 0 1.8 0.06 0.06 0.06 0.06
7.5 7.5 7.6 5.5 8.5 7.5 7.5 浸透圧 (mOsm/L) 303 303 303 303 304 240 360
Na+(mEq/し） 145 145 145 145 145 115 175
K+(mEq/L) 24 24 24 24 24 19 20
CrCmEq/L) 170 170 180 200 180 135 205 酸化還元電位 (mV) -100 +350 -150 - 50 -100 -50 -50 評価試験 1 597979 1917063 683433 61 453 625025 619432 634282
(活性酸素測定値 (cpm)) ±34903 ±59565 ±22323 ±32239 ±89892 ±23898 ±45292 評価試験 2
95±21 180±23 135±15 ― - -
(遊走細胞数（IL-8が 100ng/mlの時）
評価試験 2(生存率 (%)) 98 98 97 60 49 47 39 評価試験 3 (目の洗浄液の使用感） 良 良/可 良/可 不可 不可 不可 不可 評価試験 4 (TBA SCnmol/ml) ) 2.7 ±0.5 4.6+0.5 2-3±0.4 3.1 ±0.4 - - - 評価試験 5 (24時間培養後の生存率 (%)) 78 41 80 10 2 0 0
図 1は、本発明に係る人工生理的塩類溶液がケモカインによるヒト好中球の遊走能
•走化能を抑制するかを明らかにすることを目的としてなされた実験の結果である。実 験方法としては、炎症性細胞の遊走活性'走化活性を測定できるケモタキシスチャン バ法を用いた。まず、実施例 1の人工生理的塩類溶液について、ヒト血液より分離さ れた好中球をその液中に浮遊させ一定時間処理する。ケモカイン（IL一 8、 RANTE Sなど）の溶液をチャンバのゥヱルに入れ、その上に膜を載せた。当該膜には好中球 の大きさよりわず力 vj、さめの穴が規則的に設けられている。チャンバを組み立てた後 、その膜の上のゥエルに好中球の浮遊液を添加し、一定時間遊走'走化させる。その 後、膜の穴を通って遊走 ·走化してきた細胞を特殊な染色液（Diff— QuiK)で染色し カウントした。得られた遊走細胞数（IL一 8が 1 OOngZmlの場合）を表 1に示す。
[0079] 図 1および表 1から明らかなように実施例 1の本発明の人工生理的塩類溶液で処理 した好中球の遊走 ·走化した細胞数は、コントロール (蒸留水で作成した洗浄水）に 比べおよそ半分であり、本発明の人工生理的塩類溶液は好中球の遊走'走化活性 を抑制することがわかる。また、比較例 1一 6についても上記と同様の実験を行なった 結果、比較例 1ではコントロールと同じで抑制活性が認められなかった。比較例 2に ぉレヽては抑制活性はあつたものの、実施例に比較して約半分であつた。比較例 3— 6 においては細胞の生存率が半分以下となり測定不能であった。
[0080] また上記試験と同時に、生細胞測定法により、人工生理的塩類溶液の好中球への 影響も確認した。生細胞測定法は、具体的には、トリパン一ブルーテストを用いた。生 細胞はトリパンブルー（青色色素）を細胞外へ排除するため細胞が染色されないが、 死細胞は排除できず細胞が染色される。トリパン -ブルーテストは、位相差顕微鏡で 染色された細胞数と染色されなかった細胞数を計測し、生存率 (染色されなかった細 胞数 ÷ (染色された細胞数 +染色されなかった細胞数） X 100) (%)を算出する方 法である。結果を表 1に示す。表 1に示すように、実施例 1の本発明の人工生理的塩 類溶液により好中球は全く障害を受けていないことが確認された。一方、比較例 3— 6の場合には、生存率が半分以下になった。よって、そのような状態の細胞を遊走試 験に用いることは適切ではないことが判った。
[0081] <評価試験 3 > 目の洗浄液として使用した場合の使用感の評価
実施例 1の人工生理的塩類溶液を用いて、自分の目で目洗浄を試したところ、これ といった不快な刺激もなぐ洗浄後、液に埃がきちんととれていた。また、 10人の協力 者に同様にして目の洗浄を試して、以下の 3段階で評価をしてもらった。
良：目に不快な刺激もなぐ 目の洗浄を行なえる
可：目の洗浄液を行なえるが目に不快な刺激がある、あるいは目に不快な刺激は なレ、が目の洗浄が行なえてレ、なレ、
不可：目に不快な刺激があり、 目の洗浄も行なえていない
[0082] 結果を表 1に示す。表 1に示すように、いずれの人からも目に不快な刺激がなぐ 目 の洗浄を行なうことができた旨の評価が得られた。このことにより、本発明の人工生理 的塩類溶液に目の洗浄効果があることがわかる。一方、比較例 1、 2においては良と 可の評価が半々であり、人によりバラツキが認められた。比較例 3 6に関しては、全 て不可の評価であり、 目に不快な刺激があった。
[0083] <評価試験 4 >
人工輸液としての評価
電解還元水で作製した人工生理的塩類溶液（実施例 1 )を、 FNA (ferric nitrilot riacetic acid ;鉄ニトロ三酢酸）を用いて酸化的ストレスを与えたラットに輸液として 静脈内に継続投与し、酸化ストレスに対する改善効果を評価した。酸化ストレスの指 標として TBARS (thiobarbituric acid-reactive substances；チオノくルビツー ル酸反応）を用いた。これは不飽和脂肪酸の過酸化反応で生成した過酸化脂質の 分解反応、糖類の分解反応、核酸塩基の分解反応によって生じるマロンジアルデヒ ドまたはアルキルアルデヒドをチォバルビツール酸と反応させて生じた赤色の物質を 測定するものである。
[0084] まず、 6週齢の SD系雄性ラットを 4群（（l) FNAで 0時間処理、（2) FNAで 6時間 処理'実施例 1の人工生理的塩類溶液投与、（3) FNAで 6時間処理'比較例 1の人 ェ生理的塩類溶液投与、（4) FNAで 6時間処理 ·比較例 2の人工生理的塩類溶液 投与）に分けて実施した。採血 3日前に各ラットの外到静脈に人工生理的塩類溶液 持続投与用力ニューレを留置した。力ニューレは留置後、閉塞を防ぐため毎日 500u /mlのへパリン含有生理食塩水で洗浄した。
[0085] FNAは 10mg Fe/kgとなるように腹腔内投与した。その直後、シリンジポンプ M ODEL11 (ハーバード社製）を用い実施例 1、比較例 1および比較例 2の人工生理 的塩類溶液を、それぞれの群のラットに力ニューレを介して 0. 05ml/minの流速に て 1時間持続投与した。 FNAの腹腔内投与 6時間後、エーテル麻酔下に開腹して腹 部大動脈から全採血した。血漿は TBARSの測定まで- 80°Cに凍結保存した。ラット 血漿中の TBARS量は、 TBARSアツセィキット OXLtec (ZeptoMetrix社製）を用 レ、、そのプロトコールに従って測定した。結果を表 1に示す。
[0086] 結果、 FNAで 0時間処理した場合の TBARS値が 1. 5 ± 0. 3nmolZmlであるの 力 比較例 1では FNA6時間処理により 4. 6 ± 0. 5nmolZmlと 3. 1倍に上昇して レ、るのに対して、実施例 1では 2. 7 ± 0, 5nmol/lと 1. 8倍の上昇に留まった。これ は FNAによる酸化ストレスを 42%軽減したことになる。比較例 2では、電解還元水を 濃縮した割合ほど効果は大きくなかった力 2. 3 ± 0. 4nmolと 1. 5倍の上昇に留ま つた。これは FNAによる酸化ストレスを 52%軽減したことになる。なお、比較例 4一 6 については上述した評価試験 2で細胞毒性がみられたことから評価試験は行わなか つに。
[0087] <評価試験 5 >
細胞 ·組織培養液としての効果
ヒト血液より分離された好中球を本発明の人工生理的塩類溶液中で初代培養し、 生存率が向上するか否かを評価した。評価は、ヒト血液より分離された好中球を実施 例 1、比較例 1一 6の人工生理的塩類溶液中に懸濁し、 5ml培養用シャーレに播種し 、 37°C5%炭酸ガスインキュベータにて 24時間初代培養し、生存率をトリパンブルー テストにより算出した。結果を表 1に示す。
[0088] 培養開始時は、生存率が 98%であったのに対し、表 1から分かるように、比較例 1 の 24時間培養後の生存率は 41 %と低下していた。一方、実施例 1においては生存 率が低下しているものの 78%と高値を示した。このことは生存率の悪い初代細胞の 培養において、実施例 1の人工生理的塩類溶液が生存率の改善に寄与していること を表している。また比較例 2においては、電解還元水を濃縮した割合ほど生存率向 上には寄与しなかったが 80%と高い生存率を維持していた。また、その他の生存率 に関しては、比較例 3が 10%、比較例 4が 2%、比較例 5が 0%、比較例 6が 0%であ つに。

Claims

請求の範囲
[I] 活性水素反応値が 0. 01— 1、 pHが 4. 0-7. 9、浸透圧が 260 2560m〇sm/ Lである人工生理的塩類溶液。
[2] pHが 6. 0-7. 9、浸透圧が 260 320m〇sm/Lである、請求項 1に記載の人工 生理的塩類溶液。
[3] ナトリウムイオン、カリウムイオンおよび塩ィ匕物イオンを含むことを特徴とする請求項
2に記載の人工生理的塩類溶液。
[4] ナトリウムイオンを 200mEq/L以下含むことを特徴とする請求項 3に記載の人工 生理的塩類溶液。
[5] カリウムイオンを 100mEq/L以下含むことを特徴とする請求項 3に記載の人工生 理的塩類溶液。
[6] 塩化物イオンを 200mEq/L以下含むことを特徴とする請求項 3に記載の人工生 理的塩類溶液。
[7] 電解還元水にイオンバランスの調整を施したものである、請求項 2に記載の人工生 理的塩類溶液。
[8] 酸化還元電位カ 800— + 200mVであることを特徴とする請求項 2に記載の人工 生理的塩類溶液。
[9] 器官洗浄液として用いられる、請求項 2に記載の人工生理的塩類溶液。
[10] 人工輸液、人工羊水または保護液として用いられる、請求項 2に記載の人工生理 的塩類溶液。
[II] 細胞'組織培養液として用いられる、請求項 2に記載の人工生理的塩類溶液。
[12] 人工輸液、人工羊水または保護液として用いられる、請求項 1に記載の人工生理 的塩類溶液。
[13] 電解還元水を、活性水素反応値が 0. 01— 1、 pHが 4. 0-7. 9、浸透圧が 260 2560mOsm/Lとなるように調整することを特徴とする人工生理的塩類溶液の製造 方法。
[14] pHが 6. 0-7. 9、浸透圧が 260— 320m〇sm/Lとなるように調整することを特徴 とする請求項 13に記載の人工生理的塩類溶液の製造方法。 塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウムを添加することによって、電解還元水の イオンバランスを調整する工程をさらに含むことを特徴とする請求項 14に記載の人工 生理的塩類溶液の製造方法。
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