WO2004111649A1 - 親和性物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

測定対象である親和性物質と、この親和性物質との結合親和性を有する結合パートナーとの結合反応が凝集反応によって測定される。電界中で結合パートナーを結合した担体粒子を、親和性物質と結合させ、凝集した担体粒子のレベルを粒子の三次元情報を指標として計数することによって評価する。三次元情報を指標とすることによって、従来の測定方法よりも更に簡便且つ迅速に、しかも高感度で生物学的特異的反応性物質の存在を検出又は測定することが可能となる。

Description

親和性物質の測定方法 技術分野

本発明は担体粒子の凝集反応を利用した親和性物質の測定方法、 および装置に 関する。 背景技術

生物学的特異的反応性物質の存在を検出または測定する方法としては、 例えば、 酵素免疫測定法、 あるいは放射線免疫測定法などが従来から用いられている。 こ れらの方法は高感度であり精度も高い。 しかし酵素、 あるいは放射性同位元素を 標識として使用するため試薬が不安定である。 また放射性同位元素の利用にあた つては、 保管おょぴ保存上の規制が' ることから、 測定において細かい配慮や技 術を要求される。 そのため、 より簡便な測定方法が求められていた。 またこれら の方法は測定に比較的長時間を要するため、 緊急な検査に対応することが難しい。 これらの背景のもとで、 高感度且つ迅速な測定方法が盛んに研究されるようにな つた。

1 9 7 0年以降、 免疫学的反応を担体粒子の凝集を指標として測定する分析方 法が実用化された。 この方法は、 担体粒子の凝集の程度を光学的に測定すること によって、 定量的な分析を可能とした。 担体粒子としてラテックス粒子を利用し た、 免疫学的粒子凝集反応を光学的に測定する方法は、 ラテックス凝集比濁法 (La tex Agglutination Turbidimetry)と呼ばれている。 これらの分析方法における反 応温度は、 一般的には 3 7〜4 5 °Cの範囲で行われ、 撹拌翼などによって撹拌す ることにより特異的凝集反応が進行する。 このとき測定 （反応） に要する時間は、 およそ 1 0〜2 0分で、 酵素免疫測定法、 あるいは放射線免疫測定法に比べ迅速 である。 一方、 測定感度、 あるいは測定範囲については、 酵素免疫測定法等に比 ベ劣るといわれている。

ラテックス凝集法における粒度分布測定法も公知である （非特許文献 1 Zカム ビアソら， J. Immunol. Methods 18, 33, ' 1977、 非特許文献 2 /松沢ら，化学とェ 業， 第 36巻， 第 4号， 1982) 。 ラテックス凝集比濁法が、 粒子懸濁液の光の透過度 を測定するのに対して、 粒度分布測定法においては分散した個々の粒子の状態や 数が測定される。 カンビアソらの報告においては、 粒子径 0 . 8 μ πιのラテックス に抗体を結合させた試薬と抗原とを 3 7 °Cで 2 0分間反応させた。 反応後の粒子 数を計数し、 凝集による粒子数の減少のレベルに基いて抗原を測定した。 粒子数 は、 レーザー散乱光を原理とした計数機で測定した。

一方、 松沢らは、 粒子径 1 /i mのラテックス粒子に抗体を結合させた試薬を抗原 と 6時間反応させた。 反応後、 電気抵抗法により平均粒子容積を計測して、 抗原 を測定した。 し力 し、 実用化されて普及したのはシースフローによるレーザー散 乱法を用いた P AM I Aシステム （シスメックス株式会社） のみである。 P AM I Aでは、 粒子径 0 . 7 8 μ ιηのラテックス粒子が使用されている。 4 5 °Cで 1 5 分間の反応後にラテックス粒子を計数して免疫測定を行うものである。 P AM I Aは、 ラテックス凝集比濁法に比べ高感度化されているが、 放射免疫測定法 (RIA) や酵素免疫測定法 (EIA)といった高感度免疫測定に比べると感度は劣るといわれて いる。

ラテックス凝集比濁法においては、 一般に粒子径 0 . 0 5〜0 . 6 μ πιのラテツ クス粒子が用いられている。 ラテックス凝集粒度分布解析法の場合は、 このよう に小さい粒子では、 測定妨害物質の影響を受けやすい。 たとえば、 血液や尿など の体液中には、 脂質、 蛋白、 血球成分などが共存する。 これらの共存物質は担体 粒子との識別が難しい。 そのため担体粒子を正しく計数できない場合がある、 こ れらの測定妨害物質の影響を避けるために、 比較的大きい粒子が使用されてきた _c 一方で、 松沢らのように 1 m程度の粒子径になると、 凝集反応が起こりにくくな るため、 0 . 8 ja m程度のラテックス粒子が用いられていた。 また、 松沢らが平均 粒子容積を計測するのに使用したアパーチャ一 （細孔） の口径は 3 0 // IDである。 このサイズではアパーチャ一の詰まりの影響を受けやすい。 し力 し、 これより大 きい口径のアパーチャ一では 0 . 8 ~ 1 μ πιの粒子の検出はできなくなる。

更に、 生物学的特異的凝集反応を促進し、 また形成する凝集塊を検出しやすく するために、 反応系に交流電圧を印加する方法が公知である （特許文献 1 /特開 平 7— 8 3 9 2 8号） 。 この方法は、 担体粒子の生物学的特異的凝集反応により 生物学的特異的反応性物質の存在を検出又は測定する方法であって、 1 O mM以上 の塩の共存下に 5〜 5 0 V/画の電界強度になるように交流電圧を該反応系に印加 することを特徴とするものである。

担体粒子は、 電場に置かれると電場に沿って直線的に並ぶ (パールチヱイン 化） 。 その後電場を停止すると直線的に並んでいた担体粒子は再分散する。 パー ルチエイン化の際に生物学的特異的反応性物質が存在すると、 電場を停止後も担 体粒子の再分散が起こらず、 パールチヱイン化した担体の存在がなおも認められ る。 前記測定方法は、 この現象を利用している。 すなわち、 電場においては、 生 物学的特異的反応性物質の反応が促進される。 そして電場を停止後に担体粒子を 再分散させれば、 反応生成物を検出することができる。 発明の開示

前記公知技術においては、 生物学的特異的反応性物質の反応は、 担体粒子の凝 集を指標として検出される。 担体粒子の凝集は、 二次元の画像データに解析によ つて検出されていた。 具体的には、 まずスライドガラス上に電極を所定の間隔に 接着して、 この電極間 （セル） に試薬と検体を混合させた反応液を滴下してこの 部分をカバーガラスで覆い、 電極に電圧を印加して電場を与える。 電場を停止後、 電極間の反応液中の担体粒子の凝集塊が顕微鏡等で観察される。

し力 し、 このような実験操作は煩雑で機械化の障害となる。 またスライドガラ スを顕微鏡で観察する方法では、 高度な感度や再現性を維持するのが難しい。 た とえば、 スライドガラスのような限られた空間に収容しうる反応液は微量である。 つまりサンプルも担体粒子の数も制限される。 その結果、 十分な測定感度を期待 することは困難となる。 また、 微量の反応液において、 サンプルと担体粒子の量 的な割合や反応温度などの反応条件を一定に保っためには高度な技術が要求され る。 したがって、 再現性を高い水準で維持することは難しい。

加えて公知の方法は、 凝集粒子の検出方法にも課題を有していた。 公知の方法 においては、 凝集粒子は、 顕微鏡で観察された画像情報に基づいて計数されてい た。 つまり二次元の情報に基づいて凝集粒子を観察していた。 ところが、 二次元 の情報では、 さまざまな要因によって凝集塊を正しく検出できない場合のあるこ とが明らかになった。

たとえばパールチヱイン状に結合した凝集塊は、 パールチエインの長さ方向に 対して直角の方向から観察しなければ、 その大きさを正しく評価することができ ない。 パールチヱイン状の凝集塊を長さ方向と同じ方向から観察すると、 凝集し ていない粒子とほとんど同じ大きさにしか見えない。 逆に粒子が凝集塊を形成し ていない場合でも、 粒子同士が重なって見える位置関係にあると、 凝集塊として 計数されてしまう可能性がある。 二次元の情報は、 特定の方向から捉えることが できる粒子の形のみを表している。 したがって、 もしも粒子が、 観察する方向に よつて異なる形を示す場合には、 二次元の情報によつて粒子の大きさを正しく評 価することができない。 このように、 二次元的な情報に基づく粒子の計数方法は、 測定精度を制限する要因となっていた。

本発明は、 これらの問題点の改善を目的としている。 より具体的には、 機械化 が容易で、 かつ測定精度の維持が容易な測定方法の提供を課題とする。

本発明者らは、 上記課題を解決するために、 担体粒子の凝集塊の計測手段につ いて検討を重ねた。 その結果、 粒子あるいは凝集塊を、 その三次元情報を指標と して計数することによって、 測定精度が改善されることを見出し本発明を完成し た。 すなわち本発明は、 以下の測定方法、 および測定装置に関する。

〔1〕 次の工程を含む、 親和性物質の測定方法。

(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒 子と、 測定対象親和性物質とを混合し、 電圧パルスを印加する工程、 または (1' )測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体 粒子と、 測定対象親和性物質とを、 凝集試薬成分と混合し、 電圧パルスを 印加する工程であって、 前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、 かつ測 定対象親和性物質によつてその凝集は阻害される工程

(2)工程 (1)の後に、 測定対象である親和性物質との結合によつて形成された担 体粒子の凝集塊、 および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成 しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を、 その三次元情報を指標として 計数する工程、 または

(2' )工程（ )の後に、 凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、 およぴ測定対象である親和性物質との結合によつて凝集を阻害された担体 粒子のいずれかまたは両方を、 その三次元情報を指標として計数する工程、 および

(3)工程 (2)または (2，）の後に、 凝集塊の形成レベル、 および凝集塊を形成しな かった担体粒子のレベルのいずれか、 または両方に基づいて測定対象物質の レベルを決定する工程

〔2〕 工程 (2)または（2' )において、 凝集塊または担体粒子の三次元情報を、 物理 的に測定する 〔1〕 に記載の方法。

〔3〕 三次元情報を物理的に測定するための方法が、 電気抵抗法、 レーザー回祈 散乱法、 および三次元画像解析法からなる群から選択されたいずれかの方 法である 〔2〕 に記載の方法。

〔4〕 電圧パルスが交流電圧パルスである 〔1〕 に記載の方法。

〔5〕 工程 （2)または (2' )において、 電場を停止後に担体粒子を計数することを 特徴とする 〔1〕 に記載の方法。

〔6〕 工程 （2)または (2' )において、 電場を停止後に更に付加的に担体粒子を希 釈する工程を含む 〔5〕 に記載の方法。

〔7〕 電圧パルスを複数回与えることを特徴とする 〔1〕 に記載の方法。

〔8〕 電圧パルスを印加後に、 担体粒子を分散させてから次の電圧パルスを印加 する工程を含む、 〔7〕 に記載の方法。

〔9〕 複数回の電圧パルスが、 異なる方向の電圧パルスである 〔7〕 に記載の方 法。

〔1 0〕 担体粒子の平均粒子径が、 Ι μ πι以上である 〔1〕 に記載の方法。

〔1 1〕 担体粒子の平均粒子径が、 1 /^ 1!1〜2 0 111でぁる 〔1 0〕 に記載の方法。 〔1 2〕 次の手段を含む、 親和性物質の測定装置。

(a) 測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担 体粒子と、 測定対象親和性物質とを保持する空間、

(b) 前記空間に保持された担体粒子に電圧パルスを印加するための電極、 お よび

(c) 前記空間に保持された担体粒子の凝集によって生じた凝集塊、 および凝 集しなかった前記担体粒子のいずれかまたは両方を、 その三次元情報を 指標として計数する手段

〔1 3〕 (c) 前記空間に保持された担体粒子の凝集によって生じた凝集塊、 およ び凝集しなかった前記担体粒子のいずれかまたは両方を、 その三次元情 報を指標として計数する手段が、 三次元情報を物理的に測定するための 手段である 〔1 2〕 に記載の装置。

〔1 4〕 三次元情報を物理的に測定するための手段が、 電気抵抗法、 レーザー回 析散乱法、 およぴ三次元画像解析法からなる群から選択されたいずれか の方法によって三次元情報を物理的に測定するための手段である 〔1

3〕 に記載の装置。 〔1 5〕 少なくとも 2組の電圧パルスを印加するための電極を有する 〔1 2〕 に 記載の装置。

〔1 6〕 電圧パルスを印加するための電極を駆動する手段を有し、 前記空間に対 して異なる方向の電場を与えることができることを特徴とする 〔1 2〕 に記載の装置。

本発明において親和性物質、 および親和性物質との結合活性を有する結合パー トナーとは、 結合反応を構成することができるあらゆる物質の組み合わせを含む。 すなわち、 ある物質とある物質とが結合するとき、 一方が親和性物質であり、 他 方は結合パートナーである。 本発明における親和性物質おょぴ結合パートナーは、 天然の物質であることもできるし、 人工的に合成された化合物であってもよい。 また親和性物質および結合パートナーは、 精製された物質であることもできるし、 不純物の共存も許容される。 更に、 親和性物質および結合パートナーは、 細胞や ウィルスの表面に存在していてもよい。

本発明において、 親和性物質と結合パートナーとの結合反応の例として、 たと えば次のような反応を示すことができる。 これらの反応を構成する物質は、 いず れも本発明における親和性物質または結合パートナーとすることができる。

抗原またはハプテンと抗体との反応 （免疫反応）

相補的な塩基配列を有する核酸間のハイプリダイゼーシヨン

レクチンとそのレセプターとの反応

レクチンと糖鎖の反応

リガンドとレセプターの反応

D皿と転写調節因子の反応

上記結合反応の中で、 本発明における好ましい結合反応として、 たとえば免疫 反応を示すことができる。 免疫反応を構成する抗原として、 次のような物質を示 すことができる。 これらの抗原は、 抗原分子そのもののみならず、 その断片や、 細胞表面に存在した状態であっても良い。 なおこれらの物質は抗原物質の例であ り、 これら以外の抗原物質に本発明を応用できることは言うまでも無い。 たとえ ば、 ラテックス、 血球等を担体として使用する免疫学的凝集反応に基づく測定が 可能な抗原性物質は、 レ、ずれも本発明における親和性物質とすることができる。 腫瘍マーカー：

AFP、 CEA、 CA19_9、 PSA等

凝固線溶糸マーカー：

プロテイン C、 プロテイン S、 アンチトロンビン （AT) III、 FDP、 FDP 一 D—ダイマー等

感染症マーカー：

CRP、 ASO、 HB s抗原等

ホノレモン：

甲状腺刺激ホルモン （TSH) 、 プロラクチン、 インシュリン等

組織成分：

ミオグロビン、 ミオシン、 ヘモグロビン等

その他：

DN A等の核酸など

抗原性物質とそれを認識する抗体は、 いずれかを親和性物質として、 そして他 方を結合パートナーとして利用することができる。 本発明において親和性物質と は、 当該物質を測定対象とするときに、 親和性物質と呼ぶ。 他方、 結合パートナ 一とは、 親和性物質を測定するためにプローブとして利用することができる、 当 該親和性物質に対する結合活性を有する物質を言う。 したがって、 抗原を測定す るときには、 抗体を結合パートナーとして利用することができる。 逆に、 抗体を 測定するときには、 該抗体が認識する抗原を結合パートナーとして利用すること ができる。 たとえば、 ラテックス、 血球等を担体として使用する免疫学的凝集反 応に基づく測定が可能な抗体は、 いずれも本発明における親和性物質とすること ができる。 HB s (B型肝炎ウィルス表面抗原） 、 HB c (B型肝炎ウィルスコ ァ抗原） 、 H CV (C型肝炎） 、 H I V (A I D Sウィルス) 、 T P (梅毒） 等 に対する抗体が、 免疫学的凝集反応によって測定されている。

親和性物質と結合パートナーとの反応を担体粒子の凝集を指標として測定する ためのいくつかの反応原理が公知である。 これらの反応原理は、 いずれも本発明 に応用することができる。 以下に担体粒子の凝集を指標とする、 親和性物質と結 合パートナーとの反応を利用した測定原理を例示する。

測定対象物質と担体粒子上の結合パートナーとの反応による、 担体粒子の凝集 が検出される。 たとえば、 抗原分子を結合パートナーである抗体によって測定す る場合が、 この原理に含まれる。 あるいは逆に、 抗原を結合した担体粒子の凝集 を指標として、 親和性物質である抗体を測定する場合も、 この原理に含まれる。 直接凝集反応においては、 通常、 凝集のレベルと測定対象物質である親和性物質 の量は正比例する。 すなわち、 凝集塊の形成レベルが高いときには、 親和性物質 のレベル （すなわち濃度） が高い。 逆に、 凝集塊を形成しなかった担体粒子のレ ベルが高いときには、 親和性物質のレベル （すなわち濃度） は低い。

凝集阻止反応：

ハプテンと呼ばれる低分子抗原は、 担体粒子の凝集に必要な抗原を介した架橋 構造を作りにくレ、。 そのため、 直接凝集反応の原理ではハプテンを検出すること ができない。 そこで、 複数分子のハプテンまたはそのェピトープを含む断片を担 体に結合したポリハプテンと、 担体粒子上の抗体との結合による凝集反応が利用 される。 ポリハプテンは、 複数の抗体分子を架橋することができるので、 担体粒 子を凝集させる。 しかしハプテンが存在すると、 ポリハプテンと抗体との反応が 阻止され、 担体粒子の凝集が阻止される。 凝集阻止のレベルは、 ハプテンの存在 と正比例する。 言い換えれば、 測定対象物質の量と、 凝集反応のレベルは逆比例 する。 すなわち、 凝集塊の形成レベルが高いときには、 親和性物質のレベル （す なわち濃度） が低い。 逆に、 凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルが高いと きには、 親和性物質のレベル （すなわち濃度） は高い。

ハプテンに分類される測定対象抗原には、 以下のような成分が挙げられる。 ホスレモン：

エストロゲン、 エストラジオール

薬剤：

テオフィリン

本発明においてハプテンを凝集阻止反応の原理に基づいて測定するためには、 ハプテンに対する抗体を結合した担体粒子を凝集させることができる成分が必要 である。 ハプテンに対する抗体を結合した担体粒子を凝集させることができる成 分を、 本努明においては凝集試薬と言う。 凝集試薬は、 抗体との特異的な親和性 を有し、 かつ抗体との結合によつて担体粒子を架橋する作用を有する試薬と定義 される。 先に述べたポリハプテンは、 ハプテンの測定において凝集試薬として用 いることができる。

直接凝集反応であれ、 凝集阻止反応であれ、 予め一定量の親和性物質を含む標 準試料について同じ反応系で測定して、 凝集塊あるいは凝集しなかった担体粒子 のレベルを測定して標準曲線、 または回帰式を作成しておくことができる。 試料 の測定によつて得られた凝集塊の形成レベルおよび凝集しなかつた担体粒子のレ ベルのいずれかを、 標準曲線あるいは回帰式に適用すれば、 試料中の親和性物質 のレベルを決定することができる。

本発明において、 結合パートナーは、 担体粒子に結合して用いられる。 本発明 の担体粒子としては、 ラテックス粒子、 カオリン、 金コロイド、 赤血球細胞、 ゼ ラチン、 リボソーム等が挙げられる。 ラテックス粒子としては、 凝集反応におい て一般に用いられているものが使用できる。 ポリスチレン系ラテックス、 ポリビ エルトルエン系ラテックス、 ポリメタクリレート系のラテックス粒子が公知であ る。 好ましい粒子担体はポリスチレン系ラテックス粒子である。 官能基を有する モノマーの共重合によって、 ラテックス粒子表面に官能基を導入したラテックス 粒子を用いることもできる。 たとえば、 _COOH、 一 OH、 一 NH₂、 -S0₃ 等の官能基を有するラテツクス粒子が公知である。 官能基を有するラテツクス粒 子には、 結合パートナーを化学的に結合させることができる。

担体粒子の平均粒径は、 例えばラテックス粒子の場合、 0. 5〜20 ;zmが好ま しい。 平均粒径が 0. 5 μπι以下、 または 20 μπι以上であるとパールチェインが 形成されにくく好ましくない。 担体粒子の平均粒径は、 例えばラテックス粒子の 場合、 具体的には 2〜1 0〃m、 さらに好ましくは 1〜10 mであり、 最も好まし くは 2〜5 /imである。 また、 誘電分極が木きい楕円形粒子を用いることにより、 より小さい担体粒子を使用することもできる。

このように、 公知のラテックス 集比濁法における担体粒子が 0. 0 5〜0. 6 μηιであるのと比べ、 本発明の方法においては 1 Aim以上の大きなサイズの粒子 を利用することができる。 電圧パルスを印加する工程の利用によつて凝集反応が 促進される結果、 大きなサイズの粒子であっても短時間で十分な反応が進行する ためである。 担体粒子が大きいことは、 以下のような利点につながる。 まず、 粒 子を計測するためのアパーチャ一サイズを大きくすることができる。 その結果、 アパーチャ一が詰まりにくくなる。 また、 担体粒子が大きくなることによって、 体液に含まれる測定妨害物質との識別が容易になる。 その結果、 測定精度が向上 する。

結合パートナーと粒子担体は、 それぞれの素材に応じた方法によって結合させ ることができる。 当業者は、 両者の結合方法を適宜選択することができる。 たと えばラテックス粒子には、 抗原や抗体、 あるいはそれらの断片などの蛋白質を物 理吸着することができる。 表面に官能基を有するラテックス粒子においては、 当 該官能基との共有結合が可能な置換基を化学的に結合させることができる。 たと えば、 一 COOHを有するラテックスには、 蛋白質の一 NH₂を結合させることが できる。

結合パートナーを結合させた担体粒子は、 必要に応じてプロッキングすること ができる。 具体的には、 担体粒子表面を不活性蛋白質で処理することによって、 担体粒子表面に対する非特異的な蛋白質の結合を防止することができる。 不活性 蛋白質としては、 ゥシ血清アルブミンや脱脂粉乳などを用いることができる。 更 に、 担体粒子の分散性を向上させるために、 分散媒に界面活性剤や糖類を加える ことができる。 また、 微生物の繁殖を防ぐために、 粒子担体に抗菌剤を添加する こともできる。

本発明は、 親和性物質と担体粒子を含む反応液に電圧パルスを印加する工程を 含む。 電界中に担体粒子を整列させ、 凝集反応を行わせる方法は公知である （特 開平 7— 8 3 9 2 8号） 。 すなわち、 親和性物質と担体粒子を含む反応液に電圧 パルスを印加することにより、 担体粒子を電界に沿って整列させることができる。

このとき、 凝集阻止反応の原理を利用する場合には、 親和性物質と担体粒子は、 凝集試薬の共存下で整列させられる。 凝集試薬は、 担体粒子と測定対象親和性物 質との接触の後に接触させることができる。 あるいは予め測定対象親和性物質と 凝集試薬を混合した後に担体粒子を添加することによって、 3つの成分を同時に 接触させることができる。

電圧パルスには交流成分、 または直流成分を利用することができる。 両者を任 意に組み合わせることもできる。 反応液は電気分解を起こしやすいので交流電圧 が好ましい。 交流電圧には、 方形波、 矩形波、 あるいは正弦波等を用いることが できる。 反応液 （試薬） のイオン強度により、 交流電圧の電源周波数を任意に設 定することができる。 交流電圧は波高値で示したとき、 5〜5 0 V/腿の電解強度 が得られるように印加する。 電解強度が 5 V/匪よりも小さいと担体のパールチヱ イン化が起こりにくく、 したがって凝集反応の促進が不十分となる。 電解強度が 5 0 V /脆を超えると反応液の電気分解が起こりやすく、 凝集反応の測定が困難と なる。 より好ましくは 1 0〜 2 O V/mmの電界強度が得られるように印加する。 交 流の周波数は 1 O KHz〜l 0 MHzの周波数が好ましい。 より好ましくは 5 0 Hz〜 1 MHzの周波数である。 3 本発明において、 電圧パルスとは通常、 定常状態から振幅が遷移し、 有限の時 間だけ持続してもとの状態にもどる波または波形を有する電圧をいう。 交流電圧 は、 代表的な電圧パルスである。 交流電圧は電圧の平均値が 0であるような時間 の周期関数である。 たとえば正弦波、 矩形波、 方形波、 あるいはのこぎり波など を有する電圧は明らかに振幅が周期的であり、 交流電圧に含まれる。 一般に、 交 流電圧においては、 任意の 1周期において、 正電位側の面積と負電位側の面積は 等しく、 両者の合計は 0となる。 各面積は、 横軸 （電位差が 0 ) と上側の曲線、 あるいは下側の曲線によって規定される面積である。 本発明においては、 反応液 の電気分解を防ぐために、 電圧パルスが印加される。 したがって、 反応液の電気 分解が起こらない、 あるいは起きたとしても実質的に反応に干渉しないレベルに 抑制できる場合には、 正電位と負電位の合計が 0でない電圧パルスを用いること もできる。

本発明において、 方形波、 あるいは矩形波の電圧パルスは、 正電位/電位差 0 /負電位を繰り返し、 かつ正電位および負電位の少なくとも一方は、 電圧が一定 の状態を含む電源を言う。 そして方形波、 あるいは矩形波の、 電位差が 0の状態 力^次の 0の状態に至る間の時間がパルス幅である。 なお方形波とは、 縦軸を電 圧、 横軸を時間とするグラフに電圧の変化を描いたときに、 ほぼ四角形の形状と なる電圧パルスを言う。 四角形には、 正方形と長方形が含まれる。 これに対して 矩形波は、 正方形を含まない長方形の形状の電圧パルスである。 したがって、 矩 形波は方形波に含まれる。 本発明において、 好ましいパルス幅は、 通常 5 0 sec 以下である。 好ましいパルス幅として、 0 . 1〜1 0 /z secを例示することができ る。

方形波あるいは矩形波を構成する電位差が 0の状態の時間は、 制限されない。 一般的には電位差が 0となるのは、 正電位と負電位の間の移行の瞬間である。 し かし、 電位差が 0の状態がより長い時間継続するような電圧パルスを本発明に用 いることもできる。 たとえば、 0 . 1 〜 1 0 secのパルス幅を有する正電位/負 電位の繰り返しの間に、 0 . 1 〜 1 0 0 μ secの電位差が 0の状態を含むことがで さる。

本発明においては、 反応液に対して任意の方向から電圧パルスを印加すること ができる。 たとえば、 複数の異なる方向の電圧パルスを印加することもできる。 具体的には、 たとえば図 6上に示すように 2組の電極を組み合わせて、 反応液に 電圧パルスを印加することができる。 あるいは、 反応液に対して電極を移動させ ることによって、 異なる方向の電圧パルスを与えることができる。 たとえば、 電 極を回転させることによって、 任意の角度の電圧パルスを与えることができる。 移動させる電極の数は、 1組であってもよいし、 2組以上の電極を移動させるこ ともできる。

本発明において、 直交する電場を与えることができる 2組の電極を組み合わせ た場合に形成されるパールチェインの構造を図 6に示した。 図 6の例においては、 2方向の電圧パルスを交互に印加すれば、 担体粒子は電圧パルスが交差する領域 に収束する （図 6下右） 。 あるいは電圧パルスの印加と分散を交互に行えば、 電 極 3— 3間の電圧パルスに沿ったパールチェイン （図 6下中央） と、 電極 3 ， 一 3， 間の電圧パルスに沿ったパールチェイン （図 6下左） とを交互に形成する。 このような立体的なパールチヱインの形成は、 親和性物質間の反応を促進する。 本発明において、 複数組の電極の配置は任意である。 電極間の距離が短い場合 には、 形成されるパールチヱインが短くなる。 一方電極の距離が長いと、 印加さ れる電圧が大きくなる。 更に実際には、 電極の配置によって反応空間の構造が左 右される。 そのため一般的な電極間の距離は、 通常 0 . 0 1膽〜数十 mmである。 一般的な免疫学的粒子凝集反応においては、 好ましくは、 0 . 1騰〜 5咖、 たと えば 0 . 5 mm〜 3 mmの範囲で電極を配置することができる。

図 5に、 電極間の距離と、 そのときの反応液の体積の例を示した。 0 . 5 〜 l m mの間隔で電極を配置し、 セルの長さを 1 O mn！〜 2 0 mmとすることによって、 一般 的な免疫学的凝集反応の反応液量である 2 . 5〜 2 0 ;ζ Lの反応液を収容すること ができる。 また複数組の電極を利用する場合には、 各 ,組み合わせの間で、 電極の 距離と高さとを一致させることが好ましい。

モノクローナル抗体を感作した担体粒子の凝集を利用した、 抗原性物質の検出 方法が公知である。 モノクローナル抗体は、 通常、 抗原上の単一のェピトープを 認識する。 そのため、 担体粒子を凝集させるためには、 一般に、 複数種のモノク ローナル抗体を利用する必要がある。 しかしモノクローナル抗体を使用する限り、 原理上、 抗原 1分子に結合しうる抗体の数 （すなわち担体粒子の数） は、 利用し たモノクロ ナル抗体の種類を越えることはできない。 このこと力 モノクロ一 ナル抗体を使つた担体粒子の凝集反応に基づく分析方法の検出感度を制限する原 因の 1つとなっている。 本発明に基づいて、 複数方向からの電圧パルスを印加す ることができれば、 印加方向の変化によって、 担体粒子と抗原分子との接触の機 会が増え、 その結果、 検出感度の向上が期待できる。

スライドガラスを利用した公知の方法においては、 電圧パルスを印加する方向 は制限されていた。 また顕微鏡などを利用した観察方法を利用する限り、 立体的 な反応空間を利用することはできなかった。 これに対して本発明では、 凝集して いない粒子あるいは凝集した粒子の三次元情報を測定することによって凝集率を 解析するため、 反応空間の形状が制限されない。 親和性物質の結合を介して結合 された 2以上の粒子の集合体を、 凝集塊 (aggregate)と言う。 凝集塊を構成する粒 子の数は制限されない。 複数の粒子は、 直鎖状に結合することもあるし、 格子状 (マトリクス状） に結合することもある。 どのような形を形成していても、 複数 の粒子が結合された状態にあれば、 それは凝集塊である。 したがって、 複数の異 なる方向からの電圧パルスの印加を実現したことは、 本発明によつて実現するこ とができる大きな利点である。

一般に、 反応系中の担体粒子の濃度が高いほどパールチヱインが形成されやす いので凝集が促進される。 しかし一方で、 担体粒子の濃度の上昇に伴って、 生物 学的特異的反応性物質が存在しない場合に再分散したときの担体粒子の凝集率

(バックグランド） が大きくなる傾向があった。 2次元の情報に基づいて凝集粒 子を観察してした公知の方法 （特開平 7— 8 3 9 2 8号） においては、 担体粒子 濃度が高いほど、 凝集していない粒子を誤って凝集粒子として捉えてしまう可能 性が高まる。 粒子濃度が高い場合には、 粒子が接近するためため、 単なる粒子の '重なりと、 凝集によって形成された粒子塊との識別が困難となるのである。 した がって凝集塊を特異的に識別するためには、 粒子濃度を低く保つ必要がある。 具 体的には、 特開平 7— 8 3 9 2 8号に開示された反応系中の担体粒子の濃度は、 例えばラテックス粒子の場合、 好ましくは 0 . 0 1〜 1重量⁰ /₀、 より好ましくは 0 . 0 2 5〜0 . 5重量。 /₀、 最も好ましい濃度は 0 . 0 5〜0 . 1重量％である ₍ このような粒子濃度は、 パールチェイン化においては、 必ずしも最適な条件とは 言えない。 すなわち 2次元の情報に基づいて凝集塊を計数する手法においては、 粒子濃度を犠牲にすることによって、 凝集塊の特異的な識別を実現していた。

本発明は、 三次元の情報に基づいて凝集粒子が計測されるため、 粒子濃度とは 無関係に凝集塊を特異的に識別することができる。 その結果、 パールチヱインの 形成に最適な条件を与えることができる。 すなわち、 測定対象親和性物質と結合 活性を有する結合パートナーとのバランスを考慮して担体粒子の濃度を決定する ことができる。 たとえ高い担体粒子濃度が選択されても、 凝集塊は特異的に検出 される。 本発明においては、 通常、 反応系中の担体粒子の濃度は、 例えばラテツ クス粒子の場合、 好ましくは 0 . 0 1〜5重量％、 より好ましくは 0 . 1〜2重 量％である。 この濃度範囲は、 2次元の情報に基づく方法の、 倍〜 1 0倍である _t 最適な担体粒子の濃度は、 担体粒子の大きさや測定対象親和性物質の測定感度等 に合わせて適宜調節することができる。

本発明において、 反応液には凝集反応を促進する塩を添加することができる。 たとえば、 1 O mM以上の比較的高い濃度で塩を添加することにより、 凝集反応を 促進することができる。 ただし塩の濃度が反応系中に 6 0 O mM以上の濃度で存在 すると反応液の電気分解が起こり易くなるので好ましくない。 より好ましい塩の 濃度は 1 0〜3 0 O IBM、 最も好ましい塩の濃度は 2 5〜1 5 0 である。 生体試 料自身が凝集反応を促進する塩を含有している可能性がある場合には、 反応液中 の最終塩濃度が上記の範囲に入るように試薬の塩濃度を調整すると良い。 なお電 圧パルスとして直流成分を用いる場合では約 6 mMの塩濃度の反応液でも電気分解 が起こるため、 塩の存在下では生物学的特異的凝集反応の測定は困難である。

本発明における塩は、 生物学的特異的凝集反応を促進するものの中から選択さ れ得る。 例えば、 塩化ナトリゥム、 塩化力リゥム、 硝酸ナトリゥム、 硝酸力リゥ ム、 塩化アンモニゥムが挙げられるがこれに限定されるものではない。 モル電気 伝導度が 1 O mM、 2 5 °Cの水溶液において 1 0 O cmV ( Q · mol)以上の値を示す塩 は、 本発明に用いる塩として好ましい。 より具体的には、 例えば塩化ナトリウム、 塩化カリゥム、 および塩化アンモニゥム等を好ましい塩として示すことができる。 本発明において、 親和性物質を含む検体は制限されない。 すなわち、 測定対象 である親和性物質を含む任意の試料を検体として利用することができる。 たとえ ば、 血液試料、 咽頭などの局所から採取された試料、 唾液、 喀痰、 尿、 あるいは 便は代表的な生体試料である。 その他、 生体から採取されるあらゆる生体材料は、 生体物質測定用の検体として本発明に利用することができる。 更に、 これらの生 体試料を培養することによって得ることができる培養物も、 本発明の検体として 利用することができる。 生体材料は、 そのまま、 あるいは必要に応じて処理した 後に、 検体とすることができる。 たとえば、 生体材料は分画、 希釈、 溶解、 抽出 などの処理を経て、 検体とすることができる。

本発明は、 粒子の三次元情報を測定する工程を含む。 そのため、 検体が固形成 分を含む場合には、 除去や溶解によって、 固形成分を予め取り除くことが好まし い。 固形成分は、 ろ過や遠心分離によって除去することができる。 ただし、 粒径 などの情報に基づいて、 試料由来の固形成分のシグナルを、 担体粒子のシグナル と明瞭に識別できる場合には、 固形成分の除去は必須ではない。 本発明において検体は原液でもよく、 又は自動希釈して測定に使用される。 希 釈倍率は任意に設定することが可能である。 反応に必要な試薬が複数種類となる ときには、 2試薬以上を順次に添加することも可能である。

ここで言う 2試薬を構成する試薬としては、 たとえば以下のような試薬を示す ことができる。

本発明において、 非特異反応の原因となる物質を、 予め分解、 および/または 吸収するための試薬を用いることができる。 このような試薬は、 非特異抑制剤を 含む試薬として有用である。 非特異抑制剤を含む試薬は、 担体粒子を含む試薬と 組み合わされて、 2試薬を構成する。 非特異抑制剤を含む試薬は、 たとえば、 予 め検体と混合することことができる。 非特異抑制剤は、 例えば、 従来周知のもの を使用することができる。

ィムノアッセィにおいて、 非特異反応の原因となるさまざまな物質が試料中に 含まれることが明らかにされている。 たとえば、 リューマチ因子などのグロプリ ン類は、 ィムノアツセィを構成する免疫反応に干渉することがある。 グロブリン 類のィムノアッセィへの干渉を防止するために非特異抑制剤が用いられる。 たと えば、 グロブリン類を認識する抗体によって、 その非特異作用を吸収することが できる。 リューマチ因子は I g Gや I g M由来のグロプリンである。 したがって、 抗ヒト I g G抗体、 あるいは抗ヒト I g M抗体を使用して、 リューマチ因子を吸 収することができる。 また、 非特異原因物質の分解によって干渉を防ぐ方法も公 知である。 具体的には、 グロブリン類を還元によって分解し、 その干渉作用を抑 制できることが知られている。 グロブリン類は、 ジチオスレィトール、 あるいは 2 -メルカプトエタノールなどによって還元される。

また、 異なる結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子を含む試薬 を 2種類以上組み合わせることができる。 このような構成によって、 異なる種類 の測定対象親和性物質を同時に測定することができる。 各試薬は、 それぞれ個別 に添加することができる。 あるいは、 予め複数の試薬を混合した後に、 検体と混 合することもできる。

検体と試薬は電圧を印加する前に予め混合しておくことが望ましい。 攪拌子を 使って物理的に両者を混合することができる。 あるいは電気的な方法によって、 両者を混合することもできる。 電気的な手法としては、 異なる方向の電圧パルス の断続的な印加によって、 担体粒子の位置を物理的に動かす方法を例示すること ができる。

本発明は、 次の工程を含む親和性物質の測定方法に関する。

(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒 子と、 測定対象親和性物質とを混合し、 電圧パルスを印加して前記担体粒子 を電界に沿って整列させる工程

(2)測定対象である親和性物質との結合によつて形成された担体粒子の凝集塊、 およぴ測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかつた担体粒 子のいずれかまたは両方を、 その三次元情報を指標として計数する工程、 お ょぴ

(3)凝集塊の形成レベル、 およぴ凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのい ずれか、 または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程 本発明の測定方法を構成する各工程を以下に具体的に説明する。

混合された反応液は次に電極を介した槽に移動して、 電圧パルスを印加する。 電場をかけると担体粒子は誘電分極を起こして静電的に引き合い直鎖状に並ぶ。 この現象は、 パールチェイン化と呼ばれている。 その後電場を停止すると直鎖に 並んでいた担体粒子は瞬時に再分散する。 一方パールチエイン化の際に生物的特 異的反応物質が存在すると、 生物的特異的反応に関与した担体粒子は電場を停止 後も分散せずに凝集塊を形成したままの状態で存在する。 これらの生物的特異的 凝集反応に関与している凝集粒子及び/又は関与しなかった分散した担体粒子を 測定することにより生物的特異的反応物質の存在を検出又は測定することができ る。 本発明の測定方法は、 測定対象である親和性物質との結合によつて形成された 担体粒子の凝集塊、 および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成し なかった担体粒子のいずれかまたは両方を、 その三次元情報を指標として計数す ることを特徴とする。 本発明において、 粒子は電場を停止後に測定することがで きる。 あるいは電場に置かれた粒子を、 電場を停止することなく測定することも できる。 たとえば、 電場に置かれた粒子は、 電場の中から取り出すことによって 計数することができる。 更に、 粒子の計数前に、 粒子を分散させる工程を実施す ることができる。 計数前の分散工程によって、 非特異的な要因によって凝集した 粒子を分散させることができる。 その結果、 測定精度の向上が期待できる。 粒子 は、 攪拌や反応液の希釈によって分散させられる。

本発明においては、 粒子は、 三次元情報を指標として計数される。 本発明にお いて、 三次元情報を指標とする計数とは、 粒子および Zまたは凝集塊の三次元情 報を測定し、 その結果に基づいて粒子および Zまたは凝集塊を計数することを言 う。 顕微鏡画像を解析する公知の方法は、 二次元情報に基づいて凝集のレベルを 決定している。 したがって、 三次元情報を指標とする本発明と公知の方法とは、 明確に区別される。

三次元情報を測定するための方法は限定されない。 また、 本発明における計数 とは、 粒子および/または凝集塊の数を求めることを言う。 粒子および /または 凝集塊の数は、 単に数のみを測定することもできる。 あるいは凝集した粒子を、 凝集していない粒子と区別して測定することもできる。 更に、 凝集した粒子につ いては、 凝集した粒子の数ごとに、 その凝集塊の数を測定することもできる。 三 次元情報を指標として粒子を計数するためのいくつかの方法が公知である。 本発明に利用することができる粒子の計数方法は、 物理的な原理に基づく測定 方法が有利である。 本発明において物理的な測定方法とは、 粒子または凝集塊に 固有の物理的な情報を評価することができる測定方法を言う。 粒子または凝集塊 に固有の物理的な情報は、 真の測定結果と言い換えることもできる。 これに対し て画像情報から取得される二次元情報を解析する方法は、 実際には凝集していな い粒子の重なりを凝集塊として検出してしまう。 このような検出結果は、 粒子に 固有の物理的な情報とは言えない。

粒子または凝集塊を物理的に測定するには、 フローシステムの利用が有利であ る。 フローシステムは、 微細なフローセル中を通過する粒子の物理的な情報を解 析することができるシステムである。 フローシステムを利用することにより、 容 易に物理的な測定を実施することができる。 すなわち本発明における物理的な測 定とは、 フローシステムによつて粒子およぴ凝集塊のレ、ずれかまたは両方の三次 元情報を測定し計数する工程を含む。 三次元情報を指標として粒子を物理的に計 数するための方法として、 たとえば、 コールター原理またはレーザー回析散乱法 を示すことができる。

コールター原理 (USPA2656508, 1953年） とは、 アパーチャ一 （細孔） の両側に 電極を置き、 アパーチャ一内を通過する粒子による電気抵抗の変化に基づいて粒 子の体積を検出する解析方法である。 電解液を通して両電極間に微小電流を流し たとき、 電解液中に懸濁した粒子が吸引されてアパーチャ一を通過すると、 粒子 体積に相当する電解液が粒子によって置換される。 その結果、 両電極間の電気抵 抗に変化を生じるので、 この変化を測定することにより、 粒子の計数とサイズ

(体積） を測定することができる。 体積を検出する方法として静電容量法がある 1 実用化されているものは電気抵抗法がほとんどである。

アパーチャ一サイズは、 解析対象となる粒子に合わせて適宜調節することがで きる。 一般的な免疫学的な粒子凝集反応に用いられる担体粒子の凝集を検出する 場合、 アパーチャ一サイズとしては、 通常 3 0〜1 0 0 0 m、 好ましくは 5 0〜 2 0 0 μ ηιを示すことができる。

アパーチャ一サイズは、 担体粒子の平均粒径に対して数倍〜数 1 0 0倍、 たと えば数倍〜 1 0 0倍、 好ましくは 5倍〜 5 0倍とするのが有利である。 この場合、 体積に比例したシグナルが検出でき、 精度のよい高感度な測定が実現できる。 粒 子径に対してアパーチャ一サイズの倍率は小さい方が感度はよくなるが、 小さす ぎると粒子が詰まりやすくなり、 大きすぎると粒子の検出感度が低下するので好 ましくない。

より具体的には、 たとえば粒子径が 1〜 5 μ m、 特に 2〜 3 μ mの担体粒子を計 数する場合、 アパーチャ一サイズは 3 0〜： L 0 0 μ ιη、 好ましくは 5 0〜8 0 μ πι、 たとえば 6 5〜7 5 μ πιの範囲から選択することができる。 2〜3 μ πιの担体粒子 は、 本発明による親和性物質の測定方法において、 特に好ましい粒子サイズとし て挙げることができる。 すなわち本発明は、 以下の工程を含む親和性物質の測定 方法を提供する。

(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した平均粒 径 2〜 3 μ ηιを有する担体粒子と、 測定対象親和性物質とを混合し、 電圧パ ルスを印加する工程、 または

(1' )測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した平均 粒径 2〜3 μ ηιを有する担体粒子と、 測定対象親和性物質とを、 凝集試薬 成分と混合し、 電圧パルスを印加する工程であって、 前記担体粒子は凝集 試薬によつて凝集し、 かつ測定対象親和性物質によつてその凝集は阻害さ れる工程

(2)工程 (1)の後に、 測定対象である親和性物質との結合によつて形成された担 体粒子の凝集塊、 および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成 しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を、 5 0〜8 0 μ ηιのアパーチャ 一サイズを有するコールター原理によって、 その三次元情報を指標として計 数する工程、 または

(2' )工程 (1' )の後に、 凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、 およぴ測定対象である親和性物質との結合によつて凝集を阻害された担体 粒子のいずれかまたは両方を、 5 0〜8 0 μ πιのアパーチャ一サイズを有 するコールター原理によって、 その三次元情報を指標として計数する工程、 および

(3)工程 (2)または (2' )の後に、 凝集塊の形成レベル、 および凝集塊を形成しな かった担体粒子のレベルのいずれか、 または両方に基づいて測定対象物質の レベルを決定する工程

一般にアパーチャ一サイズが小さい方が、 非凝集粒子をより正確に計数するこ とができる。 反対にアパーチャ一サイズを大きくすることによって、 凝集粒子が アパーチャ一に詰まりにくくなる。 アパーチャ一の詰まりは解析効率の低下の原 因となる。 詰まる頻度を低くすることが、 解析効率の向上につながる。 たとえば、 凝集粒子が多量に生成することが予測される場合には、 アパーチャ一サイズを大 きめに設定することによって、 アパーチャ一の詰まりを防止することができる。 あるいは、 粒子径の小さい担体粒子を用いることで同様の効果を期待することが できる。 更に、 試料の希釈によって凝集粒子の割合を低下させ、 アパーチャ一の 詰まりを防止することもできる。 通常は、 期待される検出感度、 予想される検出 対象物質の濃度、 そ.して機器構成 (特にアパーチャ一サイズ) に応じて、 それぞ れ適切な条件を選択すればよい。

このようにして凝集粒子を計数することによって、 凝集粒子の割合を知ること ができる。 凝集粒子の割合とは、 計数した全粒子に占める凝集した粒子の割合を 言う。 また凝集粒子の割合を、 凝集率 (aggligation rate)と言う。 更に、 予め濃 度がわかっている標準試料について、 凝集率を求め、 両者の関係をグラフにプロ ットすることによって、 標準曲線を得ることができる。 これに対して、 検体の凝 集率を照合すれば、 検体に含まれる測定対象親和性物質の濃度を明らかにするこ とができる。

あるいは前記標準曲線を回帰式として表すこともできる。 回帰式が得られれば、 凝集率を回帰式に代入することによって、 測定対象親和性物質の濃度を算出する こともできる。

—方レーザー回祈散乱法とは、 粒子にレーザーを照射した際に生じる揺らぎを 検出することにより粒子の計数と平均径を測定するものである。 いずれの場合も、 測定精度を高めるために、 粒子の誤測定を抑制する目的として、 反応粒子を希釈、 超音波の印加又は 及ぴシースフォロー方式などを用いることが好ましい。

その他にも以下のような方法を、 粒子体積の測定方法として示すことができる。 遠心沈降法：液中における粒子の沈降速度と粒径の関係を示すストータスの式に より、粒径分布を測定する方法。 （光透過式遠心沈降法では、 ストークスの法則を 適用し、 同じ比重の粒子ならば大粒のものの方が小粒のものよりも早く沈降する ことを利用する。 その時の粒子濃度を光透過による濁度変化として解析し、 粒度 分布を求めることができる。 ）

キヤビラリ一方式：キヤビラリ一中を流れる粘性流体のレイノルズ数が小さレ、場 合、 そこにはポアズイユの流体が発生する。 この流れはキヤピラリー中央ほど速 く、 管壁ほど遅いため、 大きな粒子は平均的に速い流束中を、 小さい粒子は平均 的に遅い流束中を流れて行くことになる。 つまり粒子は一定長のキヤビラリ一中 を流れる際、 この移動速度の違いにより、 サイズ別に分離され検出される。

三次元的画像解析：異なる方向から撮影した複数の画像情報を解析し、 粒子の三 次元情報を求めることができる。 あるいは X y平面の画像情報を z軸方向へスキ ヤンすることにより、 粒子の三次元情報を求めることができる。

本発明の測定方法は、 三次元情報を指標として凝集した （またはしなかった） 担体粒子が計数される。 計数の結果によって、 測定対象である親和性物質が定性 的に、 または定量的に測定される。 定性的な測定においては、 凝集粒子の存在は、 測定対象である親和性物質の存在を意味する。 あるいは凝集阻止反応の場合には、 凝集の阻止が検出されたときに、 測定対象の存在が証明される。

また定量的な測定においては、 凝集のレベルを測定対象である親和性物質の量 と関連付けることができる。 より具体的には、 予め親和性物質の量が明らかな試 料について本発明の測定方法を行い、 三次元情報に基づく凝集粒子の検出結果と 親和性物質の量の関係を明らかにしておく。 次に、 試料について同様の測定を行 い、 堆積に基づく凝集粒子の検出結果から、 親和性物質の量を明らかにすること ができる。 凝集阻止反応の場合であっても、 同様にして定量的な測定は可能であ る。

粒子おょぴ zまたは凝集塊の計数方法としては、 一定の粒子数をカウントする 手段においては、 2個以上に凝集した粒子数/総粒子数や単粒子/総粒子数など 目的に合わせて演算式を選ぶことができる。 総粒子数とは、 ある計測時間内に計 測された全ての粒子の数であつても良いし、 反応液の全量を解析の対象とする場 合には、 文字通り、 反応液に含まれる粒子の総数とすることもできる。 反応液に 含まれる粒子の総数は、 反応液の全容量が明らかな場合には、 その一部を計数す ることによって、 近似的に算出することもできる。

あるいは、 電気抵抗法やレーザー回析散乱法などによって、 一定時間あたりに 検出された粒子および Zまたは凝集塊の数に基づいて、 親和性物質を検出または 測定することができる。 つまり、 凝集反応により単粒子は凝集して凝集塊を形成 することから、 時間当たりに計数される粒子数が少なくなる。 または、 所定数の 粒子およぴ または凝集塊を計数するに要する時間を指標とすることもできる。 このような計数方法を本発明に適用する場合には、 それぞれ粒子および/または 凝集塊の数と、 親和性物質の量との間の関係を、 回帰式として表すことができる ₍ 抗体が感作された粒子は、 抗原の濃度に応じて、 2個以上の粒子からなる凝集 塊の割合が多くなる。 そして 2個以上に凝集した粒子数 Z総粒子数で表される凝 集率は、 1 . 0 0 ( 1 0 0 %) に収束する。

コールター原理にしろレーザー回析散乱法にしろ、 粒子の三次元情報を計測す る方法は、 二次元的な画像データを解析する方法と比較して、 簡単な機器構成に よって、 高精度な解析が期待できる。 既に述べたように、 二次元的な画像データ の解析においては、 反応液の容積が制限される。 これに対して三次元情報を計測 する方法は、 フロー式の解析手法を応用できるため、 反応液の容積は制限されな い。 また反応空間の物理的な形状も制限されない。 これらの理由により、 機器構 成はシンプルとなる。 加えて、 反応液量を自由に設定できることが、 再現性ゃ検 出感度の向上に貢献する。

あるいは本発明は、 次の工程を含む、 親和性物質の測定方法を提供する。

(1' )測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体 粒子と、 測定対象親和性物質とを、 凝集試薬成分と混合し、 電圧パルスを 印加して前記担体粒子を電界に沿って整列させる工程であって、 前記担体 粒子は凝集試薬によつて凝集し、 かつ測定対象親和性物質によってその凝 集は阻害される工程

(2' )工程（1' )の後に、 凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、 および測定対象である親和性物質との結合によつて凝集を阻害された担体 粒子のいずれかまたは両方を、 その三次元情報を指標として計数する工程、 および

(3)工程 (2' )の後に、 凝集塊の形成レベル、 および凝集塊を形成しなかった担体 粒子のレベルのいずれか、 または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決 定する工程

凝集試薬を利用する、 凝集阻止反応に基づく免疫学的粒子凝集反応法の原理は 既に述べた。 上記工程によって、 免疫学的粒子凝集反応に本発明を応用すること ができる。 上記工程を構成する電圧パルスの印加や凝集塊の形成レベル、 あるい は凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルの解析は、 先に具体的に述べたよう な方法によって実施することができる。

なお凝集阻止反応の原理に基づいて本発明を実施する場合には、 2個以上の粒 子が凝集した凝集塊がより多く生成される条件を選択することが望ましい。 ある いは、 単粒子 Z総粒子数を指標として凝集レベルを評価する方法が好ましい。 凝 集阻止反応の原理に基づく場合には、 このような演算式を利用したほうが、 2個 以上に凝集した粒子数/総粒子数の演算式に基づく解析よりも、 高い感度を期待 できる。 加えて本発明は、 上記測定方法を実施するための装置を提供する。 すなわち本 発明は、 次の手段を含む、 親和性物質の測定装置に関する。

(a) 測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体 粒子と、 測定対象親和性物質とを保持する空間、

(b) 前記空間に保持された担体粒子に電圧パルスを印加するための電極、 およ ぴ

(c) 前記空間に保持された担体粒子の凝集によって生じた凝集塊、 および凝集 しなかつた前記担体粒子のレ、ずれかまたは両方を、 その三次元情報を指標 として計数する手段

本発明において、 （a) 測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナ 一を結合した担体粒子と、 測定対象親和性物質とを保持する空間には、 反応液を 保持するための任意の空間を利用することができる。 微量の試料を反応させるた めには、 小容量の空間であることが有利である。 たとえば 1 L〜1 O mL、 好まし くは 1 0 ~ 5 0 0 程度の空間を利用することができる。 この空間は、 必要に応 じて、 試料や試薬の供給手段、 あるいは後に述べる担体粒子の計測手段を装備す ることもできる。

次に本発明における（b) 前記空間に保持された担体粒子に電圧パルスを印加す るための電極について説明する。 担体粒子を電場に整列されるための電極は、 た とえば先に記載した先行技術文献においても利用されている。 これら公知の電極 を、 本発明に利用することができる。 本発明の装置には、 電極に電圧を供給する ための電源を装備することができる。

本発明の装置における電圧パルスを印加するための電極は、 少なくとも 1組 ( 2つ） の電極で構成される。 複数の異なる方向の電圧パルスを与えるために、 3以上の電極を備えることもできる。 たとえば、 3つの電極 A、 B、 Cを配置し、 A— B間、 B— C間、 および A— C間の 3つの方向の電圧パルスを印加すること ができる。 この他、 2組 （4つ） の電極を配置し、 直交する電圧パルスを印加す ることもできる （図 6 ) 。

更に、 異なる方向の電圧パルスを印加するために、 電極を駆動する機構を備え ることができる。 たとえば、 反応液の中で電極を回転させることにより、 複数の 異なる方向から電圧パルスを印加することができる。 異なる方向から電圧パルス を印加するとき、 印加の方向は任意の角度とすることができる。

更に本発明の装置は、 （c) 前記空間に保持された担体粒子の凝集によって生じ た凝集塊、 および凝集しなかった前記担体粒子のいずれかまたは両方を、 その三 次元情報を指標として計数する手段を含む。 該計数手段は、 前記空間に装備する ことができる。 あるいは前記空間に保持された反応液を前記空間から取り出して 計数手段に導入した後に、 計数することもできる。

三次元情報を指標として凝集した、 またはしなかった担体粒子を計数する手段 としては、 コールター原理、 あるいはレーザー回析散乱法を利用した計測手段を 利用することができる。 コールター原理のためには、 たとえば前記空間内の反応 液を、 コールター原理のための電極を備えたアパーチャ一に導入して、 必要な解 析が行われる。 アパーチャ一のサイズは、 先に述べたような基準に基づいて、 適 宜調節することができる。 試薬に用いる粒子径、 あるいは予測される凝集粒子の 割合に応じて、 異なるサイズを有する複数のアパーチャ一を切り替えて利用する 機構を採用することもできる。 たとえば、 本宪明の装置は、 複数のアパーチャ一 に反応液を導くための流路切り替え機構を備えることができる。 更に、 試薬の種 類や、 予測される凝集粒子の割合などに基づいて、 流路を自動的に選択する機構 を組み合わせることもできる。 あるいは、 本発明の装置は、 アパーチャ サイズ の切り替えによって、 自動的に検出感度を調節する機構を備えることができる。 検出感度の調節機構として、 たとえば、 まず大き目のアパーチャ一サイズで解析 し、 凝集粒子の割合が小さいと予測された場合に、 より小さいアバ一チヤ一に切 り替える機構を示すことができる。 レーザー回析散乱法を利用する場合も同様に、 解析のための光学セルに反応液を導入して解析すればよい。 本発明において、 電場においてパールチェイン化された担体粒子は、 必要に応 じて再分散させた後に、 三次元情報を取得することができる。 本発明の装置には、 担体粒子の再分散のための機構を装備することができる。 担体粒子は、 希釈や超 音波処理によって再分散することができる。

本発明の装置を構成する上記 (a) - (c)の要素は、 1つの連続する流路内に配置す ることができる。 あるいは、 各要素を不連続な空間として構成し、 各要素の間を 反応液を移動させることによって、 本発明の測定方法を実施することもできる。 本発明の装置には、 上記測定方法を実施するための付加的な機構を組み合わせ ることができる。 本発明の装置に組み合わせることができる付加的な機構を、 以 下に例示する。

試料の分取機構 測定結果の表示機構

試料の希釈機構 15 測定結果の印刷機構

測定結果の記録機構

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、 参照として本明細書 に組み入れられる。 図面の簡単な説明

図 1 (A) は、 本発明に基づく装置の構成を示す図である。 また図 1 (B ) は、 本発明に基づく装置を構成するパルス印加槽の断面を示す図である。

図中の符号はそれぞれ次の要素を示す。

1：分注 +攪拌手段 4：希釈手段

2：反応槽 5：粒度分布測定手段

3：電極 （パルス印加手段）

図 2は、 本発明に基づく親和性物質の測定方法の測定原理を示す図である。

図中の符号はそれぞれ次の要素を示す。

100：ラテックス粒子 101：抗体 102：抗原 104：反応槽

3：電極

図 3は、 本発明に基づく親和性物質の測定方法を実施するための具体的な機器 構成を示す図である。

図中の符号はそれぞれ次の要素を示す。

1：分注 +攪拌ュニット 7：シ—スフオロー

2 ：パノレス印力 Πュニッ ト （3a、 3b) 15 8：電極 （コールターカウンター） 3a：電極 （パルス印加） 9：ポンプ

3b ：パルス電源ュニッ ト 10：廃液

4：希釈ュニット 11 ： シース液

5：粒度分布測定ュニット 12：希釈液 （洗浄液）

6：ァノヽ⁰—チヤ一 20 13： コンピュータユニット 図 4は、 図 3の構成を有する測定装置によつて本発明の測定方法を実施したと きに得られた粒度分布の測定結果を示す図である。 図中、 縦軸は粒度分布 (%)を、 横軸は粒子径 m)を示す。

図 5は、 複数組の電極を配置した場合の、 電極の配置と反応空間の体積の例を 示す図である。

図 6は、 図 5のような配置の電極で電圧を印加したときに形成される、 パール チェインの構造の例を示す図である。

図中の符号はそれぞれ次の要素を示す。

3 :電極 （第 1の電極組）

3，：電極 （第 2の電極組）

100 :ラテックス粒子

図 7は、 三次元情報に基く本発明の測定方法と、 二次元情報を観測する公知の 測定方法による測定方法の比較結果を示す図である。 図中、 縦軸は凝集率 (P/T%) を、 横軸は AFP濃度 (ng/mL)を示す。 図 8は、 パールチヱイン化による反応と 3次元情報に基き測定した本発明による 方法の結果を示す図である。 図中の縦軸は凝集率 （P/T%)を、 横軸は CEA濃度 Gig/ mL) を示す。

図 9は、 3 7 °C 2 0分間のインキュベーションによる反応と 3次元情報に基き測 定した公知の方法の結果を示す図である。 図中の縦軸は凝集率 （P/T%)を、 横軸は CEA濃度 （ng/mL) を示す。 発明を実施するための最良の形態

以下、 図面に基づいて本発明を詳細に説明するが、 これらは本発明を限定する ものではない。

1 . 本発明の測定装置による測定例：

図 1 (A) は、 本発明の装置の構成を示す図である。

この装置は、 検体と試薬 1 (緩衝液） を分注して混合し、 更に試薬 2 (ラテツ タス試薬） を分注して混合し、 反応液を調製するための分注 ·攪拌槽を備える。 パルス印加槽 2に反応液を移動させ、 電極 3を介してパルス電圧を数秒から数十 秒間印加して、 パールチヱイン化させる。 反応液はパールチヱイン化された後、 希釈 （希釈槽 4 ) され、 粒度分布を測定する。

図 1 (B ) は、 パルス印加槽の断面を示す図である。 電極間の距離は 0. 5醒、 電 極の厚さは 0. 03讓、 電極の長さは 20nmである。

図 2は、 図 1の装置を使用して測定される生物学的特異的反応の測定原理を示 す図である。 直径が 2 μ ηιのラテックス粒子 1 0 0に、 測定の対象となる物質であ る抗体 1 0 1を結合させたラテックス試薬と、 緩衝液で希釈された検体 1 0 2と を混合して反応液とする。 ラテックス粒子への抗体や抗原などの結合は、 周知の 技術で行うことができ、 疎水結合もしくは化学結合で結合されている。 検体は、 血液、 尿などの体液、 大気、 土壌や河川などからの抽出物が使用される。

図 3に基づいて装置の具体例を示す。 分注 +攪拌ユニット 1により、 血清検体 1 Lとグリシン緩衝液 10 ιχ Lを分取し、 更に 3 a mラテックス粒子に AFP抗体を感作し たラテックス試薬 5 μ Lを採取して混和する。 この反応液を電極 3aを介した反応槽 に送り、 パスル電源 3bから交流電圧 (lOOKHz, 20V/mm) を 30秒間印加して、 ラテ ックス粒子をパールチヱイン化する。 この後、 反応液は希釈槽に移動し、 希釈液 1 2を lmL添カ卩して希釈される。 ここで希釈槽に超音波を 1秒間かけることにより、 抗 原抗体反応に関与していない粒子を完全に再分散させる。 この反応液の粒度分布 測定ュニット 5に送り、 シースフローシステム 7からアパーチャ一 6を通過した際に 電極 8により検出される信号からラテツクス粒子の粒度分布を測定すると図 4に示 すような粒度分布が得られ、 ラテックス粒子の凝集率 （A R ) を、 以下の式によ りして算出し、 予め AFP標準品を同様に測定して得られた検量線から AFP濃度を測 定することができる。

〔式 1〕 A R = ( 2個以上に凝集した粒子数） / (総粒子数） X I 0 0 (%) 各ュニットはコンピュータユニット 1 3により自動制御され作動して測定が行 われ、 測定結果はディスプレイに表示されるというものである。

2 . 本発明の測定方法 （三次元情報） と公知の測定方法 （二次元情報） の比較： 抗ヒ ト AFP抗体感作ラテックス試薬の調製方法

0. 07mg/mLの抗ヒ ト AFP抗体 （IgG) を含むグリシン緩衝液 1. OmLに 1. 0%の φ 3 μ m ラテックス （ポリサイエンス社） を懸濁させたグリシン緩衝液を加え、 室温で 2時 間攪拌した後、 感作したラテックス懸濁液を遠心分離 （1 0 0 0 0 rpm、 10分） し て上清を除去した。 沈殿を 1. 0%牛血清アルブミン-グリシン緩衝液に懸濁させ、 3 7°Cで 1時間インキュベーションした後、 再び遠心分離 ( 1 0 0 0 O rpm 10分） し て上清を除去した。 沈殿を 0. 2%牛血清アルブミン、 10%ショ糖、 50mM NaCl、 0. 09% NaN₃を含むグリシン緩衝液に懸濁させ、 抗ヒト AFP抗体感作ラテックス試薬を調製 した。 この試薬を用いて、 以下の 3とおりの測定方法を実施した。

本法 ( 1 ) 抗ヒト AFP抗体感作ラテックス試薬と AFP標準品 （キヤリブレーター） を用いて、 交流電圧 （100KHz、 12V/讓、 方形波） を 40秒間印加してパールチヱイン化した後、 直ちに電源を切り、 コールターカウンタ一によりラテックス粒子を計数した。 2 個以上に凝集した粒子数 (P)と総粒子数 (T)との比から凝集率を測定した。

本法 （2 )

抗ヒト AFP抗体感作ラテックス試薬と AFP標準品 （キヤリプレーター） を用いて、 交流電圧 （100KHz、 12V/讓、 方形波） を 40秒間印加してパールチヱイン化した後、 直ちに電源を切り 20秒間放置して特異的凝集反応に関与していないラテツクス粒 子を再分散させた。 パールチェイン化及び再分散の工程を 2回繰り返した後、 本法 ( 1 ) と同様にコールターカウンタ一によりラテックス粒子の計数を行って凝集 率を測定した。

比較例

抗ヒト AFP抗体感作ラテックス試薬と AFP標準品 （キヤリブレーター） を用いて、 交流電圧 （100KHz、 12V/腿、 方形波） を 40秒間印加してパールチヱイン化した後、 直ちに電源を切り 40秒聞放置して特異的凝集反応に関与していないラテツクス粒 子を再分散させた。 反応液を顕微鏡で観察し、 得られた顕微鏡映像を CCDカメラを 介してコンピュータ入力して二次元画像解析を行い、 2個以上に凝集した粒子数 (P)と総粒子数 (T)との比から凝集率を測定した。

結果

測定結果を表 1および図 7に示した。 二次元画像解析を利用する公知の測定方 法では、 凝集率が約 1 0 %に収束した。 その結果、 特に低濃度 （0 . 0 0 1 〜 0 . 0 1 ng/mL) における凝集率の変化がわずかしか得られなかった。 低濃度域では粒 子の重なりの影響により、 実際に凝集していない粒子を誤って凝集粒子と判定さ れることによる誤差の影響が大きいことが推測された。 これに対して、 本発明に 基づく、 電気抵抗法を用いた三次元解析では、 低濃度域でもほぼ直線的な凝集率 の低下が観察された。 その結果、 二次元解析法よりも約 1 0倍の高感度化が確認 できた。 すなわち、 本発明の方法においては、 抗原 (AFP)濃度 0. 0 0 1〜1 0 0 Ong/mLにわたつて、 直線的な凝集率の変化が観察された。 特に、 繰り返しパール チェイン化することにより、 特に 0. 1〜1 0 Ong/mLの濃度範囲において更に高 感度化された。

表 1

AFP 凝集率 （％)

比較例 本法 (1) 本法

0.001 0.0 4.9 6.0

0.005 11.7 9.6 12.5

0.01 13.4 11.8 16.0

0.1 19.9 20.3 26.4

1 30.0 30.2 38.0

10 44.1 43.8 50.4

100 58.3 57.8 62.4

1000 73.6 72.6 74.8

実施例 2 粒子測定とアパーチャ一口径の関係

(1) 抗 CEA抗体感作ラテックス試薬 （試薬 2) の調製

0· lmgの抗ヒト CEA抗体 （ダコ社製） を ImLのグリシン緩衝液 （50mMグリシン、 50 mM塩化ナトリウム、 0.09%NaN3含有、 以下 GBSと略す） 1. OmLに 1.0% Φ2μ mラテツ クス （ポリサイエンス社） を懸濁させた GBS ImLを加え、 37°Cで 2時間インキュべ ーシヨンした後、 感作したラテックス懸濁液を遠心分離 （10000rpm、 15分） して 上清を除去した。 沈殿を 2%牛血清アルブミン一 GBSに懸濁させ、 37°Cで 1時間イン キュベーシヨンした後、 再ぴ遠心分離 （10000rpm、 10分） して上清を除去した。 沈殿を 0.2%牛血清アルブミン、 10%ショ糖、 5%塩化コリンを含む GBS, p H8.2に懸 濁させ、 抗ヒト CEA抗体感作ラテックス試薬 （ラテックス濃度 1 % W/V、 2μπι試 薬） を調製した。 同様に、 Φ3 ίΠΐのラテックス （ポリサイエンス社） を使用して 3 Aim試薬を調製した。

(2) 測定装置 コールターカウンター （ベックマンコールター社） と 4種類のアパーチャ一 （口 径 20 m、 50 m、 70/z m、 100 /z m) を使用した。

( 3 ) 測定方法

正常血清 0. 5 Lと試薬 2 0. 5 Lを混合した後、 図 1 (B)の電極付セルに分注し、 交流電圧 （周波数 100KHz、 12V、 方形波） を 60秒間印加してパールチェインを形成 した後、 直ちに電源を切り、 生理食塩水 20mLに添加して転倒混和した。 混和した 反応液中のラテックス粒子をコールターカウンタ一により計数した。

( 4 ) 結果 結果を表 2に示した。

表 2

表 2中 「詰りやすさ 」 とは、 各口径のアパーチャ一を使用して計数したとき の、 アパーチャ一が担体粒子によって詰った頻度を示す。 たとえば、 20 μ ηιのァパ 一チヤ一を使用した場合、 詰りやすさ（%)は 5 0 %以上である。 これは、 反応液中 のラテックス粒子を計数したとき、 2回の測定で少なくとも 1回は、 アパーチャ 一における担体粒子の詰まりが、 測定結果に影響したこと意味している。 測定回 数は、 2 μ ηι試薬と 3 μ ιη試薬の合計である。 つまり 「詰りやすさ（%)」 は、 ァパー チヤ一の詰りやすさを表している。

また 「A/B/C; 可能、 または不可」 とは、 各口径のアパーチャ一を使用して計数 したときの測定精度の評価の比較結果を示している。 評価基準は以下のとおりで ある。 なお SN比とは、 N (noise) ÷S (signal) , すなわち 「誤って凝集粒子として 計数された非凝集粒子 （単粒子） 数」 Z 「真の非凝集粒子 （単粒子） 数」 である 平均粒子径が 2 μπι、 および 3 μπιの試薬を用いたとき、 ブランク検体 （AFP濃度が 検出限界以下） の非凝集粒子 （単粒子） を最も正確にかつ精度良く測定できたァ パーチヤーサイズは 20 /zmであった。 この結果に基づいて、 アパーチャ一サイズ が 20 μηιの条件で計数した非凝集粒子 （単粒子） 数を 「真の非凝集粒子 （単粒 子） 数」 とした。 一方、 各アパーチャ一サイズで計数された非凝集粒子 （単粒 子） 数と 「真の非凝集粒子 （単粒子） 数」 の差が、 各アパーチャ一サイズにおけ る 「誤って凝集粒子として計数された非凝集粒子 （単粒子） 数」 である。

A:ラテックス粒子を計数したとき、 非凝集粒子 （単粒子） と 2個に凝集した 粒子の区別が明確かつ再現性よく測定でき、 その SN比が 1. 5以下の場合

B:SNJ:I^S1. 5〜 3未満の場合

C:非凝集粒子 （単粒子） と 2個に凝集した粒子の区別が明確に測定できない 力 あるいは単粒子が正確に検出できず、 SN比が 3〜 6未満の場合 不可： SN比が 6以上の場合

A/B/Cの順に測定精度が低いことを示す。 2 Z mラテックス粒子の試薬を測定し た場合、 口径 20〜 70 /zmのアパーチャ一は精度良く計数できる （Aまたは B) , 一方、 口径 100 / mのアパーチャ一では測定精度がやや劣る（C)ことを示してい る。

2 μπιクラスの担体粒子を使用する場合は、 口径が 50 /xm以下のアパーチャ一で は詰りやすく、 100 jum以上では測定精度が良くない。 よって、 50以上 100 μη*満のァパチヤ一が適し、 特に口径 70 μηιのアパーチャ一が適していること がわかる。 一方、 3 /zmクラスの担体粒子を測定する場合は、 50〜100/imの ァパチヤ一が適し、 特に口径 70〜100 μηιのアパーチャ一が適していることが わかる。 つまり、 アパーチャ一サイズは、 担体粒子の平均粒径に対して 5倍〜 5 0倍とするのが好ましい。 実施例 3 ラテックスサイズと反応性の関係 ( 1 ) 抗 AFP抗体感作ラテックス試薬の調製

実施例 1と同様に操作して、 抗ヒト AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。 な お、 Φ 2 μ ηι、 3 μιη、 4. 5 μιη、 6 μπι、 1 0 μ mのラテックス粒子を使用して、 5種類の試薬を調製した。 ラテックス粒子濃度はそれぞれ、 1%、 1%、 ヽ 3%、 10% に調整した。

(2) 測定装置

コーノレターカウンターと 2種類のアパーチャ一 （Φ2〃ηιラテックス試薬のみ口 径 70μπιァパチヤ一、他のラテックス試薬は口径 ΙΟΟμπιァパチヤ一） を使用した。

(3) 測定方法

検体 3 Lと抗 AFP抗体感作ラテックス試薬 3 μ Lを混和して、 図 1 (Β)の電極付 セルに分注し、 交流電圧 （周波数 100KHz、 14V、 正弦波） を 40秒間印加してパール チェインを形成した後、 直ちに電源を切り、 生理食塩水 20mLに添加して転倒混和 した。 混和後の反応液中のラテックス粒子をコールターカウンタ一により計数し た。 2個以上凝集した粒子数 (P)と総粒子数 (T)との比から凝集率を測定した。

(4) 結果 結果を表 3に示した。

表 3

粒子径が 3 以下のとき凝集率のシグナルは 40%以上と大きく、 6 /zm以上 では凝集率のシグナルは 20 %以下に低下することがわかる。 この結果と表 2の 結果も合わせて、 本発明ではラテックスの粒子径は、 1〜1 0 jumが好ましく、 2 〜5 μπιが最も好ましいことがわかる。 実施例 4

(1) 抗 CEA抗体感作ラテックス試薬 （試薬²) の調製

実施例 2と同様に、 Φ2μπιのラテックスに抗ヒト CEA抗体を感作して、 抗ヒト CEA抗体感作ラテックス試薬 （ラテックス濃度 1%W/V) を調製した。

(2) グリシン緩衝液 （試薬 1) の調製

0.5%牛血清アルブミン、 0.6mg/mL非特異抑制混合剤を含む GBS， p H8.2を調製し 試薬 1とした。

(3) 測定装置

図 1 (A) の装置おょぴ （B) の電極付セルを使用して、 抗原抗体反応に基づ いて親和性物質 （抗原） を測定した。

(4) 測定方法

0.5%牛血清アルブミンを含む GBSを用いて、 CEA抗原液を希釈して濃度 0、 0.015、 0.03、 0.06、 0.49、 0.98、 1.95、 3.9、 125、 250、 500ng/mLを調整した。 これらの 検体 I Lと試薬 1の 5/zLを混和して、 45°Cで 3分間インキュベーションした後、 試 薬 2を 6 L加え混和した後、 電極付セルに注入した。 このときの最終反応液中のラ テックス濃度は 0. 5%である。 前述の装置を使用して、 室温下、 交流電圧 （周 波数 100KHz、 12V、 方形波） を 60秒間印加してパールチヱインを形成した後、 直ち に電源を切り、 コールターカウンター（アパーチャ一は口径 70 _μπιを使用） によ りラテックス粒子を計数した。 2個以上凝集した粒子数 (Ρ)と総粒子数 (Τ)との比 から凝集率を測定した。

結果は図 8に示した。 比較例 2

実施例 5の各検体と試薬を同量ずつ試験管にとり、 3 7°Cで 2 0分間インキュ ベーションした。 この反応液 0. 5 Lを生理食塩水 20 mLに希釈して、 実施例 5 と同様にコールターカウンターを使用してラテックス粒子の粒度分布を測定して- 同様に凝集率を算出した。 また、 実施例 5と同様に 5回繰り返し測定を行ない、 その結果を表 4、 表 5および図 9に示した。

表 4

パルス ： 100KHz、 ± 12V、 方形波

表 5

対照： 37°C、 20分、 インキュベーション

抗原濃度が oの場合の測定値が、 ある濃度の抗原を測定したときの値と識別で きれば、 この濃度の抗原を測定できる。 測定可能な抗原濃度の最小値が、 検出限 界である。 一般に抗原量 O ng/mLを測定した凝集率の平均値 + 2. 6SDと、 ある濃度 を測定した凝集率の平均値- 2. 6SDの重なりがなければ、 その濃度以上の抗原を検 出することができる。 図 8およぴ図 9から検出限界を比較すると、 本発明の方法 （図 8 ) の検出限界 は 0 . 0 1 5 ng/mLといえる。 一方、 従来法 （図 9 ) においての検出感度は 1 . 9 ng/mLであり、 本発明は 1 0 0倍以上高感度である。 また、 本発明は各抗原量での 再現性も良好であり CV値は概ね 1〜2%であり （抗原量 1. 95ng/mLの同時再現性は、 本発明では CV=1. 33%従来法では CV=9. 86%) 、 抗原量 5 0 0 ng/mLまで良好な直線 性が得られている。 これらのことから、 電圧パルスを印加してパールチェイン化 により反応を促進させた本発明は、 従来法に比べ非常に短時間で更に高感度、 な らびに良好な再現性であり、 且つ直線性良く測定できることがわかる。 産業上の利用の可能性

本発明は、 担体粒子の凝集を利用した、 新規な親和性物質の測定方法を提供す る。 本発明の測定方法は、 担体粒子の凝集を、 粒子の三次元情報に基づいて計数 する。 その結果、 より簡便な操作で、 高精度な測定が可能となる。 また測定のた めの装置は、 安価な構成とすることができる。

また本発明においては、 担体粒子の凝集を、 粒子の三次元情報に基づいて計数 するため、 凝集反応のための反応空間の形状が制限されない。 その結果、 複数組 の電極によって、 異なる方向から電圧パルスを印加することができる。 また反応 空間を大きくすることによって、 感度と再現性の向上が期待できる。

これに対して二次元の情報 （面積） に基づいて担体粒子の凝集を観察する公知 の方法においては、 焦点の合う限られた範囲の粒子し力観察できないため、 反応 空間の形状は著しく制限される。 フォーカスを移動すれば観察範囲を広げること はできるが、 それでも平面的に走查するのが限界である。 このように、 本発明の 測定方法は、 公知の方法に比べて、 より簡便で、 かつ高精度な測定を可能とする 方法である。

更に、 電圧パルスの印加によって反応が促進される結果、 より大きな担体粒子 を利用することができる。 その結果、 測定精度の向上が期待できる。

Claims

請求の範囲 次の工程を含む、 親和性物質の測定方法。

(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒 子と、 測定対象親和性物質とを混合し、 電圧パルスを印加する工程、 または

(1' )測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体 粒子と、 測定対象親和性物質とを、 凝集試薬成分と混合し、 電圧パルスを 印加する工程であって、 前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、 力つ測 定対象親和性物質によつてその凝集は阻害される工程

(2)工程 (1)の後に、 測定対象である親和性物質との結合によつて形成された担 体粒子の凝集塊、 および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成 しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を、 その三次元情報を指標として 計数する工程、 または

(2' )工程（1' )の後に、 凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、 および測定対象である親和性物質との結合によつて凝集を阻害された担体 粒子のいずれかまたは両方を、 その三次元情報を指標として計数する工程、 および .

(3)工程 (2)または (2' )の後に、 凝集塊の形成レベル、 および凝集塊を形成しな かった担体粒子のレベルのいずれか、 または両方に基づいて測定対象物質の レベルを決定する工程 '

. 工程 (2)または (2' )において、 凝集塊または担体粒子の三次元情報を、 物理的 に測定する請求項 1に記載の方法。

. 三次元情報を物理的に測定するための方法が、 電気抵抗法、 レーザー回析散 乱法、 および三次元画像解析法からなる群から選択されたいずれかの方法で ある請求項 2に記載の方法。

. 電圧パルスが交流電圧パルスである請求項 1に記載の方法。

5 . 工程 （2)または (2' )において、 電場を停止後に担体粒子を計数することを特 徴とする請求項 1に記載の方法。

6 . 工程 （2)または（2' )において、 電場を停止後に更に付加的に担体粒子を希釈 する工程を含む請求項 5に記載の方法。

7 . 電圧パルスを複数回与えることを特徴とする請求項 1に記載の方法。

8 . 電圧パルスを印加後に、 担体粒子を分散させてから次の電圧パルスを印加す る工程を含む、 請求項 7に記載の方法。

9 . 複数回の電圧パルスが、 異なる方向の電圧パルスである請求項 7に記載の方 法。

1 0 . 担体粒子の平均粒子径が、 1 /x m以上である請求項 1に記載の方法。

1 1 . 担体粒子の平均粒子径が、 1 ！〜 2 0 μ πιである請求項 1 0に記載の方法。

1 2 . 次の手段を含む、 親和性物質の測定装置。

(a) 測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体 粒子と、 測定対象親和性物質とを保持する空間、

(b) 前記空間に保持された担体粒子に電圧パルスを印加するための電極、 およ び

(c) 前記空間に保持された担体粒子の凝集によって生じた凝集塊、 および凝集 しなかった前記担体粒子のいずれかまたは両方を、 その三次元情報を指標 として計数する手段

1 3 . (c) 前記空間に保持された担体粒子の凝集によって生じた凝集塊、 および 凝集しなかった前記担体粒子のいずれかまたは両方を、 その三次元情報を 指標として計数する手段が、 三次元情報を物理的に測定するための手段で ある請求項 1 2に記載の装置。

1 4 . 三次元情報を物理的に測定するための手段が、 電気抵抗法、 レーザー回析 散乱法、 および三次元画像解析法からなる群から選択されたいずれかの方 法によって三次元情報を物理的に測定するための手段である請求項 1 3に 記載の装置。

少なくとも 2組の電圧パルスを印加するための電極を有する請求項 1 2に 電圧パルスを印加するための電極を駆動する手段を有し、 前記空間に対し て異なる方向の電場を与えることができることを特徴とする請求項 1 2に