KR20070018906A - 친화성 물질의 측정 방법 - Google Patents

친화성 물질의 측정 방법 Download PDF

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게이스케 이와타
유키히토 미즈타니
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펄스이뮤노테크가부시키가이샤
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Abstract

측정 대상인 친화성 물질과, 이 친화성 물질과의 결합 친화성을 갖는 결합 파트너와의 결합 반응이 응집 반응에 의해 측정된다. 결합 파트너는 담체 입자에 결합되어 있으며, 결합 반응에 의해 담체 입자가 응집된다. 본 발명은 전기장을 인가하기 전에 반응액을 인큐베이션함으로써 응집 반응을 증강한다. 또한 본 발명은 전계 중에 놓인 반응액의 온도나 점도의 조정에 의해 응집 반응을 증강한다. 본 발명은 측정 감도의 향상에 공헌한다. 또한, 본 발명은 응집 덩어리의 계수 전에 단체 입자를 포함하는 반응액을 희석하는 공정을 포함한다. 본 발명의 희석 공정은, 친화성 물질과 결합 파트너 간의 결합을 강화한다. 그로 인해 응집 덩어리의 붕괴가 방지되어 측정 감도는 높아진다. 또 희석된 담체 입자와 응집 덩어리는 높은 정밀도로 식별할 수가 있다.

Description

친화성 물질의 측정 방법{Method of measuring affinity substance}
본 발명은 담체 입자의 응집 반응을 이용한 친화성 물질(affinity substance)의 측정 방법 및 장치에 관한 것이다.
친화성 물질의 존재를 검출하거나 측정하는 방법으로는, 예를 들면, 효소 면역 측정법 또는 방사선 면역 측정법 등이 종래부터 사용되고 있다. 어떤 방법으로도 친화성 물질을 그 결합 파트너와 결합시키며, 양자의 결합 레벨에 기초하여 친화성 물질이 측정된다. 이들 방법은 고감도이면서 또한 정밀도도 높다. 그러나 효소 또는 방사성 동위 원소를 표지로 사용하기 때문에 시약이 불안정하다. 또한, 방사성 동위 원소의 이용에 있어서 보관 및 보존상의 규제가 있기 때문에, 측정에 있어서 세밀한 배려나 기술이 요구된다. 이 때문에, 보다 간편한 측정 방법이 요구되고 있었다. 또한, 이 방법들은 비교적 측정 시간이 오래 걸리기 때문에, 긴급한 검사에는 대응하기가 어렵다. 이 배경들을 바탕으로 고감도이면서 신속한 측정 방법이 계속 연구되어 왔다.
1970년 이후, 친화성 물질과 결합 파트너의 결합을 담체 입자의 응집을 지표로 하여 측정하는 분석 방법이 실용화되게 되었다. 이 방법은, 담체 입자의 응집의 정도를 광학적으로 측정함으로써 정량적인 분석을 가능하도록 하였다. 예를 들면, 담체 입자로서 라텍스 입자를 이용한, 면역학적 입자 응집 반응을 광학적으로 측정하는 방법은 라텍스 응집 비탁법(Latex Agglutination Turbidimetry)라고 불리고 있다. 이들 분석 방법에서의 반응 온도는, 일반적으로는 37~45℃의 범위에서 행해지며, 교반 날개 등에 의해 교반함으로써 특이적 응집 반응이 진행된다. 이 때 측정(반응)에 걸리는 시간은 대략 10~20분이며, 효소 면역 측정법 또는 방사선 면역 측정법에 비해서 신속하다. 한편, 측정 감도 또는 측정 범위에 대해서는, 효소 면역 측정법 등에 비해 뒤떨어진다고 한다.
라텍스 응집법에서의 입도 분포 측정법도 잘 알려져 있다(비특허 문헌 1 및 비특허 문헌 2). 라텍스 응집 비탁법이 입자 현탁액의 광 투과도를 측정하는 것이라면, 입도 분포 측정법에서는 분산된 개개의 입자의 상태나 수가 측정된다. 캄비아소 등의 보고에서는 입자의 직경이 0.8μm인 라텍스에 항체를 결합시킨 시약과 항원을 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 후의 입자수를 계수하고, 응집에 의한 입자수의 감소 레벨에 의거하여 항원을 측정했다. 입자수는 레이저 산란광을 원리로 한 계수기로 측정했다.
한편, 마츠자와 등은 입자의 직경이 1μm인 라텍스 입자에 항체를 결합시킨 시약을 항원과 6시간 반응시켰다. 반응 후, 전기 저항법으로 평균 입자의 용적을 계측하여 항원을 측정했다. 그러나 실용화되어 보급된 것은 쉬스 플로우(sheath Flow)에 의한 레이저 산란법을 이용한 PAMIA 시스템(시스멕스 주식회사)뿐이다. PAMIA에서는, 입자의 직경이 0.78μm인 라텍스 입자가 사용되고 있다. 45℃에서 15분간 반응시킨 후에 라텍스 입자를 계수하여 면역 측정을 행하는 것이다. PAMIA는 라텍스 응집 비탁법에 비해 고감도화되어 있으나, 방사 면역 측정법(RIA)이나 효소 면역 측정법(EIA)과 같은 고감도 면역 측정법에 비하면 감도는 떨어진다고 한다.
라텍스 응집 비탁법에서는, 일반적으로 입자의 직경이 0.05~0.6μm인 라텍스 입자가 사용되고 있다. 라텍스 응집 입도 분포 해석법의 경우, 이와 같이 작은 입자에서는 측정 방해 물질의 영향을 받기가 쉽다. 예를 들면, 혈액이나 소변 등의 체액 중에는 지질, 단백, 혈구 성분 등이 공존한다. 이들 공존 물질은 담체 입자와의 식별이 어렵다. 이 때문에 담체 입자를 제대로 계수할 수 없게 만드는 이러한 측정 방해 물질들의 영향을 회피하기 위해서, 비교적 큰 입자가 사용되어 왔다. 한편, 마츠자와 등과 같이 1μm 정도의 입자 직경이 되면 응집 반응이 일어나기 어려워지므로, 0.8μm 정도의 라텍스 입자가 사용되고 있었다. 또한, 마츠자와 등이 평균 입자의 용적을 계측하는 데 사용한 어퍼쳐(aperture)(세공)의 구경은 30μm이다. 이 사이즈에서는 어퍼쳐가 막히는 현상의 영향을 받기가 쉽다. 그러나, 이보다 큰 구경의 어퍼쳐에서는 0.8~1μm의 입자를 검출할 수 없게 된다.
또한, 친화성 물질과 결합 파트너의 결합에 기초하는 담체 입자의 응집을 촉진하며, 또한 형성되는 응집 덩어리의 검출을 용이하도록 하기 위해서, 반응계에 교류 전압을 인가하는 방법이 알려져 있다(특개평7-83928호/특허 문헌 1). 이 방법은, 담체 입자의 응집에 의해 친화성 물질의 존재를 검출하거나 측정하는 방법으로, 10mM 이상의 염의 공존하에 5~50V/mm의 전계(電界) 강도가 되도록 교류 전압을 그 반응계에 인가하는 것을 특징으로 한다.
결합 파트너를 보유한 담체 입자는 전기장에 놓여지면, 전기장을 따라서 나 열된다(펄 체인화). 그 후 전기장을 정지하면 나열되어 있던 담체 입자가 재분산된다. 펄 체인화시에 친화성 물질이 존재하면, 결합 파트너가 친화성 물질과 결합한다. 그 결과, 전기장을 정지한 후에도 담체 입자의 재분산이 일어나지 않고, 펄 체인화된 담체의 존재가 계속해서 인지된다. 상기 측정 방법은 이 현상을 이용하고 있다. 즉, 전기장에서는 친화성 물질의 반응이 촉진된다. 그리고 전기장을 정지한 후에 담체 입자를 재분산시키면, 반응 생성물인 담체 입자의 응집 덩어리를 검출할 수 있다.<특허 문헌 1:특개평7-83928호, 비특허 문헌 1:캄비아소 등, J. Immunol. Methods 18, 33, 1977 , 비특허 문헌 2:마츠자와 등, 화학과 공업, 제36권, 제4호, 1982>
본 발명은 친화성 물질과 결합 파트너의 결합에 의해 담체 입자를 응집시키는 방법에 있어서, 양자의 결합을 촉진할 수 있는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명의 과제는 양자의 결합 방해 요인의 영향을 억제하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 전기장의 인가를 이용한 친화성 물질의 측정 방법에 있어서, 친화성 물질의 반응은 결합 파트너를 보유한 담체 입자의 펄 체인화시에 일어난다. 양자의 반응에 의해 응집된 담체 입자가 결합의 지표로서 검출 또는 측정된다. 따라서, 양자의 반응을 촉진할 수 있다면 반응 효율의 향상을 실현할 수 있다고 생각된다. 또는, 반응을 방해하는 요인을 알아내어 그 영향을 제거하는 방법을 제공하는 것은 유용하다.
본 발명의 또 다른 과제는 펄 체인화에 의해 형성된 응집 덩어리의 검출에 있어서, 희석의 영향을 받기 어려운 친화성 물질의 측정 방법과, 이를 위한 장치를 제공하는 것이다. 상기한 바와 같이, 담체 입자의 응집을 계수하여 친화성 물질을 측정하는 방법에서는, 응집 덩어리와 응집하지 않은 담체 입자의 식별 결과가 측정 결과에 큰 영향을 미친다. 그러나 담체 입자가 응집 덩어리를 형성하지 않은 경우라도 입자끼리 중첩되어 보이는 위치 관계에 있으면, 응집 덩어리로서 계수될 가능성이 있다. 본 발명자들은 입자의 3차원 정보를 기초로 응집 입자를 계수함으로써 입자간의 중첩 문제를 해소할 수 있다는 것을 알아냈다. 그러나, 3차원 정보에 기초하는 해석에서도, 입자 농도가 진한 상태에서는 여러 개의 입자가 동시에 검출되는 경우가 있다. 즉, 응집되지 않은 복수의 담체 입자가 응집 덩어리로서 계수되는 경우가 있음이 확인되었다.
미리 입자 농도를 낮게 설정해두면, 응집 입자의 식별에 있어서 입자의 중첩을 회피할 수 있을 수도 있다. 그러나 입자의 농도가 낮은 조건하에서는 펄 체인화가 어렵다. 펄 체인화에 의한 입자 응집 반응을 위해서는, 어느 정도의 입자 농도가 필요하다. 즉, 이상적으로는 펄 체인의 형성 공정에서는 입자의 농도를 높게 하고, 다음에 응집 입자의 검출 공정에서는 입자의 농도를 낮게 하면 된다. 입자의 농도를 낮추기 위해서는, 예를 들면 담체 입자를 포함하는 반응액을 희석하면 된다.
그러나 실제로는 반응액의 희석에 의해 형성된 응집 덩어리가 붕괴된다. 이 결과, 응집 입자의 수가 실제보다 낮게 계수된다. 즉 희석에 의해 마이너스 오차가 발생하게 된다. 본 발명에서는, 펄 체인화에 의해 형성된 응집 덩어리의 검출에 있어서 희석의 영향을 받기 어려운 친화성 물질의 측정 방법과, 이를 위한 장치를 제공한다.
본 발명자들은, 친화성 물질과 결합 파트너의 결합 효율을 향상시키기 위한 방법을 알아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 펄 체인화된 담체 입자가 보유하고 있는 결합 파트너가 친화성 물질과 효율적으로 결합하기 위해서는, 가능한 한 많은 친화성 물질이 결합 파트너와 접촉하는 조건을 제공하면 될 것이다. 다시 말해, 결합 파트너와의 접촉 기회를 놓친 친화성 물질이 많은 조건은, 반응 효율이 낮은 조건이라고 할 수 있다. 이러한 조건하에서는, 양자의 결합을 담체 입자의 응집에 의해 검출하는 측정 방법에서는 측정 감도의 향상이 방해될 가능성이 있다. 이러한 문제는 본 발명에 의해 해결된다.
또한, 전압을 인가받은 반응액의 온도는 주울(Joule)열에 의해 상승한다. 본 발명자들은 반응액의 온도가 친화성 물질-결합 파트너간의 반응에 미치는 영향에 대해서 해석했다. 그 결과, 반응액의 온도 상승이 양자의 결합을 저해하는 작용을 할 가능성이 있음을 알아냈다. 그리고, 전기장을 인가하고 있는 반응액의 온도 조건의 제어에 의해 적합한 반응 조건을 실현할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉 본 발명은 이하의 측정 방법, 측정 장치, 또는 결합 파트너를 보유한 담체 입자의 친화성 물질에 의한 응집을 촉진시키기 위한 방법을 제공한다.
[1]다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법.
(1)측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액을 인큐베이션(incubation)하는 공정,
(2)공정 (1)의 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,
(3)공정 (2) 후에, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두 계수하는 공정 및
(4)공정 (3) 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나, 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
[2]공정 (1)이 상기 반응액을 37~90℃에서 인큐베이션하는 공정인 [1]에 기재된 방법.
[3]공정 (1)이 상기 반응액을 40~90℃에서 인큐베이션하는 공정인 [2]에 기재된 방법.
[4]상기 반응액 중에 수용성 고분자가 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 방법.
[5]공정 (2)에서의 반응액의 점도를 0.8~3mPas로 조정하는 [1]에 기재된 방법.
[6]공정 (2)를 0~20℃에서 행하는 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 친화성 물질의 측정 방법.
[7]공정 (2)를 0~10℃에서 행하는 것을 특징으로 하는 [6]에 기재된 친화성 물질의 측정 방법.
[8]응집 덩어리 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 그 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 [1]에 기재된 방법.
[9]친화성 물질과 결합 파트너의 결합이 항원 항체 반응에 의한 결합인 [1]에 기재된 방법.
[10]친화성 물질이 항원이고, 결합 파트너가 항체 또는 그 항원 결합 영역을 포함하는 단편인 [9] 에 기재된 방법.
[11]친화성 물질이 항체 또는 그 항원 결합 영역을 포함하는 단편이고, 결합 파트너가 항원 또는 그 항원 결정기를 포함하는 단편인 [9]에 기재된 방법.
[12]전압 펄스가 교류 전압 펄스인 [1]에 기재된 방법.
[13]다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법:
(1')적어도 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 포함하는 반응액을 응집 시약 성분과 혼합하기 전 또는 후에 인큐베이션하는 공정으로서, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집되며, 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집이 방해되는 공정,
(2')응집 시약 성분의 존재하에서 공정 (1')의 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,
(3')공정 (2') 후에, 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 방해된 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
(4')공정 (3') 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정
[14]공정 (1')에서 상기 반응액을 인큐베이션한 후, 공정 (2') 전에 응집 시약을 혼합하는 [13]에 기재된 방법.
[15]응집 시약을 혼합한 후, 공정 (2) 전에 다시 인큐베이션하는 공정을 포함하는 [13]에 기재된 방법.
[16]공정 (1')에서, 상기 반응액을 응집 시약의 존재하에서 인큐베이션한 후, 공정 (2')를 실시하는 [13]에 기재된 방법.
[17]특정 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 상기 특정 물질을 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 수단을 포함하는 담체 입자를 응집시키기 위한 장치에 있어서, 반응액의 온도를 37℃~90℃로 가열하기 위한 수단을 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
[18]특정 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 상기 특정 물질을 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정을 포함하는 담체 입자를 응집시키기 위한 방법에 있어서, 전압을 인가하는 동안의 반응액의 온도를 0℃~20℃로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
[19]결합 파트너와 특정 물질과의 결합이 항원 항체 반응인 [18]에 기재된 방법.
[20]전압 펄스가 교류 전압 펄스인 [18]에 기재된 방법.
[21]반응액에 수용성 고분자를 첨가하는 [18]에 기재된 방법.
[22]반응액의 점도를 0.8~3mPas로 조정하는 [18]에 기재된 방법.
[23]상기 담체 입자와 특정 물질을 전압 펄스를 인가하기 전에 37℃~90℃에서 인큐베이션하는 공정을 포함하는 [18]에 기재된 방법.
[24]특정 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 상기 특정 물질을 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 수단을 포함하는 담체 입자를 응집시키기 위한 장치에 있어서, 전압을 인가하는 동안의 반응액의 온도를 0℃~20℃로 하기 위한 수단을 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
[25]이하의 요소를 포함하는, 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정할 친화성 물질과의 결합을 상기 담체 입자의 친화성 물질 또는 응집 시약에 의한 응집을 지표로 하여 측정하기 위한 측정 장치:
a:반응액을 보유하기 위한 공간,
b:반응액의 온도를 37℃~90℃에서 인큐베이션하기 위한 수단,
c:반응액에 전압 펄스를 인가하기 위한 수단,
d:펄스 전압의 인가 시의 반응액의 온도를 0℃~20℃로 하기 위한 수단, 및
e:반응액에 포함되는 담체 입자와 담체 입자의 응집 덩어리 중 어느 하나 또는 모두를 계수하기 위한 수단.
또한, 본 발명자들은 담체 입자의 응집 덩어리의 검출 공정에 대해서 검토를 거듭했다. 그리고, 펄 체인화 후의 반응액을 희석하는 공정에서, 응집 덩어리를 형성하는 결합을 강화할 수 있는 수단을 이용하면, 희석에 따른 불이익을 해소할 수 있을 것으로 생각했다. 또한, 희석에 따른 불이익을 방지하기 위한 효과적인 수단을 알아내고, 그 효과를 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하의 측정 방법 및 측정 장치에 관한 것이다.
[26]다음 공정 (1)~(3) 또는 (1')~(3')을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법에 있어서, 공정 (2)또는 (2') 전에 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너와의 결합을 강화하는 수단에 의해 반응액을 희석하는 공정을 포함하는 방법:
(1)측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,
(2)공정 (1) 후에, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
(3) 공정 (2) 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정, 또는
(1')측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합시킨 담체 입자와 측정 대상 친화성 물질을 응집 시약 성분과 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정으로서, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하며, 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집이 방해되는 공정,
(2')공정 (1') 후에, 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 방해된 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
(3') 공정 (2') 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
[27]반응액을 희석하는 공정이 전압 펄스의 인가 조건하에서 반응액과 희석액을 혼합하는 공정인 [26]에 기재된 방법.
[28]전압 펄스가 교류 전압인 [27]에 기재된 방법.
[29]교류 전압이 2KHz~20MHz의 주파수인 [28]에 기재된 방법.
[30]반응액을 희석하는 공정이, 전압 펄스의 인가 조건하에서 반응액과 희석액을 혼합한 후, 전기장을 정지한 후에 다시 부가적으로 담체 입자를 희석하는 공정을 포함하는 [27]에 기재된 방법.
[31]반응액을 희석하는 공정이, 측정 대상 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너 사이의 결합을 강화하는 결합 강화제를 반응액에 첨가한 후에 반응액과 혼합하거나, 상기 결합 강화제를 포함하는 희석액으로 반응액을 희석하는 공정인 [27]에 기재된 방법.
[32]반응액을 희석하는 공정이, 측정 대상 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너 사이의 결합을 강화하는 결합 강화제를 반응액에 첨가한 후에 반응액을 희석액과 혼합하거나, 상기 결합 강화제를 포함하는 희석액으로 반응액을 희석하는 공정인 [26]에 기재된 방법.
[33]측정 대상 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너와의 결합이 면역학적인 결합인 [32]에 기재된 방법.
[34]항원이 단백질 항원이고, 결합 강화제가 글루타르알데이드 및 카르보디이미드에서 선택되는 어느 하나 또는 모두의 화합물인 [33]에 기재된 방법.
[35]반응액을 희석하는 공정이, 전압 펄스의 인가 조건하에서 반응액과 희석액을 혼합하는 공정인 [32]에 기재된 방법.
[36]공정 (1) 또는 (1')에서의 전압 펄스가 교류 전압 펄스인 [26]에 기재된 방법.
[37]공정 (1) 또는 (1')에서 전압 펄스를 복수회 부여하는 것을 특징으로 하는 [26]에 기재된 방법.
[38]공정 (1) 또는 (1')에서 전압 펄스를 인가한 후, 담체 입자를 분산시키고 나서 다음 전압 펄스를 인가하는 공정을 포함하는 [37]에 기재된 방법.
[39]복수회의 전압 펄스가 다른 방향의 전압 펄스인 [37]에 기재된 방법.
[40]담체 입자의 평균 입자 직경이 1μm 이상인 [26]에 기재된 방법.
[41]담체 입자의 평균 입자 직경이 1μm~20μm인 [40]에 기재된 방법.
[42]공정 (2) 또는 (2')에서 응집 덩어리 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 [26]에 기재된 방법.
[43]공정 (2) 또는 (2')에서 응집 덩어리 또는 담체 입자의 3차원 정보를 물리적으로 측정하는 [42]에 기재된 방법.
[44]3차원 정보를 물리적으로 측정하기 위한 방법이 전기 저항법, 레이저 회절 산란법 및 3차원 화상 해석법으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 방법인 [43]에 기재된 방법.
[45]이하의 요소를 포함하는, 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와 측정할 친화성 물질과의 결합을, 상기 담체 입자의 친화성 물질 또는 응집 시약에 의한 응집을 지표로 하여 측정하기 위한 측정 장치:
a:측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와 측정할 친화성 물질을 포함하는 시료를 포함하는 반응액, 또는 다시 부가적으로 응집 시약을 포함하는 반응액을 보유하기 위한 공간,
b:반응액에 전압 펄스를 인가하기 위한 수단,
c:반응액을 희석하기 위한 수단, 및
d:반응액에 포함되는 담체 입자와 담체 입자의 응집 덩어리 중 어느 하나 또는 모두를 계수하기 위한 수단.
[46]반응액을 희석하기 위한 수단이 전압 펄스의 인가 조건하에서 반응액과 희석액을 혼합하기 위한 수단인 [45]에 기재된 장치.
[47]반응액을 희석하기 위한 수단이, 측정 대상 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너 사이의 결합을 강화하는 결합 강화제를 반응액에 첨가하기 위한 수단을 포함하는 [45]에 기재된 장치.
본 발명에 의해 전기장을 인가한 반응액에서의, 결합 파트너를 보유한 담체 입자의 친화성 물질과의 결합 반응을 촉진하기 위한 방법, 또는 그 반응을 방해하는 요인의 영향을 억제하기 위한 방법이 제공되었다. 담체 입자의 응집을 지표로 하는 친화성 물질의 측정에 있어서 적합한 반응 조건을 나타낸 보고는 많지 않다. 본 발명에 의해, 예를 들면 담체 입자의 응집을 지표로 하는 면역학적 결합 반응을 이용한 측정 방법의 감도 상승 또는 반응 시간의 단축을 실현할 수 있다. 본 발명은 상기 반응의 최적화에 공헌한다.
또한, 본 발명에 의해, 예를 들면 담체 입자의 응집을 지표로 하는 면역학적인 결합 반응을 이용한 측정 방법의 감도 상승 또는 재현성의 향상을 실현할 수 있다. 본 발명은 상기 반응의 최적화에 공헌한다. 전압 펄스를 인가한 반응액에 있어서, 담체 입자에 보유된 결합 파트너와 친화성 물질(또는 응집 시약)과의 결합 반응에 의해 응집 덩어리가 형성된다. 본 발명에서는 응집 덩어리의 검출에 있어서, 이 결합 반응을 강화하는 수단에 의해 반응액을 희석한 후에 응집 덩어리가 검출된다. 결합 반응을 강화하는 수단으로는, 전압 펄스 인가 조건하에서의 반응액의 희석 또는 결합 강화제를 사용할 수 있다. 결합 반응을 강화하는 수단을 채용함으로써 응집 덩어리의 희석에 따른 여러 가지 장해를 피할 수 있다. 즉, 희석된 담체 입자는 서로 중첩되어 검출될 가능성이 적다. 이 결과, 입자의 중첩을 실수로 응집 덩어리로 검출하는 오차를 막을 수 있다. 한편, 응집 덩어리의 구조는 결합 강화에 의해 유지된다. 이 때문에, 희석에 동반하여 응집 덩어리가 붕괴되어 검출할 수 없게 되는 문제를 피할 수 있다. 이렇게 하여, 본 발명에 의해 재현성 및 감도의 향상을 실현할 수 있게 된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법에 관한 것이다:
(1)측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액을 인큐베이션하는 공정,
(2)공정 (1)의 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,
(3)공정 (2) 후에, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
(4)공정 (3) 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
본 발명은 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액을 전압 펄스를 인가하기 전에 인큐베이션하는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명자들은 전압 펄스 인가 전의 반응액의 인큐베이션에 의해 전압 펄스 인가 후의 응집 덩어리의 형성이 촉진됨을 알아냈다. 즉, 전압 펄스 인가 전의 인큐베이션에 의해 반응이 촉진된다.
본 발명에서 반응액의 인큐베이션은, 예를 들면 실온 이상의 온도에서 실시된다. 인큐베이션의 온도는 반응액에 포함되는 각종 반응 성분의 활성을 유지할 수 있는 한 가능하면 고온인 것이 바람직하다. 인큐베이션 시간은 한정되지 않는다. 즉 인큐베이션 온도에 있어서, 반응 성분의 변성을 가져오지 않는 범위에서 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 시간은 길수록 촉진 효과도 증대된다. 따라서, 필요한 정도의 촉진 효과를 기대할 수 있는 온도와 시간 조건을 미리 설정하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 예를 들면 인큐베이션을 위한 온도 조건으로 일반적으로 37~90℃, 바람직하게는 40~90℃ 또는 45~80℃를 들 수 있다. 예를 들면 친화성 물질인 단백질 항원을, 결합 파트너인 항체를 사용하여 본 발명에 의거하여 측정할 수 있다. 항체나 항원을 구성하는 단백질은 고온에서는 변성된다고 알려져 있다. 그러나, 예를 들면 혈청을 고정시키기 위해 이용되는 일반적인 조건인 56℃, 30분이라는 인큐베이션 조건에서는 많은 단백질이 변성되지는 않는다. 또한 본 발명자들은 이뮤노어세이(immunoassay)와 같은 낮은 단백질 농도의 조건에서, 짧은 시간동안의 처리라면 90℃ 정도의 온도에서도 단백질의 변성은 무시할 수 있음을 알아냈다. 예를 들면 45~80℃의 범위에서 5~180초간의 인큐베이션은, 거의 같은 정도의 반응 촉진 효과를 얻을 수 있음이 확인되었다(도 3). 따라서, 본 발명에서의 바람직한 인큐베이션 조건으로서, 바람직하게는 45~80℃, 보다 바람직하게는 50~65℃에서 5초 이상, 예를 들면 5~30초를 들 수 있다.
본 발명에서는 더 긴 인큐베이션 시간도 포함되는 것은 당연하다. 그러나, 반응 시간의 단축이 요구되는 경우에는 5초 이상의 짧은 시간을 채용함으로써, 반응 시간을 희생으로 하지 않고 목적으로 하는 반응 촉진 효과를 기대할 수 있다. 또한, 예를 들면 80℃를 넘는 고온 조건에서는, 인큐베이션 시간을 5~180초로 함으로써 단백질의 변성을 피할 수 있다.
또는, 본 발명의 방법을 내열성의 물질 반응에 응용하는 경우에는, 고온 조건은 문제가 되지 않는다. 예를 들면 DNA는 고온 조건하에서도 매우 안정적이다. 따라서, DNA간의 결합을 담체 입자의 응집에 의해 측정하고자 하는 경우에는, 인큐베이션을 위한 온도로서 보다 높은 온도를 선택할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 인큐베이션에 의해 반응이 촉진되는 메카니즘은 다음과 같이 설명할 수 있다. 전압 펄스의 인가에 의해 정렬된 담체 입자는, 그 위에 고정된 결합 파트너가 친화성 물질을 통해서 다른 담체 입자 상의 결합 파트너와 가교됨으로써 응집 덩어리를 구성한다. 일련의 반응은 담체 입자가 정렬되었을 때에 일어난다고 생각되고 있었다. 그러나 본 발명자가 얻은 정보에 의하면, 전압 펄스 인가 전의 인큐베이션이 반응 효율화에 공헌한다는 것이 확인되었다. 또한, 이 인큐베이션 동안에, 담체 입자 상의 결합 파트너에 친화성 물질이 결합한 상태가 형성된다는 것도 알아냈다. 즉, 전압 펄스 인가에 의해 담체 입자를 정렬시키기 전에, 결합 파트너가 친화성 물질을 포착한 상태로 해 두는 것이 반응을 효율화시킨다고 생각된다.
전압 펄스를 인가받지 않은 조건하에서는, 전압 펄스 인가시에 비해서 담체 입자의 자유도는 훨씬 크다고 생각된다. 따라서, 담체 입자 상의 결합 파트너와 친화성 물질은 접촉할 수 있고, 결합 파트너는 친화성 물질을 포착할 수 있다. 여기에 전압 펄스를 인가하면, 친화성 물질을 포착한 결합 파트너를 갖는 담체 입자는 다른 담체 입자와 함께 전기장에 정렬된다. 이 때 결합 파트너는 이미 친화성 물질을 포착하고 있으므로, 접근한 다른 담체 입자의 결합 파트너와의 결합에 의해 조속히 응집 덩어리가 형성된다. 전기장이 단속적으로 인가되고, 담체 입자의 정렬과 분산이 반복됨으로써 접촉 기회가 증가하여 응집 덩어리의 형성이 촉진된다.
즉, 전압 펄스의 인가 후에 담체 입자의 응집을 검출하고, 그 응집을 지표로 하여 친화성 물질을 측정하는 방법에서는, 담체 입자의 응집 덩어리는 이하의 1차 반응과 2차 반응을 거쳐 형성된다고 할 수도 있다.
1차 반응:담체 입자 상의 결합 파트너가 친화성 물질을 포착하는 반응. 이 때, 친화성 물질을 통한 담체 입자간의 가교 구조는 반드시 형성되지 않아도 된다.
2차 반응:복수의 담체 입자 상의 결합 파트너가 친화성 물질에 결합하는 반응. 이 결과, 친화성 물질을 매개로 한 담체 입자간의 가교 구조(즉 응집 덩어리)가 형성된다.
2차 반응은 전압 펄스의 인가에 의해 촉진된다. 그러나, 지금까지 1차 반응을 촉진하기 위한 구체적인 조건은 명확히 알려져 있지 않았다. 따라서, 본 발명은 1차 반응의 촉진을 위한 조건을 제공했다고 받아들일 수도 있다. 즉 본 발명에서의 전압 펄스의 인가 전의 인큐베이션 공정은 1차 반응의 촉진을 위한 공정이라고 말할 수도 있다.
본 발명에서는 전압 펄스를 인가하기 전의 반응액 중에 수용성 고분자 화합물을 첨가할 수 있다. 수용성 고분자 화합물의 존재하에서, 친화성 물질과 결합 파트너의 결합을 입자 응집 반응에 의해 검출함으로써 응집 반응 강화 또는 안정화를 달성할 수 있다. 반응액 중의 수용성 고분자 화합물의 농도는, 예를 들면 0.05~5%에서 적당히 선택할 수 있다. 보다 바람직하게는 0.1~3%, 더 바람직하게는 0.3~1%이다. 응집 반응 강화 작용이 강한 화합물은, 5%를 넘는 농도에서 비특이적 응집 반응의 가능성을 크게 하는 경향이 있다. 또 0.05% 이하의 낮은 농도에서는 그 효과를 충분히 기대할 수 없는 경우가 있다.
수용성 고분자 화합물로는 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 카르복시메틸셀룰로오스 등을 사용할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 6000~2000000이 바람직하다. 이 수용성 고분자 화합물들은 한가지 종류일 수도 있고, 두 가지 이상의 종류를 조합할 수도 있다. 수용성 고분자 화합물을 반응액에 첨가하기 위해서는, 입자 담체를 포함하는 시약 중에 미리 필요량을 첨가해 놓을 수 있다. 또는 수용성 고분자 화합물을 입자 담체와는 다른 시약으로 하여 혼합할 수도 있다. 예를 들면, 샘플의 희석액 중에 수용성 고분자 화합물을 첨가해 놓을 수도 있다. 또한, 혼합되는 복수의 시약 및 희석액 중에 첨가해 놓을 수도 있다.
바람직하게는, 두 가지 시약계로 하여, 완충액 등의 제 1 시약에 함유시켜 두고, 담체를 포함하는 제 2 시약과 혼합하여 측정에 사용한다. 이 때, 제 1 시약 중에는 이호성 항체(heterophile antibody) 등의 비특이 물질을 흡수하는 비특이 흡수제나 류머티즘 인자를 흡수하기 위한 물질을 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 전압 펄스의 인가 전 인큐베이션에 의한 반응 효율의 향상은 응집 저지 반응에 응용할 수도 있다. 즉, 본 발명은 다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법을 제공한다. 인큐베이션의 조건은 상기 조건과 마찬가지이다. 또한, 응집 저지 반응계에서도 반응액에 수용성 고분자 화합물을 첨가할 수 있다.
(1') 적어도 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 포함하는 반응액을 응집 시약 성분과 혼합하기 전 또는 후에 인큐베이션하는 공정으로서, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하며, 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집은 방해되는 공정,
(2')응집 시약 성분의 존재하에서 공정 (1')의 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,
(3') 공정 (2') 후에, 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 방해된 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
(4) 공정 (3') 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
상기한 바와 같이, 전압 펄스의 인가 전의 반응액의 인큐베이션은 담체 입자의 응집 반응의 촉진에 효과적이다. 이 때, 인큐베이션의 온도는 높을수록 더욱 효과가 높다는 것은 이미 위에서 설명했다. 한편, 전압 펄스를 인가받은 반응액의 온도는 주울열로 인해 상승한다. 도체에 전류가 흐를 때, 도체에서 발생하는 열이 주울열이다. 본 발명자는 인큐베이션에서의 고온 조건이 응집 반응에 촉진적으로 작용하는 것에 반해서, 전압 펄스 인가시의 온도 상승이 응집 반응에 대해서 방해적으로 작용한다는 것을 알아냈다. 따라서, 전압 인가시에는 반응액의 온도를 낮게 유지하는 것이 유리하다.
즉, 본 발명은 특정 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 상기 특정 물질을 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정을 포함하는 담체 입자를 응집시키기 위한 방법에 있어서, 전압을 인가하는 동안의 반응액의 온도를 0℃~20℃로 하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은, 예를 들면 담체 입자의 응집을 지표로 하여 친화성 물질을 측정하는 방법에 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법이 본 발명에 의해 제공된다.
(1)측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액에, 0℃~20℃의 조건하에서 전압 펄스를 인가하는 공정,
(2)공정 (1) 후에, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
(3)공정 (2) 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
또는, 본 발명은 다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법을 제공한다.
(1')적어도 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질 및 응집 시약 성분을 포함하는 반응액에 0℃~20℃의 조건하에서 전압 펄스를 인가하는 공정,
(2')공정 (1') 후에, 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 방해된 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
(3)공정 (2') 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
본 발명에 있어서, 전압 펄스 인가시의 온도는 일반적으로 0~20℃, 예를 들면 0~15℃, 바람직하게는 1~8℃, 또는 2~4℃이다. 전압 펄스의 인가에 의해 반응액의 온도는 상승한다. 따라서 반응액의 온도를 낮게 유지하기 위해서는, 냉각 수단을 이용하는 것이 유리하다. 국소적으로 저온 환경을 만들어 내기 위한 적합한 냉각 수단으로, 예를 들면 펠티에 소자를 들 수 있다. 펠티에 소자란, 펠티에(Jean Charles A. Peltier)에 의해 발견된 펠티에 효과를 이용한 반도체로 구성되는 전자 소자이다. N형과 P형의 반도체에 직류 전류를 흘려 보내면, 반도체의 한쪽에서 온도가 흡수되고, 다른 쪽에서 방열이 일어난다(열교환 현상). 온도가 흡수되는 쪽의 온도는 저하되어 냉각된다. 시판되는 펠티에 소자는 일반적으로 -1O℃ 전후의 냉각 능력을 가지고 있다. 펠티에 소자의 냉각 능력은, 반도체에 공급하는 전류에 의해 자유롭게 제어할 수 있다. 따라서, 전압 펄스를 인가하는 동안에 온도 센서로 반응액의 온도를 감시하고, 필요에 따라서 펠티에 소자를 작동시킴으로써 소정의 온도 범위로 반응액의 온도를 유지할 수 있다.
또는, 전압 펄스 인가시에 반응액을 충분히 냉각하고, 전압 펄스의 인가 후에도 반응액의 온도가 소정 범위에 있는 경우에는, 전압 펄스 인가시의 냉각은 반드시 필요한 것은 아니다. 예를 들면, 전압 펄스의 인가 종료시의 반응액의 온도가 20℃ 이하이면, 인가 동안의 냉각 없이도 필요한 온도 조건을 만족시킬 수 있다. 미리 충분히 반응액을 냉각하고, 또한 필요에 따라서, 반응액이 놓여지는 환경의 온도 상승을 억제할 수 있다면, 전압 펄스 인가 동안의 적극적인 냉각이 반드시 필요한 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 전압 펄스를 인가하는 반응액은 미리 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션을 위한 조건은 상술한 바와 같다. 반응액이 37~90℃의 고온에서 인큐베이션된 경우에는, 전압 펄스를 인가하기 전에 충분히 냉각한다. 통상적으로, 반응액의 부피는 1mL 이하이므로, 반응액은 매우 단시간에 냉각할 수 있다. 고온에서 인큐베이션한 반응액을 냉각하고 0~20℃에서 전압 펄스를 인가하는 조건은, 본 발명에서의 바람직한 조건이다.
전압 펄스 인가시의 온도 상승이 응집 반응에 방해적으로 작용하는 메카니즘은 다음과 같이 생각할 수 있다. 전압 펄스를 인가받은 반응액 중에서는 담체 입자의 정렬과 분산이 반복되고 있다. 담체 입자 상의 결합 파트너와 반응액 중의 친화성 물질(또는 응집 시약 성분)과의 접촉 기회를 증가시키기 위해서는, 담체 입자의 분산이 효과적이다. 동시에, 복수의 담체 입자를 친화성 물질(또는 응집 시약 성분)과의 결합에 의해 가교하고 응집 덩어리를 형성하기 위해서는, 담체 입자의 정렬이 효과적이다. 그러나 반응액에서의 담체 입자의 움직임이 심한 경우에는, 담체 입자가 충분히 정렬되지 못할 가능성이 있다. 반응액의 온도가 상승한 상태는, 반응액에 포함되는 담체 입자의 브라운 운동이 심해져, 전압 인가시의 담체 입자의 정렬이 어려워져 있는 상태라고 할 수 있다. 그 결과, 전압의 인가에 의한 담체 입자의 정렬이 방해되어 응집 반응이 방해된다. 본 발명에 따라서 전압 펄스 인가시의 반응액의 온도가 제어된 경우에는, 전압 인가에 의한 담체 입자가 정렬되는 효과가 충분히 얻어져, 온도 상승에 의한 응집 반응 방해를 억제할 수 있다.
전압 펄스를 인가받은 반응액에서의 담체 입자의 움직임을 억제하기 위해서, 반응액의 점도를 높이는 것도 효과적이다. 일반적인 응집 반응의 반응액은 0.75 mPas 미만이다. 이러한 점도에서는 담체 입자의 움직임은 억제되지 않아, 응집 반응이 방해되는 경우가 있다. 이에 대해서 본 발명자는, 0.8 mPas 이상의 점도에서 응집 반응을 효율적으로 진행시킬 수 있음을 알아냈다. 즉, 본 발명은 특정 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 상기 특정 물질을 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정을 포함하는 담체 입자를 응집시키기 위한 방법에서, 전압을 인가하는 동안의 반응액의 점도를 0.8 mPas 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로는, 다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법으로서, 반응액의 점도가 0.8mPas이상인 방법이 본 발명에 의해 제공된다.
(1)측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,
(2)공정 (1) 후에, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
(3)공정 (2) 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
또한, 본 발명은 다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법으로서, 반응액의 점도가 0.8mPas 이상인 방법을 제공한다.
(1')적어도 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질 및 응집 시약 성분을 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,
(2')공정 (1') 후에, 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 방해된 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
(3')공정 (2') 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
본 발명에서 반응액의 점도는, 일반적으로 0.8mPas 이상, 예를 들면 1~3mPas, 바람직하게는 1~2mPas이다. 반응액의 점도는 점도를 조절할 수 있는 화합물의 첨가에 의해 조절할 수 있다. 점도를 조절할 수 있는 화합물로는, 친화성 물질과 결합 파트너의 결합에 간섭하지 않는 임의의 화합물을 이용할 수 있다. 예를 들면, 소혈청 알부민, 카제인, 글리세린, 수크로오스, 또는 염화콜린 등을 첨가함으로써 반응액의 점도를 높일 수 있다. 이들 화합물의 첨가량은, 예를 들면 0.05~5%에서 적절히 선택할 수 있다. 보다 바람직하게는 0.1~3%, 더 바람직하게는 0.3~1%이다. 또한, 반응액의 조성이 같더라도 반응액의 온도가 떨어지면, 일반적으로 점도는 높아진다. 따라서, 반응액의 점도를 높인다는 의미에서도, 저온 조건하에서의 전압 펄스의 인가는 효과적이다.
당업자는, 이들 화합물을 반응액에 첨가하고 전압 펄스를 인가하는 온도 조건하에서, 그 점도를 측정함으로써 적절한 첨가량을 설정할 수 있다. 액체의 점도를 결정하는 방법은 잘 알려져 있는데, 일반적으로는 회전식 점도계, 초음파식 점도계 또는 진동식 점도계 등이 사용된다.
또한, 본 발명은 다음 공정 (1)~(3) 또는 (1')~(3')을 포함하는 친화성 물질 측정 방법에 있어서, 공정 (2) 또는 (2') 전에, 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너의 결합을 강화하는 수단에 의해 반응액을 희석하는 공정을 포함하는 방법이다.
(1)측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,
(2)공정 (1) 후에, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
(3)공정 (2) 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정, 또는
(1')측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을, 응집 시약 성분과 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정으로서, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하며, 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집이 방해되는 공정,
(2')공정 (1') 후에, 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 방해된 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
(3')공정 (2') 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
본 발명에서의 반응액의 희석 공정은 상기 공정 (2) 또는 (2') 전에, 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너와의 결합을 강화할 수 있는 임의의 수단에 의해 실시할 수 있다. 예를 들면, 반응액을 전압 펄스의 인가 조건하에서 희석하는 방법은 본 발명에서의 바람직한 희석 방법이다. 보다 구체적으로는, 전압 펄스를 인가한 희석액에 반응액을 첨가함으로써 희석이 행해진다. 희석액은 전극 사이에 배치되며, 전압 펄스가 인가된다. 다시 말해, 대향하는 전극 사이에 희석액이 배치된다.
본 발명의 희석 공정은, 반응액에 전압 펄스가 인가된 조건하에서 희석되는 한, 전극의 크기나 전극의 간격은 특별히 한정되지 않는다. 즉, 펄 체인화후의 반응액과 희석액의 초기의 접촉이 대향 전극을 사이에 둔 전계 중에서 행해지는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 도 6(B)에 도시한 희석 방식에서는, 전극의 크기는 (폭)2~12mm×(길이)10~50mm×(두께)0.01~0.04mm, 전극간의 거리는 5~20mm으로 거의 같은 효과가 확인되었다.
또한, 전압 펄스는 교류 전압이 바람직하다. 전압 펄스의 인가 조건은, 반응액 및 희석액의 전기 분해를 유발하지 않는 임의의 조건으로 할 수 있다. 전압 펄스의 전압은, 예를 들면 0.1V~1.2V, 보다 바람직하게는 0.3~0.9V이다. 전압 펄스의 주파수는, 예를 들면 2KHz~20MHz, 보다 바람직하게는 1OKHz~50OKHz이다. 전압 펄스에는 임의의 파형을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 사각형파, 정현(正弦)파, 삼각파 등을 들 수 있다. 보다 바람직한 전압 펄스는 사각형파이다. 본 발명에서는, 적어도 반응액과 희석액이 접촉하는 순간을 포함하는 시간대에서 전압 펄스가 인가되고 있는 것이 바람직하다. 인가 시간은 매우 짧은 시간이라도 희석에서의 결합 강화 작용을 기대할 수 있다. 보다 구체적으로는, 0.5~30초, 일반적으로 1~10초, 예를 들면 1~5초이다.
희석액에는 염을 포함하는 용액을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 50 mM ~ 600 mM의 염이 첨가된 생리 식염수, 글리신 완충액, 인산 완충액 등을 사용할 수 있다. 염으로는 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 등을 들 수 있다. 희석액에는 소듐 아자이드(sodium azide) 등의 방부제나 Triton X-100 등의 계면 활성제, 글리세린, 단당 등이 포함되어 있을 수도 있다.
본 발명에서는, 응집 덩어리를 구성하는 친화성 물질(또는 응집 시약)과 결합 파트너의 결합 반응은 강화된다. 이것은, 전압 펄스에 의해 초래된 전계에 의한 다이폴 모멘트(dipole moment) 효과가 양자의 결합을 강화하기 때문이라고 생각된다. 어쨌든, 전압 펄스 인가 조건하에서의 희석에 의해 응집 덩어리의 붕괴는 억제되며, 응집 덩어리를 유지한 채 반응액의 희석을 실현할 수 있다는 것이 확인되었다.
또한, 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너와의 결합을 강화할 수 있는 희석 수단으로서, 양자의 결합을 강화할 수 있는 결합 강화제를 이용할 수 있다. 본 발명에서 결합 강화제란, 반응액에 첨가함으로써 양자의 결합을 강화할 수 있는 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질간의 결합은 글루타르알데이드 또는 카르보디이미드 등의 화합물의 첨가에 의해 강화된다. 따라서, 단백질 항원과 항체와의 면역학적인 결합은, 글루타르알데이드 또는 카르보디이미드 등에 의해 강화할 수 있다. 이들 화합물은 본 발명에서의 결합 강화제로서 바람직하다.
결합 강화제는 친화성 물질과 결합 파트너의 관능기에 작용하여 양자를 화학적으로 결합한다. 또는 응집 저지 반응계에서는 응집 시약과 결합 파트너 사이의 결합을 강화한다. 이 결과, 양자의 결합에 의해 형성된 응집 덩어리가 물리적으로 높은 안정성을 획득한다. 예를 들면, 친화성 물질 또는 응집 시약, 그리고 결합 파트너가 단백질이면, 분자 내에는 아미노기나 카르복실기가 있다. 이들 관능기는 글루타르알데이드나 카르보디이미드 등의 화학 물질로 가교된다.
반응액 중에서의 결합 강화제의 농도는, 결합 강화제의 종류에 따라 적절히 설정할 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 글루타르알데이드의 경우, 반응액에서의 마지막 농도는 일반적으로 0.1~25%, 바람직하게는 0.2~18%이다. 결합 강화제는, 친화성 물질의 결합 파트너와의 결합체를 포함하는 반응액의 희석 전에 반응액에 첨가할 수 있다. 결합 강화제의 첨가 후의 반응액은, 바람직하게는 37℃에서 수초~20초 정도, 바람직하게는 2~10초, 또는 2~5초의 인큐베이션 후에 희석할 수 있다. 결합 강화제에 글루타르알데이드 또는 카르보디이미드를 사용한 경우에는, 반응액에 첨가한 후에 바로 희석할 수도 있다.
결합 강화제의 첨가는, 본 발명에서의 희석 공정으로서 효과적이다. 본 발명에서는 또한, 상술한 전압 펄스 인가 조건하에서의 희석 공정에 결합 강화제를 조합할 수도 있다. 즉, 반응액에 결합 강화제를 첨가한 후에, 상술한 조건에 따라서 전압 펄스 인가 조건하에 반응액을 희석할 수 있다. 또는, 결합 강화제가 첨가된 희석액을 이용하여, 상술한 조건에 따라서 전압 펄스 인가 조건하에서 반응액을 희석할 수도 있다. 양자를 조합함으로써 결합 강화 작용이 강화된다.
본 발명에서 반응액의 희석이란, 반응액과 희석액의 혼합에 의해 반응액 중에서의 담체 입자의 농도를 저하시키는 것을 말한다. 반응액에서의 담체 입자의 농도는, 시료의 양과 시약으로서 공급되는 담체 입자의 양에 의해 결정된다. 또한 본 발명에서는, 반응액에서의 담체 입자의 농도는, 일반적으로 펄 체인화에 의해 담체 입자의 응집을 촉진할 수 있는 범위로 설정된다. 구체적으로는, 반응액에서의 담체 입자의 농도는, 일반적으로 0.01~5중량%, 보다 바람직하게는 0.1~2중량%이다. 이에 대해서, 예를 들면 100배 이상, 일반적으로 1000배 이상, 구체적으로는 1000~100000배, 바람직하게는 2000~40000배로 희석할 수 있다. 희석 후의 담체 입자의 농도는 O.1×1O-5~O.OO5중량%, 바람직하게는 O.OOOO1~O.OO1중량%이다.
본 발명에 있어서 친화성 물질, 및 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너란, 결합 반응을 구성할 수 있는 모든 물질의 조합을 포함한다. 즉, 어떤 물질과 어떤 물질이 결합할 때, 한쪽이 친화성 물질이고, 다른 쪽은 결합 파트너이다. 본 발명에서의 친화성 물질 및 결합 파트너는 천연 물질일 수도 있고, 인공적으로 합성된 화합물일 수도 있다. 또한, 친화성 물질 및 결합 파트너는 정제된 물질일 수도 있고, 불순물의 공존도 허용된다. 또한, 친화성 물질 및 결합 파트너는 세포나 바이러스의 표면에 존재할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 친화성 물질과 결합 파트너의 결합 반응예로서, 예를 들면 다음과 같은 반응을 나타낼 수 있다. 이러한 반응을 구성하는 물질은 모두 본 발명에서의 친화성 물질 또는 결합 파트너로 할 수 있다.
항원 또는 합텐과 항체와의 반응(면역 반응)
상보적인 염기 배열을 갖는 핵산간의 혼성화(hybridization)
렉틴과 그 리셉터와의 반응
렉틴과 당쇄의 반응
리간드와 리셉터의 반응
DNA와 전사 조절 인자의 반응
상기 결합 반응 중에서, 본 발명에서의 바람직한 결합 반응으로서, 예를 들면 면역 반응을 들 수 있다. 면역 반응을 구성하는 항원으로서, 다음과 같은 물질을 들 수 있다.
종양 마커(marker): AFP, CEA, CA19-9, PSA 등
응고선용(凝固線溶)계 마커: 프로틴C, 프로틴S, 안티트롬빈(AT)III, FDP, FDP-D―다이머 등
감염증 마커: CRP, ASO, HBs 항원 등
호르몬: 갑상선 자극 호르몬(TSH), 프로락틴, 인슐린 등
조직 성분: 미오글로빈, 미오신, 헤모글로빈 등
기타:DNA 등의 핵산 등
이들 항원은 항원 분자 자체뿐만 아니라, 그 단편이나, 세포 표면에 존재한 상태일 수도 있다. 또한 이들 물질은 항원 물질의 예이며, 이들 이외의 항원 물질에 본 발명을 응용할 수 있음은 당연하다. 예를 들면, 라텍스, 혈구 등을 담체로 사용하는 면역학적 응집 반응에 의거하는 측정이 가능한 항원성 물질은 모두 본 발명에서의 친화성 물질이라고 할 수 있다.
항원성 물질과 그것을 인식하는 항체는, 어느 하나를 친화성 물질로 하고, 다른 하나를 결합 파트너로 하여 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서 친화성 물질이란, 해당 물질을 측정 대상으로 할 때 친화성 물질이라고 부른다. 한편, 결합 파트너란, 친화성 물질을 측정하기 위해서 프로브로서 이용할 수 있는, 해당 친화성 물질에 대한 결합 활성을 갖는 물질을 말한다. 따라서, 항원을 측정할 때에는, 항체를 결합 파트너로 하여 이용할 수 있다. 반대로, 항체를 측정할 때에는, 그 항체가 인식하는 항원을 결합 파트너로 하여 이용할 수 있다. 예를 들면, 라텍스, 혈구 등을 담체로서 사용하는 면역학적 응집 반응에 의거하는 측정이 가능한 항체는, 모두 본 발명에서의 친화성 물질이라고 할 수 있다. HBs(B형 간염 바이러스 표면 항원), HBc(B형 간염 바이러스 코어 항원), HCV(C형 간염), HIV(AIDS 바이러스), TP(매독) 등에 대한 항체가 면역학적 응집 반응에 의해 측정되고 있다.
친화성 물질과 결합 파트너와의 반응을 담체 입자의 응집을 지표로 하여 측정하기 위한 몇 가지 반응 원리가 잘 알려져 있다. 이들 반응 원리는 모두 본 발명에 응용할 수 있다. 이하에 담체 입자의 응집을 지표로 하는, 친화성 물질과 결합 파트너와의 반응을 이용한 측정 원리를 예시한다.
직접 응집 반응:
측정 대상 물질과 담체 입자 상의 결합 파트너의 반응에 의한 담체 입자의 응집이 검출된다. 예를 들면, 항원 분자를 결합 파트너인 항체에 의해 측정하는 경우가 이 원리에 포함된다. 또는 반대로, 항원을 결합한 담체 입자의 응집을 지표로 하여, 친화성 물질인 항체를 측정하는 경우도 이 원리에 포함된다. 직접 응집 반응에서는, 일반적으로 응집 입자의 레벨과 측정 대상 물질인 친화성 물질의 양은 정비례한다. 직접 응집 반응에서는, 일반적으로 응집의 레벨과 측정 대상 물질인 친화성 물질의 양은 정비례한다. 즉, 응집 덩어리의 형성 레벨이 높을 때에는, 친화성 물질의 레벨(즉 농도)이 높다. 반대로, 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨이 높을 때에는 친화성 물질의 레벨(즉 농도)은 낮다.
응집 저지 반응:
합텐이라고 불리는 저분자 항원은, 담체 입자의 응집에 필요한 항원을 통한 가교 구조를 만들기 어렵다. 이 때문에, 직접 응집 반응 원리에서는 합텐을 검출할 수 없다. 그래서, 복수개의 분자의 합텐 또는 그 에피토프를 포함하는 단편을 담체에 결합한 폴리합텐과, 담체 입자 상의 항체와의 결합에 의한 응집 반응이 이용된다. 폴리합텐은 복수개의 항체 분자를 가교할 수 있으므로, 담체 입자를 응집시킨다. 그러나 합텐이 존재하면, 폴리합텐과 항체의 반응이 저지되어, 담체 입자의 응집이 저지된다. 응집 저지 레벨은 합텐의 존재와 정비례한다. 다시 말하면, 측정 대상 물질의 양과 응집 반응 레벨은 반비례한다. 즉, 응집 덩어리의 형성 레벨이 높을 때에는, 친화성 물질의 레벨(즉 농도)이 낮다. 반대로, 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨이 높을 때에는, 친화성 물질의 레벨(즉 농도)은 높다.
합텐으로 분류되는 측정 대상 항원에는 하기한 바와 같은 성분을 들 수 있다.
호르몬:에스트로겐, 에스트라디올
약제:테오필린
본 발명에 있어서 합텐을 응집 저지 반응 원리를 바탕으로 측정하기 위해서는, 합텐에 대한 항체와 결합된 담체 입자를 응집시킬 수 있는 성분이 필요하다. 합텐에 대한 항체와 결합된 담체 입자를 응집시킬 수 있는 성분을, 본 발명에서는 응집 시약이라고 한다. 응집 시약은 항체와의 특이적인 친화성을 가지며, 항체와의 결합에 의해 담체 입자를 가교하는 작용을 갖는 시약으로 정의된다. 상술한 폴리합텐은, 합텐의 측정에 있어서 응집 시약으로서 사용할 수 있다.
직접 응집 반응이든 응집 저지 반응이든, 미리 일정량의 친화성 물질을 포함하는 표준 시료에 대해서 같은 반응계로 측정하여, 응집 덩어리 또는 응집하지 않았던 담체 입자의 레벨을 측정하여 표준 곡선 또는 회귀식을 작성해 놓을 수 있다. 시료의 측정에 의해 얻어진 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나를 표준 곡선 또는 회귀식에 적용하면, 시료 중의 친화성 물질의 레벨을 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서 결합 파트너는, 담체 입자에 결합하여 사용된다. 본 발명의 담체 입자로는 라텍스 입자, 카오린, 금 콜로이드, 적혈구 세포, 젤라틴, 리포솜 등을 들 수 있다. 라텍스 입자로는 응집 반응에서 일반적으로 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다. 폴리스티렌계 라텍스, 폴리비닐톨루엔계 라텍스, 폴리메타크릴레이트계 라텍스 입자가 잘 알려져 있다. 바람직한 입자 담체는 폴리스티렌계 라텍스 입자이다. 관능기를 갖는 모노머의 공중합에 의해 라텍스 입자의 표면에 관능기를 도입한 라텍스 입자를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 카르복실기-COOH, 수산기-OH, 아미노기-NH2, 술폰기-SO3 등의 관능기를 갖는 라텍스 입자가 잘 알려져 있다. 관능기를 갖는 라텍스 입자에는 결합 파트너를 화학적으로 결합시킬 수 있다.
담체 입자의 평균 입경은, 예를 들면 라텍스 입자의 경우, 구체적으로는 0.5~10μm, 더 바람직하게는 1~10μm이고, 가장 바람직하게는 2~5μm이다. 또 유전 분극이 큰 타원형 입자를 사용함으로써 작은 담체 입자를 사용할 수도 있다.
이와 같이 잘 알려진 라텍스 응집 비탁법에서의 담체 입자가 0.05~0.6μm인 것에 비해, 본 발명의 방법에서는 1μm 이상의 큰 사이즈의 입자를 이용할 수 있다. 전압 펄스를 인가하는 공정의 이용에 의해 응집 반응이 촉진되는 결과, 큰 사이즈의 입자라도 단시간에 반응이 충분히 진행되기 때문이다. 담체 입자가 큰 것은, 이하와 같은 이점으로 이어진다. 먼저, 입자를 계측하기 위한 어퍼쳐의 사이즈를 크게 할 수 있다. 그 결과, 어퍼쳐의 막힘 현상이 일어나기 어려워진다. 또 담체 입자가 커짐으로써, 체액에 포함되는 측정 방해 물질과의 식별이 용이해진다. 그 결과, 측정 정밀도가 향상된다. 한편, 화상 정보를 받아들이는 계수 수단을 사용하는 방법 등, 그 밖의 계수 수단에서도 장치 설계가 용이해진다.
본 발명에 있어서, 담체 입자로서 라텍스 입자를 대신하여 다른 입자를 사용하는 경우에도, 라텍스 입자와 동일한 사이즈의 입자를 이용할 수 있다. 예를 들면, 카올린, 금 콜로이드, 젤라틴, 또는 리포좀 등의 입자를 담체 입자에 사용하는 경우에, 담체 입자의 평균 입경은 바람직하게는 0.3~20μm이다.
결합 파트너와 입자 담체는 각각의 소재에 따른 방법에 의해 결합시킬 수 있다. 당업자는 양자의 결합 방법을 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면 라텍스 입자에는 항원이나 항체, 또는 그들의 단편 등의 단백질을 물리 흡착할 수 있다. 표면에 관능기를 갖는 라텍스 입자에서는, 해당 관능기와의 공유 결합이 가능한 치환기를 화학적으로 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 카르복실기-COOH를 갖는 라텍스에는, 단백질의 아미노기-NH2를 결합시킬 수 있다.
결합 파트너를 결합시킨 담체 입자는, 필요에 따라 블로킹할 수 있다. 구체적으로는, 담체 입자 표면을 불활성 단백질로 처리함으로써, 담체 입자 표면에 대한 비특이적인 단백질의 결합을 방지할 수 있다. 불활성 단백질로는 소혈청 알부민이나 탈지 분유 등을 사용할 수 있다. 또한, 담체 입자의 분산성을 향상시키기 위해서 분산매에 계면 활성제나 당류를 부가할 수 있다. 또 미생물의 번식을 막기 위해서 입자 담체에 항균제를 첨가할 수도 있다.
본 발명은 친화성 물질과 결합 파트너와 결합된 담체 입자를 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정을 포함한다. 반응액에 전압 펄스를 인가하여 응집 반응시키는 방법은 잘 알려져 있다(특개평7-83928호). 전압 펄스의 인가에 의해 담체 입자가 전계를 따라 정렬하고, 친화성 물질과 담체 입자 상의 결합 파트너와의 결합 반응이 촉진된다.
이 때, 응집 저지 반응 원리를 이용하는 경우에는, 친화성 물질과 담체 입자는 응집 시약의 공존하에서 정렬된다. 응집 시약은 담체 입자와 측정 대상 친화성 물질의 접촉 후에 접촉시킬 수 있다. 또는 미리 측정 대상 친화성 물질과 응집 시약을 혼합한 후에 담체 입자를 첨가함으로써, 3가지 성분을 동시에 접촉시킬 수 있다. 그리고나서, 응집 시약과 결합 파트너와의 반응에 의해 응집 덩어리가 형성되고, 친화성 물질은 양자의 결합을 방해한다.
전압 펄스에는 교류 성분 또는 직류 성분을 이용할 수 있다. 양자를 임의로 조합할 수도 있다. 반응액은 전기 분해를 일으키기 쉬우므로, 교류 전압이 바람직하다. 교류 전압에는 사각형파, 직사각형파, 또는 정현파 등을 사용할 수 있다. 반응액(시약)의 이온 강도에 의해, 교류 전압의 전원 주파수를 임의로 설정할 수 있다. 교류 전압은 파고치(波高値)로 나타냈을 때 5~50V/mm의 전해 강도가 얻어지도록 인가한다. 전해 강도가 5V/mm보다 작으면 담체의 펄 체인화가 일어나기 어려우며, 따라서 응집 반응 촉진이 불충분해진다. 전해 강도가 50V/mm을 넘으면 반응액의 전기 분해가 일어나기 쉬워, 응집 반응의 측정이 어려워진다. 보다 바람직하게는 10~20V/mm의 전계 강도가 얻어지도록 인가한다. 교류 주파수는 1OKHz~1OMHz의 주파수가 바람직하다. 보다 바람직하게는 50KHz~1MHz의 주파수이다.
본 발명에 있어서 전압 펄스란, 일반적으로 정상 상태에서 진폭이 천이(遷移)되고, 제한된 시간만큼 지속되더라도 본래의 상태로 되돌아오는 파 또는 파형을 갖는 전압을 말한다. 교류 전압은 대표적인 전압 펄스이다. 교류 전압은 전압의 평균값이 0인 시간의 주기 함수이다. 예를 들면, 정현파, 직사각형파, 사각형파, 또는 톱파 등을 갖는 전압은 뚜렷하게 진폭이 주기적이며, 교류 전압에 포함된다. 일반적으로, 교류 전압에서는 임의의 1주기에서 정전위측의 면적과 부전위측의 면적은 같으며, 양자의 합계는 0이 된다. 각 면적은 횡축(전압이 0)과 상측 곡선, 또는 하측 곡선에 의해 규정되는 면적이다. 본 발명에서는 반응액의 전기 분해를 막기 위해서 전압 펄스가 인가된다. 따라서, 반응액의 전기 분해가 일어나지 않거나, 일어났다고 하더라도 실질적으로 반응에 간섭하지 않는 레벨로 억제할 수 있는 경우에는, 정전위와 부전위의 합계가 0이 아닌 전압 펄스를 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서 사각형파, 또는 직사각형파의 전압 펄스는, 정전위/전위차 0/부전위를 반복하고, 또한 정전위 및 부전위 중 적어도 하나는 전압이 일정한 상태를 포함하는 전원을 말한다. 그리고 사각형파, 또는 직사각형파의 전위차가 0인 상태에서 다음 0인 상태에 이르는 동안의 시간이 펄스폭이다. 또한 사각형파란, 종축을 전압, 횡축을 시간으로 하는 그래프에 전압의 변화를 그렸을 때, 거의 사각형의 형상이 되는 전압 펄스를 말한다. 사각형에는 정사각형과 직사각형이 포함된다. 이에 대해서 직사각형파는 정사각형을 포함하지 않는 직사각형 형상의 전압 펄스이다. 따라서, 직사각형파는 사각형파에 포함된다. 본 발명에 있어서, 바람직한 펄스폭은 일반적으로 50μsec 이하이다. 바람직한 펄스폭으로서 O.1~1Oμsec를 들 수 있다.
사각형파 또는 직사각형파를 구성하는 전압이 0인 상태의 시간은 제한되지 않는다. 일반적으로는 전위차가 0이 되는 것은, 정전위와 부전위 사이의 이동 순간이다. 그러나, 전위차가 0인 상태가 보다 긴 시간 계속되는 전압 펄스를 본 발명에 사용할 수도 있다. 예를 들면, O.1~1Oμsec의 펄스폭을 갖는 정전위/부전위가 반복되는 동안에 O.1~1OOμsec의 전위차가 O인 상태를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 공정 (1) 또는 (1')의 반응액에 전압 펄스를 인가하는 횟수는 제한되지 않는다. 즉, 1회 이상, 예를 들면 1~20회, 일반적으로 1~10회, 또는 1~5회 단속적으로 전압 펄스를 인가할 수 있다. 단속적인 인가에 의해 담체 입자의 분산과 정렬이 반복된다. 그 결과, 담체 입자 상의 결합 파트너와 친화성 물질, 또는 응집 시약의 접촉 기회가 증가한다. 즉, 단속적인 전압 펄스의 인가에 의해 반응 촉진 효과를 기대할 수 있다. 본 발명에 있어서, 전압 펄스를 복수회 인가할 때, 반응액에 대해서 다른 방향에서 전압 펄스를 인가할 수 있다. 구체적으로는, 복수 세트의 전극을 반응액 내에 배치하고, 통전하는 전극을 바꿈으로써, 반응액에 대해서 다른 방향의 전압 펄스를 부여할 수 있다. 또는, 반응액 내의 전극을 이동시켜 전압 펄스의 방향을 변화시킬 수도 있다. 전극을 고정하고, 반응액을 수용한 공간을 움직임으로써 동일한 효과를 얻을 수도 있다.
또한 복수회의 전압 펄스의 인가 동안에 담체 입자를 분산시킬 수도 있다. 분산 공정을 개재시킴으로써, 결합 파트너와 친화성 물질, 또는 응집 시약과의 접촉 기회를 더욱 증가시키는 효과를 기대할 수 있다. 반응액의 교반, 진탕 또는 반응액에 진동을 가함으로써 전압 펄스의 인가 동안에 담체 입자를 분산시킬 수 있다.
일반적으로, 반응계 중의 담체 입자의 농도가 높을수록 펄 체인이 형성되기 쉬우므로 응집이 촉진된다. 그러나 한편으로, 담체 입자의 농도 상승에 동반하여, 생물학적인 특이적 반응성 물질이 존재하지 않는 경우에 재분산했을 때의 담체 입자의 응집율(백그라운드)이 커지는 경향이 있었다. 2차원의 정보를 바탕으로 응집 입자를 관찰한 주지 방법(특개평7-83928호)에서는, 담체 입자의 농도가 높을수록, 응집되지 않은 입자를 실수로 응집 입자로서 받아들일 가능성이 높아진다. 입자 농도가 높은 경우에는 입자가 접근하기 때문에, 단순한 입자의 중첩과, 응집에 의해 형성된 입자 덩어리의 식별이 어려워진다. 따라서, 응집 덩어리를 특이적으로 식별하기 위해서는, 입자 농도를 낮게 유지할 필요가 있다. 구체적으로는, 특개평7-83928호에 개시된 반응계 중의 담체 입자의 농도는, 예를 들면 라텍스 입자의 경우, 바람직하게는 0.01~1중량%, 보다 바람직하게는 0.025-0.5중량%, 가장 바람직한 농도는 0.05~0.1중량%이다. 이러한 입자 농도는, 펄 체인화에서는 반드시 최적의 조건이라고 말할 수는 없다. 즉, 2차원 정보에 의거하여 응집 덩어리를 계수하는 기법에서는, 입자 농도를 희생으로 함으로써 응집 덩어리의 특이적인 식별을 실현했었다.
본 발명은 3차원 정보에 의거하여 응집 입자가 계측되므로, 입자의 농도와는 무관하게 응집 덩어리를 특이적으로 식별할 수 있다. 그 결과, 펄 체인의 형성에 최적의 조건을 부여할 수 있다. 즉, 측정 대상 친화성 물질과 결합 활성을 갖는 결합 파트너와의 균형을 고려하여 담체 입자의 농도를 결정할 수 있다. 비록 높은 담체 입자의 농도가 선택되더라도 응집 덩어리는 특이적으로 검출된다. 본 발명에서는 통상, 반응계 중의 담체 입자의 농도는, 예를 들면 라텍스 입자의 경우, 바람직하게는 0.01~5중량%, 보다 바람직하게는 0.1~2중량%이다. 이 농도의 범위는, 2차원 정보에 의거하는 방법의 2배~10배이다. 최적의 담체 입자의 농도는 담체 입자의 크기나 측정 대상 친화성 물질의 측정 감도 등에 맞도록 적절히 조절할 수 있다.
본 발명에 있어서, 반응액에는 응집 반응을 촉진하는 염을 첨가할 수 있다. 예를 들면, 10mM 이상의 비교적 높은 농도로 염을 첨가함으로써 응집 반응을 촉진할 수 있다. 단, 염의 농도가 반응계 중에 600mM 이상의 농도로 존재하면 반응액의 전기 분해가 일어나기 쉬워지므로 바람직하지 않다. 더 바람직한 염의 농도는 10~300mM, 가장 바람직한 염의 농도는 25~150mM이다. 생체 시료 자체가 응집 반응을 촉진하는 염을 함유하고 있을 가능성이 있는 경우에는, 반응액 중의 최종 염의 농도가 상기한 범위에 들어가도록 시약의 염 농도를 조정하면 된다. 또한 전압 펄스로서 직류 성분을 사용하는 경우에는, 약 6mM의 염 농도의 반응액으로도 전기 분해가 일어나므로, 염의 존재하에서는 생물학적 특이적 응집 반응을 측정하기는 어렵다.
본 발명에서의 염은, 생물학적 특이적 응집 반응을 촉진하는 것 중에서 선택될 수 있다. 예를 들면, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 질산 나트륨, 질산 칼륨, 염화 암모늄을 들 수 있으나, 이것들에 한정되는 것은 아니다. 몰 전기 전도도가 10mM, 25℃의 수용액에서 1OOcm2/(Ω·mol) 이상의 값을 나타내는 염은, 본 발명에서 사용하는 염으로서 바람직하다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 염화 나트륨, 염화 칼륨 및 염화 암모늄 등을 바람직한 염으로서 들 수 있다.
측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 상기 반응액에 전압 펄스를 인가하여 펄 체인화함으로써 특이적인 반응에 의해 응집 덩어리가 형성되고, 전압 펄스를 정지하더라도 이들의 재분산은 일어나지 않는다. 그러나, 비교적 강한 물리적인 외력이 가해지면, 응집 덩어리가 붕괴될 수 있어 정확한 측정이 불가능하다. 또한, 본 발명은 이러한 특이적인 반응에 의해 형성된 응집 덩어리를 안정화시키기 때문에, 이것을 형성하는 담체 입자에 부착되는 단백의 관능기에 대해서, 또한 이것들을 화학적인 결합으로 보강하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 조작은 담체 입자를 희석하기 전의 공정에서 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 친화성 물질을 포함하는 검체는 제한되지 않는다. 즉, 측정 대상인 친화성 물질을 포함하는 임의의 시료를 검체로서 이용할 수 있다. 예를 들면, 혈액 시료, 인두(咽頭) 등의 국소에서 채취된 시료, 타액, 가래, 소변 또는 대변은 대표적인 생체 시료이다. 그 밖에, 생체에서 채취되는 모든 생체 재료는 생체 물질 측정용 검체로서 본 발명에 이용할 수 있다. 또한, 이들 생체 시료를 배양함으로써 얻을 수 있는 배양물도 본 발명의 검체로서 이용할 수 있다. 생체 재료는 그대로 사용하거나, 또는 필요에 따라 처리한 후에 검체로 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 재료는 분획화(fractionation), 희석, 용해, 추출 등의 처리를 거쳐 검체로 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 검체는 원액일 수도 있고, 또는 자동 희석하여 측정에 사용된다. 희석 배율은 임의로 설정할 수가 있다. 반응에 필요한 시약이 여러 종류일 때에는, 2가지 이상의 시약을 순차적으로 첨가할 수도 있다.
여기서 말하는 2가지 시약을 구성하는 시약으로는, 예를 들면 이하와 같은 시약을 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 비특이적 반응의 원인이 되는 물질을 미리 분해 및/또는 흡수하기 위한 시약을 사용할 수 있다. 이러한 시약은 비특이적 반응 억제제를 포함하는 시약으로서 유용하다. 비특이 억제제를 포함하는 시약은 담체 입자를 포함하는 시약과 조합되어 제 1 시약 및 제 2 시약을 구성한다. 비특이적 반응 억제제를 포함하는 시약은, 예를 들면 미리 검체와 혼합할 수 있다. 비특이 억제제는, 예를 들면 종래에 잘 알려진 것을 사용할 수 있다.
이뮤노어세이에서 비특이적 반응의 원인이 되는 여러 가지 물질이 시료 중에 포함되어 있다는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 류머티즘 인자 등의 글로불린류는 이뮤노어세이를 구성하는 면역 반응에 간섭하는 경우가 있다. 글로불린류의 이뮤노어세이로의 간섭을 방지하기 위해서 비특이적 반응 억제제가 사용된다. 예를 들면, 글로불린류를 인식하는 항체에 의해 그 비특이적 작용을 흡수할 수 있다. 류머티즘 인자는 IgG나 IgM 유래의 글로불린이다. 따라서, 항인간 IgG 항체, 또는 항인간 IgM 항체를 사용하여 류머티즘 인자를 흡수할 수 있다. 또한, 비특이적 반응의 원인 물질의 분해에 의해 간섭을 방지하는 방법도 잘 알려져 있다. 구체적으로는, 글로불린류를 환원에 의해 분해하고, 그 간섭 작용을 억제할 수 있는 것이 알려져 있다. 글로불린류는 디티오쓰레이톨 또는 2-머캅토에탄올 등에 의해 환원된다.
또한, 다른 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자를 포함하는 시약을 2종류 이상 조합할 수 있다. 이러한 구성에 의해 다른 종류의 측정 대상 친화성 물질을 동시에 측정할 수 있다. 각 시약은 각각 개별적으로 첨가할 수 있다. 또는, 미리 복수의 시약을 혼합한 후에 검체와 혼합할 수도 있다.
검체와 시약은 전압을 인가하기 전에 미리 혼합해 놓는 것이 바람직하다. 교반 바(bar)를 사용하여 물리적으로 양자를 혼합할 수 있다. 또는 전기적인 방법에 의해 양자를 혼합할 수도 있다. 전기적인 기법으로는, 다른 방향의 전압 펄스의 단속적인 인가에 의해 담체 입자의 위치를 물리적으로 움직이는 방법을 예시할 수 있다.
본 발명의 측정 방법을 구성하는 각 공정을 이하에 구체적으로 설명하기로 한다. 시료와 함께 필요한 성분을 혼합한 반응액은 전극을 배치한 조로 이동하여, 전압 펄스를 인가받는다. 전압 펄스의 인가 전에 미리 반응액을 인큐베이션하는 경우에는, 전극을 구비한 조로 이동한 후나 이동하기 전 모두, 또는 어느 한 단계에서 인큐베이션된다. 전기장을 걸면 담체 입자는 유전 분극을 일으켜 정전적으로 서로 끌어당기는 직쇄 모양으로 나열된다. 이 현상은 펄 체인화라고 불린다. 그 후 전기장을 정지하면 직쇄로 나열되어 있던 담체 입자는 순간 재분산된다. 한편 펄 체인화시에 친화성 물질을 통해서 결합 파트너끼리 결합하면, 담체 입자는 전기장을 정지한 후에도 분산되지 않고 응집 덩어리를 형성한 채로 존재한다. 이렇게 해서 형성된 응집 덩어리 및 응집하지 않은 담체 입자 모두, 또는 어느 하나를 측정함으로써 친화성 물질의 존재를 검출 또는 측정할 수 있다.
본 발명의 측정 방법은, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나, 또는 모두를 지표로 하여 계수하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서, 입자는 전기장을 정지한 후에 측정할 수 있다. 또는 전기장에 놓인 입자를, 전기장을 정지하지 않고 측정할 수도 있다. 예를 들면, 전기장에 놓인 입자는 전기장으로부터 꺼냄으로써 계수할 수 있다. 또한, 입자의 계수 전에 입자를 분산시키는 공정을 실시할 수 있다. 계수 전의 분산 공정에 의해 비특이적인 요인에 의해 응집한 입자를 분산시킬 수 있다. 그 결과, 측정 정밀도의 향상을 기대할 수 있다. 입자는 교반이나 반응액의 희석에 의해 분산시킬수 있다.
응집한 담체 입자를 계수하기 위해서 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 2차원 정보에 의거하여 응집 레벨을 결정하는 방법이 잘 알려져 있다. 즉 반응액의 현미경 화상을 스캔하고, 단위 면적당 차지하는 응집 덩어리와 비응집 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수한다.
또는 본 발명에서는 담체 입자를, 3차원 정보를 지표로 하여 계수할 수도 있다. 본 발명에 있어서 3차원 정보를 지표로 하는 계수란, 입자 및/또는 응집 덩어리의 3차원 정보를 측정하고, 그 결과에 의거하여 입자 및/또는 응집 덩어리를 계수하는 것을 말한다. 3차원 정보에 의거하는 담체 입자의 계수는, 본 발명에서의 계수 방법으로서 바람직하다.
3차원 정보를 측정하기 위한 방법은 한정되지 않는다. 또, 본 발명에서의 계수란, 입자 및/또는 응집 덩어리의 수를 구하는 것을 말한다. 입자 및/또는 응집 덩어리의 수는, 단순히 수만 측정할 수도 있다. 또는 응집한 입자를, 응집하지 않은 입자와 구별하여 측정할 수도 있다. 또한, 응집한 입자에 대해서는, 응집한 입자 수마다 그 응집 덩어리의 수를 측정할 수도 있다. 3차원 정보를 지표로 하여 입자를 계수하기 위한 몇 가지 방법이 알려져 있다.
본 발명에 이용할 수 있는 입자의 계수 방법은, 물리적인 원리에 의거하는 측정 방법이 유리하다. 본 발명에서 물리적인 측정 방법이란, 입자 또는 응집 덩어리에 고유의 물리적인 정보를 평가할 수 있는 측정 방법을 말한다. 입자 또는 응집 덩어리에 고유의 물리적인 정보는 진정한 측정 결과라고 말할 수도 있다. 이에 대해서 화상 정보로부터 취득되는 2차원 정보를 해석하는 방법은, 실제로는 응집하지 않은 입자의 중첩을 응집 덩어리로서 검출한다. 이러한 검출 결과는 입자에 고유한 물리적인 정보라고 말할 수는 없다.
입자 또는 응집 덩어리를 물리적으로 측정하기 위해서는 플로우(flow) 시스템의 이용이 유리하다. 플로우 시스템은 미세한 플로우 셀 안을 통과하는 입자의 물리적인 정보를 해석할 수 있는 시스템이다. 플로우 시스템을 이용함으로써 쉽게 물리적인 측정을 실시할 수 있다. 즉, 본 발명에서의 물리적인 측정이란, 플로우 시스템에 의해 입자 및 응집 덩어리 중 어느 하나, 또는 모두의 3차원 정보를 측정하여 계수하는 공정을 포함한다. 3차원 정보를 지표로 하여 입자를 물리적으로 계수하기 위한 방법으로서, 예를 들면 쿨터(Coulter) 원리 또는 레이저 회절 산란법을 들 수 있다.
쿨터 원리(USPA2656508, 1953년)란, 어퍼쳐(세공)의 양측에 전극을 두고, 어퍼쳐 안을 통과하는 입자에 의한 전기 저항의 변화에 의거하여 입자의 부피를 검출하는 해석 방법이다. 전해액을 통과하여 양 전극간에 미소 전류를 흘려 보냈을 때, 전해액 중에 현탁시킨 입자가 흡입되어 어퍼쳐를 통과하면, 입자 부피에 해당하는 전해액이 입자에 의해 치환된다. 이 결과, 양 전극간의 전기 저항에 변화를 일으키므로, 이 변화를 측정함으로써 입자의 계수와 사이즈(부피)를 측정할 수 있다. 부피를 검출하는 방법으로서 정전 용량법이 있으나, 대부분 실용화되고 있는 것은 전기 저항법이다.
어퍼쳐 사이즈는 해석 대상이 되는 입자에 맞춰 적절히 조절할 수 있다. 일반적인 면역학적인 입자 응집 반응에 사용되는 담체 입자의 응집을 검출하는 경우, 어퍼쳐 사이즈로는 일반적으로 30~1000μm, 바람직하게는 50~200μm을 들 수 있다.
어퍼쳐 사이즈는, 담체 입자의 평균 입경에 대해서 수배~수백배, 예를 들면 수배~100배, 바람직하게는 5배~50배로 하는 것이 유리하다. 이 경우, 부피에 비례한 시그널을 검출할 수 있어, 고정밀도로 고감도 측정을 실현할 수 있다. 입자 직경에 대해서 어퍼쳐 사이즈의 배율은 작을수록 감도는 향상되지만, 너무 작으면 입자의 막힘이 발생하기 쉬워지고, 너무 크면 입자의 검출 감도가 저하되므로 바람직하지 않다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 입자의 직경이 1~5μm, 특히 2~3μm의 담체 입자를 계수하는 경우, 어퍼쳐의 사이즈는 30~100μm, 바람직하게는 50~80μm, 예를 들면 65~75μm의 범위에서 선택할 수 있다. 2~3μm의 담체 입자는, 본 발명에 의한 친화성 물질의 측정 방법에 있어서 특히 바람직한 입자 사이즈라고 할 수 있다. 즉, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법을 제공한다.
(1)측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 평균 입경 2~3μm을 갖는 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합하고, 전압 펄스를 인가하는 공정, 또는
(1')측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 평균 입경 2~3μm을 갖는 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 응집 시약 성분과 혼합하여 전압 펄스를 인가하는 공정으로서, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하며, 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집은 방해되는 공정,
(2)공정 (1) 후에, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 50~80μm의 어퍼쳐 사이즈를 갖는 쿨터 원리에 의해 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 공정, 또는
(2')공정 (1') 후에, 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 방해된 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 50~80μm의 어퍼쳐 사이즈를 갖는 쿨터 원리에 의해 그 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 공정, 및
(3)공정 (2) 또는 (2') 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
일반적으로 어퍼쳐 사이즈가 작을수록 비응집 입자를 더욱 정확하게 계수할 수 있다. 반대로 어퍼쳐 사이즈를 크게 함으로써, 응집 입자가 어퍼쳐에 쉽게 막히지 않게 된다. 어퍼쳐의 막힘은 해석 효율을 저하시키는 원인이 된다. 막히는 빈도를 낮추는 것이 해석 효율의 향상으로 이어진다. 예를 들면, 응집 입자가 다량으로 생성됨이 예측되는 경우에는, 어퍼쳐 사이즈를 조금 크게 설정함으로써 어퍼쳐의 막힘을 방지할 수 있다. 또는, 입자 직경이 작은 담체 입자를 사용함으로써 마찬가지의 효과를 기대할 수 있다. 또한, 시료의 희석에 의해 응집 입자의 비율을 저하시켜 어퍼쳐의 막힘을 방지할 수도 있다. 통상적으로는, 기대되는 검출 감도, 예상되는 검출 대상 물질의 농도, 그리고 기기 구성(특히 어퍼쳐 사이즈)에 따라 각각 적절한 조건을 선택할 수도 있다.
이와 같이 하여 응집 입자를 계수함으로써 응집 입자의 비율을 알 수가 있다. 응집 입자의 비율이란, 계수한 모든 입자에 대한 응집한 입자의 비율을 말한다. 또, 응집 입자의 비율을 응집율(agglutination ratio)이라고 한다. 또한, 미리 농도를 알고 있는 표준 시료에 대해 응집율을 구하고, 양자의 관계를 그래프에 플롯함으로써 표준 곡선을 얻을 수 있다. 이에 대해서, 검체의 응집율을 대조 확인하면, 검체에 포함되는 측정 대상 친화성 물질의 농도를 명확히 할 수 있다.
또는 상기 표준 곡선을 회귀식으로서 나타낼 수도 있다. 회귀식이 얻어지면, 응집율을 회귀식에 대입함으로써, 측정 대상 친화성 물질의 농도를 산출할 수도 있다.
한편 레이저 회절 산란법이란, 입자에 레이저를 조사했을 때 발생하는 흔들림을 검출함으로써, 입자의 계수와 평균 직경을 측정하는 것이다. 어떠한 경우도, 측정 정밀도를 높이기 위해서 입자의 측정의 오차를 억제하는 목적으로서, 반응 입자를 희석, 초음파의 인가 또는/및 쉬스 플로우 방식(sheath follow system) 등을 사용하는 것이 바람직하다.
이 밖에도 이하와 같은 방법을 입자 부피의 측정 방법으로서 나타낼 수 있다.
원심침강법:액체 중의 입자의 침강 속도와 입경의 관계를 나타내는 스토크의 식(Stoke's equation)에 의해 입경 분포를 측정하는 방법.(광투과식 원심침강법에서는 스토크의 법칙을 적용하고, 동일한 비중의 입자라면 큰 입자가 작은 입자보다도 빨리 침강하는 것을 이용한다. 이 때의 입자 농도를 광 투과에 의한 탁도 변화로 해석하여 입도 분포를 구할 수 있다.)
캐필러리(capillary) 방식: 모세관(capillary) 안을 흐르는 점성 유체의 레이놀즈 수가 작은 경우, 거기에는 푸아죄유(Poiseuille)의 유체가 발생한다. 이 흐름은 모세관 중앙일수록 빠르고 관벽일수록 느리므로, 큰 입자는 평균적으로 빠른 유속을, 작은 입자는 평균적으로 느린 유속을 흘러 가게 된다. 즉 입자는 일정한 길이의 캐피러리 안을 흐를 때, 이 이동 속도의 차이에 의해 사이즈별로 분리되어 검출된다.
3차원적 화상 해석:다른 방향에서 촬영한 복수의 화상 정보를 해석하여 입자의 3차원 정보를 구할 수 있다. 또는 xy 평면의 화상 정보를 z축 방향으로 스캔함으로써 입자의 3차원 정보를 구할 수 있다.
본 발명의 측정 방법에서는, 응집한(또는 하지 않은) 담체 입자가 계수된다. 계수 결과에 따라서 측정 대상인 친화성 물질이 정성적 또는 정량적으로 측정된다. 정성적인 측정에서는, 응집 입자의 존재는 측정 대상인 친화성 물질의 존재를 의미한다. 또는 응집 저지 반응의 경우에는, 응집 저지가 검출되었을 때 측정 대상의 존재가 증명된다.
또한, 정량적인 측정에서는, 응집의 레벨을 측정 대상인 친화성 물질의 양과 관련지을 수 있다. 보다 구체적으로는, 미리 친화성 물질의 양이 뚜렷한 시료에 대해서 본 발명의 측정 방법을 행하고, 응집 입자의 검출 결과와 친화성 물질의 양의 관계를 명확히 해 둔다. 다음에, 시료에 대해서 동일한 측정을 행하여, 체적에 의거하여 응집 입자의 검출 결과로부터 친화성 물질의 양을 명확히 할 수 있다. 응집 저지 반응의 경우에도 마찬가지로 하여 정량적인 측정을 할 수 있다.
입자 및/또는 응집 덩어리의 계수 방법으로는, 일정한 입자수를 카운트하는 수단에 있어서는 2개 이상으로 응집한 입자수/총입자수나 단입자수/총입자수 등의 목적에 맞게 연산식을 선택할 수 있다. 총입자수란, 어떤 계측 시간 내에 계측된 모든 입자의 수일 수도 있고, 반응액의 전량을 해석 대상으로 하는 경우에는, 말 그대로 반응액에 포함되는 입자의 총수로 할 수도 있다. 반응액에 포함되는 입자의 총수는, 반응액의 전용량이 뚜렷한 경우에는 그 일부를 계수함으로써 근사적으로 산출할 수도 있다.
택일적으로는, 전기 저항법이나 레이저 회절 산란법 등에 의해 일정 시간 쯤에 검출된 입자 및/또는 응집 덩어리의 수에 의거하여 친화성 물질을 검출 또는 측정할 수 있다. 즉, 응집 반응에 의해 단입자는 응집하여 응집 덩어리를 형성하기 때문에, 시간당 계수되는 입자수가 적어진다. 또는, 소정수의 입자 및/또는 응집 덩어리를 계수하는 데 걸리는 시간을 지표로 할 수도 있다. 이러한 계수 방법을 본 발명에 적용하는 경우에는, 각각 입자 및/또는 응집 덩어리의 수와 친화성 물질의 양과의 관계를 회귀식으로 나타낼 수 있다. 항체가 감작된 입자는 항원의 농도에 따라 2개 이상의 입자로 이루어진 응집 덩어리의 비율이 커진다. 그리고 2개 이상으로 응집한 입자수/총 입자수로 표현되는 응집율은 1.00(100%)가 된다.
쿨터 원리로 하든 레이저 회절 산란법으로 하든, 입자의 3차원 정보를 계측하는 방법은 2차원적인 화상 데이터를 해석하는 방법에 비해, 간단한 기기 구성에 의해 고정밀도의 해석을 기대할 수 있다. 이미 설명한 바와 같이, 2차원적인 화상 데이터의 해석에서는 반응액의 용적이 제한된다. 이에 반해서 3차원 정보를 계측하는 방법은 플로우식 해석 기법을 응용할 수 있으므로, 반응액의 용적은 제한되지 않는다. 또한, 반응 공간의 물리적인 형상도 제한되지 않는다. 이러한 이유에 의해 기기 구성은 단순해진다. 또한, 반응액량을 자유롭게 설정할 수 있는 것이 재현성이나 검출 감도의 향상에 공헌한다.
택일적으로, 본 발명은 응집 저지 반응계에 응용할 수도 있다. 응집 시약을 이용하는 응집 저지 반응에 의거하는 면역학적 입자 응집 반응법의 원리는 이미 설명했다. 상기 공정에 의해 면역학적 입자 응집 반응에 본 발명을 응용할 수 있다. 상기 공정을 구성하는 전압 펄스의 인가나 응집 덩어리의 형성 레벨, 또는 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨의 해석은, 먼저 구체적으로 설명한 바와 같은 방법에 의해 실시할 수 있다.
또한 응집 저지 반응 원리에 의거하여 본 발명을 실시하는 경우에는, 2개 이상의 입자가 응집한 응집 덩어리가 더 많이 생성되는 조건을 선택하는 것이 바람직하다. 또는, 단입자/총 입자수를 지표로 하여 응집 레벨을 평가하는 방법이 바람직하다. 응집 저지 반응의 원리에 의거하는 경우에는, 이러한 연산식을 이용하는 것이 2개 이상으로 응집한 입자수/총 입자수의 연산식에 의거하는 해석보다 높은 감도를 기대할 수 있다.
택일적으로는, 본 발명은 상기 측정 방법을 실시하기 위한 장치를 제공한다. 즉, 본 발명은 특정 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 상기 특정 물질을 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 수단을 포함하는 담체 입자를 응집시키기 위한 장치에 있어서, 반응액의 온도를 37℃~90℃로 가열하기 위한 수단을 갖는 것을 특징으로 하는 장치를 제공한다.
또는, 본 발명은 이하의 요소를 포함하는 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정할 친화성 물질과의 결합을 상기 담체 입자의 친화성 물질 또는 응집 시약에 의한 응집을 지표로 하여 측정하기 위한 측정 장치를 제공한다.
1a:반응액을 보유하기 위한 공간,
1b:반응액의 온도를 37℃~90℃에서 인큐베이션하기 위한 수단,
1c:반응액에 전압 펄스를 인가하기 위한 수단,
1d:펄스 전압의 인가시에서의 반응액의 온도를 0℃~20℃로 하기 위한 수단, 및
1e:반응액에 포함되는 담체 입자와 담체 입자의 응집 덩어리 중 어느 하나 또는 모두를 계수하기 위한 수단.
상기 요소를 포함하는 본 발명의 측정 장치의 구성예를 도 1 또는 도 5에 나타냈다.
또한, 본 발명은 이하의 요소를 포함하는, 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정할 친화성 물질과의 결합을, 상기 담체 입자의 친화성 물질 또는 응집 시약에 의한 응집을 지표로 하여 측정하기 위한 측정 장치를 제공한다.
2a:측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정할 친화성 물질을 포함하는 시료를 포함하는 반응액 또는 더 부가적으로 응집 시약을 포함하는 반응액을 보유하기 위한 공간,
2b:반응액에 전압 펄스를 인가하기 위한 수단,
2c:반응액을 희석하기 위한 수단, 및
2d:반응액에 포함되는 담체 입자와 담체 입자의 응집 덩어리 중 어느 하나 또는 모두를 계수하기 위한 수단.
상기 요소를 포함하는 본 발명의 측정 장치의 구성예를 도 11에 나타냈다.
본 발명에 있어서, 요소 1a 및 2a:반응액을 보유하기 위한 공간은 반응액을 보유하기 위한 임의의 공간을 이용할 수 있다. 소량의 시료를 반응시키기 위해서는 소용량의 공간이 유리하다. 예를 들면 1μL~1OmL, 바람직하게는 10~500μL 정도의 공간을 이용할 수 있다. 이 공간은, 필요에 따라서 시료나 시약의 공급 수단, 또는 후술하는 담체 입자의 계측 수단을 장비(裝備)할 수도 있다. 공간에 수용되는 반응액은 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상인 친화성 물질을 포함하는 시료로 구성된다. 또는 응집 저지 반응계에서는 응집 시약 성분이 더 첨가된다.
본 발명에 있어서, 요소 1a:반응액을 보유하기 위한 공간에는, 1b:반응액의 온도를 37℃~90℃에서 인큐베이션하기 위한 수단이 장비된다. 반응액을 소정의 온도로 유지하기 위해서는, 예를 들면 온도 센서와 가열 수단을 이용할 수 있다. 가열 수단으로는 히터나 펠티에 소자를 이용할 수 있다.
다음에 본 발명에서의 요소 1c 및 2b:반응액에 전압 펄스를 인가하기 위한 수단에 대해서 설명하기로 한다. 전압 펄스는 반응액에 접촉된 전극을 통해 인가된다. 담체 입자를 전기장에 정렬되도록 하기 위한 전극은, 예를 들면 상술한 선행 기술 문헌에서도 이용되고 있다. 이들 주지의 전극을 본 발명에 이용할 수 있다. 본 발명의 장치에는 전극에 전압을 공급하기 위한 전원을 장비할 수 있다.
본 발명의 장치에 있어서 전압 펄스를 인가하기 위한 전극은, 적어도 1세트(2개)의 전극으로 구성된다. 복수의 다른 방향의 전압 펄스를 부여하기 위해서 3개 이상의 전극을 구비할 수도 있다. 예를 들면, 3개의 전극(A, B, C)을 배치하고, A-B간, B-C간, 및 A-C간의 3가지 방향의 전압 펄스를 인가할 수 있다. 이 밖에, 2세트(4개)의 전극을 배치하여 직교하는 전압 펄스를 인가할 수도 있다.
또한, 다른 방향의 전압 펄스를 인가하기 위해서, 전극을 구동하는 기구를 구비할 수 있다. 예를 들면, 반응액 중에서 전극을 회전시킴으로써 복수의 다른 방향에서 전압 펄스를 인가할 수 있다. 또한 본 발명의 장치는, 반응액을 교반하는 수단, 반응액을 진탕하는 수단, 또는 반응액에 진동을 주는 수단을 구비할 수 있다. 이들 수단은 모두 복수회의 전압 펄스의 사이에 담체 입자를 분산시키기 위한 수단으로서 유용하다.
본 발명의 장치는 요소 2c:반응액을 희석하기 위한 수단을 갖는다. 본 발명에 있어서, 반응액을 희석하는 수단을 이하, 희석 수단으로 기재할 수 있다. 희석 수단은, 예를 들면 희석액을 보유하고, 반응액의 적어도 일부를 채취하여 희석액과 혼합하기 위한 기구에 의해 구성된다. 또, 희석 수단은 소정의 희석 배수를 부여하는 희석액을 수용할 수 있는 공간으로 구성된다. 본 발명에서의 희석 배수는, 예를 들면 100배 이상, 일반적으로 1000배 이상, 구체적으로는 1000~100000배, 바람직하게는 2000~40000배이다.
본 발명의 희석 수단은 바람직하게는, 응집 덩어리를 형성하고 있는 결합을 강화할 수 있는 기구를 구비하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 전압 펄스 인가 조건하에서 반응액과 희석액을 혼합할 수 있는 희석 수단은 본 발명에서 바람직한 희석 수단이다. 예를 들면, 상기 희석액을 보유하는 공간에, 희석액에 전압 펄스를 인가하기 위한 전극을 배치할 수 있다. 또는 본 발명에서의 희석 수단은, 반응액에 결합 강화제를 첨가하기 위한 기구를 포함할 수 있다. 이들 응집 덩어리를 형성하고 있는 결합을 강화하기 위한 구성은 단독으로, 또는 양자를 조합하여 장비할 수 있다.
본 발명의 장치는, 1d:펄스 전압의 인가시에서의 반응액의 온도를 0℃~20℃로 하기 위한 수단을 구비한다. 반응액을 0℃~20℃로 유지하기 위한 바람직한 수단으로 온도 센서와 펠티에 소자를 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 장치는, 요소 1e 및 2d:반응액에 포함되는 담체 입자와 담체 입자의 응집 덩어리 중 어느 하나 또는 모두를 계수하기 위한 수단을 포함한다. 상기 계수 수단은 상기 공간에 장비할 수 있다. 또는 상기 공간에 보유된 반응액을 상기 공간에서 꺼내어, 계수 수단에 도입한 후에 계수할 수도 있다. 또한, 상기 계수 수단은, 예를 들면 희석된 반응액에 포함되는 담체 입자를 해석하기 위한 기구를 포함한다. 또는 희석액을 보유하는 공간으로부터 희석된 반응액을 꺼내어 계수 수단에 도입한 후에 입자를 계수할 수도 있다. 담체 입자 또는 응집 덩어리는, 2차원적인 화상 정보, 또는 3차원적인 물리적인 정보에 의거하여 해석할 수 있다.
3차원 정보를 지표로 하여 응집하거나, 또는 응집하지 않은 담체 입자를 계수하는 수단으로는 쿨터 원리, 또는 레이저 회절 산란법을 이용한 계측 수단을 이용할 수 있다. 쿨터 원리를 위해서는, 예를 들면 상기 공간 내의 반응액을, 쿨터 원리를 위한 전극을 구비한 어퍼쳐에 도입하여 필요한 해석이 이루어진다. 어퍼쳐의 사이즈는 상술한 기준을 바탕으로 적절히 조절할 수 있다. 시약에 사용하는 입자의 직경, 또는 예측되는 응집 입자의 비율에 따라서 다른 사이즈를 갖는 복수의 어퍼쳐를 전환하여 이용하는 기구를 채용할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 장치는 복수의 어퍼쳐에 반응액을 유도하기 위한 유로 전환 기구를 구비할 수 있다. 또한, 시약의 종류나, 예측되는 응집 입자의 비율 등에 의거하여 유로를 자동적으로 선택하는 기구를 조합할 수도 있다. 또는, 본 발명의 장치는 어퍼쳐 사이즈의 전환에 의해 자동적으로 검출 감도를 조절하는 기구를 구비할 수 있다. 검출 감도의 조절 기구로서, 예를 들면 먼저 비교적 큰 어퍼쳐 사이즈로 해석하고, 응집 입자의 비율이 적다고 예측된 경우에 더 작은 어퍼쳐로 전환하는 기구를 들 수 있다. 레이저 회절 산란법을 이용하는 경우도 마찬가지로, 해석을 위한 광학 셀에 반응액을 도입하여 해석할 수도 있다. 3차원 정보를 지표로 하는 담체 입자 및/또는 응집 덩어리의 해석 기구는 본 발명에서의 계수 수단으로서 바람직하다.
본 발명에 있어서, 전기장에서 펄 체인화된 담체 입자는, 필요에 따라 재분산시킨 후에 계수할 수 있다. 본 발명의 장치에는 담체 입자의 재분산을 위한 기구를 장비할 수 있다. 담체 입자는 희석이나 초음파 처리에 의해 재분산시킬 수 있다.
본 발명의 장치를 구성하는 상기 (1a)~(1e)요소, 혹은 (2a)-(2d)요소는 하나의 연속되는 유로 내에 배치할 수 있다. 또는, 각 요소를 불연속적인 공간으로서 구성하고, 각 요소의 사이에 반응액을 이동시킴으로써 본 발명의 측정 방법을 실시할 수도 있다.
본 발명의 장치에는, 상기 측정 방법을 실시하기 위한 부가적인 기구를 조합할 수 있다. 본 발명의 장치에 조합할 수 있는 부가적인 기구를 이하에 예시한다.
시료의 분류 기구
시료의 희석 기구
측정 결과의 기록 기구
측정 결과의 표시 기구
측정 결과의 인쇄 기구
도 1(A)는 본 발명에 따른 장치의 구성을 나타내는 도면이고, 도 1(B)는 본 발명에 따른 장치를 구성하는 펄스 인가조의 단면을 나타내는 도면이고,
도 2는 도 1의 구성을 갖는 측정 장치에 의해 본 발명의 측정 방법을 실시했을 때에 얻어진 측정 결과(전처리 온도와의 관계)를 나타내는 그래프로서, 그래프의 종축은 응집율(%)을, 횡축은 AFP 농도(ng/mL)를 나타내며,
도 3은 도 1의 구성을 갖는 측정 장치에 의해 본 발명의 측정 방법을 실시했을 때에 얻어진 측정 결과(고온하에서의 전처리 시간과의 관계)를 나타내는 그래프이고,
도 4는 도 1의 구성을 갖는 측정 장치에 의해 본 발명의 측정 방법을 실시했을 때에 얻어진 측정 결과(반응 촉진제와의 관계)를 나타내는 그래프로서, 그래프 에서 플롯은 각각 다음 결과를 나타낸다. 백색 사각형:항원량 0 ng/mL(블랭크 값) 백색 동그라미:항원량 9.5 ng/mL, 흑색 동그라미:블랭크 보정(9.5~0 ng/mL)
도 5(A)는 본 발명에 따른 장치의 구성을 나타내는 도면이고, 도 5(B)는 본 발명에 따른 장치를 구성하는 펄스 인가조의 단면을 나타내는 도면으로. 도면 중의 부호는 각각 부호의 설명에 기재한 요소를 나타내고,
도 6은 도 5의 구성을 갖는 측정 장치에 의해 전압 펄스를 인가하는 동안의 반응액을 저온으로 유지하는 본 발명의 측정 방법을 실시했을 때에 얻어진 측정 결과를 나타내는 그래프로서, 그래프의 종축은 응집율(%)을, 횡축은 AFP 농도(ng/mL)를 나타내고,
도 7은 도 6의 대조군(전압 펄스를 인가하는 동안의 반응액의 온도 제어 없음:실온)의 결과를 나타내는 그래프로서, 그래프의 종축은 응집율(%)을, 횡축은 AFP 농도(ng/mL)를 나타내고,
도 8은 도 6의 대조군(전압 펄스를 인가하지 않고, 37℃에서 20분간 인큐베이션)의 결과를 나타내는 그래프로서, 그래프의 종축은 응집율(%)을, 횡축은 AFP 농도(ng/mL)를 나타내고,
도 9는 본 발명에 따른 전립선 특이 항원(PSA)의 측정에 있어서, 반응액에 첨가된 소혈청 알부민(BSA)의 담체 입자의 응집율에 미치는 영향을 나타내는 그래프로서, 그래프의 종축은 응집율(%)을, 횡축은 반응액에서의 BSA의 최종 농도를 나타낸다. 각 칼럼은 좌측에서 순서대로 PSA 0 ng/mL, 9.5 ng/mL 및 32 ng/mL의 결과를 나타낸다. 그래프 중에는 각 BSA 농도에서의 PSA 0 ng/mL에서의 응집율과, 9.5 ng/mL에서의 응집율의 차이(흑색 사각형) 및 32 ng/mL에서의 응집율의 차이(백색 동그라미)를 모두 나타내었으며,
도 10은 반응액의 점도에 미치는 반응액 중의 소혈청 알부민(BSA)의 농도와 온도의 영향을 나타내는 그래프로서, 그래프의 종축은 점도(mPas)를, 횡축은 온도(℃)를 나타내고,
도 11(A)는 담체의 응집 상태를 측정하기 위한 장치의 개략적인 도면이고, 도 11(B)는 도 11(A)의 희석조(5)의 개략적인 도면이고,
도 12는 AFP 컨트롤 혈청을 검체액으로 하고, 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 담체로 하여 반응을 행한 경우의 담체의 응집율을 나타내는 그래프로서, 인가하여 희석한 경우의 응집율을 흑색 마름모, 인가하지 않고 희석한 경우의 응집율을 백색 사각형으로 나타내었으며, 그래프의 종축은 응집율을 나타내고, 횡축은 AFP의 농도를 나타내며,
도 13은 AFP 컨트롤 혈청을 검체액으로 하고, 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 담체로 하여 반응을 행한 경우의 담체의 응집율을 나타내는 그래프로서, 인가하여 희석한 경우의 응집율을 흑색 동그라미, 인가하지 않고 희석한 경우의 응집율을 백색 사각형, 미리 인가해 놓은 희석액으로 희석한 경우의 응집율을 흑색 삼각형으로 나타내었으며, 그래프의 종축은 응집율을, 횡축은 AFP의 농도를 나타내고,
도 14는 PSA 컨트롤 혈청을 검체액으로 하고, 항 PSA 항체 감작 라텍스 시약을 담체로 하여, 반응 촉진 시약을 첨가하여 반응을 행한 경우의 담체의 응집율을 나타내는 그래프로서, 인가하여 희석한 경우의 응집율을 흑색 마름모꼴, 인가하지 않고 희석한 경우의 응집율을 흑색 사각형, 미리 인가해 놓은 희석액으로 희석한 경우의 응집율을 백색 삼각형으로 나타내었으며, 그래프의 종축은 응집율을, 횡축은 PSA의 농도를 나타내고,
도 15는 2.0μm의 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 담체로 하여 AFP 컨트롤 혈청과 반응시킨 경우의 담체의 응집율을 나타내는 그래프로서, 인가하여 희석한 우의 응집율을 흑색 마름모꼴, 인가하지 않고 희석한 경우의 응집율을 백색 사각으로 나타내었으며, 그래프의 종축은 응집율을, 횡축은 AFP의 농도를 나타내고,
도 16은 3μm의 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 담체로 하여 AFP 컨트롤 혈청과 반응시킨 경우의 담체의 응집율을 나타내는 그래프로서, 인가하여 희석한 경우의 응집율을 흑색 마름모꼴, 인가하지 않고 희석한 경우의 응집율을 백색 사각형으로 나타내었으며, 그래프의 종축은 응집율을, 횡축은 AFP의 농도를 나타내고,
도 17은 4.5μm의 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 담체로 하여 AFP 컨트롤 혈청과 반응시킨 경우의 담체의 응집율을 나타내는 그래프로서, 인가하여 희석한 경우의 응집율을 흑색 마름모꼴, 인가하지 않고 희석한 경우의 응집율을 백색 사각형으로 나타내었으며, 그래프의 종축은 응집율을, 횡축은 AFP의 농도를 나타내고,
도 18은 AFP 컨트롤 혈청과 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 반응시킨 후, 0.25%, 2.5% 또는 25%의 글루타르알데이드를 첨가하여 초음파 처리를 행한 경우, 및 글루타르알데이드를 첨가하지 않고 초음파 처리를 행한 경우의 담체의 응집율을 나타내는 그래프로서, 그래프의 종축은 응집율을, 횡축은 초음파 처리 시간을 나타내고,
도 19는 AFP 컨트롤 혈청과 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 반응시킨 후, 글루타르알데이드를 첨가하여 0초, 15초, 30초 또는 60초간 인큐베이션하고 나서 초음파 처리를 행한 경우, 및 글루타르알데이드를 첨가하지 않고 초음파 처리를 행한 경우의 담체의 응집율을 나타내는 그래프로서, 그래프의 종축은 응집율을, 횡축은 초음파 처리 시간을 나타내고,
도 20은 2.0μm의 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 담체로 하여 AFP 컨트롤 혈청과 반응시킨 후, 글루타르알데이드를 첨가하여 인큐베이션하고 나서 초음파 처리를 행한 경우, 및 글루타르알데이드를 첨가하지 않고 초음파 처리를 행한 경우의 담체의 응집율을 나타내는 그래프로서, 그래프의 종축은 응집율을, 횡축은 초음파 처리 시간을 나타내고,
도 21은 2.8μm의 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 담체로 하여 AFP 컨트롤 혈청과 반응시킨 후, 글루타르알데히드를 첨가하여 인큐베이션하고 나서 초음파 처리를 행한 경우, 및 글루타르알데히드를 첨가하지 않고 초음파 처리를 행한 경우의 담체의 응집율을 나타내는 그래프로서, 그래프의 종축은 응집율을, 횡축은 초음파 처리 시간을 나타내고,
도 22는 1.7μm의 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 담체로 하여 AFP 컨트롤 혈청과 반응시킨 후, 글루타르알데히드를 첨가하여 인큐베이션하고 나서 초음파 처리를 행한 경우, 및 글루타르알데히드를 첨가하지 않고 초음파 처리를 행한 경우의 담체의 응집율을 나타내는 그래프로서, 그래프의 종축은 응집율을, 횡축은 초음파 처리 시간을 나타낸다.
본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술 문헌은 참고로 본 명세서에 통합된다. 이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 한다.
<실시예 1:항원 항체 반응의 촉진화>
(1)AFP 항체 감작 라텍스 시약의 제조
0.1mg의 항α페토프로틴(AFP) 항체(다코사 제품)를 1mL의 글리신 완충액(50mM 글리신, 50mM 염화 나트륨, 0.09% 소듐 아자이드 함유, 이하 GBS로 약칭함)에 용해시키고, 2.0μm의 라텍스(세키스이 화학 공업사 제품, 고형분 1% 현탁액) 1mL을 첨가하여 37℃에서 2시간 교반한 후, 감작한 라텍스를 원심분리하여 상층액을 제거했다. 침전물을 0.5%의 소혈청 알부민의 글리신 완충액(0.5%의 BSA-GBS) 1mL에 현탁시켜, 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)측정 장치
도 1(A)의 장치를 사용하여 친화성 물질(AFP)을 항원 항체 반응에 의해 측정했다. 도 1의 장치는 검체와 시약 1(완충액)을 분주하여 혼합하고, 다시 시약 2(라텍스 시약)를 분주하여 혼합하며, 반응액으로 만들기 위한 분주·교반조(1) 및 온도 컨트롤 기구(2)를 구비한다. 단, 실제로는, 제1시약계의 경우에는 시약 1(완충액)의 분주는 생략할 수 있다. 다음에 반응조(3)(펄스 인가조)로 반응액을 이동시키고, 전극(4)을 통해서 반응액에 전압 펄스를 수초 내지 수십초간 인가시킨다. 전기장에 놓인 담체 입자는 펄 체인화된다. 전압 펄스를 인가받은 반응액은 희석조(5)에서 희석되고, 입도 분포계(6)를 사용하여 담체의 응집 상태가 측정된다. 펄 스 인가조의 단면은 도 1(B)에 나타낸다. 전극간의 거리는 0.8mm, 전극의 두께는 0.03mm, 전극의 길이는 20mm이다.
(3)검체의 측정
0.5%의 BSA-GBS를 사용하여, AFP 항원액을 희석하여 농도 0, 0.0075 및 0.015ng/mL의 검체액을 제조했다. 이들 검체 3μL과 상술한 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약 3μL을 시험관에 넣고 혼합했다. 20초간, 45℃, 62℃, 80℃ 중 어느 하나에서 인큐베이션한 후, 즉시 전극이 부착된 반응 셀에 주입했다. (2)의 장치를 사용하여 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±12V/mm의 전해 강도로 30초간 전압 펄스를 인가했다. 30초간 인가 후 즉시 전기장을 제거하고 반응액을 생리 식염수에 희석하고, 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 라텍스의 응집율(Agglutination Ratio;AR;%)을 이하의 식에 의해 구했다.
AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)
(4)대조군의 측정
대조군 1:(3)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약 3μL씩 시험관에 넣고, 25℃에서 20초간 인큐베이션한 후, 전극이 부착된 반응 셀에 주입하여 (3)과 마찬가지로 고주파 전압을 인가했다. 25℃에서의 인큐베이션 이외의 조작은 (3)의 조작과 동일하게 했다. 그 결과를 도 2의 「비교예 1」로서 나타냈다.
대조군 2:(3)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약 3μL씩 시험관에 넣고, 37℃에서 20분간 인큐베이션했다. 이 반응액 0.5μL을 20mL의 생리 식염수 20mL에 희석하여, (3)과 마찬가지로 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분 포를 측정하여 응집율을 산출했다. 그 결과를 도 2의 「비교예 2」로서 나타냈다.
(5)결과
각 검체 및 각 대조군의 측정 결과를 도 2에 나타냈다. 전압 펄스를 인가하기 전의 반응액을 고온하(45℃, 62℃, 또는 80℃)에서 20초간 인큐베이션한 본 발명의 조건에서는, 전압 펄스를 인가하기 전의 반응액은 실온(25℃)에서 제조하고, 고온 처리를 하지 않은 종래의 방법(대조군 1, 도 2의 「비교예 1」)에 비해 높은 응집율이 확인되었다. 또한, 펄스 전압을 인가하지 않는 일반적인 라텍스 응집법에서, 37℃에서 20분간 인큐베이션을 행한 대조군 2(도 2의 「비교예」)에서는, 0.015pg/mL의 저농도역의 반응은 인정되지 않았다. 이 결과로부터, 본 발명의 방법은 종래의 방법(펄스 전압을 인가하기 전의 온도 처리 없음)보다 더 고감도로 측정할 수 있음이 확인되었다.
<실시예 2:항원 항체 반응의 촉진>
(1)AFP 항체 감작 라텍스 시약의 제조
실시예 1과 마찬가지로 하여, 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)측정 장치
도 1의 장치를 사용하여 친화성 물질(항원 항체 반응)을 측정했다.
(3)검체의 측정
0.5%의 BSA-GBS를 사용하여, AFP 항원액을 희석하여 농도 0, 0.0075 및 0.015ng/mL의 검체액을 제조했다. 이들 검체 3μL과 상술한 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약 3μL을 시험관에 넣고 혼합했다. 62℃에서 5초, 20초, 또는 180초 중 어느 하나의 시간동안 인큐베이션을 행한 후, 즉시 전극이 부착된 반응 셀에 주입하여 상술한 장치를 사용하여, 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±12V/mm의 전해 강도로 30초간 인가하여 펄 체인을 형성시켰다. 이 30초간의 인가 후, 즉시 전기장을 제거하고 반응액을 생리 식염수에 희석하고, 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 라텍스의 응집율(Agglutination Ratio;AR;%)을 이하의 식에 의해 구했다.
AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)
(4)대조군의 측정
전압 펄스를 인가하기 전에 고온 처리를 하지 않은(0초) 것 이외에는 (3)과 동일하게 하여 측정했다.
(5)결과
결과를 도 3에 나타냈다. 「5초」, 「20초」 또는 「180초」로 하여 나타내는 본 발명의 조건(전압 펄스를 인가하기 전의 반응액을 고온하(62℃)에서 5초, 20초, 또는 180초 인큐베이션)에서는, 「Osec」로서 나타내는 종래의 방법(전압 펄스를 인가하기 전의 고온 처리 없음)에 비해 응집율이 높아졌다. 즉, 본 발명에 의해 종래의 방법보다 더욱 고감도로 측정할 수 있음이 확인되었다.
<실시예 3:항원 항체 반응의 촉진화>
(1)PSA 항체 감작 라텍스 시약(시약 2)의 제조
0.1mg의 항 PSA 항체(다코사 제품)를 1mL의 글리신 완충액(50mM 글리신, 50mM 염화 나트륨, 0.09% 소듐 아자이드 함유, 이하, GBS로 약칭함)에 용해시키고, 2.0μm의 라텍스(세키스이(淸水) 화학 공업사 제품, 고형분 1%의 현탁액) 1mL을 첨가하여 37℃에서 2시간 교반한 후, 감작한 라텍스를 원심분리하여 상층액을 제거했다. 침전물을 0.5%의 소혈청 알부민의 글리신 완충액(0.5%의 BSA-GBS) 1mL에 현탁시켜 항 PSA 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)PEG20000을 함유하는 Tris 염산 완충액(시약 1)의 제조
0.5%의 소혈청 알부민의 50mM-Tris 염산 완충액(50mM Tris, 50mM 염화 나트륨, 0.09% 소듐 아자이드 함유, pH 8.4)에 폴리에틸렌글리콜(분자량 20000, 이하 PEG20000로 약칭함)을 0.1~1.0% 함유하는 반응 촉진 시약을 제조했다.
(3)대조군 Tris 염산 완충액의 제조
대조군으로 PEG20000을 포함하지 않는 것 이외에는 (2)에 기재된 시약과 동일한 성분의 시약을 제조했다.
(4)측정 장치
도 1의 장치를 사용하여 친화성 물질(항원 항체 반응)을 측정했다. 온도 컨트롤 기구(2)는 실온으로 설정했다.
(5)검체 및 대조군의 측정
0.5%의 BSA-GBS를 사용하여 PSA 항원액을 희석하여 농도 0 및 9.5ng/mL의 검체액을 제조했다. 이들 검체 1μL과 PEG2O000을 0~1.0% 함유하는 0.5%의 BSA-Tris 염산 완충액 3μL을 혼합한 후, 상술한 항 PSA 항체 감작 라텍스 시약 3μL을 시험관에 넣고 혼합한 후, 즉시 전극이 부착된 반응 셀에 주입했다. 상술한 장치를 사용하여 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±12V/mm의 전해 강도로 전압 펄스 를 30초간 인가했다. 30초간 인가 후, 즉시 전기장을 제거하고 반응액을 생리 식염수에 희석하고, 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 라텍스의 응집율(Agglutination Ratio;AR;%)을 이하의 식에 의해 구했다.
AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)
(6)결과
결과를 도 4에 나타냈다. 도 4로부터 수용성 고분자 화합물인 PEG를 사용함으로써 응집율이 증가함이 확인되었다. 이로부터, 본 발명은 대조군에 비해 더욱 고감도로 측정할 수 있음이 확인되었다.
<실시예 4:응집 반응 촉진>
(1)항 AFP 항체 감작 라텍스 시약의 제조
실시예 1과 마찬가지로 하여 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)측정 장치
도 5(A)의 장치를 사용하여 AFP를 항원 항체 반응에 의해 측정했다. 도 5(A)의 장치는 검체와 시약 1(완충액)을 분주하여 혼합하고, 다시 시약 2(라텍스 시약)를 분주하여 혼합하여, 반응액으로 만들기 위한 분주·교반조 및 온도 컨트롤 기구를 구비한다. 다만 실제로는, 제 1 시약계의 경우에는 완충액의 분주를 생략할 수 있다. 다음에 반응조(2)(펄스 인가조)로 반응액을 이동시키고, 전극(3)을 통해서 전압 펄스를 수초 내지 수십초간 인가한다. 이 때 반응조는 온도 컨트롤 유닛에 의해 4℃로 냉각된다. 전압 펄스를 인가받은 반응액은 희석조(5)에서 희석되고, 입도 분포계(6)를 사용하여 담체의 응집 상태가 측정된다. 도 5(B)는 펄스 인가조의 단 면을 나타내는 도면이다. 전극간의 거리는 0.8mm, 전극의 두께는 0.03mm, 전극의 길이는 20mm이다.
(3)검체의 측정
0.5%의 BSA-GBS를 사용하여, AFP 항원액을 희석하여 농도 0 및 0.0075ng/mL의 검체액을 제조했다. 이들 검체 3μL과 상술한 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약 3μL을 시험관에 넣고 혼합하여, 즉시 전극이 부착된 반응 셀에 주입했다. 상술한 장치를 사용하여 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±12V/mm의 전해 강도로 반응액에 전압 펄스를 30초간 인가했다. 이 때, 반응 셀의 온도는 4℃로 유지했다. 30초간 인가 후, 즉시 전기장을 제거하고 반응액을 생리 식염수에 희석하고, 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 라텍스의 응집율(Agglutination Ratio;AR;%)을 이하의 식에 의해 구했다.
AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)
상술한 조작을 마찬가지로 5회 반복하여 측정하고, 측정 결과의 평균값 및 평균값±2.6SD를 구하여 도 6에 나타냈다.
(4)대조군의 측정
대조군 1:(3)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약을 사용하여, 반응 셀의 온도를 22℃로 하는 것 이외에는 모두 (3)의 조작과 동일하게 했다. 그 결과를 도 7에 나타냈다.
대조군 2:(3)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약 3μL씩 시험관에 넣고, 37℃에서 20분간 인큐베이션했다. 이 반응액 0.5μL을 20mL의 생리 식염수 20mL에 희석하고, (3)과 마찬가지로 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 응집율을 산출했다. 또, (3)과 마찬가지로 5회 반복하여 측정하고, 그 결과를 도 8에 나타냈다.
(5)결과
항원 농도가 0ng/mL인 경우의 측정값(백그라운드 시그널)을 어떤 농도의 항원을 측정했을 때의 값과 식별할 수 있다면, 이 농도의 항원을 측정할 수 있다. 측정 가능한 항원 농도의 최소값이 검출 한계이다. 예를 들면, 다음 값 A와 B의 중첩이 없다면, 0.0075ng/mL 이상의 항원을 검출할 수 있다.
측정값 A:항원량 0ng/mL과 0.0075ng/mL을 반복해서 측정했을 때, 「0ng/mL을 측정한 응집율의 평균값+2.6SD
측정값 B:0.0075ng/mL을 측정한 응집율의 평균값-2.6SD
도 6, 도 7 및 도 8로부터 각 조건에서의 검출 한계를 비교했다. 본 발명의 방법(도 6)의 검출 한계는 0.0075ng/mL임을 알 수 있다. 한편, 대조군으로 한 종래의 방법(도 7 및 도 8)에서는 이 농도를 검출할 수 없다는 것이 확인되었다. 이로부터, 전압 펄스의 인가 중인 반응액을 저온으로 유지하는 본 발명은 종래의 방법에 비해 매우 단시간에 더욱 고감도로 측정할 수 있음이 확인되었다.
<실시예 5:응집 반응 촉진화>
(1)항 PSA 항체 감작 라텍스 시약(시약 2)의 제조
실시예 3과 마찬가지로 하여 항 PSA 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)Tris 염산 완충액(시약 1)의 제조
Tris 염산 완충액(50mM Tris, 50mM 염화 나트륨, 0.09% 소듐 아자이드, 0.25% PEG20000을 함유, pH 8.4)에 소혈청 알부민(이하, BSA로 약칭함)을 0.5%, 2.5%, 5%, 7.5% 및 10% 함유하는 시약 1을 각각 제조했다.
(3)측정 장치
도 1의 장치를 사용하여 친화성 물질(항원 항체 반응)을 측정했다. 온도 컨트롤 기구(2)는 실온으로 설정했다.
(4)측정
0.5%의 BSA-GBS를 사용하여, PSA 항원액을 희석하여 농도 0, 9.5 및 32ng/mL의 검체액을 제조했다. 이들 검체 1μL과, 0.5%, 2.5%, 5%, 7. 5%, 또는 10%의 BSA를 포함하는 Tris 완충액 3μL을 혼합한 후, 상술한 항 PSA 항체 감작 라텍스 시약 3μL을 부가하고 혼합한 후, 즉시 전극이 부착된 반응 셀에 주입했다. 상술한 장치를 사용하여, 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±12V/mm의 전해 강도로 전압 펄스를 30초간 인가했다. 30초간 인가 후, 즉시 전기장을 제거하고 반응액을 생리 식염수에 희석하고, 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 라텍스의 응집율(Agglutination Ratio;AR;%)을 이하의 식에 의해 구했다.
AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)
또한, 최종 반응액 중의 BSA 농도는 0.5%, 1.4%, 2.4%, 3.5%, 4.6%이다. 여기서 최종 반응액 중의 BSA 농도 0.5%는 대조군으로서 비교했다.
(5)반응액의 온도 측정
상술한 측정 방법으로 펄 체인을 형성했을 때의 반응액의 온도 변화를 측정 했다.
(6)최종 반응액의 점도 측정
상술한 최종 반응액(BSA 농도 0.5%~4.6%), BSA 농도 0.3% 및 6.8%의 반응액의 4~52℃에서의 점도를 진동식 점도계(viscomate)를 사용하여 측정했다.
(7)결과
[표 1]
최종 반응액 중의 BSA 농도 인가전 차단 직전
0.5% 24℃ 37℃
1.4% 24℃ 38℃
2.4% 25℃ 37℃
3.5% 25℃ 38℃
4.6% 24℃ 37℃
결과를 도 9, 도 10 및 표 1에 나타냈다. 도 9에 도시한 바와 같이, 최종 반응액 중의 BSA 농도를 0.5%에서 2.4%로 상승시킴에 따라 각 농도의 응집율이 상승했다. PSA 0ng/mL(블랭크)에서도 응집율이 상승하는 경향을 나타냈기 때문에, 블랭크 보정한 응집율을 비교했다. 그 결과, 최종 반응액 중의 BSA 농도를 0.5%에서 2.4%로 상승시킴에 따라 현저하게 응집율이 상승한다는 것이 확인되었다. 즉 본 발명에 의해서 더욱 고감도화할 수 있음이 확인되었다.
도 10으로부터, 최종 반응액 중의 BSA 농도와 점도의 관계, 및 반응액 중의 온도와 점도의 관계가 나타났다. 먼저, 도 9 및 도 10으로부터, 펄 체인형성중에 온도 제어를 하지 않는 조건하에서는, 최종 반응액 중의 BSA 농도를 0.5%에서 2.4%로 상승시킴으로써 응집율이 상승하는 것을 알 수 있었다. 이 때, 최종 반응액 중의 점도는 0.75에서 0.9mPas로 상승했다. 즉, 최종 반응액 중의 점도를 0.75에서 0.9mPas로 조정함으로써 고감도화할 수 있음이 확인되었다.
표 1은 교류 전압을 인가하여 펄 체인을 형성시켰을 때의 반응액의 온도 변화를 측정한 결과이다. 인가 전의 반응액의 온도는 실온(약25℃)이었으나, 인가 후에는 약 37℃로 상승했다. 한편, 종래의 방법에서는 최종 반응액 중의 BSA 농도는 0.5% 정도였으나, 전압 펄스의 인가에 의한 온도 상승에 의해 반응액의 점도는 0.8mPas미만(0.6-0.75mPas)이었다. 이상으로부터, 반응액의 점도를 0.8~0.9mPas의 조건하에서 교류 전압을 인가함으로써 더욱 고감도로 측정할 수 있음이 확인되었다.
또한, 실시예 4에서 나타낸 전압 펄스의 인가 중인 반응액의 온도를 저온으로 유지하는 본 발명에 따른 반응액의 점도는 표 1로부터 1.4mPas임을 알 수 있다. 이로부터, 반응액 중의 점도를 0.8~3mPas의 조건하에서 교류 전압을 인가함으로써, 더욱 고감도로 측정할 수 있음을 알 수 있다. 이상의 결과에 의해, 감도의 향상을 위한 바람직한 점도는 1~3mPas이고, 보다 바람직하게는 1~2mPas임이 확인되었다.
<실시예 6>
(1)항 AFP 항체 감작 라텍스 시약의 제조
0.1mg의 항 AFP 항체(다코사 제품)를 1mL의 글리신 완충액(50mM 글리신, 50mM 염화 나트륨, 0.09% 소듐 아자이드 함유, 이하 GBS로 약칭함)에 용해시키고, 2.06μm의 라텍스(폴리 사이언스사 제품, 고형분 1.0%의 현탁액) 1mL을 첨가하여 37℃에서 2시간 교반한 후, 감작한 라텍스를 원심분리하여 상층액을 제거했다. 침전물을 0.5%의 소혈청 알부민의 글리신 완충액(0.5%의 BSA-GBS) 1mL에 현탁시켜 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)측정 장치
도 11(A)의 장치를 사용하여 생물학적 특이적 응집 반응(항원 항체 반응)을 측정했다. 도 11(A)의 장치는, 검체와 시약 1(완충액: 제 2 시약계인 경우에 적용. 제 1 시약계/라텍스 시약뿐인 경우에는 불필요)을 분주하여 혼합하고, 다시 시약 2(라텍스 시약)를 분주하여 혼합하기 위한 분주·교반조 온도 컨트롤 기구(1)를 구비한다. 분주·교반조 온도 컨트롤 기구(1)에서 반응액이 혼합된 후, 다음에 반응조(펄스 인가조)(3)로 반응액을 이동시키고, 전극(4)을 통해서 전압 펄스를 수초 내지 수십초간 인가하여 펄 체인화시켰다. 반응액은 펄 체인화된 후에 희석(희석조(5))되어, 입도 분포계(6)를 사용하여 담체의 응집 상태를 측정했다.(온도 컨트롤 기구(1, 2)는 OFF로 설정했다.)
희석조(5)의 개략은 도 11(B)에 나타낸다. 희석 용기(103)에 희석액이 분주되고, 대향 전극(101) 사이에 반응액이 분주된다.
(3)검체의 측정
AFP 컨트롤 혈청 L(15.6ng/mL), M(125ng/mL), H(1000ng/mL) 및 프리 혈청(0 ng/mL)을 검체액으로 하여 측정했다. 검체 3μL과 상술한 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약 3μL을 시험관에 넣어 혼합하고, 즉시 전극이 부착된 반응 셀에 주입하여 상술한 장치를 사용하여 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±12V/mm의 전해 강도로 30초간 인가하여 펄 체인을 형성했다. 이 30초간의 인가 후, 즉시 전기장을 제거하고 반응액을 생리 식염수에 희석했다. 희석은, 도 1(B)에 도시한 장치를 사 용하고, 희석액에 전극을 통해서 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±0.7V를 인가하면서 반응액을 첨가한 후, 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 라텍스의 응집율(AR)을 이하의 식에 의해 구했다.
AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)
(4)대조군의 측정
(2)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약을 사용했다. 펄 체인 형성 후에 반응액을 희석하는 공정에서 전기장을 인가하지 않고 희석한 것 이외에는 (3)과 동일하게 행했다. 그 결과를 도 12에 「대조군」으로서 나타냈다.
(5)결과
결과를 도 12에 나타냈다. AFP 1000ng/mL의 측정 결과(응집율)는, 본 발명의 방법 53.4%에 비해 대조군인 종래의 방법은 40.9%이었다. 즉, 본 발명의 방법에서는, 종래의 방법에 비해 반응액을 희석할 때 붕괴되는 응집 덩어리, 즉 특이적으로 응집한 담체 입자의 응집 덩어리의 붕괴를 약 20% 경감시킬 수 있었다. 또한, AFP 0 ng/mL의 측정 결과(응집율)는, 본 발명의 방법 7.4%에 비해 대조군으로서 종래의 방법은 10.6%이었다. 0ng/mL의 시료를 측정했을 때의 응집율은 비특이적인 응집에 동반하는 백그라운드라고 생각할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 의하면 비특이적인 응집이 억제된다. 이상의 결과로부터, 본 발명의 측정 방법은 응집율의 경사가 크고 직선성이 양호하다는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명에 의해 고감도이면서 넓은 농도 범위의 측정이 가능하다.
<실시예 7>
(1)항 AFP 항체 감작 라텍스 시약의 제조
실시예 6과 마찬가지로 하여 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)측정 장치
도 11의 장치를 사용하여 친화성 물질(항원 항체 반응)을 측정했다.
(3)검체의 측정
AFP 컨트롤 혈청L(15.6ng/mL) 및 프리 혈청(0ng/mL)을 검체액으로 하여 측정했다. 검체 3μL과 상술한 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약 3μL을 시험관에 넣어 혼합하고, 즉시 전극이 부착된 반응 셀에 주입하여 상술한 장치를 사용하여 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±12V/mm의 전해 강도로 30초간 인가하여 펄 체인을 형성했다. 이 30초간의 인가 후, 즉시 전기장을 제거하고 반응액을 생리 식염수 20mL에 희석했다. 희석은, 도 11(B)에 도시하는 장치를 사용하고, 희석액에 전극을 통해서 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±0.7V를 인가하면서 반응액을 첨가한 후, 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 라텍스의 응집율(AR)을 이하의 식에 의해 구했다.
AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)
상술한 조작을 마찬가지로 5회 반복하여 측정하고, 측정 결과의 평균값 및 평균값±2SD를 구했다.
(4)대조군의 측정
대조군 1:(3)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약을 사용했다. 펄 체인 형성 후에 반응액을 희석하는 공정에서 전기장은 인가하지 않고 희석한 것 이외에는 (3)과 동일하게 행했다. 그 결과를 도 13의 「대조군 1」로 하여 나타냈다.
대조군 2:(3)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약을 사용했다. 반응액의 희석액에 미리 (3)과 동일한 조건의 전기장을 인가한 것을 희석액으로서 사용한 것 이외에는 (3)과 동일하게 행했다. 그 결과를 도 13에 「대조군 2」로 하여 나타냈다.
(5)결과
결과를 도 13에 나타냈다. AFP 15.6ng/mL의 측정 결과(응집율)는, 본 발명의 방법 35.7%에 비해 대조군인 종래의 방법은 32.6%이었다. 즉 본 발명의 방법에서는, 종래의 방법에 비해 반응액을 희석할 때 붕괴되는 응집 덩어리, 즉 특이적으로 응집한 담체 입자의 응집 덩어리의 붕괴를 약 10% 경감시킬 수 있었다. 또 AFP 0ng/mL의 측정 결과(응집율)는, 본 발명의 방법 5.6%에 비해 종래의 방법은 11.1%이었다. 0ng/mL의 시료를 측정했을 때의 응집율은, 비특이적인 응집에 동반하는 백그라운드라고 생각할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 의하면 비특이적인 응집이 억제된다. 또한, AFP 15.6ng/mL을 5중 측정했을 때의 CV값은, 본 발명의 방법 1.16%에 비해 종래의 방법은 4.28%이고, 측정의 재현성도 현저하게 향상되었다. 따라서, 본 발명에 의해 고감도이면서 고정밀도의 측정이 가능하다는 것이 확인되었다.
<실시예 8:항원 항체 반응 촉진화>
(1)항 PSA 항체 감작 라텍스 시약(시약 2)의 제조
0.1mg의 항 PSA 항체(다코사 제품)를 1mL의 글리신 완충액(50mM 글리신, 50mM 염화 나트륨, 0.09% 소듐 아자이드 함유, 이하, GBS로 약칭함)에 용해시키고, 2.06μm의 라텍스(폴리 사이언스사 제품, 고형분 1% 현탁액) 1mL을 첨가하여 37℃에서 2시간 교반한 후, 감작한 라텍스를 원심분리하여 상층액을 제거했다. 침전물을 0.5%의 소혈청 알부민의 글리신 완충액(0.5%의 BSA-GBS) 1mL에 현탁시켜 항 PSA 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)Tris염산 완충액(시약 1)의 제조
0.5%의 소혈청 알부민의 50mM-Tris 염산 완충액(50mM Tris, 50mM 염화 나트륨, 0.09% 소듐 아자이드 함유, pH 8.4)에 폴리에틸렌글리콜(분자량 20000, 이하 PEG 20000로 약칭함)을 0.25% 함유하는 반응 촉진 시약을 제조했다.
(3)측정 장치
도 11의 장치를 사용하여 친화성 물질(항원 항체 반응)을 측정했다.
(4)검체의 측정
PSA 컨트롤 혈청 L(9.5ng/mL), M(32ng/mL) 및 프리 혈청(0ng/mL)을 검체액으로 하여 측정했다. 검체 1μL과 상술한 Tris 염산 완충액 및 항 PSA 항체 감작 라텍스 시약 3μL을 시험관에 넣어 혼합하고, 즉시 전극이 부착된 반응 셀에 주입하여 상술 장치를 사용하여 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±12V/mm의 전해 강도로 30초간 인가하여 펄 체인을 형성시켰다. 이 30초간의 인가 후, 즉시 전기장을 제거하고 반응액을 GBS 20mL에 희석했다. 이 때의 희석 배율은 약 3300배이다. 희석은, 도 11(B)에 도시하는 장치를 사용하고, 희석액에 전극을 통해서 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±0.7V를 인가하면서 반응액을 첨가한 후, 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 라텍스의 응집율(AR) 을 이하의 식에 의해 구했다.
AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)
(5)대조군의 측정
대조군 1:(4)의 각 검체와 Tris 완충액 및 항 PSA 감작 라텍스 시약을 사용했다. 펄 체인 형성 후에 반응액을 희석하는 공정에서 전기장은 인가하지 않고 희석한 것 이외에는 (4)와 동일하게 행했다. 그 결과를 도 14에 「대조군 1」로 하여 나타냈다.
대조군 2:(4)의 각 검체와 Tris 완충액 및 항 PSA 감작 라텍스 시약을 사용했다. 반응액의 희석액에 미리 (4)와 동일한 조건의 전기장을 인가한 것을 희석액으로서 사용한 것 이외에는 (4)와 동일하게 행했다. 그 결과를 도 14의 「대조군 2」로 하여 나타냈다.
(6)결과
결과를 도 14에 나타냈다. PSA 32 ng/mL의 측정 결과(응집율)는 본 발명의 방법 35.7%에 비해 대조군인 종래의 방법은 30.3%이었다. 즉 본 발명의 방법에서는, 종래의 방법에 비해 반응액을 희석할 때 붕괴되는 응집 덩어리, 즉 특이적으로 응집한 담체 입자의 응집 덩어리의 붕괴를 약 20% 경감시킬 수 있었다. 또 PSA 0 ng/mL의 측정 결과(응집율)는, 본 발명의 방법 1.73%에 비해 종래의 방법은 2.45%이었다. 0ng/mL의 시료를 측정했을 때의 응집율은, 비특이적인 응집에 동반하는 백그라운드라고 생각할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 의하면 비특이적인 응집이 억제된다. 이상의 결과로부터, 본 발명의 측정 방법은 응집율의 경사가 크고 직선성 이 양호하다는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명에 의해 고감도이면서 넓은 농도 범위의 측정이 가능하다는 것이 확인되었다.
<실시예 9>
(1)항 AFP 항체 감작 라텍스 시약의 제조
실시예 6과 마찬가지로 하여 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다. 단, 2.0μm의 라텍스(세키스이 화학 공업사 제품), 3μm(폴리 사이언스사 제품) 및 4.5μm(폴리 사이언스사 제품)를 고형분 1.0%의 현탁액으로서 사용하여, 3종류의 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)측정 장치
도 11의 장치를 사용하여 친화성 물질(항원 항체 반응)을 측정했다.
(3)검체의 측정
상술한 3종류의 라텍스 시약을 사용하여 실시예 6과 동일하게 하여 측정했다.
(4)대조군의 측정
(3)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약을 사용했다. 펄 체인 형성 후에 반응액을 희석하는 공정에서 전기장은 인가하지 않고 희석한 것 이외에는 (3)과 동일하게 행했다. 그 결과를 도 15, 도 16, 및 도 17에 「대조군」으로 하여 나타냈다.
(5)결과
2.0μm, 3μm 및 4.5μm을 포함하는 라텍스 시약을 사용한 결과를 각각 도 15, 도 16 및 도 17에 나타냈다.
2.0μm의 라텍스 시약을 사용한 경우의 AFP 15.6ng/mL의 측정 결과(응집율)는 본 발명의 방법 35.8%에 비해 대조군인 종래의 방법은 24.1%이고, 특이적으로 응집한 응집 덩어리의 붕괴를 30% 경감시킬 수 있었다(도 15). 또, 도 15에서, AFP 0ng/mL의 측정 결과(응집율)는 본 발명의 방법 5.3%에 비해 종래의 방법은 8.0%이었다.
3μm의 라텍스 시약을 사용한 경우의 AFP 15.6ng/mL의 측정 결과(응집율)는, 본 발명의 방법 29.5%에 비해 대조군인 종래의 방법은 23.6%이고, 특이적으로 응집한 응집 덩어리의 붕괴를 20% 경감할 수 있었다(도 16). 또한 도 16에서, AFP 0ng/mL의 측정 결과(응집율)는 본 발명의 방법 13.6%에 비해 종래의 방법은 17.8%이었다.
또한 4.5μm의 라텍스 시약을 사용한 경우의 AFP 15.6ng/mL의 측정 결과(응집율)는, 본 발명의 방법 11.5%에 비해서 대조군인 종래의 방법은 3.0%이고, 특이적으로 응집한 응집 덩어리의 붕괴를 70% 경감할 수 있었다(도 17). 또한 도 17에서, AFP 0ng/mL의 측정 결과(응집율)는 본 발명의 방법 4.1%에 비해 종래의 방법은 2.5%이었다.
즉, 본 발명은 종래의 방법에 비해 특이적으로 응집한 담체 입자의 응집 덩어리의 붕괴를 경감시킬 수 있음이 확인되었다. 또한, 희석 시에 발생하는 비특이적인 응집도 억제할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의해 고감도의 측정이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 10>
(1)항 AFP 항체 감작 라텍스 시약의 제조
2.2mg의 항 AFP항체(다코사 제품) 0.1mL과 1.716μm의 라텍스(폴리사이언스사 제품, 고형분 2.5% 현탁액) 0.5mL 및 카르보디이미드 키트(폴리사이언스사 제품)를 사용하여 키트의 메뉴얼에 따라서 조작을 행하고, 항 AFP항체와 라텍스 입자를 화학 결합시켜 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)측정 장치
도 1의 장치를 사용하여, 친화성 물질(항원 항체 반응)을 측정했다.
(3)검체의 측정
AFP 컨트롤 혈청 H(1000ng/mL)을 검체액으로 하여 측정했다. 검체 3μL과 상술한 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약 3μL을 시험관에 넣어 혼합하고, 즉시 전극이 부착된 반응 셀에 주입하여 상술 장치를 사용하여, 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±12V/mm의 전해 강도로 30초간 인가하여 펄 체인을 형성시켰다. 이 30초간의 인가 후, 즉시 전기장을 제거하고 반응액에 0.25%~25%의 글루타르알데이드액(이하 GA액이라고 약칭함) 16μL을 첨가하여 37℃에서 60초간 인큐베이션한 후, 생리 식염수 20mL에 희석했다. 이 반응 희석액에 대해서, 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 라텍스의 응집율(AR)을 이하의 식에 의해 구했다.
AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)
다음에 반응 희석액의 나머지에 초음파를 30초, 60초간 인가한 후, 마찬가지 로 조작하여 입도 분포를 측정했다(붕괴성 가혹 시험).
(4)대조군의 측정
(3)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약을 사용했다. GA를 포함하지 않는 생리 식염수에 희석한 것 이외에는 (3)과 동일하게 행했다. 그 결과를 도 18의 「0%의 GA」로 하여 나타냈다.
(5)결과
결과를 도 18에 나타냈다. 희석 직후의 응집율을 비교하면, GA 처리를 행하고 나서 희석한 것은 그 응집율이 21%이었던 것에 대해서, GA 미처리에서는 16%로, 5%의 붕괴가 일어났다. 또한 붕괴성 가혹 시험에서는, 25%의 GA처리에서는 붕괴성이 현저하게 개선되었음이 확인되었다. 이상으로부터, 본 발명은 종래의 방법에 비해 특이적으로 응집한 담체 입자의 응집 덩어리의 붕괴를 경감시키고 고감도로 측정할 수 있음이 확인되었다.
<실시예 11>
(1)항 AFP 항체 감작 라텍스 시약의 제조
실시예 10과 마찬가지로 하여 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)측정 장치
도 11의 장치를 사용하여 친화성 물질(항원 항체 반응)을 측정했다.
(3)검체의 측정
AFP 컨트롤 혈청 H(1000ng/mL)을 검체액으로 하여 측정했다. 검체 3μL과 상술한 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약 3μL을 시험관에 넣어 혼합하고, 즉시 전극이 부착된 반응 셀에 주입하여 상술 장치를 사용하여 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±12V/mm의 전해 강도로 30초간 인가하여 펄 체인을 형성했다. 이 30초간의 인가 후, 즉시 전기장을 제거하고 반응액에 25% 글루타르알데이드액(이하 GA액으로 약칭함) 16μL을 첨가하여 37℃에서 0~60초간 인큐베이션한 후, 생리 식염수에 희석했다. 이 반응 희석액에 대해서, 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 라텍스의 응집율(AR)을 이하의 식에 의해 구했다.
AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)
다음에 반응 희석액의 나머지에 초음파를 30초, 60초간 인가한 후, 마찬가지로 조작하여 입도 분포를 측정했다(붕괴성 가혹 시험).
(4)대조군의 측정
(3)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약을 사용했다. GA를 포함하지 않는 생리 식염수에 희석한 것 이외에는 (3)과 동일하게 행했다. 그 결과를 도 19의 「GA 없음」으로 하여 나타냈다.
(5)결과
결과를 도 19에 나타냈다. 희석 직후의 응집율을 비교하면, 25%의 GA 처리를 한 후에 희석한 것은 처리 시간(15초, 30초, 60초)에 관계없이 21%의 응집율을 나타낸 것에 비해, 처리 시간 0초(혼합한 직후에 희석)에서는 18%, GA 미첨가한 것은 16%의 응집율을 나타냈다. 또한, 붕괴성 가혹 시험에서도, 25%의 GA 처리(처리 시간 15~60초)에서는 거의 비슷하게 붕괴성이 개선되었음이 확인되었다. 이상으로부터, 본 발명은 종래의 방법에 비해 특이적으로 응집한 담체 입자의 응집 덩어리의 붕괴를 경감시키고 고감도로 측정할 수 있음이 확인되었다.
<실시예 12>
(1)항 AFP 항체 감작 라텍스 시약의 제조
실시예 6과 마찬가지로 하여 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다. 단, 2.0μm의 라텍스(세키스이 화학 공업사 제품), 2.8μm(폴리사이언스사 제품) 및 1.7μm(폴리사이언스사 제품)를 고형분 1.0%의 현탁액으로서 사용하여 3종류의 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)측정 장치
도 11의 장치를 사용하여 친화성 물질(항원 항체 반응)을 측정했다.
(3)검체의 측정
상술한 3종류의 라텍스 시약을 사용하여 실시예 11과 마찬가지로 측정했다.
(4)대조군의 측정
(3)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약을 사용했다. GA를 포함하지 않는 생리 식염수에 희석한 것 이외에는 (3)과 동일하게 행했다. 그 결과를 도 20, 도 21 및 도 22에 「대조군」으로 하여 나타냈다.
(5)결과
2.0μm, 2.8μm 및 1.7μm을 포함하는 라텍스 시약을 사용한 결과를 각각 도 20, 도 21 및 도 22에 나타냈다. 이상, 도 20, 도 21 및 도 22로부터, 본 발명은 종래의 방법(결합 강화제를 포함하지 않는 희석액)에 비해, 라텍스의 입자 직경을 불문하고 특이적으로 응집한 담체 입자의 응집 덩어리의 붕괴를 경감시키고 고감도 로 측정할 수 있음이 확인되었다.
<실시예 13:동시 재현성 시험>
(1)항 AFP 항체 감작 라텍스 시약의 제조
실시예 10과 마찬가지로 하여 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약을 제조했다.
(2)측정 장치
도 11의 장치를 사용하여 친화성 물질(항원 항체 반응)을 측정했다.
(3)측정 방법
AFP 컨트롤 혈청 L 및 M을 검체액으로 하여 측정했다. 검체 3μL과 상술한 항 AFP 항체 감작 라텍스 시약 3μL을 시험관에 넣어 혼합하고, 즉시 전극이 부착된 반응 셀에 주입하여 상술 장치를 사용하여 주파수 200KHz의 교류 전압(직사각형파)±12V/mm의 전해 강도로 30초간 인가하여 펄 체인을 형성했다. 이 30초간의 인가 후, 즉시 전기장을 제거하고 반응액에 글루타르알데이드 25%액(이하 GA액으로 약칭함) 16μL에 첨가하여 37℃에서 0~60초간 인큐베이션한 후, 생리 식염수에 희석했다. 이 반응 희석액에 대해서, 쿨터·멀티사이저를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하여 라텍스의 응집율(AR)을 이하의 식에 의해 구했다.
AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)
상술한 조작을 10회 반복하여 측정하여 재현성 시험을 행했다.
(4)대조군의 측정
(3)의 각 검체와 항 AFP 감작 라텍스 시약을 사용했다. GA를 포함하지 않는 생리 식염수에 희석한 것 이외에는 (3)과 동일하게 행했다. 그 결과를 표 2의 「대 조군」으로 하여 나타냈다.
(5)결과
결과를 표 2에 나타냈다. 본 발명에서는 동시 재현성의 CV값은 2%전후이었으나, 대조군의 CV값은 7~11%로 편차가 크다는 것이 확인되었다. 이상으로부터, 본 발명은 대조군에 비해 높은 재현성으로 측정할 수 있음이 확인되었다.
[표 2]
Figure 112006073237338-PCT00001
본 발명의 측정 방법 또는 측정 장치는 친화성을 갖는 모든 물질의 측정에 유용하다. 구체적으로는, 생체에서 채취된 시료의 해석에 의해 여러 가지 질환의 진단에 유용한 정보를 얻을 수 있다. 보다 구체적으로는, 호르몬, 종양 마커, 효소, 약제, 감염성 병원체, 또는 이들에 대한 항체는 의료 기관에서 일상적으로 측정되고 있다. 이들 측정 대상 성분은 모두 본 발명에서의 친화성 물질에 포함된다. 또한, 생체 시료나 식품 또는 환경에서 채취된 시료에 포함되는 미생물이나 약제 등을 본 발명에 의해 측정 또는 검출할 수도 있다.

Claims (47)

  1. (1)측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액을 인큐베이션(incubation)하는 공정,
    (2)공정 (1)의 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,
    (3)공정 (2) 후에, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
    (4)공정 (3) 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    공정 (1)은 상기 반응액을 37~90℃에서 인큐베이션하는 공정인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    공정 (1)은 상기 반응액을 40~90℃에서 인큐베이션하는 공정인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 반응액 중에 수용성 고분자가 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    공정 (2)에서의 반응액의 점도를 0.8~3mPas로 조정하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    공정 (2)를 0~20℃에서 행하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    공정 (2)를 0~10℃에서 행하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    응집 덩어리 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 그 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    친화성 물질과 결합 파트너의 결합이 항원 항체 반응에 의한 결합인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    친화성 물질이 항원이고, 결합 파트너가 항체 또는 그 항원 결합 영역을 포함하는 단편인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    친화성 물질이 항체 또는 그 항원 결합 영역을 포함하는 단편이고, 결합 파트너가 항원 또는 그 항원 결정기를 포함하는 단편인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    전압 펄스가 교류 전압 펄스인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  13. (1')적어도 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결 합된 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 포함하는 반응액을, 응집 시약 성분과 혼합하기 전 또는 후에 인큐베이션하는 공정으로서, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하며, 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집이 방해되는 공정,
    (2')응집 시약 성분의 존재하에서 공정 (1')의 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,
    (3')공정 (2') 후에, 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 방해된 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
    (4)공정 (3') 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법
  14. 제13항에 있어서,
    공정(1')에 있어서, 상기 반응액을 인큐베이션한 후, 공정 (2') 전에 응집 시약을 혼합하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    응집 시약을 혼합 후에, 공정 (2') 전에 다시 인큐베이션하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    공정 (1')에 있어서, 상기 반응액을 응집 시약의 존재하에서 인큐베이션한 후, 공정 (2')를 실시하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  17. 특정 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 상기 특정 물질을 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 수단을 포함하는 담체 입자를 응집시키기 위한 장치에 있어서, 반응액의 온도를 37℃~90℃로 가열하기 위한 수단을 갖는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 장치.
  18. 특정 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 상기 특정 물질을 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정을 포함하는 담체 입자를 응집시키기 위한 방법에 있어서, 전압을 인가하는 동안의 반응액의 온도를 0℃~20℃로 하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    결합 파트너와 특정 물질과의 결합이 항원 항체 반응인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    전압 펄스가 교류 전압 펄스인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방 법.
  21. 제18항에 있어서,
    반응액에 수용성 고분자를 첨가하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  22. 제18항에 있어서,
    반응액의 점도를 0.8~3mPas로 조정하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  23. 제18항에 있어서,
    상기 담체 입자와 특정 물질을, 전압 펄스를 인가하기 전에 37℃~90℃에서 인큐베이션하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  24. 특정 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와, 상기 특정 물질을 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 수단을 포함하는 담체 입자를 응집시키기 위한 장치에 있어서, 전압을 인가하는 동안의 반응액의 온도를 0℃~20℃로 하기 위한 수단을 갖는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 장치.
  25. 이하의 요소를 포함하는 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와 측정할 친화성 물질과의 결합을, 상기 담체 입자의 친화성 물질 또는 응집 시약에 의한 응집을 지표로 하여 측정하기 위한 측정 장치.
    a:반응액을 보유하기 위한 공간,
    b:반응액의 온도를 37℃~90℃에서 인큐베이션하기 위한 수단,
    c:반응액에 전압 펄스를 인가하기 위한 수단,
    d:펄스 전압의 인가 시 반응액의 온도를 0℃~20℃로 하기 위한 수단, 및
    e:반응액에 포함되는 담체 입자와 담체 입자의 응집 덩어리 중 어느 하나 또는 모두를 계수하기 위한 수단.
  26. 다음 공정 (1)~(3) 또는 (1')~(3')을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법에 있어서, 공정 (2) 또는 (2') 전에 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너와의 결합을 강화하는 수단에 의해 반응액을 희석하는 공정을 포함하는 방법.
    (1)측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,
    (2)공정 (1) 후에, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
    (3)공정 (2) 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정, 또는
    (1')측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와 측정 대상 친화성 물질을, 응집 시약 성분과 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정으로서, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하며, 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집이 방해되는 공정,
    (2')공정 (1') 후에, 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 방해된 입자 중 어느 하나 또는 모두를 계수하는 공정, 및
    (3')공정 (2') 후에, 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 레벨 중 어느 하나 또는 모두에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
  27. 제26항에 있어서,
    반응액을 희석하는 공정이 전압 펄스의 인가 조건하에서 반응액과 희석액을 혼합하는 공정인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    전압 펄스가 교류 전압인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    교류 전압이 2KHz~20MHz의 주파수인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  30. 제27항에 있어서,
    반응액을 희석하는 공정이, 전압 펄스의 인가 조건하에서 반응액과 희석액을 혼합한 후, 전기장을 정지한 후에 다시 부가적으로 담체 입자를 희석하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  31. 제27항에 있어서,
    반응액을 희석하는 공정이, 측정 대상 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너 사이의 결합을 강화하는 결합 강화제를 반응액에 첨가한 후에 반응액과 혼합하거나, 또는 상기 결합 강화제를 포함하는 희석액으로 반응액을 희석하는 공정인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  32. 제26항에 있어서,
    반응액을 희석하는 공정이 측정 대상 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너 사이의 결합을 강화하는 결합 강화제를 반응액에 첨가한 후에 반응액을 희석액과 혼합하거나, 또는 상기 결합 강화제를 포함하는 희석액에 반응액을 희석하는 공정인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    측정 대상 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너와의 결합이 면역학적인 결합인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    항원이 단백질 항원이고, 결합 강화제가 글루타르알데이드 및 카르보디이미드에서 선택되는 어느 하나 또는 모두의 화합물인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  35. 제32항에 있어서,
    반응액을 희석하는 공정이 전압 펄스의 인가 조건하에서 반응액과 희석액을 혼합하는 공정인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  36. 제26항에 있어서,
    공정 (1) 또는 (1')에서의 전압 펄스가 교류 전압 펄스인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  37. 제26항에 있어서,
    공정 (1) 또는 (1')에 있어서 전압 펄스를 복수회 부여하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    공정 (1) 또는 (1')에 있어서 전압 펄스를 인가한 후에, 담체 입자를 분산시키고 나서 다음 전압 펄스를 인가하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  39. 제37항에 있어서,
    복수회의 전압 펄스가 다른 방향의 전압 펄스인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  40. 제26항에 있어서,
    담체 입자의 평균 입자 직경이 1μm이상인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    담체 입자의 평균 입자 직경이 1μm~20μm인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  42. 제26항에 있어서,
    공정 (2) 또는 (2')에 있어서, 응집 덩어리 및 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 모두를 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    공정 (2) 또는 (2')에 있어서, 응집 덩어리 또는 담체 입자의 3차원 정보를 물리적으로 측정하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    3차원 정보를 물리적으로 측정하기 위한 방법은 전기 저항법, 레이저 회절 산란법, 및 3차원 화상 해석법으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 방법인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 방법.
  45. 이하의 요소를 포함하는 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와 측정할 친화성 물질과의 결합을, 상기 담체 입자의 친화성 물질 또는 응집 시약에 의한 응집을 지표로 하여 측정하기 위한 측정 장치.
    a:측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 갖는 결합 파트너와 결합된 담체 입자와 측정할 친화성 물질을 포함하는 시료를 포함하는 반응액, 또는 다시 부가적으로 응집 시약 포함하는 반응액을 보유하기 위한 공간,
    b:반응액에 전압 펄스를 인가하기 위한 수단,
    c:반응액을 희석하기 위한 수단, 및
    d:반응액에 포함되는 담체 입자와 담체 입자의 응집 덩어리 중 어느 하나 또는 모두를 계수하기 위한 수단.
  46. 제45항에 있어서,
    반응액을 희석하기 위한 수단은 전압 펄스의 인가 조건하에서 반응액과 희석액을 혼합하기 위한 수단인 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 장치.
  47. 제45항에 있어서,
    반응액을 희석하기 위한 수단은 측정 대상 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너 사이의 결합을 강화하는 결합 강화제를 반응액에 첨가하기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 친화성 물질의 측정 장치.
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