WO2005035753A1 - 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体 - Google Patents

機能蛋白質を代替する二重特異性抗体 Download PDF

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WO2005035753A1
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Tetsuo Kojima
Taro Miyazaki
Tetsuhiro Soeda
Chiaki Senoo
Osamu Natori
Keiko Kasutani
Shinya Ishii
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a bispecific antibody that substitutes for a functional protein. More specifically, the present invention relates to a bispecific antibody that substitutes for the function of a ligand for a heteroreceptor, a bispecific antibody that substitutes for the action of a cofactor that enhances an enzymatic reaction, and a pharmaceutical composition containing the antibody as an active ingredient. . Background art
  • Antibodies have attracted attention as pharmaceuticals because of their high stability in blood and low antigenicity. Among them are bispecific antibodies that can recognize two kinds of antigens simultaneously. Bispecific antibodies have been proposed for a long time. However, until now, only antibodies that merely connect two types of antigens, such as for the purpose of retargeting NK cells, macrophages, and T cells, have been reported (see Non-Patent Document 8). For example, MDX-210, which is undergoing clinical trials, is only a bispecific antibody that retargets FcrRI-expressing monocytes and the like to HER-2 / neu-expressing cancer cells. Absent. Thus, to date, there have been no examples of using bispecific antibodies as an alternative to proteins that function in vivo.
  • IL interleukin
  • EP0 erythropoietin
  • G-CSF growth hormone
  • TP0 thrombopoietin
  • GM-CSF macrophage colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • CNTF ciliary neurotrophic factor
  • LIF Leukemia inhibitory factor
  • CT-1 tumor death factor
  • TNF tumor death factor
  • a suitable anti-receptor antibody can be an antibody that can mimic the dimerization or quantification of a receptor by a ligand.
  • Monoclonal antibodies that already have homodimeric TP0 receptor (MPL) see Patent Literature 1 and Non-Patent Literature 1), EP0 receptor, GH receptor, and G-CSF receptor have a ligand-substituting action. It has been reported. Each of these antibodies is thought to exhibit a platelet count recovery effect during thrombocytopenia, erythrocytosis during anemia, growth promotion of short stature, or neutrophil recovery in neutropenia, It is expected to be applied to medicine.
  • cofactors include tissue factor (TF), blood coagulation factor V (F.V), activated blood coagulation factor V (F.Va), blood coagulation factor VIII (F.VIII), and activity Blood coagulation factor VIII (F. Villa), thrompomodulin (TM), protein S (PS), protein Z (PZ), heparin,.
  • TF tissue factor
  • F.V blood coagulation factor V
  • F.Va activated blood coagulation factor V
  • F.VIII blood coagulation factor VIII
  • F. Villa activity Blood coagulation factor VIII
  • TM thrompomodulin
  • PS protein S
  • PZ protein Z
  • heparin heparin
  • Complement C4b complement control factor H
  • MCP membrane coiactor protein
  • CCD complement receptor 1
  • F.VIII / F.VIIIa is a cofactor required for sufficient expression of F.IXa activity.
  • Scheiilinger F et al. Have found that certain anti-F.IX / F.IXa antibodies have an effect of promoting F.IXa-induced F.X activation in a chromogenic assay (see Patent Document 2).
  • Patent Document 2 In the measurement of the coagulation recovery ability of F.VIII-deficient plasma, The ability to recover coagulation by the antibody alone was not shown, but only when exogenous F.IXa was added.
  • F. Villa is known to interact not only with F.IXa but also with F.X (see Non-Patent Documents 6 and 7).
  • the antibody of Scheiflinger F et al. Cannot be said to sufficiently substitute for the function of F.VIII / F.Villa, and its activity is presumed to be insufficient.
  • Patent Document 1 U.S. Patent Application Publication No. 98/17364
  • Patent Document 2 WO 01/19992
  • Patent Document 3 U.S. Pat.No. 4,474,893
  • Patent Document 4 EP404,097
  • Patent Document 5 WO 93/11161
  • Patent Document 6 Japanese Patent Application No. 2002-112369
  • Patent Document 7 Japanese Patent Application No. 2003-012648
  • Patent Document 8 JP-A-5-304992
  • Patent Document 9 JP-A-2-145187
  • Patent Document 10 JP-A-5-213775 Kimiyuki
  • Patent Document 11 JP-A-10-165184
  • Patent Document 13 Japanese Patent Application Publication No. 2002-518041
  • Patent Document 15 JP-A-5-199894
  • Patent Document 16 Japanese Patent Publication No. Hei 10-511085
  • Patent Document 17 JP-A-5-184383 (Non-Patent Document 1) Deng D et al., "Blood", 1998, Vol. 92, No. 6, p. 1981-1988
  • Non-Patent Document 2 Nilsson IM et al., ⁇ J. Intern.Med.J, 1992,
  • Non-Patent Document 3 Lofqvist T et al., ⁇ J. Intern. Med. '', 1997,
  • Non-Patent Document 4 The 24th Annual Meeting of the Japanese Society of Thrombosis and Hemostasis, Academic Special Committee, Hemophilia Standardization Study Group, Mini Symposium, 2001, http: //ww.sth.org
  • Non-Patent Document 5 Medical Bulletin # 193 1994
  • Non-Patent Document 6 Mertens K et al., "Thromb. Haemost.J, 1999, Vol. 82, p. 209-217.
  • Non-Patent Document 7 Lapan KA et al., "Thromb. Haemost. J, l", 8th year, Vol. 80, p. 418-422
  • Non-Patent Document 8 Segal DM et al., ⁇ Journal of Immunological Methods J, 2001, Vol. 248, p. 1-6.
  • Non-Patent Document 9 Bos R and Nieuwenhuitzen W, "Hybridoma”, 1992, Vol. 11, No. 1, p. 41-51
  • Non-Patent Document 10 Brennan M et al., Science, 1985, Vol. 229, No. 1708, p. 81-3.
  • Non-Patent Document 11 Karpovsky B et al., ⁇ J. Exp.Med. '', 1984,
  • Non-Patent Document 1 2) Suresh MR et al., ⁇ Methods Enzymol.J, 1986, Vol. 121, p. 210-28
  • Non-Patent Document 13 Massimo YS et al., ": T. Immunol. Methods", 1997, Vol. 201, p. 57-66.
  • Non-Patent Document 14 Brennan M et al., ⁇ Science '', 1985, Vol. 229, p. 81
  • Non-patent Document 15 Shabby MR et al., ⁇ Exp.Med.J, 1992, Vol.175, p.217-25
  • Non-Patent Document 16 Hoi liner P et al., ⁇ Proc. Natl. Acad. Sci. USAJ, 1993, Vol. 90, p. 6444-8
  • Non-Patent Document 17 Ridgway JB et al., ⁇ Protein Eng. J, 1996, Vol. 9, p. 617-21
  • Non-Patent Document 18 Hammerling U et al., Rj.Exp.Med.J, 1968,
  • Non-Patent Document 19 Kurokawa T et al., ⁇ Bio / Technology '', 1989, Vol. 7, p. 1163
  • Non-Patent Document 20 Link BK et al., ⁇ Blood '', 1993, Vol.81, .3343
  • Non-Patent Document 21 Nitta T et al., ⁇ LancetJ, 1990, Vol.335, p.368-
  • Non-Patent Document 22 deLeij L et al., ⁇ Foimdation Nationale de
  • Non-Patent Document 23 Le Doussal JM et al., Rj.Nucl.Med.J, 1993, Vol. 34, p. 1662-71.
  • Non-Patent Document 24 Stickney DR et al., ⁇ Cancer Res.J, 1991, Vol.51, p.6650-5
  • Non-Patent Document 26 Kroesen BJ et al., ⁇ Br. J. CancerJ, 1994, Vol. 70, p. 652-61.
  • Non-Patent Document 27 Weiner GJ et al., ⁇ J. Immunol. '', 1994, Vol.152, p.2385
  • Non-Patent Document 28 Suresh MR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USAJ, 1986, Vol. 83, p. 7989-93.
  • Non-Patent Document 29 Milstein C and Cuello AC, "Nature”, 1983, Vol. 305, p. 537
  • Non-Patent Document 31 Bebbington CR et al., ⁇ / Technologyj, 1992, Vol. 10, p. 169
  • Non-Patent Document 32 Huse WD et al., Science, 1989, Vol. 246, p. 1275 '.
  • Non-Patent Document 33 McCaf ferty J et al., Nature, 1990, Vol. 348, p. 552
  • Non-Patent Document 34 Kang AS et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USAJ, 1991, Vol. 88, p.
  • An object of the present invention is to provide a bispecific antibody that substitutes for the function of a functional protein. More specifically, it is an object of the present invention to provide a bispecific antibody that substitutes a ligand function for a receptor including a heteroreceptor molecule and a bispecific antibody that substitutes a function of a cofactor that enhances an enzymatic reaction. .
  • the present inventors have succeeded in separating an antibody that substitutes a ligand function for a type I interferon receptor composed of two types of molecules, an AR1 chain and an AR2 chain. That is, the present inventors have succeeded in separating, for the first time, a bispecific antibody having a function of substituting a ligand function for a receptor composed of a hetero molecule.
  • the present inventors have conducted intensive studies, and as a result, specifically bind to both F.IX / F.IXa and F.X, and act as a cofactor of F.Villa, that is, F.Xa by F.IXa. Promote activation
  • the present inventors firstly developed a bispecific antibody having a function of substituting a functional protein for the first time. It can be said that it was developed.
  • the present invention relates to a bispecific antibody that substitutes for a functional protein. More specifically, it relates to a bispecific antibody having a ligand function-substituting action on a receptor including a heteromolecule, and a bispecific antibody which substitutes a function of a cofactor for enhancing an enzymatic reaction. ,
  • the antibody according to (6) comprising a variable region of an anti-AR1 chain antibody and a variable region of an anti-AR2 chain antibody;
  • variable region comprising the amino acid sequence of the following (a) in the anti-AR1 chain antibody, and a variable region comprising the amino acid sequence of any of the following (b1) to (b10) in the anti-AR2 antibody: Region, comprising the antibody of (8), (a) The variable region of the H chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the variable region of the L chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • variable region of the L chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9
  • variable region of the L chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19
  • variable region of the L chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23
  • variable region of the L chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • variable region of the L chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • variable region comprising the amino acid sequence of the following (a) in the anti-AR1 chain antibody, and a variable region comprising the amino acid sequence of any of the following (bl) to (b3) in the anti-AR2 chain antibody:
  • variable region of the H chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
  • the variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9
  • variable region of the L chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9
  • variable region of the L chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21
  • variable region of the L chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • an antibody that recognizes both an enzyme and a substrate for the enzyme, wherein the bispecific antibody substitutes for a function of a cofactor that enhances enzyme activity;
  • a complementarity-determining region comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, or 82, Or having a functionally equivalent complementarity determining region, the antibody according to any one of (12) to (15),
  • [17] has a complementarity-determining region consisting of the amino acid sequence of the heavy chain CDR3 of either XB12 or # 04 or a functionally equivalent complementarity-determining region, and the sequence of the heavy chain CDR3 is SEQ ID NO: 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78 or 82, having a complementarity-determining region consisting of the amino acid sequence of any of the above, or a functionally equivalent complementarity-determining region; (12)
  • H chain CDR sequence is SEQ ID NO: 40-42, 44-46, 48-50, 52-54, 56-58, 60-62, 64-66, 68-70, 72-74, 76-
  • the H chain sequence has a complementarity determining region consisting of the amino acid sequence of either XB12 or # 04, or a functionally equivalent complementarity determining region, and the H chain CDR sequence is SEQ ID NO: 48. -50, 52-54, 56-58, 60-62, 64-66, 68-70, 72-74, 76-78 or 80-82.
  • the antibody according to any one of (12) to (15), which has a complementarity determining region functionally equivalent to
  • composition comprising the antibody according to any of (12) to (19) and a pharmaceutically acceptable carrier;
  • composition according to (21) which is a disease that develops and / or progresses due to reduction or deficiency of the activity of factor VIII and / or activated blood coagulation factor VIII,
  • a bispecific antibody (bispeciiic antibody) in the present invention is an antibody having specificity for two different antigenic determinants.
  • the bispecific antibody of the present invention is not particularly limited, but is preferably a monoclonal antibody. Further, it is preferable that the antibody is a recombinant antibody produced using a gene recombination technique. (See, for example, Borrebaeck CAK and Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLI SHE S LTD, 1990). Recombinant antibodies are produced by cloning the DNA encoding them from hybridoma cells or antibody-producing cells such as sensitized lymphocytes that produce the antibodies, inserting the DNA into an appropriate vector, and introducing it into a host.
  • the antibody in the present invention may be an antibody fragment or a modified antibody thereof.
  • Antibody fragments include diabody (Db), linear antibodies, single-chain antibody (hereinafter also referred to as scFv) molecules, and the like.
  • the “Fv” fragment is the smallest antibody fragment and contains a complete antigen recognition and binding site.
  • This region of one heavy (H) chain variable region (V H) and light (L) chain variable region (V L) are strongly connected by a non-covalent dimer - a (V H V L dimer).
  • Three complementarity-determining regions of each variable region (comple mentari ty determining region; CDR ) interact, V H - V L dimer to form the antigen binding site on the first surface.
  • the Fab fragment (also referred to as F (ab)) further contains a constant region for an L chain and a constant region (CH1) for an H chain.
  • Fab 'fragments differ from Fab fragments by having additional few residues from the carboxy terminus of the heavy chain CH1 region including one or more cysteines from the hinge region of the antibody.
  • Fab'-SH refers to Fab 'in which one or more cysteine residues in the constant region has a free thiol group.
  • F (ab ') fragments are produced by cleavage of disulfide bonds in the cysteine at the hinge of the F (a)') 2 pepsin digest. Other antibody fragments which are chemically linked are known to those skilled in the art.
  • Diapod refers to a bivalent antibody fragment constructed by gene fusion. Iger P et al., Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 90: 6444-6448 (1993), EP404, 097 No., TO93 / 11161 etc.). Diapody is a dimer composed of two polypeptide chains, and each of the polypeptide chains cannot bind to the L chain variable region (V L ) and the H chain variable region (V H ) in the same chain. It is linked by a linker with a short position, for example, about 5 residues.
  • the encoded V L and V H in the same polypeptide chain can not be formed a single chain variable region fragments for the linker is short between its dimer In order to form a body, a diapody will have two antigen binding sites.
  • Single chain antibodies or scFv antibody fragments include the VH and regions of the antibody, which regions are present in a single polypeptide chain.
  • Fv polypeptides further include a polypeptide linker between the VH and VL regions, which allows the scFv to form the necessary structure for antigen binding (for a review of scFv, see Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Ant ibodies, Vol. 113 (Rosenburg and Mooreed (Springer Verlg, New York) pp. 269-315, 1994)).
  • the linker in the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the expression of the antibody variable regions linked to both ends.
  • Bispecific IgG type antibodies can be secreted by a hybrid hybridoma (auadroma) generated by fusing two hybridomas producing IgG antibodies (Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537-540). ).
  • secretion can be achieved by co-expression by introducing into the cell four genes, the genes of the L chain and the H chain constituting the two desired IgGs.
  • by making an appropriate amino acid substitution in the CH3 region of the H chain it is also possible to preferentially secrete IgG in a heterozygous combination with the H chain (Ridgway JB et al.
  • Bispecific antibodies can also be made by chemically cross-linking Fab '.
  • Fa prepared from one antibody is maleimidated with ⁇ PDM ( ⁇ / ⁇ iT-heny 1ened i-male imi de), and this is reacted with Fa prepared from the other antibody.
  • bispecific F (ab ') 2 can be prepared by cross-linking Fab's derived from different antibodies (Keler T et al. Cancer Research 1997, 57: 4008-4014).
  • a method of chemically binding an antibody fragment such as Fab'-thionitrobenzoic acid (TNB) derivative to Fab'-thiol (SH) is known (Brennan M et al. Science 1985, 229: 81-83).
  • Leucine zippers derived from Fos, Tim, etc. can be used instead of chemical crosslinking.
  • Fos,; iun also takes advantage of the fact that it forms homodimers but preferentially forms heterodimers.
  • Bispecific F (ab ') 2 can be formed by mixing and reacting the mildly reduced monomers Fab'-Fos, Fab'-Jim under mild conditions (Kostelny SA eta al. J of Immunology, 1992 , 148: 1547-53). This method is not limited to Fab ', but can be applied to scFv, Fv, etc.
  • Bispecific antibodies can also be made in diapody.
  • the bispecific diapody is a heterodimer of two cross-over scFv fragments.
  • V H (A)-V L (B) and V favor(B)-(A) were created by connecting the two types of antibody AJ-derived V H with a relatively short linker of about 5 residues.
  • To form a heterodimer Holliger P et al. Proc. Of the National Academy of Sciences of the USA 1993, 90: 6444-6448).
  • Sc (Fv) 2 which can be produced by linking two types of scFv with a flexible and relatively long linker of about 15 residues, can also be a bispecific antibody (Mallender WD et al. J of Biological Chemistry, 1994, 269: 199-206).
  • modified antibody examples include an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the substance to be bound is not limited.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification. These methods have already been established in this field.
  • the origin of the antibody of the present invention is not limited, such as a human antibody, a mouse antibody, and a rat antibody. Genetically modified antibodies such as chimeric antibodies and humanized antibodies may also be used.
  • a target human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with a target antigen (International Patent application publication numbers W093 / 12227, W092.
  • a chimeric antibody is an antibody comprising the variable regions of the H and L chains of an antibody of an immunized animal and the constant regions of the H and L chains of a human antibody.
  • DNA encoding the variable region of an antibody derived from an immunized animal is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, and this is inserted into an expression vector, introduced into a host, and produced to produce a chimeric antibody. be able to.
  • a humanized antibody is a modified antibody, also called a reshaped human antibody.
  • a humanized antibody is constructed by transplanting the CDR of an antibody derived from an immunized animal into the complementarity determining region of a human antibody. Its general gene recombination technique is also known.
  • a DM sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was prepared by adding several DM sequences that had overlapping portions at the ends. It is synthesized from oligo nucleotides by PCR. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, then integrated into an expression vector, and introduced into a host to produce the same (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent Application publication number! See 96/02576).
  • the FRs of the human antibody linked via the CDR are selected so that the complementarity determining region forms a favorable antigen-binding site.
  • the amino acid in the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato K et al, Cancer Research 1993, 53: 851-85
  • the present invention provides a bispecific antibody having a function of substituting a functional protein, and more preferably a bispecific antibody having a function of substituting a functional protein.
  • a preferred embodiment of the antibody of the present invention is an antibody having a ligand function-substituting activity for a receptor containing a hetero molecule.
  • the term "receptor containing a hetero molecule” means a receptor (multimer) composed of two or more different proteins (receptor molecules).
  • the multimer is not limited by the number of proteins (receptor molecules) such as dimer, trimer and tetramer, but is preferably a dimer.
  • a heteroreceptor indicates that the two constituent proteins (receptor molecules) are not identical.
  • An antibody having a ligand function-substituting activity refers to an antibody having an agonist action for a certain receptor.
  • a ligand which is an agonist
  • binds to a receptor the three-dimensional structure of the receptor protein is changed, and the receptor is activated (if the receptor is a membrane protein, it is usually used for cell proliferation, etc.). Emits a signal).
  • the ligand-function-substituting antibody can perform the same function as a ligand by dimerizing the receptor at an appropriate distance and angle. That is, a suitable anti-receptor antibody can mimic receptor dimerization with a ligand, and can serve as a ligand function replacement antibody.
  • the receptor of the present invention includes a cytokine heteroreceptor.
  • Cytokinin is generally used as a generic term for bioactive proteins that control the growth and differentiation of various blood cells, but may also refer to growth factors and growth-suppressing factors for cells including non-immune cells. Therefore, cytokins are released from cells and are a generic term for proteinaceous factors that mediate cell-cell interactions such as immunity, control of inflammatory response, antiviral action, antitumor action, regulation of cell growth and differentiation.
  • cytokine acting on the hetero receptor include: Interleukins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, colony stimulating factors (GM-CSF, etc.), interferons (IFN-a, IFN-; 3, IFN- Etc.), CNTF, LIF, Oncostat in M, CT-1 and the like, preferably interferon, particularly preferably type I interferon.
  • Interferons include IFN-H, IFN-i3, IFN- ⁇ , IFN-te and the like.
  • IFN- ⁇ and IFN_j3 have high homology, these two IFNs can react via the same receptor. It is classified into IFN- ⁇ , IFN- / 3 and IFN-type I interferon.
  • Examples of the type I interferon receptor include the AR1 chain (GenBank ACCESSION No: J0317L, Uze G et al. Cel l 1990, 60: 225-34) and the AR2 chain (GenBank ACCESSION No: thigh 84, Reference: Domanski P et al. J of Biological Chemistry 1995, 270: 21606-11, Lut faUa G et al. EMB0 J 1995, 14: 5100-8).
  • the method for obtaining the bispecific antibody with alternative ligand function of the present invention is not particularly limited, and may be obtained by any method.
  • a bispecific antibody that substitutes for a ligand function for a hetero receptor composed of two types of receptor molecules (A chain and B chain) an anti-A chain antibody and an anti-B chain antibody are obtained.
  • a bispecific antibody containing the H chain and L chain of the anti-A chain antibody and the H chain and L chain of the anti-B chain antibody is prepared.
  • an antibody having a ligand function-substituting activity is selected.
  • the bispecific antibody can be prepared by a known method such as fusion of the respective antibody-producing hybridomas or introduction of an antibody expression vector into cells.
  • Antibodies to the receptor can be obtained by methods known to those skilled in the art. For example, it can be prepared by immunizing an immunized animal with an antigen. Antigens that immunize animals include complete immunogenic antigens and incomplete non-immunogenic antigens. Hara (including hapten). In the present invention, a receptor whose ligand function-substituting antibody of the present invention is considered to act as a ligand is used as the antigen (immunogen).
  • the receptor in the present invention is not particularly limited, but is preferably a heterodimer. As an animal to be immunized, for example, a mouse, a hamster, a macaque, and the like can be used.
  • variable regions of the L chain and the H chain of the antibody are recovered from the immunized animal or cells of the animal.
  • This operation can be performed by those skilled in the art using generally known techniques.
  • Animals immunized with the antigen express antibodies to the antigen, especially in spleen cells. Therefore, for example, it is possible to prepare mRNA from the spleen cells of the immunized animal and recover the variable regions of the L and H chains by RT-PCR using primers corresponding to the variable region of the animal. it can.
  • an animal is immunized with each of the A and B chains of the receptor.
  • the receptor to be used as the immunogen may be the entire protein constituting the receptor or a partial peptide of the protein.
  • an immunogen used to immunize an animal an antigen that can be an antigen in some cases can be bound to another molecule to be a soluble antigen, and a fragment thereof can also be used in some cases. Good.
  • a transmembrane molecule such as a receptor
  • it is preferable to use these fragments eg, the extracellular region of the receptor.
  • cells expressing the transmembrane molecule on the cell surface can be used as an immunogen.
  • Such cells may be cells of natural origin (such as tumor cell lines) or cells constructed to express transmembrane molecules by recombinant techniques.
  • MRNA is extracted from spleen cells of this animal, and the cDNA of the L chain and H chain variable region is recovered by RT-PCR using primers corresponding to the vicinity of the variable region.
  • Primers corresponding to CDRs, primers corresponding to frameworks less diverse than CDRs, or primers corresponding to a signal sequence and CH1 or L chain constant region () can be used.
  • Lymphocytes can also be immunized in vitro. ScFv or Fab using this Construct the library to be presented.
  • the antigen-binding antibody clone is enriched and cloned by panning, and an antibody expression vector is prepared using the variable region.
  • a bispecific antibody can be obtained by introducing an anti-A chain antibody expression vector and an anti-B chain antibody expression vector into the same cell and expressing the antibody.
  • screening can be performed using a similar library using mRNAs derived from peripheral blood mononuclear cells, spleen, tonsils, etc. of animals not immunized with humans.
  • Selection of an antibody having a ligand function-substituting activity can be performed, for example, by the following method.
  • the test multispecific antibody is determined to have a ligand function-substituting action.
  • the above cells usually express a heteroreceptor on which the antibody can act as an agonist on the cell surface, and the receptor emits a signal by binding to a ligand.
  • the cells used in the above method are preferably cells that can proliferate in a ligand-dependent manner of a receptor (ligand-dependent proliferating cells).
  • the receptor usually emits a cell proliferation signal by binding to a ligand.
  • the receptor may be used in the above method by fusing the receptor with a receptor of the type that emits a cell proliferation signal to form a so-called chimeric receptor. Can be.
  • the chimeric receptor emits a cell proliferation signal when bound to a ligand.
  • Receptors suitable for constructing chimeric receptors by fusing with the receptor are those that produce cell proliferation signals.
  • the type of receptor is not particularly limited as long as it is a type of receptor. Usually, it is a membrane protein, more preferably a receptor fragment having an extracellular region having a ligand binding function, and a receptor having an intracellular region having a signal transduction function. A receptor that is a fragment.
  • Receptors used for the intracellular region include GH receptor, G-CSF receptor, MPL, EP0 receptor, c-Kit, Flt-3, IL-2 receptor, IL-3 receptor, IL-5 receptor, GM-CSF receptor and the like can be mentioned.
  • a chimeric receptor in which the extracellular region is a ligand receptor fragment and the intracellular region is a G-CSF receptor fragment is expressed.
  • the ligand-dependent proliferating cell Ba / F3 can be shown.
  • cells that can be used in the above method include, for example, NFS60, FDC-PL FDC-P2, CTLL-2, DA_1, KT-3 and the like.
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody may be performed by the separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, if appropriate selection and combination of chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and isoelectric focusing, antibodies are separated and purified. (Ant ibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor
  • the antibody of the present invention is an antibody having a ligand function-substituting activity for a type I interferon receptor containing an AR1 chain and an AR2 chain
  • the antibody preferably comprises a variable region in an anti-AR1 chain antibody, It has a structure including a variable region of an AR2 chain antibody.
  • the inuichi-feron function-substituting antibody was prepared by the following method. IL-3-dependent mouse pro-B cell line that expresses the receptor molecule of type I interface receptor AR1 chain and AR2 chain and the chimeric receptor of G-CSF receptor intracellular region respectively Ba / F3 was established. Each cell was immunized intraperitoneally with BALB / c.
  • PolyA W RNA was extracted from the spleen of the immunized mouse with an increased antibody titer, and a scFv was synthesized by RT-PCR to construct a scFv display phage library.
  • a scFv display phage library After binding the AR1 chain expressing Ba / F3 immunized mouse spleen-derived phage library and the biotinylated soluble AR1 chain, bound phages were concentrated by the panning method of capturing with streptavidin magnetic beads. Phage displaying anti-AR1 chain antibody was selected by phage ELISA using soluble AR1 chain.
  • an anti-AR2 chain antibody phage was selected using a library phage derived from the spleen of a soluble AR2 chain and an AR2 / chain-expressing Ba / F3 immunized mouse. Antibodies were selected that differ in the amino acid sequence of the CDR3 of the H chain, which is said to be most involved in the specificity of the antibody.
  • the scFv was inserted between the signal sequence for animal cells and CHI-hinge-CH2-CH3 to prepare an scFv-CH1-Fc expression vector.
  • Antibodies against the AR1 and AR2 chains were introduced into cells in various combinations to express bispecific antibodies.
  • BaF3-ARG was established by introducing into Ba / F3 an expression vector for a chimeric molecule of the extracellular region of each of the AR1 and AR2 chains and the intracellular region of the G-CSF receptor. The cells proliferated in an IFN-dependent manner. Bispecific antibodies were selected that were combinations of antibodies that could support the growth of BaF3-ARG.
  • Daudi cells are human B cell lines highly sensitive to the cytostatic activity of IFN_a.
  • the bispecific antibody selected above was added to Daudi cells, and it was confirmed that proliferation was inhibited in the same manner as IFN- ⁇ .
  • Examples of the antibody include, but are not particularly limited to, an antibody including any of the following variable regions of an anti-AR1 chain antibody and any of the following variable regions of an anti-AR2 chain antibody: be able to.
  • V H and Vj_ of each of the above variable regions are shown in SEQ ID NOs: 1 to 26 (the relationship between V H and of each variable region and SEQ ID NOs is shown in Table 1).
  • Table 1 Variable region SEQ ID NO: v H v L
  • the anti-AR2 chain antibody serving as a partner is preferably AR2-13, AR2-31, or AR2-44, and when the anti-AR1 chain antibody is AR1-41.
  • the partner anti-AR2 chain antibody is AR2-11, AR2-13, AR2-14, AR2-22, AR2-33, AR2-37, AR2-40, AR2-43, AR2-44, or AR2- Preferably it is 45.
  • AR2-13 and AR2-44 must be partners for both ⁇ -41 and AR1-24 antibodies Is possible. Antibodies that form such pairs are also included in the present invention.
  • bispecific antibody having a function of substituting the functional protein of the present invention
  • a bispecific antibody that substitutes for a function of a cofactor that recognizes both an enzyme and a substrate of the enzyme is used. It is.
  • the cofactor in the present invention is not particularly limited as long as it acts on the enzyme and can enhance the enzyme reaction.
  • the cofactor in the present invention include a cofactor for a protease.
  • proteolytic cofactors include cofactors in blood coagulation and fibrinolysis-related factors (F.VIII / F. Villa, PZ, TM, TM / PS system) and cofactors in complement reaction (C4b, MCP, CRL H factor) and the like.
  • the cofactor F. Villa enhances the activation of F.Xa by F.IXa by binding to both F.IXa and F.X.
  • Some bispecific antibodies that recognize both the enzyme F.IXa and the substrate F.X have an action of enhancing F.X activation. It is considered that some of such antibodies have an action to replace the action function of cofactor F.VIII / F. Villa.
  • Cofactor PZ enhances ZPI-induced F.Xa inhibition by binding to serpin family ZPI and F.Xa. That is, a bispecific antibody that recognizes both ZPI and FX / F.Xa It is thought that some bodies have the function of substituting the function of PZ. (0 Example of cofactors in blood coagulation / fibrinolysis-related factors 3
  • Cofactor TM enhances the activation of TAFI by thrombin. That is, it is considered that among the bispecific antibodies that recognize both thrombin and TAFI, there are those that have an action of substituting the function of TM.
  • the TM / PS system enhances the activation of PC by thrombin. That is, it is considered that some bispecific antibodies that recognize both thrombin and PC substitute for the function of the TM / PS system.
  • C4b has the effect of promoting the decomposition of C2 by Cls. In other words, it is considered that some bispecific antibodies that recognize both Cls and C2 substitute for the function of C4b.
  • MCP Membrane Cofactor Protein
  • CCP Complement Receptor 1
  • Complement Regulatory Factor H MCP and CRl have the effect of promoting C3b decomposition by Complement Regulatory Factor I. That is, among the bispecific antibodies that recognize both Co immediate regulatory Regulatory Factor I and C3b, Co immediate complement
  • F.VIII / F.Villa is subject to limited degradation by proteolytic enzymes such as thrombin, but in any form as long as it has the cofactor activity of F.VIII / F.VIIIa.
  • proteolytic enzymes such as thrombin
  • the method for obtaining the bispecific antibody alternative to the cofactor function of the present invention is not particularly limited, and may be obtained by any method.
  • immunized animals are immunized with enzyme A and substrate B, respectively, to obtain anti-enzyme A antibodies and anti-substrate B antibodies.
  • a bispecific antibody containing the H chain and L chain of the anti-enzyme A antibody and the H chain and L chain of the anti-substrate B antibody is prepared.
  • a plurality of anti-enzyme A antibodies and a plurality of anti-substrate B antibodies are obtained, respectively, and it is preferable to use these to produce as many combinations of bispecific antibodies as possible.
  • an antibody having a cofactor function-substituting activity is selected.
  • Antibodies to enzymes or substrates can be obtained by methods known to those skilled in the art. For example, it can be prepared by immunizing an immunized animal with an antigen. Antigens that immunize animals include complete immunogenic antigens and incomplete non-immunogenic antigens (including haptens). In the present invention, an enzyme or substrate which is considered to act as a cofactor by the cofactor function-substituting antibody of the present invention is used as the antigen (immunogen). As an animal to be immunized, for example, a mouse, a hamster, a rhesus monkey, or the like can be used. Immunization of these animals with an antigen can be carried out by those skilled in the art by well-known methods.
  • variable regions of the L chain and the H chain of the antibody are recovered from the immunized animal or the cells of the animal.
  • This operation can be performed by those skilled in the art using generally known techniques.
  • Animals immunized with the antigen express antibodies to the antigen, especially in spleen cells. Therefore, for example, mRNA can be prepared from spleen cells of an immunized animal, and the variable regions of the L and H chains can be recovered by RT-PCR using primers corresponding to the variable region of the animal.
  • an animal is immunized with each of an enzyme and a substrate.
  • the enzyme or substrate used as an immunogen may be the whole protein or a partial peptide of the protein.
  • an immunogen used for immunizing an animal an antigen that can be used as an antigen in some cases can be bound to another molecule to make a soluble antigen, and a fragment thereof can be used in some cases. .
  • MRNA is extracted from spleen cells of the immunized animal, and cDNAs for the L chain and H chain variable regions are recovered by RT-PCR using a primer corresponding to the vicinity of the variable regions.
  • Primers corresponding to CDRs, primers corresponding to frameworks less diverse than CDRs, or signal sequences and primers corresponding to the CH1 or L chain constant region can be used in vitro.
  • Lymphocytes can also be immunized Constructing a library displaying scFv or Fab using this antibody Concentrating and cloning antigen-binding antibody clones by panning, and using the variable region to construct an antibody expression vector
  • a bispecific antibody can be obtained by introducing an anti-enzyme antibody expression vector and an anti-substrate antibody expression vector into the same cell and expressing the antibody. Screening was performed using a similar library made of mRNA derived from peripheral blood mononuclear cells, spleen, tonsils, etc. of non-treated animals. It is also possible.
  • An antibody having a cofactor function-substituting activity can be selected, for example, by the following method.
  • the enzyme activity by adding the antibody using a reaction system containing the enzyme Selection is based on the increase in sex (substrate resolution) as an index.
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody may be performed by the separation and purification methods used for ordinary proteins.
  • antibodies can be separated by appropriately selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and isoelectric focusing.
  • Can be purified (Ant ibodies: A
  • the bispecific antibody of the present invention can be used, for example, when the alternative cofactor is F.VI II / F.Villa, that is, when the combination of the enzyme and the substrate is the blood coagulation / fibrinolysis-related factor F.IXa and F.IX.
  • the alternative cofactor is F.VI II / F.Villa
  • F.IXa the blood coagulation / fibrinolysis-related factor
  • F.IX preferably has a structure including a variable region in an anti-F.IXa antibody and a variable region in an anti-F.X antibody.
  • the bispecific F.VIII / F.Vila function-substituting antibody of the present invention was prepared by the following method. Mice were immunized subcutaneously with commercially available RIXa and FX, respectively. Splenocytes were isolated from the spleen of the immunized mouse with an increased antibody titer, and fused with mouse myeloma cells to produce a hybridoma. Hybridomas that bind to the antigen (F.IXa, F.X) were selected, and the variable regions of the L and H chains were recovered by RT-PCR using primers corresponding to the variable regions. The L chain variable region was inserted into an L chain expression vector containing CL, and the H chain variable region was inserted into an H chain expression vector containing an H chain constant region.
  • bispecificity is achieved.
  • Antibodies were obtained.
  • synthetic substrates of F.XIa F.IX activating enzyme
  • F.IX F.X activating enzyme
  • F.L F.Xa S-2222
  • a phospholipid assay system was evaluated for its activity to substitute for F.VIII / F. Villa (a cofactor for F.X activation by F.IXa). Based on the results, bispecific antibodies having F.VIII / F. Villa substitution activity were selected.
  • the coagulation recovery ability was measured using a coagulation measurement system (APTT) using F.VIII-deficient human plasma. As a result, it was confirmed that a bispecific antibody having an ability to recover coagulation against F.VIII-deficient human plasma was obtained.
  • APTT coagulation measurement system
  • the H chain CDR3 of the antibody of the present invention is not particularly limited.
  • the sequence of the H chain CDR3 is SEQ ID NO: 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78 or Can be a complementarity-determining region consisting of the amino acid sequence described in any of 82, or a complementarity-determining region functionally equivalent thereto.
  • the antibody of the present invention may be, for example, a complementarity-determining region consisting of the amino acid sequence of H3 CDR3 of either XB12 or ⁇ 04 described in Examples described later, or a complementarity-determining region functionally equivalent thereto.
  • the H chain CDR3 sequence has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78 or 82, or It has a functionally equivalent complementarity determining region.
  • the above-mentioned antibody of the present invention has, as a specific example, a CDR sequence of H chain: SEQ ID NO: 40 to 42, 44 to 46, 48 to 50, 52 to 54, 56 to 58, 60 to 62, 64 to 66, 68 To 70, 72 to 74, 76 to 78 or 80 to 82, or an antibody having a complementarity determining region functionally equivalent thereto. .
  • the H chain sequence has a complementarity-determining region comprising an amino acid sequence of either XB12 or XT04, or a complementarity-determining region functionally equivalent thereto
  • the heavy chain CDR sequence is SEQ ID NO: 48-50, 52-54, 56-58, 60-62, 64-66, 68-70, 72-74, 76-78 or any of the amino acids of 80-82 Arrangement
  • An antibody having a complementarity-determining region consisting of a row or a complementarity-determining region functionally equivalent thereto can be suitably shown.
  • the constant region is not particularly limited, and it is possible to use a constant region known to those skilled in the art, for example, the Sequences of protein ins immunological interest, (1991), US Department of Health and Human Services.Public Health Health Health Service National Insti tutes of Heal th, An ef f icient route to human bispec if ic IgG, (1998) .Nature Biotechnology vol The constant region described in 16, 16, 677-681, etc. can be used.
  • the antibody of the present invention can be used as an effective drug for diseases caused by a decrease in the activity (function) of the receptor on which the antibody acts. It is expected to become.
  • the above-mentioned diseases include, for example, diseases caused by viral infection. These diseases are, for example, diseases in which the immune response of the host is activated by viral infection and the inflammation becomes chronic, and more specifically, chronic hepatitis C can be exemplified.
  • Chronic hepatitis C is a chronic inflammatory disease caused by hepatitis C virus infection, where the host's immune response to virus-infected cells causes inflammation in the liver. As the symptoms progress, liver function gradually decreases, leading to liver cirrhosis and eventually to liver cancer. In chronic hepatitis C patients, treatment with interferon-o; / j3 is performed to eliminate the hepatitis C virus, but due to the short half-life in blood, daily administration is necessary. The burden is quite heavy. Therefore, a drug having the action of interferon and having excellent sustainability has been demanded.
  • Another disease caused by viral infection is chronic myeloid leukemia.
  • the antibody of the present invention includes an action of substituting a function of a cofactor. Therefore, the antibody of the present invention is expected to be an effective drug for diseases caused by reduced activity (function) of the cofactor.
  • the cofactor that substitutes for the antibody of the present invention is a blood coagulation / fibrinolysis-related factor
  • examples of the above-mentioned diseases include bleeding, diseases accompanied by bleeding, and diseases caused by bleeding.
  • F. VI II / F. Vila, F. IX / F. IXa, and F. XI / F. XIa functional decline or deficiency are known to cause bleeding disorders called hemophilia.
  • hemophilia A bleeding disorders due to congenital F. VI I I / F. VII Ia hypofunction or deficiency are called hemophilia A. If hemophilia A bleeds, F.VIII I replacement therapy is given.
  • prophylactic administration of F.VI II preparations may be performed if frequent intra-articular bleeding occurs on the day of intense exercise or excursion, or if the patient is classified as severe hemophilia (non-patented). References 2 and 3).
  • this prophylactic administration of the F.VIII product has become very widespread in order to dramatically reduce bleeding episodes in hemophilia A patients. Reducing bleeding episodes not only reduces the risk of fatal and non-fatal bleeding and the associated pain, but also prevents haemophilic joint damage due to frequent joint bleeding. As a result, it greatly contributes to improving Q0L of hemophilia A patients.
  • F. VHI preparations have a short blood half-life, about 12 to 16 hours. Therefore, it is necessary to administer the F.VIII product about three times a week for continuous prevention. This is equivalent to maintaining approximately 1% or more of F.VIII activity (see Non-Patent Documents 4 and 5).
  • F.VIII preparations even in the case of bleeding replacement therapy, unless the bleeding is mild, it is necessary to periodically add additional F.VIII preparations for a certain period of time to prevent re-bleeding and complete hemostasis.
  • the F.VIII formulation is administered intravenously.
  • hemophilia A patients especially those with severe hemophilia A, may develop antibodies to F.VIII called incipita.
  • F.VIII F.VIII
  • the efficacy of the F.VIII preparation is hindered by the inhibitor. As a result, it becomes very difficult to control hemostasis for patients.
  • bleeding disorders related to F.VIII / F.Villa include hemophilia, acquired hemophilia having anti-F.VIII autoantibodies, and phenotypes caused by abnormal or defective vWF function.
  • Billbrand disease is known.
  • vWF is not only required for platelets to adhere properly to the subendothelial tissue at the site of injury to the vessel wall, but also forms a complex with F.VIII to maintain normal levels of F.VIII in plasma. Is also necessary. Patients with von Willebrand disease In these cases, these functions have declined, leading to abnormal hemostasis.
  • the administration interval is wide, (ii) the administration is easy, (iii) it is not influenced by the presence of the inhibitor, and (iv) its function is substituted independently of F. VI II / F.
  • a method using antibodies can be considered.
  • the half-life of antibodies in blood is generally relatively long, from days to weeks.
  • antibodies are generally known to be transferred into the blood after subcutaneous administration. That is, the antibody drug satisfies the above (i) and (ii).
  • Another embodiment of the functional protein in the present invention is a protein that binds to two types of proteins having different physiological actions and controls a plurality of different physiological actions.
  • Preferable examples thereof include the fourth complement component C4b and C4b binding protein (C4bp) which binds to protein S (PS).
  • C4to dissociates C2b from the C4b-C2b complex and has the effect of eliminating the aPC cofactor activator of PS.
  • C4bp has a regulatory effect on the complement system and the blood coagulation system.
  • Bispecific antibodies to C4b and PS are thought to have an action to replace the action of C4bp.
  • C4bp also acts as a cofactor for the degradation of C4b by factor I.
  • bispecific antibodies to factor I and C4b are also considered to have an action to replace the action of C4bp.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention as an active ingredient.
  • the antibody of the present invention is an antibody having an activity of substituting the function of IFN for a cytokine receptor
  • the antibody is considered to have a cytodynamic effect. Therefore, the antibody is expected to be a drug (pharmaceutical composition) or drug having an antiviral effect, an antitumor effect, and a cell growth / differentiation regulating effect.
  • antibodies that substitute for the function of IL-2 substitute for drugs (pharmaceutical compositions) or drugs that have T cell or NK cell differentiation, activation, and immunostimulation and antitumor effects, and IL-3 function
  • Antibodies are drugs (pharmaceutical compositions) or drugs that promote hematopoietic recovery by proliferating hematopoietic progenitor cells.
  • Antibodies that substitute for IL-4 function are induced by Th2 (humoral immunity).
  • Anti-allergic drugs (pharmaceutical compositions) or drugs that substitute for the function of IL-5 are immunostimulatory by inducing B cell / eosinophil proliferation / differentiation / pharmaceuticals with anti-tumor effects (pharmaceutical compositions) Products) or drugs, antibodies that substitute the function of IL-6 are drugs (pharmaceutical compositions) that stimulate platelet production, or antibodies that substitute the function of IL-7, are immunized by proliferation of T cells and B cells Activator ⁇ Pharmaceutical (pharmaceutical composition) or drug with anti-tumor action, antibody that substitutes for IL-9 function is a mast cell proliferation ⁇ Pharmaceutical (pharmaceutical composition) or drug with action of promoting hematopoietic hematopoietic recovery -An antibody that substitutes for the function of 10 is a drug (pharmaceutical composition) or drug that has an immunosuppressive effect, and an antibody that replaces the function of IL-11 is a drug (pharmaceutical composition) that has a platelet
  • Drugs or drugs that have antitumor activity, or antibodies that substitute for IL-15 function are Pharmaceuticals (pharmaceutical compositions) with immunostimulation and anti-tumor activity by activating NK cells or drugs that substitute for the function of GM-CSF are used as pharmaceuticals (pharmaceuticals) that promote leukocyte recovery after chemotherapy or bone marrow transplantation Composition) or a drug, an antibody that substitutes CNTF function is a drug with anti-obesity effect (pharmaceutical composition) or a drug, an antibody that replaces LIF function is a drug with platelet production stimulating / blood cholesterol lowering action ( (Pharmaceutical composition) or a drug, or an antibody that substitutes the function of Oncostat in M is a drug (pharmaceutical composition) or a drug that promotes hematopoiesis, and an antibody that substitutes the function of CT-1 has a cardioprotective effect Is expected to be a that pharmaceutical (pharmaceutical composition) or drug.
  • the antibody of the present invention is an antibody that recognizes F.IX or both F.IXa and F.X and is an antibody that substitutes for the function of F.Villa
  • the antibody may be used for bleeding or bleeding. It is expected to be a drug (medicinal composition) or drug for the prevention or treatment of diseases associated with bleeding or diseases caused by bleeding.
  • antibodies that bind to ZPI and F.X and substitute for PZ function bind to drugs (pharmaceutical compositions) or drugs with antithrombotic action, or to thrombin and TAFI to substitute for TM function
  • Antibodies that act as drugs (pharmaceutical compositions) or drugs with haemostasis-promoting action can be converted into drugs (pharmaceutical compositions) or drugs that have the action of substituting the function of the PS / TM system by binding to thrombin and PC. Be expected.
  • complement C4 deficiency causes systemic erythematosus (SLE)
  • an antibody that substitutes for the action of C4b is expected to be a drug (pharmaceutical composition) or drug that has SLE onset suppression Is done.
  • deficiency of factor H causes suppurative infection and autoimmune glomerulonephritis
  • antibodies that substitute for the action of factor H become pharmaceuticals (pharmaceutical compositions) or drugs that have the effect of suppressing the onset of these diseases It is expected.
  • an antibody that substitutes for the action of C4bp is expected to be a drug (pharmaceutical composition) or drug having an action to suppress the onset of Behcet's disease.
  • the pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention used as an active ingredient for therapeutic or prophylactic purposes may be mixed, if necessary, with a suitable pharmaceutically acceptable carrier, medium or the like which is inactive against them.
  • a suitable pharmaceutically acceptable carrier for example, sterile water or saline, stabilizers, excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), preservatives, surfactants (PEG, Tween, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like.
  • proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine and lysine, saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides, and mannini] ⁇ 1 Rusorubi] may also be contained.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants-one solution such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, It may be used in combination with a suitable solubilizing agent, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, PEG), and nonionic surfactant (eg, polysorbate 80, HCO-50).
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, propylene glycol, PEG
  • nonionic surfactant eg, polysorbate 80, HCO-50
  • the antibody of the present invention may be encapsulated in microcapsules (microcapsules of hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid], etc.), or a colloid drug delivery system (ribosome, albumin microsphere, Microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) (see Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Oslo Ed. (1980), etc.).
  • a method for converting a drug into a sustained-release drug is also known and can be applied to the antibody of the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982); U.S. Patent No.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the type of the dosage form, the administration method, the age and weight of the patient, the symptoms of the patient, the type of the disease and the degree of progress, etc. In general, for adults, 0.1 to 2000 ing can be orally administered in one to several divided doses per day, though it is determined as appropriate. More preferably, the dose is 1 to 1000 mg / day, even more preferably 50 to 500 mgZ day, most preferably 100 to 300 mg / day. These doses vary depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose. It is preferable that the administration period is appropriately determined according to the healing process of the patient.
  • Administration methods include direct administration using naked plasmids, packaging in ribosomes, and various other methods such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, vaccinia virus vectors, box virus vectors, adenovirus-related vectors, and HVJ vectors. It can be administered as a vector for wiping (see Adolpli “Virus Genome Method”, CRC Press, Florid (1996)) or coated on a bead carrier such as colloidal gold particles (W093 / 17706 etc.). it can.
  • the antibody may be administered by any method as long as the antibody is expressed in vivo and its action can be exerted.
  • a suitable parenteral route static Intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intracutaneous, intradermal, adipose tissue, mammary tissue, inhalation or intramuscular route of injection, infusion, or gas-induced particle bombardment (by electron gun, etc.)
  • a sufficient amount is administered by a method via the route).
  • the cells are administered ex vivo to blood cells and bone marrow-derived cells using liposomal transfection, particle bombardment (US Pat. No. 4,945,050), or virus infection.
  • the gene encoding the antibody of the present invention may be administered by re-introducing the animal.
  • the present invention also provides a method for preventing and / or treating bleeding, a disease associated with bleeding, or a disease caused by bleeding, comprising a step of administering the antibody or the composition of the present invention.
  • Administration of the antibody or the composition can be performed, for example, by the method described above.
  • the present invention also relates to the use of the antibody of the present invention for producing the (pharmaceutical) composition of the present invention.
  • the present invention provides a kit for use in the above method, comprising at least the antibody or the composition of the present invention.
  • the kit may be packaged with a syringe, a needle, a pharmaceutically acceptable medium, an alcohol swab, a bandage, or instructions for use.
  • FIG. 1 shows the insertion region of PCDNA4-g4H.
  • FIG. 2 is a diagram showing insertion regions of PCDNA4-g4L and pIND-g4L.
  • FIG. 3 shows the insertion region of pIND-g4H.
  • Fig. 4 shows the use of anti-F.IXa / anti-F.X bispecific antibodies prepared with anti-F.IXa antibody XB12 and anti-F.X antibody SB04, SB2K SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06, and SB34. And F. Villa-like activity are shown.
  • the concentration of the antibody solution is 10 g / niL (final concentration lg / mL).
  • results 9 bispecific antibodies showed increased F.Villa-like activity, XB12 / SB04, XB12 / SB2L XB12 / SB42, XB12 / SB38, XB12 / SB30, XB12 / SB07, The activity was strong in the order of XB12 / SB05, XB12 / SB06, XB12 / SB34.
  • Figure 5 shows anti-RIXa antibody XT04 and anti-F.X antibody SB04, SB2L SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06, SB34 prepared anti-F.IXa / anti-F.X bispecific antibody or anti-F04 antibody. Shows the results of measuring F. Villa-like activity using The concentration of the antibody solution is 10 g / mL (final concentration 1 x g / mL).
  • FIG. 6 shows the results of measuring the concentration dependence of F. Villa-like activity for XB12 / SB04, which had the highest activity in FIG. Results XB12 / SB04 showed a concentration-dependent increase in FVIIIa-like activity.
  • Figure 7 shows the results of measuring plasma coagulation assay using XB12 / SB04, XB12 / SB2K, XB12 / SB42, XB12 / SB38, XB12 / SB30, XB12 / SB07, XB12 / SB05, XB12 / SB06, and XB12 / SB34.
  • the concentration of the antibody solution is 3.4 / ig / fflL for XB12 / SB06, and 20 g / uiL for the rest.
  • Result XB12 / SB04 XB12 / SB2K 12 Fine 2, 12 / SB38,
  • XB12 / SB30, XB12 / SB07, XB12 / SB05, XB12 / SB06, and XB12 / SB34 showed an effect of shortening the clotting time (APTT) as compared to the absence of the antibody.
  • Fig. 8 shows the results of measuring plasma coagulation assay using S / SB04, XT04 / SB2U XT04 / SB42, XT04 / SB38, XT04 / SB30 XT04 / SB07, XT04 / SB05, XT04 / SB06, XT04 / SB34. .
  • the concentration of the antibody solution is 10 / g / mL for XT04 / SB06, and 20 g / mL for the others.
  • Result XT04 / SB04, XT04 / SB2K XT04 / SB42, XT04 / SB38,
  • XT04 / SB30, XT04 / SB07, XT04 / SB05, and XT04 / SB06 showed an effect of shortening the clotting time (APTT) compared to the absence of the antibody.
  • XT04 / SB34 did not show any reduction in clotting time ( ⁇ ).
  • FIG. 9 shows the results of measuring the concentration dependency of XB12 / SB04, which had the highest effect of shortening the coagulation time (APTT) in FIGS. 7 and 8.
  • Results XB12 / SB04 showed a concentration-dependent reduction in clotting time (APTT).
  • An expression vector of a soluble receptor tagged with AR2FLAG) or His6 was introduced into CH0 cells, and purified from the culture supernatant using an affinity column.
  • a mouse pro-B cell line Ba / F3 was transfected with an expression vector for a chimeric molecule of the extracellular region of the human AR1 chain and the intracellular region of the G-CSF receptor, and high-expressing cells were established.
  • PolyA (+) NA was extracted from the spleen of the immunized mouse, scFv was synthesized by RT-PCR, and a phagemid library in which the scFv was expressed as a fusion protein with gene3 of ⁇ phage was constructed (J. Immun. Methods, 201, (1997), 35-55). Inoculate E. coli (2 x 10 9 cfu) from the library into 50 mL of 2xYTAG (2 x T ⁇ ⁇ containing 100 ⁇ g / mL ampicillin and 2% glucose) at 37 ° C until 0D 600 0.4 to 0.5. Cultured.
  • helper phage VCSM13 4 ⁇ 10 11 helper phage VCSM13 was added, and the cells were allowed to stand for 37 minutes and infected.
  • 450 mL 2xYTAG and 25 ⁇ lmol / L IPTG were added, and cultured for 26 10 hours.
  • the culture supernatant was recovered by centrifugation, mixed with 100 mL PEG-NaCl (10% polyethylene glycol 8000, 2.5 mol / L NaCl), and allowed to stand for 4 and 60 minutes.
  • Precipitate the phage by centrifugation at 10, 800 xg for 30 minutes, The precipitate was suspended in 40 mL of water, mixed with 8 mL of PEG-NaCl, and allowed to stand at 4 ° C for 20 minutes.
  • Fuzz was precipitated by centrifugation at 10,800 g for 30 minutes and suspended in 5 mL PBS.
  • AR1FLAG and AR2FLAG prepared in Example 1 were labeled with biotin using No-Weigh Premeasured NHS-PE04-Biot in Microti! Bes (Pierce). 100 pmol of a biotin-labeled AR1FLAG or AR2FLAG was added to the phage library and contacted with the antigen for 60 minutes. 600 L of Streptavidin MagneSphere (Promeg a) washed with 5% M-PBS (PBS containing 5% skim milk) was added and allowed to bind for 15 minutes.
  • the beads were washed three times with 1 mL of PBST (PBS containing 0.1% Tween-20) and PBS.
  • the beads were suspended in 0.8 mL of 0.1 mol / L glycine / HC1 (pH 2.2) for 5 minutes to elute the phage.
  • the colonies were collected, inoculated into 2xYTAG, and cultured at 37 ° C until OD600 0.4 to 0.5.
  • 5 L lmol / L IPTG and 10 "pfu helper phage (VCSM13) were added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C for 30 minutes.
  • the cells were suspended and cultured for 30 and 10 hours.
  • the culture supernatant was collected by centrifugation, mixed with 20 mL of PEG-NaCl, and allowed to stand for 4 and 20 minutes.
  • the beads were washed with PBST and PBS five times each in the second panning, and the phages were infected with the phages. Clones producing AR chain-binding phage were selected by ELISA.
  • the above single colony was inoculated into 150 iL 2xYTAG and cultured at 30 ° C overnight. After inoculating 5 L of this into 500 L of 2xYTAG and culturing at 37 ° C for 2 hours, add 2 ⁇ YTAG containing helper phage 2.5 10 ⁇ i and 0.3 L lmol / L IPTG to IOOL, and add 30 L at 37. Let stand for minutes. Subsequently, the cells were cultured in 3 (TC), and the centrifuged supernatant was subjected to ELISA.
  • StreptaWell 96 microphone Oral plates (Roche) were coated overnight with 100 zL of PBS containing 1.0 xg / mL of biotin-labeled AR1FLAG or AR2FLAG. After washing with PBST to remove the antigen, blocking was performed overnight with 200 L of 2 w / v% M-PBS. Except for 2% (w / v) M-PBS, the culture supernatant was added thereto and allowed to stand for 40 minutes to bind the antibody.
  • PBG3-F1 (5'-CA GCTATGAAATACCTATTGCC-3'Z SEQ ID NO: 27) and PBG3-R1 (5'-CTTTTCATAATCAAA ATCACCGG-3 '/ SEQ ID NO: 28) was used to amplify the scFv region by PCR, and its nucleotide sequence was determined.
  • the PCR reaction solution containing 0.3 L was amplified in a Perkin Elmer 9700 at 96 ° C, 10 seconds, 55, 10 seconds, 72 ° C, 30 seconds, 30 cycles.
  • a substitution (-ppcpScp- ⁇ -ppcpPcp-) was introduced into both hinge parts.
  • the signal sequence of human IL-3 was constructed for type A, and the signal sequence of human IL-6 was constructed for type B (pCAGG-IL3ss-g4CHPa, pCAGG-IL6ss-g4CHPb).
  • the PCR product of the scFv region of the clone selected from the base sequence was treated with S ⁇ iI, and the anti-AR 1-chain clone was subcloned into pCAGGG-IL3ss-g4CHPa, and the anti-AR2 chain clone was subcloned into pCAGG_IL3ss-g4CHPb.
  • the expression vector was transfected into HEK293 cells using Ribofectamine 2000 for a total of 2025 combinations of anti-AR1 chain and anti-AR2 chain clones 45 ⁇ 45, and the culture supernatant after 3 days was collected.
  • Ribofectamine 2000 for a total of 2025 combinations of anti-AR1 chain and anti-AR2 chain clones 45 ⁇ 45, and the culture supernatant after 3 days was collected.
  • BaF3-ARG was established by introducing an expression vector for a chimeric molecule of the extracellular regions of the AR1 and AR2 chains and the intracellular region of the G-CSF receptor into Ba / F3, a mouse IL-3-dependent proliferating cell.
  • B aF3- ARG grew depending on IFN a.
  • a 96-well plate was seeded with 0.1 ml of a medium containing 3 cells / sample and 1 lxlO per well washed three times. After culturing for 4 days, 10/2 L of a viable cell counting reagent SF (nacal ai tesaue) was added, and the mixture was incubated for 2 hours and 37, and A450 was measured.
  • a viable cell counting reagent SF nacal ai tesaue
  • Daudi cells are a human B cell line that is highly sensitive to IFN. 6.25xl0 3 cells / well were seeded in a 96-well plate in 0.1 mL medium containing the sample. Four days After the interculture, 10 / zL of a viable cell count reagent SF (nacalai tesaue) was added, and the mixture was incubated for 2 hours and 37, and then A450 was measured.
  • a viable cell count reagent SF nacalai tesaue
  • amino acid sequences of the variable regions of the antibodies selected in the above screening are shown in SEQ ID NOs: 1 to 26.
  • the relationship between the name of each antibody and the sequence number is shown in Table 1 above.
  • the fused cells suspended in RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% FBS (Invitrogen) (hereinafter referred to as 10% FBS / RPMI1640) were seeded on a 96-well culture plate.
  • a selective medium (10% FBS / RPMI1640 I 2% HAT 50x concentrate (Dainippon Pharmaceutical) I 5% BM-Condimed HI (Roche Diagnostics)
  • selective culture of the hybridoma was performed.
  • the binding activity to Factor IXa was measured by ELISA shown in 5 ”2 to select hybridomas having Factor IXa binding activity.
  • the neutralizing activity for the enzyme activity of Factor IXa was measured by the method shown in 5-3, and a hybridoma having no neutralizing activity for Factor IXa was selected.
  • Hybrids were cloned by limiting dilution twice by seeding one cell per well in a 96-well culture plate. Cells confirmed to be a single colony by microscopic observation were subjected to ELISA and neutralization activity measurement shown in 5-2 and 5-3, and clones were selected.
  • Ascites of the cloned antibody was prepared by the method shown in 5-4, and the antibody was purified from the ascites. It was confirmed by the method shown in 5-5 that the purified antibody did not prolong APTT (activated partial tropoplastin time).
  • TBSB Tris-buffered saline containing 0.1% serum albumin (hereinafter referred to as TBSB) 40 L and 30 ng / mL Factor IXa) 3 (Enzyme Research Laboratories) IOL and 400 g / mL phospholipid solution 5 / iL and 100 mM CaC12 Then, 5 L of TBSB containing 20 mM MgC12 and 10 L of the hybridoma culture supernatant were mixed in a 96-well plate, and incubated at room temperature for 1 hour.
  • the ascites of the established hybridoma was prepared according to a conventional method. That is, 2 ⁇ 10 6 hybridomas cultured in vitro were
  • BALB / c mice male, 5-7 weeks old at the start of the experiment, Nippon Chillers' Liver
  • BALB / c nude mice female, 5-6 weeks old at the start of the experiment, Nippon Charles River and Nippon Clea
  • ascites was collected from mice whose abdomen was enlarged.
  • Antibody purification from ascites is performed using Protein G SepharoseTM 4 Fast Flow (Amersham
  • Binding Buffer 20 mM sodium acetate, pH 5.0
  • the antibody was eluted with 5 column volumes of Elution Buffer (0.1 M glycine-HCl, pH 2.5) and neutralized with Neutralizing Buffer (1 M Tris-HCL pH 9.0). This was concentrated with Centriprep 10 (Millipore), and the solvent was replaced with TBS (50 mM Tris-buf fered Saline).
  • APTT was measured by KC10A (Amelung) connected to CR-A (Amelung).
  • An antibody solution diluted with TBSB 50 and a mixture of 50 L of standard human plasma (Dade Behring) and APTT reagent (Dade Behring) were heated at 37 ° C. for 3 minutes.
  • the coagulation reaction was started by adding 50 L of 20 mM CaC12 (Dade Behring) to the same mixture, and the coagulation time was measured.
  • the binding activity to Factor X was measured by ELISA shown in 6-2.
  • Hybridomas having Factor X binding activity were selected, and the neutralizing activity against Factor Xa enzyme activity was measured by the method shown in 6-3.
  • Hybridomas without neutralizing activity against Factor Xa were cloned by performing two limiting dilutions.
  • ascites of the cloned antibody was prepared, and the antibody was purified from the ascites. That purified antibodies do not prolong APTT
  • the mixture was incubated at 4 ° C. After washing three times with PBS (-) containing Tween (R) 20, the plate was blocked with diluent buiier at room temperature for 2 hours.
  • RMs were extracted from the hybridoma producing anti-F.IXa antibody or anti-F.X antibody using QIAGEN (R) R easy (R) Mini Kit (QIAGEN) according to the method described in the instruction manual. All RM was dissolved in 40 L of sterile water. Single-stranded cDNA was synthesized from the purified RNAl to 2 ⁇ g by RT-PCR using the Superscript cDNA synthesis system (Invitrogen) according to the method described in the instruction manual.
  • a primer for amplifying mouse antibody H chain variable region (VH) cDNA As a primer for amplifying mouse antibody H chain variable region (VH) cDNA, an HB primer mixture and an HF primer mixture described in a report by Krebber et al. (J. Immunol. Methods 1997; 201: 35-55) were used. Prepared. Using 0.5 L each of the IOOM HB primer mixture and the IOOM HF primer mixture, 25 L of the reaction mixture (cDNA solution 2.51, prepared in 7-1, K0D plus buffer (Toyobo), 0.2 mM dNTPs, 1.5niM MgC12, 0.75 units DNA polymerase KOD plus (Toyobo) was prepared.
  • PCR was carried out using the GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer) according to the efficiency of the amplification of the cDNA fragment under the condition A (heating at 98 ° C for 3 minutes, 98 ° C for 20 seconds, 58 ° C).
  • a reaction consisting of 20 seconds and 72 ° C for 30 seconds is a cycle of 32 cycles) or condition B (after heating at 94 ° C for 3 minutes, a reaction consisting of 20 seconds, 46 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 30 seconds)
  • One cycle consisted of 5 cycles, and the reaction consisting of 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, and 1T for 30 seconds was 30 cycles).
  • the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. Amplified fragment of desired size (about 400bp)
  • the DNA sequencer was determined using the ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) using the Seuencing Kit (Applied Biosystems) according to the method described in the attached instruction manual. Analysis software GENETYX-SV / RC
  • the following operation was performed to add a restriction enzyme SI cleavage site for cloning to both ends of the amplified fragment of the antibody variable region.
  • a modified version (primer VH-5 'end) was prepared. 0.5 1 of each 10 M sequence-specific primer VH-5 'end and primer scior (J. Immunol.
  • conditions A 32 cycles of a reaction consisting of 98 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds after heating for 3 minutes at 98 ° C
  • condition B After heating at 94 ° C for 3 minutes, 5 cycles of a reaction consisting of 94 ° C for 20 seconds, 46 ° C for 20 seconds, and 68 ° C for 30 seconds, followed by 94 ° C for 20 seconds, 58 for 20 seconds, and 72 The reaction consisting of 30 seconds at 30 ° C was performed as one cycle).
  • the reaction solution was subjected to 1 agarose gel electrophoresis.
  • the amplified fragment of the target size (about 400 bp) was purified using the QIAduick Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction manual, and eluted with 30 L of sterile water.
  • VL mouse antibody light chain variable region
  • PCR was performed using a ThermoCycler GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer), according to the efficiency of fragment amplification, after heating at 94 for 3 minutes, 94 ° C for 20 seconds, 46 ° C for 20 seconds, and 68 ° C for 30 minutes.
  • the reaction was performed under the conditions of 5 cycles each including 1 second, and 30 cycles each including a reaction consisting of 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds.
  • the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • the amplified fragment of the desired size (about 400 bp) was purified using the QIAQUcick Gel Extractio Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction manual, and eluted with 30 ⁇ L of sterile water.
  • the fragment has a (Gly4Ser) 3-linker sequence derived from primer LF added to its C-terminal.
  • the (Gly4Ser) 3-linker sequence of primer LF was changed to a sequence (SEQ ID NO: 32) having a SiiI cleavage site (primer VL- 3 'end) was prepared.
  • the reaction was performed under the following conditions: 30 cycles at 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, and 72 seconds for 30 seconds. After PCR, the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. The amplified fragment of the target size (about 400 bp) was purified using the QIAduick Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction manual, and eluted with 30 L of sterile water.
  • QIAduick Gel Extraction Kit QIAduick Gel Extraction Kit
  • reaction solutions were prepared using Sii I (Yukara Bio) according to the method described in the attached instruction manual, and digested at 50 ° C overnight. Thereafter, the reaction solution was purified using a QIAauick PCR Purification Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction manual, and eluted with 30 L of Buffer EB attached to the kit.
  • Sii I Yukara Bio
  • QIAGEN QIAauick PCR Purification Kit
  • Type a is a substitution of Y349C, T366W
  • type b is a substitution of E356C, T366S, L368A, Y407V.
  • a substitution (-ppcpScp--> -ppcpPcp-) was introduced into the hinge region of both substitutions. This technology can be almost heterologous, but not limited to the L chain, and the generation of unnecessary antibody molecules may affect subsequent activity measurements.
  • each antibody molecule with each specificity (referred to as HL molecule) is separately expressed, and each HL molecule is supported in order to efficiently produce the target bispecific IgG antibody in cells.
  • the expression vectors used were those induced by different drugs.
  • the right arm HL molecule For expression of one arm of the antibody molecule (referred to as the right arm HL molecule for convenience), Into the inducible vector pcDNA4 (Invitrogen), the respective regions of the H and L chains (FIGS. 1 and 2), that is, the signal sequence for animal cells (IL3ss) (Proc. Natl.
  • PCDNA4-g4H to PCDNA4-g4L.
  • PCDNA4 was digested with restriction sites Eco RV and Not I (Yukara Bio) at the multiple cloning site. After digesting the right arm H-chain or L-chain expression unit (approximately 1.6 kb to approximately 1. Okb, respectively) with an appropriate antibody variable region with XhoI (Yukara Bio), use the QIA uick PCR Purification Kit.
  • the product was purified by (QIAGEN) according to the method described in the instruction manual, and reacted with DNA polymerase K0D (Toyobo) in the reaction solution composition described in the instruction manual for 10 minutes at 72 ° C to blunt the ends.
  • the blunt-ended fragment was purified using the QIAduick PCR Purification Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached manual, and digested with Not I (Takara Bio).
  • the Not I-blunt fragment (each about 1.6 kb to 1. Okb) and pcDNA4 digested with the Eco RV-Not I were ligated using Ligation High (Toyobo) according to the method described in the attached instruction manual. I got it.
  • Escherichia coli DH5 strain (Competent high DH5a (Toyobo)) was transformed with the reaction solution. Plasmid DNi was isolated from each of the ampicillin-resistant clones obtained using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN).
  • the other arm (referred to as the left arm HL molecule for convenience) is linked to an ecdysone analog-inducible vector, pIND (Invitrogen), for each of the H and L chains ( Figures 2 and 3), ie, the signal sequence for animal cells ( An appropriate mouse antibody variable region (VH or VL) and a human IgG4rb constant region (SEQ ID NO: 35) or a ⁇ constant region (SEQ ID NO: 34) are incorporated downstream of IL3ss) (EMBO. J. 1987; 6: 2939). (PIND-g4H to pIND-g4L) were prepared according to the method described above, and each plasmid DNA was isolated.
  • the Sfi I digested anti-F.IXa antibody-derived Sii I-VH or Sfi I-VL fragment prepared in 7-3 corresponding to each fragment was attached using the Quick Ligation Kit (New England Biolabs). The ligation reaction was performed according to the method described in the manual. Escherichia coli DH5o! Strain (Co immediately etent high DH5o; (Toyobo)) was transformed with the reaction solution. From the SfiI digested ecdysone analog-inducible expression plasmid (pIND-g4H to pIND-g4L) prepared in 7-4, the antibody variable region (VH to VL (Fig. The fragments excluding) and the corresponding Sfi I-digested anti-FX antibody-derived Sii I-VH or Sfi I-VL fragments prepared in 7-3 were incorporated in the same manner.
  • insertion of the target fragment was confirmed by colony PCR using a primer that sandwiched the insert fragment.
  • 2Hner primer CMVF SEQ ID NO: 36
  • BGHR 18-mer primer that anneals to priming 36 was synthesized (Sigma Genosys). Anneals upstream of the insertion site for the expression vector of the anti-F.X antibody chimera H or L chain.
  • PCR is a thermal cycler GeneAmp PCR After heating at 96 ° C for 1 minute using a system 9700 (Parkin Elmer), the reaction was performed under the conditions of 30 cycles of 96 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 10 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. Was. After PCR, the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a clone from which an amplified fragment of the desired size was obtained was selected.
  • the PCR product is ExoSAP-IT (Amersham
  • Plasmid DNA was isolated from each target clone using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) and dissolved in 100 L of sterilized water.
  • Each plasmid solution was stored at 4 ° C until use.
  • HL molecule expression vector pcDNA4-g4IXaHn and PCDNA4-g4IXaLn
  • Plasmid PCDNA6 / TR Invitrogen
  • Tet repressor is required to completely suppress expression in the absence of tetracycline.
  • the vector for expressing the HL molecule of the left arm of the antibody contains the insect hormone ecdysone analog (bonastere). Ron A) induces expression.
  • a plasmid pVgRXR (Invitrogen) encoding the ecdysone receptor and the retinoid X receptor, which react with and induce bonasterone A, is required. Therefore, a total of six types of plasmid DNA mixtures were prepared for transfection of animal cells. For 1 mL of cell culture solution, 218.8 ng each of pcDNA4-g4IXaHn, pcIND4-g4IXaLn, pIND_g4XHn and pIND-g4XLn, and 1312.5 ng each of PCDNA6 / TR and pVgRXR were used.
  • Human embryonic kidney cancer cell-derived HEK293H strain (Invitrogen) was suspended in DMEM medium (Invitrogen) containing 10% FCS (M0REGATE), and 12-wel I plate for adherent cells was prepared at a cell density of 5 x 10 5 cells / mL. LmL was inoculated into each well of (CORNING) and cultured in a C02 incubator (37%, 5% C02). Transfer the plasmid DNA mixture prepared in 8-1 to the transfection reagent, 7 L of Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and Opti-MEM I medium.
  • the cells were removed by centrifugation (approximately 2000 g, 5 minutes, room temperature), and concentrated with a Microcon YM-50 (Millipore) as necessary. The samples were stored at 4 until use.
  • a Goat affinity purified antibody to human IgG Fc was prepared in a coating buffer and immobilized on a Nunc-1 substitution plate. After blocking with Diluent buffer (D.B.), a culture supernatant sample appropriately diluted with D.B. was added. In addition, as a standard for calculating antibody concentration, human IgG4 (humanized anti-TF antibody, see WO99 / 51743) diluted in 11 steps in D.B. in a 2-fold series from 1000 ng / mL was similarly added. After washing three times, Goat anti-human IgG and alkaline phosphatase (Biosource International) were reacted.
  • TBSB-S TBSB containing 5 L, 5 mM CaC12 and lmM MgC12
  • the absorbance at 405 nm (reference wavelength 655 nm) at 0 and 30 minutes was measured with a Model 3550 Microplate Reader (Bio Rad Loboratories).
  • F. Villa-like activity was expressed as a value obtained by subtracting the change in absorbance for 30 minutes without addition of the antibody from the change in absorbance for 30 minutes after addition of the antibody (see FIGS. 4 and 5).
  • TBSB, Factor XIa, Factor IX and Factor X were used as the phosphol ipid solvent, and TBSB-S was used as the solvent.
  • the chromogenic substrate solution is a 1: 1 mixture of test team chromogenic substrate S-2222 (Chromogenix) and polypropylene solution (0.6 mg / L hexadimethrine bromide (Sigma)) dissolved according to the attached instructions.
  • the antibody was eluted after suspending at 1011111 (; 1, pH2.0 and standing for 3 minutes. Immediately, the plate was neutralized by adding 5 L of 1M Tris_HCl, pH8.0. Microplate Manager III (Bio-Rad Laboretories) software was used to calculate the concentration of human IgG in the culture supernatant from the standard calibration curve. The antibody concentration was determined according to Example 9.
  • an antibody having a ligand function-substituting action on a receptor containing a heteromolecule.
  • the present invention also provides an antibody that recognizes both an enzyme and a substrate of the enzyme, and that substitutes for the function of a cofactor that enhances enzyme activity.
  • the antibody of the present invention is considered to have high stability in blood and low antigenicity, it is generally expected to be a pharmaceutical.

Abstract

AR1鎖,AR2鎖の二種の分子から成るI型インターフェロン受容体に対するリガンド機能代替二種特異性抗体の分離に成功した。また、血液凝固第IX因子/活性化血液凝固第IX因子及び血液凝固第X因子の双方に結合し、酵素反応を増強させる血液凝固第VIII因子/活性化血液凝固第VIII因子の作用を代替する二種特異性抗体を作製することに成功した。

Description

明細書 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 技術分野
本発明は、 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体に関する。 詳しくはへテロ受 容体に対するリガンドの機能を代替する二種特異性抗体、 酵素反応を増強する補 因子の作用を代替する二種特異性抗体、 および該抗体を有効成分として含有する 医薬組成物に関する。 背景技術
抗体は血中での安定性が高く、 抗原性も低いことから医薬品として注目されて いる。 その中には二種類の抗原を同時に認識できる二種特異性抗体がある。 二種 特異性抗体は提唱されて久しい。 しかしながらこれまでに、 NK細胞、 マクロフ ァージ、 T細胞の retarget ingを目的とするなど、 二種類の抗原を単に繋ぐだけ の抗体しか報告されていない （非特許文献 8参照） 。 例えば、 臨床試験が行なわ れている MDX- 210は、 Fc r RIを発現している monocyte等を HER- 2/neuを発現し ている癌細胞に retarget ingする二種特異性抗体であるに過ぎない。 従って現在 まで、 二種特異性抗体を生体内で機能する蛋白質の代替手段として利用した例は なかった。
生体内で機能する蛋白質の 1つとして、 受容体に対するリガンドが挙げられる。 これらのリガンドとしては、 インターロイキン （IL) -2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15、 エリスロポエチン （EP0) 、 成長ホルモン （GH) 、 顆粒球コロ 二一剌激因子 （G- CSF) 、 トロンポポェチン （TP0) 、 顆粒球マクロファージコロ ニー刺激因子 （GM- CSF) 、 マクロファージコロニー剌激因子 （M- CSF) 、 インタ 一フエロン （IFN - 、 IFN - |S、 IFN -ァなど） 、 毛様体神経向性因子 （CNTF) 、 白血病抑制因子 （LIF) 、 Oncostat in M, カルジォトロピン- 1 (CT-1)、 腫瘍壌死 因子 （TNF) などが挙げられる。 これらの受容体では、 リガンドが結合すること によって、 二量体あるいは数量体を形成する受容体分子の距離 ·角度に変化が生 じ、 細胞内にシグナルを伝え得ると考えられている。 つまり適切な抗受容体抗体 は、 リガンドによる受容体の二量体化もしくは数量体化を模倣できる抗体となり うる。 既にホモ二量体から成る TP0受容体 （MPL) (特許文献 1および非特許文 献 1参照） 、 EP0受容体、 GH受容体、 G-CSF受容体に対してリガンド代替作用を 示すモノクローナル抗体が報告されている。 これらの抗体はそれぞれ、 血小板減 少時の血小板数回復作用、 貧血時における赤血球増多作用、 低身長症の成長促進 作用、 あるいは好中球減少症における好中球回復作用を示すと考えられ、 医薬へ の応用が期待されている。
しかしながら、 ヘテロ二量体を形成する受容体の場合は、 二種あるいは数種の 受容体分子の複合体を形成させる必要があるため、 一般的な抗体ではリガンド機 能の代替を期待できない。 この目的には二種類の受容体分子を二本の腕でそれぞ れ認識出来る上記の二種特異性抗体が適すると考えられるが、 報告例は未だなか つた。
また、 生体内で機能する蛋白質の 1つとして、 補因子 （coiactor) が挙げられ る。 補因子としては、 例えば、 組織因子 （TF) 、 血液凝固第 V因子 （F. V) 、 活 性化血液凝固第 V因子 （F. Va) 、 血液凝固第 VIII因子 （F. VIII) 、 活性化血液 凝固第 VIII因子 （F. Villa) 、 トロンポモデュリン （TM) 、 プロテイン S (PS) 、 プロテイン Z (PZ)、 へパリン、.補体 C4b、 補体制御夕ンパク H因子、 membrane coiactor protein (MCP) 、 complement receptor 1 (CRD 等が挙げられる。
これらのうち、 F. VIII/F. VIIIaは、 十分な F. IXaの活性発現に必要な補因子で ある。 Scheiil inger Fらは、 ある種の抗 F. IX/F. IXa抗体に、 chromogenic assay において F. IXaによる F. X活性化を促進する作用があることを見出している （特許 文献 2参照） 。 しかしながら、 F. VIII欠乏血漿の凝固回復能測定においては、 こ の抗体単独による凝固回復能は示されておらず、 外来的に F. IXaを添加した状態 でのみ凝固回復能を示している。
F. Villaは、 F. IXaと相互作用するだけでなく F.Xとも相互作用することが知ら れている （非特許文献 6および 7参照） 。 この点で、 Scheiflinger Fらの抗体は、 F. VIII/F. Villaの機能を十分に代替しているといえず、 その活性も不十分である と推測される。
本発明者らは、 鋭意研究の結果、 機能蛋白質の作用を代替する二種特異性抗体 の作製に成功し、 本発明に至った。 (特許文献 1) 米国特許出願公開第 98/17364号明細書
(特許文献 2) 国際公開第 01/19992号
(特許文献 3) 米国特許第 4, 474, 893号公報
(特許文献 4) EP404，097号
(特許文献 5) 国際公開第 93/11161号
(特許文献 6) 特願 2002- 112369号公報
(特許文献 7) 特願 2003- 012648号公報
(特許文献 8) 特開平 5- 304992号公報
(特許文献 9) 特開平 2- 145187号公報
(特許文献 10) 特開平 5-213775号公幸
(特許文献 11) 特開平 10-165184号公報
(特許文献 12) 特開平 11- 71288号公報
(特許文献 13) 特表 2002- 518041号公報
(特許文献 14) 特表平 U-506310号公報
(特許文献 15) 特開平 5- 199894号公報
(特許文献 16) 特表平 10- 511085号公報
(特許文献 17) 特開平 5- 184383号公報 (非特許文献 1 ) Deng D ら著、 「Blood」 、 1998年、 Vol. 92、 No. 6、 p. 1981-1988
(非特許文献 2 ) Nilsson IM ら著、 「J. Intern. Med. J 、 1992年、
Vol. 235、 p. 25-32
(非特許文献 3 ) Lofqvist T ら著、 「J. Intern. Med.」 、 1997年、
Vol. 241、 p. 395-400
(非特許文献 4 ) 第 24回日本血栓止血学会学術集会学術専門部会血友病標 準化検討部会 ミニシンポジウム、 2001年、 http : //ww. sth. org
(非特許文献 5 ) Medical Bulletin #193 1994
(非特許文献 6 ) Mertens K ら著、 「Thromb. Haemost. J 、 1999年、 Vol. 82、 p. 209-217
(非特許文献 7 ) Lapan KA ら著、 「Thromb. Haemost. J 、 l"8年、 Vol. 80、 p. 418-422
(非特許文献 8 ) Segal DM ら著、 「Journal of Immunological MethodsJ 、 2001年、 Vol. 248、 p. 1-6 .
(非特許文献 9 ) Bos Rおよび Nieuwenhuitzen W著、 「Hybridoma」 、 1992 年、 Vol. 11、 No. 1、 p. 41-51
(非特許文献 1 0 ) Brennan M ら著、 「Science」 、 1985年、 Vol. 229、 No. 1708、 p. 81-3
(非特許文献 1 1 ) Karpovsky B ら著、 「J. Exp. Med.」 、 1984年、
Vol. 160、 No. 6、 p. 1686-701
(非特許文献 1 2 ) Suresh MR ら著、 「Methods Enzymol. J 、 1986年、 Vol. 121、 p. 210-28
(非特許文献 1 3 ) Massimo YS ら著、 「： T. Immunol. Methods」 、 1997年、 Vol. 201、 p. 57-66
(非特許文献 1 4 ) Brennan M ら著、 「Science」 、 1985年、 Vol. 229、 p. 81
(非特許文献 15) Shabby MR ら著、 Π· Exp. Med. J 、 1992年、 Vol.175、 p.217-25
(非特許文献 16) Hoi liner P ら著、 「Proc. Natl. Acad. Sci. USAJ 、 1993年、 Vol.90、 p. 6444-8
(非特許文献 17) Ridgway JB ら著、 「Protein Eng. J 、 1996年、 Vol.9、 p. 617-21
(非特許文献 18) Hammer ling U ら著、 rj. Exp. Med. J 、 1968年、
Vol.128、 p.1461-73
(非特許文献 19) Kurokawa T ら著、 「Bio/Technology」 、 1989年、 Vol.7、 p.1163
(非特許文献 20) Link BK ら著、 「Blood」 、 1993年、 Vol.81、 .3343 (非特許文献 21) Nitta T ら著、 「LancetJ 、 1990年、 Vol.335、 p.368-
71
(非特許文献 22) deLeij L ら著、 「Foimdation Nationale de
Transfusion Sanguine, Les Ulis FranceJ 、 1990年、 p.249-53
(非特許文献 23) Le Doussal JM ら著、 rj. Nucl. Med. J 、 1993年、 Vol.34、 p. 1662-71
(非特許文献 24) Stickney DR ら著、 「Cancer Res. J 、 1991年、 Vol.51、 p.6650-5
(非特許文献 25) einer LM ら著、 「Cancer Res. J 、 1993年、 Vol.53, p.94-100
(非特許文献 26) Kroesen BJ ら著、 「Br. J. CancerJ 、 1994年、 Vol.70、 p.652-61
(非特許文献 27) Weiner GJら著、 「J. Immunol.」 、 1994年、 Vol.152、 p.2385 (非特許文献 2 8 ) Suresh MR ら著、 「Proc. Nat l. Acad. Sci. USAJ 、 1986年、 Vol. 83、 p. 7989-93
(非特許文献 2 9 ) Mi l stein Cおよび Cuel lo AC 著、 「Nature」 、 1983年、 Vol. 305、 p. 537
(非特許文献 3 0 ) Xiang J ら著、 「Mol. I雇 unol.」 、 1990年、 Vol. 27、 p. 809
(非特許文献 3 1 ) Bebbington CR ら著、 ΓΒίο/Technologyj 、 1992年、 Vol. 10、 p. 169
(非特許文献 3 2 ) Huse WD ら著、 「Science」 、 1989年、 Vol. 246、 p. 1275 '
(非特許文献 3 3 ) McCaf ferty J ら著、 「Nature」 、 1990年、 Vol. 348、 p. 552
(非特許文献 3 4 ) Kang AS ら著、 「Proc. Nat l. Acad. Sci. USAJ 、 1991 年、 Vol. 88、 p. 4363 発明の開示
本発明は、 機能蛋白質の作用を代替する二種特異性抗体の提供を課題とする。 よ り詳しくは、 ヘテロ受容体分子を含む受容体に対するリガンド機能を代替する二 種特異性抗体、 および酵素反応を増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗 体の提供を課題とする。
本発明者らは鋭意研究を行った結果、 AR1鎖, AR2鎖の二種の分子から成る I型ィ ンターフェロン受容体に対するリガンド機能代替抗体の分離に成功した。 即ち本 発明者らは、 ヘテロ分子からなる受容体に対してリガンド機能代替作用を有する 二種特異性抗体を初めて分離することに成功した。
さらに本発明者らは鋭意研究を行つた結果、 F. IX/F. IXa及び F. Xの双方に特異 的に結合し、 F. Vi llaの補因子作用、 すなわち F. IXaによる F. X活性化を促進する 作用を代替する二種特異性抗体を見出すことに成功した。 即ち、 本発明者らは、 酵素および該酵素の基質の両者を認識し、 該酵素の補因子の機能を代替し得る二 種特異性抗体の作製に成功した。
上記へテロ分子からなる受容体のリガンド蛋白質、 および上記酵素補因子は共 に、 機能蛋白質であることから、 本発明者らによって初めて、 機能蛋白質の代替 機能を有する二種特異性抗体が実際に開発されたものと言える。
即ち本発明は、 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体に関する。 より詳しくは、 ヘテロ分子を含む受容体に対してリガンド機能代替作用を有する二種特異性抗体、 および酵素反応を増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗体に関し、 より 具体的には、
〔 1〕 機能蛋白質の代替機能を有する二種特異性抗体、
〔2〕 ヘテロ分子を含む受容体に対してリガンド機能代替活性を有する二種特 異性抗体、
〔3〕 受容体がサイト力イン受容体である 〔2〕 に記載の抗体、
〔4〕 サイト力イン受容体がインターフェロン受容体である 〔3〕 に記載の抗 体、
〔5〕 インターフェロン受容体が I型インターフェロン受容体である 〔4〕 に 記載の抗体、
〔6〕 I型インターフエ口ン受容体が AR1鎖及び AR2鎖を含んでいることを特徴 とする 〔5〕 に記載の抗体、
〔7〕 ヘテロ分子を含む受容体が二量体である 〔2〕 に記載の抗体、
〔8〕 抗 AR1鎖抗体の可変領域と、 抗 AR2鎖抗体の可変領域とを含む、 〔6〕 に 記載の抗体、
〔9〕 抗 AR1鎖抗体における下記 （a ) のアミノ酸配列からなる可変領域と、 抗 AR2鎖抗体における下記 （b 1 ) 〜 （b 1 0 ) のいずれかに記載のアミ ノ酸配列からなる可変領域とを含む、 〔8〕 に記載の抗体、 (a) H鎖可変領域が配列番号： 1に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 2に記載のアミノ酸配列
(b 1) H鎖可変領域が配列番号： 7に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 8に記載のアミノ酸配列
(b 2) H鎖可変領域が配列番号： 9に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 10に記載のアミノ酸配列
(b 3) H鎖可変領域が配列番号： 19に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 20に記載のアミノ酸配列
(b4) H鎖可変領域が配列番号： 13に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 14に記載のアミノ酸配列
(b 5) H鎖可変領域が配列番号： 23に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 24に記載のアミノ酸配列
(b 6) H鎖可変領域が配列番号： 5に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 6に記載のアミノ酸配列
(b 7) H鎖可変領域が配列番号： 17に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 18に記載のアミノ酸配列
(b 8) H鎖可変領域が配列番号： 15に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 16に記載のアミノ酸配列
(b 9) H鎖可変領域が配列番号： 21に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 22に記載のアミノ酸配列
(b 10) H鎖可変領域が配列番号： 11に記載のアミノ酸配列であり、 L 鎖可変領域が配列番号： 12に記載のアミノ酸配列
〕 抗 AR1鎖抗体における下記 （a) のアミノ酸配列からなる可変領域と、 抗 AR2鎖抗体における下記 （b l) 〜 （b 3) のいずれかに記載のアミ ノ酸配列からなる可変領域とを含む、 〔8〕 に記載の抗体、
(a) H鎖可変領域が配列番号： 3に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 4に記載のアミノ酸配列
(b 1) H鎖可変領域が配列番号： 9に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 10に記載のアミノ酸配列
(b 2) H鎖可変領域が配列番号： 9に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 10に記載のアミノ酸配列
(b 3) H鎖可変領域が配列番号： 21に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 22に記載のアミノ酸配列
〔1 1〕 〔2〕 〜 〔1 0〕 のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する 医薬組成物、
〔1 2〕 酵素、 および該酵素の基質の両方を認識する抗体であって、 酵素活性 を増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗体、
〔1 3〕 酵素が蛋白質分解酵素である、 〔12〕 に記載の抗体、
〔14〕 蛋白質分解酵素が血液凝固線溶関連因子である、 〔1 3〕 に記載の抗 体、 '
〔1 5〕 血液凝固第 VIII因子および/または活性化血液凝固第 VIII因子の作用 を代替する作用を有する、 〔14〕 に記載の抗体、
〔16〕 H鎖 CDR3の配列が配列番号： 42、 46、 50、 54、 58、 62、 66、 70、 74、 78、 もしくは 82のいずれかに記載のアミノ酸配 列からなる相補性決定領域、 またはこれと機能的に同等の相補性決定領 域を有する、 〔12〕 〜 〔1 5〕 のいずれかに記載の抗体、
〔1 7〕 XB12または Π04のいずれかの H鎖 CDR3のアミノ酸配列からなる相補性 決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有し、 且つ、 H 鎖 CDR3の配列が配列番号： 50、 54、 58、 62、 66、 70、 74、 78もしくは 82のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる相補性決定 領域、 またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有する、 〔12〕
〜 〔1 5〕 のいずれかに記載の抗体、 〔18〕 H鎖 CDR配列が配列番号： 40〜42、 44〜46、 48〜50、 52 〜54、 56〜58、 60〜62、 64〜66、 68〜70、 72〜7 4、 76〜 78もしくは 80〜 82のいずれかに記載のアミノ酸配列か らなる相補性決定領域、 またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を 有する、 〔12〕 〜 〔15〕 のいずれかに記載の抗体、
〔19〕 H鎖配列が XB12もしくは Π04のいずれかのアミノ酸配列からなる相補 性決定領域、 またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有し、 且つ、 H鎖 CDR配列が配列番号： 48〜50、 52〜54、 56〜58、 60〜 62、 64〜66、 68~70、 72〜74、 76〜 78もしくは 80 〜82のいずれかのアミノ酸配列からなる相補性泱定領域、 またはこれ と機能的に同等の相補性決定領域を有する、 〔12〕 〜 〔15〕 のいず れかに記載の抗体、
〔20〕 〔12〕 〜 〔19〕 のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容され る担体を含む組成物、
〔21〕 出血、 出血を伴う疾患、 もしくは出血に起因する疾患の予防および/ または治療に用いられる医薬組成物である、 〔20〕 に記載の組成物、 〔22〕 出血、 出血を伴う疾患、 もしくは出血に起因する疾患が、 血液凝固第
VIII因子および/または活性化血液凝固第 VIII因子の活性の低下ないし 欠損によって発症および/または進展する疾患である、 〔21〕 に記載 の医薬組成物、
〔23〕 第 VIII因子の活性の低下ないしは欠損によって発症および/または進 展する疾患が、 血友病 Aである、 〔22〕 に記載の医薬組成物、
[24〕 血液凝固第 VIII因子および/または活性化血液凝固第 VIII因子の活性 の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、 血液凝 固第 VIII因子および/または活性化血液凝固第 VIII因子に対するインヒ ビ夕一が出現している疾患である、 〔22〕 に記載の医薬組成物、 〔25〕 血液凝固第 ΉΙΙ因子および/または活性化血液凝固第 VIII因子の活性 の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、 後天性 血友病である、 〔22〕 に記載の医薬組成物、
〔26〕 血液凝固第 VIII因子および/または活性化血液凝固第 VIII因子の活性 の低下によって発症および/または進展する疾患が、 フォンビルブラン ド病である、 〔22〕 に記載の医薬組成物、
〔27〕 〔12〕 ~ 〔19〕 のいずれかに記載の抗体、 または 〔20〕 〜 〔2 6〕 のいずれかに記載の組成物を投与する工程を含む、 出血、 出血を伴 う疾患、 もしくは出血に起因する疾患を予防および/または治療する方 法、
〔28〕 〔12〕 〜 〔19〕 のいずれかに記載の抗体の、 〔20〕 〜 〔26〕 のいずれかに記載の組成物の製造のための使用、
〔29〕 少なくとも 〔12〕 〜 〔1 9〕 のいずれかに記載の抗体、 または 〔2
0〕 に記載の組成物を含む、 〔27〕 に記載の予防および/または治療 する方法に用いるためのキット、
を提供するものである。
本発明における二種特異性抗体 （bispeciiic抗体） は、 2種類の異なる抗原決 定基に対して特異性を有する抗体のことである。
本発明の二種特異性抗体は、 特に制限されないが、 モノクローナル抗体である ことが好ましい。 また、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体であ ることが好ましい。 （例えば、 Borrebaeck CAK and Larrick JW, THERAPEUTIC M ONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLI SHE S LTD, 1990参照） 。 組換え型抗体は、 それをコードする DNAをハイプリド 一マ、 または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し産生させることにより得るこ とができる。 さらに、 本発明における抗体は、 その抗体断片や抗体修飾物であってよい。 抗 体断片としては、 ダイアポディ（diabody ; Db)、 線状抗体、 一本鎖抗体 （以下、 s cFvとも記載する） 分子などが含まれる。 ここで、 「Fv」 断片は最小の抗体断片 であり、 完全な抗原認識部位と結合部位を含む。 この領域は 1つの重 （H) 鎖可変 領域 （VH) および軽 （L) 鎖可変領域 （VL) が非共有結合により強く連結された ダイマー （VH- VLダイマー） である。 各可変領域の 3つの相補鎖決定領域 （comple mentari ty determining region； CDR) が相互作用し、 VH- VLダイマ一の表面に抗 原結合部位を形成する。 6つの CDRが抗体に抗原結合部位を付与している。 しかし ながら、 1つの可変領域 （または、 抗原に特異的な 3つの CDRのみを含む Fvの半 分） であっても、 全結合部位よりも親和性は低いが、 抗原を認識し、 結合する能 力を有する。
また、 Fab断片 （F (ab)とも呼ばれる） はさらに、 L鎖の定常領域および H鎖の定 常領域 （CH1) を含む。 Fab'断片は、 抗体のヒンジ領域からの 1またはそれ以上の システィンを含む H鎖 CH1領域のカルポキシ末端由来の数残基を付加的に有する点 で Fab断片と異なっている。 Fab' -SHとは、 定常領域の 1またはそれ以上のシステ イン残基が遊離のチオール基を有する Fab'を示すものである。 F (ab' )断片は、 F (a )' ) 2ペプシン消化物のヒンジ部のシスティンにおけるジスルフィド結合の切断 により製造される。 化学的に結合されたその他の抗体断片も当業者には知られて いる。
ダイアポディは、 遺伝子融合により構築された二価 (bivalent)の抗体断片を指 す圆 iger P et al. , Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA 90 : 6444-6448 (1993)、 EP404, 097号、 TO93/11161号等)。 ダイアポディは、 2本のポリペプチド鎖から構成され るダイマ一であり、 ポリペプチド鎖は各々、 同じ鎖中で L鎖可変領域 (VL)及び H鎖 可変領域 (VH)が、 互いに結合できない位に短い、 例えば、 5残基程度のリンカ一 により結合されている。 同一ポリペプチド鎖上にコードされる VLと VHとは、 その 間のリンカーが短いため単鎖可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量 体を形成するため、 ダイアポディは 2つの抗原結合部位を有することとなる。 一本鎖抗体または scFv抗体断片には、 抗体の VHおよび 領域が含まれ、 これら の領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。 一般に、 Fvポリペプチドはさらに VHおよび VL領域の間にポリぺプチドリンカ一を含んでおり、 これにより scFvは、 抗原結合のために必要な構造を形成することができる （scFvの総説については、 Pluckthun 『The Pharmacology of Monoclonal Ant ibodies』 Vol. 113 (Rosenburg and Moore ed (Springer Verl g, New York) pp. 269-315, 1994) を参照） 。 本 発明におけるリンカ一は、 その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害する ものでなければ特に限定されない。
IgGタイプ二種特異性抗体は IgG抗体を産生するハイプリドーマ二種を融合する ことによって生じる hybrid hybridoma (auadroma)によって分泌させることが出 来る （Mi lstein C et al. Nature 1983, 305 : 537-540) 。 また目的の二種の IgGを構成する L鎖及び H鎖の遺伝子、 合計 4種の遺伝子を細胞に導入すること によって共発現させることによって分泌させることが出来る。 この際 H鎖の CH3 領域に適当なアミノ酸置換を施すことによって H鎖についてヘテロな組合せの IgGを優先的に分泌させることも出来る （Ridgway JB et al. Prote in
Engineering 1996, 9 : 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16 : 677-681) 。
Fab' を化学的に架橋することによつても二種特異性抗体を作製し得る。 例え ば一方の抗体から調製した Fa を ^PDM (^/ ^iT- heny 1 ened i-mal e imi de)にてマ レイミド化し、 これともう一方の抗体から調製した Fa を反応させることによ り、 異なる抗体由来 Fab' 同士を架橋させ二種特異性 F (ab' ) 2を作製すること が出来る (Keler T et al. Cancer Research 1997, 57 : 4008-4014) 。 また Fab' -チォニトロ安息香酸 (TNB)誘導体と Fab' -チオール (SH)等の抗体断片を化 学的に結合する方法も知られている （Brennan M et al. Science 1985, 229 : 81-83) 。 化学架橋の代りに Fos, ； Timなどに由来するロイシンジッパーを用いることも 出来る。 Fos, ； iunはホモダイマーも形成するが、 ヘテロダイマ一を優先的に形 成することを利用する。 Fosロイシンジッパーを付加した Fab' と Jimのそれを 付加したもう一方の Fab' を発現調製する。 温和な条件で還元した単量体 Fab' - Fos, Fab' -Jimを混合し反応させることによって二種特異性 F (ab' ) 2が形成で きる (Kostelny SA eta al. J of Immunology, 1992, 148 : 1547-53) 。 この方 法は Fab' には限定されず、 scFv, Fvなどにおいても応用可能である。
ダイアポディにおいても二種特異性抗体を作製し得る。 二種特異性ダイアポデ ィは二つの cross-over scFv断片のへテロダイマーである。 つまり二種の抗体 AJ由来の VHと を 5残基前後の比較的短いリンカーで結ぶことによつて作製 された VH (A) -VL (B) , V„ (B) - (A)を用いてへテロダイマ一を構成することによつ て出来る (Hol l iger P et al. Proc of the Nat ional Academy of Sciences of the USA 1993, 90 : 6444-6448) 。
この際、 二種の scFvを 15残基程度の柔軟な比較的長いリンカーで結ぶ (一本 鎖ダイアポディ ： Kipriyanov SM et al. J of Molecular Biology. 1999， 293 : 41-56) , 適当なアミノ酸置換 (knobs-into-tioles : Zhu Z et al. Prote in
Science. 1997, 6 : 78卜 788)を行なうことによって目的の構成を促進させること も出来る。
二種の scFvを 15残基程度の柔軟な比較的長いリンカーで結ぶことによって作 製できる sc (Fv) 2も二種特異性抗体となり得る （Mal lender WD et al. J of Biological Chemistry, 1994, 269 : 199-206) 。
抗体修飾物としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子 と結合した抗体を挙げることができる。 本発明の抗体修飾物においては、 結合さ れる物質は限定されない。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化 学的な修飾を施すことによって得ることができる。 これらの方法はこの分野にお いて既に確立されている。 本発明の抗体は、 ヒト抗体、 マウス抗体、 ラット抗体など、 その由来は限定さ れない。 またキメラ抗体ゃヒト化抗体などの遺伝子改変抗体でもよい。
ヒト抗体の取得方法は既に知られており、 例えば、 ヒト抗体遺伝子の全てのレ パートリ一を有するトランスジエニック動物を目的の抗原で免疫することで目的 のヒト抗体を取得することができる （国際特許出願公開番号 W0 93/12227， W0 92 。
/03918, W0 94/02602, W0 94/25585, W0 96/34096, W0 96/33735参照） 。
遺伝子改変抗体は、 既知の方法を用いて製造することができる。 具体的には、 たとえばキメラ抗体は、 免疫動物の抗体の H鎖、 および L鎖の可変領域と、 ヒト抗 体の H鎖および L鎖の定常領域からなる抗体である。 免疫動物由来の抗体の可変領 域をコードする DNAを、 ヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、 これを発 現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによって、 キメラ抗体を得 ることができる。
ヒト化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称される改変抗体である。 ヒ ト化抗体は、 免疫動物由来の抗体の CDRを、 ヒ卜抗体の相補性決定領域へ移植す ることによって構築される。 その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域 （framework r egion； FR) を連結するように設計した DM配列を、 末端部にオーバーラップする 部分を有するように作製した数個のォリゴヌクレオチドから PCR法により合成す る。 得られた DNAを、 ヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、 次いで発現べ クタ一に組み込んで、 これを宿主に導入し産生させることにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400, 国際特許出願公開番号！） 96/02576参照） 。 CDRを 介して連結されるヒ卜抗体の FRは、 相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成 するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な 抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のァ ミノ酸を置換してもよい （Sato K et al, Cancer Research 1993, 53 : 851-85
6) 。 また、 様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい （国際 特許出願公開番号 TO 99/51743参照） 。
本発明は、 機能蛋白質の代替機能を有する二種特異性抗体、 より好ましくは機 能蛋白質の代替機能を有する二種特異性抗体を提供する。 本発明の抗体の好まし い態様としては、 ヘテロ分子を含む受容体に対してリガンド機能代替活性を有す る抗体である。
本発明においてへテロ分子を含む受容体とは、 受容体 （多量体） が異なる 2つ 以上の蛋白質 （受容体分子） で構成されているものをいう。 多量体は二量体、 三 量体、 四量体など、 その蛋白質 （受容体分子） 数により限定はされないが、 好ま しくは二量体である。 例えば、 受容体が二量体の場合には、 ヘテロ受容体は 2つ の構成蛋白質 （受容体分子) .が同一でないことを表す。
リガンド機能代替活性を有する抗体とは、 ある受容体に対して、 ァゴニスト作 用を有する抗体を指す。 一般的に、 ァゴニストであるリガンドが受容体と結合す ると、 受容体蛋白質の立体構造が変化し、 受容体が活性化 （受容体が膜蛋白質で ある場合には、 通常、 細胞増殖などのシグナルを発する） される。 二量体を形成 するタイプの受容体である場合には、 リガンド機能代替抗体は適切な距離、 角度 で受容体を二量体化させることにより、 リガンドと同様の働きをすることができ る。 つまり、 適当な抗受容体抗体はリガンドにより受容体の二量体化を模倣でき、 リガンド機能代替抗体となり得る。
本発明の好ましい態様においては、 本発明の受容体としてサイトカインヘテロ 受容体を挙げることができる。
サイ卜力インは、 通常、 各種の血球細胞の増殖と分化を制御する生理活性蛋白 質の総称として用いられるが、 非免疫系細胞を含む細胞の増殖因子及び増殖抑制 因子を指すこともある。 従って、 サイト力インは細胞から放出され、 免疫、 炎症 反応の制御作用、 抗ウィルス作用、 抗腫瘍作用、 細胞増殖 ·分化の調節作用など 細胞間相互作用を媒介する蛋白質性因子の総称である。
本発明でいうへテロ受容体に作用するサイトカインの具体的な例としては、 インターロイキン 2, 3, 4, 5, 6, 7， 9, 10, 11, 12, 13, 15、 コロニー刺激因 子 （GM- CSFなど） 、 インターフェロン （IFN- a、 IFN- ;3、 IFN-ァなど） 、 CNTF、 LIF、 Oncos tat in M、 CT-lなどを挙げることができるが、 好ましくはインターフ ェロンであり、 特に好ましくは I型インターフェロンである。
インターフェロンには IFN -ひ、 IFN - i3、 IFN -ァ、 IFN-てなどが含まれる。
IFN- αと IFN_ j3は相同性が高い為、 これら 2つの IFNは同一のレセプターを介し て反応することができる。 又、 IFN- α、 IFN - /3ならびに IFN -ては I型インター フエロンに分類される。
I型インターフェロン受容体の例として、 AR1鎖 （GenBank ACCESSION No ： J0317L 文献： Uze G et al. Cel l 1990, 60 : 225-34) および AR2鎖 （GenBank ACCESSION No ： 腿 84、 文献： Domanski P et al. J of Biological Chemistry 1995, 270 : 21606-11、 Lut faUa G et al. EMB0 J 1995, 14: 5100-8) を有する 受容体を挙げることができる。
本発明のリガンド機能代替二種特異性抗体を得る方法は特に制限されず、 どのよ うな方法で取得されてもよい。 例えば、 二種の受容体分子 （A鎖， B鎖） からなる ヘテロ受容体に対するリガンド機能代替二種特異性抗体を得る場合、 抗 A鎖抗体 及び抗 B鎖抗体を取得する。 その後、 抗 A鎖抗体の H鎖と L鎖及び抗 B鎖抗体の H鎖と L鎖を含む二種特異性抗体を作製する。 ここで、 抗 A鎖抗体と抗 B鎖抗体はそれぞ れ複数種得られていることが望ましく、 これらを用いてなるべく多くの組合せの 二種特異性抗体を作製することが好ましい。 二種特異性抗体を作製後、 リガンド 機能代替活性を有する抗体を選択する。 二種特異性抗体の作製は、 それぞれの抗 体産生ハイプリドーマ同士の融合、 もしくは抗体発現ベクターの細胞導入など、 公知の方法により行うことができる。
受容体に対する抗体は、 当業者に公知の方法により得ることができる。 例えば、 免疫動物に対して抗原を免疫することにより調製することができる。 動物を免疫 する抗原としては、 免疫原性を有する完全抗原と、 免疫原性を有さない不完全抗 原 （ハプテンを含む） が挙げられる。 本発明においては、 本発明のリガンド機能 代替抗体がリガンドとして作用すると考えられる受容体を、 上記抗原 （免疫原） として使用する。 本発明における上記受容体は特に制限されないが、 好ましくは ヘテロ二量体である。 免疫化する動物として、 例えば、 マウス、 ハムスター、 ま たはァカゲザル等を用いることができる。 これら動物に対して、 抗原を免疫化す ることは、 当業者においては、 周知の方法によって行うことができる。 本発明に おいて好ましくは、 免疫化された動物または該動物の細胞から抗体の L鎖および H鎖の可変領域の回収を行う。 この操作は、 当業者においては一般的に公知の技 術を用いて行うことができる。 抗原によって免疫化された動物は、 とりわけ脾臓 細胞において該抗原に対する抗体を発現する。 従って、 例えば、 免疫化された動 物の脾臓細胞から mRNAを調製し、 該動物の可変領域に対応するプライマーを用い て、 RT-PCRにより L鎖および H鎖の可変領域の回収を行うことができる。
詳細には、 動物に受容体の A鎖、 B鎖それぞれを免疫する。 免疫原とする受容体 は、 該受容体を構成する蛋白質全体、 もしくは該蛋白質の部分ペプチドであって もよい。 また、 動物を免疫するのに用いる免疫原としては、 場合により抗原とな るものを他の分子に結合させ可溶性抗原とすることも可能であり、 また、 場合に よりそれらの断片を用いてもよい。 受容体のような膜貫通分子を抗原として用い る場合、 これらの断片 (例えば、 受容体の細胞外領域）を用いるのが好ましい。 ま た、 膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原とすることもできる。 この ような細胞は天然 (腫瘍セルライン等）由来の細胞、 または、 組換え技術により膜 貫通分子を発現するように構成された細胞であってもよい。 この動物の脾細胞か ら mRNAを抽出し、 可変領域付近に対応するプライマーを用いて RT-PCRにて L鎖、 H 鎖可変領域の cDNAを回収する。 CDRに対応するプライマー、 CDRよりも多様性の低 いフレームワークに対応するプライマ一、 あるいはシグナル配列と CH1もしくは L 鎖定常領域 （ ） に対応するプライマーを用いることができる。 また、 in vi tro においてリンパ球を免疫化することもできる。 これを用いて scFvもしくは Fabを 提示するライブラリーを構築する。 パンニングによって抗原結合抗体クローンを 濃縮 'クローン化し、 その可変領域を用いて抗体発現ベクターを作製する。 抗 A 鎖抗体発現ベクターと抗 B鎖抗体発現べクタ一を同一の細胞に導入し、 抗体を発 現させることにより二種特異性抗体を得ることができる。 この際、 ヒトゃ免疫し ていない動物の末梢血単核球、 脾臓、 扁桃腺などに由来する mRNAを材料とする同 様のライブラリーを用いてスクリーニングを行うことも可能である。
リガンド機能代替活性を有する抗体の選択は、 例えば、 以下のような方法によ り行うことができる。
( 1 ) リガンド依存的に増殖する細胞の培養時に抗体を添加することによって、 リガンド同様に細胞が増殖するか否かを指標とする。 細胞が増殖する場合 に、 被験多種特異性抗体は、 リガンド機能代替作用を有するものと判定す る。
( 2 ) リガンドの本来の活性 （増殖とは限らない） を示す細胞株の培養時に加え ることによって、 リガンド同様の反応を示すか否かを指標とする。 リガン ド同様の反応を示す場合に、 抗体は、 リガンド機能代替作用を有するもの と判定する。
上記細胞は、 通常、 抗体がァゴニストとして作用し得るヘテロ受容体を細胞表 面に発現しており、 該受容体はリガンドと結合することによりシグナルを発する。 上記方法において使用する細胞は、 受容体のリガンド依存的に増殖できる細胞 (リガンド依存性増殖細胞） であることが好ましい。 また、 上記受容体は、 通常、 リガンドと結合することにより、 細胞増殖シグナルを発するものであることが好 ましい。 しかし、 上記受容体が細胞増殖シグナルを出さないものである場合、 該 受容体を、 細胞増殖シグナルを発するタイプの受容体と融合させ、 所謂キメラ受 容体とすることにより、 上記方法に使用することができる。 該キメラ受容体は、 リガンドと結合することにより、 細胞増殖シグナルを発する。 受容体と融合させ ることによりキメラ受容体を構築するのに適した受容体は、 細胞増殖シグナルを 発するタイプの受容体であれば特に制限されないが、 通常、 膜蛋白質であり、 よ り好ましくは細胞外領域がリガンド結合機能を有する受容体断片であり、 細胞内 領域がシグナル伝達機能を有する受容体断片であるような受容体である。 細胞内 領域に用いる受容体は、 具体的に GH受容体、 G- CSF受容体、 MPL、 EP0受容体、 c- Ki t, Fl t-3、 IL-2受容体、 IL-3受容体、 IL- 5受容体、 GM-CSF受容体等を挙げるこ とができる。 本発明における上記リガンド依存性増殖細胞の好適な例として、 具 体的には、 細胞外領域がリガンド受容体断片であり細胞内領域が G-CSF受容体断 片であるキメラ受容体を発現させたリガンド依存性増殖細胞 Ba/F3を示すことが できる。 その他、 上記方法において使用できる細胞として、 例えば、 NFS60、 FDC-PL FDC-P2, CTLL- 2、 DA_1、 KT - 3等を挙げることができる。
得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 抗体の分離、 精製は通常 の蛋白質で使用されている分離、 精製方法を使用すればよい。 例えばァフィニテ ィークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選 択、 組み合わせれば、 抗体を分離、 精製することができる（Ant ibodies ： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988) が、 これらに限定されるものではない。 ァフィ二ティーク口 マトグラフィ一に用いるカラムとしては、 プロテイン Aカラム、 プロテイン Gカラ ムなどが挙げられる。
本発明の抗体は、 例えば、 AR1鎖および AR2鎖を含む I型インターフェロン受容 体に対して、 リガンド機能代替活性を有する抗体である場合には、 好ましくは、 抗 AR1鎖抗体における可変領域と、 抗 AR2鎖抗体における可変領域とを含む構造を 有する。 イン夕一フエロン機能代替抗体は以下の方法で作製した。 I型インター フエ口ン受容体の受容体分子 AR1鎖及び AR2鎖それぞれの細胞外領域と G- CSF受容 体の細胞内領域のキメラ受容体をそれぞれ発現する IL- 3依存性マウスプロ B細胞 株 Ba/F3を樹立した。 それぞれの細胞を BALB/cの腹腔に免疫した。 抗体価の上昇した免疫マウスの脾臓より polyA W RNAを抽出し、 RT-PCRにて scFvを合成し、 scFv提示ファージライブラリーを構築した。 AR1鎖発現 Ba/F3免疫 マウス脾臓由来のファージライブラリーとピオチン化可溶型 AR1鎖を混合後スト レプトアビジン磁気ビーズで捕捉するパンニング法にて、 結合ファージを濃縮し た。 可溶型 AR1鎖を用いたファージ ELISAにて抗 AR1鎖抗体提示ファージを選択し た。 また同様に可溶型 AR2鎖及び AR2鎖発現 Ba/F3免疫マウス脾臓由来のライブラ リーファージを用いて抗 AR2鎖抗体ファージを選択した。 抗体の特異性に最も関 与するといわれている H鎖の CDR3のアミノ酸配列が異なる抗体を選択した。
scFvを動物細胞用のシグナル配列と CHI- hinge- CH2- CH3の間に挿入し、 scFv - CHl-Fc発現べクタ一を作製した。 AR1鎖に対する抗体と AR2鎖に対する抗体を様々 な組合せで細胞に導入し、 二種特異性抗体を発現させた。
BaF3- ARGは、 Ba/F3に AR1鎖及び AR2鎖のそれぞれの細胞外領域と G- CSF受容体の細 胞内領域とのキメラ分子の発現ベクターを導入して樹立した。 この細胞は IFN -ひ に依存して増殖した。 BaF3- ARGの増殖を支持できる抗体の組合せの二種特異性抗 体を選択した。
Daudi細胞は IFN_ aによる細胞増殖抑制活性について高感受性なヒト B細胞株で ある。 先に選択された二種特異性抗体を Daudi細胞に加え、 IFN- αと同様に増殖 を阻害することを確認した。 該抗体としては、 特に制限されるものではないが、 例えば、 抗 AR1鎖抗体の下記のいずれかの可変領域と、 抗 AR2鎖抗体の下記のいず れかの可変領域とを含む抗体を挙げることができる。
•抗 AR1鎖抗体の可変領域： AIU- 41、 AR1-24
•抗 !^鎖抗体の可変領域： AR2- 37、 AR2-1 K AR2-13, AR2-45, AR2- 22、 AR2- 43、 AR2- 40、 AR2 - 14、 AR2 - 44、 AR2 - 33、 AR2-31
上記のそれぞれの可変領域の VHおよび Vj_のアミノ酸配列を、 配列番号： 1〜2 6に示す （各可変領域の VHおよび と、 配列番号との関係を表 1に示す） 。 表 1 可変領域 配列番号 vH vL
AR1-41 1 2
AR1-24 3 4
AR2-37 5 6
AR2 - 11 7 8
AR2-13 9 1 0
AR2-45 1 1 1 2
AR2-22 1 3 1 4
AR2-43 1 5 1 6
AR2-40 1 7 1 8
AR2-14 1 9 2 0
AR2-44 2 1 2 2
AR2-33 2 3 2 4
AR2-31 2 5 2 6
抗 Ml鎖抗体が Αΐα- 24の場合、 パ一トナーとなる抗 AR2鎖抗体は、 AR2- 13、 AR2- 31、 あるいは AR2- 44であることが好ましく、 抗 AR1鎖抗体が AR1- 41の場合、 パー トナーとなる抗 AR2鎖抗体は、 AR2- 11、 AR2-13, AR2-14, AR2-22, AR2- 33、 AR2- 37、 AR2 - 40、 AR2 - 43、 AR2- 44、 あるいは AR2- 45であることが好ましい。 AR2- 13お よび AR2-44は、 Αΐα- 41および AR1- 24の両方の抗体に対してパートナーとなること が可能である。 上記のような対を形成する抗体もまた、 本発明に含まれる。
また本発明の機能蛋白質の代替機能を有する二種特異性抗体の好ましい態様と しては、 酵素および該酵素の基質の両方を認識するような補因子の機能を代替す る二種特異性抗体である。
本発明における補因子は、 酵素に作用し酵素反応を増強し得るものであれば特 に制限されない。 本発明における補因子としては、 例えば、 蛋白質分解酵素の補 因子を挙げることができる。 蛋白質分解酵素の補因子の具体例としては、 血液凝 固線溶関連因子における補因子 (F. VIII/F. Villa, PZ、 TM、 TM/PSシステム） や 補体反応の補因子 （C4b、 MCP、 CRL H因子） 等を挙げることができる。
本発明における酵素、 および該酵素の基質、 および該酵素の補因子の具体例と しては、 例えば、 以下の組合せを挙げることができる。
(a) 血液凝固線溶関連因子における補因子の例 1
酵素： F. IXa
基質： F. X
補因子： F.VIII/F. Villa
補因子 F. Villaは、 F. IXaと F.Xの両方に結合することによって、 F. IXaによる F.Xの活性化を増強する。 上記の酵素 F. IXa、 基質 F. Xの両方を認識する二種特異 性抗体の中には、 F.Xの活性化を増強する作用を有するものがある。 このような 抗体の中には、 補因子 F.VIII/F. Villaの作用機能を代替する作用を有するものが 存在すると考えられる。
(b) 血液凝固線溶関連因子における補因子の例 2
酵素： ZPI
基質： F. X/F. Xa
補因子： PZ
補因子 PZは、 serpinファミリーの ZPIと F.Xaに結合することで、 ZPIによる F.Xa 阻害活性を増強する。 すなわち、 ZPIと F.X/F.Xaの両方を認識する二種特異性抗 体の中には、 PZの機能を代替する作用を有するものが存在すると考えられる。 (0 血液凝固線溶関連因子における補因子の例 3
酵素： トロンビン
基質： TAFI
補因子： TM
補因子 TMは、 トロンビンによる TAFIの活性化を増強する。 すなわち、 トロンビ ンと TAFIの両方を認識する二種特異性抗体の中には、 TMの機能を代替する作用を 有するものが存在すると考えられる。
(d) 血液凝固線溶関連因子における補因子の例 4
酵素： 卜ロンビン
基質： PC
補因子： TM/PS
TM/PSシステムは、 トロンビンによる PCの活性化を増強する。 すなわち、 トロ ンビンと PCの両方を認識する二種特異性抗体の中には、 TM/PSシステムの機能を 代替するものが存在すると考えられる。
(e) 補体反応の補因子の例 1
酵素： Cls
基質： C2
補因子： C4b
C4bは Clsによる C2の分解促進作用を有する。 すなわち Clsと C2の両方を認識す る二種特異性抗体の中には、 C4bの機能を代替するものが存在すると考えられる。
(f) 補体反応の補因子の例 2
酵素：補体制御タンパク I因子 (Complement Regulatory Factor I) 基質： C3b
補因子：補体制御タンパク H因子 （Co即 lement Regulatory Factor H)
Membrane Cofactor Protein (MCP) Complement Receptor 1 (CRl)
Complement Regulatory Factor H、 MCP、 CRlは、 Complement Regulatory Factor Iによる C3b分解促進作用を有する。 すなわち、 Co即 lement Regulatory Factor Iと C3bの両方を認識する二種特異性抗体の中には、 Co即 lement
Regulatory Factor H、 MCP、 CRlの機能を代替するものが存在すると考えられる。 上記補因子の中で、 特に好ましいのは F. VIII/F. Villaである。 F. VIII/F. Villa は、 トロンビン等の蛋白分解酵素により限定分解を受けるが、 F. VIII/F. VIIIaの 補因子活性を有している限り、 その形態は問わない。 また、 変異?. ¥111 111& や、 遺伝子組換技術により人為的に改変した F. VIII/F. VIIIaに関しても、
F. VIII/F. VIIIaの補因子活性を有している限り、 F. VII I/F. Villaに含まれる。 本発明の補因子機能代替二種特異性抗体を得る方法は特に制限されず、 どのよ うな方法で取得されてもよい。 例えば、 酵素 A及び基質 Bに対する補因子機能代替 二種特異性抗体を得る場合、 酵素 A、 基質 Bそれぞれを免疫動物に免疫し、 抗酵素 A抗体及び抗基質 B抗体を取得する。 その後、 抗酵素 A抗体の H鎖と L鎖及び抗基質 B 抗体の H鎖と L鎖を含む二種特異性抗体を作製する。 ここで、 抗酵素 A抗体と抗基 質 B抗体はそれぞれ複数種得られていることが望ましく、 これらを用いてなるベ く多くの組合せの二種特異性抗体を作製することが好ましい。 二種特異性抗体を 作製後、 補因子機能代替活性を有する抗体を選択する。
酵素あるいは基質に対する抗体は、 当業者に公知の方法により得ることができ る。 例えば、 免疫動物に対して抗原を免疫することにより調製することができる。 動物を免疫する抗原としては、 免疫原性を有する完全抗原と、 免疫原性を有さな い不完全抗原 （ハプテンを含む） が挙げられる。 本発明においては、 本発明の補 因子機能代替抗体が補因子として作用すると考えられる酵素あるいは基質を、 上 記抗原 （免疫原） として使用する。 免疫する動物として、 例えば、 マウス、 ハム スター、 またはァカゲザル等を用いることができる。 これら動物に対して、 抗原 を免疫することは、 当業者においては、 周知の方法によって行うことができる。 本発明において好ましくは、 免疫された動物または該動物の細胞から抗体の L鎖 および H鎖の可変領域の回収を行う。 この操作は、 当業者においては一般的に公 知の技術を用いて行うことができる。 抗原によって免疫された動物は、 とりわけ 脾臓細胞において該抗原に対する抗体を発現する。 従って、 例えば、 免疫された 動物の脾臓細胞から mRNAを調製し、 該動物の可変領域に対応するプライマーを用 いて、 RT-PCRにより L鎖および H鎖の可変領域の回収を行うことができる。
詳細には、 動物に酵素、 基質それぞれを免疫する。 免疫原とする酵素、 基質は、 蛋白質全体、 もしくは該蛋白質の部分ペプチドであってもよい。 また、 動物を免 疫するのに用いる免疫原としては、 場合により抗原となるものを他の分子に結合 させ可溶性抗原とすることも可能であり、 また、 場合によりそれらの断片を用い てもよい。
この免疫された動物の脾細胞から mRNAを抽出し、 可変領域付近に対応するブラ イマ一を用いて RT- PCRにて L鎖、 H鎖可変領域の cDNAを回収する。 CDRに対応する プライマー、 CDRよりも多様性の低いフレームワークに対応するプライマー、 あ るいはシグナル配列と CH1もしくは L鎖定常領域 （ に対応するプライマーを用 いることができる。 また、 in vi troにおいてリンパ球を免疫することもできる。 これを用いて scFvもしくは Fabを提示するライブラリーを構築する。 パンニング によって抗原結合抗体クローンを濃縮 ·クローン化し、 その可変領域を用いて抗 体発現べクタ一を作製する。 抗酵素抗体発現べクタ一と抗基質抗体発現べク夕一 を同一の細胞に導入し、 抗体を発現させることにより二種特異性抗体を得ること ができる。 この際、 ヒトゃ免疫していない動物の末梢血単核球、 脾臓、 扁桃腺な どに由来する mRNAを材料とする同様のライブラリーを用いてスクリーニングを行 うことも可能である。
補因子機能代替活性を有する抗体の選択は、 例えば、 以下のような方法により 行うことができる。
( 1 ) 該酵素 ·該基質を含む反応系を用い、 該抗体を加えることによる該酵素活 性 （基質分解能） の上昇を指標とし、 選択する。
( 2 ) 該酵素 ·該基質 ·該補因子が関わる生体機能を測定するあるいは模倣する 系 （例えば、 血漿凝固測定系） を用い、 該補因子非存在条件下にて該抗体を加え ることによる機能回復活性を指標とし、 選択する。
得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 抗体の分離、 精製は通常 の蛋白質で使用されている分離、 精製方法を使用すればよい。 例えばァフイエテ ィ一クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、 フィル夕一、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選 択、 組合せれば、 抗体を分離、 精製することができる（Ant ibodies ： A
Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988) が、 これらに限定されるものではない。 ァフィ二ティーク口 マトグラフィ一に用いるカラムとしては、 プロテイン Aカラム、 プロテイン Gカラ ムなどが挙げられる。
本発明の二種特異性抗体は、 例えば代替する補因子が F. VI II/F. Villaである場 合、 すなわち酵素および基質の組合せが、 血液凝固線溶関連因子の F. IXa、 及び F. Xである場合には、 好ましくは、 抗 F. IXa抗体における可変領域と、 抗 F. X抗体 における可変領域とを含む構造を有する。
本発明の F. VIII/F. Vil la機能代替二種特異性抗体は以下の方法で作製した。 市販 の R IXa及び F. Xをそれぞれマウスの皮下に免疫した。 抗体価の上昇した免疫マウ スの脾臓から脾細胞を単離し、 マウスミエローマ細胞と融合し、 ハイプリドーマ を作製した。 抗原 （F. IXa、 F. X) に結合するハイプリドーマをそれぞれ選択し、 可変領域に対応するプライマーを用いて RT-PCRにて L鎖、 H鎖の可変領域を回収し た。 L鎖可変領域を CLを含む L鎖発現ベクターに、 H鎖可変領域を H鎖定常領域を含 む H鎖発現ベクターにそれぞれ組み込んだ。
抗 F. IXa抗体 （H鎖、 L鎖） の発現ベクターと F. X抗体 （H鎖、 L鎖） の発現べクタ 一を同一の細胞に導入し、 抗体を発現させることにより二種特異性抗体を得た。 得られた二種特異性抗体に関しては、 F. XI a (F. IX活性化酵素） 、 F. IX (F. X活 性化酵素） 、 F. L F.Xaの合成基質 (S-2222) 、 リン脂質から成る測定系で、 F.VIII/F. Villa (F. IXaによる F. X活性化の補因子） を代替する活性を評価した。 その結果を以つて、 F.VIII/F. Villa代替活性を有する二種特異性抗体を選択した。 上記で選択された二種特異性抗体に関しては、 F. VIII欠乏ヒ卜血漿を用いた凝 固測定系 （APTT) を用い、 凝固回復能を測定した。 その結果、 F. VIII欠乏ヒト血 漿に対し、 凝固回復能を有する二種特異性抗体を得たことを確認した。
本発明の抗体の H鎖 CDR3は、 特に制限されないが、 具体的には、 H鎖 CDR3の配列 が配列番号： 42、 46、 50、 54、 58、 62、 66、 70、 74、 78も しくは 82のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域、 またはこ れと機能的に同等の相補性決定領域を挙げることができる。
また、 本発明の上記抗体は、 例えば、 後述の実施例に記載の XB12または Π04の いずれかの H鎖 CDR3のアミノ酸配列からなる相補性決定領域、 またはこれと機能 的に同等の相補性決定領域を有し、 且つ、 H鎖 CDR3の配列が配列番号： 50、 5 4、 58、 62、 66、 70、 74、 78もしくは 82のいずれかに記載のアミ ノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を 有する。
さらに、 本発明の上記抗体は具体例としては、 H鎖 CDR配列が配列番号： 40〜 42、 44〜46、 48〜50、 52〜54、 56〜58、 60〜62、 64〜 66、 68〜70、 72〜74、 76〜 78もしくは 80〜 82のいずれかに記 載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域、 またはこれと機能的に同等の相補性 決定領域を有する抗体を挙げることができる。 また本発明の上記抗体の一例とし て、 H鎖配列が XB 12もしくは XT04のいずれかのァミノ酸配列からなる相補性決定 領域、 またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有し、 且つ、 H鎖 CDR配列が 配列番号： 48〜50、 52〜54、 56〜58、 60〜62、 64〜66、 6 8〜70、 72〜74、 76〜78もしくは 80〜82のいずれかのアミノ酸配 列からなる相補性決定領域、 またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有す る抗体を好適に示すことができる。
本発明で開示されている可変領域を用いて全長抗体を作製する場合、 定常領域 は特に限定されず、 当業者に公知の定常領域を用いることが可能であり、 例えば、 Se uences of prote ins of immunological interest, (1991) , U. S. Department of Heal th and Human Services. Publ ic Heal th Service Nat ional Ins t i tutes of Heal thや、 An ef f icient route to human bispec i f ic IgG, (1998) . Nature Biotechnology vol. 16, 677-681、 等に記載さ ている定常領域を用いることが できる。
本発明の抗体の一つの態様としてはリガンド機能代替作用を有することから、 本発明の抗体は、 該抗体が作用する受容体の活性 （機能） 低下に起因する疾病に 対して、 有効な薬剤となることが期待される。
本発明の抗体の代替するリガンド機能が IFN_ a / ^である場合には、 上記疾患 として、 例えば、 ウィルス感染に起因する疾患を挙げることができる。 これら疾 患は、 例えば、 ウィルス感染により宿主の免疫反応が活性化して炎症が慢性化す る疾患であり、 より具体的には、 慢性 C型肝炎を例示することができる。
慢性 C型肝炎は C型肝炎ウイルス感染を原因とする慢性炎症疾患であり、 ウイ ルス感染細胞に対する宿主の免疫反応が肝臓における炎症を引き起こす。 症状の 進行に伴い、 徐々に肝機能は低下し、 肝硬変を経て、 末期には肝臓癌に至る。 慢性 C型肝炎患者においては、 C型肝炎ウィルスを排除するため、 インターフ ェロン- o; / j3による治療が行われているが、 血中半減期が短いことから連日投与 が必要なため、 患者の負担は相当に重い。 従って、 インタ一フエロン- の作 用を有し、 持続性に優れた薬剤が求められていた。
また、 ウィルス感染に起因する別の疾患として、 慢性骨髄性白血病が挙げられ る。
また、 本発明における抗体の別の態様としては、 補因子の機能を代替する作用 を有することから、 本発明の抗体は、 該補因子の活性 （機能） 低下に起因する疾 病に対して、 有効な薬剤となることが期待される。 本発明の抗体の代替する補因 子が血液凝固線溶関連因子である場合には、 上記疾病として、 例えば、 出血、 出 血を伴う疾患、 もしくは出血に起因する疾患等を挙げることができる。 特に、 F. VI II/F. Vi lla, F. IX/F. IXa、 F. XI/F. XIaの機能低下や欠損は、 血友病と呼ばれる 出血異常症を引き起こすことで知られる。
血友病のうち、 先天性な F. VI I I/F. VII I a機能低下または欠損による出血異常症 は、 血友病 Aと呼ばれる。 血友病 A患者が出血した場合、 F. VI I I製剤の補充療法が 行われる。 また、 激しい運動や遠足の当日、 頻回に関節内出血を来たす場合、 あ るいは重症血友病に分類される場合には、 F. VI II製剤の予防投与が行われること がある （非特許文献 2および 3参照） 。 この F. VI I I製剤の予防投与は、 血友病 A 患者の出血エピソードを激減させるため、 近年、 大きく普及しつつある。 出血ェ ピソードを減らすことは、 致死性及び非致死性の出血の危険及びそれに伴う苦痛 を低下させるだけでなく、 頻回の関節内出血に起因する血友病性関節障害を未然 に防ぐ。 その結果、 血友病 A患者の Q0L向上に大きく寄与する。
F. VH I製剤の血中半減期は短く、 約 12 〜 16時間程度である。 それ故、 継続的 な予防のためには、 F. VIII製剤を週に 3回程度投与する必要がある。 これは、 F. VI II活性として、 概ね 1%以上を維持することに相当する （非特許文献 4および 5参照） 。 また、 出血時の補充療法においても、 出血が軽度な場合を除き、 再出 血を防ぎ、 完全な止血を行うため、 一定期間、 F. VIII製剤を定期的に追加投与す る必要がある。
また、 F. VI I I製剤は、 静脈内に投与される。 静脈内投与実施には、 技 fl的な困 難さが存在する。 特に年少の患者に対する投与においては、 投与に用いられる静 脈が細い故、 困難さが一層増す。
前述の、 F. VII I製剤の予防投与や、 出血の際の緊急投与においては、 多くの場 合、 家庭療法 · 自己注射が用いられる。 頻回投与の必要性と、 投与の際の技術的 困難さは、 投与に際し患者に苦痛を与えるだけでなく、 家庭療法 ·自己注射の普 及を妨げる要因となっている。
従って、 現存の血液凝固第 VIII因子製剤に比し、 投与間隔が広い薬剤、 あるい は投与が簡単な薬剤が、 強く求められていた。
さらに、 血友病 A患者、 特に重症血友病 A患者には、 インヒピタ一と呼ばれる F. VIIIに対する抗体が発生する場合がある。 インヒビターが発生すると、 F. VIII 製剤の効果がインヒビターにより妨げられる。 その結果、 患者に対する止血管理 が非常に困難になる。
このような血友病 Aインヒビター患者が出血を来たした場合は、 通常、 大量の F. VIII製剤を用いる中和療法か、 複合体製剤 (complex concentrate) あるいは F. Vila製剤を用いるバイパス療法が、 実施される。 しかしながら、 中和療法では、 大量の F. VIII製剤の投与が、 逆に、 インヒビ夕一 （抗 F. VIII抗体） 力価を上げて しまう場合がある。 また、 バイパス療法では、 複合体製剤や F. Vila製剤の短血中 半減期 （約 2〜 8時間） が問題となっている。 その上、 それらの作用機序が、 F. VIII/F. Villaの機能、 すなわち F. IXaによる F. X活性化を触媒する機能に非依存 であるため、 場合によっては、 止血機構をうまく機能させられず、 不応答になつ てしまうケースがある。 そのため、 血友病 Aインヒビター患者では、 非インヒビ ター血友病 A患者の出血に比し、 十分な止血効果を得られない場^ &が多いのであ る。
従って、 インヒビターの存在に左右されず、 且つ F. Vi n/F. VIIIaの機能を代替 する薬剤が、 強く求められていた。
ところで、 F. VIII/F. Villaに関係する出血異常症として、 血友病、 抗 F. VIII自 己抗体を有する後天性血友病のほかに、 vWFの機能異常または欠損に起因するフ オンビルブランド病が知られている。 vWFは、 血小板が、 血管壁の損傷部位の内 皮下組織に正常に粘着するのに必要であるだけでなく、 F. VIIIと複合体を形成し、 血漿中 F. VIIIレベルを正常に保つのにも必要である。 フォンビルブランド病患者 では、 これらの機能が低下し、 止血機能異常を来たしている。
さて、 （i)投与間隔が広く、 （i i)投与が簡単であり、 （i i i)インヒビターの存在に 左右されず、 （iv) F. VI I I/F. Vi lla非依存的にその機能を代替する医薬品の創製 には、 抗体を利用する方法が考えられる。 抗体の血中半減期は、 一般に、 比較的 長く、 数日から数週間である。 また、 抗体は、 一般に、 皮下投与後に血中に移行 することが知られている。 すなわち、 抗体医薬品は、 上記の（i)、 （i i)を満たし ている。
本発明における機能蛋白質の他の態様として、 2種の異なる生理作用を有する蛋 白に結合して、 異なる複数の生理作用を制御する蛋白が挙げられる。 その好適な 例としては、 補体第四成分 C4bおよび protein S (PS) に結合する C4b binding protein (C4bp) が挙げられる。 C4toは、 C4b - C2b複合体から C2bを解離させると 共に、 PSの aPC cof actor活性を消失させる作用を有する。 従って C4bpは補体系と 血液凝固系に対して制御作用を示す。 C4bおよび PSに対する二種特異性抗体は、 C4bpの作用を代替する作用を有すると考えられる。 また、 C4bpは I因子による C4b の分解に対する補因子としての作用も有する。 従って、 I因子および C4bに対する 二種特異性抗体も、 C4bpの作用を代替する作用を有すると考えられる。 本発明では、 本発明の抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。 例えば、 本発明の抗体がサイトカイン受容体に対して IFNの機能代替活性を有す る抗体である場合には、 該抗体はサイト力イン様作用を有するものと考えられる。 従って該抗体は抗ウィルス作用、 抗腫瘍作用、 細胞増殖 ·分化調節作用を有する 医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤となることが期待される。 一方で、 IL-2の機 能を代替する抗体は T細胞や NK細胞の分化 ·活性化による免疫賦活 ·抗腫瘍作用 を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 IL- 3の機能を代替する抗体は造血 前駆細胞を増殖することによる血球回復促進作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 IL- 4の機能を代替する抗体は Th2 (体液性免疫） への誘導による 抗アレルギー作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 IL- 5の機能を代 替する抗体は B細胞 ·好酸球の増殖 ·分化誘導による免疫賦活 ·抗腫瘍作用を有 する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 IL- 6の機能を代替する抗体は血小板産 生刺激作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 IL- 7の機能を代替する 抗体は T細胞 · B細胞の増殖による免疫賦活 ·抗腫瘍作用を有する医薬品 （医薬組 成物） もしくは薬剤、 IL- 9の機能を代替する抗体は肥満細胞の増殖 ·造血による 血球回復促進作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 IL- 10の機能を 代替する抗体は免疫抑制作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 IL- 11の機能を代替する抗体は血小板産生刺激作用を有する医薬品 （医薬組成物） も しくは薬剤、 IL- 12の機能を代替する抗体は Thl (細胞性免疫） への誘導による免 疫賦活 ·抗腫瘍作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 IL-15の機能 を代替する抗体は NK細胞の活性化による免疫賦活 ·抗腫瘍作用を有する医薬品 (医薬組成物） もしくは薬剤、 GM-CSFの機能を代替する抗体は化学療法や骨髄移 植後の白血球回復促進作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 CNTFの 機能を代替する抗体は抗肥満作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 LIFの機能を代替する抗体は血小板産生刺激 ·血中コレステロール低下作用を有 する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 Oncostat in Mの機能を代替する抗体は 造血促進作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 CT- 1の機能を代替す る抗体は心筋保護作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤となることが 期待される。
また、 本発明の抗体が F. IXもしくは F. IXa、 および F. Xの両方を認識する抗体の うち、 F. Villaの機能を代替する抗体である場合には、 該抗体は、 出血、 出血を 伴う疾患、 もしくは出血に起因する疾患の予防もしくは治療のための医薬品 （医 薬組成物） もしくは薬剤となることが期待される。
一方で、 ZPIと F. Xに結合して PZの機能を代替する抗体は抗血栓作用を有する医 薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 トロンビンと TAFIに結合して TMの機能を代替 する抗体は止血促進作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤、 トロンビ ンと PCに結合して PS/TMシステムの機能を代替する作用を有する医薬品 （医薬組 成物） もしくは薬剤となることが期待される。
また、 補体 C4の欠損は全身性ェリテマト一デス（SLE)を引き起こすことから、 C4bの作用を代替する抗体は SLE発症抑制作用を有する医薬品 （医薬組成物） もし くは薬剤となることが期待される。 H因子の欠損は易化膿性感染症、 自己免疫性 の糸球体腎炎を引き起こすことから、 H因子の作用を代替する抗体はこれら疾患 の発症抑制作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤となることが期待さ れる。
C4bpの欠損はベーチェット病を引き起こすことから、 C4bpの作用を代替する抗 体はベーチェット病発症抑制作用を有する医薬品 （医薬組成物） もしくは薬剤と なることが期待される。
治療または予防目的で使用される本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成 物は、 必要に応じて、' それらに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体、 媒体等と混和して製剤化することができる。 例えば、 滅菌水や生理食塩水、 安定 剤、 賦形剤、 酸化防止剤（ァスコルビン酸等)、 緩衝剤（リン酸、 クェン酸、 他の 有機酸等）、 防腐剤、 界面活性剤 (PEG、 Tween等)、 キレート剤 (EDTA等)、 結合剤 等を挙げることができる。 また、 その他の低分子量のポリペプチド、 血清アルブ ミン、 ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、 グリシン、 グルタミン、 ァスパラ ギン、 アルギニン及びリシン等のアミノ酸、 多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、 マンニ] ^一ルゃソルビ] ル等の糖アルコールを含んでいてもよい。 注射用の水 溶液とする場合には、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張 —一液、 例えば、 D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナトリウム が挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール (エタノール等)、 ポリアルコ —ル（プロピレングリコ一ル、 PEG等）、 非イオン性界面活性剤（ポリソルベート 80、 HCO-50)等と併用してもよい。 また、 必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセル口 —ス、 ゼラチン、 ポリ [メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入した り、 コロイドドラッグデリバリーシステム（リボソーム、 アルブミンミクロスフ エア、 マイクロエマルジヨン、 ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもでき ¾ (" Remington' s Pharmaceut ical Science 16th edi t ion" , Oslo Ed. (1980)等 参照）。 さらに、 薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、 本発明の抗体に 適用し得る（Langer et al. , J. Biomed. Mater. Res. 15 : 167-277 (1981)； Langer, chem. Tech. 12 : 98-105 (1982)；米国特許第 3， 773, 919号;欧州特許出願公開 (EP) 第 58, 481号； Sidman et al. , Biopolymers 22 : 547-556 (1983) ;ΕΡ第 133, 988号）。 本発明の医薬組成物の投与量は、 剤型の種類、 投与方法、 患者の年齢や体重、 患者の症状、 疾患の種類や進行の程度等を考慮して、 最終的には医師の判断によ り適宜決定されるものであるが、 一般に大人では、 1日当たり、 0. l〜2000ingを 1 〜数回に分けて経口投与することができる。 より好ましくは l〜1000mg/日、 更 により好ましくは 50~500mgZ日、 最も好ましくは 100〜300mg/日である。 これ らの投与量は患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当業者であれ ば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 投与期間も、 患者の治癒経過 等に応じて適宜決定することが好ましい。
また、 本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、 遺 伝子治療を行うことも考えられる。 投与方法としては、 nakedプラスミドによる 直接投与の他、 リボソーム等にパッケージングするか、 レトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 ワクシニアウィルスベクター、 ボックスウィルスべク ター、 アデノウイルス関連ベクター、 HVJベクタ一等の各種ウイするベクターと して形成するか (Adolpli 『ウィルスゲノム法』， CRC Press, Florid (1996)参照）、 または、 コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆 (W093/17706等）して投与すること ができる。 しかしながら、 生体内において抗体が発現され、 その作用を発揮でき る限りいかなる方法により投与してもよい。 好ましくは、 適当な非経口経路 (静 脈内、 腹腔内、 皮下、 皮内、 脂肪組織内、 乳腺組織内、 吸入または筋肉内の経路 を介して注射、 注入、 またはガス誘導性粒子衝撃法 (電子銃等による）、 点鼻薬等 粘膜経路を介する方法等）により十分な量が投与される。 ex vivoにおいてリポソ ーム卜ランスフエクシヨン、 粒子衝撃法 (米国特許第 4, 945， 050号）、 またはウイ ルス感染を利用して血液細胞及び骨髄由来細胞等に投与して、 該細胞を動物に再 導入することにより本発明の抗体をコードする遺伝子を投与してもよい。
また本発明は、 本発明の抗体もしくは組成物を投与する工程を含む、 出血、 出 血を伴う疾患、 または出血に起因する疾患の予防および/または治療するための 方法を提供する。 抗体もしくは組成物の投与は、 例えば、 前記の方法により実施 することができる。
また本発明は、 本発明の抗体の、 本発明の （医薬） 組成物の製造のための使用 に関する。
さらに本発明は、 少なくとも本発明の抗体もしくは組成物を含む、 上記方法に 用いるためのキットを提供する。 該キットには、 その他、 注射筒、 注射針、 薬学 的に許容される媒体、 アルコール綿布、 絆創膏、 または使用方法を記載した指示 書等をパッケージしておくこともできる。 図面の簡単な説明
図 1は PCDNA4- g4Hの挿入領域を表した図である。
図 2は PCDNA4- g4Lおよび pIND- g4Lの挿入領域を表した図である。
図 3は pIND-g4Hの挿入領域を表した図である。
図 4は抗 F. IXa抗体 XB12と抗 F. X抗体 SB04、 SB2K SB42、 SB38、 SB30、 SB07、 SB05、 SB06、 SB34により作製した抗 F. IXa/抗 F. X二種特異性抗体を用い、 F. Villa様活性を測定した結果を示している。 抗体溶液の濃度は 10 g/niL (最終濃 度 l g/mL)である。 結果 9種の二種特異性抗体で F. Vil la様活性の上昇を示し、 XB12/SB04, XB12/SB2L XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06, XB12/SB34の順に活性が強かった。
図 5は抗 R IXa抗体 XT04と抗 F. X抗体 SB04、 SB2L SB42、 SB38, SB30, SB07、 SB05、 SB06、 SB34により作製した抗 F. IXa/抗 F. X二種特異性抗体または Π04抗体 を用い、 F. Villa様活性を測定した結果を示している。 抗体溶液の濃度は lO^ g/mL (最終濃度 1 x g/mL)である。 結果、 XT04/SB04、 XT04/SB2L XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30 XT04/SB07, XT04/SB05, 藤細 6、 XT04/SB34は
F. Villa様活性の上昇を示した。
図 6は、 図 4の中で最も活性の高かった XB12/SB04について F. Villa様活性の濃 度依存性を測定した結果を示している。 結果 XB12/SB04は濃度依存的に FVIIIa様 活性の上昇を示した。
図 7は XB12/SB04、 XB12/SB2K XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06、 XB12/SB34を用い、 血漿凝固アツセィを測定した結果を 示している。 抗体溶液の濃度は XB12/SB06に関しては 3. 4/ig/fflL、 それ以外は 20 g/uiLである。 結果、 XB12/SB04 XB12/SB2K 12細 2、 12/SB38、
XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06, XB12/SB34は抗体非存在下と比 較して、 凝固時間 (APTT)の短縮効果を示した。
図 8は讓 /SB04、 XT04/SB2U XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30 XT04/SB07、 XT04/SB05, XT04/SB06, XT04/SB34を用い、 血漿凝固アツセィを測定した結果を 示している。 抗体溶液の濃度は XT04/SB06に関しては 10 / g/mL、 それ以外は 20 g/mLである。 結果、 XT04/SB04、 XT04/SB2K XT04/SB42, XT04/SB38,
XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06は抗体非存在下と比較して、 凝固 時間 (APTT)の短縮効果を示した。 XT04/SB34は凝固時間 (ΑΠΤ)の短縮は認められ なかった。
図 9は図 7、 図 8の中で最も凝固時間 (APTT)の短縮効果の高かった XB12/SB04 につレ ^て濃度依存性を測定した結果が示されている。 結果 XB 12/SB04は濃度依存 的に凝固時間 (APTT)の短縮効果を示した。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
〔実施例 1〕 抗原および免疫
ヒト AR1鎖及び AR2鎖それぞれの細胞外領域の C末端に FLAG (AR1FLAG、
AR2FLAG) もしくは His6 (ARlHis、 AR2His) のタグを付加した可溶型受容体の発 現ベクターを CH0細胞に導入し、 その培養上清からァフィ二ティーカラムを用い て精製した。 マウスプロ B細胞株 Ba/F3にヒト AR1鎖の細胞外領域と G- CSF受容体細 胞内領域とのキメラ分子の発現ベクターを導入し、 高発現細胞を樹立した。 同様 にヒト AR2鎖の細胞外領域と G-CSF受容体細胞内領域とのキメラ分子の高発現細胞 を樹立した。 それぞれの細胞を BALB/cの腹腔に免疫した。 脾臓を摘出する 3日前 に ARlHisもしくは AR2Hisを静注した。
〔実施例 2〕 SCFY提示ライブラリ—からの抗体分離
( a ) ファージライブラリーのパンニング
免疫マウスの脾臓より polyA (+) NAを抽出し、 RT - PCRにて scFvを合成し、 scFv が Πファージの gene3との融合蛋白として発現するファージミドライブラリーを 構築した（J. Immun. Methods, 201, (1997) , 35-55)。 ライブラリ一の大腸菌 （2 X 109cfu) を 50 mL 2xYTAG (lOO i g/mLアンピシリン、 2%グルコースを含む 2xT Υ) に植菌し、 0D 600 0. 4〜0. 5まで 37°Cにて培養した。 4 x 1011のヘルパーファ ージ VCSM13を加え 37 、 15分間静置して感染させた。 ここに 450 mL 2xYTAG、 25 β ί lmol/L IPTGを添加し、 26 10時間培養した。 遠心分離にて培養上清を回収 し、 lOOmL PEG-NaCl (10%ポリエチレングリコール 8000, 2. 5 mol/L NaCl) を混 合後、 4 、 60分間静置した。 10, 800 x g、 30分間遠心にてファージを沈殿させ、 沈殿物を 40 mLの水に懸濁し、 8 mL PEG- NaClを混合後、 4°C、 20分間静置した。 1 0, 800 g、 30分間遠心にてファ ジを沈殿させ 5 mL PBSに懸濁した。 実施例 1 で調製した AR1FLAGと AR2FLAGは No- Weigh Premeasured NHS-PE04- Biot in Microti! bes (Pierce) を用いてビォチン標識した。 ファージライブラリーに 100 pmolの ピオチン標識 AR1FLAGもしくは AR2FLAGを加え、 60分間抗原と接触させた。 5% M - P BS (5%スキムミルクを含む PBS) で洗浄した Streptavidin MagneSphere (Promeg a) 600 Lを加え、 15分間結合させた。 ビーズを 1 mLの PBST (0. 1% Tween- 20を含 む PBS) と PBSにて 3回ずつ洗浄した。 0. 8 mLの 0. 1 mol/L グリシン/ HC1 (pH2. 2) 中にビーズを 5分間懸濁し、 ファージを溶出した。 回収したファージ溶液に 45 n l 2 mol/L Trisを添加して中和し、 対数増殖期 （0D 600 = 0. 4〜0. 5) XLl-Blu e 10 mLに添加、 37°C、 30分間静置することで感染させた。 これを 2xYTAGプレー トに広げ、 30°Cで培養した。 コロニーを回収し、 2xYTAGに植菌、 0D 600 0· 4〜0. 5まで 37°Cにて培養した。 培養液 10 mLに 5 L lmol/L IPTG、 10" pfuヘルパーフ ァージ （VCSM13) を添加し 37°C 30分間静置した。 遠心集菌後、 25 ^ g/mLカナマ イシンを含む 2xYTAG 100mLに再懸濁し、 30 、 10時間培養した。 遠心分離にて培 養上清を回収し、 20 mL PEG- NaClを混合後、 4 、 20分間静置した。 10, 800 x g、 30分間遠心にてファージを沈殿させ、 2 mL PBSに懸濁したものを次のパンニング に供した。 2回目のパンニングではビーズを PBSTと PBSにて 5回ずつ洗浄した。 溶 出したファージを感染させ得られた大腸菌から AR鎖結合ファージを産生するクロ ーンを ELISAにて選択した。
( b ) ファージ ELISA
上記のシングルコロニ一を 150 iL 2xYTAGに植菌し、 30°Cで一晩培養した。 こ の 5 Lを 500 L 2xYTAGに植菌、 37°C、 2時間培養後、 ヘルパーファージ 2. 5 10 ¾iuと 0. 3 L lmol/L IPTGを含む 2xYTAGを I OO L添加し 37 にて 30分間静置した。 続いて 3(TCにてー晚培養し、 遠心上清を ELISAに供した。 StreptaWel l 96マイク 口夕イタ一プレート （Roche) を 1.0 xg/mLピオチン標識 AR1FLAGもしくは AR2FLAG を含む PBS 100 zLにて一晩コートした。 PBSTにて洗浄し抗原を除いた後、 2 w/v % M-PBS 200 Lで一晩ブロッキングした。 2% (w/v) M- PBSを除き、 ここに培養上 清を加え 40分間静置し抗体を結合させた。 洗浄後、 結合ファージは 2 w/v % M-PB Sにて希釈した HRP結合抗 M13抗体 （Amersham Pharmacia Biotech) と腿 blue POD 基質 （Roche) で検出し、 硫酸の添加により反応を停止した後、 A450の値を測定 した。
(c) 配列決定とクローン選択
ELISAにて陽性であったクローンのファージ液からプライマー PBG3-F1 (5'- CA GCTATGAAATACCTATTGCC - 3'Z配列番号： 27) と PBG3 - R1 (5'- CTTTTCATAATCAAA ATCACCGG - 3' /配列番号： 28) を用いて PCRにて scFv領域を増幅し、 その塩基 配列決定した。 ファージ液 1 L、 10 X KOD Dash緩衝液 2 xL、 10 xmol/Lプライマ 一を 0.5 Lづっ、 KOD Dashポリメラーゼ （東洋紡績、 2.5
Figure imgf000041_0001
0.3 Lを含む P CR反応液 を、 Perkin Elmer9700で 96°C、 10秒、 55 、 10秒、 72°C、 30秒、 3 0サイクルの増幅を行なった。 PCR後、 5 Lの反応液に ExoSAP-IT (アマシャム） を 3/ L添加し、 37° (：、 20分間、 引き続き 80°C、 15分間保温した。 このサンプルに ついて PBG3 - F2 (5' - ATTGCCTACGGCAGCCGCT -3' Z配列番号 : 2 9) あるいは PBG 3-R2 (5'- AAATCACCGGAACCAGAGCC - 3'/配列番号： 30) をプライマーとして Bi gDye Terminator Cycle Seauencing kit (Applied Biosystems) 【こて反応を行レ Applied Biosystems PRISM 3700 DNA Sequencerで泳動した。 塩基配列から推定 されるアミノ酸配列の CDR3の異なるクローンを抗 AR1鎖及び抗 AR2鎖についてそれ ぞれ 45クローンずつ選択した。 〔実施例 3〕 二種特異性抗体の発現
scFv-CHl-Fcとして発現させるために CAGGプロモーターで駆動されるヒトシグ ナル配列とイントロン - C - Fc (ヒト IgG4 cDNA) の間に Si i lサイトを介して scFv を挿入できる発現ベクター pCAGGss-g4CHヘテロ IgG4を構築した。 ヘテロ分子とし て発現させるために IgGlの knobs-into- holes (Prote in Engineer ing vol. 9, 61 7-621, 1996) を参考に IgG4の CH3部分へのアミノ酸置換体を作成した。 Aタイプ は Y349C、 T366Wの置換体である。 Bタイプは E356C、 T366S, L368A, Y407Vの置換 体である。 両者のヒンジ部分にも置換 （- ppcpScp-→- ppcpPcp- ) を導入した。 また Aタイプにはヒト IL- 3のシグナル配列を、 Bタイプにはヒト IL-6のシグナル配 列を用いて構築した （pCAGG-IL3ss- g4CHPa, pCAGG-IL6ss-g4CHPb) 。 塩基配列よ り選択したクロ一ンの s cFv領域の PCR産物を S ί i I処理し、 抗 AR 1鎖クローンは pCAG G- IL3ss- g4CHPaに、 抗 AR2鎖クローンは pCAGG_IL3ss- g4CHPbにサブクローニング した。 抗 AR1鎖及び抗 AR2鎖クローン 45 x 45の合計 2025種類の全組合せについて 発現ベクターを HEK293細胞にリボフェクトァミン 2000を用いてトランスフエクシ ヨンし、 3日後の培養上清を回収した。 〔実施例 4〕 リガンド機能代替二種特異性抗体の分離
( a ) Ba/F3増殖アツセィ
BaF3- ARGはマウス IL- 3依存性増殖細胞 Ba/F3に AR1鎖及び AR2鎖の細胞外領域と G - CSF受容体の細胞内領域とのキメラ分子の発現ベクターを導入して樹立した。 B aF3- ARGは IFN aに依存して増殖した。 3度洗浄したゥエル当り lxlO3個の細胞およ びサンプルを含む 0. lmLの培地で 96ゥエルプレートに播種した。 4日間培養後 10 /2 Lの生細胞数測定試薬 SF (nacal ai tesaue) を添加し、 2時間 37で保温した後 A450 を測定した。
( b ) Daudi細胞増殖抑制アツセィ
Daudi細胞は IFNに対して高感受性を示すヒト B細胞株である。 サンプルを含む 0. lmLの培地でゥエル当り 6. 25xl03個の細胞を 96ゥエルプレートに播種した。 4日 間培養後 10/zLの生細胞数測定試薬 SF (nacalai tesaue) を添加し、 2時間 37で保 温した後、 A450を測定した。
(c) リガンド機能代替二種特異性抗体の配列
上記スクリーニングにて選択された抗体の可変領域のアミノ酸配列を、 配列番 号： 1〜26に示す。 各抗体の名称および配列番号との関係は、 上記表 1に示す。
〔実施例 5〕 Factor IXa (F. IXa) に対する非中和抗体の作製
5-1. 免疫およびハイプリドーマ作製
BALB/cマウス （雄、 免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一） 8匹および MRL/lprマウス （雄、 免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一） 5匹に、 Factor IXajS (Enzyme Research Laboratories, Inc.). を以下の通り免疫した。 初回免 疫として FCA (フロイント完全アジュバント H37 Ra (Difco laboratories) ) で ェマルジヨン化した Factor IXa/3を 40 zg/head皮下投与した。 2週間後に FIA (フ ロイント不完全アジュバント （Difco laboratories) ) でェマルジヨン化した Factor IXa3を 40 g/tiead皮下投与した。 以後 1週間間隔で追加免疫を 3〜7回行 つた。 Factor IXaj3に対する血清抗体価の上昇を 5- 2に示した ELISA (Enzyme linked innnunosorbent assay) で確認後、 最終免疫として PBS (-) (カルシウムィ オン、 マグネシウムイオンを含まない phosphate buffered saline)に希釈した Factor IXa]3を ^^ g/head静脈内投与した。 最終免疫の 3日後、 マウスの脾臓細 胞とマウスミエローマ細胞 P3X63Ag8U.1 (P3U1と称す、 ATCC CRL-1597) を、 PEG1500 (ロシュ ·ダイァグノスティックス） を用いた常法に従い細胞融合した。 10%FBS(Invitrogen)を含む RPMI1640培地 （Invitrogen) (以下、 10%FBS/RPMI1640 と称す）に懸濁した融合細胞を 96 well culture plateに播種し、 融合 1, 2, 3, 5 日後に HAT選択培地 (10%FBS/RPMI1640 I 2%HAT 50x concentrate (大日本製薬) I 5% BM-Condimed HI (ロシュ■ダイァグノスティックス） ） への置換を行うこ とにより、 ハイプリドーマの選択培養を行った。 融合後 8日目または 9日目に採取 した培養上清を用いて、 5」2に示した ELISAにより Factor IXaに対する結合活性 を測定することにより、 Factor IXa結合活性を有するハイプリドーマを選択した。 続いて 5-3に示した方法で Factor IXaの酵素活性に対する中和活性を測定し、 Factor IXaに対する中和活性を有さないハイプリドーマを選択した。 ハイプリド 一マは、 96 well culture plateに 1 wellあたり 1個の細胞を播種することによる 限界希釈を 2回行ってクローン化した。 顕微鏡観察により単一コロニーであるこ とが確認された細胞について、 5-2、 5- 3に示した ELISAおよび中和活性測定 を行い、 クローンを選択した。 5- 4に示した方法により、 クローン化した抗体 の腹水を作製し、 腹水から抗体を精製した。 精製抗体が、 APTT (活性化部分トロ ンポプラスチン時間） を延長させないことを、 5- 5に示した方法で確認した。
5-2. Factor IXa ELISA
Coating buffer (lOOmM sodium bicarbonate, pH 9.6, 0.02¾ sodium azide) で11 /11^に希釈した？&(^(^ IXa/3を、 Nunc- 1匪 uno plate (Nunc- 1画 unoTM 96 MicroWellTM plates MaxiSorpTM (Nalge Nunc International) ) に 100 L/well で分注後、 4°Cでー晚インキュベーションした。 Tween(R) 20を含む PBS (-)で 3回 洗浄後、 diluent buffer (50 Tris-HCl, ρΗ8.1, 1% bovine serum albumin, MgC12, 0.15M NaCl, 0.05% Tween ( ) 20, 0.02% sodium azide)で plateを室 温で 2時間 blockingした。 Bufferを除去後、 plateに diluent bufferで希釈したマ ウスの抗血清またはハイプリドーマの培養上清を 100 L/well添加し、 室温で 1時 間インキュベーションした。 Plateを 3回洗浄後、 diluent bufferで 1/2000希釈し たアルカリホスファターゼャギ抗マウス IgG (H+L) (Zymed Laboratories) を 100/zL/well添加し、 室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 6回洗浄後、 発色基質 Blue- PhosTM Phosphate Substrate (Kirkegaad & Perry
Laboratories) を 100 xL/well添加し、 室温で 20分インキュベーションした。 Blue-PhosTM Stop Solution (Kirkegaad & Perry Laboratories) を lOO L/well 添加した後、 595nmにおける吸光度を Microplate Reader Model 3550 (Bio- ad Laboratories) で測定した。 5-3. Factor IXa中和活性測定
Phospholipid (Sigma- Aldrich) を注射用蒸留水で溶解し、 超音波処理を施す ことにより、 400 xg/mLの phospholipid溶液を調製した。 0.1%ゥシ血清アルブミ ンを含むトリス緩衝生理食塩液 （以下、 TBSB) 40 Lと 30ng/mL Factor IXa )3 (Enzyme Research Laboratories) IO Lと 400 g/mL phospholipid溶液 5 /iLと 100 mM CaC12、 20 mM MgC12を含む TBSB 5 Lとハイプリドーマ培養上清 10 Lを 96穴プレート中で混和し、 室温で 1時間インキュベーションした。 この混合溶液 に、 50 g/mL Factor X (Enzyme Research Laboratories) 20 Lおよび 3U/mL Factor Villa (Amrican diagnostica) IO Lを加え、 室温で 30分間反応させた。 これに 10 zLの 0.5M EDTAを添加することにより反応を停止させた。 この反応溶液 に、 の S- 2222溶液 （Chromogenix) を添加し、 室温で 30分間インキュベーシ ヨンした後、 測定波長 405nm、 対照波長 655nmにおける吸光度を Microplate Reader Model 3550 (Bio-Rad Laboratories, Inc. ) により測定した。
5-4. 腹水の作製および抗体の精製
樹立したハイプリドーマの腹水作製は常法に従って行った。 すなわち、 in vitroで培養したハイプリドーマ 2 X 106個を、 あらかじめプリスタン
(2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane; 和光純薬工業） を 2回腹腔内に投与して おいた BALB/cマウス （雄、 実験開始時 5〜7週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一) また は BALB/cヌードマウス （雌、 実験開始時 5〜6週齢、 日本チヤ一ルス · リバ一およ び日本クレア） の腹腔内に移植した。 移植後 1〜4週目で腹部が肥大したマウスか ら腹水を回収した。 腹水からの抗体精製は Protein G SepharoseTM 4 Fast Flow (Amersham
Biosciences) カラムを用いて行った。 Binding Buffer (20 mM sodium acetate, pH5. 0) にて 2倍希釈した腹水をカラムにアプライし、 10カラム容量の Binding Bufferで洗浄した。 5カラム容量の Elut ion Buffer (0. 1 M glycine-HCl, pH2. 5) にて抗体を溶出し、 Neutral izing Buffer (1 M Tris-HCL pH9. 0) で中 和した。 これを Centriprep 10 (Mi l l ipore) にて濃縮し、 TBS (50mM Tris- buf fered Sal ine) に溶媒を置換した。 抗体濃度は、 280nmの吸光度から、 A = 5として算出した。 吸光度の測定は、 DU- 650 (Beckman Coul ter) にて測定し た。
5 - 5 . APTT (活性化部分トロンポプラスチン時間） の測定
APTTは CR- A (Amelung) を接続した KC10A (Amelung) により測定した。 TBSBで 希釈した抗体溶液 50 し 標準ヒト血漿 （Dade Behring) 及び APTT試薬 (Dade Behring) 50 Lの混合液を 37°Cで 3分間加温した。 20 mMの CaC12 (Dade Behring) 50 Lを同混合液に加えることにより凝固反応を開始させ、 凝固時間を 測定した。
〔実施例 6〕 Factor X (F. X) に対する非中和抗体の作製
6 - 1 . 免疫およびハイプリドーマ作製
BALB/cマウス （雄、 免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス ·リバ一） 8匹および MRL/lprマウス （雄、 免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リパー） 5匹に、 Factor X (Enzyme Research Laboratories) を以下の通り免疫した。 初回免疫として FCA でェマルジヨン化した Factor Xを 40 x g/head皮下投与した。 2週間後に FIAでエマ ルジョン化した Factor Xを 20または 40 g/head皮下投与した。 以後 1週間間隔で 追加免疫を合計 3〜6回行った。 Factor Xに対する血清抗体価の上昇を 6 - 2に示 した ELISAで確認後、 最終免疫として PBS (-)に希釈した Factor Xを 20または 40 g/head静脈内投与した。 最終免疫の 3日後、 マウスの脾臓細胞とマウスミエ 口一マ細胞 P3U1を、 PEG1500を用いた常法に従い細胞融合した。 10%FBS/RPMI 1640 培地に懸濁した融合細胞を 96 wel l cul ture plateに播種し、 融合 1， 2, 3, 5日 後に HAT選択培地への置換を行うことにより、 ハイプリドーマの選択培養を行つ た。 融合後 8日目に採取した培養上清を用いて 6 - 2に示した ELISAにより Factor Xに対する結合活性を測定した。 Factor X結合活性を有するハイプリドーマを選 択し、 6 - 3に示した方法で Factor Xaの酵素活性に対する中和活性を測定した。 Factor Xaに対する中和活性を有さないハイプリドーマを、 限界希釈を 2回行うこ とによりクローン化した。 5 - 4に示した方法により、 クローン化した抗体の腹 水を作製し、 腹水から抗体を精製した。 精製抗体が、 APTTを延長させないことを、
5 - 5に示した方法で確認した。
6 - 2 . Factor X ELISA
Coat ing buf ferで 1 g/mLiこ希釈した Factor Xを、 Nunc— I匪 uno plateiこ
100 L/wel lで分注後、 4°Cでー晚インキュベーションした。 Tween (R) 20を含む PBS (-)で 3回洗浄後、 di luent buiierで plateを室温で 2時間 blockingした。
Buiierを除去後、 plateに di luent buiierで希釈したマウスの抗血清またはハイ プリドーマの培養上清を添加し、 室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 3回洗浄後、 di luent buf ferで 1/2000希釈したアルカリホスファタ一ゼャギ抗マ ウス IgG (H+L)を添加し、 室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 6回洗浄 後、 発色基質 Blue- PhosTM Phosphate Substrate (Kirkegaad & Perry
Laboratories) を lOO iL/wel 1添加し、 室温で 20分インキュベーションした。
Blue-PhosTM Stop Solut ion (Kirkegaad & Perry Laboratories) を 100 L/wel l 添加した後、 595nmにおける吸光度を Microplate Reader Model 3550 (Bio-Rad Laboratories) で測定した。 6- 3. Factor Xa中和活性測定
TBSBで 1/5希釈したハイプリドーマ培養上清 IO Lと 40 xLの 250 pg/niL Factor Xa (Enzyme Research Laboratories) を含む TBCP (2.78 mM CaC12、 22.2 iM'J > 脂質 （フォスファチジルコリン：フォスファチジルセリン =75 : 25、 Sigma- Aldrich) を含む TBSB) を混和し、 室温で 1時間インキュベーションした。 この混 合溶液に、 20 xg/mLプロトロンビン （Enzyme Research Laboratories) および 100 ng/mL活性化凝固第 V因子 (Factor Va (Haema to logic Technologies) ) を含 む TBCPを 50 L添加して室温で 10分間反応させた。 0.5 M EDTAを 10 zL添加するこ とにより反応を停止させた。 この反応溶液に、 1 mM S- 2238溶液 （Chromogenix) を 添加し、 室温で 30分間インキュベーションした後、 405 mnにおける吸光 度を Microplate Reader Model 3550 (Bio-Rad Laboratories) で測定した。
〔実施例 7〕 キメラ二種特異性抗体発現ベクターの構築
7- 1. ハイプリドーマからの抗体可変領域をコードする DNA断片の調製
抗 F. IXa抗体あるいは抗 F.X抗体を産生するハイプリドーマから、 QIAGEN(R) R easy(R) Mini Kit (QIAGEN) を用いて説明書記載の方法に従い全 RMを抽出し た。 全 RMを 40 Lの滅菌水に溶解した。 精製された RNAl〜2^gを鎢型に、 Superscript cDNA合成システム （Invitrogen) を用いて説明書記載の方法に従い RT - PCR法により一本鎖 cDNAを合成した。
7-2. 抗体 H鎖可変領域の PCRによる増幅と配列解析
マウス抗体 H鎖可変領域 （VH) cDNAの増幅用プライマーとして、 Krebberらの報 告 (J. Immunol. Methods 1997;201:35-55) に記載の HBプライマー混合物、 およ び HFプライマ一混合物を用意した。 各 0.5 Lの IOO M HB プライマー混合物およ び IOO M HFプライマー混合物を用いて、 反応液 25 L ( 7 - 1で調製した cDNA溶 液 2.5 1、 K0D plus buffer (東洋紡績) 、 0.2mM dNTPs, 1.5niM MgC12, 0.75 units DNA polymerase KOD plus (東洋紡績） ） を調製した。 PCRは、 サ一マルサ イクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer) を用いて、 cDNA断片の増幅 の効率性に応じて、 条件 A (98°Cで 3分間加熱後、 98°C 20秒、 58 20秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 32サイクル） ないし条件 B (94°Cで 3分間加 熱後、 20秒、 46°C 20秒、 68°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 5サイ クル、 さらに 94°C 20秒、 58°C 20秒、 1T 30秒からなる反応を 1サイクルとして 30サイクル） のいずれかの条件で行った。 PCR後、 反応液を 1% ァガローズゲル電 気泳動に供した。 目的のサイズ （約 400bp) の増幅断片を QIAduick Gel
Extraction Kit (QIAGEN) を用い、 添付説明書記載の方法で精製し、 滅菌水 30 】で溶出した。 各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye Terminator Cycle
Se uencing Kit (Applied Biosystems) を用い、 DNAシークェンサ一ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) にて、 添付説明書記載の方法に 従い決定した。 本方法により決定した配列群を解析ソフト GENETYX- SV/RC
Version 6.1 (Genetyx) にて比較解析し、 異なる配列を有するものを選択した。
7 - 3.クローニング用抗体可変領域 DNA断片の調製
クローニング用制限酵素 S I切断サイトを抗体可変領域増幅断片の両末端へ 付加するために、 以下の操作を行った。
Sii I切断部位付加 VH断片 （Sii I-VH) 増幅のために、 プライマ一 HBの
(Gly4Ser) 2- リンカ一配列を Sii I切断部位を有するに示す配列 （配列番号： 3
1) へ変更したもの （プライマー VH- 5' end) を用意した。 各 0.5 1の 10 M 配列特異的プライマー VH- 5' endおよび プライマー scior (J. Immunol.
Methods 1997; 201: 35-55) を用いて、 反応液 20 L ( 7 - 2で調製した精製 VH cDNA増幅断片溶液 1 1， KOD plus buffer (東洋紡績) 、 0.2mM dNTPs, 1.5ιηΜ MgC12, 0.5 units DNA polymerase KOD plus (東洋紡績) ) を調製した。 PCRは、 サーマルサイクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer) を用いて、 断片 の増幅の効率性に従い、 条件 A (98°Cで 3分間加熱後、 98°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 32サイクル） ないし条件 B (94°Cで 3分 間加熱後、 94°C 20秒、 46°C 20秒、 68°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 5 サイクル、 さらに 94°C 20秒、 58で 20秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクルと して 30サイクル） のいずれかの条件で行った。 PCR後、 反応液を 1 ァガローズゲ ル電気泳動に供した。 目的のサイズ （約 400bp) の増幅断片を QIAduick Gel Extraction Kit (QIAGEN) にて添付説明書記載の方法で精製し、 滅菌水 30 Lで 溶出した。
マウス抗体 L鎖可変領域 (VL) cDNA断片増幅のために、 まず Krebberらの報告 （J. Immunol. Methods 1997; 201: 35-55) 記載の各 0.5^Lの 100 M LBプライマー混 合物および 100 M LFプライマー混合物を用いて、 反応液 (7-1で調製 した c - DNA溶液 2. 励 plus buffer (東洋紡績) 、 0. M dNTPs, 1.5mM MgC12, 0.75 units DNA polymerase K0D plus (東洋紡績) ) を調製した。 PCRは、 サ一マルサイクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer) を用いて、 断片 の増幅の効率性に従い、 94 で 3分間加熱後、 94°C 20秒、 46°C 20秒、 68°C 30秒 からなる反応を 1サイクルとして 5サイクル、 さらに 94°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。 PCR後、 反応液 を 1% ァガローズゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ （約 400bp) の増幅断片を QIAQUcick Gel Extractio Kit (QIAGEN) にて添付説明書記載の方法で精製し、 滅菌水 30 ^Lで溶出した。 該断片はその C末端にプライマー LF由来の （Gly4Ser)3 - リンカ一配列が付加された状態にある。 該断片 C末端へ Sfi I切断部位を付加する 目的で、 プライマー LFの （Gly4Ser)3- リンカ一配列を Sii I切断部位を有するに 示す配列 （配列番号： 32) へ変更したもの （プライマー VL- 3' end) を用意し た。 Sfi I 切断部位付加 VL断片 (Sfi I- VL) 増幅のために、 各 0. の 10 M VL- 3， endプライマ一混合物および 10 zM scbackプライマーを用いて、 反応液 20 L (精製 VL cDNA増幅断片溶液 1 L， K0D plus buffer (東洋紡績) 、 0.2mM dNTPs, 1.5ni MgC12, 0.5 units DNA polymerase KOD plus (東洋紡績) ) を調 製した。 PCRは、 サ一マルサイクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer) を用いて、 94°Cで 3分間加熱後、 94°C 20秒、 46°C 20秒、 68で 30秒からなる反応 を 1サイクルとして 5サイクル、 さらに 94°C 20秒、 58°C 20秒、 72で 30秒からな る反応を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。 PCR後、 反応液を 1% ァガ ローズゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ （約 400bp) の増幅断片を QIAduick Gel Extraction Kit (QIAGEN) を用い、 添付説明書記載の方法で精製し、 滅菌水 30 Lで溶出した。
精製 Sfi I-VHおよび Sii I-VL断片は Sii I (夕カラバイオ） にて添付説明書記 載の方法に従い反応液を調製し、 50°Cで一晩消化を行った。 その後、 反応液を QIAauick PCR Purification Kit (QIAGEN) を用いて添付説明書記載の方法で精 製し、 該キット添付の Buffer EB 30 Lで溶出した。
7-4.ヒト IgG4-マウスキメラ二種特異性 IgG抗体発現用プラスミド
目的の二種特異性 IgG抗体を産生する際に、 各 H鎖のへテロ分子を形成させるた めに IgGlの knobs- into-holes技術 (Ridway et al. , Protein Eng. 1996; 9:
617-621) を参考に IgG4の CH3部分へのアミノ酸置換体を作製した。 タイプ a (IgG4ra) は Y349C、 T366W置換体であり、 タイプ b (IgG4rb) は E356C、 T366S, L368A、 Y407Vの置換体である。 さらに、 両置換体のヒンジ領域にも置換 （- ppcpScp- - > -ppcpPcp-) を導入した。 本技術により、 殆どへテロ体となり得る が、 L鎖についてはその限りでなく、 不必要な抗体分子の生成がその後の活性測 定へ影響を及ぼしかねない。 そのため、 本方策では各特異性を有する抗体分子片 腕 (HL分子と称する) を別々に発現させ細胞内で目的型二種特異性 IgG抗体を効 率的に作らせる為に各 HL分子に対応する発現ベクターとして異なる薬剤で誘導が かかるものを用いた。
抗体分子片腕 （便宜上右腕 HL分子と称する） の発現用として、 テトラサイクリ ン誘導型ベクター pcDNA4 (Invitrogen) へ H鎖ないし L鎖それぞれの該領域 （図 1ないし図 2) 、 すなわち動物細胞用シグナル配列 (IL3ss) (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 1984; 81: 1075) の下流に適当なマウス抗体可変領域 （VHない し VL) とヒト IgG4ァ a定常領域 （配列番号： 33) ないし κ定常領域 （配列番 号： 34) を組み込んだもの （PCDNA4- g4Hないし PCDNA4- g4L) を作製した。 まず、 PCDNA4をそのマルチクローニングサイトに存在する制限酵素切断サイト Eco RVお よび Not I (夕カラバイオ） で消化した。 適当な抗体可変領域を有するキメラ二 種特異性抗体右腕 H鎖ないし L鎖発現ュニッ卜 （それぞれ約 1.6kbないし約 1. Okb) を Xho I (夕カラバイオ） で消化した後に、 QIA uick PCR Purification Kit (QIAGEN)にて添付説明書記載の方法で精製し、 DNA polymerase K0D (東洋紡績） を用いて添付説明書記載の反応液組成にて 72°C 10分間反応させ、 末端を平滑化し た。 該平滑化末端断片を QIAduick PCR Purification Kit (QIAGEN) にて添付説 明書記載の方法で精製し、 Not I (タカラバイオ） で消化した。 該 Not I-blunt断 片 (それぞれ約 1.6kbないし 1. Okb) と該 Eco RV- Not Iで消化した pcDNA4を、 Ligation High (東洋紡績） を用いて添付説明書記載の方法に従い連結反応を行 つた。 該反応液により大腸菌 DH5ひ株 （Competent high DH5a (東洋紡績） ） を 形質転換した。 得られたアンピシリン耐性クローンより QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) を用いて各々プラスミド DNiを単離した。
もう一方の片腕 （便宜上左腕 HL分子と称する） はェクダイソン類似体誘導型べ クタ一 pIND (Invitrogen) へ H鎖ないし L鎖それぞれの （図 2ないし図 3) 、 す なわち動物細胞用シグナル配列 （IL3ss) (EMBO. J. 1987; 6: 2939) の下流に 適当なマウス抗体可変領域 （VHないし VL) とヒト IgG4rb定常領域 （配列番号： 35) ないし κ定常領域 （配列番号： 34) を組み込んだもの （pIND- g4Hないし pIND-g4L) を前述の方法に則り作製し、 各々のプラスミド DNAを単離した。
7-5.二種特異性抗体発現べクタ一構築 7 - 4で調製されたテトラサイクリン誘導型発現プラスミド （pcDNA4_g4Hない し pcDNA4-g4L) を Sfi Iで消化し、 反応液を 1% ァガ口一ズゲル電気泳動に供した。 もともと有していた抗体可変領域部分 （VHないし VL (図 1ないし図 2参照） ) が 除かれた断片 (約 5kb) を QIAduick Gel Extraction Kit (QIAGEN) を用い、 添付 説明書記載の方法で精製し、 滅菌水 30/iLで溶出した。 該断片と、 それぞれに対 応する 7- 3で調製された Sfi I 消化抗 F. IXa抗体由来 Sii I-VHないし Sfi I-VL断 片を Quick Ligation Kit (New England Biolabs) を用いて添付説明書記載の方 法に従い連結反応を行った。 該反応液により大腸菌 DH5o!株 （Co即 etent high DH5o; (東洋紡績） ） を形質転換した。 また、 7- 4で調製された Sfi I消化ェク ダイソン類似体誘導型発現プラスミド （pIND-g4Hないし pIND- g4L) から、 上述と 同様の手法で抗体可変領域部分 （VHないし VL (図 2ないし図 3参照） ) を除いた 断片と、 それぞれに対応する 7- 3で調製された Sfi I消化抗 F.X抗体由来 Sii I- VHないし Sfi I- VL断片を、 同様の手法にて組込んだ。
得られた各々のアンピシリン耐性形質転換体は、 挿入断片を挟み込むようなプ ライマ一を用いて、 コロニー PCR法にて目的断片の挿入を確認した。 まず、 抗 F. IXa抗体キメラ H鎖ないし L鎖発現ベクターのために、 挿入部位上流に存在する CMV Forward priming siteヘアニールする 2Hnerのプライマー CMVF (配列番号： 36) と挿入部位下流に存在する BGH Reverse priming 3 6へァニールする18- merのプライマー BGHR (配列番号： 37) を合成した （Sigma Genosys) 。 抗 F. X 抗体キメラ H鎖ないし L鎖発現べクタ一のために、 挿入部位上流ヘアニールする 24 - merのプライマー EcdF (配列番号： 38) と挿入部位下流に存在する BGH Reverse priming siteヘアニールする 18- merのプライマー BGffi (配列番号： 3 7) を合成した （Sigma Genosys) 。 コロニー PCRのために、 反応液 (各 IO Mプライマー 0.2 L、 KOD dash buffer (東洋紡績) 、 0.2mM dNTPs、 0.75 units DNA polymerase KOD dash (東洋紡績） ） を調製した。 該反応液へ、 形質 転換株細胞を適量投入し PCRを行った。 PCRは、 サーマルサイクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer) を用いて、 96°Cで 1分間加熱後、 96°C 10秒、 55°C 10秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 30サイクル反応させる条件より 行った。 PCR後、 反応液を 1% ァガローズゲル電気泳動に供し、 目的サイズの増幅 断片が得られたクローンを選択した。 該 PCR産物は、 ExoSAP- IT (Amersham
Biosciences) を用いて添付説明書に従い、 過剰のプライマーと dNTPsの不活性化 を行った。 各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ki t (Appl ied Biosystems) を用い、 DNAシークェンサ一 ABI PRISM 3100 Genet ic Analyzer (Appl ied Biosystems) にて添付説明書記載の方法に従い決定した。 本 方法により決定した配列群を解析ソフト GENETYX - SV/RC Vers ion 6. 1 (Genetyx) にて解析し、 VHについて挿入欠失変異等の入っていない目的クローンを、 また、 VLについてハイプリドーマで使用された P3U1由来偽 VL遺伝子とは異なり挿入欠失 変異等のはいっていない目的クローンを選択した。
該目的クローンから、 QIAprep Spin Miniprep Ki t (QIAGEN) を用いて各々プ ラスミド DNAを単離し、 100 Lの滅菌水へ溶解した。 抗 F. IXa抗体キメラ H鎖発現 ベクター、 抗 F. IXa抗体キメラ L鎖発現ベクター、 抗 F. X抗体キメラ H鎖発現べクタ 一、 そして抗 F. X抗体キメラ L鎖発現ベクターを、 それぞれ PCDM4- g4IXaHn、 pcDNA4-g4IXaLn, pIND- g4XHnそして pIND-g4XLnと名付けた。 各プラスミド溶液は、 使用するまで 4°Cで保存した。 〔実施例 8〕 キメラ二種特異性抗体の動物細胞での発現
8 - 1 . DNA溶液の調製
抗体右腕 HL分子発現用ベクター （pcDNA4-g4IXaHnそして PCDNA4- g4IXaLn) はテ トラサイクリンにより発現誘導がかかる。 テトラサイクリンが存在しない状況下 で発現を完全に抑制する為に Tetリブレッサーをコードするプラスミド PCDNA6/TR (Invi trogen) が要求される。 また、 抗体左腕 HL分子発現用ベクター （pIND- g4XHnそして pIND- g4XLn) は昆虫ホルモンであるェクダイソン類似体 （ボナステ ロン A) により発現誘導がかかる。 このとき、 ボナステロン Aと反応し誘導を行 ぅェクダイソンレセプ夕一とレチノィド Xレセプ夕一をコードするプラスミド pVgRXR (Invitrogen) が要求される。 従って、 動物細胞のトランスフエクシヨン の為に計 6種類のプラスミド DNA混液を調製した。 細胞培養液 1 mLの為に、 pcDNA4-g4IXaHn pcDNA4-g4IXaLn, pIND_g4XHnそして pIND- g4XLnを各 218.8 ng、 PCDNA6/TRそして pVgRXRを各 1312.5 ng用いた。
8-2. 動物細胞のトランスフエクシヨン
ヒト胎児腎癌細胞由来 HEK293H株 (Invitrogen) を 10%FCS (M0REGATE)を含む DMEM培地（Invi trogen)へ懸濁し、 5 x 105個/ mLの細胞密度で接着細胞用 12- wel Iプ レート （CORNING) の各 wellへ lmLずつ蒔きこみ C02インキュベーター （37で、 5% C02) 内で培養した。 8-1で調製したプラスミド DNA混液をトランスフエクショ ン試薬、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 7 Lと Opti-MEM I培地
(Invitrogen) 250 Lの混液へ加えて室温 20分間静置したものを各 wellの細胞へ 投入し、 4〜5時間、 C02インキュベータ一 （37°Cにて 5% C02) 内でインキュベー トした。
8-3. 二種特異性 IgG抗体の発現誘導
前項のようにトランスフエクションした細胞培養液から培地を吸引除去し、 1 g/mLのテトラサイクリン （和光純薬工業） を含む 1 mL CH0-S-SFM-II
(Invitrogen) 培地を投入し、 C02インキュベーター （37°C、 5% C02) 内で 1日 培養して、 抗体右腕 HL分子の第一次発現誘導を行った。 その後、 培地を吸引除去 し、 一旦 1 mL CH0-S - SFM - II培地にて洗浄した後、 5/ιΜのボナステロン A (Invitrogen) を含む 1 mL CH0- S- SFM- II培地を投入し、 C02インキュベーター (37°C、 5% C02) 内で 2日ないし 3日培養して、 抗体左腕 HL分子の第二次発現誘 導を行い培地中へ二種特異性 IgG抗体を分泌させた。 培養上清は回収された後、 遠心分離 （約 2000g、 5分間、 室温） して細胞を除去し、 必要に応じて Microcon口 YM-50 (Millipore) で濃縮を行った。 該サンプルは使用するまで 4でで保存した。
〔実施例 9〕 ヒト IgG濃度の定量
Goat affinity purified antibody to human IgG Fc (Cappel) を coating bufferにて に調製し、 Nunc- 1讓訓 plateに固相化した。 Diluent buffer (D. B. ) にてブロッキング処理した後、 D.B.を用いて適当に希釈した培養上清サ ンプルを添加した。 また、 抗体濃度算出のためのスタンダードとして、 1000 ng/mLから 2倍系列で D.B.にて 11段階希釈したヒト IgG4 (ヒト型化抗 TF抗体、 W0 99/51743参照） を同様に添加した。 3回洗浄したのち、 Goat ant i -human IgG, alkaline phosphatase (Biosource International) を反応させた。 5回洗浄し たのち、 Sigma 104 (R) phosphatase substrate (Sigma- Aldrich) を基質として 発色させ、 吸光度リーダー Model 3550 (Bio- ad Laboratories) により、 参照波 長 655nmとして 405nmの吸光度を測定した。 Microplate Manager III (Bio-Rad Laboretories) ソフトウェアを用いて、 スタンダードの検量線から培養上清中の ヒ卜 IgG濃度を算出した。
〔実施例 10〕 F. Villa (活性化凝固第 VIII因子） 様活性アツセィ
まず、 二種特異性抗体の F. Villa様活性は、 以下の酵素アツセィで評価した。 また、 以下の反応は全て室温で行った。 3.75 ig/mLの Factor IX (Enzyme
Research Laboratories) 40 zLと抗体溶液 10 /Lの混合液を 96穴プレート中で 1時 間インキュベーションした。 さらにその混合液に、 10 ng/mLの Factor XIa (Enzyme Research Laboratories) 10 iL, 50 g/mLの Factor X (Enzyme
Research Laboratories) 20 L, 400 g/mLの phospholipid (実施例 5- 3参照） 5 L, 5mM CaC12と lmM MgC12を含む TBSB (以下、 TBSB - Sと称す） を添加し、 酵素反応を開始させた。 1時間反応させたのち、 0.5M EDTA 10 Lを加えることに より停止させた。
発色基質溶液 50 / Lをそれぞれのゥエルに加えた後、 0分、 30分の 405nm (参照 波長 655nm) における吸光度を Model 3550 Microplate Reader (Bio Rad Loboratories) により測定した。 F. Villa様活性は、 抗体添加の 30分間の吸光度 変化値から抗体無添加の 30分間の吸光度変化値を引いた値で表した （図 4および 5参照） 。
Phosphol ipidの溶媒には TBSB、 Factor XIa、 Factor IX及び Factor Xの溶媒に は TBSB- Sを用いた。 発色基質溶液は、 添付説明書に従い溶解したテストチーム発 色基質 S- 2222 (Chromogenix) とポリプレン液 (0. 6 mg/L hexadimethrine bromide (Sigma) ) の 1 : 1混合液である。
さらに、 最も活性の高かった XB12/SB04について、 F. Villa様活性の濃度依存性 を測定した （図 6 ) 。
〔実施例 1 1〕 血漿凝固アツセィ
血友病 A血液の凝固能を二種特異性抗体が是正するか明らかにするために、 F. VI I I欠乏血漿を用いた活性化部分トロンポプラスチン時間 （APTT) に対する同 抗体の影響を検討した。 様々な濃度の抗体溶液 50 L、 F. VII I欠乏血漿
(Biomerieu) 50 /iL及び APTT試薬 (Dade Behring) 50 ^Lの混合液を 37°Cで 3分 間加温した。 凝固反応は 20 mMの CaC12 (Dade Behring) 50 Lを同混合液に加え ることにより開始させた。 CR- A (Amelung) が接続された KC10A (Amelung) によ り凝固するまでの時間を測定した （図 7および 8 ) 。
さらに、 最も凝固時間 (APTT)の短縮効果の高かった XB12/SB04について濃度依 存性を測定した （図 9 ) 。 〔実施例 1 2〕 抗体精製
実施例 8に記載の方法で得られた 10mLの培養上清を Centricon (R) YM-50 (Millipore) により、 1 mLまで濃縮した。 これに 10 Lの 10% BSA、 IO Lの 1 % Tween (R) 20及び 100 Lの rProtein A Sep aroseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) を添加し、 4°Cでー晚転倒混和した。 その溶液を 0.222mのフィル 夕一カップ Ultrafree(R)-MC (Millipore) に移し、 0.01% Tween (R) 20を含む TBS 500 Lにて 3回洗浄後、 rProtein A SepharoseTM樹脂を 100 Lの 0.01%
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1011111(；1， pH2.0に懸濁して 3分間静置したのち、 抗体を溶出 させた。 直ちに、 5 Lの 1M Tris_HCl , pH8.0を加えて中和した。 Microplate Manager III (Bio-Rad Laboretories) ソフトウェアを用いて、 スタンダードの 検量線から培養上清中のヒト IgG濃度を算出した。 抗体濃度は実施例 9に従い定 量した。
産業上の利用の可能性
本発明によりへテロ分子を含む受容体に対してリガンド機能代替作用を有する 抗体が提供された。
また本発明により酵素および該酵素の基質の両方を認識する抗体であって、 酵 素活性を増強する補因子の機能を代替する抗体が提供された。
本発明の抗体は、 血中での安定性が高く、 抗原性も低いと考えられることから、 医薬品となるものと大ぃに期待される。

Claims

請求の範囲
1 . 機能蛋白質の代替機能を有する二種特異性抗体。
2. ヘテロ分子を含む受容体に対してリガンド機能代替活性を有する二種特異 性抗体。
3. 受容体がサイトカイン受容体である請求項 2に記載の抗体。
4. サイトカイン受容体がインターフェロン受容体である請求項 3に記載の抗 体。
5. インターフエ口ン受容体が I型ィンターフェ口ン受容体である請求項 4に記 載の抗体。
6. I型インターフエ口ン受容体が AR1鎖及び AR2鎖を含んでいることを特徴と する請求項 5に記載の抗体。
7. ヘテロ分子を含む受容体が二量体である請求項 2に記載の抗体。
8. 抗 AR1鎖抗体の可変領域と、 抗 AR2鎖抗体の可変領域とを含む、 請求項 6に 記載の抗体。
9. 抗 AR1鎖抗体における下記 （a) のアミノ酸配列からなる可変領域と、 抗 AR2鎖抗体における下記 （b l ) 〜 （b l O ) のいずれかに記載のアミノ酸 配列からなる可変領域とを含む、 請求項 8に記載の抗体。
( a ) H鎖可変領域が配列番号： 1に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 2に記載のアミノ酸配列
( b l ) H鎖可変領域が配列番号： 7に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 8に記載のアミノ酸配列
( b 2 ) H鎖可変領域が配列番号： 9に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 1 0に記載のアミノ酸配列
( b 3 ) H鎖可変領域が配列番号： 1 9に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列 (b 4) H鎖可変領域が配列番号： 1 3に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 14に記載のアミノ酸配列
(b 5) H鎖可変領域が配列番号： 2 3に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 24に記載のアミノ酸配列
(b 6) H鎖可変領域が配列番号： 5に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 6に記載のアミノ酸配列
(b 7) H鎖可変領域が配列番号： 1 7に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 1 8に記載のアミノ酸配列
(b 8) H鎖可変領域が配列番号： 1 5に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 1 6に記載のアミノ酸配列
(b 9) H鎖可変領域が配列番号： 2 1に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 22に記載のアミノ酸配列
(b 1 0) H鎖可変領域が配列番号： 1 1に記載のアミノ酸配列であり、 L 鎖可変領域が配列番号： 1 2に記載のアミノ酸配列
1 0. 抗 AR1鎖抗体における下記 （a) のアミノ酸配列からなる可変領域と、 抗 AR2鎖抗体における下記 （b l) 〜 （b 3) のいずれかに記載のアミノ酸 配列からなる可変領域とを含む、 請求項 8に記載の抗体。
(a) H鎖可変領域が配列番号： 3に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 4に記載のァミノ酸配列
(b l) H鎖可変領域が配列番号： 9に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖
■ 可変領域が配列番号： 1 0に記載のアミノ酸配列
(b 2) H鎖可変領域が配列番号： 9に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖 可変領域が配列番号： 1 0に記載のアミノ酸配列 (b 3) H鎖可変領域が配列番号： 2 1に記載のアミノ酸配列であり、 L 鎖可変領域が配列番号： 2 2に記載のアミノ酸配列
1 1. 請求項 2〜1 0のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬 組成物。
1 2. 酵素、 および該酵素の基質の両方を認識する抗体であって、 酵素反応を 増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗体。
1 3. 酵素が蛋白質分解酵素である、 請求項 12に記載の抗体。
14. 蛋白質分解酵素が血液凝固線溶関連因子である、 請求項 1 3に記載の抗 体。
1 5. 血液凝固第 VI 11因子および/または活性化血液凝固第 VI 11因子の作用を代 替する作用を有する、 請求項 14に記載の抗体。
16. H鎖 CDR3の配列が配列番号： 42、 46、 50、 54、 58、 62、 66、 70、 .74、 78、 もしくは 82のいずれかに記載のアミノ酸配列から なる相補性決定領域、 またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有 ' する、 請求項 12〜1 5めいずれかに記載の抗体。
17. XB12または XT04のいずれかの H鎖 CDR3のアミノ酸配列からなる相補性決定 領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有し、 且つ、 HIICDR3 の配列が配列番号： 50、 54、 58、 62、 66、 70、 74、 78 もしくは 82のいずれかに記載のァミノ酸配列からなる相補性決定領域、 またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有する、 請求項 1 2〜1 5のいずれかに記載の抗体。
1 8. H鎖 CDR配列が配列番号： 40〜42、 44〜46、 48〜50、 52〜 54、 56〜58、 60~62、 64〜66、 68〜70、 7 2〜74、
76〜 78もしくは 80〜 82のいずれかに記載のアミノ酸配列からな る相補性決定領域、 またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有す る、 請求項 1 2〜15のいずれかに記載の抗体。
19. H鎖配列が XB 12もしくは XT04のいずれかのァミノ酸配列からなる相補性決 定領域、 またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有し、 且つ、 H鎖
CM配列が配列番号： 48〜50、 52〜54、 56〜58、 60〜62、 64〜66、 68〜70、 72〜74、 76〜 78もしくは 80〜 82 のいずれかのアミノ酸配列からなる相補性決定領域、 またはこれと機能 的に同等の相補性決定領域を有する、 請求項 12〜15のいずれかに記 載の抗体。
20. 請求項 12〜19のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担 体を含む組成物。
21. 出血、 出血を伴う疾患、 もしくは出血に起因する疾患の予防および/また は治療に用いられる医薬組成物である、 請求項 20に記載の組成物。
22. 出血、 出血を伴う疾患、 もしくは出血に起因する疾患が、 血液凝固第 VIII因子および/または活性化血液凝固第 VIII因子の活性の低下ないし欠 損によって発症および/または進展する疾患である、 請求項 21に記載の 医薬組成物。
23. 第 VIII因子の活性の低下ないしは欠損によって発症および/または進展す る疾患が、 血友病 Aである、 請求項 22に記載の医薬組成物。
24. 血液凝固第 VIII因子および/または活性化血液凝固第 VIII因子の活性の低 下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、 血液凝固第 νΐΠ因子および/または活性化血液凝固第 VIII因子に対するインヒビター が出現している疾患である、 請求項 22に記載の医薬組成物。
25. 血液凝固第 VIII因子および/または活性化血液凝固第 ΉΙΙ因子の活性の低 下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、 後天性血友病 である、 請求項 22に記載の医薬組成物。
26. 血液凝固第 VI 11因子および/または活性化血液凝固第 VI 11因子の活性の低 下によつて発症および/または進展する疾患が、 フォンビルブランド病で ある、 請求項 22に記載の医薬組成物。
27. 請求項 12〜 19のいずれかに記載の抗体、 または請求項 20〜 26の いずれかに記載の組成物を投与する工程を含む、 出血、 出血を伴う疾患、 もしくは出血に起因する疾患を予防および/または治療する方法。
8. 請求項 1 2〜1 9のいずれかに記載の抗体の、 請求項 2 0〜2 6のいず れかに記載の組成物の製造のための使用。
9. 少なくとも請求項 1 2〜 1 9のいずれかに記載の抗体、 または請求項 2 0に記載の組成物を含む、 請求項 2 7に記載の予防および/または治療す る方法に用いるためのキット。
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