WO2005080575A1 - ヒトｃ型肝炎ウイルスの全長ゲノムを含む核酸構築物及び該核酸構築物を導入した組換え全長ウイルスゲノム複製細胞、並びにｃ型肝炎ウイルス粒子の作製方法 - Google Patents

ヒトｃ型肝炎ウイルスの全長ゲノムを含む核酸構築物及び該核酸構築物を導入した組換え全長ウイルスゲノム複製細胞、並びにｃ型肝炎ウイルス粒子の作製方法 Download PDF

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Takanobu Kato
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Jun-Ichi Tanabe
Saburo Sone
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    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • a nucleic acid construct comprising the full-length genome of human hepatitis C virus, a recombinant full-length virus genome replicating cell into which the nucleic acid construct has been introduced, and a method for producing hepatitis c virus particles
  • the present invention relates to a nucleic acid construct comprising the full-length genome of hepatitis C virus, a method for producing hepatitis C virus particles in vitro, and use of the produced hepatitis C virus particles.
  • Hepatitis C virus is a virus that belongs to the Flaviviridae family and has a single-stranded (+) sense RNA genome, and is known to cause hepatitis C .
  • HCV causes chronic hepatitis by persistent infection.
  • HCV persistent infection is the main cause of chronic hepatitis recognized worldwide.
  • about 50% of those with persistent infection develop chronic hepatitis, of which about 20% transition to cirrhosis after 10 to 20 years, and some of them are fatal, such as liver cancer.
  • Progress to disease state is the main cause of chronic hepatitis recognized worldwide.
  • about 50% of those with persistent infection develop chronic hepatitis, of which about 20% transition to cirrhosis after 10 to 20 years, and some of them are fatal, such as liver cancer. Progress to disease state.
  • the current main treatment for hepatitis C is interferon 1 ⁇ , interferon 1 ⁇ ⁇ and interferon 1 ⁇ combined with purine nucleoside derivative ribavirin.
  • interferon 1 ⁇ interferon 1 ⁇
  • interferon 1 ⁇ interferon 1 ⁇
  • interferon 1 ⁇ interferon 1 ⁇
  • purine nucleoside derivative ribavirin purine nucleoside derivative
  • HCV subgenomic RNA levels have been identified as RNA with autonomous replication ability derived from HCV.
  • Precon systems were produced (Patent Documents 1, 2 and 3, Non-Patent Documents 1 to 4).
  • the HCV subgenomic RNA replicon system creates an HCV replicon RNA in which the structural gene of the HCV genome is removed and a selective drug marker gene is inserted instead, and the replicon RNA is introduced into cultured cells, and the replicon RNA is then introduced into the cell.
  • This is a system that replicates autonomously. This made it possible to analyze the replication mechanism of HCV using cultured cells.
  • This is an experimental system that can evaluate only viral RNA replication in the process of HCV virus replication.
  • Non-patent Document 5 an experimental system using an animal body as it is is complicated and extremely difficult to analyze. Therefore, analyze the process of formation and release of HCV virus particles inside infected cells, and infection of new cells, and create anti-HCV drugs with the inhibition of these processes as the mechanism of action. To do so, it is necessary to construct a very simplified experimental system that can reproduce these processes, that is, a system for producing HCV virus particles in a culture experimental system.
  • viruses can be attenuated or non-infectious HCV viruses can be produced using molecular biological techniques. It can be used for vaccines.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2 0 0 1— 1 7 1 8 7
  • Patent Document 2 International Application P C T No J P 0 3 Z 1 5 0 3 8
  • Patent Document 3 Patent Application 2 0 0 3— 3 2 9 0 8 2
  • Non-patent literature 1 Lohmann et al., Science, (1999) 285, p. 110-113
  • Non-patent literature 4 Ikeda et al., J. Virol., (2002) 76 (6): p. 2997-3006
  • Non-patent literature 5 Kolykhalov et al., Science, (1997) 277, p. 570-574
  • Non-Patent Document 6 Kato et al., Gastroenterology, (2003) 125, p. 1808-1817
  • Non-Patent Document 7 Yanagi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1997) 96 (16): p. 8738-8743
  • Non-patent literature 8 Okamoto et al., J. Gen. Virol., (1991) 73, p 2697-26704
  • Non-patent literature 9 Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., (1999) 37 (6): p Disclosure of the invention
  • the present invention provides a method for efficiently replicating RNA containing an HCV full-length genomic sequence, which has not been successful so far, and a method for producing HCV viral particles containing full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA using a cell culture system,
  • the purpose is to provide.
  • the present inventors have developed a method for producing HCV virus particles in a cell culture system. That is, the present invention is as follows. .
  • NS4B protein coding sequence NS5A protein coding sequence, NS5B protein coding sequence, and 3 'untranslated region, at least one selectable marker gene and at least one reporter gene, and at least one IRES sequence.
  • Replicon RNA consisting of a base sequence containing
  • the base sequence includes the 5 ′ non-translated region, at least one selectable marker gene and / or at least one reporter gene, at least one IRES sequence, and core protein. Coding sequence, E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence, NS2 protein coding sequence, NS3 protein coding sequence, NS4A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence,
  • NS5A protein coding sequence NS5B protein coding sequence, and 3 'untranslated region
  • the genomic RNA of genotype 2a hepatitis C virus is an RNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the 5 ′ untranslated region consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • the core protein coding sequence consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • the E1 protein coding sequence consists of SEQ ID NO: 3
  • the E2 protein coding sequence consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • the NS2 protein coding sequence consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5
  • the NS3 protein coding sequence shows in SEQ ID NO: 6.
  • NS4A protein coding sequence consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7
  • NS4B protein coding sequence consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8
  • NS5A protein coding sequence consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • NS5B protein coding sequence consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, and the 3 'untranslated region is the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 It made.
  • a replicon RNA comprising the following RNA (a) or (b):
  • a method for producing a cell that replicates the replicon RNA and produces virus particles comprising introducing the replicon RNA according to any one of [1] or [2] above into the cell.
  • the cells are preferably proliferating cells.
  • the cells in this method are preferably eukaryotic cells.
  • the eukaryotic cell is a human liver-derived cell, a human cervix-derived cell, or a human fetal kidney-derived cell. More preferably, the eukaryotic cell is a Huh7 cell, HepG2 cell, IMY-N9 cell, HeLa cell, or 293 cell.
  • [5] A method for producing hepatitis C virus particles, comprising culturing the cells according to [4] above to produce virus particles.
  • [7] A method for producing a hepatitis C virus-infected cell, comprising culturing the cell according to [4] above, and infecting the virus particle in the culture with another cell. [8] A hepatitis C virus-infected cell produced by the method according to [7] above.
  • a hepatitis C vaccine comprising the hepatitis C virus particle or a part thereof according to [6] above.
  • [11] A method for producing hepatitis C vaccination using the hepatitis C virus particle or a part thereof according to [6] above as an antigen.
  • [12] A method for producing a hepatocyte-directed viral vector for gene therapy using the levicon of any one of [1] or [2] above; NA.
  • a method for producing a cell that replicates the RNA and produces virus particles comprising introducing into the cell an RNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • a method for producing C-type J3 sweat inflammation virus particles comprising introducing RNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 into cells, and culturing the cells to produce virus particles.
  • a foreign gene comprising inserting RNA encoding a foreign gene into RNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 and introducing it into a cell and culturing the cell to produce virus particles.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the construction procedure of a saddle-shaped DNA for producing the full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA of the present invention.
  • the upper part of Fig. 1 shows the structure of plasmid clone pjrai prepared by inserting the full-length HCV genome downstream of the T7 promoter.
  • the lower part of Fig. 1 shows the structure of plasmid clone pFGREP-JFH1, which contains the full-length HCV genomic sequence inserted with a DNA fragment containing neomycin resistance gene and EMCV IRES downstream of pJFHl T7 promoter and translation region.
  • the symbols in the figure are as follows.
  • T7 T7 RNA promoter, 5, UTR: 5 'translation region, C: Core protein, E1, E2: Envelope protein.
  • Age I, Pme I, Xba I Cleavage sites for restriction enzymes Age I, Pme I and Xba I.
  • GDD NS5B protein activity The amino acid motif corresponding to the central position of GDD.
  • n e o Neomycin resistance gene
  • EMCV I RES EMCV IRES (internal ribosome binding site of encephalomyocarditis virus).
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of Northern plot analysis showing replication of rJFH-1 in Huh7 cells into which rJFH-1, a full-length HCV genome RM, was introduced.
  • Figure 3 shows the results of quantification of HCV core protein in the medium. Open circles indicate cells transfected with rJFHl, and black circles indicate cells introduced with rJFHl / GND.
  • Figure 4 is a graph showing the HCV core protein amount, full-length HCV genomic RNA amount, and specific gravity of each fraction obtained by fractionating the culture supernatant of Huh7 cells into which rJFH-1 had been introduced using a sucrose density gradient. is there. Black circles indicate HCV core protein, open circles indicate full-length HCV genomic RNA, and shaded circles indicate specific gravity.
  • FIG. 5 is a photograph showing colony formation of Huh7 cells transfected with rFGREP-JFH1, a full-length HCV replicon RNA.
  • FIG. 6 is a photograph showing full-length HCV replicon RNA replication in a full-length HCV replicon RNA replicating cell clone established by transfection of rFGREP-JFH1 into Huh7 cells.
  • Figure 7 confirms the presence or absence of the neomycin resistance gene in the genomic DNA. This is a photograph showing the results of PCR amplification using a neomycin-resistant gene-specific primer with the host cell genomic DNA as a cocoon type. M: DNA size marker, P: positive control, N: Huh7 cells.
  • FIG. 8 is a photograph showing the results of Western plot analysis showing the expression of core protein in Huh7 cells into which rFGREP-JFH1, a full-length HCV replicon RNA, has been introduced.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of Western blot analysis showing the expression of NS3 protein in Huh7 cells into which rFGREP-JFH1, a full-length HCV replicon RNA, has been introduced.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of Western blot analysis showing the expression of NS5A protein in Huh7 cells into which rFGREP-JFHl, a full-length HCV replicon RNA, has been introduced.
  • Figure 11 shows the amount of HCV core protein, the total length of HCV replicon RNA, and the specific gravity of each fraction obtained by fractionating the culture supernatant of Huh7 cells into which rFGREP-JFH1 was introduced using a sucrose density gradient. It is a graph to show. Black circles represent HCV core protein, open circles represent full-length HCV replicon RNA, and shaded circles represent specific gravity.
  • Fig. 12 is a photograph showing the formation of phlegm of Huh7 cells to which virus particles contained in the culture supernatant of full-length HCV replicon RNA replicating cells were added.
  • the genome of hepatitis C virus is a (+) single-stranded RNA consisting of about 9600 nucleotides.
  • This genomic RNA consists of 5, untranslated region (also referred to as 5 'NTR or 5' UTR), translated region composed of structural region and non-structural region, and 3 'untranslated region (3' NTR or 3 ' 'Also expressed as UTR).
  • the structural region encodes the structural protein of HCV, and the nonstructural region encodes multiple nonstructural proteins.
  • NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, and NS5B are released from the translation region after being translated as a stretch of protein and then subject to limited degradation by proteases. It is.
  • core is the core protein and E1 and E2 are envelope proteins.
  • Nonstructural proteins are proteins involved in the virus's own replication.
  • NS2 is a meta-oral protease activity
  • NS3 is a serine protease activity (1/3 of the N-terminal side) and a helicase activity (3 minutes of the C-terminal side). 2).
  • NS4A is a cofactor for the protease activity of NS3.
  • NS5B has also been reported to have RNA-dependent RNA polymerase activity.
  • the present inventors constructed a replicon RNA that can replicate autonomously and has the ability to produce virus particles using HCV genomic RNA.
  • RNA having autonomous replication ability and produced by modifying HCV genomic RNA is referred to as “replicon RNA” or “RNA replicon”.
  • HCV-derived replicon RNA is also referred to as HCV-RNA replicon.
  • the replicon RNA of the present invention containing the full length of HCV genomic RNA is referred to as “full length HCV replicon RNA”.
  • the full length HCV replicon RNA of the present invention has the ability to produce virus particles.
  • hepatitis C virus in a preferred embodiment of the full length HCV replicon RNA of the present invention, hepatitis C virus, but it is not limited to, the it is preferred c present invention is a hepatitis C virus genotype 2a, the "genotype 2a "Hepatitis C virus”"HCV of genotype 2a” is identified as genotype 2a according to the international classification by Simmonds et al. (See Simmonds, P. et al, Hepatology, (1994) 10, p. 1321-1324) Means hepatitis C virus.
  • “genotype 2a hepatitis C virus” and “genotype 2a HCV” include not only viruses having naturally-derived HCV genomic RNA, but also artificially modified naturally-occurring HCV genomic sequences. Also included are viruses with genomic RNA.
  • a specific example of HCV of genotype 2a is JFH-1 strain (see Japanese Patent Laid-Open No. 2000-170-178).
  • hepatitis C virus genomic RNA means an RNA having a base sequence extending over the entire length of the hepatitis C virus single-stranded (+) strand sense RNA. Without limitation, the genome of genotype 2a hepatitis C virus
  • RNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 is preferable.
  • HCV replicon RNA is a hepatitis C virus On genomic RNA, 5, untranslated region, core protein coding sequence, E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence, NS2 protein coding sequence, NS3 protein coding sequence, NS4A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence
  • a replicon RNA comprising a nucleotide sequence comprising: NS5A protein coding sequence; NS5B protein coding sequence; and a 3 ′ untranslated region; at least one selectable marker gene or reporter gene; and at least one IRES sequence. It is.
  • the full length HCV replicon RNA of the present invention comprises 5, untranslated region, at least one selectable marker gene or reporter gene, at least one IRES sequence, core protein coding
  • NS4A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, NS5B protein coding sequence, and 3 'untranslated region Include in this order from 5 'to 3'.
  • 5 ′ untranslated region (5 ′ NTR or 5 ′ UTR)
  • core protein coding sequence core region or C region
  • E1 protein coding sequence E1 region
  • E2 protein coding sequence (E2 region) "N2 protein coding sequence (NS2 region)”, “NS3 protein coding sequence (NS3 region)”, “NS4A protein coding sequence IJ (NS4A region)”, “NS4B protein Coding sequence (NS4B region), NS5A protein coding sequence (NS5A region), NS5B protein coding sequence (NS5B region), and 3 'untranslated region (3' NTR or 3 'UTR)
  • the other specific region or site is the JFH-1 strain, which is genotype 2a hepatitis C virus (Japanese Patent Laid-Open No.
  • the full-length genomic RNA (SEQ ID NO: 12) consisting of the entire genomic region of No. 9 78) can be determined as a standard.
  • the partial region or site in the hepatitis C virus (HCV) genome in the present invention is represented by SEQ ID NO: 1-11, which is a partial base sequence of the genomic RNA of JFH-1 strain (SEQ ID NO: 12) It can also be defined on the basis of the arrangement.
  • the “5 'untranslated region” of JFH 1 full-length genomic RNA (derived from JFH-1 clone) (SEQ ID NO: 12) is SEQ ID NO:
  • the “core protein coding sequence” consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • “E1 protein coding sequence” is a salt shown in SEQ ID NO: 3. Consists of base sequence.
  • the “E2 protein coding sequence” consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • “NS2 protein coding sequence”. ′ Consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the “NS3 protein coding sequence” consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the “NS4A protein coding sequence” consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the “NS4B protein coding sequence” consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • NS5A protein code sequence consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • NS5B protein coding sequence IJ consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • the “3 ′ untranslated region” consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the region or site in the RNA sequence derived from HCV is aligned with the nucleotide sequence shown in sequence numbers 1 to 12 of the RNA sequence, and the base number in the sequence of SEQ ID NOs: 1 to 12 is used. It may be set as a standard. In such an alignment, gaps, additions, deletions, substitutions, etc. may exist between the sequences.
  • the coding sequence, NS4A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, NS5B protein coding sequence, and 3 ′ untranslated region each have the nucleotide sequence shown in self-sequence number 1-1 1 Is preferred.
  • a preferred embodiment of the full-length HCV replicon RNA according to the present invention includes a nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1-11, at least one selectable marker gene and Z or reporter gene, and at least one IRES sequence, It is a replicon RNA consisting of
  • the “selection marker gene” means a gene capable of imparting selectivity to a cell such that only the cell in which the gene is expressed is selected.
  • a common example of a selectable marker gene is an antibiotic resistance gene.
  • selectable marker genes suitable for the present invention include neomycin resistance gene, thymidine kinase gene, kanamycin resistance gene, pyrithiamine resistance gene, adenylyltransferase gene, zeocin resistance gene, and puromycin resistance gene.
  • the neomycin resistance gene and the thymidine kinase gene are preferable, and the neomycin resistance gene is more preferable.
  • the selection marker gene is not limited to these.
  • the “reporter gene” is an index of gene expression. It means a marker gene encoding a gene product.
  • reporter genes include structural genes of enzymes that catalyze luminescence and color reactions.
  • reporter genes suitable in the present invention include chloramphenicol acetyltransferase gene derived from transposon Tn9, ⁇ -glucuronidase or galactosidase gene derived from E. coli, luciferase gene, green fluorescent protein gene, equolin gene derived from jellyfish, Examples include secreted placental alkaline phosphatase (SEAP) gene.
  • SEAP secreted placental alkaline phosphatase
  • the reporter gene in the present invention is not limited to these.
  • the selection marker gene and the reporter gene described above may contain either one or both in the full length HCV replicon RNA.
  • One selection marker gene or reporter gene may be included in the full-length HCV replicon RNA, or may be included in two or more.
  • the “IRES sequence” in the present invention means an internal ribosome binding site capable of binding a ribosome inside RNA to initiate translation.
  • IRES sequences in the present invention include, but are not limited to, EMCV IRES (internal ribosome binding site of encephalomyocarditis virus), FMDV IRES, HCV IRES, etc.
  • HCV IRES are more preferred, and EMCV IRES is most preferred.
  • One more preferred embodiment of the full-length HCV replicon RNA according to the present invention is RNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • 1 to 100 preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, most preferably 1 to RNA having a nucleotide sequence in which several (2 to 5) base groups are deleted, substituted or added, and having autonomous replication ability and virus particle production ability are also suitable embodiments.
  • Overall length of the present invention preferably 1 to 100, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, most preferably 1 to RNA having a nucleotide sequence in which several (2 to 5) base groups are deleted, substituted or added, and having autonomous replication ability and virus particle production ability are also suitable embodiments.
  • HCV replicon RNA Included within the scope of HCV replicon RNA.
  • the full-length HCV replicon RNA according to the present invention may further contain RNA encoding any foreign gene to be expressed in the cell into which the full-length HCV replicon RNA is introduced.
  • RNA encoding a foreign gene may be ligated downstream of the 5 'untranslated region or selected It may be linked upstream or downstream of the marker gene or reporter gene
  • core protein coding sequence E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence, NS2 protein coding sequence [J, NS3 protein coding sequence, NS4A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, and NS5B protein Any of the coding sequences may be inserted.
  • the full-length HCV replicon RNA containing RNA encoding a foreign gene can express the gene product encoded by the foreign gene when translated in the introduced cell. Therefore, the full-length HCV replicon RNAf containing RNA encoding a foreign gene can also be suitably used for the purpose of generating a gene product of an exogenous gene in a cell.
  • the full-length HCV replicon RNA according to the present invention may contain a liposome.
  • a ribozyme is linked downstream of the selectable marker gene and Z or reporter gene in the full-length HCV replicon RNA, and the selection marker gene and / or reporter gene is converted into an IRES sequence, core protein code by the self-cleaving activity of the ribozyme.
  • the selection marker gene and / or reporter gene as described above, a sequence encoding a viral protein, and a foreign gene or ribozyme are translated from the full-length HCV replicon RNA in the correct reading frame. Are connected to each other. Proteins encoded by the full-length HCV replicon RNA are translated and expressed as a stretch of polypeptide, then cleaved into proteases by the protease and released from each other via protease cleavage sites, etc. It is preferable to connect.
  • the present invention also relates to a DNA vector, preferably an expression vector, encoding the replicon RNA of the present invention.
  • RNA has “autonomous replication ability” means that RNA is introduced into cells. When it does, it means that the RNA is self-propagating.
  • the autonomous replication ability of RNA includes, for example, RNAJ extracted from cells in the resulting culture by transfecting the target RNA into Huh7 cells, culturing the Huh7 cells, and This can be confirmed by detecting RNA by Northern blot high-precipitation using a probe that can specifically detect the introduced RNA. Examples are described in the description of measurement of colony forming ability, confirmation of expression of HCV protein, and detection of replicon RNA described in Examples of the specification.
  • “having the ability to produce viral particles” means that when the RNA is introduced into a cell (for example, a cultured cell such as a Huh7 cell), viral particles are produced in the cell.
  • a cell for example, a cultured cell such as a Huh7 cell
  • the ability to produce virus particles can be determined by, for example, detecting a culture supernatant of a cell into which the target RNA has been introduced by RT-PCR using primers specific to the RNA, or The virus particles can be separated by applying a sugar concentration gradient and confirmed by a method of detecting HCV protein.
  • full-length HCV replicon RNA can be prepared using any genetic engineering technique known to those skilled in the art. Although not limited thereto, full-length HCV replicon RNA can be prepared by the following method when, for example, JFH-1 strain is used as the genotype 2a hepatitis C virus.
  • DNA corresponding to the RNA (SEQ ID NO: 12) of the entire genome of JFH-1 strain (this sequence is registered as an accession number AB047639 in the International DNA Data Bank) is re-established by a conventional method.
  • “DNA corresponding to RNA” means DNA having a base sequence in which uracil in the base sequence of the RNA is replaced with T (thymine).
  • the RNA promoter motor is preferably contained in a plasmid clone.
  • Good Suitable RNA promoters include, but are not limited to, T7 RNA promoter, SP6 RNA promoter, SP3 RNA promoter, with T7 RNA promoter being particularly preferred.
  • a DNA that codes for the selectable marker gene and the Z or reporter gene and the IRES sequence is inserted into the DNA clone. It is preferable to insert a selection marker and a Z or reporter gene downstream of the 5 ′ untranslated region and an IRES sequence downstream thereof.
  • RNA is synthesized by RNA polymerase using the DNA clone prepared as described above as a cage. RNA synthesis can be initiated from the 5 'untranslated region by conventional methods.
  • the DNA clone is a plasmid clone
  • RNA can be synthesized using a DNA fragment excised from the plasmid clone by a restriction enzyme as a cage. It is preferable that the 3 ′ end of the synthesized RNA coincides with the end of the 3 ′ untranslated region of the viral genomic RNA, and no other sequence is added or deleted.
  • the RNA synthesized in this way is the full-length HCV replicon RNA according to the present invention. ⁇
  • the full-length HCV replicon RNA By introducing the full-length HCV replicon RNA produced as described above into a cell, the full-length HCV replicon RNA can be replicated, and preferably can be replicated continuously (ie, replication of revlikon RNA). Recombinant cells can be obtained.
  • a recombinant cell replicating full-length HCV revlikon RNA is referred to as a “full-length HCV revlikon RNA replicating cell”.
  • This full length HCV replicon RNA replicating cell can produce viral particles.
  • the produced virus particles contain full-length HCV replicon RNA in a virus shell composed of HCV viral proteins.
  • the viral particles produced from the full length HCV replicon RNA replicating cells of the present invention are HCV particles. That is, in the present invention, HCV particles can be produced in a cell culture system by culturing full-length HCV replicon RNA replicating cells.
  • the full length HCV replicon RNA replicating cells are cultured, and the virus particles produced in the culture (preferably culture supernatant) are collected. Thus, HCV particles can be obtained.
  • HCV particles are also produced by recombinant cells obtained by introducing full length HCV genomic RNA.
  • the full-length HCV genomic RNA according to the present invention preferably full-length HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone, more preferably RNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12
  • the full-length HCV genomic RNA is Replicated with efficiency.
  • a recombinant cell replicating full-length HCV genomic RNA is referred to as a “full-length HCV genomic RNA-replicating cell”.
  • Virus particles produced by this full-length HCV genomic RNA replicating cell contain full-length HCV genomic RNA in a virus shell composed of HCV viral proteins.
  • the virus particles produced from the cells into which the full-length HCV genomic RNA of the present invention has been introduced are HCV particles.
  • HCV particles are preferably cultured in cells by culturing cells into which full-length HCV genomic RNA derived from the JFH-1 clone (for example, RNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12) has been introduced. It can be produced by a system. For example, a cell into which full-length HCV genomic RNA (for example, RNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12) is introduced is cultured, and HCV particles produced in the culture (preferably, culture supernatant) are collected. As a result, HCV particles can be obtained.
  • any cell can be used as long as it can be subcultured, but it is preferably a eukaryotic cell, and human More preferably, it is a human liver-derived cell, human cervix-derived cell, or human fetal kidney-derived cell.
  • proliferative cells including cancer cell lines and stem cell lines are preferable, and Huh7 cells, HepG2 cells, IMY-N9 cells, HeLa cells, or 293 cells are more preferable.
  • These cells may be commercially available, may be obtained from cell depository agencies, or may be cells that are established from any cell (for example, cancer cells or stem cells). Also good.
  • introduction of full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA into cells can be performed using any technique known to those skilled in the art. Such introduction methods include, for example, an electric mouth positioner, a particle gun method, a lipofusion method, a calcium phosphate method, a microinjection method, and a DEAE sepharose method. However, the electroporation method is particularly preferred.
  • Full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA may be introduced alone or mixed with other nucleic acids. If you want to change the amount of full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA introduced while keeping the amount of RNA to be introduced constant, extract the desired amount of full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA from the cells to be introduced.
  • the total cellular RNA can be mixed to obtain a certain total RNA amount, which can be used for intracellular introduction.
  • the amount of replicon RNA used for intracellular introduction may be determined according to the introduction method to be used, but preferably 1 picogram to 100 micrograms, more preferably 10 picograms to 10 micrograms. To do.
  • Full-length HCV replicon RNA-replicating cells can be selected using the expression of a selection marker gene or reporter gene contained in the full-length HCV replicon RNA.
  • a selection marker gene or reporter gene contained in the full-length HCV replicon RNA.
  • cells that have undergone such intracellular introduction treatment of full-length HCV replicon RNA may be cultured in a medium that can be selected by expression of a selectable marker gene.
  • the expression of a reporter gene for example, a fluorescent protein
  • the full-length HCV replicon RNA contains a neomycin-resistant gene as a selectable marker gene
  • cells treated with electroporation using the full-length HCV replicon RNA are seeded in a culture dish, and 1 2 to 7 2 hours Preferably, after incubation for 16 to 48 hours, add G418 (neomycin) to the culture dish.
  • full length HCV replicon RNA replicating cell clone The full length HCV replicon RNA replicating cells of the present invention include full length HCV replicon RNA replicating cell clones.
  • the replicated full-length HCV replicon RNA is detected, and it is confirmed that the selected marker gene or reporter gene in the full-length HCV replicon RNA is not integrated into the host genomic DNA of the cell.
  • the HCV protein it can be confirmed that the cell or cell clone actually replicates the full length HCV replicon RNA.
  • the replicated full-length HCV replicon RNA can be detected by any RNA detection method known to those skilled in the art.
  • the total RNA extracted from the cells is specific for the introduced full-length HCV replicon RNA. It can be detected by carrying out a Northern hybridization method using a typical DNA fragment as a probe.
  • ⁇ Confirmation that the selection marker gene or reporter gene in the full-length HCV replicon RNA is not integrated into the host genomic DNA of the cell is not limited 1S
  • the selection marker gene for genomic DNA extracted from cells Alternatively, PCR can be performed by amplifying at least a part of the reporter gene, and the presence or absence of the amplified product can be confirmed.
  • Detection of HCV protein can be performed, for example, by reacting an antibody against HCV protein to be expressed from the introduced full-length HCV replicon RNA with a protein extracted from cells.
  • This method can be performed by any protein detection method known to those skilled in the art. Specifically, for example, a protein sample extracted from a cell is blotted on a nitrocellulose membrane and subjected to it. It can be carried out by reacting an anti-HCV protein antibody (for example, an anti-NS3-specific antibody or antiserum collected from a patient with hepatitis C) and detecting the anti-HCV protein antibody.
  • an anti-HCV protein antibody for example, an anti-NS3-specific antibody or antiserum collected from a patient with hepatitis C
  • HCV protein is detected in the protein extracted from the cell, it can be determined that the cell replicates the full length HCV replicon RNA and expresses the HCV protein.
  • the virus particle producing ability of the full length HCV replicon RNA replicating cell or the full length HCV genomic RNA replicating cell of the present invention may be confirmed by any virus detection method known to those skilled in the art.
  • the culture supernatant of cells suspected of producing virus particles is fractionated using a sucrose density gradient, and the density of each fraction, HCV core protein concentration, and full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA.
  • the peaks of the HCV core protein and the full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA coincide, and the density of the fraction in which the peak is detected is 25% NP40 (polyoxyethylene. (9) Lighter than the density of the same fraction after fractionation after treatment with Polyoxyethylene (9) Octylphenyl Ether] (eg 1.18 ⁇ : L. 20 mg)
  • NP40 polyoxyethylene.
  • Octylphenyl Ether eg 1.18 ⁇ : L. 20 mg
  • HCV virus particles released into the culture supernatant can also be detected using, for example, antibodies against core protein, E1 protein, or E2 protein.
  • the full length HCV replicon RNA in the culture supernatant, by amplifying and detecting Ri by the RT- PCR method using specific primers can also be indirectly detect the presence of HCV viral particles 9
  • the HCV viral particle of the present invention has the ability to infect cells (preferably HCV sensitive cells).
  • the present invention comprises culturing full-length HCV replicon RNA-replicating cells or full-length HCV genomic RNA-replicating cells, and transferring virus particles in the obtained culture (preferably culture supernatant) to other cells (preferably HCV-sensitive cells). It also relates to a method for producing hepatitis C virus-infected cells, including infecting cells.
  • HCV-sensitive cells are cells having infectivity to HCV, preferably liver cells or lymphoid cells, but are not limited thereto.
  • liver cells include primary liver cells, Huh7 cells, HepG2 cells, IMY-N9 cells, HeLa cells, and 203 cells.
  • Lymphocyte cells include Molt4 cells and HPB-Ma cells. Examples include, but are not limited to, Daudi cells.
  • HCV particles produced in full-length HCV replicon RNA replicating cells of the present invention are produced in full-length HCV replicon RNA replicating cells of the present invention.
  • HCV sensitive cells eg HCV sensitive cells
  • Con RNA When infected with HCV sensitive cells (eg HCV sensitive cells), Con RNA is replicated and virus particles are formed.
  • Cells infected with viral particles produced in full-length HCV replicon RNA-replicating cells express selective genes and / or reporter genes, which can be used for selection and / or detection. Is possible.
  • virus particles produced in the full-length HCV replicon RNA-replicating cells of the present invention the full-length HCV replicon RNA is replicated in the cells, and virus particles can be further produced.
  • full-length HCV genomic RNA is replicated in the infected cells to form virus particles. Is done.
  • virus particles produced in the full-length HCV genomic RNA-replicating cells of the present invention
  • the full-length HCV genomic RNA is replicated in the cells and virus particles can be further produced.
  • the HCV virus particles produced in the full-length HCV replicon RNA-replicating cells or full-length HCV genomic RNA-replicating cells of the present invention infect animals that can be infected with I-ICV viruses such as chimpanzees and cause HCV-derived hepatitis be able to.
  • the full-length HCV replicon RNA-replicating cells of the present invention the full-length HCV replicon RNA is replicated with high efficiency. Further, even in the full-length HCV genomic RNA replicating cells of the present invention, full-length HCV genomic RNA is replicated with high efficiency. Therefore, full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA can be produced with high efficiency using the full-length HCV replicon RNA-replicating cells or full-length HCV genomic RNA-replicating cells of the present invention.
  • full-length HCV replicon RNA-replicating cells are cultured and cultured (cultured cells and
  • Full length HCV replicon RNA can be produced by extracting RNA from Z or culture medium), subjecting it to electrophoresis, and isolating and purifying the separated full length HCV replicon RNA. Even when full-length HCV genomic RNA-replicating cells are used, full-length HCV genomic RNA can be produced by the same method.
  • the RNA thus produced contains the full-length genomic sequence of hepatitis C virus.
  • the full-length genome sequence of hepatitis C virus is the selectable marker gene and / or reporter gene and the IRES sequence. Therefore, it may be divided.
  • HCV protein can be produced by any method known to those skilled in the art.
  • full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA is introduced into a cell to produce a recombinant cell, and the recombinant cell is produced.
  • Culture may be performed by recovering the protein from the obtained culture (cultured cells and Z or culture medium) by a conventional method.
  • the HCV viral particle of the present invention may have hepatocyte directivity. Therefore, a hepatocyte-directed viral vector can be produced using the full length HCV replicon RNA of the present invention.
  • This viral vector is suitably used for gene therapy.
  • RNA encoding a foreign gene is incorporated into a full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA, and the RNA is introduced into the cell, whereby the foreign gene is introduced into the cell and replicated in the cell. And can be further expressed.
  • RNA by preparing RNA by converting the E1 protein coding sequence or the E2 protein coding sequence in the full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA into the outer shell protein of a virus derived from another species, It is possible to infect cells of various species with the RNA. In this case as well, a foreign gene can be further incorporated into the full-length HCV replicon RNA or the full-length HCV genomic RNA and used as a hepatocyte-directed virus vector for expressing the foreign gene in hepatocytes.
  • the present invention includes inserting RNA encoding a foreign gene into RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12, introducing it into a cell, and culturing the cell to produce virus particles.
  • the present invention also relates to a method for producing a viral vector containing a foreign gene.
  • the present invention also includes a hepatitis C vaccine containing the HCV particles according to the present invention or a part thereof as a vaccine antigen, and a method for producing a hepatitis C vaccine using the HCV particles according to the present invention or a part thereof as an antigen. , provide.
  • the produced HCV particles can be used directly as a vaccine. It can also be used after being attenuated or inactivated by methods known in the art. For example, after preparing the HCV vaccine stock solution by purifying the prepared HCV particles by column chromatography, filtration, centrifugation, etc., a live attenuated HCV vaccine or an inactivated HCV vaccine may be prepared from the stock solution. Virus inactivation can be achieved by adding an inactivating agent such as formalin, ⁇ -propiolatathone, or dartal dialdehyde to a virus suspension and mixing it and reacting with the virus. and Ru can force s (Appaiahgari et al, Vaccine, (2004) 22 (27 -. 28), p.3669-3675).
  • an inactivating agent such as formalin, ⁇ -propiolatathone, or dartal dialdehyde
  • HCV replicon RNA in which a mutation has been introduced by using a known technique to reduce or eliminate the pathogenicity.
  • the vaccine of the present invention is prepared for administration as either a solution or a suspension. It can be prepared in the form of a solid suitable for dissolution or suspension in a liquid. The preparation can be emulsified or encapsulated in ribosomes. Active immunogenic ingredients such as HCV particles are often mixed with pharmaceutically acceptable excipients compatible with the active ingredient. Suitable excipients include, for example, water, saline, dextrose, daricerol, ethanol, and the like, and mixtures thereof. In addition, if desired, the vaccine may contain minor amounts of adjuvants (eg, humidifiers or emulsifiers), pH buffers, and / or adjuvants that enhance the efficacy of the vaccine.
  • adjuvants eg, humidifiers or emulsifiers
  • adjuvants examples include, but are not limited to: Aluminum hydroxide, N-acetyl-Muramil, L-Threoninore, D-Isoglutamine (thr-I MD P), N-Acetyl-Nor-Muramil L-Laranyl-I D-Isoglutamine (CGP 1 1 6 3 7, nor-MD P and N-Acetylmuramyl 1 L-Alanil D-Isoglutamin 2 L L-Alanin 1 2-(1 '1 2' 1 Dipalmi Toinole 1 sn-Glycero 3-Hydroxyphospholinoleoxy)-Ethylamine (CGP 1 9835A , MTP—PE)), and RIBI.
  • R I B Aluminum hydroxide
  • N-acetyl-Muramil L-Threoninore
  • D-Isoglutamine thr-I MD P
  • I contains 3 components extracted from Pacteria, namely monophosphoryl lipid A, trehalose dimycolate, and cell wall skeleton (HP L + TDM + CWS) in 2% squalene / Tween® 80 emulsion doing.
  • the efficacy of adjuvants arises from the administration of a vaccine composed of HCV particles. This can be determined by measuring the amount of antibody against this immunogenic HCV particle.
  • the vaccine is usually administered parenterally, for example by injection such as subcutaneous or intramuscular injection.
  • Alternative dosage forms suitable for other routes of administration include suppositories, and optionally oral formulations.
  • Adjuvants are nonspecific stimulators of the immune system. They enhance the host's immune response to the HCV vaccine. Specific examples of adjuvants known in the art include Freund's complete and incomplete adjuvants, vitamin E, non-ionic block polymers, muramyl dipeptides, saponins, mineral oils, vegetable oils and Carbopol. Adjuvants that are particularly suitable for mucosal applications include, for example, E. coli heat-labile toxin (LT) or Cholera toxin (CT).
  • LT heat-labile toxin
  • CT Cholera toxin
  • the vaccine of the present invention comprises an adjuvant.
  • HCV vaccine of the present invention examples include stabilizers, carbohydrates ( Examples include sorbitol, mannitol, starch, sucrose, glucose, dextran), proteins such as albumin or casein, protein-containing substances such as sushi serum or skim milk, and buffers (eg, phosphate buffer). .
  • carbohydrates examples include sorbitol, mannitol, starch, sucrose, glucose, dextran), proteins such as albumin or casein, protein-containing substances such as sushi serum or skim milk, and buffers (eg, phosphate buffer).
  • binders and carriers used for suppositories may include, for example, polyalkylene dallicol or triglyceride. Suppositories can be formed from mixtures containing the active ingredient in the range of 0.5% to 50%, preferably 1% to 20%. Oral preparations may contain commonly used excipients. Examples of the excipient include pharmaceutical grade mannitol, ratatoose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, and magnesium carbonate.
  • the vaccines of the present invention can take the form of solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release formulations, or powders. 10% to 95%, preferably 25% to Contains 70% active ingredient (virus particles or parts thereof).
  • the vaccine is administered in a manner suitable for the dosage form and in such an amount that it has a prophylactic and / or therapeutic effect.
  • the amount to be administered is usually in the range of 0 to 100 g of antigen per dose, which indicates the ability of the patient to be treated and its ability to synthesize antibodies in the patient's immune system.
  • route of administration such as oral, subcutaneous, intradermal, intramuscular and intravenous routes.
  • the vaccine may be given on a single dose schedule or preferably on a multiple dose schedule.
  • 1 to 10 individual doses are given at the start of the inoculation, followed by the time interval required to maintain and / or strengthen the immune response, for example as a second dose 1
  • Another dose can be given after -4 months. If necessary, administration can be continued after several months.
  • the dosing regimen will also be determined, at least in part, by the individual patient's needs and will depend on the judgment of the physician.
  • vaccines containing immunogenic HCV particles may be administered with other immunoregulatory agents (eg, immunoglobulins).
  • immunoregulatory agents eg, immunoglobulins
  • the HCV particle vaccine can also be used prophylactically against a newly occurring HCV infection by administering to a healthy person and inducing an immune response to HCV in the healthy person. Furthermore, it can be used as a therapeutic vaccine that eliminates HCV by administering HCV particle vaccine to patients infected with HCV and inducing a strong immune response against HCV in vivo.
  • hepatitis C virus replication virus particle
  • the cells are cultured in the presence of the test substance, and the full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA or virus particles in the obtained culture are detected.
  • a substance that promotes or suppresses the growth of hepatitis C virus can be screened by determining whether it promotes or suppresses the replication of RNA or full-length HCV genomic RNA or the formation or release of viral particles.
  • detection of full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA in the culture is performed by measuring the amount, ratio, or presence of full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA in RNA extracted from the above cells. It may be a thing.
  • Detection of virus particles in the culture (mainly culture supernatant) may be to detect the amount, ratio or presence or absence of HCV protein contained in the culture supernatant.
  • the immune globulin purified from the serum of HCV-infected patients has the ability to block the infection of the HCV virus particles according to the present invention.
  • serum from mice, rats, rabbits, etc. immunized with the HCV virus particles of the present invention may be used.
  • Immunization with a partial protein of HCV, HCV gene, etc. may be used. This test can be similarly applied to other substances that can block infection other than antibody molecules.
  • the antibodies of the present invention produced against the HCV virus particles of the present invention include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. If polyclonal antibodies are desired, first a selected mammal (eg, mouse, rabbit, goat, hidge, horse, etc.) is immunized with the HCV particles of the invention. Serum from sensitized animals is collected and processed according to known procedures. When serum containing a polyclonal antibody against HCV epitopes contains antibodies against other antigens, this polyclonal antibody may be purified by immunoaffinity chromatography. Methods for producing a polyclonal oral antiserum and methods for processing it are known in the art. Polyclonal antibodies may be isolated from mammals already infected with HCV.
  • a selected mammal eg, mouse, rabbit, goat, hidge, horse, etc.
  • Serum from sensitized animals is collected and processed according to known procedures.
  • serum containing a polyclonal antibody against HCV epitopes contains antibodies against other antigens
  • Monoclonal antibodies against HCV epitopes can also be readily produced by those skilled in the art.
  • General methods for producing hybridomas that produce monoclonal antibodies are well known. For example, Current Protocols in Immunology (John Wiley
  • ⁇ Noclonal antibody-producing cell lines may be generated by cell fusion, and tumors It may also be generated by other methods such as direct transformation of B lymphocytes with tumor gene DNA or transfection with Epstein-B arr virus.
  • Monoclonal antibodies and polyclonal antibodies obtained by these methods are useful for diagnosis, treatment, and prevention of HCV.
  • Antibodies produced using the HCV particles of the present invention are administered together with pharmaceutically acceptable solubilizers, additives, stabilizers, buffers, and the like.
  • the administration route may be any administration route, but is preferably subcutaneous, intradermal, or intramuscular administration, and more preferably intravenous administration.
  • Test system for screening HCV particles produced in full-length HCV replicon RNA-replicating cells or full-length HCV genomic RNA-replicating cells of the present invention and HCV-sensitive cells with substances that promote or suppress the binding of HCV to cells can also be used as Specifically, for example, HCV-sensitive cells are cultured with HCV particles produced in the full-length HCV replicon RM replicating cells of the present invention in the presence of a test substance, and the full-length HCV replicon RNA or virus in the resulting culture is obtained. Screening for substances that promote or inhibit the growth of hepatitis C virus by detecting the particles and determining whether the test substance promotes or inhibits replication of replicon RNA or virus particle formation. Can do.
  • Such detection of full-length HCV replicon RNA, full-length HCV genomic RNA, or virus particles can be performed according to the above-described method or the examples described below.
  • the above test system can also be used for the manufacture or evaluation of preventive, therapeutic or diagnostic agents for hepatitis C virus infection.
  • Substances that inhibit HCV growth and infection include, for example, by hybridizing directly or indirectly to organic compounds that directly affect HCV growth and infection, or to the target sequence of the HCV genome or its complementary strand. And antisense oligonucleotides that directly or indirectly affect HCV proliferation or HCV protein translation.
  • the full length HCV replicon RNA replicating cells or the full length HCV genomic RNA replicating cells according to the present invention can be used to identify host cellular proteins that play an important role for HCV virus propagation.
  • JFH-1 clone containing the full-length cDNA of JFH-1 strain (genotype 2a), a hepatitis C virus isolated from a patient with fulminant hepatitis, was placed downstream of the T7 RNA promoter sequence in pUC19 plasmid.
  • the inserted plasmid DNA was prepared.
  • RT-PCR fragments obtained by amplifying viral RNA of JFH-1 strain were cloned into pGEM-T EASY vector (Promega) and pGEM-258, pGEM44-486, pGEM317-849, pGEM617-1323, pGEM1141- 2367, pGEM2285-3509, pGEM3471-4665, pGEM4547-5970,
  • the plasmid DNAs 9634 and pGEM9594- 9678 were obtained (see Non-Patent Document 6).
  • the viral genomic RNA cDNAs contained in each plasmid were joined together using PCR and restriction enzymes, and the full-length viral genomic cDNA was cloned.
  • Full length wee A T7R RNA promoter sequence was inserted upstream of the Rus genome.
  • the plasmid DNA thus constructed is hereinafter referred to as pJFHl (the upper part of FIG. 1).
  • the production of the JFH-1 clone is described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 3.
  • NS5B region in pJFHl and pFGREP-JFH1 a mutation that mutates the amino acid motif GDD corresponding to the active center of the RNA polymerase encoded in the region to GND was introduced, and the mutation plasmid region was introduced.
  • pJFHl / GND and pFGREP-JFH1 / GND were also fabricated.
  • Mutant clones pJFHl / GND and pFGREP_JFHl / GND express the active NS5B protein required for replicating levicon RNA because the amino acid sequence of the active site of the NS5B protein encoded by it is mutated. I can't.
  • the / luciferase gene was introduced between the Mlul sites of pFGREP-JFH1 at positions 415 to 420 and the Pmel site at 2075 to 2082, and the neomycin resistance gene of pFGREP-JFH1 was transferred to luciferase.
  • PFGREP-JFHl / Luc replaced with the gene was prepared.
  • a mutant pFGREP-Jf3 ⁇ 4l / Luc / GND was constructed by mutating the 10933 of pFGREP-JFHl / Luc from G to A and changing the GDD motif at the active center of the RNA polylase of NS5b to GND.
  • mutant pFGREP-JRll / PFGREP-JRll / pGREP-JRll / PfGREP-JRll / pGREP-JFH1 was replaced with a green fluorescent protein gene between the Mlul site from 415 to 420 and the Pmel site from 1142 to 1149. EGFP was produced. Furthermore, mutant pFGREP-JFH1 / EGFP / GND was prepared by mutating pFGREP-JFH1 / EGFP number 10000 from G to A and changing the NS5b RNA polymerase active center GDD motif to GND.
  • pFGREP-JFH1 introduces a secretory placental strength phosphatase gene between Mlul rhizome 415 to 420 and Pmel sites 1982 to 1989
  • pFGREP-JFHl neo PFGREP-JFH1 / SEAP was prepared by substituting the mycin resistance gene with the secretory placental phosphatase gene.
  • a mutant pFGREP-JFH1 / SEAP / GND was constructed by changing the 10840 of pFGREP-JFH1 / SEAP from G to A and changing the GDD motif at the active center of NS5b RNA polymerase to GND.
  • the expression vectors PJFH1, pJFHl / GND, pFGREP-JFH1, and pFGREP-JFH1 / GND constructed as described above were respectively used as restriction enzymes Xbal. Disconnected with Then, for each of these Xbal cleavage fragments, is contained 10 to 20 ⁇ in 50 1 of the reaction solution by incubating at 30 ° C 30 minutes with Mung Bean Nuclease 20 U, and further processed.
  • Mung Bean Nuclease is an enzyme that catalyzes a reaction that selectively degrades a single-stranded portion of double-stranded DNA. Normally, when RNA synthesis is performed using the above Xbal cleaved fragment as it is as a cage, a replicon RNA in which 4 bases of CUGA, which is part of the recognition sequence of Xbal, are added to the 3 'end is synthesized. End up. Therefore, in this example, the Xbal cleavage fragment was treated with Mung Bean Nuclease to remove 4 bases of CUGA from the Xbal cleavage fragment.
  • the Xbal cleaved fragments from which 4 bases of CUGA were removed were purified by protein removal treatment according to the usual method, and this was used as vertical DNA. .
  • RNA was synthesized in vitro from this caged DNA using T7 RNA polymerase.
  • Ambion MEGAscript was used for this RNA synthesis.
  • JFH1 / GND The base sequences of these RNAs are shown in SEQ ID NOS: 12 and 13 for rJFH-1 and rFGREP-JFH1, and SEQ ID NOs: 14 and 15 for rJFHl / GND and rFGREP-JFH1 / GND, respectively.
  • rJFHl has the same sequence structure as the full-length HCV genome of the JFH-1 strain. It is an example of the full-length HCV genomic RNA of the present invention.
  • rFGREP-JFHl is an example of a full-length HCV replicon RNA in the present invention. .
  • Example 2 Full-length HCV genomic RNA replicating cells and virus particle production in cells
  • C Full-length HCV genomic RNA replication and viral particle production in cells
  • RNA extracted from the cultured cells was subjected to denatured agarose electrophoresis, and after completion of the electrophoresis, the RNA was transferred to a positive charge membrane.
  • the 32 P-labeled DNA or RNA probe prepared from pJFHl was hyperpredated to the RNA transcribed onto the membrane as described above, then the membrane was washed and exposed to film, so that the JFH-1 clone An RNA band specific for full-length HCV genomic RNA was detected.
  • the introduced RNA band was confirmed as a weak signal after 4 hours of transfection, but the signal attenuated over time, and 24 hours later Is almost panda Signal could not be confirmed.
  • the signal strength of the introduced RNA band gradually decreased as in the case of rJFHl / GND between 4 hours and 1.2 hours after transfection. After 24 hours, a clear band signal was confirmed.
  • the confirmed signal was specific for HCV genomic RNA. In other words, it was considered that a part of the introduced full-length HCV genomic RNA replicated and proliferated.
  • Core protein was detected in the culture supernatant after 8 hours and 72 hours.
  • the culture solution after 72 hours of transfection with rJFHl was fractionated by a sucrose density gradient.
  • 60% (w / w) pepper solution dissolved in 50 mM Tris pH 7.5 / 0.1 M NaCl / lmM EDTA) 2 ml, 50 ° /.
  • Sucrose solution l ml 40% sucrose solution l ml, 30% sucrose solution l ml,
  • Centrifugation was performed at 400,000 RPM, 4 ° C for 16 hours. After completion of centrifugation, 0.5 ml fractions were collected from the bottom of the centrifuge tube. The density of each fraction, the concentration of HCV core protein, and the amount of full-length HCV genomic RNA were quantified. Quantitative RT-PCR detection of full-length HCV genomic RNA was performed by Takeuchi T, Katsurae A, ⁇ an'aka T, Abe A, Inoue K, Tsukiyama-Konara K, Kawaguchi R, ranaka S, Gastroenterology 116: 636— 642 (1999) ⁇ ⁇ ⁇ , by detecting RNA in the 5 ′ untranslated region of full-length HCV genomic RNA.
  • the peaks of the core protein and full-length HCV genomic RNA coincided with the 1st fractation.
  • the density of this fraction was about 1.18 mg / ml, which was a lighter specific gravity than previously reported core protein / nucleic acid conjugates.
  • the peak of the core protein and the full-length HCV genomic RNA shifted to a specific gravity of about 1.28 mg / ml. In other words, it was thought that the specific gravity increased as a result of the NP40 treatment separating the light-weight surface membrane containing lipids from the virus particles into core particles consisting only of nucleic acid and core protein.
  • Example 1 RFGREP-JFH1 and rFGREP-JFH1 / GND prepared in Example 1 were transfected into Huh7 cells in the same manner as in Example 2 to produce full-length HCV replicon RNA-replicating cells, and then full-length HCV replicon-RNA replicating cells. An attempt was made to establish a clone.
  • each of rFGREP-JFH1 and rFGREP-JFH1 / GND was transfected into Huh7 cells, and then the cells were seeded in a culture dish. G418 was added at various concentrations after incubation for 16 to 24 hours. The culture was continued twice a week while changing the culture medium. 2 After culturing for 1 day, viable cells were stained with crystal violet. Count the number of colonies to be stained and per weight of transfected RNA The number of colonies obtained was calculated. In some culture dishes, colonies of viable cells were cloned and culture was continued.
  • RNA was extracted by acidic phenol extraction from full-length HCV replicon RNA-replicating cell clones established by rFGREP-JFH1 transfection into Huh7 cells according to (E) above. The total RNA was then analyzed by the Northern plot method. As the probe, a pFGREP-JFH1-specific probe was used. As a control, total extracted in the same way from Huh7 cells without transfection
  • RNA shown as “Huh7” in Fig. 6
  • total RNA extracted from Huh7 cells sample of replicon RNA synthesized in vitro added to the 7th power of 10 (in Fig. 6, “1
  • 0 7 shows a j
  • Fig 6 the synthesized replicon RNA in vitro to total RNA extracted from Huh7 cells were added 8 square copy 10, shown as "1 0 8" Was used.
  • FIG. 6, 1-4 are cell clone numbers.
  • RNA of the same size as rFGREP-JFH1 was detected by the pFGREP-JFH1-specific probe (Fig. 6). This confirmed that the transfected rFGREP-JFH1 replicon RNA replicated and propagated within the cell clone. In addition, there was a difference in the amount of replicon RNA between cell clones. In Fig. 6, for example, clone 2 had less replicon RNA than other clones.
  • the resistance of the cell clone to G418 is the neomycin resistance gene.
  • a neomycin resistance gene-specific primer (sense primer, NE0-S3: 5'-AACAAGATGGATTGCACGCA-3 '(SEQ ID NO: 1 9), antisense primer, Using NE0-R: 5′-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 20)), PCR amplification was performed using the genomic DNA of the stool cells extracted from the cell clone as a cage. As shown in Fig. 7, this ligation showed no positive clones that showed amplification of the neomycin resistance gene.
  • rFGREP-JFH1 was transfected and the protein was extracted from an isolated cell mouth by a conventional method, and analyzed by SDS-PAGE and Western plotting.
  • the cell clones examined are the same as those used in (G) above.
  • a cell extract obtained by transient transfection of HCV genomic RNA into Huh7 cells was used as a positive control (shown as JFH-1 in FIGS. 8, 9 and 10).
  • the clonal cell extract obtained by transfecting the HCV subdienomic RNA replicon (SGR-JFH1) was used as a negative control for the core protein, and NS3 and NS5a tampers. It was used as a positive control for the quality (shown as SGR-JFH1 in FIGS. 8, 9 and 10).
  • Untransfected Huh7 cell extract was used as a negative control (shown as Huh7 in FIGS. 8, 9 and 10).
  • NS5A protein from full-length HCV replicon RNA was also confirmed for each cell clone in which the expression of NS3 protein L5 protein was confirmed above (Fig. Ten ) .
  • rFGREP-JFH1 was transfected into Huh7 cells, and the culture supernatants of the established full-length HCV replicon RNA replicating cell clones 2 and 3 (FGR-JFH1 / 2-3) were recovered, and Measure HCV virus particles in the culture supernatant using the same method as (D).
  • Fig. 11 shaded circles indicate the specific gravity (g / ml) of each fraction.
  • the black circle indicates the amount of core protein (fmol / L).
  • Open circles indicate the titer of full-length HCV replicon RNA (X 0.1 copy / mL).
  • the peak of the core protein and the full-length HCV replicon RNA coincided in the fraction with a specific gravity of about 1.18 to 1.20 mg / ml. Lighter than that A small peak was observed in the fraction.
  • the culture supernatant of FGR-JFH1 / 2-3 and FGR-JFH1 / 2-5 was used to infect hepatitis C virus, and the colonies formed were then cloned.
  • Three clones of FGR-JFH1 / C2-3-11, FGR-JFH1 / C2-3-12, FGR-JFH1 / C2-3-13 from a culture dish using the culture supernatant of FGR-JFH1 / 2-3 was established.
  • the culture supernatant of full-length HCV replicon RNA replicating cells was used for infection, and RNA, protein, and genomic DNA were extracted from these cell clones established from the infected cells.
  • RNA, protein, and genomic DNA were extracted from these cell clones established from the infected cells.
  • the full-length HCV replicon RM replicated in cells could be detected by a quantitative PCR method using RNA as a cage.
  • the core protein could be detected in the culture supernatant. This result indicates that virus particles containing the full length HCV replicon RNA produced from the full length HCV replicon RNA replicating cells of the present invention can infect new cells.
  • HCV virus particles can be produced in a cell culture system.
  • RNA containing HCV full-length genomic RNA can be efficiently produced in a cell culture system.
  • the full-length HCV replicon RNA or the full-length HCV genomic RNA is replicated, and the HCV virus particles of the present invention are maintained in a cell culture system. Can be produced.
  • the cells into which the full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA of the present invention has been introduced are used for screening various substances that affect the HCV replication process, virus particle formation process, and extracellular release process of virus particles. It can also be used as a test system.
  • the full-length HCV replicon RNA, full-length HCV genomic RNA and viral particles of the present invention are also useful as a viral vector for a foreign gene.
  • the virus particle of the present invention or a part thereof can also be contained in a vaccine as a vaccine antigen against hepatitis C virus.
  • the system in which the virus particles of the present invention are cultured together with other cells can be used as a test system for screening various substances that affect the infection of virus particles into cells.
  • the full-length HCV replicon RNA or full-length HCV genomic RNA of the present invention is also a full-length HCV genome. It is also useful as a saddle that can easily replicate the nom sequence.
  • sequence of SEQ ID NO: 1 represents the 5 ′ untranslated region of HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone
  • sequence of SEQ ID NO: 2 represents the core protein code sequence of HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 3 shows the E1 protein coding sequence of HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 4 shows the E2 protein coding sequence of HCV genomic RNA derived from JI3 ⁇ 4-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 5 shows the NS2 protein coding sequence of HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 6 shows the NS3 protein coding sequence of HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 7 shows the NS4A protein code sequence of HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 8 shows the NS4B protein code sequence of HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 9 shows the NS5A protein code sequence of HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 10 shows the NS5B protein code sequence of HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 11 represents the 3 ′ untranslated region of HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 12 represents full-length HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 13 represents a replicon RNA containing a full length HCV genomic RNA derived from a JFH-1 clone.
  • sequence of SEQ ID NO: 14 represents the full-length HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone, in which the amino acid motif GDD is mutated to GND.
  • sequence of SEQ ID NO: 15 represents a replicon RNA containing a full-length HCV genomic RNA derived from JFH-1 clone, in which the amino acid motif GDD is mutated to GND.
  • sequences of SEQ ID Nos: 16-20 represent primers.
  • sequence of SEQ ID NO: 21 represents the replicon RNA derived from the expression vector pFGREP-JFHl / Luc.
  • sequence of SEQ ID NO: 22 represents a replicon RNA derived from the expression vector pFGREP-JFHl / Luc / GND.
  • sequence of SEQ ID NO: 23 represents the replicon RNA derived from the expression vector pFGREP-JFH1 / EGFP.
  • sequence of SEQ ID NO: 24 represents the replicon RNA derived from the expression vector pFGREP-JFH1 / EGFP / GND.
  • sequence of SEQ ID NO: 25 represents the replicon RNA derived from the expression vector pFGREP-JFH1 / SEAP.
  • sequence of SEQ ID NO: 26 represents the replicon RNA derived from the expression vector pFGREP-JFH1 / SEAP / GND.

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Abstract

本発明は、HCV全長ゲノム配列を含むRNAを効率良く複製する方法、及び全長HCVレプリコンRNA又は全長HCVゲノムRNAを含有するHCVウイルス粒子を細胞培養系により製造する方法を提供する。また本発明は、遺伝子型2aのＣ型肝炎ウイルスの全長ゲノムRNA配列と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子と、少なくとも１つのIRES配列とを含む塩基配列からなるレプリコンRNA、あるいは遺伝子型2aのＣ型肝炎ウイルスの全長ゲノムRNAを導入した細胞を培養して、培養物中にウイルス粒子を産生させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法に関する。さらに本発明は、Ｃ型肝炎ワクチン及びＣ型肝炎ウイルス粒子に対する抗体にも関する。

Description

ヒ ト C型肝炎ウィルスの全長ゲノムを含む核酸構築物及ぴ該核酸構築物を導入し た組換え全長ウィルスゲノム複製細胞、 並びに c型肝炎ウィルス粒子の作製方法 技術分野
本発明は、 C型肝炎ウィルスの全長ゲノムを含む核酸構築物、 C型肝炎ウィル ス粒子の in vitroでの作製方法、 及び作製した C型肝炎ウィルス粒子の使用に関 明
する。 書
背景技術
C型肝炎ウィルス (Hepatitis C virus, HCV) は、 フラビウィルス科に属する、 一本鎖の（+)鎖センス RNAをゲノムとするウィルスであり、 C型肝炎の原因となる ことが知られている。
HCVは持続的に感染することにより慢性肝炎を引き起こす。 現在、 世界的規模 で認められる慢性肝炎の主たる原因が HCV持続感染である。 実際、 持続感染者の 5 0 %程度が慢性肝炎を発症し、 そのうち約 2 0 %の患者が 1 0年〜 2 0年を経 て肝硬変に移行し、 さらにその一部は肝癌といった致死的な病態へと進展する。
C型肝炎に対する現在の主な治療は、 インターフヱロン一 α、 インターフエ口 ンー βヽ 及びインターフェロン一 αとプリンーヌクレオシド誘導体であるリバビ リンとの併用療法により行われている。 しかしながら、 これらの治療を行っても、 全治療者の約 6 0 %に治療効果が認められるだけであり、 効果が出た後に治療を 中止すると半分以上の患者が再燃する。
.工業国において罹患率が高く、 最終的に深刻な結果を招き、 かつ現在は原因治 療法が存在しない C型肝炎に対する効果的な治療薬又は予防薬の開発は重要な目 標である。 そのため、 HCV特異的な化学療法、 ワクチン療法の発展が切望されて いる。 抗 HCV薬開発のターゲットとしては、 HCVの複製抑制や HCVの細胞感染の抑 制が考えられる。
最近になって、 HCV由来の自律複製能を有する RNAとして、 HCVサブゲノム RNAレ プリコンシステムが作製された （特許文献 1、 2及び 3、 非特許文献 1〜4 ) 。 HCVサブゲノム RNAレプリコンシステムは、 HCVゲノムの構造遺伝子を取り除いて 代わりに選択薬剤マーカー遺伝子を揷入した HCVレプリコン RNAを作製し、 そのレ プリコン RNAを培養細胞内に導入し、 細胞内でレプリコン RNAを自律的に複製させ るシステムである。 これにより、 培養細胞を用いて HCVの複製機構を解析するこ とが可能になったが、 これは HCVウィルスの増殖複製過程におけるウイルス RNA複 製のみを評価することが可能な実験系であり、 HCVウィルス粒子の感染細胞内で の形成と細胞外への放出、 さらに新たな細胞への感染という過程は解析できなレ、。 現在、 HCVウィルス粒子の开$成と細胞外への放出、 さらに新たな細胞への感染 という過程を評価する方法と しては、 チンパンジーなどの動物を用いた実験系し かない （非特許文献 5 ) 。 しかしながら、 動物という生体をそのまま用いた実験 系は、 煩雑で解析が極めて困難である。 したがって、 HCVウィルス粒子の感染細 胞内での形成と細胞外への放出、 さらに新たな細胞への感染という過程を解析お ょぴ、 これらの過程の阻害を作用メカニズムとした抗 HCV薬を作製するには、 こ れらの過程を.再現できる極めて単純化した実験系、 すなわち、 培養実験系での HCVウィルス粒子の作製系を構築する必要がある。
また、 細胞培養系を用いて安定して HCVウィルス粒子を供給可能になれば、 ゥ ィルスを弱毒化したり、 分子生物学的手法を用いて非感染性の HCVウィルスを作 製したりして、 それをワクチンに用いることができる。
特許文献 1 特開 2 0 0 1— 1 7 1 8 7号公報
特許文献 2 国際出願 P C Tノ J P 0 3 Z 1 5 0 3 8
特許文献 3 特願 2 0 0 3— 3 2 9 0 8 2
非特許文献 1 Lohmann et al. , Science, (1999) 285， p. 110-113 非特許文献 2 Blight et al. , Science, (2000) 290， p. 1972-1974 非特許文献 3 Friebe et al. , J. Virol. , (2001) 75 (24)： p. 12047-
12057
非特許文献 4 Ikeda et al. , J. Virol.， (2002) 76 (6)： p. 2997-3006 非特許文献 5 Kolykhalov et al. , Science, (1997) 277， p. 570-574
.非特許文献 6 Kato et al.， Gastroenterology ， (2003) 125, p. 1808- 1817 非特許文献 7 Yanagi et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. , (1997) 96 (16)： p. 8738-8743
非特許文献 8 Okamoto et al.， J. Gen. Virol. , (1991) 73, p 2697-26704 非特許文献 9 Aoyagi et al. , J. Clin. Microbiol. , (1999) 37 (6)： p. 1802-1808 発明の開示
本発明は、 これまで成功していない、 HCV全長ゲノム配列を含む RNAを効率良く 複製する方法、 及び全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNAを含有する HCV ウィルス粒子を細胞培養系により製造する方法、 を提供することを目的とする。 本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、 HCVウィルス粒 子を細胞培養系で作製する方法を開発した。 すなわち、 本発明は以下の通りであ る。 .
[1] 遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルスのゲノム RNAの、 5'非翻訳領域、 coreタンパ ク質コード配 、 E1タンパク質コード配歹 ϋ、 Ε2タンパク質コード配列、 NS2タン パク質コード配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コード配列、
NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード 配列、 及び 3'非翻訳領域と、 少なくとも 1つの選択マーカー遺伝子及びノ又は少 なくとも 1つのリポーター遺伝子と、 少なく とも 1つの IRES配列と、 を含む塩基 配列からなる、 レプリ.コン RNA。
このレプリコン RNAにおいては、 好ましくは、 前記塩基配列が、 前記の 5'非翻 訳領域、 少なくとも 1つの選択マーカー遺伝子及び/又は少なく とも 1つのリポ 一ター遺伝子、 少なく とも 1つの IRES配列、 coreタンパク質コード配列、 E1タン ノ ク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード配列、 NS3タ ンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コー ド配列、 NS4Bタンパク質コード配列、
NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列、 及ぴ 3'非翻訳領域を、
5'から 3'方向へこの順番で含む。
このレブリコン RNAのより好ましい実施形態では、 遺伝子型 2aの C型肝炎ウイ ルスのゲノム RNAが、 配列番号 1 2に示す塩基配列からなる RNAである。 このレプリコン RNAのさらに好ましい実施形態では、 5'非翻訳領域が配列番号 1に示す塩基配列からなり、 coreタ パク質コード配列が配列番号 2に示す塩基 配列からなり、 E1タンパク質コード配列が配列番号 3に示す塩基配列からなり、 E2タンパク質コード配列が配列番号 4に示す塩基配列からなり、 NS2タンパク質 コード配列が配列番号 5に示す塩基酉己列からなり、 NS3タンパク質コード配列が 配列番号 6に示す塩基配列からなり、 NS4Aタンパク質コード配列が配列番号 7に 示す塩基配列からなり、 NS4Bタンパク質コード配列が配列番号 8に示す塩基配列 力 らなり、 NS5Aタンパク質コード配列が配列番号 9に示す塩基配列からなり、 NS5Bタンパク質コード配列が配列番号 1 0に示す塩基配列からなり、 3'非翻訳領 域が配列番号 1 1に示す塩基配列からなる。
[2] 以下の（a)又は（b)の RNAからなるレプリコン RNA。
(a) 配列番号 1 3に示す塩基配列からなる RNA。
(b) 配列番号 1 3に示す塩基配列において 1〜 1 0 0個の塩基が欠失、 置換又は 付加された塩基配列からなる RNAであつて、 自律複製能及びゥィルス粒子産生能 を有する RNA。
[3] 上記 [1]又は [2]記載のいずれかのレプリコン RNAを細胞に導入することを含 む、 該レプリコン RNAを複製しかつウィルス粒子を産生する細胞を製造する方法。 この方法では、 細胞が増殖性細胞であることが好ましい。 あるいは、 この方法 における細胞は、 真核細胞であることが好ましい。
この方法では、 好ましくは、 真核細胞はヒ ト肝由来細胞、 ヒ ト子宫頸由来細胞、 又はヒ ト胎児腎由来細胞である。 さらに好ましくは、 真核細胞が Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY-N9細胞、 HeLa細胞、 又は 293細胞である。
[4] 上記 [3]記載の方法により製造される、 レブリコン RNAを複製しかつウィルス 粒子を産生する細胞。
[5] 上記 [4]記載の細胞を培養してウィルス粒子を産生させることを含む、 C型 肝炎ウィルス粒子の製造方法。
[6] 上記 [5]記載の方法により製造される、 C型肝炎ウィルス粒子。
[7] 上記 [4]記載の細胞を培養し、 培養物中のウィルス粒子を他の細胞に感染さ せることを含む、 C型肝炎ウィルス感染細胞を製造する方法。 [8] 上記 [7]記載の方法によって製造される、 C型肝炎ウィルス感染細胞。
[9] 被験物質の存在下で、 下記（a)〜（C) ：
(a) 上記 [4]記載の細胞
(b) 上記 [8]記載の C型肝炎ウィルス感染細胞、 並びに
(c) 上記 [6]記載の C型肝炎ウィルス粒子及び C型肝炎ウィルス感受性細胞、 のうちの少なくとも 1つを培養し、 得られる培養物中のレプリコン RNA又はウイ ルス粒子を検出することを含む、 抗 C型肝炎ウイ/レス物質をスクリーユングする 方法。
[10] 上記 [6]記載の C型肝炎ウィルス粒子又はその一部分を含有する C型肝炎ヮ クチン。
[11]上記 [6]記載の C型肝炎ウィルス粒子又はその一部分を抗原として使用して、 C型肝炎ヮクチンを製造する方法。
[12] 上記 [1]又は [2]記載のいずれかのレブリコン； NAを使用して、 遺伝子治療の ための肝細胞指向性ウィルスベクターを製造する方法。
[13] 上記 [12〕に記載の方法により製造される、 肝細胞指向性ウィルスベクター。
[14] 外来遺伝子をコードする RNAを上記 [1]又は [2 ]記載のいずれかのレプリコン RNA中に挿入し、 それを細胞中に導入することを含む、 該細胞内で外来遺伝子を 複製及ぴノ又は発現させる方法。
[15] 配列番号 1 2に示す塩基配列からなる RNAを細胞に導入することを含む、 該 RNAを複製しかつウィルス粒子を産生する細胞を製造する方法。
[16] 配列番号 1 2に示す塩基配列からなる RNAを細胞に導入し、 その細胞を培養 してウィルス粒子を産生させることを含む、 C型 J3汗炎ウィルス粒子の製造方法。
[17] 細胞が増殖性細胞である、 上記 [15]又は [16]記載の方法。
[18] 配列番号 1 2に示す塩基配列からなる RNAに外来遺伝子をコードする RNAを 挿入し、 それを細胞に導入し、 その細胞を培養してウィルス粒子を産生させるこ とを含む、 外来遺伝子を含有するウィルスベクターを製造する方法。
[19] 上記 [6]記載の C型肝炎ゥィルス粒子に対する抗体。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004- 045489号の明細書 及び図面に記載される内容を包含する。 . 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNAを作製するため の鎵型 DNAの構築手順を示す概略図である。 図 1の上段は、 T7プロモーターの下 流に全長 HCVゲノムを挿入して作製したプラスミ ドクローン pjraiの構造を示す。 図 1の下段は、 pJFHlの T7プロモーターと 翻訳領域の下流にネオマイシン耐 性遺伝子と EMCV IRESを含む DNA断片を揷入した、 全長 HCVゲノム配列を含むプラ スミ ドクローン pFGREP - JFH1の構造を示す。 図中の記号は以下のとおりである。 T 7： T7 RNAプロモーター、 5，UTR: 5 ' 翻訳領域、 C： コアタンパク質、 E l、 E 2： エンベロープタンパク質。 NS 2、 NS 3、 N S 4 A、 NS 4B、 4A、 4 B： 非構造タンパク質。 3，UTR: 3'非翻訳領域。 Age I、 Pme I、 Xba I： 制限酵素 Age I、 Pme I及ぴ Xba Iの切断部位。 GDD: NS5Bタンパク質の活性 中心に相当するアミノ酸モチーフ GDDの位置。 n e o : ネオマイシン耐性遺伝 子、 EMCV I RES : EMCV IRES (脳心筋炎ゥィルスの内部リボソーム結合部 位） 。
図 2は、 全長 HCVゲノム RMである rJFH- 1を導入した Huh7細胞における rJFH - 1の 複製を示すノーザンプロット解析の結果を示す写真である。
図 3は、 培地中の HCVコアタンパク質の定量の結果を示す。 白抜きの円は rJFHl を導入し'た細胞、 黒塗りの円は rJFHl/GNDを導入した細胞を示す。
図 4は、 rJFH- 1を導入した Huh7細胞の培養上清をショ糖密度勾配により分画し た各画分についての、 HCVコアタンパク質量及び全長 HCVゲノム RNA量、 並びに比 重を示すグラフである。 黒塗りの円は HCV コア（core)タンパク質、 白抜きの円は 全長 HCVゲノム RNA、 網掛けの円は比重を示す。
図 5は、 全長 HCVレプリコン RNAである rFGREP- JFH1をトランスフエクションし た Huh7細胞のコロニー形成を示す写真である。
図 6は、 rFGREP- JFH1の Huh7細胞へのトランスフエクシヨンにより樹立した全 長 HCVレプリコン RNA複製細胞クローンにおける、 全長 HCVレプリコン RNAの複製を 示す写真である。
図 7は、 ゲノム DNA中へのネオマイシン耐生遺伝子の組み込みの有無を確認す るための、 宿主細胞のゲノム DNAを鐃型とし、 ネオマイシン耐性遺伝子特異的プ ライマーを用いて PCR増幅した結果を示す写真である。 M ： DNAサイズマーカー、 P ： 陽性対照、 N ： Huh7細胞。
図 8は、 全長 HCVレプリコン RNAである rFGREP- JFH1を導入した Huh7細胞におけ る coreタンパク質の発現を示すウェスタンプロット解析の結果を示す写真である。
.図 9は、 全長 HCVレプリコン RNAである rFGREP- JFH1を導入した Huh7細胞におけ る NS3タンパク質の発現を示すウエスタンブロッ ト解析の結果を示す写真である。 図 1 0は、 全長 HCVレプリコン RNAである rFGREP-JFHlを導入した Huh7細胞にお ける NS5Aタンパク質の発現を示すウェスタンブロット解析の結果を示す写真であ る。
図 1 1は、 rFGREP- JFH1を導入した Huh7細胞の培養上清をショ糖密度勾配によ り分画した各画分についての、 HCV coreタンパク質の量及ぴ全長 HCVレプリコン RNA量、 並びに比重を示すグラフである。 黒塗りの円は HCV コア（core)タンパク 質、 白抜きの円は全長 HCVレプリコン RNA、 網掛けの円は比重を示す。
図 1 2は、 .全長 HCVレプリコン RNA複製細胞の培養上清に含まれるウィルス粒子 を添加した Huh7細胞のコ口ニー形成を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
1 . 全長 HCVレプリコン RNA
C型肝炎ウィルス (HCV) のゲノムは、 約 9600ヌクレオチドからなる（+)鎖の一 本鎖 RNAである。 このゲノム RNAは、 5，非翻訳領域 （5' NTR又は 5' UTRとも表記す る） 、 構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、 及び 3'非翻訳領域 (3' NTR又は 3' UTRとも表記する） からなる。 その構造領域には HCVの構造タンパ ク質がコードされており、 非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされ ている。
このような HCVの構造タンパク質 （core、 El、 及ぴ E2) と非構造タンパク質
(NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 及ぴ NS5B) は、 翻訳領域から一続きのポリプロ ティンとして翻訳された後、 プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、 生成さ れる。 これらの構造タンパク質及ぴ非構造タンパク質 （すなわち、 HCVのウィル スタンパク質） のうち、 coreはコアタンパク質であり、 E1及び E2はエンベロープ タンパク質である。 非構造タンパク質はウィルス自身の複製に関与するタンパク 質であり、 NS2はメタ口プロテアーゼ活性、 NS3はセリンプロテアーゼ活性 （N末 端側の 3分の 1 ) とへリカーゼ活性 （C末端側の 3分の 2 ) を有することが知ら れている。 さらに、 NS4Aは NS3のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり . NS5Bは RNA依存 RNAポリメラーゼ活性を有することも報告されている。
本発明者らは、 HCVゲノム RNAを用いて、 自律的に複製可能であり、 かつウィル ス粒子産生能を有するレプリコン RNAを構築した。
本明細書では、 自律複製能を有しており HCVゲノム RNAを改変して作製された RNAを、 「レプリコン RNA」 又は 「RNAレプリコン」 と称する。 本明細書において HCV由来のレプリコン RNAは、 HCV- RNAレプリコンとも称する。 本明細書では、 HCV ゲノム RNAの全長を含む本発明のレプリコン RNAを、 「全長 HCVレプリコン RNA」 と 呼ぶ。 本発明の全長 HCVレプリコン RNAは、 ウィルス粒子産生能を有する。
本発明の全長 HCVレプリコン RNAの好適な実施形態では、 C型肝炎ウィルスは、 限定するものではないが、 遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルスであることが好ましい c 本発明において、 「遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルス」 「遺伝子型 2aの HCV」 とは、 Simmondsら (Simmonds, P. et al, Hepatology, (1994) 10, p. 1321 - 1324を参 照） による国際分類に従って遺伝子型 2aと同定される C型肝炎ウィルスを意味す る。 本発明における 「遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルス」 「遺伝子型 2aの HCV」 に は、 天然由来の HCVゲノム RNAを有するウィルスだけでなく、 天然由来の HCVゲノ ム配列に人為的な改変を加えたゲノム RNAを有するウィルスも包含する。 遺伝子 型 2aの HCVの具体例としては、 JFH- 1株 （特開 2 0 0 2— 1 7 1 9 7 8号公報を参 照） が挙げられる。
本明細書において 「C型肝炎ウィルスのゲノム RNA」 とは、 C型肝炎ウィルス の一本鎖の（+)鎖センス RNAからなるゲノムの全長にわたる塩基配列を有する RNA を意味する。 限定するものではないが、 遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルスのゲノム
RNAとしては、 配列番号 1 2に示す塩基配列力 らなる RNAが好ましい。
本発明に係る全長 HCVレプリコン RNAの一つの実施形態は、 C型肝炎ウィルスの ゲノム RNA上の、 5，非翻訳領域、 coreタンパク質コード配列、 E1タンパク質コー ド配列、 E2タンパク質コ一ド配列、 NS2タンパク質コード配列、 NS3タンパク質コ ード配列、 NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパ ク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列、 及び 3'非翻訳領域と、 少なく とも 1つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子と、 少なく とも 1つの IRES配列 と、 を含む塩基配列からなる、 レプリコン RNAである。
限定するものではないが、 好ましくは、 本発明の全長 HCVレプリコン RNAは、 5， 非翻訳領域、 少なく とも 1つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子、 少な く とも 1つの IRES配列、 coreタンパク質コード配歹 (|、 E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード配列、 NS3タンパク質コード配列. NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード 配列、 NS5Bタンパク質コード配列、 及ぴ 3'非翻訳領域を、 5'から 3'方向へこの順 番で含む。
本明細書において、 「5'非翻訳領域 （5' NTR又は 5' UTR) 」 、 「coreタンパク質 コード配列 （core領域又は C領域） 」 、 「E1タンパク質コード配列 （E1領域） 」 .
「E2タンパク質コード配列 （E2領域） 」 、 「N2タンパク質コード配列 （NS2領 域） 」 、 「NS3タンパク質コード配列 （NS3領域） 」 、 「NS4Aタンパク質コード配 歹 IJ (NS4A領域） 」 、 「NS4Bタンパク質コード配列 （NS4B領域） 」 、 「NS5Aタンパ ク質コード配列 （NS5A領域） 」 、 「NS5Bタンパク質コード配列 （NS5B領域） 」 、 及び 「3'非翻訳領域 （3' NTR又は 3' UTR) 」 、 並びにその他の特定の領域若しくは 部位は、 遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルスである JFH-1株 （特開 2 0 0 2— 1 7 1
9 7 8号公報） のゲノムの全領域からなる全長ゲノム RNA (配列番号 1 2 ) を基 準として定めることができる。
あるいは、 本願発明における C型肝炎ウィルス （HCV) ゲノム中の部分領域又 はその部位は、 JFH-1株のゲノム RNA (配列番号 1 2 ) の部分塩基配列である配列 番号 1〜1 1に示す配列を基準として定めることもできる。 JFH 1株の全長ゲノ ム RNA (JFH- 1クローン由来） （配列番号 1 2 ) の 「5'非翻訳領域」 は、 配列番号
1に示す塩基配列からなる。 また、 「coreタンパク質コード配列」 は配列番号 2 に示す塩基配列からなる。 「E1タンパク質コード配列」 は、 配列番号 3に示す塩 基配列からなる。 「E2タンパク質コード配列」 は、 配列番号 4に示す塩基配列か らなる。 「NS2タンパク質コード配列」.'は、 配列番号 5に示す塩基配列からなる。 「NS3タンパク質コード配列」 は、 配列番号 6に示す塩基配列からなる。 「NS4A タンパク質コード配列」 は、 配列番号 7に示す塩基配列からなる。 「NS4Bタンパ ク質コード配列」 は、 配列番号 8に示す塩基配列からなる。 「NS5Aタンパク質コ ード配列」 は、 配列番号 9に示す塩基配列からなる。 「NS5Bタンパク質コード配 歹 IJ」 は、 配列番号 1 0に示す塩基配列からなる。 「3'非翻訳領域」 は、 配列番号 1 1に示す塩基配列からなる。
例えば、 HCV由来の RNA配列中の領域又は部位は、 その RNA配列を酉己列番号 1〜 1 2に示す塩基配列に対してアラインメントし、 配列番号 1〜1 2の配列中の塩 基番号を基準として定めてもよい。 このようなアラインメントにおレヽては、 配列 間でギャップ、 付加、 欠失、 置換等が存在していてもよい。
本発明のさらなる好適な実施形態では、 本発明の全長 HCVレブリコン RNAに含ま れる 5'非翻訳領域、 coreタンパク質コード配列、 E1タンパク質コード配列、 E2タ ンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタン z ク質コード 配列、 NS5Bタンパク質コード配列、 及び 3'非翻訳領域が、 それぞれ酉己列番号 1〜 1 1に示す塩基配列を有することが好ましい。
本発明に係る全長 HCVレプリコン RNAの好適な実施形態は、 配列番号 1〜 1 1に 示す塩基配列と、 少なくとも 1つの選択マーカー遺伝子及ぴ Z又はリポーター遺 伝子と、 少なくとも 1つの IRES配列と、 からなるレプリコン RNAである。
本発明において 「選択マーカー遺伝子」 とは、 その遺伝子が発現された細胞だ けが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。 選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙 られる。 本 発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、 ネオマイシン耐性遺伝子、 チミジンキナーゼ遺伝子、 カナマイシン耐性遺伝子、 ピリチアミン耐性遺伝子、 アデ二リルトランスフェラーゼ遗伝子、 ゼォシン耐性遺伝子、 ピュー口マイシン 耐性遺伝子などが挙げられるが、 ネオマイシン耐性遺伝子、 チミジンキナーゼ遺 伝子が好ましく、 ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。 但し本発明におけ る選択マーカ一遺伝子はこれらに限定されるものではない。
また本発明において 「リポーター遺伝子」 とは、 その遺伝子発現の指標となる. 遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。 リポーター遺伝子の一般的 な例としては、 発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。 本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、 トランスポゾン Tn9由来 のクロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、 大腸菌由来の βグ ルクロニダーゼ若しくは ガラクトシダーゼ遺伝子、 ルシフェラーゼ遺伝子、 緑 色蛍光タンパク質遺伝子、 クラゲ由来のェクオリン遺伝子、 分泌型胎盤アルカリ フォスファターゼ （SEAP) 遺伝子等が挙げられる。 但し本発明におけるリポータ 一遺伝子はこれらに限定されるものではない。
上記の選択マーカー遺伝子やリポーター遺伝子は、 全長 HCVレプリコン RNA中に どちらか一方のみが含まれていてもよいし、 両方が含まれていてもよい。 選択マ 一力一遺伝子又はリポーター遺伝子は、 全長 HCVレプリコン RNAに 1つ含まれてい てもよいし、 2つ以上含まれていてもよい。
本発明にお.ける 「IRES配列」 とは、 RNAの内部にリボソームを結合させて翻訳 を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。 本発明における IRES配列の好適な例としては、 以下に限定するものではないが EMCV IRES (脳心 筋炎ゥィルスの内部リボゾーム結合部位) 、 FMDV IRES, HCV IRES, 等が挙げら れるが、 EMCV IRES, 及び HCV IRESがより好ましく、 EMCV IRESが最も好ましい。 本発明に係る全長 HCVレプリコン RNAのさらに好ましい 1つの実施形態は、 配列 番号 1 3に示す塩基配列からなる RNAである。 さらに、 この配列番号 1 3に示す 塩基配列において、 1〜1 0 0個、 好ましくは 1〜3 0個、 より好ましくは 1〜 1 0個、 さらに好ましくは 1〜6個、 最も好ましくは 1〜数個 （2〜5個） の塩 基が欠失、 置換又は付加された塩基配列からなる RNAであって、 かつ、 自律複製 能及ぴウィルス粒子産生能を有する RNAも、 好適な実施形態として本発明の全長
HCVレプリコン RNAの範囲に含まれる。
本発明に係る全長 HCVレプリコン RNAは、 その全長 HCVレプリコン RNAを導入する 細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子をコードする RNAをさらに含んでもよレ、。 外来遺伝子をコードする RNAは、 5'非翻訳領域の下流に連結してもよいし、 選択 マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子の上流又は下流に連結させてもよいし
3'非翻訳領域の上流に連結してもよい。 また、 coreタンパク質コード配列、 E1タ ンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード配歹【J、 NS3 タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタンパク質コー ド配列 NS5Aタンパク質コード配列、 及び NS5Bタンパク質コード配列のいずれかの に揷 入してもよい。
外来遺伝子をコードする RNAを含む全長 HCVレプリコン RNAは、 導入された細胞 内で翻訳される際に、 該外来遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現することが できる。 従って外来遺伝子をコードする RNAを含む全長 HCVレプリコン RNAfま、 外 来遺伝子の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする場合にも、 好適に 使用することができる。
本発明に係る全長 HCVレプリコン RNAは、 リポザィムを含んでいてもよい。 全長 HCVレプリコン RNA中の選択マーカー遺伝子及び Z又はリポーター遺伝子の下流に リボザィムを連結しておき、 そのリボザィムの自己切断活性によって、 選抚マー カー遺伝子及び/又はリポーター遺伝子が、 IRES配列、 coreタンパク質コード配 列、 E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード 配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタン z、。ク質 コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列、 及び 3'非 翻訳領域から切り離されるようにすることもできる。
本発明に係る全長 HCVレプリコン RNAにおいては、 上述したような選択マーカー 遺伝子及び/若しくはリポーター遺伝子、 ウィルスタンパク質をコードする配列、 並びに外来遺伝子又はリボザィム等が、 全長 HCVレプリコン RNAから正しい読み枠 で翻訳されるように連結される。 全長 HCVレプリコン RNAにコードされるタンパク 質は、 一続きのポリべプチドとして翻訳され発現された後でプロテアーゼ こよつ て各タンパク質へと切断され、 遊離するように、 プロテアーゼ切断部位等を介し て互いに連結させることが好ましい。
本発明はまた、 本願発明のレプリコン RNAをコードする DNAベクター、 好ましく は発現ベクターにも関する。
なお、 本発明において RNAが 「自律複製能を有する」 とは、 RNAを細胞中 こ導入 したときに、 その RNAが自己増殖することを意味する。 限定するものではないが RNAの自律複製能は、 例えば、 対象とする RNAを Huh7細胞中にトランスフ クショ ンし、 その Huh7細胞を培養し、 得られる培養物中の細胞から抽出した RNAJこつい て、 導入した RNAを特異的に検出可能なプローブを用いたノーザンブロッ トハイ プリダイゼーシヨンにより RNAを検出することによって、 確認することができる 自律複製能を確認するための具体的な操作は、 本明細書の実施例に記載されたコ ロニー形成能の測定、 HCVタンパク質の発現確認、 レプリコン RNAの検出筝の記載 に例示されている。
さらに本発明において、 RNAが 「ウィルス粒子産生能を有する」 とは、 その RNA を細胞 （例えば、 Huh7細胞などの培養細胞） に導入したときに、 該細胞中でウイ ルス粒子が産生されることを意味する。 ウィルス粒子産生能は、 例えば、 対象と する RNAを導入した細胞の培養上清について、 その RNAに特異的なプライマーを用 いた RT- PCR法での検出を行う方法、 又はその培養上清をショ糖濃度勾配 にかけ てウィルス粒子を分離し、 HCVタンパク質を検出する方法などにより、 確認する ことができる。 これらの具体的な操作は、 本明細書の実施例に記載されだコロニ 一形成能の測定、 HCVタンパク質の発現確認、 レプリコン RNAの検出等の記載に例 示されている。
2 . 全長 HCVレプリコン RNAの作製
本発明に係る全長 HCVレプリコン RNAは、 当業者に公知である任意の遺伝子工学 的手法を用いて作製することができる。 限定するものではないが、 全長 HCVレプ リコン RNAは、 例えば遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルスとして JFH-1株を用いる場合 には以下のような方法で作製することができる。
まず、 JFH- 1株のゲノム全領域の RNA (配列番号 1 2 ) に対応する DNA (この配 列は、 国際 DNAデータバンクにァクセッション番号 AB047639として登録されてい る） を、 常法により再構築して RNAプロモーターの下流に挿入して、 DNAク ローン を作製する。 ここで、 「RNAに対応する DNA」 とは、 当該 RNAの塩基配列のひ （ゥラ シル） を T (チミン） に置き換えた塩基配列からなる DNAを意味する。 前記 RNAプ 口モーターは、 プラスミ ドクローン中に含まれるものであることが好ましい。 好 適な RNAプロモーターとしては、 限定するものではないが、 T7 RNAプロモーター、 SP6 RNAプロモーター、 SP3 RNAプロモーターが挙げられるが、 T7 RNAプロモータ 一が特に好ましい。
次に、 選択マーカー遺伝子及び Z又はレポーター遺伝子、 並びに IRES配列をコ ードする DNAを上記 DNAクローンに挿入する。 5'非翻訳領域の下流に、 選択マーカ 一遺伝子及ぴ Z又はレポーター遺伝子を、 さらにその下流に IRES配列を、 揷入す ることが好ましい。
次いで、 以上のようにして作製された DNAクローンを铸型として、 RNAポリメラ ーゼにより RNAを合成する。 RNA合成は、 5'非翻訳領域から、 常法により 開始させ ることができる。 DNAクローンがプラスミ ドクローンの場合には、 プラスミ ドク ローンから制限酵素によって切り出した DNA断片を鍚型として用いて RNAを合成す ることもできる。 なお、 合成される RNAの 3'末端がウィルスゲノム RNAの 3'非翻訳 領域の末端と一致しており、 他の配列が付加されたり削除されたりしないことが 好ましい。 このようにして合成される RNAが、 本発明に係る全長 HCVレプリコン RNAである。 ·
3 . HCV粒子の作製
上記のようにして作製される全長 HCVレプリコン RNAを細胞に導入することによ り、 全長 HCVレブリコン RNAを複製することができ、 好ましくは持続的に複製する ことができる （すなわち、 レブリコン RNAの複製能を有する） 組換え細胞を得る ことができる。 本明細書では、 全長 HCVレブリコン RNAを複製している組換え細胞 を 「全長 HCVレブリコン RNA複製細胞」 と称する。
この全長 HCVレプリコン RNA複製細胞は、 ウィルス粒子を産生することができる。 産生されたウィルス粒子は、 HCVのウィルスタンパク質から構成される ウィルス 殻中に全長 HCVレプリコン RNAを含有する。 従って本発明の全長 HCVレプリコン RNA 複製細胞から産生されるウィルス粒子は、 HCV粒子である。 すなわち本発明では、 全長 HCVレプリコン RNA複製細胞を培養することにより、 HCV粒子を細胞培養系に て作製することができる。 好ましくは、 全長 HCVレブリコン RNA複製細胞を培養し、 その培養物 （好ましくは培養上清） 中に産生されたウィルス粒子を採取すること により、 HCV粒子を取得することができる。
あるいは、 HCV粒子は、 全長 HCVゲノム RNAを導入して得られる組換え細胞によ つても産生される。 本発明に係る全長 HCVゲノム RNA (好ましくは JFH - 1クローン 由来の全長 HCVゲノム RNA、 より好ましくは配列番号 1 2に示す塩基配列を有する RNA) を導入した細胞では、 その全長 HCVゲノム RNAが髙効率で複製される。 本明 細書では、 全長 HCVゲノム RNAを複製している組換え細胞を 「全長 HCVゲノム RNA複 製細胞」 と称する。 この全長 HCVゲノム RNA複製細胞によって産生されるウィルス 粒子は、 HCVのウィルスタンパク質から構成されるウィルス殻中に全長 HCVゲノム RNAを含有する。 すなわち、 本発明の全長 HCVゲノム RNAを導入した細胞から産生 されるウィルス粒子は、 HCV粒子である。 限定するものではないが、 好ましくは、 JFH-1クローン由来の全長 HCVゲノム RNA (例えば、 配列番号 1 2に示す塩基配列 を有する RNA) を導入した細胞を培養することによって、 HCV粒子を細胞培養系に て作製することができる。 例えば、 全長 HCVゲノム RNA (例えば、 配列番号 1 2に 示す塩基配列を有する RNA) を導入した細胞を培養し、 その培養物 （好ましくは、 培養上清） 中に産生された HCV粒子を採取することにより、 HCV粒子を取得するこ とができる。
上記の全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNAを導入する細胞としては、 継代培養することが可能な細胞であれば任意の細胞を用いることができるが、 真 核細胞であることが好ましく、 ヒト細胞であることがより好ましく、 ヒ ト肝由来 細胞、 ヒ ト子宮頸由来細胞、 又はヒ ト胎児腎由来細胞であることがさらに好まし い。 これらの細胞としては、 癌細胞株や幹細胞株などを含む増殖性細胞が好まし く、 Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY- N9細胞、 HeLa細胞、 又は 293細胞等がさらに好ま しい。 これらの細胞は、 市販のものを利用してもよいし、 細胞寄託機関から入手 して使用してもよいし、 任意の細胞 （例えば癌細胞又は幹細胞） から株化した細 胞を使用してもよい。
全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNAの細胞内への導入は、 当業者には 公知の任意の技術を使用して行うことができる。 そのような導入法としては、 例 えば、 エレク ト口ポレーシヨン、 パーティクルガン法、 リポフエクシヨン法、 リ ン酸カルシウム法、 マイクロインジェクション法、 DEAEセファロース法等が挙げ られるが、 エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNAは、 単独で導入してもよいし、 他. の核酸と混合させたものを導入してもよい。 導入する RNA量を一定にしながら全 長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNAの導入量を変更したい場合には、 所望 の導入量の全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNAを、 導入する細胞から抽 出したトータル細胞性 RNAと混合して一定の RNA総量とし、 それを細胞内導入に用 いればよい。 細胞内導入に用いるレプリコン RNAの量は、 使用する導入法に応じ て決めればよいが、 好ましくは 1ピコグラム〜 1 0 0マイクログラム、 より好ま しくは 1 0ピコグラム〜 1 0マイクログラムの量を使用する。
全長 HCVレプリコン RNA複製細胞は、 全長 HCVレプリコン RNAに含まれる選択マー カー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現を利用して、 選択することができる。 具 体的には、 例えば、 そのような全長 HCVレプリコン RNAの細胞内導入処理を施した 細胞を、 選択マーカー遺伝子の発現により選択可能となる培地において培養すれ ばよい。 あるいは、 そのような全長 HCVレプリコン RNAの細胞内導入処理を施した 細胞を培養した後、 リポーター遺伝子 （例えば、 蛍光タンパク質） の発現につい て検出すればよい。
一例として、 全長 HCVレプリコン RNAにネオマイシン耐性遗伝子が選択マーカー 遺伝子として含まれる場合には、 その全長 HCVレプリコン RNAを用いてエレクトロ ポレーシヨン処理した細胞を培養ディッシュに播種し、 1 2〜7 2時間、 好まし くは 1 6〜4 8時間培養した後に、 培養ディッシュに G418 (ネオマイシン） を
0. 05ミリグラム/ミリ リツトル〜 3. 0ミリグラム/ミリリツトルの濃度で添加し、 その後、 週に 2回培養液を交換しながら培養を継続し、 播種時から好ましくは 1
0日間〜 4 0日間、 より好ましくは 1 4日間〜 2 8日間培養した後にクリスタル
' バイオレットで生存細胞を染色することにより、 導入された全長 HCVレブリコン RNAが複製されている細胞を、 コロニーとして選択することができる。
形成されたコロニーからは、 常法により細胞をクローン化することができる。 こうして得られる全長 HCVレプリコン RNAを複製している細胞クローンを、 本明細 書では 「全長 HCVレプリコン RNA複製細胞クロ一ン」 と称する。 本発明の全長 HCV レプリコン RNA複製細胞は、 全長 HCVレプリコン RNA複製細胞クローンを包含する。 全長 HCVレプリコン RNA複製細胞については、 複製された全長 HCVレプリコン RNA を検出し、 全長 HCVレプリコン RNA中の選択マ一カー遺伝子又はリポーター遺伝子 が細胞の宿主ゲノム DNAに組み込まれていないことを確認し、 さらに HCVタンパク 質の検出を行うことにより、 実際に該細胞又は細胞クローンが全長 HCVレプリコ ン RNAを複製していることを確認することができる。
複製された全長 HCVレプリコン RNAの検出は、 当業者には公知の任意の RNA検出 法に従って行えばよいが、 例えば、 細胞から抽出したトータル RNAについて、 導 入された全長 HCVレプリコン RNAに対して特異的な DNA断片をプローブとして用い るノーザンハイブリダィゼーション法を実施することにより検出することができ る。 · また全長 HCVレプリコン RNA中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子が細 胞の宿主ゲノム DNAに組み込まれていないことの確認は、 限定するものではない 1S 例えば、 細胞から抽出したゲノム DNAについて該選択マーカー遺伝子又はリ ポーター遺伝子の少なくとも一部を増幅する PCRを行い、 その増幅産物の有無を 確認することによって行うことができる。 増幅産物が確認された細胞では、 宿主 ゲノム中に選択マーカー遺伝子又はリボータ一遺伝子が組み込まれていると判断 されることから、 全長 HCVレプリコン RNA自体は複製されていない可能性がある。 この場合、 全長 HCVレプリコン RNAが複製されているか否かを、 次に説明する HCV タンパク質の検出によって、 さらに確認することができる。
HCVタンパク質の検出は、 例えば、 導入された全長 HCVレプリコン RNAから発現 されるべき HCVタンパク質に対する抗体を、 細胞から抽出したタンパク質と反応 させることによって行うことができる。 この方法は、 当業者には公知の任意のタ ンパク質検出法によって行うことができるが、 具体的には、 例えば、 細胞から抽 出したタンパク質試料を二トロセルロース膜にブロッティングし、 それに対して 抗 HCVタンパク質抗体 （例えば、 抗 NS3特異的抗体、 又は C型肝炎患者から採取し た抗血清） を反応させ、 さらにその抗 HCVタンパク質抗体を検出することによつ て行うことができる。 細胞から抽出したタンパク質中から HCVタンパク質が検出 されれば、 その細胞は、 全長 HCVレプリコン RNAを複製し、 HCVタンパク質を発現 しているものと判断することができる。 本発明の全長 HCVレプリコン RNA複製細胞又は全長 HCVゲノム RNA複製細胞のウイ ルス粒子産生能は、 当業者には公知の任意のウィルス検出法に従つて確認すれば よい。 例えば、 ウィルス粒子を産生していると思われる細胞の培養上清をショ糖 密度勾配により分画し、 各分画の密度、 HCVコアタンパク質濃度、 及ぴ全長 HCVレ プリコン RNA若しくは全長 HCVゲノム RNAの量を測定した結果、 HCVコアタンパク質 と全長 HCVレプリコン RNA若しくは全長 HCVゲノム RNAのピークが一致し、 しかもそ のピークが検出される画分の密度が、 培養上清を 25% NP40 (ポリオキシェチレ ン（9)才クチノレフ工ニノレエーテノレ [Polyoxyethylene (9) Octylphenyl Ether] ) で処 理してから分画した場合の同画分の密度と比較して軽い （例えば、 1. 18〜： L. 20 mg) 場合には、 該細胞はウィルス粒子産生能を有すると判定することができる。 培養上清中に放出された HCVウィルス粒子は、 例えば、 coreタンパク質、 E1タ ンパク質、 又は E2タンパク質に対する抗体を用いて検出することもできる。 また、 培養上清中の全長 HCVレプリコン RNAを、 特異的プライマーを用いた RT- PCR法によ り増幅して検出することによって、 HCVウィルス粒子の存在を間接的に検出する こともできる 9
4 . 本発明の HCV粒子の他の細胞への感染
本発明の HCVウィルス粒子は、 細胞 （好ましくは HCV感受性細胞） への感染能を 有する。 本発明は、 全長 HCVレブリコン RNA複製細胞又は全長 HCVゲノム RNA複製細 胞を培養し、 得られた培養物 （好ましくは、 培養上清） 中のウィルス粒子を他の 細胞 （好ましくは HCV感受性細胞） に感染させることを含む、 C型肝炎ウィルス 感染細胞を製造する方法にも関する。 本発明において、 HCV感受性細胞とは、 HCV に対し感染性を有する細胞であり、 好ましくは肝臓細胞またはリンパ球系細胞で あるが、 これらに限定されるものでは無い。 具体的には、 肝臓細胞としては初代 肝臓細胞や、 Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY- N9細胞、 HeLa細胞、 203細胞などが挙げ られ、 リ ンパ球系細胞としては Molt4細胞や、 HPB-Ma細胞、 Daudi細胞などが挙げ られるが、 これらに限定されるものでは無い。
本発明の全長 HCVレプリコン RNA複製細胞において産生された HCV粒子を細胞
(例えば、 HCV感受性細胞） に感染させると、 その感染細胞中では全長 HCVレプリ コン RNAが複製され、 さらにウィルス粒子が形成される。 全長 HCVレプリコン RNA 複製細胞において産生されたウィルス粒子に感染した細胞は、 選択マ一力一遺伝 子及び/又はリポーター遺伝子を発現するので、 その発現を利用して選択及ぴ/ 又は検出することが可能である。 本発明の全長 HCVレプリコン RNA複製細胞におい て産生されたウィルス粒子を細胞に感染させることにより、 全長 HCVレプリコン RNAが細胞内で複製され、 ウィルス粒子をさらに製造することができる。
さらに、 本発明の全長 HCVゲノム RNA複製細胞において産生された HCV粒子を細 胞 （例えば、 HCV感受性細胞） に感染させることにより、 その感染細胞中で全長 HCVゲノム RNAが複製され、 ウィルス粒子が形成される。 本発明の全長 HCVゲノム RNA複製細胞において産生されたウィルス粒子を細胞に感染させることにより、 全長 HCVゲノム RNAが細胞内で複製され、 ウィルス粒子をさらに製造することがで さる。
本発明の全長 HCVレプリコン RNA複製細胞又は全長 HCVゲノム RNA複製細胞におい て産生された HCVゥィルス粒子は、 チンパンジ一などの I-ICVウィルスに感染しうる 動物に感染して、 HCV由来の肝炎を引き起こすことができる。
5 . 本発明の他の実施形態
本発明の全長 HCVレプリコン RNA複製細胞では、 全長 HCVレプリコン RNAが高効率 で複製される。 また本発明の全長 HCVゲノム RNA複製細胞でも、 全長 HCVゲノム RNA が高効率で複製される。 従って、 本発明の全長 HCVレブリコン RNA複製細胞又は全 長 HCVゲノム RNA複製細胞を用いて、 全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNA を高効率で製造することができる。
本発明では、 全長 HCVレブリコン RNA複製細胞を培養し、 培養物 （培養細胞及び
Z又は培養培地） から RNAを抽出し、 それを電気泳動法にかけ、 分離された全長 HCVレプリ コン RNAを単離精製することによって、 全長 HCVレプリコン RNAを製造す ることができる。 全長 HCVゲノム RNA複製細胞を用いた場合にも、 同様の方法で全 長 HCVゲノム RNAを製造することができる。 このようにして製造される RNAは、 C 型肝炎ウィルスの全長ゲノム配列を含む。 この場合、 C型肝炎ウィルスの全長ゲ ノム配列は、 選択マーカー遺伝子及び/又はリポーター遺伝子並びに IRES配列に よって分断されていてもよい。 C型肝炎ウィルスの全長ゲノム配列を含む RNAの 製造方法が提供されることにより、 C型肝炎ウィルスゲノムに関してより詳細な 分析が可能となる。
さらに本発明の全長 HCVレブリコン RNA複製細胞又は全長 HCVゲノム RNA複製細胞 は、 HCVタンパク質を製造するために好適に使用することができる。 HCVタンパク 質の製造は、 当業者に周知の任意の方法によって行えばよいが、 例えば、 全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNAを細胞に導入して組換え細胞を作製し、 該組換え細胞を培養し、 得られる培養物 （培養細胞及び Z又は培養培地） から常 法によりタンパク質を回収することによって行えばよい。
また本発明の HCVウィルス粒子は、 肝細胞指向性を有しうる。 そのため本発明 の全長 HCVレプリコン RNAを使用して、 肝細胞指向性ウィルスベクターを製造する ことができる。 このウィルスベクターは、 遺伝子治療用に好適に用いられる。 本 発明では、 外来遺伝子をコードする RNAを全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノ ム RNAに組み込み、 その RNAを細胞に導入することにより、 該外来遺伝子を細胞中 に導入し、 細.胞内で複製させ、 さらに発現させることができる。 さらに、 全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNA中の E1タンパク質コード配列、 及ぴ 又 は E2タンパク質コード配列を、 他の生物種由来のウィルスの外殻タンパク質に変 換した RNAを作製することにより、 その RNAを様々な生物種の細胞に感染させるこ とも可能となる。 この場合にも、 全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNAに さらに外来遺伝子を組み込んで、 それを、 該外来遺伝子を肝細胞で発現させるた めの肝細胞指向性ウィルスベクターとして使用することができる。
本発明は、 配列番号 1 2に示す塩基配列からなる RNAに外来遺伝子をコードす る RNAを揷入し、 それを細胞に導入し、 その細胞を培養してウィルス粒子を産生 させることを含む、 外来遺伝子を含有するウィルスベクターを製造する方法にも 関する。
本発明は、 本発明に係る HCV粒子又はその一部分をワクチン抗原として含有す る C型肝炎ワクチン、 及ぴ本発明に係る HCV粒子又はその一部分を抗原として用 いて C型肝炎ワクチンを製造する方法も、 提供する。
具体的には、 作製された HCV粒子を直接ワクチンとして使用することもできる し、 当該分野で既知の方法により弱毒化または不活化して用いることもできる。 例えば、 調製した HCV粒子を、 カラムクロマトグラフィー、 ろ過、 遠心等により 精製することにより、 HCVワクチン原液を得た後、 かかる原液から、 弱毒生 HCVヮ クチンあるいは不活化 HCVワクチンを調製すればよい。 尚、 ウィルスの不活化は、 ホルマリン、 β一プロピオラタ トン、 ダルタルジアルデヒ ド等の不活化剤を、 例 えば、 ゥィルス浮遊液に添加して混合し、' ウィルスと反応させることによって達 成するこ と力 sでき る ( Appaiahgari et al. , Vaccine, (2004) 22 (27 - 28)， p.3669-3675) 。
本発明のワクチンの製造には、 HCVレプリコン RNAに公知の技術を用いて変異を 導入し病原性を原弱もしくは消失させたものを使用することも可能である。
本発明のワクチンは、 溶液または懸濁液のいずれかとして、 投与可能に調製さ れる。 液体中の溶解または懸濁に適した固形物の形態で調製することができる。 調製物は乳濁され、 またはリボソームにカプセル化され得る。 HCV粒子などの活 性免疫原性成分は、 医薬上許容される、 活性成分に適合した賦形剤がしばしば混 合される。 適^な賦形剤には、 例えば、 水、 生理食塩水、 デキス トロース、 ダリ セロール、 エタノールなど、 およびそれらの混合物がある。 さらに、 所望であれ ば、 ワクチンは、 少量の補助剤 （例えば加湿剤または乳化剤） 、 pH緩衝剤、 お よび/またはワクチンの効能を高めるアジュバントを含有し得る。 有効であり得 るアジュパントの例は、 限定されないが、 以下を包含する。 水酸化アルミニウム、 N—ァセチル一ムラミル一 L—トレォニノレ一 D—イソグルタミン ( t h r一 MD P) 、 N—ァセチルーノル一ムラミル一 Lーァラニル一 D—ィソグルタミン (C G P 1 1 6 3 7、 n o r— MD Pと称せられる) 、 N—ァセチルムラミル一 L— ァラニルー D—ィソグルタミ二ルー Lーァラニン一 2 - ( 1 ' 一 2 ' 一ジパルミ トイノレ一 s n—グリセロ ー 3—ヒ ドロキシホスホリノレォキシ) ーェチルァミン (CGP 1 9835A、 MTP— PEと称せられる） 、 および R I B I。 R I B
Iは、 パクテリァから抽出した 3成分、 すなわちモノホスホリルリピド A、 トレ ハロースジミコレート、 および細胞壁骨格 （HP L + TDM+CWS) を 2%ス クアレン/ Twe e n (登録商標） 80ェマルジヨン中に含有している。 アジュ バントの効能は、 HCV粒子から構成されるワクチンを投与することにより生じ るこの免疫原性 HCV粒子に対する抗体の量を測定することにより、 決定され得る。 本ワクチンは、 通常非経口的に、 例えば皮下注射または筋内注射のような注射 により投与される。 他の投与経路に適した別の剤形として、 坐薬、 および場合に より経口製剤が挙げられる。
所望により、 アジュバント活性を有する 1以上の化合物を HCVワクチンに加える ことができる。 アジュバントは、 該免疫系の非特異的刺激因子である。 それらは、 HCVワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。 当技術分野で公知のアジュバ ントの具体例としては、 フロイント完全および不完全アジュバント、 ビタミン E、 非イオンブロック重合体、 ムラミルジペプチド、 サポニン、 鉱油、 植物油および Carbopolが挙げられる。 粘膜適用に特に適したアジュバントとしては、 例えば、 大腸菌 （E. coli) 易熱性毒素 （LT) またはコレラ （Cholera) 毒素 （CT) が挙げ られる。 他の適当なアジュバントとしては、 例えば、 水酸化アルミニウム、 リン 酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、 油性乳剤 （例えば、 Bayol (登録商 標） または Marcol 52 (登録商標） のもの） 、 サポニンまたはビタミン Eソリュビ Vゼートが挙げられる。 好ましい形態においては、 本発明のワクチンはアジュバ ントを含む。
例えば、 皮下、 皮内、 筋肉内、 静脈内に投与する注射剤において、 本発明の HCVワクチンとともに含められる医薬上許容される担体または希釈剤の他の具体 例としては、 安定化剤、 炭水化物 (例えば、 ソルビトール、 マンニトール、 デン プン、 ショ糖、 グルコース、 デキストラン) 、 アルブミンまたはカゼィンなどの タンパク質、 ゥシ血清または脱脂乳などのタンパク質含有物質、 およびバッファ 一 (例えば、 リン酸バッファー） などが挙げられる。
坐薬に使用される従来の結合剤およぴ担体には、 例えば、 ポリアルキレンダリ コールまたはトリグリセリ ドが包含され得る。 坐薬は、 活性成分を 0 . 5 %から 5 0 %までの範囲で、 好ましくは 1 %から 2 0 %までの範囲で含有する混合物か ら形成することができる。 経口製剤は、 通常用いられる賦形剤を含有してもよレ、。 この賦形剤としては、 例えば、 製薬等級のマンニトール、 ラタ トース、 デンプン、 ステアリン酸マグネシウム、 サッカリンナトリウム、 セルロース、 炭酸マグネシ ゥムなどが挙げられる。 本発明のワクチンは、 溶液、 懸濁液、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 持続放出製剤、 または粉剤の剤形をとることができ、. 1 0 %〜 9 5 %、 好ましくは 2 5 %〜 7 0 %の活性成分 （ウィルス粒子又はその一部分） を含有する。
本ワクチンは、 投与剤形に適した方法で、 そして予防および/または治療効果 があるような量で投与される。 投与されるべき量は、 通常 1回の投与当たり抗原 を 0 . から 1 0 0， 0 0 0 gまでの範囲であり、 これは、 処置される 患者、 その患者の免疫系での抗体合成能、 および所望の防御の程度に依存し、 経 口、 皮下、 皮内、 筋肉内、 静脈内経路などの投与経路にも依存する。
本ワクチンは、 単独投与スケジュールで、 または好ましくは複合投与スケジュ ールで与えられ得る。 複合投与スケジュールでは、 接種の開始時期に 1〜 1 0回 の個別の投与を行い、 続いて免疫応答を維持するおよびまたは強化するのに必要 とされる時間間隔で、 例えば 2回目の投与として 1〜4力月後に、 別の投与を行 い得る。 必要であれば、 数ケ月後に引続き投与を行い得る。 投与レジメもまた、 少なくとも部分的には、 個々の患者の必要性により決定され、 医師の判断に依存 する。
さらに、 免疫原性 H C V粒子を含有するワクチンは、 他の免疫制御剤 （例えば、 免疫グロブリン） と共に投与してもよい。
HCV粒子ワクチンは、 健常人に投与して、 健常人に HCVに対する免疫応答を誘導 することにより、 新たに生じ得る HCV感染に対して予防的に使用することもでき る。 更に、 HCV粒子ワクチンを HCVに感染した患者に投与し、 生体内に HCVに対す る強い免疫反応を誘導することにより、 HCVを排除する治療的ワクチンとして使 用することもできる。
本発明の全長 HCVレプリコン RNA複製細胞又は全長 HCVゲノム RNA複製細胞、 又は それらの細胞において産生されるゥィルス粒子を感染させた C型肝炎ゥィルス感 染細胞を、 例えば C型肝炎ウィルスの複製、 ウィルス粒子の再構築、 ウィルス粒 子の放出を促進又は抑制する物質 (抗 C型肝炎ウィルス物質) をスクリーニング するための試験系として使用することもできる。 具体的には、 例えば、 被験物質 の存在下でそれらの細胞を培養し、 得られる培養物中の全長 HCVレプリコン RNA若 しくは全長 HCVゲノム RNA又はウィルス粒子を検出し、 その被験物質がレプリコン RNA若しくは全長 HCVゲノム RNAの複製又はウィルス粒子の形成若しくは放出を促 進又は抑制するかどうかを判定することにより、 C型肝炎ウィルスの増殖を促進 又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。 この場合、 培養物中の全 長 HCVレプリコン RNA若しくは全長 HCVゲノム RNAの検出は、 上記細胞から抽出した RNA中の全長 HCVレプリコン RNA若しくは全長 HCVゲノム RNAの量、 割合若しくは有 無を測定することによるものであってよい。 培養物 （主として培養上清） 中のゥ ィルス粒子の検出は、 培養上清中に含まれる HCVタンパク質の量、 割合若しくは 有無を検出するものであってよい。
また本培養物中のウィルス粒子を検出することにより、 H C V感染患者血清か ら精製した免疫グロプリンが本発明による H C Vウィルス粒子の感染を阻止する 能力を有するかどうかを検討することができる。 この試験においては、 本発明の H C Vウィルス粒子により免疫したマウス、 ラット、 ゥサギなどの血清を用いて も良い。 H C Vの部分蛋白質、 H C V遺伝子などによる免疫を利用してもよい。 抗体分子以外の、 感染を阻止できる他の物質についても、 この試験を同様に適用 することができる。
本発明の H C Vウィルス粒子に対して産生される本発明の抗体には、 ポリクロ ーナル抗体およびモノクローナル抗体を包含する。 ポリクローナル抗体が望まし い場合、 まず、 選択された哺乳類 （例えば、 マウス、 ゥサギ、 ャギ、 ヒッジ、 ゥ マなど） を、 本発明の H C V粒子で免疫感作する。 感作動物由来の血清を採集し、 既知の手法に従って処理する。 H C Vェピトープに対するポリクローナル抗体を 含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合には、 このポリクローナル 抗体をィムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製すればよい。 ポリク 口一ナル抗血清を産生させる方法およびそれを処理する方法は当該分野で既知で ある。 ポリクローナル抗体は、 既に H C Vに感染した哺乳類から単離してもよい。
H C Vェピトープに対するモノクローナル抗体もまた、 当業者により容易に製 造され得る。 モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマを製造する一般的な 方法は、 周知である。 例えば、 Current Protocols in Immunology (John Wiley
& Sons, Inc. )に記載された方法を用いることができる。
ΐノクローナル抗体産生細胞株は、 細胞融合により生成してもよく、 また、 腫 瘍遺伝子 D N Aによる Bリンパ球の直接形質転換または E p s t e i n— B a r r ウィルスでの形質移入のような他の方法によっても生成してもよい。
これらの方法によって得られたモノクローナル抗体や、 ポリクローナル抗体は、 HCVの診断や治療、 予防に有用である。
本発明の HCV粒子を用いて作製された抗体は、 医薬上許容される、 溶解剤、 添 加剤、 安定化剤、 バッファーなどともに投与される。 投与経路は、 いずれの投与 経路でも良いが、 好ましくは、 皮下、 皮内、 筋肉内投与であり、 より好ましくは、 静脈内投与が好ましい。
本発明の全長 HCVレプリコン RNA複製細胞又は全長 HCVゲノム RNA複製細胞におい て産生された HCV粒子と HCV感受性細胞とを、 HCVの細胞への結合を促進又は抑制 する物質をスクリーユングするための試験系として使用することもできる。 具体 的には例えば、 被験物質の存在下で、 本発明の全長 HCVレブリコン RM複製細胞に おいて産生された HCV粒子とともに HCV感受性細胞を培養し、 得られる培養物中の 全長 HCVレプリコン RNA又はウィルス粒子を検出し、 その被験物質がレプリコン RNAの複製又はウィルス粒子の形成を促進又は抑制するかどうかを判定すること により、 C型肝炎ウィルスの増殖を促進又は抑制する物質をスクリ一二ングする ことができる。
このような全長 HCVレプリコン RNA若しくは全長 HCVゲノム RNA又はウィルス粒子 の検出は、 上述の手法又は後述の実施例に従って行うことができる。 上記試験系 は、 C型肝炎ウィルス感染の予防剤、 治療剤若しくは診断剤の製造又は評価のた めにも使用することができる。
具体的には、 本発明の上記試験系の利用例としては以下が挙げられる。
(1) HCVの増殖及ぴ感染を抑制する物質の探索
HCVの増殖及び感染を抑制する物質としては、 例えば、 直接的若しくは間接的 に HCVの増殖及ぴ感染に影響を及ぼす有機化合物、 あるいは HCVゲノム若しくはそ の相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることにより HCVの増殖若しくは HCVタン パク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチ ド等が挙げられる。
(2) .細胞培養中で抗ウィルス作用を有する各種物質の評価 前記各種物質としては、 合理的ドラッグデザイン又はハイスループッ トスタリ 一-ングを用いて得られた物質 （例えば単離精製された酵素） 等が挙げられる。
(3) HCVに感染した患者の治療のための、 新規攻撃標的の同定
例えば HCVウィルス増殖のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質を 同定するために、 本発明に係る全長 HCVレプリコン RNA複製細胞又は全長 HCVゲノ ム RNA複製細胞を使用することができる。
(4) HCVウィルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異の 同定
(5) C型肝炎ウィルス感染の診断薬又は治療薬の開発、 製造及ぴ評価のために使 用可能な抗原としてのウィルスタンパク質の製造 '
(6) C型肝炎ウィルス感染のワクチンの開発、 製造及び評価のために使用可能な 抗原としてのウィルスタンパク質及び弱毒化 HCVの製造
(7) C型肝炎ウィルス感染の診断又は治療用のポリクローナル抗体もしくはモノ ク口ーナル抗体及びポリク口ーナル抗体の製造。 本発明を、 以下の実施例及ぴ図面に基づいてさらに具体的に説明する。 但し本 発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
[実施例 1 ] 全長 HCVゲノム RNA由来の全長 HCVレプリコン RNAの作製
(A) 発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離した C型肝炎ウィルスである JFH-1株 （遺伝子型 2a) のゲノム全長 cDNAを含む DNA (JFH-1クローン） を、 pUC19プラスミ ド中で T7 RNA プロモーター配列の下流に挿入したプラスミ ド DNAを作製した。
具体的には、 JFH- 1株のウィルス RNAを増幅した RT- PCR断片を pGEM-T EASY vector (Promega)にクローニングして pGEMト 258、 pGEM44-486、 pGEM317-849、 pGEM617- 1323、 pGEM1141- 2367、 pGEM2285- 3509、 pGEM3471- 4665、 pGEM4547- 5970、
PGEM5883- 7003、 pGEM6950_8035、 pGEM7984- 8892、 pGEM8680- 9283、 pGEM9231-
9634及び pGEM9594- 9678の各プラスミ ド DNAを得た （非特許文献 6を参照）。 各プ ラスミ ドに含まれるウィルスゲノム RNA由来の cDNAを PCR法および制限酵素を用い てつなぎ合わせて、 全長のウィルスゲノム cDNAをクローニングした。 全長のウイ ルスゲノムの上流に T7R RNAプロモーター配列を揷入した。 このようにして構築 されたプラスミ ド DNAを、 以下、 pJFHlと称する （図 1上段） 。 なお、 上記 JFH - 1 クローンの作製については、 特許文献 1及び非特許文献 3に記載されている。 ま た JFH- 1ク ローンの全長 cDNAの塩基配列は、 国際 DNAデータノ ン ク (DDBJ/EMBL/GenBank) のァクセッション番号： AB047639に登録されている。 次に、 プラスミ ド DNAである pJFHlの 5'非翻訳領域と core領域の間に、 EMCV- IRES (脳心筋炎ウィルスの内部リボゾーム結合部位） 及びネオマイシン耐性遺伝 子 (neo ； ネオマイシンホスホ トランスフェラーゼ遗伝子とも称する) を揷入し て、 プラスミド DNAである pFGREP - JFH1を構築した （図 1の下段） 。 この構築手順 は、 既報 （非特許文献 4 ) に従った。 また、 pJFHl及び pFGREP- JFH1中の NS5B領域 について、 該領域にコードされる RNAポリメラーゼの活性中心に相当するアミノ 酸モチーフ GDDを GNDに変異させる突然変異を導入して、 突然変異プラスミ ドク口 ーン pJFHl/GND、 及び pFGREP- JFH1/GNDも作製した。 突然変異クローン pJFHl/GND 及び pFGREP_JFHl/GNDは、 それにコードされる NS5Bタンパク質の活性部位のアミ ノ酸配列が変異しているため、 レブリコン RNAを複製するのに必要な活性 NS5Bタ ンパク質を発現することができない。
さらに、 レポーター遺伝子導入発現ベクターとして、 pFGREP- JFH1の 415から 420番の Mlulサイ トと 2075から 2082番の Pmelサイ トの間に/レシフェラーゼ遺伝子 を導入し、 pFGREP- JFH1のネオマイシン耐性遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に置 換した pFGREP- JFHl/Lucを作製した。 また、 pFGREP- JFHl/Lucの 10933番を Gから A に変異させ、 NS5bの RNAポリ ラーゼの活性中心の GDDモチーフを GNDに変えた変 異体 pFGREP- Jf¾l/Luc/GNDを作製した。
pFGREP- JFH1の 415から 420番の Mlulサイトと 1142から 1149番の Pmelサイ トの間 に緑色蛍光タンパク質遺伝子を導入し、 pFGREP - JFH1のネオマイシン耐性遺伝子 を緑色蛍光タンパク質遺伝子に置換した pFGREP-JRll/EGFPを作製した。 さらに、 pFGREP - JFH1/EGFPの 10000番を Gから Aに変異させ、 NS5bの RNAポリメラーゼの活性 中心の GDDモチーフを GNDに変えた変異体 pFGREP- JFH1/EGFP/GNDを作製した。
pFGREP - JFH1の 415から 420番の Mlulサイ 卜と 1982から 1989番の Pmelサイ トの間 に分泌型胎盤アル力リ性フォスファターゼ遺伝子を導入し、 pFGREP-JFHlのネオ マイシン耐性遺伝子を分泌型胎盤アル力リ性フォスファターゼ遺伝子に置換した pFGREP - JFH1/SEAPを作製した。 また、 pFGREP- JFH1/SEAPの 10840番を Gから Aに変 異させ、 NS5bの RNAポリメラーゼの活性中心の GDDモチーフを GNDに変えた変異体 pFGREP- JFH1 /SEAP/GNDを作製した。
( B ) 全長 HCVゲノ ARMと全長 HCVレプリコン RNAの作製
全長 HCVゲノム RNA合成及び全長 HCVレプリコン RNA合成に用いる铸型 DNAを作製 するために、 上記のとおり構築した発現ベクター PJFH1、 pJFHl/GND、 pFGREP- JFH1、 pFGREP- JFH1/GNDを、 それぞれ制限酵素 Xbalで切断した。 次いで、 これら の Xbal切断断片のそれぞれについて、 10〜20 §を50 1の反応液中に含有させ、 Mung Bean Nuclease 20 Uを用いて 30°Cで 30分間インキュベートすることにより、 さらに処理した。 Mung Bean Nucleaseは、 二本鎖 DNA中の一本鎖部分を選択的に 分解する反応を触媒する酵素である。 通常、 上記 Xbal切断断片をそのまま铸型と して用いて RNA合成を行うと、 Xbalの認識配列の一部である CUGAの 4塩基が 3 '末 端に余分に付加されたレプリコン RNAが合成されてしまう。 そこで本実施例では、 Xbal切断断片を Mung Bean Nucleaseで処理することにより、 Xbal切断断片から CUGAの 4塩基を除去した。 この後、 Xbal切断断片を含む Mung Bean Nuclease処理 後の溶液について、 通常法に従ったタンパク質除去処理により、 CUGAの 4塩基が 除去された Xbal切断断片を精製して、 これを铸型 DNAとした。
次に、 この鎵型 DNAから、 T7 RNAポリメラーゼを用いて RNAを in vitro合成した。 この RNA合成には Ambion社の MEGAscriptを用いた。 铸型 DNAを 0. 5〜1. 0マイクログ ラム含む反応液 20 // 1を製造業者の使用説明書に従って反応させた。
RNA合成終了後、 反応溶液に DNase ( 2 U) を添加して 37°Cで 15分間反応させた 後、 さらに酸性フエノールによる RNA抽出を行って、 鎵型 DNAを除去した。 このよ うにして pJFHl、 pJFHl/GND, pFGREP-JFHl、 pFGREP- JFH1/GNDに由来する上述の鎵 型 DNAから合成した RNAを、 それぞれ rJFHl、 rJFHl/GND、 rFGREP- JFH1、 rFGREP -
JFH1/GNDと命名した。 これらの RNAの塩基配列を、 rJFH - 1、 rFGREP- JFH1について は配列番号 1 2及ぴ 1 3、 rJFHl/GND、 rFGREP- JFH1/GNDについては配列番号 1 4 及ぴ 1 5にそれぞれ示す。 rJFHlは、 JFH-1株の全長 HCVゲノムと同じ配列構造を もつ、 本発明の全長 HCVゲノム RNAの一例である。 rFGREP-JFHlは、 本発明におけ る全長 HCVレプリコン RNAの一例である。.
続いて、 上述の通り 作製した発現ベクター pFGREP- JFHl/Luc、 pFGREP - JFHl/Luc/GND, pFGREP- JFH1/EGFP、 pFGREP- JFH1/EGFP/GND、 pFGREP-JFHl/SEAP, pFGREP- JFH1/SEAP/GNDをそれぞれ铸型として用いて、 HCVレプリコン RNAである rFGR-JFHl/Luc (配列番号 2 1 ) 、 rFGR-JFHl/Luc/GND (配列番号 2 2 ) 、 rFGR- JFH1/EGFP (配列番号 2 3 ) 、 rFGR-JFHl/EGFP/GND (配列番号 2 4 ) 、 rFGR - JFH1/SEAP (配列番号 2 5 ) 、 rFGR- JFH1/SEAP/GND (配列番号 2 6 ) を上記と同 様の方法で製造した。
[実施例 2 ] 細胞内における全長 HCVゲノム RNA複製細胞とウィルス粒子産生 ( C ) 細胞内における全長 HCVゲノム RNAの複製とウィルス粒子の産生
上記の通り合成した全長 HCVゲノム RNA (rJFHl、 rJFHl/GND) のそれぞれを、 様々な量で、 Huh7細胞から抽出したトータル細胞性 RNAと混合して、 RNA総量が 1 0 /z gとなるように調製した。 次いでその混合 RNAをエレク ト口ポレーシヨン法に より Huh7細胞に導入した。 エレク トロポレーシヨン処理を行った Huh7細胞を培養 ディッシュに播種し、 1 2時間、 2 4時間、 4 8時間及ぴ 7 2時間培養した後に、 細胞を回収して、 細胞から RNAを抽出して、 ノーザンプロッ トで解析した。 ノー ザンブロッ 卜角早析は、 Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2ηα edition, J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis著、 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)の記載に従って行った。 具体的には、 培養後の細胞から抽出した RNAを変性ァガロース電気泳動に供し、 泳動終了後に RNAをポジティブチヤ一ジナ ィ口ン膜に転写した。 pJFHlから作製した32 Pラベルした DNAまたは RNAプローブを、 前記のとおり膜に転写した RNAに対しハイプリダイゼーションさせ、 次いでその 膜を洗浄し、 それをフィルムに感光させることにより、 JFH-1クローンの全長 HCV ゲノム RNAに特異的な RNAバンドを検出した。
図 2に示すように、 rJFHl/GNDをトランスフエクシヨンした場合、 トランスフ ェクション 4時間後において、 導入した RNAバンドは弱いシグナルとして確認で きたが、 時間の経過とともにシグナルは減弱し、 2 4時間後にはほとんどパンド のシグナルが確認できなかった。 一方、 rJFHlをトランスフエクションした場合 トランスフエクシヨンの 4時間後〜 1. 2時間後には、 導入した RNAバンドのシグ ナルの強さは rJFHl/GNDを導入した場合と同様にいつたん減弱したが、 2 4時間 以降にははつきりとした匪バンドのシグナルが確認できた。 確認されたシグナ ルは HCVゲノム RNAに特異的であった。 つまり導入した全長 HCVゲノム RNAの一部が 複製増殖したものと考えられた。 RNA複製酵素である NS5Bの活性モチーフを変異 させた rJFHl/GNDでは複製はみられず、 NS5Bの活性が全長 HCVゲノム RNAの複製に 重要であることが示された。 一方、 これまでに分離された H77株 （非特許文献 7 ) 、 J6株 （非特許文献 8 ) や本発明者らが慢性肝炎から分離した JCH1株 （非特 許文献 6 ) などの C型肝炎ウィルス株に由来する全長 HCVゲノム RNAについても同 様の実験をおこなったが、 これらの株では全長 HCVゲノム RNAの複製は全く確認で きなかった。
(D ) トランスフエクション細胞培養液中の HCVウィルス粒子の検出
上記に従つ.てエレク トロポレーション処理を行った Huh7細胞を培養ディッシュ に播種し、 1 2時間、 2 4時間、 4 8時間、 及び 7 2時間培養した後、 培養上清 中の HCVコアタンパク質を測定した。 測定はォーソ HCV抗原 IRMAテストによって行 つた (非特許文献 9 ) 。 図 3に示す通り、 rJFHlをトランスフエクシヨンして 4
8時間後及び 7 2時間後の培養上清中にコアタンパク質が検出された。 このコア タンパク質がウィルス粒子として分泌されているかどうかを確認するため、 rJFHlをトランスフエクシヨンした 7 2時間後の培養液をショ糖密度勾配により 分画した。 60% (重量/重量） ショ糠溶液 （50mM Tris pH7. 5/0. 1M NaCl/lmM EDTA に溶解） 2 ml、 50°/。ショ糖溶液 l ml、 40%ショ糖溶液 l ml、 30%ショ糖溶液 l ml、
20%ショ糖溶液 1 ml、 10%ショ糖溶液 1 mlを遠心チューブに重層し、 さらにその上 にサンプルの培養上清を 4 ml重層した。 これをベックマンローター S W41Tiで
400, 000RPM, 4 °C、 16時間遠心した。 遠心終了後遠心チューブの底から 0. 5mlず つ分画回収した。 各分画の密度、 HCVコア蛋白濃度、 全長 HCVゲノム RNA量を定量 した。 全長 HCVゲノム RNAの定量的 RT- PCRによる検出は、 Takeuchi T， Katsurae A, 丄 an'aka T， Abe A, Inoue K, Tsukiyama-Konara K, Kawaguchi R, ranaka S, Kohara M. Real-Time detection system for quantification of Hepatitis C virus genome. Gastroenterology 116 : 636— 642 (1999) ίこ従レヽ、 全長 HCVゲノム RNAの 5'非翻訳領域の RNAを検出することによって行った。 具体的には、 細胞から 抽出した RNAに含まれる全長 HCVゲノム RNAを、 合成プライマー、 R6 - 130-S17 : 5 ， -CGGGAGAGCCATAGTGG-3 ' ( 配列番号 1 6 ) 、 R6- 290- R19 : 5 ' - AGTACCACAAGGCCTTTCG-3 ' (配列番号 1 7 ) 、 TaqMan Probe : R6- 148- S21FT, 5' -CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3 ' (配列番号 1 8 ) と EZ rTth RNA PCR kitを用い て PCR増幅し、 次レヽで ABI Prism 7700 sequence detector systemにより検出した t 図 4に示すように 1 1番のフラタションでコアタンパク質と全長 HCVゲノム RNA のピークが一致した。 このフラクションの密度は約 1. 18mg/mlであり、 これまで 報告されているコアタンパク質と核酸の結合物よりも軽い比重であった。 さらに 培養上清を 0. 25% NP40で処理した後に同様の分画を行うと、 コアタンパク質と全 長 HCVゲノム RNAのピークは比重約 1. 28mg/mlへとシフトした。 つまり、 NP40処理 により、 脂質を含む比重の軽い表面膜がウィルス粒子から剥離して、 核酸とコア タンパク質のみのコア粒子となった結果、 比重が重くなつたと考えられた。 以上 の結果から、 rJFHlを Huh7細胞へトランスフエクションすることにより細胞内で 全長 HCVゲノム RNAが複製されたこと、 さらにウィルス粒子が形成され、 培養上清 中に分泌されたことが明らかになつた。 [実施例 3 ]
( E ) 全長 HCVレプリコン RNA複製細胞の作製及ぴ細胞クローンの樹立
実施例 1で作製した rFGREP- JFH1及び rFGREP- JFH1/GNDを、 実施例 2と同様にし て Huh7細胞へトランスフエクションして全長 HCVレプリコン RNA複製細胞の作製を 行い、 さらに全長 HCVレプリコン RNA複製細胞クローンの樹立を試みた。
まず、 rFGREP- JFH1及ぴ rFGREP- JFH1/GNDのそれぞれを Huh7細胞へトランスフエ クシヨンした後、 培養ディッシュにその細胞を播種した。 1 6時間から 2 4時間 培養した後に G418を様々な濃度で添加した。 週に 2回培養液を交換しながら培養 を継続した。 2 1 日間培養した後、 クリスタルバイオレッ トで生存細胞を染色し た。.染色されるコロニー数を計測し、 トランスフエクションした RNA重量あたり に得られたコロニー数を計算した。 また、 一部の培養ディッシュでは生存細胞の コロニーをクローン化して培養を継続した。 クローン化された細胞から RNA、 ゲ ノム DNA、 タンパク質をそれぞれ抽出した後、 全長 HCVレプリコン RNAの検出、 ネ ォマイシン耐性遺伝子のゲノム DNAへの組み込みの有無、 HCVタンパク質の発現を 検討した。 これらの結果の詳細は下記に示す。
( F ) コロニー形成能
上記のトランスフエクションの結果、 トランスフエタションしたレブリコン RNA 1 μ g当たりのコロニー形成能は、 rFGREP-JFHlをトランスフエクシヨンした Huh7細胞では、 G418濃度が 1. 0 mg/mlの場合、 368 CFU (Colony Forming Unit ; コロニー形成単位）/ g · RNAであった （図 5の左側） 。 これに対して、 rFGR'EP - JFH1/GNDをトランスフエクションした Huh7細胞では、 コロニー形成が認められな かった (図 5の右側) 。 このことは、 rFGREP-JFHlレプリコン RNAをトランスフエ ク'シヨンした Huh7細胞のコロニー形成能は、 rFGREP- JFH1から発現される NS5B (RNAポリメラーゼ) の活性に依存することを示した。 つまり、 コロニーを形成 した細胞では、 rFGREP - JFH1から発現される NS5Bのはたらきにより rFGREP- JFH1レ プリコン RNAが自律複製することによって、 ネオマイシン耐性遺伝子が持続的に 発現され G418耐性が維持される結果、 細胞増殖が可能になったものと考えられた。 (G ) 樹立した細胞クローンにおける全長 HCVレプリコン RNAの検出
上記（E )に従って rFGREP- JFH1の Huh7細胞へのトランスフヱクシヨンにより樹 立した全長 HCVレプリコン RNA複製細胞クローンから、 酸性フヱノール抽出法によ り トータル RNAを抽出した。 次いでこのトータル RNAをノーザンプロッ ト法により 解析した。 プローブとしては pFGREP - JFH1特異的プローブを用いた。 対照として は、 トランスフエクシヨンを行っていない Huh7細胞から同様に抽出したトータル
RNA (図 6中、 「Huh7」 として示す） 、 Huh7細胞から抽出したトータル RNAに試験 管内で合成したレプリコン RNAを 10の 7乗コピー加えたサンプル （図 6中、 「 1
0 7j として示す） 、 及び Huh7細胞から抽出したトータル RNAに試験管内で合成し たレプリコン RNAを 10の 8乗コピー加えたサンプル （図 6中、 「1 0 8」 として示 す） を用いた。 図 6中、 1〜4は細胞クローンの番号である。
この結果、 rFGREP- JFH1と同程度の大きさの RNAが pFGREP - JFH1特異的プローブ により検出された （図 6 ) 。 これにより、 トランスフエクシヨンした rFGREP - JFH1レプリコン RNAが細胞クローン内で複製増殖していることが確認された。 ま た細胞クローン間で、 レプリコン RNAの量に差があることが示された。 図 6中、 例えば、 クローン 2はレプリコン RNAの量が他のクローンに比べて少な力 つた。
(H) ネオマイシン耐性遺伝子のゲノム D N Aへの組み込みの有無の確認
( E )に従って得られた細胞クローン 1〜8 (図 7中では FGR- JFH1/2 -：!〜 FGR - JFH1/2- 8と表記） について、 その細胞クローンの G418に対する耐性がネオマイシ ン耐性遺伝子の宿主細胞ゲノムへの組み込みによるものでないことを確認するた めに、 ネオマイシン耐性遺伝子特異的プライマー （センスプライマー、 NE0-S3： 5' -AACAAGATGGATTGCACGCA-3' (配列番号 1 9 ) , アンチセンスプライマー、 NE0 - R： 5' -CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3' (配列番号 2 0 ) ) を用いて、 細胞クローンか ら抽出した宿ま細胞のゲノム DNAを鎳型とする PCR増幅を行った。 この結某、 図 7 に示すとおり、 ネオマイシン耐性遺伝子の増幅が示された陽性クローンは認めら れな力 つた。
この（H)の結果から、 本発明の全長 HCVレプリコン RNAをトランスフエクシヨン し樹立した細胞クローンでは、 全長 HCVレプリコン RNAが複製されていることが確 認された。
( I ) H C Vタンパク質の検出
rFGREP- JFH1をトランスフエクシヨンし榭立した細胞ク口一ンから常法により タンパク質を抽出して、 SDS- PAGE及びウェスタンプロット法による解析を行った。 調べた細胞クローンは、 上記 （G ) で用いたものと同じである。 合成した全長
HCVゲノム RNAを Huh7細胞に一過性にトランスフヱクションして得られた細胞抽出 液を陽性対照とした （図 8、 図 9及ぴ図 1 0中、 JFH- 1として示す） 。 HCVのサブ ジエノミック RNAレプリコン (SGR-JFH1 ) をトランスフエクシヨンして得られた クローン細胞抽出液を coreタンパク質の陰性対照として、 及び NS3、 NS5aタンパ ク質の陽性対照として用いた （図 8、 図 9及び図 1 0中、 SGR- JFH1として示す） 。 . トランスフエクションしていない Huh7細胞抽出液は全ての陰性対照として用いた (図 8、 図 9及ぴ図 1 0中、 Huh7として示す） 。 それぞれの細胞クローンから抽 出したタンパク質試料を PVDF膜 （Immobilon- P , Millipore社製） にプロッティ 5 ングし、 抗 core特異的抗体及び抗 NS3特異的抗体 （Dr. Moradpour より分与され たもの ； Wolk B, et al, J. Virology. 2000； 74： 2293-2304) を用いて、 全長 HCVレプリコン RNAにコードされている coreタンパク質及び NS3タンパク質を検出 した。 図 8及び図 9に示される通り、 rFGREP- JFH1をトランスフヱクシヨンし樹 立した細胞クローン 1〜 4では、 それぞれのタンパク質について陽性対照と同じ L0 大きさのタンパク質が検出された。 トランスフエクシヨンしていない Huh7細胞で は coreタンパク質、 及び NS3タンパク質も検出されなかったため、 細胞クローン ：!〜 4では、 トランスフヱクシヨンされた全長 HCVレプリコン RNAが自律複製し、 さらに coreタンパク質や NS3タンパク質が発現されていることが確認された。
なお、 C型肝炎患者の血清を抗体として用いることにより、 上記で NS3タンパ L5 ク質の発現が確認された各細胞クローンについて、 全長 HCVレプリコン RNAからの NS5Aタンパク質の発現も同様に確認した （図 1 0 ) 。
以上の（H)及ぴ（ I )の結果から、 全長 HCVレプリ コン RNAをトランスフエクショ ンし樹立した細胞クローンでは、 全長 HCVレプリコン RNAが複製され、 さらにウイ ルスタンパク質が発現されていることが確認された。
20
( J ) 全長 HCVレプリコン RNA複製細胞におけるウィルス粒子産生
上記（E )に従って rFGREP- JFH1を Huh7細胞へトランスフエクションし、 樹立し た全長 HCVレプリコン RNA複製細胞クローン 2及ぴ 3 (FGR-JFH1/2-3) の培養上清 を回収して、 上記（D )と同様の方法で、 培養上清中の HCVウィルス粒子を測定し
25 た。 この結果を図 1 1に示す。 図 1 1中、 網掛けの円は各フラクション （面分） の比重 （g/ml) を示す。 また黒塗りの円は、 coreタンパク質の量 （fmol/L) を示 す。 白抜きの円は、 全長 HCVレプリコン RNAの力価 （X 0. 1コピー/ mL) を示す。 図 1 1に示すように、 比重が約 1. 18〜1. 20 mg/mlとなるフラクションで、 core タンパク質と全長 HCVレプリコン RNAのピークは一致していた。 またそれよりも軽 い分画にも小さなピークを認めた。 以上の結果から、 rFGREP-JFHllをトランスフ ェクシヨンした Huh7細胞中では、 全長 HCVレプリコン RNAが複製されたこと、 及ぴ ゥィルス粒子が形成されて培養上清中に分泌されたことが示された。 [実施例 4 ]
(K) 培養上清中のウィルス粒子の感染実験
( H )で用いた細胞クローン 1 〜 8 ( FGR-JFH1/2-1、 FGR- JFH1/2- 2、 FGR- JFH1/2- 3、 FGR-JFH1/2- 4、 FGR- JFH1/2- 5、 FGR- JFH1/2- 6、 FGR- JFH1/2- 7、 FGR - JFH1/2-8) のそれぞれの培養上清を Huh7細胞に添加して、 培養上清中のウィルス 粒子を Huh7細胞に感染させた。 感染翌日に感染させた Huh7細胞の培養液に G418を 0. 3mg/ml添加し、 さらに 2 1 日間培養した。 培養終了後に細胞を固定し、 ク リス タルバイオレツ トで染色したと ころ、 FGR-JFH1/2-3、 FGR- JFH1/2- 5、 FGR- JFH1/2 - 6の培養上清を用いて感染させた細胞についてコロニー形成が観察された。 一方、 対照に甩いたサブジエノミックレプリコン細胞 SGR- JFH1/4 - 1 (非特許文献 6記載） の培養上清を用いて感染させた細胞ではコロニー形成はみられなかった。 図 1 2に、 ？0!?-^111/2-3と361^^111/4-1の培養上清4 1111または8 1111を¾±7細胞に 添加し、 2 1 日間培養した後に染色した培養ディッシュの写真を示す。 FGR- JFH1/2-3の培養上清 4 mlを添加した細胞を播種したディッシュには 3コロニー、 ?61?- 111/2-3の培養上清8 1]11を添加した細胞を播種したディッシュには 9コロニ 一の形成を確認した。 し力 し、 SGR- JFH1/4- 1の培養上清を添加した細胞を播種し たディッシュではコロニー形成はみられなかった。
FGR- JFH1/2- 3、 FGR- JFH1/2- 5の培養上清を用いて C型肝炎ウィルスに感染させ、 形成されたコロニーを、 次いでクローン化した。 FGR-JFH1/2- 3の培養上清を用い た培養ディッシュから、 FGR- JFH1/C2- 3-11、 FGR- JFH1/C2- 3-12、 FGR- JFH1/C2 - 3- 13の 3クローンを樹立した。 FGR- JFH1/C2- 5の培養上清を用いた培養ディッシュ から、 FGR-JFH1/C2— 5- 11、 FGR-JFH1/C2-5 - 12の 2クローンを樹立した。
FGR- JFH1/C2- 3- 11、 FGR- JFH1/C2- 3- 12、 FGR- JFH1/C2-3- 13、 FGR- JFH1/C2- 5-11、
FGR- JFH1/C2- 5 - 12の各細胞クローンの培養上清を用いて再度 Huh7細胞を感染させ ると、 FGR - JFH1/C2- 3 - 12、 FGR- JFH1/C2-5- 12の培養上清を用いた培養ディッシュ ではコロニーの形成が観察された。 FGR- JFH1/C2 - 3- 12の培養上清を用いて感染さ せた細胞から、 さらに FGR-JFH1/C2- 3-12-1, FGR - JFH1/C2 - 3 - 12- 2の 2クローンを 樹立した。 FGR- JFH1/C2 - 5 - 12の培養上清を用いて感染させた細胞から、 さらに FGR- JFH1/C2-5 - 12-1、 FGR-JFH1/C2 - 5- 12- 2の 2クローンを樹立した。
以上の通り全長 HCVレプリコン RNA複製細胞の培養上清を用いて感染させ、 その 感染細胞より樹立したこれらの細胞クローンから、 RNA、 タンパク質、 ゲノム DNA を抽出した。 ゲノム DNAを铸型とした PCRでネオマイシン耐性遺伝子の組み込みの 有無を検討したところ、 いずれも陰性であった。 また、 RNAを鎳型とする定量的 PCR法により、 細胞内で複製している全長 HCVレプリコン RMを検出することがで きた。 さらに培養上清中に coreタンパク質を検出することができた。 この結果は、 本発明の全長 HCVレプリコン RNA複製細胞から産生された全長 HCVレプリコン RNAを 含むウィルス粒子が、 新たな細胞に感染することができることを示している。 産業上の利用可能性
本発明の方.法により、 HCVウィルス粒子を細胞培養系で作製することができる。 本発明のレプリコン RNAを用いれば、 細胞培養系において HCVの全長ゲノム RNAを 含有する RNAを効率よく製造することができる。 また本発明に係る全長 HCVレプリ コン RNA又は全長 HCVゲノム RMを導入した細胞を用いれば、 全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNAを複製し、 本発明の HCVウィルス粒子を細胞培養系で持 続的に産生させることができる。 本発明の全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲ ノム RNAを導入した細胞は、 HCVの複製過程、 ウィルス粒子形成過程、 ウィルス粒 子の細胞外放出過程に影響を及ぼす各種物質をスクリ一二ングするための試験系 として利用することもできる。 本発明の全長 HCVレプリコン RNA及び全長 HCVゲノ ム RNA並びにウィルス粒子は、 外来遺伝子のウィルスベクターとしても有用であ る。 本発明のウィルス粒子又はその一部分はまた、 C型肝炎ウィルスに対するヮ クチン抗原としてワクチンに含有させることができる。 さらに、 本発明のウィル ス粒子と他の細胞とを一緒に培養する系を、 ウィルス粒子の細胞への感染に影響 を及ぼす各種物質をスクリ一二ングするための試験系として利用することができ る。.本発明の全長 HCVレプリコン RNA又は全長 HCVゲノム RNAはまた、 HCVの全長ゲ ノム配列を容易に複製することができる鎳型としても有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及ぴ特許出願の全体を参照として本明 細書に組み入れるものとする。 配列表フリーテキスト
配列番号 1の配列は、 JFH - 1クローン由来の HCVゲノム RNAの 5'非翻訳領域を示す, 配列番号 2の配列は、 JFH- 1クローン由来の HCVゲノム RNAの coreタンパク質コー ド配列を示す。
配列番号 3の配列は、 JFH-1クローン由来の HCVゲノム RNAの E1タンパク質コード 配列を示す。
配列番号 4の配列は、 JI¾ - 1クローン由来の HCVゲノム RNAの E2タンパク質コード 配列を示す。
配列番号 5の配列は、 JFH- 1クローン由来の HCVゲノム RNAの NS2タンパク質コード 配列を示す。
配列番号 6の配列は、 JFH- 1クローン由来の HCVゲノム RNAの NS3タンパク質コード 配列を示す。
配列番号 7の配列は、 JFH- 1クローン由来の HCVゲノム RNAの NS4Aタンパク質コー ド配列を示す。
配列番号 8の配列は、 JFH-1クローン由来の HCVゲノム RNAの NS4Bタンパク質コー ド配列を示す。
配列番号 9の配列は、 JFH- 1クローン由来の HCVゲノム RNAの NS5Aタンパク質コー ド配列を示す。
配列番号 1 0の配列は、 JFH- 1クローン由来の HCVゲノム RNAの NS5Bタンパク質コ 一ド配列を示す。
配列番号 1 1の配列は、 JFH- 1クローン由来の HCVゲノム RNAの 3'非翻訳領域を示 す。
配列番号 1 2の配列は、 JFH-1クローン由来の全長 HCVゲノム RNAを示す。
配列番号 1 3の配列は、 JFH-1クローン由来の全長 HCVゲノム RNAを含むレプリコ ン RNAを示す。 配列番号 1 4の配列は、 アミノ酸モチーフ GDDを GNDに変異させた、 JFH-1クロー ン由来の全長 HCVゲノム RNAを示す。
配列番号 1 5の配列は、 アミノ酸モチーフ GDDを GNDに変異させた、 JFH - 1クロー ン由来の全長 HCVゲノム RNAを含むレプリコン RNAを示す。
配列番号 1 6〜2 0の配列は、 プライマーを示す。
配列願号 2 1の配列は、 発現ベクター pFGREP-JFHl/Luc由来のレプリコン RNAを示 す。
配列願号 2 2の配列は、 発現べクタ一 pFGREP- JFHl/Luc/GND由来のレプリコン RNA を示す。
配列願号 2 3の配列は、 発現ベクター pFGREP- JFH1/EGFP由来のレプリコン RNAを 示す。
配列願号 2 4の配列は、 発現べクタ一 pFGREP- JFH1/EGFP/GND由来のレプリ コン RNAを示す。
配列願号 2 5の配列は、 発現ベクター pFGREP- JFH1/SEAP由来のレプリコン RNAを 示す。
配列願号 2 6の配列は、 発現べクタ一 pFGREP- JFH1/SEAP/GND由来のレプリ コン RNAを示す。

Claims

請求の範囲
1 . 遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルスのゲノム RNAの、 5'非翻訳領域、 coreタ ンノ ク質コード配列、 E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 NS2 タンパク質コード配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コード配列 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード 配歹 及び 3'非翻訳領域と、 少なく とも 1つの選択マーカー遺伝子及び/又は少 なく とも 1つのリポーター遺伝子と、 少なく とも 1つの IRES配列と、 を含む塩基 配歹 Uからなる、 レプリコン RNA。
2 . 前記塩基配列が、 前記の 5'非翻訳領域、 少なく とも 1つの選択マーカー 遺伝子及び Z又は少なく とも 1つのリポーター遺伝子、 少なく とも 1つの IRES配 歹 (1、 coreタンパク質コード配列、 E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード 配歹 U、 NS2タンパク質コード配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コ 一ド酉 S列、 NS4Bダンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパ ク質コード配列、 及び 3'非翻訳領域を、 5'から 3'方向へこの順番で含む、 請求項 1記載のレプリコン RNA。
3 . 遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルスのゲノム RNAが、 配列番号 1 2に示す塩 基酉己列からなる RNAである、 請求項 1又は 2記載のレプリコン RNA。
4 . 5'非翻訳領域が配列番号 1に示す塩基配列からなり、 coreタンパク質コ 一ド配列が配列番号 2に示す塩基配列からなり、 E1タンパク質コード配列が配列 番号 3に示す塩基配列からなり、 E2タンパク質コード配列が配列番号 4に示す塩 基配列からなり、 NS2タンパク質コード配列が配列番号 5に示す塩基配列からな り、 NS3タンパク質コード配列が配列番号 6に示す塩基配列からなり、 NS4Aタン パク質コード配列が配列番号 7に示す塩基配列からなり、 NS4Bタンパク質コード 配歹 IIが配列番号 8に示す塩基配列からなり、 NS5Aタンパク質コード配列が配列番 号 9に示す塩基配列からなり、 NS5Bタンパク質コード配列が配列番号 1 0に示す 塩基配列からなり、 3'非翻訳領域が配列番号 1 1に示す塩基配列からなる、 請求 項 1 〜 3のいずれか 1項記載のレプリコン RNA。
5 . 以下の（a)又は（b)の RNAからなるレプリコン RNA。 (a) 配列番号 1 3に示す塩基配列からなる RNA。
(b) 配列番号 1 3に示す塩基配列において 1〜1 0 0個の塩基が欠失、 置換又は 付加された塩基配列からなる RNAであって、 自律複製能及ぴウイルス粒子産生能 を有する RNA。
6 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項記載のレプリコン RNAを細胞に導入するこ とを含む、 該レプリコン RNAを複製しかつウィルス粒子を産生する細胞を製造す る方法。
7 . 細胞が増殖性細胞である、 請求項 6記載の方法。
8 . 細胞が真核細胞である、 請求項 6又は 7記載の方法。
9 . 真核細胞がヒ ト肝由来細胞、 ヒ ト子宮頸由来細胞、 又はヒ ト胎児腎由来 細胞である、 請求項 8記載の方法。
1 0 . 真核細胞が Huh7細胞、 HePG2細胞、 IMY- N9細胞、 HeLa細胞、 又は 293細 胞である、 請求項 8記載の方法。
1 1 . 請求項 6〜 1 0のいずれか 1項記載の方法により製造される、 レプリ コン RNAを複舞しかつウイルス粒子を産生する細胞。
1 2 . 請求項 1 1記載の細胞を培養してウィルス粒子を産生させることを含 む、 C型肝炎ウィルス粒子の製造方法。
1 3 . 請求項 1 2記載の方法により製造される、 C型肝炎ウィルス粒子。
1 4 . 請求項 1 1記載の細胞を培養し、 培養物中のウィルス粒子を他の細胞 に感染させることを含む、 C型肝炎ウィルス感染細胞を製造する方法。
1 5 . 請求項 1 4記載の方法によって製造される、 C型肝炎ウィルス感染細 胞。
1 6 . 被験物質の存在下で、 下記（a)〜（c) ：
(a) 請求項 1 1記載の細胞
(b) 請求項 1 5記載の C型肝炎ウィルス感染細胞、 並びに
(c) 請求項 1 3記載の C型肝炎ウィルス粒子及ぴ C型肝炎ウィルス感受性細胞、 のうちの少なくとも 1つを培養し、 得られる培養物中のレプリコン RNA又はウイ ルス粒子を検出することを含む、 抗 C型肝炎ウィルス物質をスクリーニングする 方法。
1 7 . 請求項 1 3記載の C型肝炎ウィルス粒子又はその一部分を含有する、 C型肝炎ワクチン。
1 8 . 請求項 1 3記載の C型肝炎ウィルス粒子又はその一部分を抗原として 使用して、 C型肝炎ワクチンを製造する方法。
1 9 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項記載のレプリコン RNAを使用して、 遺伝 子治療のための肝細胞指向性ウィルスベクタ一を製造する方法。
2 0 . 請求項 1 8に記載の方法により製造される、 肝細胞指向性ウィルスべ クタ一。
2 1 . 外来遺伝子をコードする RNAを請求項 1〜 5のいずれか 1項記載のレ プリコン RNA中に挿入し、 それを細胞中に導入することを含む、 該細胞内で外来 遺伝子を複製及び Z又は発現させる方法。
2 2 . 配列番号 1 2に示す塩基配列からなる RNAを細胞に導入することを含 む、 該 RNAを複製しかつウィルス粒子を産生する細胞を製造する方法。
2 3 . 配列番号 1 2に示す塩基配列からなる RNAを細胞に導入し、 その細胞 を培養してウィルス粒子を産生させることを含む、 C型肝炎ウィルス粒子の製造 方法。 '
2 4 . 細胞が増殖性細胞である、 請求項 2 1又は 2 2記載の方法。
2 5 . 配列番号 1 2に示す塩基配列からなる RNAに外来遺伝子をコードする RNAを挿入し、 それを細胞に導入し、 その細胞を培養してウィルス粒子を産生さ せることを含む、 外来遺伝子を含有するウィルスベクターを製造する方法。
2 6 . 請求項 1 3記載の C型肝炎ウィルス粒子に対する抗体。
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