WO2005064333A1 - タンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法 - Google Patents

タンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法 Download PDF

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WO2005064333A1
WO2005064333A1 PCT/JP2004/019333 JP2004019333W WO2005064333A1 WO 2005064333 A1 WO2005064333 A1 WO 2005064333A1 JP 2004019333 W JP2004019333 W JP 2004019333W WO 2005064333 A1 WO2005064333 A1 WO 2005064333A1
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sugar chain
protein
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interacts
lectin
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Jun Hirabayashi
Atsushi Kuno
Sachiko Nakamura
Noboru Uchiyama
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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    • Y10S435/97—Test strip or test slide

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing an interaction between a protein and a sugar chain.
  • Protein power which plays a leading role in the vital functions of living organisms.
  • Post-translational modifications such as sugar chain modifications play a very important role in orderly exerting functions in a cellular society.
  • Most proteins in the living body are modified by sugar chains, and the sugar chains added to the proteins can be infected by viruses, parasites, infection, binding of toxins, binding of hormones, fertilization, development and differentiation, In recent years, it has become clear that it plays an important role in various aspects of life phenomena, such as stability, cancer cell metastasis, and apoptosis.
  • a microarray is a general term for a plurality of immobilized samples such as DNA 'proteins, which are immobilized in a spot form on a solid support (glass' membrane' silicon chip) at a high density. It is possible to detect the presence or absence of a molecule (hereinafter referred to as a probe) that specifically binds to the sample spot. Fluorescently labeled probe molecules are generally used, and after the probe solution is reacted with the array surface, it is observed with a fluorescence detection scanner to quantify the probe molecules bound to each sample spot. Analysis can be performed. Since the development of DNA microarrays by Affimetrix in the U.S., microarrays have been used in a very wide range of research fields, bringing a variety of new insights to humanity.
  • these dissociation constants (K) is often at 10- 6 M or more.
  • sugar chains and sugar chains are often at 10- 6 M or more.
  • the probe solution is washed and removed after the probe solution is brought into contact with the immobilized sample to reach a binding reaction, and a jet gas or a centrifuge is used. After performing the operation to completely remove water adhering to the slide glass using the above, perform imaging using a microarray scanner. This is due to the fact that a general microarray reader cannot observe fluorescence on a slide glass with moisture attached. Even if the probe solution is removed before scanning as described above, the dissociation rate constant is sufficiently small for interactions that show strong binding, such as complementary nucleotide fragments or antigen-antibody reactions. The reaction is not expected to proceed easily.
  • Protein microarrays are also used in basic research fields such as elucidating the functions of proteins that are transcripts of DNA in vivo, and in application fields such as diagnosis and judgment based on quantitative and qualitative changes in proteins.
  • active use is expected in the future, and active research has been conducted worldwide in terms of research.
  • the spread of protein microarrays is far behind that of DNA microarrays.
  • One of the reasons for this is that it is technically very difficult to immobilize protein samples with various properties at a fixed rate while maintaining their activity. It has been pointed out by more researchers.
  • Non-Patent Document 1 a method of physically adsorbing proteins onto a membrane typified by a PVDF membrane.
  • Some proteins, such as transcription factors, have been reported to be able to maintain some activity.
  • immobilization on a membrane there is a limit in increasing the density of the array.
  • immobilizing proteins on solid surfaces such as metals and glass.
  • proteins are applied to solid surfaces such as metals and glass. It has the property of being easily denatured by contact. For this reason, an immobilization method using some kind of linker to crosslink a protein with a solid surface has been intensively researched and developed.
  • Non-Patent Document 1 a method of bonding a polyacrylamide pad of 10 to 100 m in thickness on a slide glass and spotting a protein on the pad is used (see Non-Patent Document 1).
  • Patent documents 2 and 3 the protein is immobilized in a three-dimensional space, so it can be expected to be more than 100 times more quantitative than the method of immobilizing it on a two-dimensional surface.
  • these methods require the production of expensive and special slide glasses, and have not been widely used. Further, it may not be preferable that the immobilized protein layer has a thickness depending on the detection method.
  • a protein is expressed in a form to which a tag is added, and the protein is transferred to a solid phase carrier via a tag portion of the protein.
  • a method of performing a fixed dangling According to this method, if the effective ligand concentration of the protein is increased, it is possible in principle to make the irrigation effect and the orientation of the protein uniform.
  • Non-patent Document 5 a method of immobilizing the substrate to a surface modified with a nickel complex via an oligohistidine tag
  • Patent Document 1 a method of immobilizing avidin-biotin
  • Such a method is considered to be an effective method in that immobilization is performed while the activity of the protein is maintained, or the immobilization ratio is uniform.
  • adding a tag at the gene level to all the proteins to be immobilized on the microarray and expressing and purifying it in E. coli or a cell-free system would require a large amount of cost and enormous labor. At this point, it is difficult for general researchers to use the system freely and in a manner that suits individual needs.
  • a method of using a protein functional group for immobilization on a solid phase carrier involves immobilizing a protein extracted from nature or a commercially available protein sample as it is, and forming a microarray. When available, it has ⁇ ⁇ features.
  • Examples of a method for immobilizing a protein on a solid support via an amino group in a protein include a method for immobilizing a protein via an active ester group bonded to the surface of a solid phase, and an epoxy group arranged on the surface of a solid phase.
  • a method for immobilizing a protein via a method Non-Patent Document 6). The method of immobilizing a protein via an amino group is a simple method.
  • Patent Document 1 Patent application 2001—520104
  • Patent Document 2 Patent Publication 8—201383
  • Patent document 3 Patent publication 2002—544485
  • Non-Patent Document 1 LJ Holt, K. Bussow, G. Walter, IM Tomlinson, Nucleic Acids Res., 15, E72, 2000
  • Non-Patent Document 2 D. Guschin, G. Yershov, A. Zaslavsky, A. Gemmell, V. Shick, D.
  • Non-Patent Document 3 A. Lueking, M. Horn, H. Eickhoff, K. Bussow, H. Lehrach, G.
  • Non-Patent Document 4 P. Mitchell, Nat.BiotechnoL, 20, 225-229, 2002
  • Non-Patent Document 5 H. Zhu, M. Bilgin, R. Bangham, D. Hall, A. Casamayor, P. Bertone,
  • Non-Patent Document 6 H. Zhu, JF Klemic, S. Chang, P. Bertone, A. Casamayor, KG Klemic, D. Smith, M. Gerstein, MA Reed, M. Snyder, Nat.Genetics. 26, 283- 289, 2000
  • An object of the present invention is to provide a method for simply and simply analyzing the interaction between a sugar chain and a protein that interacts with the sugar chain at high speed, high sensitivity, and high accuracy.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above-mentioned problems.
  • cross-linking with a solid phase carrier generally occurs at random positions in the protein, so that there may be some molecules whose activity is impaired at a certain probability. In addition, there is a high probability that the activity of the protein will survive with a certain probability (the danger of losing the protein is small).
  • Such properties are very useful in practical use in a microarray that is intended to immobilize a large number of proteins having different properties and proteins whose properties are unknown.
  • the inventors of the present invention consider the practicality of microarrays in producing lectin arrays, their usefulness in application, responsiveness to analysis target objects, competitiveness in the market (including cost), and the like.
  • the immobilization method using the amino group of the protein is the best considering the overall consideration.
  • the optimal conditions for the immobilization method via an amino group are The aim was to improve the noise-to-noise ratio (S / N ratio) and the protein immobilization density.
  • the protein sample was immobilized under conditions with a higher S / N ratio than the conventional product.
  • GTMS 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
  • the present inventors created a substrate in which a plurality of reaction vessels were formed on glass by attaching a rubber having a plurality of holes, and accurately placed a fluorescence-labeled probe solution around a lectin spot. Made it possible to meet.
  • spotting of lectin and washing with PBST improved the density of lectin immobilization and succeeded in detecting weak interaction between sugar chain and lectin with higher sensitivity.
  • the operation of washing and removing the probe solution which is a major problem in accurately analyzing the information on the interaction between the lectin and the sugar chain in the equilibrium state, becomes unnecessary. This makes it possible to detect even weak interactions that would otherwise occur.
  • the lectin array can be put into practical use by improving the immobilization method and the detection method. That is, the present invention relates to a method for analyzing the interaction between a protein that interacts with a sugar chain and a sugar chain, and provides the following [1]-[22].
  • a method for analyzing the interaction between a protein that interacts with a sugar chain and the sugar chain comprising the following steps.
  • a substrate on which a protein that interacts with a sugar chain is immobilized is a substrate on which a protein that interacts with a sugar chain is immobilized on a substrate coated with a compound having an epoxy group as an active group.
  • a method for analyzing the interaction between a sugar chain and a protein that interacts with the sugar chain comprising the following steps.
  • a method for analyzing the interaction between a protein that interacts with a sugar chain and the sugar chain comprising the following steps.
  • step (b) Step of bringing a protein that interacts with a fluorescently labeled sugar chain into contact with the substrate obtained in step (a)
  • a substrate on which a protein that interacts with a region other than the sugar chain of the complex carbohydrate is immobilized is placed on a substrate coated with a compound having an epoxy group as an active group.
  • the method according to [7], wherein the protein exhibiting the interaction is an immobilized substrate.
  • a protein that interacts with a sugar chain is a lectin, an enzyme protein having a sugar binding domain, a cytokinin having an affinity for a sugar chain, or an antibody that interacts with a sugar chain.
  • a protein that interacts with a sugar chain is a lectin, an enzyme protein having a sugar binding domain, a cytokinin having affinity for a sugar chain, or an antibody that interacts with a sugar chain; [14 ] Or the substrate according to [15].
  • the glycoconjugate is a glycoprotein, proteodalican, or glycolipid; [14] one [1
  • a method for manufacturing a substrate comprising the following steps.
  • step (b) a step of immobilizing a protein that interacts with a sugar chain on the substrate obtained in step (a) or a protein that interacts with a region other than the sugar chain of the glycoconjugate;
  • a protein that interacts with a sugar chain is a lectin, an enzyme protein having a sugar-binding domain, a cytokinin having affinity for a sugar chain, or an antibody that interacts with a sugar chain; [19 ].
  • glycoconjugate is a glycoprotein, proteodalican, or glycolipid
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a system of the present invention.
  • the detecting means is a microarray scanner device.
  • FIG. 2 is a configuration diagram of a computer in the system of the present invention.
  • the storage means 6 stores at least a program 61-163 for executing the processing of the system using the microarray scanner device.
  • the storage means (database) 7 stores information on the interaction of a plurality of sugar chains with various proteins that interact with sugar chains, and information on Z or a combination pattern of the interaction information.
  • FIG. 3 is a diagram showing a reaction process of GTMS on a glass surface.
  • GTMS alkoxysilyl groups are hydrolyzed with water to silanol groups. These silanol groups are unstable, and partially condense into an oligomer state with the passage of time, and subsequently adsorb to the glass surface in a hydrogen bonding manner. Thereafter, the glass is dried to cause a dehydration-condensation reaction with silanol groups on the glass surface, resulting in a strong covalent bond.
  • FIG. 4 is a view showing a substrate on which eight reaction vessels used in the present example are formed.
  • the thickness of the newly designed 8-hole rubber is 1 mm, and it is possible to accurately fill the spot around the spot with the fluorescence-labeled dagger sugar probe solution by bringing it into close contact with the slide glass on a dedicated adjuster star.
  • the optimal amount of sample to fill the reactor is 50 / zL.
  • FIG. 5 is a conceptual diagram of a lectin array performance experiment in which a Cy3-ASF solution is squeezed onto an array on which two types of lectins are immobilized.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of inhibitory sugars on lectin-sugar chain interaction.
  • the experiment was performed in the presence of lactose (competitive inhibitory sugar).
  • the fluorescence intensity of the spots decreased as the concentration of coexisting ratatose (competitive inhibitory sugar) increased, indicating that the binding of the fluorescent glycoprotein probe was a sugar-specific binding reaction between the lectin and the sugar chain. It could be confirmed.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of the interaction between each sugar chain-related array and a sugar chain.
  • A Lectin array and FIG. 4 is a schematic diagram when a sugar chain is used as a probe. It can be used for structural analogy of fluorescently labeled sugar chains. In addition, the sugar chain can be indirectly fluorescently labeled.
  • B Lectin array and a schematic diagram in the case of using a glycoprotein as a probe. It can be used to analogize the sugar chain structure on proteins. The sugar chain can also be indirectly fluorescently labeled.
  • C Schematic diagram when using a glycopeptide array and lectin as a probe. It can be used for analogy of the sugar chain structure on the fractionated peptide.
  • D Schematic diagram when using a glycoprotein array and lectin as a probe. It can be used for analogy of the sugar chain structure on two-dimensionally fractionated proteins.
  • E Schematic diagram when using lectin as the antibody array and probe. It can be used to infer the sugar chain structure on crude glycoproteins.
  • FIG. 10 is a photograph showing an example of a lectin-antibody hybrid array. Specifically, a probe solution in which each model protein was fluorescently labeled was brought into contact with an array in which 7 types of lectins and 2 types of antibodies were immobilized, and after parallelization, an evanescent excitation scanner was used. The result of observation using the above is shown.
  • FIG. 12 is a diagram and a photograph showing the results of a glycopeptide array detection experiment in which the HPLC fraction of a mouse liver-derived glycopeptide sample was immobilized.
  • Fuc is a fucose recognition lectin group
  • Sia is a sialic acid recognition lectin group
  • Lac is a ratatose recognition lectin group
  • Gal is a galactose recognition lectin group
  • GalNAc is an N-acetyl galatatosamine recognition lectin group
  • Man is a mannose recognition.
  • Lectin group, Chitin means chitin recognition lectin group.
  • FIG. 13 is a photograph and a diagram showing the results of an experiment using a glycopeptide probe for detection of a lectin array.
  • FIG. 14 is a photograph showing an analysis result by a lectin array when a crude sample derived from a living body is probed.
  • the present invention provides a method for analyzing the interaction between a sugar chain and a protein that interacts with the sugar chain.
  • the method of the present invention comprises the steps of contacting a fluorescently labeled test sugar chain or a test glycoconjugate with a substrate on which a protein that interacts with a sugar chain is immobilized, and exciting without washing the substrate. Measuring the intensity of the excited fluorescence by applying light.
  • the sugar chains in the present invention include, for example, glycoprotein sugar chains (N-linked sugar chains and 0-linked sugar chains), glycolipid sugar chains, glycosaminodalican sugar chains, or And polysaccharide-derived oligosaccharide chains.
  • N-linked sugar chains include N-linked sugar chains of high-mannose type 'mixed-type' complex type, etc.
  • Glycolipid-based glycans include gandario-type 'globo-type' lacto 'neolacto-type glycans.
  • Glycosaminodalican-based sugar chains include hyaluronic acid 'keratan sulfate' heparin 'heparan sulfate' chondroitin sulfate 'dermatan sulfate, etc.5)
  • Polysaccharide-derived oligosaccharide chains include chitin, cellulose, curdlan, Examples thereof include oligosaccharide chains derived from laminarin, dextran, starch, glycogen, arabinogalatatan, alginic acid, fructan, fucoidan, xylan, and the like.
  • sugar chains include M3 'M5A' Hybrid (monoagalacto, bisect) -NAl
  • glycoconjugate is a generic term for in vivo macromolecules having sugar chains.
  • the glycoconjugates of the present invention include glycoproteins (including glycopeptides), proteodaricans, and glycolipids.
  • the proteins that interact with sugar chains of the present invention include peptides that interact with sugar chains. Is also included.
  • Examples of the protein that interacts with the sugar chain of the present invention include lectin, an enzyme protein having a sugar binding domain, a cytokinin having affinity for the sugar chain, a mutant thereof, or an antibody that interacts with the sugar chain. And the like.
  • the lectins include lectins belonging to various molecular families obtained from animals, plants, fungi, bacteria, viruses, etc., ie, ricin B chain-related “R-type lectins found in all living organisms including bacteria.
  • Canexin 'calreticulin which is present in eukaryotes in general and is involved in glycoprotein folding, and calcium, which is widely present in multicellular animals and is rich in typical lectins such as” selectin "and” collectin " Requirement "C-type lectin", “Galectin” which is widely distributed in the animal kingdom and has specificity for galactose, "Legume lectin” which forms a large family in leguminous plants, and animals with structural similarity “L-type lectin” involved in intracellular trafficking, “P-type lectin with mannose 6-phosphate binding involved in intracellular transport of lysosomal enzymes”, glycosaminodali “Annexin”, which binds to acidic sugar chains such as cans, and “I-type lectin,” which belongs to the immunoglobulin superfamily and includes “Siglec”
  • lectins include ACA (Senninko lectin) ⁇ BPL (Purple bean lectin) 'ConA (Pork bean lectin)' DBA (Horsegram lectin) ⁇ DSA (Yoshichi sensual asaga lectin) 'ECA (D Sesame lectin) 'EEL (Spindle Tree lectin).
  • GNA Yukinohana lectin
  • GSL I Glypho-bean lectin
  • GSL II Glypho-bean lectin
  • HHL Amarilis lectin
  • LBA Lia bean lectin
  • LEL LEL
  • Tomato lectin 'LTL
  • PHA-L Pink bean lectin
  • Peanut lectin PWM
  • Pink pokeweed lectin RCA120 (French bean lectin)' SBA
  • Examples of the enzyme protein having the sugar-binding domain include various glycosidases (xylanase, glucanase) and glycosyltransferases (UDP-GalNA polypeptide GalNAc transferase).
  • examples of cytokins having affinity for sugar chains include interleukin-2 (IL-2), interleukin-12 (IL-12), tumor necrosis factor ⁇ (TNF-a), fibroblast growth factor. (FGF) and the like.
  • Antibodies that interact with sugar chains include sugar chain-related tumor markers (CA19-9, Forssman antigen, T antigen, Tn antigen, sialyl ⁇ antigen), blood group-related sugar chains (A, ⁇ , ⁇ , Le a, Le x antigens), such as an antibody against differentiation associated antigens (Ii, SSEA-1-4) can be exemplified.
  • sugar chain-related tumor markers CA19-9, Forssman antigen, T antigen, Tn antigen, sialyl ⁇ antigen
  • A ⁇ , ⁇ , Le a, Le x antigens
  • Ii differentiation associated antigens
  • the substrate in the present invention is exemplified by glass, quartz glass, synthetic quartz glass, and the like. However, the substrate is not limited thereto.
  • the substrate on which a protein that interacts with a sugar chain is immobilized is preferably immobilized on a substrate coated with a compound having an epoxy group as an active group. Substrate.
  • Examples of the compound having an epoxy group as an active group include, but are not limited to, 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GTMS).
  • GTMS 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
  • the substrate of the present invention on which a protein that interacts with a sugar chain is immobilized can be prepared by the following method.
  • a substrate is coated with a compound having an epoxy group as an active group.
  • GTMS is used as a compound having an epoxy group as an active group
  • it can be carried out by the method described in Examples. Specifically, a slide glass is immersed in a 10% KOH I MeOH solution, and the container is shaken and left for 1 hour to treat the glass surface, and this is washed with a sufficient amount of purified water (Milli Q water). After drying, dry in an oven at 60 ° C. Then slide glass 2% Immerse in GTMS acetone solution and react for 1 hour while shaking the whole container under light shielding.
  • GTMS alkoxysilyl groups are hydrolyzed with water to form silanol groups.
  • the silanol groups are unstable and are partially bonded to form oligomers with the lapse of time.
  • Adsorbs adsorbently After the reaction, dry the slide glass in an oven at 110 ° C for 8 hours. By the drying treatment, a silanol group on the glass surface reacts with a dehydration-condensation reaction to form a strong covalent bond.
  • Figure 3 shows a series of GTMS coating methods.
  • a protein that interacts with a sugar chain is immobilized on a substrate coated with a compound having an epoxy group as an active group. Immobilization of proteins that interact with sugar chains is performed by covalent bonds. Specifically, a compound having an amino group as an active group is spotted on the substrate and allowed to react to perform immobilization. As a spotter, STAMPMAN manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd. can be used.
  • the concentration of spotted lectin is not particularly limited, but is preferably 1 mgZmL or more. More preferably, after the spot treatment, unbound lectin can be removed by washing with a PBS solution containing Tween20 (PBST).
  • the substrate on which the protein that interacts with the sugar chain is immobilized is preferably a substrate in which a plurality of reaction vessels are formed. More preferably, it is a substrate in which a plurality of reaction vessels are formed by sticking rubber having a plurality of holes.
  • an 8-hole rubber designed and developed by the present inventors is attached to a predetermined position on a slide glass on which a protein interacting with a sugar chain is immobilized. Then, eight reactors are prepared. This 8-hole rubber has eight rectangular holes regularly, and can form eight reaction tanks when attached to a slide glass.
  • reaction tank By filling this reaction tank with a fluorescently labeled probe solution, it becomes possible to smoothly carry out contact with a protein that interacts with a sugar chain.
  • This reaction tank is not limited to 8-hole rubber.
  • a reaction field can be formed by applying a water-repellent coating to a non-spot area on the glass surface. More preferably, many reaction fields are formed.
  • proteins interacting with a plurality of types of sugar chains can be spotted and used on the same substrate.
  • the protein that interacts with the sugar chain is immobilized on the substrate on which the protein is immobilized.
  • the fluorescently labeled test sugar chain or test glycoconjugate is contacted.
  • a fluorescent labeling agent for a test sugar chain or a test glycoconjugate a fluorescent color having a 2-aminopyridine, Cy3, Cy3.5, Cy5, tetramethylrhodamine, or fluorescein skeleton is used.
  • fluorescent color having a 2-aminopyridine, Cy3, Cy3.5, Cy5, tetramethylrhodamine, or fluorescein skeleton is used.
  • examples thereof include various dyes, a fluorescent dye Alexa series manufactured by Molecular Probes, and a quantum dot fluorescent dye, but are not limited to these as long as they have a property of fluorescently labeling a sugar chain.
  • test sugar chain or test glycoconjugate can be directly or indirectly fluorescently labeled.
  • the test sugar chain can be indirectly fluorescently labeled by binding a protein that interacts with the test sugar chain and the sugar chain that has been fluorescently labeled in advance.
  • a protein that has been fluorescently labeled in advance and that interacts with a portion other than the sugar chain of the test glycoconjugate for example, an antibody that interacts with a portion other than the sugar chain of the test glycoconjugate
  • the test glycoconjugate can be indirectly fluorescently labeled with the test glycoconjugate.
  • the test glycoconjugate can also be indirectly fluorescently labeled by binding the test glycoconjugate to a protein that is fluorescently labeled in advance and that interacts with the sugar chain.
  • a protein that is fluorescently labeled in advance and that interacts with the sugar chain.
  • sugar chains other than the sugar chain to which the protein interacting with the sugar chain is bound bind to the substrate).
  • an antibody that has been fluorescently labeled in advance and that interacts with a portion other than the sugar chain of the target glycoconjugate can be used as a sample including a target glycoconjugate sample, blood, body fluid, biological extract components, food components, etc.
  • the fluorescent glycolabel can be selectively labeled without separating and purifying the target glycoconjugate.
  • a crude sample on which the above-mentioned antibody, which has been fluorescently labeled in advance has acted, for example, on a substrate on which lectin is immobilized, only the sugar chain information of the target glycoconjugate can be selectively observed.
  • the interaction of the test sugar chain or the test complex carbohydrate with the protein that interacts with each sugar chain is then performed by applying excitation light without washing the substrate. Measure.
  • the present inventors have solved the above problem by measuring the intensity of fluorescence excited by the action of excitation light without washing the probe solution. More specifically, this is a measurement method in which excitation light is incident on a surface of the substrate that is not fixed and the excited fluorescence is detected.
  • the excitation light in the present invention include a light source cut out from white light, which is not particularly limited, preferably a laser light having a single wavelength power, and more preferably an evanescent wave.
  • white light which is not particularly limited, preferably a laser light having a single wavelength power, and more preferably an evanescent wave.
  • evanescent light when the excitation light is totally reflected inside the glass, a weak light called evanescent light falls within a range of 200 to 300 nm (about half the excitation wavelength) from the interface.
  • the evanescent light excites the excitation light while the solution containing the probe molecules is in contact with the slide glass. It is possible to selectively observe the probe molecules that participate in the binding reaction without almost exciting the probe molecules.
  • the method of the present invention can be used for sugar chain structure analysis utilizing the interaction between a fluorescently labeled test sugar chain and a protein that interacts with a sugar chain immobilized on a substrate. That is, the method of the present invention is expected to be applied as a sugar chain profiler for performing sugar chain structure analysis quickly and easily. For example, the profiling method described in “Protein Nucleic Acid Enzyme, August 2003 Special Issue, Vol. 48, NO. 11” can be applied.
  • the present invention is applicable to a sugar chain structure analysis system using a computer.
  • the structure of the test sugar chain can be identified, and when the test sugar chain has an unknown structure, Even if there is a characteristic structure existing in the test sugar chain ( ⁇ 2-3 sialic acid ' ⁇ 2-6 sialic acid' oc 1-3 galactose ' ⁇ 1-3 fucose' a 1-6 fucose 'bisect It is possible to point out the prediction of N-acetyldarcosamine (sulfation, etc.) or the similarity with known structural sugar chains. In this system, various proteins that interact with a sugar chain contacted with a fluorescently labeled test sugar chain are obtained.
  • the system of the present invention can also automate the step of bringing a fluorescently labeled test sugar chain into contact with a substrate on which various proteins interacting with sugar chains are immobilized.
  • the solution contact process can be controlled centrally.
  • the system of the present invention can also be combined with mass spectrometry and enzymatic digestion, and these methods are very useful because more reliable data can be obtained.
  • FIG. 1 shows an example of a system configuration diagram of the present invention.
  • a system using a microarray scanner is composed of the following components.
  • a storage means in which information on the interaction of a plurality of sugar chains with various proteins interacting with the sugar chains is stored.
  • a fluorescently labeled test sugar chain is brought into contact with a substrate on which various proteins interacting with sugar chains are immobilized, and excitation light is incident on the substrate without performing a washing operation.
  • a computer including a calculating means for comparing the combination information of the detected fluorescence intensities with the information stored in (a) and selecting one or a plurality of sugar chains of known structures having a matching combination information pattern.
  • FIG. 2 shows an example of a computer configuration diagram in the system of the present invention.
  • Input means 1 and output means 2 are connected to bus line 3.
  • the temporary storage means 4 stores the entered information, And the calculated information are temporarily stored.
  • the central processing unit (CPU) 5 performs various operations in response to instructions of the program of the present invention.
  • the storage means (database) 7 stores information on the interaction of a plurality of sugar chains with various proteins that interact with the sugar chain, and information on Z or a combination pattern of the interaction information.
  • interaction information fluorescence intensity information obtained by a method or system using the microarray scanner device of the present invention, or information obtained from various experimental systems established so far can be used.
  • the storage means 6 stores various programs including a program for executing the processing of the present invention.
  • the program for executing the process of the present invention stores the input information on the combination of the input fluorescence intensities in a database and stores the information on the interaction of a plurality of sugar chains with various proteins that interact with the sugar chains.
  • At least the program 63 is included.
  • the values of the combination information of the interaction information may be compared with each other.
  • the program 61 compares, for example, the value of the combination information of the input fluorescence intensity with the value of the combination information of the interaction information stored in the database, and determines the sugar chain having a known structure based on the closeness of the value. The ability to select one or more is built-in.
  • the combination information of the interaction information may be patterned to compare the patterns.
  • the storage means 6 stores the program 61-1 for patterning the input information of the combination of the input fluorescence intensities and the sugar stored in the database.
  • a program 61-2 for patterning combination information of interaction information of a plurality of sugar chains with various proteins that interact with chains, and a pattern of combination information of input fluorescence intensities are stored in a database. Structure that matches the combination information pattern with the combination information pattern of multiple sugar chain interaction information for various proteins that interact with sugar chains
  • a program 61-3 for connecting one and two or more known sugar chains is stored.
  • the interaction information is divided into levels within the threshold range and coded (for each level, for example, a different Function to apply numbers and different colors).
  • the program 61-3 compares the pattern obtained by executing the program 61-1 with the pattern obtained by executing the program 61-2, and finds a sugar chain having a known structure having a matching combination information pattern. One or more programs to select. If the pattern information is stored in the database, the program 61-3 compares the pattern obtained by executing the program 61-1 with the pattern stored in the database, and the pattern matches. Select one or more sugar chains with known structures. Program 61-3 incorporates, for example, a function to compare the code of a sugar chain with a known structure with the code of a sugar chain to be tested and to select a sugar chain with a known structure whose code matches that of the sugar chain to be tested! / Puru.
  • the program 62 performs, for example, display of fluorescence intensity information, display of interaction information, display of selected sugar chain information having a known structure, and the like.
  • the flow of the processing performed by the system of the present invention first, various proteins that interact with the sugar chains that have been brought into contact with the fluorescently labeled test sugar chains are immobilized.
  • the substrate is set on the microarray scanner device, excitation light is incident on the substrate, and the intensity of the excited fluorescence is detected.
  • the plurality of substrates are automatically and sequentially fixed to the detection unit, and scanning is performed.
  • the fluorescence intensity information is automatically input to the computer.
  • the input information can be stored in a storage unit or a temporary storage unit of the computer. Further, the fluorescence intensity information may be stored in a database.
  • arithmetic means such as a central processing unit (CPU) receives an instruction of the program 62 in the storage means, reads out the fluorescence intensity information stored in the storage means or the temporary storage means, and reads the fluorescence intensity information.
  • Information can also be displayed. For example, display the corrected value of the brightness value of each spot based on the fluorescence intensity emitted from a protein sample spot (internal standard spot) that interacts with a sugar chain, which serves as a reference whose properties have been thoroughly investigated in advance.
  • the internal standard spot may be plural.
  • the combination information of the input fluorescence intensities is then converted to the information on the interaction of a plurality of sugar chains with various proteins that interact with the sugar chains stored in the database.
  • arithmetic means such as a central processing unit (CPU) receives a command of the program 61 in the storage means, and stores the combination information of the fluorescence intensity stored in the storage means or the temporary storage means and the database.
  • CPU central processing unit
  • Reads the combination information of the interaction information of multiple sugar chains for various proteins that interact with the existing sugar chain collates each combination information, and finds a sugar chain with a known structure that matches the combination information pattern.
  • the selected sugar chain information of known structure can be stored in a storage means or a temporary storage means of a computer.
  • arithmetic means such as a central processing unit (CPU) receives instructions from the program 61 in the storage means, and performs various operations to interact with sugar chains stored in the database.
  • the combination information of the interaction information of a plurality of sugar chains with the protein is input to the computer, the combination information of the fluorescence intensities stored in the storage means or the temporary storage means is read, and the respective combination information is collated. Select one or more sugar chains with known structures.
  • the selection result is displayed by the display means.
  • the arithmetic means such as a central processing unit (CPU) receives a command from the program 62 in the storage means, and receives the information on the sugar chain of known structure stored in the storage means or the temporary storage means. Is read and displayed.
  • CPU central processing unit
  • the present invention provides a step of bringing a protein having an interaction with a fluorescently-labeled sugar chain into contact with a substrate on which a test glycoconjugate is immobilized, and a step of applying excitation light without washing the substrate. And a method for analyzing the interaction between a protein that interacts with a sugar chain and the sugar chain, comprising a step of measuring the intensity of the excited fluorescence.
  • the substrate on which the test glycoconjugate is immobilized is preferably a substrate on which the test glycoconjugate is immobilized on a substrate coated with a compound having an epoxy group as an active group. More preferably, the substrate is a GTMS compound having an epoxy group as an active group.
  • a step is the same as the above-described method.
  • the glycosylation status of a test glycoconjugate immobilized on a substrate is examined using a fluorescent-labeled lectin or the like. This is useful as a means of examining the situation at once for a group of proteins (glycoform analysis). It is also expected to be applied to quality control checks of sugar chains in protein preparations.
  • the present invention also provides a step of bringing a test glycoconjugate into contact with a substrate on which a protein that interacts with a region other than the sugar chain of the glycoconjugate is immobilized.
  • the method includes the steps of contacting a protein that interacts with a fluorescently labeled sugar chain, and measuring the intensity of the excited fluorescence by applying excitation light without washing the substrate.
  • Provided is a method for analyzing the interaction between a protein having an action and a sugar chain.
  • the substrate on which the test glycoconjugate is immobilized is preferably a substrate on which the test glycoconjugate is immobilized on a substrate coated with a compound having an epoxy group as an active group. More preferably, the substrate is a GTMS compound having an epoxy group as an active group.
  • the protein that interacts with a region other than the sugar chain of the glycoconjugate according to the present invention is preferably an antibody that interacts with a region other than the sugar chain of the glycoconjugate.
  • the protein that interacts with a sugar chain is preferably a lectin, an enzyme protein having a sugar binding domain, a cytokin with affinity for a sugar chain, a mutant thereof, or an antibody that interacts with a sugar chain. It is.
  • the method includes a step of bringing a protein that interacts with a fluorescently labeled sugar chain into contact with a substrate, which has been brought into contact with a glycoconjugate to be tested.
  • a sample containing a test complex carbohydrate sample, blood, a body fluid, a biological extract component, and a food on which a protein that interacts with a region other than the sugar chain of the complex carbohydrate is immobilized.
  • Contact the stock solution or diluted solution of the components, etc. and ensure sufficient reaction time.
  • wash thoroughly with PBS or PBST to remove components other than the test glycoconjugate.
  • the sugar chain portion can be contacted with a fluorescently labeled probe solution exhibiting an interaction.
  • the present invention is useful as a method for quickly and easily examining the state of sugar chain modification of a target protein from a mixture of different glycoconjugates, such as blood, body fluids, biological extract components, and food components. By observing the status of glycosylation of the target protein without purifying a mixed solution of various components such as undiluted solution or diluted solution, it can be applied in fields such as diagnosis and grasping the treatment status. Conceivable.
  • the present invention provides (a) a step of coating a substrate with a compound having an epoxy group as an active group, and (b) a protein that interacts with a sugar chain on the substrate obtained in step (a), or Provided is a method for producing a substrate, comprising a step of immobilizing a protein that interacts with a region other than the sugar chain of a glycoconjugate. The steps of the method are described in detail above.
  • the present invention also provides a substrate manufactured by the above method.
  • the present invention provides a substrate coated with a compound having an epoxy group as an active group, which interacts with a protein that interacts with a sugar chain or a region other than the sugar chain of a glycoconjugate.
  • a substrate on which the protein is immobilized is provided.
  • the substrate of the present invention is preferably a substrate made of 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GTMS) having an epoxy group as an active group.
  • GTMS 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
  • a protein that interacts with a region other than the sugar chain of the glycoconjugate is a substrate that is an antibody that interacts with a region other than the sugar chain of the glycoconjugate, or interacts with the sugar chain.
  • the substrate is a lectin, an enzyme protein having a sugar-binding domain, a cytoforce having affinity for a sugar chain, a mutant thereof, or an antibody that interacts with the sugar chain.
  • the concentration of spotted lectin is not particularly limited, but is preferably 1 mgZmL or more. More preferably, it is washed with PBST. Thus, the lectin is immobilized on the substrate.
  • the substrate of the present invention is preferably a substrate in which a plurality of reaction vessels are formed.
  • Asaguchi fetuin Asaguchi fetuin (SIGMA, ASF) is used as a fluorescent dye with a maximum absorption wavelength around 550 nm, Cy3 Mono-reactive Dye (Amersham Pharmacia, Cy3). And prepared by fluorescent labeling.
  • ASF has three N-linked sugar chains and three 0-linked sugar chains in the molecule, and has a sugar chain structure in which the sialic acid cap at the non-reducing end of the sugar chain is partially removed. It is known that ASF was prepared in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.3) to a final concentration of 1 mg / mL, and 1 mL was mixed with 1.0 mg of Cy3 powder, and reacted for 1 hour in a dark place with appropriate stirring. .
  • Lectin was immobilized on the glass surface using a glass slide (Fig. 3) coated with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane having an epoxy group as an active group (Shin-Etsu Silicone Co., Ltd., hereinafter GTMS).
  • GTMS coating was performed by the following procedure using a slide glass manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd. The slide glass was immersed in a 10% KOH I MeOH solution and left standing for 1 hour while shaking the whole container to treat the glass surface. This was washed with a sufficient amount of purified water (milli-Q water), and then dried in an oven at 60 ° C.
  • the slide glass was immersed in a 2% GTMS acetone solution, and allowed to react for 1 hour while shaking the whole container under light shielding. Anti After the reaction, the resultant was dried in an oven at 110 ° C for 8 hours, washed with a sufficient amount of purified water, and dried.
  • Lectin was spotted on the slide glass coated with GTMS of (2).
  • GTMS GTMS
  • a STAMPMAN made by Nippon Laser Electronics Co., Ltd. as a microarray spotter
  • spots with a diameter of about 0.6-0.7 mm were placed on the slide glass by using a stamp pin with a tip diameter of 0.40 mm.
  • Each spotted lectin was dissolved in phosphate buffered saline, pH 7.4 (PBS) to a concentration of 1 mg / mL (partially 0.25 mg / mL for some lectins). This was dispensed 10 times into each reaction tank of a 96-well microtiter plate for PCR (Corning) and set in a microarray spotter.
  • PBS phosphate buffered saline, pH 7.4
  • stamp pin operation program was executed.
  • the stamp pin was immersed in an immobilized sample solution in a 96-well PCR microtiter plate for 1 second, lifted up, and brought into contact with a predetermined position on the surface of the slide glass for 1 second. This operation was repeated for each spot, and the same sample solution force was spotted at four points in a row, and then the stamp pin cleaning process was performed.
  • the tip of the stamp pin is dipped in a 0.05% SDS solution for 2 seconds, the stamp pin is dried in a vacuum device for 15 seconds, further dipped in purified water for 2 seconds, dried in a vacuum device for 15 seconds, and finally It was immersed in ethanol for 2 seconds and dried for 15 seconds in a vacuum device.
  • lectins having various sugar-binding specificities RCA120, SSA, xylan-binding domain of xylanase derived from recombinant actinomycetes (hereinafter referred to as XBD), C-terminal domain derived from recombinant earthworm 29 kDa lectin (A total of 5 proteins were spotted: EW29 (Ch) below) and one negative control (PB serum albumin (BSA)) RCA120 and BSA purchased from SIGMA, SSA from Seikagaku The purchased and XBD, EW29 (Ch) were expressed in Escherichia coli and purified in our laboratory.
  • XBD xylan-binding domain of xylanase derived from recombinant actinomycetes
  • BSA PB serum albumin
  • An eight-hole rubber designed and developed by the present inventors was attached to predetermined positions on the slide glass after the lectin immobilization, thereby producing eight reaction vessels (Fig. 4).
  • This 8-hole rubber is made of black silicone rubber with a thickness of 1 mm, and has 8 rectangular holes measuring 9.5 x 7.5 mm, which form 8 reaction vessels when attached to a slide glass. can do. If about 50 L of sample is added to this reactor, the inside can be filled with a sufficient amount of sample solution.
  • the blocking solution on the slide glass was removed, and the plate was sufficiently washed with PBS, and then water was removed.
  • the following operation was carried out as soon as possible to prevent denaturation of the protein due to drying of the glass surface and increase in the background due to drying.
  • a fluorescence-labeled dani-glycoprotein probe solution to be analyzed for interaction was added to the reaction tank on the lectin-immobilized slide glass prepared in (4).
  • the fluorescence-labeled glycoprotein probe was prepared by dissolving it in PBS to a final concentration of 10 g / mL, and 50 ⁇ L was dropped into each reaction tank.
  • excitation light was injected from the end surface of the slide glass using the GTMAS Scan III (Nippon Laser Electronics), an evanescent excitation type microarray scanner. Then, the fluorescence generated by the excitation was detected by an ICCD (Charge Coupled Device with Image Intensifier) camera provided on the lower surface of the slide glass. Scanning the fluorescence image on almost the entire surface of the slide glass The image was saved in TIFF file format (about 100 MB per page). The parameters for scanning were unified with a gain of 5,000 times, an integration count of 4 times, and an exposure time of 33 msec.
  • GTMAS Scan III Nippon Laser Electronics
  • ICCD Charge Coupled Device with Image Intensifier
  • Array-Pro Analyzer (.version 4.0 for Windows (registered trademark), Media Cybernetics), which is a commercially available analysis software for microarrays, was used for digitizing the scanning images.
  • the brightness of each spot was calculated using the above analysis software, and the brightness of the non-spot area was set as a background value.
  • the value obtained by subtracting the background value from the brightness of each spot was used as the net brightness value, and the average value and standard deviation were calculated for each spot from the same sample arranged in four rows.
  • the performance of the GTMS-coated slide glass manufactured as described above was compared and evaluated with existing slide glasses (six types). That is, lectins (100 ⁇ g / mL) previously labeled with Cy3 were immobilized in an array on each surface-coated slide glass. (3) After passing through step (6), the brightness value of the spotting area was determined. The S / N ratio was calculated from (S) and the brightness value (N) of the non-spotting surface. As a result, as shown in Table 1, the brightness value of the GTMS-coated slide glass manufactured in the process (2) was only about one-half that of the glass slide A, which showed the highest value. Therefore, the S / N was 16.1, which was the best value among the slide glasses evaluated this time.
  • RCA120 and ConA are typical lectins known to have high affinity for complex type sugar chains and high mannose type sugar chains, respectively. These lectins were prepared at various concentrations, and the same sample was spotted in an array by arranging four points horizontally. After 10 L / L of Cy3-ASF was applied to each reaction vessel of the array to cause a binding reaction, fluorescence was observed with a scanner.
  • ASF has three N-linked sugar chains and three 0-linked sugar chains in the molecule, and the sialic acid cap at the non-reducing end of the sugar chain is released, and the ratatosamine structure protrudes. It is known to have a modified sugar chain structure. Therefore, it was expected that RCA120 had a very strong affinity and ConA had a weak affinity in the experimental system in which Cy3-ASF was added to the lectin array on which RCA120 and ConA were immobilized.
  • Glycan-related arrays include lectin arrays using sugar chains as probes, lectin arrays using glycoproteins as probes, glycopeptide arrays using lectins as probes, glycoprotein arrays using lectins as probes, and lectins as probes. There are five types of antibody arrays used.
  • FIG. 9 shows a schematic diagram of the interaction between each sugar chain-related array and the sugar chain.
  • the fluorescence intensity information obtained using each array is encoded.
  • the value of the luminance value is a value fetched in 16 bits, so it is a value between 0 and 65355. Therefore, coding was performed from 0 to 5 by classifying the value of (brightness value-background value) at a gain of "1000 times" into six steps in increments of 10,000. If the luminance signal value is saturated at Gain “1000 times”, Observe with the gain lowered, and convert it to the value when the gain is 1000 times. Whether the signal value is saturated or not is determined by whether the linearity of the correlation between the gain value and the signal strength is maintained when the gain value is changed.
  • lectins having various sugar-binding specificities as lectins immobilized on the lectin array.
  • a protein BSA which did not bind to a sugar chain was selected.
  • GNA and SNA were purchased from VECTOR
  • BSA was purchased from SIGMA
  • RCA120, ECA, ConA and SSA were purchased from Seikagaku Corporation.
  • the model fluorescence-labeled dani-sugar protein probes include ASF, FET, ribonuclease B (RNase B) derived from sac spleen, and proteins such as ribonuclease (RNase A) derived from sac spleen as a negative control. (All purchased from SIGMA) was prepared by fluorescent labeling using Cy3 Mono-reactive Dye (Amersham Pharmacia, hereinafter Cy3), a fluorescent dye having an absorption maximum wavelength around 550 nm.
  • Lectin was immobilized on the glass surface using a glass slide (Fig. 3) coated with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane having an epoxy group as an active group (Shin-Etsu Silicone Co., Ltd., hereinafter GTMS).
  • GTMS coating was performed by the following procedure using a slide glass manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd. The slide glass was immersed in a 10% KOH I MeOH solution and left standing for 1 hour while shaking the whole container to treat the glass surface. This was washed with a sufficient amount of purified water (milli-Q water), and then dried in an oven at 60 ° C.
  • the slide glass was immersed in a 2% GTMS acetone solution, and allowed to react for 1 hour while shaking the whole container under light shielding. After the reaction, the resultant was dried in an oven at 110 ° C. for 8 hours, washed with a sufficient amount of purified water, and dried.
  • Lectin was spotted on the GTMS-coated slide glass prepared in (2) to prepare a lectin array.
  • a stamp pin having a tip diameter of 0.40 mm was used, and a spot having a diameter of about 0.5 mm was arranged on a slide glass. The following conditions were recorded on the computer attached to the microarray spotter when the lectin was fixed to the slide glass, and the stamp pin operation program was executed.
  • the stamp pin was immersed in the immobilized sample solution in a 96-well PCR microtiter plate for 1 second, lifted up by bow I, and brought into contact with a predetermined position on the surface of the slide glass for 1 second. While repeating this operation for each spot, six spots were spotted in one horizontal row from the same sample solution, and then the stamp pins were washed.
  • the tip of the stamp pin is immersed in a 0.05% SDS solution for 2 seconds, the stamp pin is dried in a vacuum device for 15 seconds, further immersed in purified water for 2 seconds, dried in a vacuum device for 15 seconds, and finally It was immersed in ethanol for 2 seconds and dried in a force vacuum device for 15 seconds.
  • the probe solution was brought into contact with the array by adding 50 L of each fluorescence-labeled iridose protein probe solution adjusted to about 100 ng / mL to each reaction tank to the slide after blocking.
  • excitation light is injected from the end surface of the slide glass using the GTMAS Scan III (Nippon Laser Electronics), an evanescent excitation type microarray scanner. Then, the fluorescence generated by the excitation was detected by an ICCD (Charge Coupled Device with Image Intensifier) camera provided on the lower surface of the slide glass. After scanning the fluorescent image of almost the entire surface of the slide glass, the obtained image was saved in the TIFF file format. The parameters at the time of scanning were unified with a gain of "4000 times", an integration number of "8 times”, and an exposure time of "110 msec".
  • Array-Pro Analyzer Ver. 4.5 Media Cybernetics
  • the brightness of each spot was calculated by the above analysis software, and the brightness of the non-spot area was set as a background value.
  • the value obtained by subtracting the background value from the brightness of each spot was used as the net brightness value, and the average value and standard deviation were calculated for each spot from the same sample arranged in five rows.
  • this Cy3_ASF was fragmented by trypsin treatment to prepare a Cy3-ASF peptide.
  • Example 3 was carried out by the method described in (2).
  • the lectins to be immobilized are grouped according to the major sugar recognition ability of each lectin, and then 5 types of fucose recognition lectins, 6 types of sialic acid recognition lectins, 3 types of ratatosamine structure recognition lectins, and 3 types of galactose recognition lectins Six kinds, 11 kinds of galactosamine recognition lectins, 4 kinds of mannose recognition lectins, and 5 kinds of chitin structure recognition lectins, a total of 40 kinds of lectins were selected, and an array immobilized on a slide glass was prepared. The experimental operation was performed by the method described in Example 3 (3).
  • RCA120 which strongly recognizes the ratatosamine structure, was used as a lectin probe
  • BSA which has no sugar-binding ability
  • Fluorescently labeled lectin probes were prepared by fluorescent labeling using the fluorescent dye Cy3. Lectin is dissolved in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.3) to a final concentration of 1 mg / mL, mixed with 1.0 mg of Cy3 powder per 1 m, and reacted for 1 hour in a dark place with appropriate stirring. I let it. After the reaction, unreacted Cy3 dye was removed using an ultrafiltration filter kit.
  • GTMS coated slides were performed by the method described in Example 5 (2).
  • Glycopeptides were spotted on the GTMS-coated slide glass ( Figure 3) prepared in (2) to prepare a glycopeptide array.
  • a spot having a diameter of about 0.5 mm was arranged on a slide glass by using a stamp pin having a tip diameter of 0.40 mm using a STAMPMAN manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd. as a microarray spotter.
  • the immobilized glycopeptide sample was obtained by fragmenting the glycoprotein fraction purified using a mouse liver soluble fractional lectin column with trypsin, followed by peptide fragmentation.
  • the glycopeptide fractionated by HPLC was used.
  • the following conditions were stored in the computer attached to the microarray spotter, and the stamp pin operation program was executed.
  • the stamp pin was immersed in a sample solution for fixing in a 96-well PCR microtiter plate for 1 second, then lifted up, and brought into contact with a predetermined position on the surface of the slide glass for 1 second. This operation was repeated for each spot, and after six spots were made in one horizontal row of the same sample solution force, the stamp pins were washed.
  • the tip of the stamp pin was dipped in a 0.05% SDS solution for 2 seconds, the stamp pin was dried in a vacuum device for 15 seconds, further dipped in purified water for 2 seconds, dried in a vacuum device for 15 seconds, and finally washed. Immersed in ethanol for 2 seconds in a vacuum device A drying operation for 15 seconds was performed.
  • Methods for preparing a glycopeptide array include 1) immobilizing purified glycopeptides, 2) immobilizing crude glycopeptides, and 3) immobilizing glycopeptide fractions separated by HPLC. It is possible. In this experiment, an array of fractions separated by HPLC could be prepared and proved to be useful.
  • the state of glycosylation of the glycoprotein in the living body is analyzed.
  • a method of observing the interaction between a lectin and a sugar chain in a solution in an equilibrium state for the first time has been put to practical use.
  • This technique has an interaction like the traditional lectin plot. It is possible to obtain the information of the middle part that is not nothing (0 or 1), that is, the strength information of the connection from the luminance value (for example, from 0 to 6 steps).
  • by preparing an array for lectin-sugar chain interaction analysis for various uses it can be used for diagnosis / determination from undiluted or diluted solutions such as blood, body fluids, tissue extracts, etc. The application to quality control of protein products is expected.

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Abstract

　糖鎖に相互作用を示すタンパク質の基板への固定化方法の最適条件を検討した結果、スライドガラス表面にGTMSコートを施すことにより、従来よりS/N比の高い条件で固定化されることが判明した。さらに、複数の穴を有するラバーが貼り付けられた複数の反応槽を有する基板を用いること、また、レクチンをスポットし、PBSTで洗浄することで、糖鎖-レクチン間の弱い相互作用をより感度良く検出することに成功した。また、エバネッセント励起方式のスキャナーを導入することにより、プローブ溶液の洗浄除去操作を行うことなく、レクチン-糖鎖間の相互作用を検出することが可能となった。

Description

タンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法
技術分野
[0001] 本発明は、タンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法に関する。
背景技術
[0002] 生体の生命機能を担う主役であるタンパク質力 細胞社会の中において秩序正しく 機能を発揮するためには、糖鎖修飾をはじめとする翻訳後修飾が大変に重要な役割 を担っている。生体内のほとんどのタンパク質は糖鎖による修飾をうけており、タンパ ク質に付加した糖鎖がウィルスの感染、原虫の寄生、感染、毒素の結合、ホルモンの 結合、受精、発生分化、タンパク質の安定性、がん細胞転移、アポトーシスなど、生 命現象の様々な場で重要な役割を果たしていることが近年次々と明らかになつてき た。
[0003] 糖鎖機能の解析のためには、まずその糖鎖の構造解析が欠かせな!/ヽ。今後も糖鎖 構造解析法の重要性は増すことが予想される。しかし糖鎖の構造解析は多大な時間 と労力、経験を要することから、従来の手法に基づき完全な構造決定を目指すので はなぐより簡便に、高速、高感度、かつ高精度に多彩な糖鎖構造の特徴を抽出し、 相互識別できるシステム開発が期待されて 、た。
[0004] マイクロアレイは多種の DNA'タンパク質等の固定ィ匕試料を高密度に固相担体 (ガ ラス'メンブレン'シリコンチップ）上にスポット状に固定ィ匕したものの総称であり、固定 化した多種の試料スポットに対して特異的に結合する分子（以下プローブ）の有無を 検出することが可能である。プローブ分子には一般的には蛍光標識ィ匕されたものが 用いられており、プローブ溶液をアレイ表面と反応させた後に、蛍光検出スキャナー で観察することにより各試料スポットに結合したプローブ分子の定量的解析を行うこと ができる。米国 Affimetrix社が DNAマイクロアレイを開発して以来、マイクロアレイは非 常に広範な研究分野において使用され、人類に様々な新しい知見をもたらしてきた
[0005] 第三の生命鎖と呼ばれる糖鎖の構造'機能情報を研究する上で、マイクロアレイを 利用した糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質 (糖結合性タンパク質、例えば、レ クチン等)の迅速かつ高感度な大規模相互作用解析が可能となれば、基礎研究力 医療診断や産業応用に至るまで、広範隨こ利用されうる非常に有用なツールになる ことが考えられる。
[0006] 糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質間の結合は抗原抗体反応の一般的な解 離定数 (K = 10— 8以下)等に比べて、一般的に弱い相互作用であることが知られてお
d
り、これらの解離定数 (K )は 10— 6 Mかそれ以上であることが多い。また糖鎖と糖鎖に
d
相互作用を示すタンパク質間の相互作用は比較的速い解離-会合反応力 成り立つ ていることが知られており、結果的に一般的なタンパク質間相互作用や相補的ヌクレ ォチド断片間の相互作用に比べ、洗浄操作などにより解離側に平衡が傾きやすい。 例えば、レクチンを糖タンパク質固定ィ匕カラム等にて精製を行う際にも、レクチンの結 合が弱い場合は洗浄操作中にレクチンがカラム外に流出してしまう現象がしばしば 観察される。
[0007] 従来のスライドガラスを用いた一般的なマイクロアレイ技術では、プローブ溶液を固 定ィ匕試料と接触させて結合反応に至らしめる過程後にプローブ溶液を洗浄 '除去し 、ジェットガスや遠心機を用いてスライドガラスに付着して ヽる水分を完全に除去する 操作を行った後に、マイクロアレイスキャナーを用いてイメージングを行う。これは一 般的なマイクロアレイリーダーが、水分の付着した状態でスライドガラス上の蛍光を観 察することが出来な 、ことに起因して 、る。このようにスキャニングの前段階でプロ一 ブ溶液を除去しても、相補的ヌクレオチド断片や抗原-抗体反応等、強い結合を示す 相互作用においては解離速度定数が十分に小さいため、プローブ分子の解離反応 は容易に進行しないと考えられる。しかし、糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質 間に一般的に見られる解離速度定数の大きい、すなわち弱い相互作用の観察に際 しては、プローブ溶液の除去 ·洗浄操作を行う時点で糖鎖と糖鎖に相互作用を示す タンパク質間の解離反応が進行してしま 、、平衡状態下での正確な相互作用情報を 得ることが困難になる。このため、マイクロアレイにおいて糖鎖と糖鎖に相互作用を示 すタンパク質間の平衡状態での相互作用情報を精密に解析する場合、このプローブ 溶液の洗浄操作が大きな問題点となる。 [0008] DNAマイクロアレイは現在大変広範囲に利用されている。タンパク質のマイクロアレ ィについても DNAの転写産物であるタンパク質の生体内での機能を解明する等の基 礎研究分野やタンパク質の量的，質的な変化に基づいた診断'判断等の応用分野に おいても、将来の利用が期待されており、研究面においても世界中で活発な研究が 行われてきた。しかしタンパク質マイクロアレイの開発'普及は DNAマイクロアレイに比 ベ、圧倒的に遅れているのが現状である。この原因の一つとして、様々に異なる性質 を持つタンパク質試料を、活性を保ったままの状態で、一定の割合で固定ィ匕していく という工程が技術的に大変に難しいということが、以前より多くの研究者によって指摘 されている。
[0009] タンパク質をアレイ上に固定ィ匕する方法として、最も初期に開発された方法として PVDF膜 (非特許文献 1)に代表されるメンブレン上にタンパク質を物理的に吸着させ る方法が挙げられる。転写因子など一部のタンパク質では、ある程度の活性を維持 できると報告されている力 一般性には乏しい。またメンブレン上に固定ィ匕する場合、 アレイの高密度化に限界があった。高密度化を達成するために、金属やガラスなど の固体表面に対してタンパク質を固定ィ匕していく方向で研究が進められてきた力 一 般にタンパク質は金属やガラスなどの固体表面への接触によって変性しやすいという 性質を持つ。このため、固体表面とタンパク質を架橋するための何らかのリンカ一を 使用する固定化方法が、鋭意研究'開発されてきた。
[0010] タンパク質の変性の問題を軽減する手法の一例としては、スライドガラス上に厚さ 10 一 100 mのポリアクリルアミドのパッドを接合して、これにタンパク質をスポットする手 法が挙げられる（非特許文献 2および 3)。この場合、タンパク質は 3次元空間に固定 化されるために、 2次元表面に固定化する手法に比べて、量的に 100倍以上の向上 が望めるという。また、タンパク質を多孔性ポリアクリルアミドゲル内にアミノ基を介して 固定化する方法もある（非特許文献 4)。しカゝしこれらの方法は高価で特殊なスライド ガラスを作製する必要があり、一般的な普及には至っていない。また固定化されたタ ンパク質の層に厚みがあることは、検出法によっては好ましくな 、こともある。
[0011] 現在最も精力的に研究されている固相へのタンパク質固定ィ匕法として、何らかのタ グを付加した形でタンパク質を発現し、タンパク質のタグ部分を介した固相担体への 固定ィ匕を行う方法がある。この方法ではタンパク質の有効リガンド濃度が向上すると V、つた効果やタンパク質の向きをそろえることが原理的に可能であると 、われて 、る
。このような手法の一例として、オリゴヒスチジンタグを介して、ニッケル錯体で表面修 飾した基板へ固定化する方法や (非特許文献 5)、アビジン-ピオチンを介した固定ィ匕 法 (特許文献 1)を挙げることができる。
[0012] このような方法はタンパク質の活性を保ったまま固定ィ匕する、あるいは固定ィ匕率を そろえるという点で有効な方法であると考えられる。しかしマイクロアレイに固定ィ匕しょ うとするすべてのタンパク質について遺伝子レベルでタグを付加し、大腸菌、ないし 無細胞系等で発現及び精製を行うことは多額のコストと莫大な労力が必要となると考 えられる点で、現時点で一般的な研究者が自在かつ個々の要求に合わせる形で気 軽に利用することは難しい。
[0013] これに対し、タンパク質の官能基を固相担体との固定ィ匕に利用する方法は、天然か ら抽出したままのタンパク質や市販のタンパク質試料をそのまま固定ィ匕し、マイクロア レイに利用できると ヽぅ特徴をもつ。タンパク質中のアミノ基を介した固相担体への固 定化方法としては、固相表面に結合させた活性エステル基を介してタンパク質を固 定化する方法や、固相表面に配置したエポキシ基を介してタンパク質を固定ィ匕する 手法が挙げられる（非特許文献 6)。タンパク質をアミノ基を介して固定ィ匕する方法は シンプルな方法である力 市販のタンパク質や生体抽出'成分、特定のタグのない糸且 み換えタンパク質等においても簡便に固定ィ匕することができるため、個々の使用者が 自分の目的に合わせ、自在にタンパク質を選択し、迅速かつ安価に目的にあったマ イクロアレイに最適化して使用することができる。タンパク質のアミノ基を介した固定ィ匕 方法の欠点としては、タンパク質中のリジン残基の数が個々のタンパク質によって異 なることや、固定ィ匕に用いられるリジン残基の位置によってはタンパク質の不活化が 起こる可能性等が挙げられる。
[0014] 特許文献 1：特許出願 2001— 520104
特許文献 2：特許公開平 8— 201383
特許文献 3：特許公表 2002— 544485
非特許文献 1 : L. J. Holt, K. Bussow, G. Walter, I. M. Tomlinson, Nucleic Acids Res., 15, E72, 2000
非特許文献 2 : D. Guschin, G. Yershov, A. Zaslavsky, A. Gemmell, V. Shick, D.
Proudnikov, P. Arenkov, A. Mirzabekov, Anal. Biochem., 250, 203—211, 1997 非特許文献 3 : A. Lueking, M. Horn, H. Eickhoff, K. Bussow, H. Lehrach, G.
Walter, Anal. Biochem., 270, 103-111, 1999
非特許文献 4 : P. Mitchell, Nat. BiotechnoL, 20, 225-229, 2002
非特許文献 5 : H. Zhu, M. Bilgin, R. Bangham, D. Hall, A. Casamayor, P. Bertone,
N. Lan, R. Jansen, S. Bidlingmaier, T. Houfek, T. Mitchell, P. Miller, R. A. Dean,
M. Gerstein.M. Snyder, Science, 293, 2101-2105, 2001
非特許文献 6 : H. Zhu, J. F. Klemic, S. Chang, P. Bertone, A. Casamayor, K. G. Klemic, D. Smith, M. Gerstein, M. A. Reed, M. Snyder, Nat. Genetics. 26, 283-289, 2000
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0015] 本発明の目的は、より簡便に、高速、高感度、かつ高精度に糖鎖に相互作用を示 すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0016] 本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。
タンパク質のアミノ基を介した固定ィ匕方法では、一般的にタンパク質内のランダムな 位置で固相担体との架橋が起こるため、ある確率で活性が損なわれてしまう分子もあ りうるが、逆に、ある確率でタンパク質の活性が生き残る可能性が高い（タンパク質が 全滅する危険性が小さ 、)。多数の性質の異なるタンパク質や性質が未知であるタン ノ ク質を固定ィ匕していくことを想定したマイクロアレイにおいては、このような性質は 実用上、非常に有用である。
[0017] そこで、本発明者らは、レクチンアレイを作製するに当たりマイクロアレイの実用面' 応用面での有用性、解析目的対象物に対する即応性、市場での競争力（コスト面も 含む)等を総合的に考慮すると現時点ではタンパク質のアミノ基を利用した固定ィ匕法 が最適であると判断した。本発明ではアミノ基を介した固定ィ匕法の最適条件をシグナ ル-ノイズ比 (S/N比）とタンパク質固定化密度の向上を目指し多角的に検討した。
[0018] その結果、スライドガラス表面に 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン (GTMS)コ ートを施すことにより、タンパク質試料は、従来製品より S/N比の高い条件で固定化さ れた。さらに、本発明者らは、複数の穴を有するラバーを貼り付けることで、ガラス上 に複数の反応槽を形成させた基板を作成し、レクチンのスポット周囲に正確に蛍光 標識ィ匕プローブ溶液を満たすことを可能にした。また、レクチンをスポットし、 PBSTで 洗浄することで、レクチン固定化密度の向上を図り、糖鎖-レクチン間の弱い相互作 用をより感度良く検出することに成功した。
[0019] 本発明では、レクチン-糖鎖間の平衡状態での相互作用情報を精密に解析する上 での大きな問題点であったプローブ溶液の洗浄除去操作が不要となり、従来法では 洗浄時に洗い流されてしまうような弱い相互作用をも検出することが可能となった。
[0020] このように、固定ィ匕方法および検出方法の改良より、レクチンアレイの実用化が可 能となった。すなわち本発明は、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作 用を分析する方法に関し、以下の〔1〕一〔22〕を提供するものである。
〔1〕以下の工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分 析する方法。
(a)糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板に蛍光標識した被検糖鎖 または被検複合糖質を接触させる工程
(b)基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定するェ 程
〔2〕糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板が、エポキシ基を活性基 として有する化合物がコートされた基板に糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定 化された基板である、〔1〕に記載の方法。
〔3〕エポキシ基を活性基として有する化合物が、 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシ ラン (GTMS)である、〔2〕に記載の方法。
〔4〕以下の工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分 析する方法。
(a)被検複合糖質が固定化された基板に蛍光標識した糖鎖に相互作用を示すタン パク質を接触させる工程
(b)基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定するェ 程
〔5〕被検複合糖質が固定化された基板が、エポキシ基を活性基として有する化合物 がコートされた基板に被検複合糖質が固定化された基板である、〔4〕に記載の方法
〔6〕エポキシ基を活性基として有する化合物が、 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシ ラン (GTMS)である、〔5〕に記載の方法。
〔7〕以下の工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分 析する方法。
(a)複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板 に被検複合糖質を接触させる工程
(b)工程 (a)で得られた基板に蛍光標識した糖鎖に相互作用を示すタンパク質を接 触させる工程
(c)基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定するェ 程
〔8〕複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板 が、エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板に複合糖質の糖鎖 以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板である、〔7〕に記載の 方法。
〔9〕エポキシ基を活性基として有する化合物が、 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシ ラン (GTMS)である、〔8〕に記載の方法。
〔10〕複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が、複合糖質の糖鎖 以外の領域に相互作用を示す抗体である、〔7〕一〔9〕のいずれかに記載の方法。 〔11〕糖鎖に相互作用を示すタンパク質が、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タ ンパク質、糖鎖に親和性を有するサイト力イン、または糖鎖に相互作用を示す抗体で ある、〔1〕一〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔 12〕励起光がエバネッセント波である、〔 1〕一〔 11〕の!、ずれかに記載の方法。 〔13〕複合糖質が、糖タンパク質、プロテオダリカン、または糖脂質である、〔1〕一〔12 〕のいずれかに記載の方法。
〔14〕エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板であって、糖鎖に 相互作用を示すタンパク質、または複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示す タンパク質が固定化された基板。
〔15〕エポキシ基を活性基として有する化合物が、 3-グリシドキシプロピルトリメトキシ シラン (GTMS)である、〔14〕に記載の基板。
〔16〕複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が、複合糖質の糖鎖 以外の領域に相互作用を示す抗体である、〔14〕または〔15〕に記載の基板。
〔17〕糖鎖に相互作用を示すタンパク質が、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タ ンパク質、糖鎖に親和性を有するサイト力イン、または糖鎖に相互作用を示す抗体で ある、〔14〕または〔15〕に記載の基板。
〔18〕複合糖質が、糖タンパク質、プロテオダリカン、または糖脂質である、〔14〕一〔1
7]の!、ずれかに記載の基板。
〔19〕以下の工程を含む、基板の製造方法。
(a)基板にエポキシ基を活性基として有する化合物をコートする工程
(b)工程 (a)で得られた基板に糖鎖に相互作用を示すタンパク質、または複合糖質 の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質を固定ィ匕する工程
〔20〕複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が、複合糖質の糖鎖 以外の領域に相互作用を示す抗体である、〔19〕に記載の方法。
〔21〕糖鎖に相互作用を示すタンパク質が、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タ ンパク質、糖鎖に親和性を有するサイト力イン、または糖鎖に相互作用を示す抗体で ある、〔19〕に記載の方法。
〔22〕複合糖質が、糖タンパク質、プロテオダリカン、または糖脂質である、〔19〕一〔2 1〕の 、ずれかに記載の方法。
図面の簡単な説明
[図 1]本発明のシステムの構成図である。検出手段は、マイクロアレイスキャナー装置 である。 [図 2]本発明のシステムにおけるコンピューターの構成図である。記憶手段 6には、マ イクロアレイスキャナー装置を利用したシステムの処理を実行するためのプログラム 6 1一 63が少なくとも格納されている。記憶手段 (データベース） 7には、糖鎖に相互作 用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報、および Zまたは該 相互作用情報の組み合わせパターン情報が格納されている。
[図 3]ガラス表面に対する GTMSの反応過程を示す図である。 GTMSのアルコキシシリ ル基は水で加水分解されてシラノール基となる。このシラノール基は不安定で、経時 変化により部分的に縮合してオリゴマー状態になり、続いてガラス表面に水素結合的 に吸着する。その後、ガラスを乾燥処理することでガラス表面のシラノール基と脱水 縮合反応が起こり、強固な共有結合となる。
圆 4]本実施例で用いた 8つの反応槽を形成させた基板を示す図である。新規設計し た 8穴ラバーの厚さは 1 mmであり、専用のアジヤスター上でスライドガラスと密着させ ることによってスポット周囲に正確に蛍光標識ィ匕糖プローブ溶液を満たすことが可能 となる。反応槽内に満たす試料の最適量は 50 /z Lである。
[図 5]2種のレクチンを固定化したアレイ上に Cy3-ASF溶液をカ卩えた、レクチンアレイ の性能実験の概念図である。
圆 6]固定ィ匕時のレクチン溶液濃度とスポットの蛍光強度との関係を示す図及び写真 である。親和定数の高いレクチン-糖鎖間の相互作用の検出においては、スポットす るレクチン試料の濃度を 1 mg/mL以上に高濃度化することがシグナル強度の向上に 有効であることが分力つた。
圆 7]レクチン-糖鎖相互作用の検出と、阻害糖による相互作用への影響を示す図及 び写真である。 RCA120のスポットにおいて強い蛍光が、また EW29(Ch)のスポットに お!、ては中程度の蛍光が観察された。
圆 8]阻害糖のレクチン-糖鎖相互作用への影響をグラフとして示す図である。ラクト ース (競合阻害糖)共存下で実験を行った。共存するラタトース (競合阻害糖)の濃度 増加に従って、スポットの蛍光強度が減少していることから、蛍光糖タンパク質プロ一 ブの結合はレクチンと糖鎖間の糖特異的結合反応であるということが確認できた。
[図 9]各糖鎖関連アレイと糖鎖の相互作用の模式図である。 A：レクチンアレイ、およ びプローブとして糖鎖を用いた場合の模式図である。蛍光標識糖鎖の構造類推に用 いることができる。なお、糖鎖は、間接的に蛍光標識することもできる。 B :レクチンァ レイ、およびプローブとして糖タンパク質を用いた場合の模式図である。タンパク質上 の糖鎖構造の類推に用いることができる。なお、糖鎖は、間接的に蛍光標識すること もできる。 C :糖ペプチドアレイ、およびプローブとしてレクチンを用いた場合の模式図 である。分画したペプチド上の糖鎖構造の類推に用いることができる。 D :糖タンパク 質アレイ、およびプローブとしてレクチンを用いた場合の模式図である。 2次元分画し たタンパク質上の糖鎖構造の類推に用いることができる。 E :抗体アレイ、およびプロ ーブとしてレクチンを用いた場合の模式図である。クルードな糖タンパク質上の糖鎖 構造の類推に用いることができる。
[図 10]レクチン-抗体ハイブリッドアレイの実施例を示す写真である。具体的には、 7 種のレクチンと 2種の抗体を固定ィ匕したアレイに対して、各モデルタンパク質を蛍光 標識ィ匕したプローブ溶液を接触させ、平行ィ匕した後にエバネッセント励起型スキャナ 一を用いて観察した結果を示す。
圆 11]8つの反応槽を使用して、同一スライド上に異なる濃度の阻害糖を共存させて 、相互作用の阻害を観察した結果を示す写真及び図である。（A) RCA120と ASFの結 合にラタトースをカ卩えたケース、（B) ConAと RNase Bの結合にマンノースをカ卩えたケー スである。
[図 12]マウス肝由来糖ペプチドサンプルの HPLC分画フラクションを固定ィ匕した、糖 ペプチドアレイの検出実験の結果を示す図及び写真である。図中、 Fucはフコース認 識レクチン群、 Siaはシアル酸認識レクチン群、 Lacはラタトース認識レクチン群、 Galは ガラクトース認識レクチン群、 GalNAcは N-ァセチルガラタトサミン認識レクチン群、 Manはマンノース認識レクチン群、 Chitinはキチン認識レクチン群を意味する。
[図 13]レクチンアレイの検出に糖ペプチドプローブを用いる実験の結果を示す写真 及び図である。
[図 14]生体由来のクルードな試料をプローブィ匕した際のレクチンアレイによる解析結 果を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態 [0022] 本発明は、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法 を提供する。本発明の方法は、糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基 板に蛍光標識した被検糖鎖または被検複合糖質を接触させる工程、および、基板を 洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定する工程を含む。
[0023] 本発明における糖鎖としては、例えば、糖タンパク質系糖鎖 (N-結合型糖鎖と 0-結 合型糖鎖)、糖脂質系糖鎖、グリコサミノダリカン系糖鎖、または多糖類由来オリゴ糖 鎖などが挙げられる。また、 1) N-結合型糖鎖としては、高マンノース型'混成型'複合 型カゝらなる N-結合型糖鎖など、 2) 0-結合型糖鎖としては、ムチン型（O-GalNAc) ·
0- Fuc型 · O-Man型 · O-Glc型など力もなる 0-結合型糖鎖など、 3)糖脂質系糖鎖とし ては、ガンダリオ系列 'グロボ系列'ラクト 'ネオラクト系列糖鎖など、 4)グリコサミノダリ カン系糖鎖としては、ヒアルロン酸'ケラタン硫酸'へパリン'へパラン硫酸'コンドロイ チン硫酸'デルマタン硫酸など、 5)多糖類由来オリゴ糖鎖としては、キチン、セルロー ス、カードラン、ラミナリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、ァラビノガラタタン、 アルギン酸、フルクタン、フコィダン、キシランなどに由来するオリゴ糖鎖などが例示 できる。
[0024] その他の糖鎖としては、 M3 'M5A' Hybrid (monoagalacto,bisect) -NAl ·ΝΑ1( a
1- 6Fuc) -NA2 (monoagalacto) -NA2 (monoagalacto, bisect) · NA2 · NA2 ( a l— 6Fuc) - A2 · NA2 (bisect) · NA3 · NA3 ( a 1— 6Fuc) · NA4 · NA4 ( a 1— 6Fuc) · NA5
(pentaagalacto.bisect) · Lactose · GA2 · GA1 · GM3— NeuAc · GM3— NeuGc · GM1 · GM2 · GDla，GDlb，GD3，Gb3， Gb4 · Forssman · LNnT · LNT · Galili pentasaccharide · B-hexasaccharide - LNFP-I - LNFP-II (Lea) · LNFP- III (Lex) · LNFP- II (Leb) - A-hexas accharide · A- heptasaccharide · B- pentasaccharide · 6 'Sialyl Lactose · pLNH · jS GalLac- jS Gal Lac · LN3 · GN3 · GN4 · maltotriose · Sialyl Lexなどを挙げることができ
2
る。
[0025] また、本発明にお 、て、複合糖質とは、糖鎖を持つ生体内高分子の総称である。本 発明の複合糖質としては、糖タンパク質 (糖ペプチドも含む）、プロテオダリカン、糖脂 質が挙げられる。
[0026] 本発明の糖鎖に相互作用を示すタンパク質には、糖鎖に相互作用を示すペプチド も含まれる。本発明の糖鎖に相互作用を示すタンパク質としては、レクチン、糖結合ド メインを有する酵素タンパク質、糖鎖に親和性を有するサイト力イン、これらの変異体 、または糖鎖に相互作用を示す抗体などが挙げられる。
[0027] 上記レクチンとしては、動'植物、真菌、細菌、ウィルスなど力 得られる様々な分子 家系に属するレクチン、すなわち、細菌を含むすべての生物界で見出されるリシン B 鎖関連の「R型レクチン」、真核生物全般に存在し糖タンパク質のフォールデイングに 関与する「カルネキシン'カルレティキュリン」、多細胞動物に広く存在し、「セレクチン 」、 「コレクチン」等代表的なレクチンを多く含むカルシウム要求性の「C型レクチン」、 動物界に広く分布しガラクトースに特異性を示す「ガレクチン」、植物豆科で大きな家 系を形成する「豆科レクチン」、およびこれと構造類似性をもち動物細胞内輸送に関 わる「L型レクチン」、リソソーム酵素の細胞内輸送に関わるマンノース 6-リン酸結合性 の「P型レクチン」、グリコサミノダリカンをはじめとする酸性糖鎖に結合する「ァネキシ ン」、免疫グロブリン超家系に属し「シグレック」を含む「I型レクチン」などが挙げられる
[0028] その他のレクチンとしては、 ACA (センニンコクレクチン） · BPL (ムラサキモクワンジュ レクチン) 'ConA (タチナタマメレクチン) 'DBA (Horsegramレクチン) · DSA (ヨウシュチ ヨウセンアサガオレクチン) 'ECA (ディゴマメレクチン) 'EEL (Spindle Treeレクチン) . GNA (ユキノハナレクチン) 'GSL I (グリフォ-アマメレクチン) 'GSL II (グリフォ-アマメ レクチン) 'HHL (ァマリリスレクチン) 'ジャカリン (ジャックフルーツレクチン) 'LBA (リマ マメレクチン) 'LCA (レンズマメレクチン) 'LEL (トマトレクチン) 'LTL (ロータスマメレク チン) ·ΜΡΑ (アメリカハリグヮレクチン) ·ΝΡΑ (ラッパズイセンレクチン) ·ΡΗΑ-Ε (インゲ ンマメレクチン) 'PHA-L (インゲンマメレクチン) ·ΡΝΑ (ピーナッツレクチン) 'PSA (ェン ドウレクチン) 'PTL-I (シカクマメレクチン) 'PTL-II (シカクマメレクチン) 'PWM (ヨウシ ュャマゴボウレクチン) RCA120 (ヒママメレクチン) 'SBA (ダイズレクチン) 'SJA (ェンジ ユレクチン) 'SNA (セィヨウニヮトコレクチン) 'SSA (二ホンニヮトコレクチン) 'STL (ジャ ガイモレクチン) .TJA-I (キカラスゥリレクチン) .TJA-II (キカラスゥリレクチン) 'UDA (Common Stinging Nettleレクチン) · UEA I (ハリエ-シダレクチン) 'VFA (ソラマメレク チン) 'WA (ヘアリーべッチレクチン) 'WFA (フジレクチン) 'WGA (パンコムギレクチ ン)などを挙げることができる。
[0029] 上記糖結合ドメインを有する酵素タンパク質としては、各種グリコシダーゼ (キシラナ ーゼ、グルカナーゼ）、および糖転移酵素（UDP-GalNA ポリペプチド GalNAc転移 酵素)などが例示できる。また、糖鎖に親和性を有するサイト力インとしては、インター ロイキン- 2 (IL-2)、インターロイキン- 12 (IL-12)、腫瘍壊死因子 α (TNF- a )、繊維 芽細胞成長因子 (FGF)などが例示できる。また、糖鎖に相互作用を示す抗体として は、糖鎖関連腫瘍マーカー（CA19- 9、フォルスマン抗原、 T抗原、 Tn抗原、シァリル Τ抗原)、血液型関連糖鎖 (A, Β, Η, Lea, Lex抗原)、分化関連抗原 (Ii, SSEA-1-4) に対する抗体などが例示できる。
[0030] 本発明における基板としては、ガラス、石英ガラス、合成石英ガラスなどが例示でき る力 これらに限定されるものではない。また、本発明における糖鎖に相互作用を示 すタンパク質が固定化された基板は、好ましくは、エポキシ基を活性基として有する 化合物がコートされた基板に糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板 である。
[0031] エポキシ基を活性基として有する化合物としては、好ましくは 3-グリシドキシプロピ ルトリメトキシシラン（GTMS)が挙げられるが、これに限定されない。その他に、 2-(3、 4 トキシシラン、 3-グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、または分岐したスぺーサ一の 先端にエポキシ基を複数持つシランカップリング化合物で、好ましくはスぺーサ一と してポリエチレングリコールやタンパク質、ピオチン.アビジン等を含む化合物などが 例示できる。
[0032] 本発明の、糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板は、下記の方法 で作成することができる。
[0033] まず、基板にエポキシ基を活性基として有する化合物をコートする。例えば、ェポキ シ基を活性基として有する化合物として GTMSを用いる場合、実施例に記載の方法 で行うことができる。具体的には、スライドガラスを 10% KOH I MeOH溶液に浸し、容 器ごと振盪させた状態で 1時間放置しガラス表面を処理し、これを十分量の精製水 (ミ リ Q水）により洗浄した後、 60°Cのオーブン内で乾燥させる。次にスライドガラスを 2% GTMSアセトン溶液に浸し、遮光下で容器ごと振盪させながら 1時間反応させる。 GTMSのアルコキシシリル基は水でカ卩水分解されてシラノール基となっており、このシ ラノール基は不安定で、経時変化により部分的に結合してオリゴマー状態になり、続 いてガラス表面に水素結合的に吸着する。反応後、スライドガラスを 110°Cのオーブ ン内で 8時間乾燥させる。乾燥処理により、ガラス表面のシラノール基と脱水縮合反 応が起こり、強力な共有結合となる。一連の GTMSコーティング方法を図 3に示す。
[0034] 次に、エポキシ基を活性基として有する化合物をコーティングした基板に、糖鎖に 相互作用を示すタンパク質を固定ィ匕する。糖鎖に相互作用を示すタンパク質の固定 化は、共有結合によって行われる。具体的には、該基板にアミノ基を活性基として有 する化合物をスポットし、反応させることで固定ィ匕することができる。スポッターとして は、 日本レーザ電子社製 STAMPMANなどを利用することができる。糖鎖に相互作用 を示すタンパク質がレクチンである場合、スポットするレクチンの濃度は、特に限定は ないが、 1 mgZmL以上であることが好ましい。さらに、より好ましくは、スポット処理後 Tween20を含む PBS溶液 (PBST)で洗浄することにより、未結合レクチンを除去するこ とがでさる。
[0035] 上記糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板は、複数の反応槽を形 成させた基板であることが好ましい。より好ましくは、複数の穴を有するラバーを貼り 付けることで、複数の反応槽を形成させた基板である。一例としては、実施例に記載 のように、糖鎖に相互作用を示すタンパク質を固定ィ匕したスライドガラスに対し、本発 明者らが設計 ·開発した 8穴ラバーを所定の位置に貼り付け、 8つの反応槽を作製さ せる。この 8穴ラバーには 8つの長方形の穴が規則正しく空いており、スライドガラスに 貼り付けたときに 8つの反応槽を形成することができる。この反応槽に蛍光標識化プ ローブ溶液を満たすことで、糖鎖に相互作用を示すタンパク質との接触を円滑に行う ことが可能になる。また、この反応槽は 8穴ラバーに限定されるものではなぐ例えば ガラス表面の非スポット領域を撥水コートすることで反応場を形成することも可能であ る。より好ましくは反応場を多数ィ匕することである。本発明においては、同一基板上に 複数種の糖鎖に相互作用を示すタンパク質をスポットして用いることもできる。
[0036] 本発明の方法では、上記糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板に 蛍光標識した被検糖鎖または被検複合糖質を接触させる。
[0037] 本発明にお ヽて、被検糖鎖または被検複合糖質の蛍光標識剤としては、 2-アミノビ リジン、 Cy3、 Cy3.5、 Cy5、テトラメチルローダミン、フルォレセイン骨格を持つ蛍光色 素各種、モレキュラープローブス社製蛍光色素 Alexaシリーズ、量子ドット蛍光色素が 挙げられるが、糖鎖を蛍光標識する性質を有する物質であれば、これらに限定され ない。
[0038] 被検糖鎖または被検複合糖質は、直接的または間接的に蛍光標識することができ る。被検糖鎖と予め蛍光標識した糖鎖に相互作用を示すタンパク質を結合させること により、被検糖鎖を間接的に蛍光標識できる。
[0039] また、予め蛍光標識したタンパク質であって、被検複合糖質の糖鎖以外の部分に 相互作用を示すタンパク質 (例えば被検複合糖質の糖鎖以外の部分に相互作用を 示す抗体)と被検複合糖質を結合させることにより、被検複合糖質を間接的に蛍光標 識できる。
[0040] また、予め蛍光標識したタンパク質であって糖鎖に相互作用を示すタンパク質と被 検複合糖質を結合させることによつても、被検複合糖質を間接的に蛍光標識できる（ この場合、被検複合糖質が有する糖鎖のうち、糖鎖に相互作用を示すタンパク質が 結合した糖鎖以外の糖鎖が基板に結合する)。
[0041] 例えば、標的複合糖質の糖鎖以外の部分に相互作用を示す予め蛍光標識した抗 体を、標的複合糖質試料を含むサンプル ·血液 ·体液 ·生体抽出成分，食品成分等 のクルードな試料に作用させることで、クルードな試料カゝら標的複合糖質を分離'精 製することなく選択的に蛍光標識できる。また、予め蛍光標識した上記抗体を作用さ せたクルードな試料を、例えばレクチンが固定化された基板に接触させることで、標 的複合糖質の糖鎖情報だけを選択的に観察できる。
[0042] 本発明の方法では、次いで、基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、それぞれ の糖鎖に相互作用を示すタンパク質に対する被検糖鎖または被検複合糖質の相互 作用を測定する。
[0043] 糖鎖に相互作用を示すタンパク質と被検糖鎖または被検複合糖質の相互作用は 一般的に良く知られているタンパク質間相互作用などに比べて弱いため、プローブ 溶液の除去'洗浄操作を行うことで糖鎖に相互作用を示すタンパク質と被検糖鎖また は被検複合糖質間の解離反応が進行してしま \平衡状態下での正確な相互作用 情報を得ることが出来な 、ケースが生じて 、た。
[0044] 本発明者らは上記問題を、プローブ溶液の洗浄を行うことなぐ励起光を作用させ て励起される蛍光の強度を測定することで解決した。より具体的には、励起光を基板 の固定ィ匕されていない面カゝら入射して、励起された蛍光を検出する測定方法である 。本発明における励起光としては、特に限定はなぐ白色光から切り出した光源、好 ましくは単一波長力もなるレーザ光、より好ましくはエバネッセント波が挙げられる。励 起光の検出は、エバネッセント型励起マイクロアレイスキャナーの使用が好ましいが、 その他に共焦点型マイクロアレイスキャナーを使用することもできる。
[0045] 例えば、エバネッセント励起方式では励起光をガラス内部で全反射させた際に界 面からの高さ 200— 300 nm (励起波長の半分程度）の範囲に、エバネッセント光と呼 ばれる微弱光がしみ出し、このエバネッセント光により蛍光物質を励起するために、 プローブ分子を含む溶液をスライドガラス上に接触させた状態で励起光を入射して 蛍光を観察する際にも、ブラウン運動をしているプローブ分子をほとんど励起すること なぐ結合反応に預カるプローブ分子を選択的に観察することができる。
[0046] 本発明の方法は、蛍光標識した被検糖鎖と基板に固定化された糖鎖に相互作用 を示すタンパク質との相互作用を利用した糖鎖構造解析に用いることができる。すな わち本発明の方法は、糖鎖構造解析を迅速'簡便に行う糖鎖プロファイラ一としての 応用が期待される。例えば、蛋白質核酸酵素 2003年 8月号増刊 Vol.48.NO. l lに記載 のプロフアイリング方法が応用可能である。
[0047] すなわち、本発明は、コンピューターを用いた糖鎖構造分析システムに利用可能で ある。該システムを使用することで、被検糖鎖が既知構造を有している場合は被検糖 鎖の構造を同定することができ、被検糖鎖が未知構造を有して 、る場合であっても 被検糖鎖中に存在する特徴的な構造（ α 2-3シアル酸'《2-6シアル酸' oc 1-3ガラク トース' α 1-3フコース' a 1-6フコース 'バイセクト N-ァセチルダルコサミン'硫酸化な ど）の予測、ないし既知構造糖鎖との類似性を指摘することができる。このシステムは 、蛍光標識した被検糖鎖を接触させた糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質がそ れぞれ固定化された基板をマイクロアレイスキャナー装置にセットすると、自動的に、 被検糖鎖の構造が表示されるシステムである。本発明のシステムでは、糖鎖に相互 作用を示す種々のタンパク質がそれぞれ固定化された基板に蛍光標識した被検糖 鎖を接触させる工程を自動化することもできる。すなわち、微小流路系を基板上の反 応槽に導き、流路内に送液する溶液の種類'濃度 ·流速をコントロールすることで、ブ ロッキングやブロッキング液の洗浄除去工程、蛍光標識糖鎖溶液の接触工程を一元 的にコントロールすることができる。本発明のシステムには質量分析や、酵素消化を 組み合わせることもでき、これらの方法を用いることでさらに信頼度の高いデータを得 ることができるため、大変に有用である。
[0048] 図 1に本発明のシステム構成図の一例を示す。マイクロアレイスキャナー装置を用 Vヽたシステムは以下力 構成される。
(a)糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報 が格納されて 、る記憶手段 (データベース）
(b)糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質がそれぞれ固定化された基板に、蛍光 標識した被検糖鎖を接触させ、洗浄操作を行わずに、該基板に励起光を入射し、励 起される蛍光の強度を検出する検出手段
(c)検出された蛍光強度の組み合わせ情報を、 (a)に格納されている情報と照合し、 組み合わせ情報のパターンが一致する構造既知糖鎖を 1つないし複数選出する演 算手段を含むコンピューター
(d)選出結果を表示する表示手段
[0049] データベースについては、図 1のようにコンピューターの外部にある場合、図 2のよう にコンピューター内部にある場合、共に許容される。また、該データベースを利用す ることで、限定されたレクチン数であっても多種類の糖鎖を識別することが可能である 。理論的には 10種類のレクチンであってもその特異性が異なる場合、識別可能な糖 鎖の種類は 61Q=60,466,176となり、事実上自然界に存在する殆どの糖鎖構造の識 別が可能である。
[0050] 図 2に、本発明のシステムにおけるコンピューター構成図の一例を示す。入力手段 1と出力手段 2がバス線 3に接続されている。一時記憶手段 4は、入力された情報、お よび算出された情報などを一時的に記憶する。中央処理装置 (CPU) 5は、本発明の プログラムの命令を受けて各種演算を行う。記憶手段 (データベース） 7には、糖鎖に 相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報、および Z または該相互作用情報の組み合わせパターン情報が格納されて 、る。相互作用情 報として、本発明のマイクロアレイスキャナー装置を利用した方法やシステムによって 得られた蛍光強度情報、また、これまでに確立されている様々な実験系から得られた 情報が利用可能である。
[0051] 記憶手段 6には、本発明の処理を実行するためのプログラムを含む各種プログラム が格納されている。本発明の処理を実行するためのプログラムには、入力された蛍光 強度の組み合わせ情報を、データベースに格納されて 、る糖鎖に相互作用を示す 種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報の組み合わせ情報と照合し 、組み合わせ情報のパターンが一致する構造既知糖鎖 (データベースに格納されて いる構造既知糖鎖情報)を 1つないし複数選出するプログラム 61、表示プログラム 62 、およびこれらを制御するためのプログラム 63が少なくとも含まれる。
[0052] 相互作用情報の組み合わせ情報の照合過程においては、相互作用情報の組み合 わせ情報の値同士を比較してもよい。プログラム 61には、例えば、入力された蛍光強 度の組み合わせ情報の値とデータベースに格納されている相互作用情報の組み合 わせ情報の値を比較して、その値の近さから構造既知糖鎖を 1つないし複数選出す る機能が組み込まれて 、てもよ 、。
[0053] また、相互作用情報の組み合わせ情報の照合過程にお!、ては、相互作用情報の 組み合わせ情報をパターンィ匕して、そのパターン同士を比較してもよい。このような 観点から、記憶手段 6には、プログラム 61の代わりに (または、プログラム 61とともに） 、入力された蛍光強度の組み合わせ情報をパターンィ匕するプログラム 61— 1、データ ベースに格納されている糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の 糖鎖の相互作用情報の組み合わせ情報をパターンィ匕するプログラム 61— 2、および 、入力された蛍光強度の組み合わせ情報のパターンを、データベースに格納されて いる糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報 の組み合わせ情報のパターンと照合し、組み合わせ情報のパターンが一致する構造 既知糖鎖を 1つな 、し複数選出するプログラム 61—3が格納されて 、てもよ 、。このパ ターンィ匕に際しては、適切な内部標準を用いて相互作用情報の規格ィ匕を行うことも 可能である。プログラム 61— 1や 61— 2には、例えば、任意の設定スレツショルド値が 入力されることで、そのスレツショルドの範囲に相互作用情報をレベル分けし、コード 化する（各レベルに対して、例えば異なる数字や異なる色を当てはめる)機能が組み 込まれている。
[0054] プログラム 61— 3は、プログラム 61— 1を実行して得られるパターンを、プログラム 61 —2を実行して得られるパターンと照合し、組み合わせ情報のパターンが一致する構 造既知糖鎖を 1つないし複数選出するプログラムである。なお、データベースにパタ ーン情報が格納されている場合は、プログラム 61— 3は、プログラム 61—1を実行して 得られるパターンを、データベースに格納されているパターンと照合し、パターンが 一致する構造既知糖鎖を 1つないし複数選出する。プログラム 61— 3には、例えば、 構造既知糖鎖のコードと被検糖鎖のコードを比較して、被検糖鎖とコードが一致する 構造既知糖鎖を選出する機能が組み込まれて!/ヽる。
[0055] プログラム 62は、例えば、蛍光強度情報の表示、相互作用情報の表示、選出され た構造既知糖鎖情報の表示などを行う。
[0056] 本発明においては、上述のプログラムを 1つのプログラムにまとめることもできる。
[0057] 本発明のシステムにより実行される処理のフローの一例としては、まず、蛍光標識し た被検糖鎖を接触させた糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質がそれぞれ固定 ィ匕された基板がマイクロアレイスキャナー装置にセットされた場合に、該基板に励起 光が入射され、励起される蛍光の強度が検出される。複数の基板がマイクロアレイス キヤナー装置にセットされた場合は、該複数の基板が順次自動的に検出部に固定さ れ、スキャニングが行われる。処理のフローの一例としては、次いで、蛍光強度情報 が自動的にコンピューターに入力される。入力された情報は、コンピューターの記憶 手段または一時記憶手段に格納しておくことができる。また、蛍光強度情報は、デー タベースに格納されてもよい。蛍光強度情報を蓄積することで、今まで存在しえなか つた大規模かつ実用性の高い、糖鎖に相互作用を示すタンパク質に対する糖鎖の 相互作用情報データベースを構築することができる。 [0058] 本発明では、中央処理装置 (CPU)などの演算手段が記憶手段中のプログラム 62 の指令を受け、記憶手段または一時記憶手段に格納された蛍光強度情報を読み出 し、該蛍光強度情報を表示することもできる。例えば、あらかじめ性状を十分に調査し た基準となる糖鎖に相互作用を示すタンパク質試料スポット（内部標準スポット)の発 する蛍光強度を基準として、各スポットの輝度値を補正した値を表示することができる
。内部標準スポットは複数であってもよい。
[0059] 処理のフローの一例としては、次いで、入力された蛍光強度の組み合わせ情報を、 データベースに格納されている糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複 数の糖鎖の相互作用情報の組み合わせ情報と照合し、組み合わせ情報のパターン がー致する構造既知糖鎖を 1つないし複数選出する。この処理工程は、中央処理装 置 (CPU)などの演算手段が記憶手段中のプログラム 61の指令を受け、記憶手段ま たは一時記憶手段に格納された蛍光強度の組み合わせ情報とデータベースに格納 されている糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作 用情報の組み合わせ情報を読み出し、それぞれの組み合わせ情報を照合し、組み 合わせ情報のパターンが一致する構造既知糖鎖を 1つないし複数選出する。選出さ れた構造既知糖鎖情報は、コンピューターの記憶手段または一時記憶手段に格納 しておくことができる。
[0060] データベースがコンピューターの外部にある場合は、中央処理装置（CPU)などの 演算手段が記憶手段中のプログラム 61の指令を受け、データベースに格納されてい る糖鎖に相互作用を示す種々のタンパク質に対する複数の糖鎖の相互作用情報の 組み合わせ情報をコンピューターに入力し、記憶手段または一時記憶手段に格納さ れた蛍光強度の組み合わせ情報を読み出し、それぞれの組み合わせ情報を照合し 、組み合わせ情報のパターンが一致する構造既知糖鎖を 1つないし複数選出する。
[0061] なお、プログラム 61の代わりに、プログラム 61—1— 61— 3を用いるときも、同様なフ ローで処理される。
[0062] 処理のフローの一例としては、次 、で、選出結果が表示手段によって表示される。
この処理工程では、中央処理装置 (CPU)などの演算手段が記憶手段中のプロダラ ム 62の指令を受け、記憶手段または一時記憶手段に格納された構造既知糖鎖情報 を読み出し、表示する。
[0063] 本発明は、被検複合糖質が固定化された基板に蛍光標識した糖鎖に相互作用を 示すタンパク質を接触させる工程、および、基板を洗浄せずに、励起光を作用させて 、励起される蛍光の強度を測定する工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質 と糖鎖との相互作用を分析する方法を提供する。
[0064] 本発明における、被検複合糖質が固定化された基板は、好ましくは、エポキシ基を 活性基として有する化合物がコートされた基板に被検複合糖質が固定化された基板 であり、より好ましくは、エポキシ基を活性基として有する化合物力 GTMSである基 板である。各工程は、上述の方法と同様である。本発明の方法は、基板に固定化さ れた被検複合糖質の糖鎖付加状況を蛍光標識レクチン等により調べることで、生体 にあるタンパク質を分離後、各タンパク質成分それぞれについての糖鎖付加状況を タンパク質の一団について一度に調べる（グライコフォーム解析)ことができる手段と して有用である。またタンパク質製剤等の糖鎖部分の品質管理チェック等に応用が 期待される。
[0065] 本発明は、また、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定 ィ匕された基板に被検複合糖質を接触させる工程、該工程で得られた基板に蛍光標 識した糖鎖に相互作用を示すタンパク質を接触させる工程、および、基板を洗浄せ ずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定する工程を含む、糖鎖に 相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法を提供する。
[0066] 本発明における、被検複合糖質が固定化された基板は、好ましくは、エポキシ基を 活性基として有する化合物がコートされた基板に被検複合糖質が固定化された基板 であり、より好ましくは、エポキシ基を活性基として有する化合物力 GTMSである基 板である。また、本発明における複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタン ノ ク質は、好ましくは、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示す抗体である。 また、糖鎖に相互作用を示すタンパク質は、好ましくは、レクチン、糖結合ドメインを 有する酵素タンパク質、糖鎖に親和性を有するサイト力イン、これらの変異体、または 糖鎖に相互作用を示す抗体である。各工程は、上述の方法と基本的に同様であるが 、さらに、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された 基板であって、被検複合糖質を接触させた基板に、蛍光標識した糖鎖に相互作用を 示すタンパク質を接触させる工程を含む。該工程は、例えば、複合糖質の糖鎖以外 の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板に対し、被検複合糖質試 料を含むサンプル ·血液 ·体液 ·生体抽出成分 '食品成分等の原液または希釈溶液 を接触させ、十分な反応時間を確保した後に、 PBSないし PBSTで十分に洗浄して被 検複合糖質以外の成分を除く。その後に糖鎖部分に相互作用を示す蛍光標識プロ ーブ溶液を接触させることで行うことができる。
[0067] 本発明は、異なる複合糖質の混合物中から、目的としたタンパク質の糖鎖修飾の 状況を迅速かつ簡便に調べる方法として有用であり、血液 ·体液 ·生体抽出成分 ·食 品成分等の原液または希釈溶液等の様々な成分の混合溶液を精製することなく、目 的タンパク質の糖鎖修飾の状況を観察することで、診断'治療状況の把握等を行うよ うな分野での応用が考えられる。
[0068] 本発明は、（a)基板にエポキシ基を活性基として有する化合物をコートする工程、 および、（b)工程 (a)で得られた基板に糖鎖に相互作用を示すタンパク質、または複 合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質を固定化する工程を含む、 基板の製造方法を提供する。該方法の工程は、詳しくは、上述のとおりである。本発 明はまた、上記方法で製造された基板も提供する。
[0069] すなわち、本発明は、エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板 であって、糖鎖に相互作用を示すタンパク質、または複合糖質の糖鎖以外の領域に 相互作用を示すタンパク質が固定化された基板を提供する。本発明の基板としては 、好ましくは、エポキシ基を活性基として有する化合物力 3-グリシドキシプロピルトリ メトキシシラン (GTMS)である基板である。また、好ましくは、複合糖質の糖鎖以外の 領域に相互作用を示すタンパク質が、複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示 す抗体である基板、あるいは、糖鎖に相互作用を示すタンパク質力 レクチン、糖結 合ドメインを有する酵素タンパク質、糖鎖に親和性を有するサイト力イン、これらの変 異体、または糖鎖に相互作用を示す抗体である、基板である。エポキシ基を活性基と して有する化合物がレクチンである場合、スポットするレクチンの濃度は、特に限定は ないが、 1 mgZmL以上であることが好ましい。さらに、より好ましくは、 PBSTで洗浄す ることでレクチンが固定化された基板である。本発明の基板は、複数の反応槽を形成 させた基板であることが好まし 、。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0070] 以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例 に制限されるものではな 、。
〔実施例 1〕レクチンアレイを利用した糖鎖とレクチンとの相互作用解析
(1)蛍光標識化糖タンパク質プローブ (Cy3-ASF)の調製
蛍光標識化糖タンパク質プローブとして、ァシァ口フェツイン（SIGMA社、以下 ASF) を 550 nm付近に吸収極大波長を持つ蛍光色素である Cy3 Mono-reactive Dye (アマ シャムフアルマシア社、以下 Cy3)を用いて蛍光標識ィ匕して調製した。 ASFは N-結合 型糖鎖と 0-結合型糖鎖を 3本ずつ分子中に持ち、かつ糖鎖中の非還元末端のシァ ル酸キャップが部分的に外れて 、る糖鎖構造を持つことが知られて 、る。 ASFを 0.1 M炭酸緩衝液 (pH 9.3)に終濃度 1 mg/mLになるよう調製した後、 1 mLについて 1.0 mgの Cy3粉末と混合させ、 1時間、適時攪拌しながら暗所で反応させた。
[0071] 次に担体として Sephadex G- 25を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、遊離の Cy3と Cy3-ASFを分離回収し、精製した Cy3-ASFにつ 、て吸光光度計を用いて濃度 及び蛍光標識効率を測定した。タンパク質ベースの収率は 35-40%、蛍光標識効率（ 1タンパク質分子あたりの蛍光色素数）は約 3.0であった。
[0072] (2)スライドガラスへの GTMSコーティング
エポキシ基を活性基として有する 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン (信越シリ コーン社、以降 GTMS)をコーティングしたスライドガラス（図 3)を用い、レクチンをガラ ス表面に固定ィ匕した。 GTMSコーティングは、松浪硝子工業社製のスライドガラスを用 い、以下の手順で行った。スライドガラスを 10% KOH I MeOH溶液に浸し、容器ごと 振盪させた状態で 1時間放置しガラス表面を処理した。これを十分量の精製水 (ミリ Q 水）により洗浄した後、 60°Cのオーブン内で乾燥させた。次にスライドガラスを 2% GTMSアセトン溶液に浸し、遮光下で容器ごと振盪させながら 1時間反応させた。反 応後、 110°Cのオーブン内で 8時間乾燥させた後、十分量の精製水により洗浄し、乾 燥させた。
[0073] (3)スライドガラスへのレクチンの固定化
(2)の GTMSコーティングを施したスライドガラスにレクチンをスポットした。マイクロア レイスポッターとして日本レーザ電子社製 STAMPMANを使用し、先端直径 0.40 mm のスタンプピンを使用してスポットを行ことで、直径約 0.6 - 0.7 mmのスポットをスライ ドガラス上に配置した。スポットする各レクチンを濃度 1 mg/mL (レクチンによっては一 部 0.25 mg/mL)となるようにリン酸緩衝生理食塩水、 pH 7.4 (以下 PBS)に溶解した。 これを 96穴の PCR用マイクロタイタープレート（コ一-ング社）の各反応槽に 10 ずつ分注したものを、マイクロアレイスポッターにセットした。
[0074] スライドガラスへのレクチンの固定ィ匕操作に際しては以下の条件をマイクロアレイス ポッター付属のコンピューターに記憶させ、スタンプピン動作プログラムを実行させた 。まずスタンプピンを 96穴 PCR用マイクロタイタープレート内の固定化試料溶液中に 1秒間浸した後に引き上げ、スライドガラス表面の所定の位置に 1秒間接触させた。こ の動作を 1スポットごとに繰り返しながら、同一試料溶液力も横 1列に 4点スポットを行 つた後、スタンプピンの洗浄工程を行った。洗浄工程ではスタンプピンの針先を 0.05% SDS溶液に 2秒間浸し、スタンプピンをバキューム装置内で 15秒間乾燥させ、さらに 精製水に 2秒間浸した後に、バキューム装置内で 15秒間乾燥、最後にエタノールに 2 秒間浸して力もバキューム装置内で 15秒間の乾燥操作を行った。
[0075] 本実施例では様々な糖結合特異性をもったレクチン 4種 (RCA120、 SSA、組み換え 放線菌由来キシラナーゼのキシラン結合ドメイン (以下 XBD)、組み換えミミズ 29 kDa レクチン由来の C末端側ドメイン（以下 EW29 (Ch) )とネガティブコントロール 1種 (ゥシ 血清アルブミン（以下 BSA))の計 5種のタンパク質をスポットした。 RCA120、 BSAにつ いては SIGMAより購入したもの、 SSAは生化学工業より購入したもの、 XBD, EW29 ( Ch)については本発明者らの研究室で大腸菌にて発現 '精製したものを用いた。
[0076] (4)非スポット面のブロッキング
レクチン溶液をスポット処理後 1時間反応させガラス表面に固定ィ匕した後、未結合 レクチンを洗浄した。洗浄は 0.1% Tween20を含む PBS溶液（PBST)を数回ピペットで スライドガラスに吹き付けるようにかけて洗浄した後、 PBSを用いてさらに十分に洗浄 した。
[0077] このレクチン固定ィ匕後のスライドガラスに対し、本発明者らが設計'開発した 8穴ラバ 一を所定の位置に貼り付け、 8つの反応槽を作製した（図 4)。この 8穴ラバーは厚さ 1 mm力 なる黒色のシリコンゴム製で、縦横 9.5 X 7.5 mm力 なる 8つの長方形の穴が 規則正しく空いており、スライドガラスに貼り付けたときに 8つの反応槽を形成すること ができる。この反応槽に 50 L程度の試料を加えれば、内部を十分量の試料溶液で 満たすことができる。
[0078] レクチンをスポットした領域以外のガラス表面には活性基であるエポキシ基が残存 しているため、非スポット面に対するブロッキング操作を行った。なお、ブロッキング剤 には高純度 BSA (SIGMA)を使用した。 8つの反応槽内に 1% BSAを含む PBS溶液を 50 μ Lずつ満たし、湿度を 90%以上に保った保存容器中で 4°C、 1時間放置し、スライド ガラス上の非スポット面へのブロッキングを行った。反応の間はガラス表面の乾燥防 止に留意した。
[0079] 次にスライドガラス上のブロッキング溶液を除去し、 PBSを用いて十分に洗浄した後 、水分を除去した。タンパク質固定ィ匕後はガラス表面の乾燥によるタンパク質の変性 や、乾燥に伴うバックグラウンドの上昇を防ぐため、可及的速やかに次の操作に移つ た。
[0080] (5)プローブ溶液の添加とスキャニング
(4)で作製したレクチン固定化スライドガラス上の反応槽に相互作用を解析したい 蛍光標識ィ匕糖タンパク質プローブ溶液を加えた。蛍光標識化糖タンパク質プローブ は終濃度 10 g/mLになるよう PBSに溶解したものを調製し、それぞれの反応槽に 50 μ Lを滴下した。
[0081] レクチン-糖鎖間の反応が平衡に達するまで静置した後に、エバネッセント励起方 式マイクロアレイスキャナーである GTMAS Scan III (日本レーザ電子社）を使用してス ライドガラス端面より励起光を入射し、励起されて生じた蛍光発光を、スライドガラス下 面に配置されて ヽる ICCD (イメージインテンシファイア一付電荷結合素子)カメラで検 出した。スライドガラスのほぼ全面に対する蛍光イメージをスキャニングし、得られたィ メージ画像を TIFFファイル形式（1枚につき約 100 M Bite)にて保存した。スキヤニン グ時のパラメータ一は Gain「5000倍」、積算回数「4回」、露光時間「33 msec」で統一し た。
[0082] (6)スキャニング画像の数値ィ匕
スキャニング画像の数値化には市販のマイクロアレイ用解析ソフトである Array-Pro Analyzer (.version 4.0 for Windows (登録商標)、 Media Cybernetics社)を使用した。 各スポットの輝度を上記解析ソフトを用いて算出し、非スポット領域の輝度をバックグ ラウンド値とした。各スポットの輝度からバックグラウンド値を差し引いたものを正味の 輝度値とし、横列に 4点並べた同一試料由来のスポットごとに平均値と標準偏差を算 出した。
[0083] 以降は各レクチン試料に対するプローブの結合に対してはこの同一試料由来の 4 点の平均輝度値を用いて評価を行った。以降に示す各レクチンアレイの性能評価は 操作 (2)一 (6)の一連の行程を経た後に行われた。
[0084] (7) GTMSコートスライドガラスの性能評価
上述のように作製した GTMSコートスライドガラスの性能を、既存のスライドガラス (6 種)と比較評価した。すなわち表面コートされた各スライドガラスに、あらかじめ Cy3標 識したレクチン（100 μ g/mL)をアレイ状に固定ィ匕し、 (3)一 (6)の行程を経た後に、 スポッティング領域の輝度値（S)と非スポッティング表面の輝度値（N)から S/N比を 算出した。その結果、表 1に示すように（2)の行程で作製した GTMSコートスライドガラ スの輝度値は、最高値を示したスライドガラス Aの 2分の 1程度にとどまった力 ック グラウンドが非常に低いため、その S/Nは 16.1となり、今回評価したスライドガラスの中 で最良値を示した。
[0085] [表 1] 各スライドガラスの性能評価
100 g/ml Cy3 RCA— 1 20 in 30% glycerol/PBS
スポット 4点の平均値 ブランク 4点の平均値
S/N比 (Gain X 1 000) :主 (Gain 1000)
市販スライドガラス A 6061 7 5971 10.2 市販スライドガラス B 52059 401 3 13.0 市販スライドガラス C 36462 2865 1 2.7
GTM Sスライドガラス 28220 1753 1 6.1 市販スライドガラス D 13838 4520 3.1 市販スライドガラス E 12802 3105 4.1 市販スライドガラス F 5902 1621 3.6 注）同一 Cy3標識レクチンスポットの平均輝度値を比較
[0086] (8)アレイ上の固定ィ匕レクチン濃度の検討（図 5および 6)
RCA120と ConAはそれぞれ複合型糖鎖と高マンノース型糖鎖に対し高い親和性を もつことが知られる代表的なレクチンである。これらのレクチンを様々な濃度で調製し 、同一試料について横に 4点並べてアレイ状にスポットした。このアレイの各反応槽に 対して 10 /z g/mLの Cy3- ASFを各 Lずつアプライして結合反応を起こさせた後に 、スキャナーで蛍光を観察した。
[0087] 上述したように ASFは N-結合型糖鎖と 0-結合型糖鎖を 3本ずつ分子中に持ち、か つ糖鎖中の非還元末端のシアル酸キャップが外れラタトサミン構造が突出した糖鎖 構造を持つことが知られて 、る。よって RCA120と ConAを固定化したレクチンアレイに 対し、 Cy3-ASFを添カ卩した実験系においては、 RCA120が非常に強い親和性を示し 、 ConAが弱い親和性を示すことが予想された。
[0088] 実験の結果、 RCA120のスポットが強い蛍光を発したのに対し、 ConAのスポットは同 条件の RCA120のスポットに比べて 1/3程度の蛍光強度を示すに止まった。 ConAが 弱!ヽながらも複合型糖鎖を持つ ASFに結合したのは、 N-結合型糖鎖のうち ASFに主 として存在する 3本鎖型糖鎖には結合できないものの、少量存在するとされる 2本鎖 型糖鎖には結合できるためと考えられた。またこのデータから同一試料由来の 4点に っ 、ての標準偏差 (SD)は約 ±20%程度になると 、うことが分力つた（図 6)。
[0089] 次にスポット時のレクチン濃度と蛍光強度の関係をグラフ化したところ、スポット時の レクチン濃度と蛍光強度の間に正の相関関係があり、スポットするレクチン試料の濃 度を 1 mg/mL以上に高濃度化することで、効果的にシグナル強度を向上することが できることが分力つた。すなわち親和定数の小さ!ヽ (結合の弱!、)レクチン-糖鎖間の 相互作用の検出は固定ィ匕レクチン濃度を上げる事により可能となることが分力つた（ 図 6)。
[0090] (9)レクチンアレイの性能評価
様々な糖特異性をもったレクチン 4種（RCA120、 SSA、 XBD、 EW29 (Ch) )、とネガ ティブコントロール 1種 (BSA)の計 5種のタンパク質を同一試料について横に 4点並べ てアレイ状にスポットした。このアレイについて 10 μ g/mLの Cy3- ASFを各 50 μ Lずつ 滴下し、スキャナーで蛍光を観察した。
[0091] 実験の結果 FACでラタトサミン構造に親和性があると確認することができた RCA120 、 EW29(Ch)の 2種のレクチンのスポットにおいて蛍光シグナルが観察された（図 7)。 またそれぞれの蛍光強度を比較すると、 RCA120のスポットにおいて強い蛍光が、 EW29(Ch)のスポットにおいては中程度の蛍光が観察され、 FAC解析データと一致し た。
[0092] また同条件のアレイに対しラタトース (競合阻害糖)共存下で同様の実験を行ったと ころ、阻害糖の濃度上昇に伴って、スポットの蛍光強度の減少が観察された（図 8)。 このことから、蛍光糖タンパク質プローブとの結合はレクチンと糖鎖間の糖特異的結 合反応によるものであることを確認することが出来た。
[0093] 〔実施例 2〕他の糖鎖関連アレイへの応用
糖鎖関連アレイには、糖鎖をプローブに用いるレクチンアレイの他、糖タンパク質を プローブに用いるレクチンアレイ、レクチンをプローブに用いる糖ペプチドアレイ、レク チンをプローブに用いる糖タンパク質アレイ、レクチンをプローブに用いる抗体アレイ の 5タイプが挙げられる。図 9に、各糖鎖関連アレイと糖鎖の相互作用の模式図を示 す。
[0094] それぞれのアレイを使用して得られた蛍光強度情報をコードィ匕する。輝度値の数値 は 16bitで取り込まれた数値であるため、 0-65355の間の値となる。そこで Gain「1000 倍」での (輝度値-バックグラウンド値)の値を 10000刻みで 6段階に分類することで 0か ら 5までのコード化を行った。 Gain「1000倍」で輝度信号値が飽和している場合は、 Gainを下げて観察し Gain「1000倍」時の値に換算する。信号値が飽和しているかどう かの判定は、 Gain値を変化させた際に Gain値と信号強度の相関の直線性が保たれ ているかどうかで判断する。
[0095] 現在のスレツショルド値 （輝度値-バックグラウンド値）
0-10000 レべノレ 0
10001-20000 レベル 1
20001-30000 レベル 2
30001-40000 レベル 3
40001-50000 レべノレ 4
50001以上 レべノレ 5
[0096] 〔実施例 3〕 レクチン-抗体を同一区画内にスポットしたアレイによる解析（図 10)
1.材料と方法
(1)モデル糖タンパク質の蛍光標識ィ匕プローブの調製
本実験例ではレクチンアレイ上に固定ィ匕するレクチンとして、様々な糖結合特異性 を持つレクチンとして 6種（RCA120、 ECA、 ConA、 GNA、 SSA、 SNA)を選択した。また ネガティブコントロールとして糖鎖と結合しな 、タンパク質である BSAを選択した。また 今回の実験では、プローブのコアタンパク部分を認識する抗フヱツイン抗体と抗 RNase抗体の 2種を、レクチンと同じ区画内にスポットした。 GNA、 SNAは VECTOR社 より購入したもの、 BSAについては SIGMA社より購入したもの、 RCA120、 ECA、 ConA 、 SSAは生化学工業より購入したものを用いた。
[0097] モデル蛍光標識ィ匕糖タンパク質プローブは、 ASF、 FET、ゥシ脾由来リボヌクレア一 ゼ B (RNase B)、またネガティブコントロールとしてゥシ脾由来リボヌクレア一ゼ （ RNase A)、 BSAなどのタンパク質（全て SIGMA社より購入）を 550 nm付近に吸収極大 波長を持つ蛍光色素である Cy3 Mono-reactive Dye (アマシャムフアルマシア社、以 下 Cy3)を用いて蛍光標識ィ匕することで調製した。プローブ作製時は前述のタンパク 質を 0.1 M炭酸緩衝液 (pH 9.3)に終濃度 1 mg/mLになるよう調製した後、 1.0 mgの Cy3粉末と混合させ、 1時間、適時攪拌しながら暗所で反応させ、担体として S印 hadex G-25を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、 Cy3標識タンパク質を精製した。 [0098] (2)スライドガラスへの GTMSコーティング
エポキシ基を活性基として有する 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン (信越シリ コーン社、以降 GTMS)をコーティングしたスライドガラス（図 3)を用い、レクチンをガラ ス表面に固定ィ匕した。 GTMSコーティングは、松浪硝子工業社製のスライドガラスを用 い、以下の手順で行った。スライドガラスを 10% KOH I MeOH溶液に浸し、容器ごと 振盪させた状態で 1時間放置しガラス表面を処理した。これを十分量の精製水 (ミリ Q 水）により洗浄した後、 60°Cのオーブン内で乾燥させた。次にスライドガラスを 2% GTMSアセトン溶液に浸し、遮光下で容器ごと振盪させながら 1時間反応させた。反 応後、 110°Cのオーブン内で 8時間乾燥させた後、十分量の精製水により洗浄し、乾 燥させた。
[0099] (3)レクチンアレイの作製
(2)で作製した GTMSコートスライドガラスに対してレクチンをスポットし、レクチンァレ ィを作製した。マイクロアレイスポッターとして日本レーザ電子社製 STAMPMANを使 用し、先端直径 0.40 mmのスタンプピンを用い、直径約 0.5 mmのスポットをスライドガ ラス上に配置した。スライドガラスへのレクチンの固定ィ匕操作に際しては以下の条件 をマイクロアレイスポッター付属のコンピューターに記'隐させ、スタンプピン動作プロ グラムを実行させた。まずスタンプピンを 96穴 PCR用マイクロタイタープレート内の固 定化試料溶液中に 1秒間浸した後に弓 Iき上げ、スライドガラス表面の所定の位置に 1 秒間接触させた。この動作を 1スポットごとに繰り返しながら、同一試料溶液から横 1 列に 6点スポットを行った後、スタンプピンの洗浄を行った。洗浄工程ではスタンプピ ンの針先を 0.05% SDS溶液に 2秒間浸し、スタンプピンをバキューム装置内で 15秒間 乾燥させ、さらに精製水に 2秒間浸した後に、バキューム装置内で 15秒間乾燥、最後 にエタノールに 2秒間浸して力 バキューム装置内で 15秒間の乾燥操作を行った。
[0100] (4)非スポット面のブロッキング
上記の操作でレクチンをスポットしたスライド上に、シリコンゴム製の 8穴ラバーを接 着して 8つの反応槽を作製した。この反応槽に 0.1% Tween20を含む PBS溶液（PBST) を満たすことで、スライド固層に結合しな力つた余剰レクチンを洗浄 '除去した。次に 1% BSAを溶解した PBS溶液を各反応槽に 200 Lずつ満たした後に、湿度を 90%以上 に保った保存容器中で 4°C、 1時間放置することで非レクチンスポット領域のブロッキ ング操作を行った。
[0101] (5)プローブ溶液の添加とスキャン
ブロッキングを終えたスライドに対し、約 100 ng/mLに調整した各蛍光標識ィ匕糖タン パク質プローブ溶液を各反応槽に 50 Lずつ加えることで、アレイ上にプローブ溶液 を接触させた。
[0102] レクチン-糖鎖間の反応が平衡に達するまで静置した後に、エバネッセント励起方 式マイクロアレイスキャナーである GTMAS Scan III (日本レーザ電子社）を使用してス ライドガラス端面より励起光を入射し、励起されて生じた蛍光発光を、スライドガラス下 面に配置されて ヽる ICCD (イメージインテンシファイア一付電荷結合素子)カメラで検 出した。スライドガラスのほぼ全面に対する蛍光イメージをスキャンした後、得られたィ メージ画像を TIFFファイル形式にて保存した。スキャン時の各パラメータ一は、 Gain「 4000倍」、積算回数「8回」、露光時間「110 msec」で統一した。
[0103] (6)スキャン画像の数値ィ匕
スキャン画像の数値化には市販のマイクロアレイ用解析ソフトである Array-Pro Analyzer Ver. 4.5 (Media Cybernetics社）を使用した。各スポットの輝度を上記解析 ソフトで算出し、非スポット領域の輝度をバックグラウンド値とした。各スポットの輝度か らバックグラウンド値を差し引いたものを正味の輝度値とし、横列に 5点並べた同一試 料由来のスポットごとに平均値と標準偏差を算出した。
以降は各レクチン試料に対するプローブの結合に対してはこの同一試料由来の 5 点の平均輝度値を用いて評価を行った。
[0104] 2.結果と考察
今回の実験では多様な特異性を持つレクチンを並べたアレイを構成し、既知の糖 鎖構造を持つ糖タンパク質プローブをアプライした際の各レクチンスポットの蛍光パタ ーンから、レクチンアレイとしての性能評価を行った。また本実験では、プローブのコ ァタンパク部分の情報も同時に取得することを目指し、糖タンパク質プローブのコアタ ンパク部分を認識する抗体もレクチンと並べてスポットしたアレイを作製した。モデル 糖タンパク質としては、コアタンパク部分の構造は同一だが修飾糖鎖部分の構造が 異なるタンパク質として、 ASFと FETの組み合わせと、 RNase Aと RNase Bの組み合わ せを選択した。
[0105] 実験 (A) '(B)では、プローブとして用いた ASFと FETの糖鎖プロファイルを比較した（ 図 10A及び B)。 FETは N-結合型糖鎖と 0-結合型糖鎖を 3本ずつ分子中に持ち、各 糖鎖構造の非還元末端が高度にシアル酸で修飾されて ヽることが知られて ヽる。一 方、 ASFは FET糖鎖のうち末端シアル酸を酵素或いは酸処理によって除去したタン パク質であり、ラタトサミン構造が露出している。このため ASFプローブを用いた場合、 ラタトサミンを認識する RCA120や ECAのスポットが観察され、 FETプローブを用いた 場合、シアル酸を認識する SSA、 SNAのスポットが観察されると予想された。また抗体 スポットに対しては FETも ASFもコアタンパク部分は同一であるため、両プローブ共に 結合が観察されると予想された。実験の結果、末端ラタトサミン構造を持つ ASFプロ ーブでは RCA120や ECAの非常に明るいスポットが検出された力 S (図 10A)、ラタトサミ ン構造がシアル酸でキヤッビングされて 、る FETプローブでは RCA120、 ECAのスポッ トは非常に暗くなつた（図 10B)。この結果は RCA120、 ECAカ^クトサミン構造を強く 認識し、ラタトサミン構造の末端がシアル酸でキャップされると親和性が大幅に低下 すると 、う従来の知見と一致して 、た。また実験（B)では FETプローブに特徴的なシ アル酸の存在に対応して、シアル酸認識レクチンである SSAや SNAのスポットが観察 された（図 10B)。 ConAのスポットでは実験 (A)、 （B)共に弱い蛍光が観察された（図 10A及び B)。これは N-結合型糖鎖のうち、主として存在する 3本鎖型糖鎖には親和 性が低いものの、少量存在するとされる 2本鎖型糖鎖には結合できるためと考えられ た。共通コアタンパク部分を認識する FET抗体のスポットは、実験 (A)、 （B)において 蛍光が観察された (図 10A及び B)。
[0106] 実験（C) · (D)では RNase Aと RNase Bプローブの糖鎖プロファイルの相違を比較し た（図 10C及び D)。 RNase Bは、ハイマンノース型の N-結合型糖鎖を分子内に 1本の み持ち、 RNase Aは、コアタンパク部分は RNase Bと同一の構造を持つが糖鎖を全く 持たな 、ことが知られて 、る。これらのプローブをレクチンアレイに接触させた場合、 両プローブ共に抗 RNase抗体スポットに対しては親和性を示す力 レクチンのスポット に対する反応性に相違が生じる（RNase Bプローブは ConAなどのマンノース認識レク チンに親和性を示すのに対し、 RNase Aは親和性を示さない)ことが予想された。実 験の結果、抗体に対する反応性では、両プローブにおいて共通コアタンパク部分を 認識する RNase抗体との結合が観察された。一方レクチンに対する反応性では、ハイ マンノース構造を持つ RNase Bで ConAのスポットにおいて結合が観察された力 糖 鎖を持たない RNase Aではレクチンのスポットにおいて、結合による蛍光は観察され なかった。実験 (E)ではネガティブコントロールとして、糖鎖を持たないタンパク質で ある BSAを用いた。 BSAプローブでは予想通り、抗体'レクチンスポットともに結合は観 察されなかった（図 10E)。
[0107] 実験 (A)— (E)を通して、微量の糖タンパク質試料力も迅速に、レクチンの糖結合特 異性を反映したプロファイルを得ることができた（図 10A— E)。また今回の実験では、 レクチンと抗体を同一アレイ上にスポットすることで、糖タンパク質のコアタンパク部分 と、修飾糖鎖部分の情報を同時並行的に一枚のスライド上で取得することができた。 同一スライド上で同時並行解析を行うことで、各反応槽間の実験条件 (温度、反応時 間等)を揃えた形での観察が可能となると 、う利点が生じた。
[0108] 〔実施例 4〕 レクチンアレイを用いた阻害濃度解析（図 11)
1.材料と方法
先の実験で観察されたレクチンとプローブ分子間の結合が、糖鎖を介した特異的 結合であることを確認する為に競合阻害糖を用いた阻害実験を行った。実験 (A)で はスライドガラス上の 8つの反応槽内に RCA120をスポットしてアレイを構成した上で、 競合阻害糖 (ラタトース)の濃度を変えた 8種類の ASFプローブ溶液を同時に接触さ せ、結合反応の阻害を観察した（図 11A)。実験 (B)では固定ィ匕レクチンとして ConA を用い、プローブとして RNase B、競合阻害糖としてマンノースを用い、同様の操作で 結合の阻害を観察した (図 11B)。アレイ作成時に要した材料'操作は、実施例 3と同 じであるため記述を省略する。
[0109] 2.結果と考察
実験の結果、競合阻害糖の濃度上昇に伴ってスポットの蛍光強度の減少が観察さ れ（図 11)、阻害曲線をカーブフィッティングすることにより、阻害物質固有の半阻害 濃度を算出することができた。この結果から、蛍光糖タンパク質プローブとの結合はレ クチンと糖鎖間の特異的結合反応によるものであることを確認できた。またこのような 阻害実験を用い、半阻害濃度を算出することで結合の強さを評価したり、結合する相 手分子を探索することが可能であることが示された。
[0110] 〔実施例 5〕 レクチンアレイの糖ペプチドプローブによる検出（図 12)
1.材料と方法
(1)糖ペプチドプローブの調製
実施例 3 (1)に記述した方法で Cy3-ASFを調製した後に、この Cy3_ASFをトリプシ ン処理により断片化し、 Cy3-ASFペプチドを調製した。
(2)スライドガラスへの GTMSコ一ティング
実施例 3 (2)に記述した方法で行った。
(3)レクチンアレイの作製
固定ィ匕するレクチンは、各レクチンの持つ主要な糖認識能ごとにグループ分けを行 つた上で、フコース認識レクチン 5種、シアル酸認識レクチン 6種、ラタトサミン構造認 識レクチン 3種、ガラクトース認識レクチン 6種、ガラクトサミン認識レクチン 11種、マン ノース認識レクチン 4種、キチン構造認識レクチン 5種の計 40種類のレクチンを選択し 、スライドガラスに固定ィ匕したアレイを作製した。実験操作は実施例 3 (3)に記述した 方法で行った。
(4)非スポット面のブロッキング
(5)プローブ溶液の添加とスキャン
(6)スキャン画像の数値ィ匕
上記（4)一（6)の操作については、 Cy3-ASFペプチドプローブを用い、実施例 3 (4 )一 (6)に記述した方法と同様の操作にて、実験を行った。
[0111] 2.結果と考察
実験の結果、レクチンアレイに糖ペプチドプローブを供することで、糖鎖構造を反 映した糖鎖プロファイルを得ることができた。得られた糖鎖プロファイルは酵素消化す る前の ASFと同等であり、レクチンアレイに糖タンパク質だけでなく糖タンパク質のぺ プチド消化産物をプローブとして利用できることが示された。この技術を用いれば糖 ペプチドを HPLC等で分画した後にプローブとしてレクチンアレイに供することで糖ぺ プチド各成分の糖鎖プロファイルの観察が可能になり、有用である。
〔実施例 6〕 糖ペプチドアレイによる、糖ペプチド上の糖鎖プロフアイリング（図 13) 1.材料と方法
(1)レクチンプローブの調製
本実施例ではレクチンプローブとして、ラタトサミン構造を強く認識する RCA120、ネ ガティブコントロールとして糖結合能を持たな 、BSAを使用した。蛍光標識レクチンプ ローブは蛍光色素である Cy3を用いて蛍光標識して調製した。レクチンは 0.1 M炭酸 緩衝液 (pH 9.3)中に終濃度 1 mg/mLになるよう溶解した後、 1 mじ当たり 1.0 mgの Cy3粉末と混合させ、 1時間、適時攪拌しながら暗所で反応させた。反応後は限外ろ 過フィルターキットを用いて未反応の Cy3色素を除去した。
(2)スライドガラスへの GTMSコ一ティング
GTMSコートスライドは実施例 5 (2)に記述した方法で行った。
(3)糖ペプチドアレイの作製
(2)で作製した GTMSコートスライドガラス（図 3)に対して糖ペプチドをスポットして糖 ペプチドアレイを作製した。マイクロアレイスポッターとして日本レーザ電子社製 STAMPMANを使用し、先端直径 0.40 mmのスタンプピンを使用してスポットを行こと で、直径約 0.5 mmのスポットをスライドガラス上に配置した。
本実験では固定ィ匕した糖ペプチドサンプルは、マウス肝臓の可溶性画分力 レク チンカラムを用いて精製した糖タンパク質画分をトリプシンによりペプチド断片化後、
HPLCにより分画'分取した糖ペプチドを用 、た。スライドガラスへの糖ペプチドの固 定ィ匕操作に際しては以下の条件をマイクロアレイスポッター付属のコンピューターに 記憶させ、スタンプピン動作プログラムを実行させた。まずスタンプピンを 96穴 PCR用 マイクロタイタープレート内の固定ィ匕試料溶液中に 1秒間浸した後に引き上げ、スライ ドガラス表面の所定の位置に 1秒間接触させた。この動作を 1スポットごとに繰り返し ながら、同一試料溶液力ゝら横 1列に 6点スポットを行った後、スタンプピンの洗浄を行 つた。洗浄工程ではスタンプピンの針先を 0.05% SDS溶液に 2秒間浸し、スタンプピン をバキューム装置内で 15秒間乾燥させ、さらに精製水に 2秒間浸した後に、バキュー ム装置内で 15秒間乾燥、最後にエタノールに 2秒間浸して力 バキューム装置内で 15秒間の乾燥操作を行った。
(4)非スポット面のブロッキング
(5)プローブ溶液の添加とスキャン
(6)スキャン画像の数値ィ匕
上記（4)一 (6)の操作にっ 、ては、 Cy3-RCA120プローブと Cy3-BSAプローブを用 い、実施例 3 (4)— (6)に記述した方法に従い、実験操作を行った。
[0113] 2.結果と考察
本実験の結果、糖ペプチドをアレイ化することで、糖ペプチドに付加した糖鎖の構 造情報を、ハイスループットかつ容易に得られることが示された。糖ペプチドアレイの 作成方法としては、 1)精製糖ペプチドを固定ィ匕する、 2)クルードの糖ペプチドを固 定化する、 3) HPLCで分離した糖ペプチドフラクションを固定ィ匕する、などが考えられ る。今回の実験では HPLCで分離した各フラクションをアレイ化したものを作製でき、 有用であることを示すことができた。
[0114] 従来、 HPLCで分画したフラクションのうち、どこに糖ペプチドが含まれているかとい う情報を得ることは、 UV吸収や蛍光等でモニターできないために容易ではな力つた。 本実験の結果、各糖ペプチドフラクションを固定ィ匕したアレイを用いることで、どのフ ラタシヨンにどのような糖鎖構造を持った糖ペプチドがあるのかを容易に知ることが可 能となることが分力つた。
[0115] 本法を利用することで、解析対象の糖鎖を持つ糖ペプチドがどのフラクションに含 まれているのかといつた情報を迅速に得ることができるため、多数のフラクションから 効率的に糖鎖の含まれるフラクションのみを選出し、質量分析など他の解析へと供す ること等が可能になる。また解析対象の糖ペプチドの糖鎖構造情報や、どのようなレ クチンが結合するかと!/、う情報がな!、場合、トリプシン消化前の糖タンパク質の状態 でレクチンアレイを用いた分析を行い、糖鎖プロフアイリングを行うことで、当該糖タン ノ ク質に結合するレクチンを数十種類のレクチンの中力も絞り込むことが出来る。この ような情報が得られることで、従来多数のレクチンを用いて総当り的に行っていたレク チンプロットなどの操作が簡略化され、大幅に時間と労力を節約できるなどの利点が ある。 [0116] 〔実施例 7〕 レクチンアレイに対し、クルード生体試料をプローブとして用いた実験（ 図 14)
1.材料と方法
レクチンアレイを用いて糖タンパク質混合物、特に生体由来混合試料のプロファイリ ングを行うことで、生体内の糖タンパク質の糖鎖付加状態を解析する。
[0117] マウス肝臓より抽出'精製した糖タンパク質サンプルとマウス脳より抽出'精製した糖 タンパク質サンプルを Cy3標識ィ匕してプローブとした後に、 40種レクチンの固定ィ匕さ れたレクチンアレイと接触させて、マウス抽出糖タンパク質混合物全体の糖鎖プロフ アイルを観察した。
アレイ作製時に要した材料'操作は、実施例 3と同じであるため記述を省略する。
[0118] 2.結果と考察
マウス脳由来糖タンパク質プローブ（図 14A)と肝臓由来糖タンパク質プローブ（図 14B)では、明らかに異なった糖鎖プロファイルが観察された。特にシアル酸認識の レクチン群で、両プローブ間に顕著な相違が見られた。脳では糖タンパク質に対する シアル酸の付加が少ないことが知られており、この事実は実験結果の傾向と一致した 。このようにクルード系を用いた実験では、試料全体の糖鎖付加情報を迅速'簡便に 得ることができるため、血液成分や臓器等の、個体間や病態間での糖鎖構造の差を 一斉比較解析する目的での使用に適して 、る。
[0119] 次に先の実験で用いた脳由来糖タンパク質プローブに対し、競合阻害糖としてラタ トースを 10 mM加え、糖鎖プロファイルを観察した (図 14C)。その結果、競合阻害に より蛍光シグナルのパターンに変化が観察され、主にラタトサミン認識レクチンのシグ ナルの減弱が観察された。この実験で示したように、よりクルードな試料に対するレク チンアレイによる糖鎖プロフアイリングにおいても、様々な阻害糖の添加実験を併用 し、獲得される情報を絞り込んだ上で比較解析することで、より簡便かつ迅速に個体 間の比較解析を行うことができる。
産業上の利用の可能性
[0120] 本発明により、レクチン-糖鎖間の相互作用を溶液中で平衡状態のまま観察する方 法が初めて実用化された。この技術は従来のレクチンプロットのような相互作用の有 無 (0か 1か)ではなぐ中間部分の情報、すなわち結合の強度情報を輝度値から得る ことができる（例えば 0から 6段階)。このことは n種のレクチン-糖鎖間の相互作用にお いて、従来は 2n通りであった情報量が 6n通りへと格段に増したことを意味する。この 技術は今後さらに高密度化、高精度化していくことにより糖鎖構造解析、及び関連す るその他の糖鎖工学諸分野の発展に大きな貢献をもたらすことが期待される。さらに は、様々な用途に向けレクチン-糖鎖間の相互作用解析用のアレイを作製することで 、血液 ·体液 ·組織抽出物等の原液または希釈溶液からの診断'判定への利用や、 糖タンパク質製品の品質管理等への応用が期待される。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析す る方法。
(a)糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板に蛍光標識した被検糖鎖 または被検複合糖質を接触させる工程
(b)基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定するェ 程
[2] 糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板が、エポキシ基を活性基とし て有する化合物がコートされた基板に糖鎖に相互作用を示すタンパク質が固定化さ れた基板である、請求項 1に記載の方法。
[3] エポキシ基を活性基として有する化合物が、 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン
(GTMS)である、請求項 2に記載の方法。
[4] 以下の工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析す る方法。
(a)被検複合糖質が固定化された基板に蛍光標識した糖鎖に相互作用を示すタン パク質を接触させる工程
(b)基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定するェ 程
[5] 被検複合糖質が固定化された基板が、エポキシ基を活性基として有する化合物がコ ートされた基板に被検複合糖質が固定化された基板である、請求項 4に記載の方法
[6] エポキシ基を活性基として有する化合物が、 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン
(GTMS)である、請求項 5に記載の方法。
[7] 以下の工程を含む、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖との相互作用を分析す る方法。
(a)複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板 に被検複合糖質を接触させる工程
(b)工程 (a)で得られた基板に蛍光標識した糖鎖に相互作用を示すタンパク質を接 触させる工程
(C)基板を洗浄せずに、励起光を作用させて、励起される蛍光の強度を測定するェ 程
[8] 複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が固定化された基板が、 エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板に複合糖質の糖鎖以外 の領域に相互作用を示すタンパク質が固定ィ匕された基板である、請求項 7に記載の 方法。
[9] エポキシ基を活性基として有する化合物が、 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン
(GTMS)である、請求項 8に記載の方法。
[10] 複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が、複合糖質の糖鎖以外 の領域に相互作用を示す抗体である、請求項 7— 9の ヽずれかに記載の方法。
[11] 糖鎖に相互作用を示すタンパク質が、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タンパク 質、糖鎖に親和性を有するサイト力イン、または糖鎖に相互作用を示す抗体である、 請求項 1一 10のいずれかに記載の方法。
[12] 励起光がエバネッセント波である、請求項 1一 11のいずれかに記載の方法。
[13] 複合糖質が、糖タンパク質、プロテオダリカン、または糖脂質である、請求項 1一 12の いずれかに記載の方法。
[14] エポキシ基を活性基として有する化合物がコートされた基板であって、糖鎖に相互作 用を示すタンパク質、または複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク 質が固定化された基板。
[15] エポキシ基を活性基として有する化合物が、 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン
(GTMS)である、請求項 14に記載の基板。
[16] 複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が、複合糖質の糖鎖以外 の領域に相互作用を示す抗体である、請求項 14または 15に記載の基板。
[17] 糖鎖に相互作用を示すタンパク質が、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タンパク 質、糖鎖に親和性を有するサイト力イン、または糖鎖に相互作用を示す抗体である、 請求項 14または 15に記載の基板。
[18] 複合糖質が、糖タンパク質、プロテオダリカン、または糖脂質である、請求項 14一 17 の！、ずれかに記載の基板。
[19] 以下の工程を含む、基板の製造方法。
(a)基板にエポキシ基を活性基として有する化合物をコートする工程
(b)工程 (a)で得られた基板に糖鎖に相互作用を示すタンパク質、または複合糖質 の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質を固定ィ匕する工程
[20] 複合糖質の糖鎖以外の領域に相互作用を示すタンパク質が、複合糖質の糖鎖以外 の領域に相互作用を示す抗体である、請求項 19に記載の方法。
[21] 糖鎖に相互作用を示すタンパク質が、レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タンパク 質、糖鎖に親和性を有するサイト力イン、または糖鎖に相互作用を示す抗体である、 請求項 19に記載の方法。
[22] 複合糖質が、糖タンパク質、プロテオダリカン、または糖脂質である、請求項 19一 21 のいずれかに記載の方法。
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